2016.02.24.

Szerológiai módszerek

ELISA

Definíció

A szerológia az immunológiai tudományág

egyik részterülete.
Kutatási területe a vérsavóban (szérum) lévő
ellenanyagok. Az antigén-antitest reakció
tanulmányozásával foglalkozik.

A tünetek alapján nehezen azonosítható

betegségek identifikálásában
(azonosításában) szerológiai vizsgálatokat
végezhetnek.

ELISA 2

1
 2016.02.24.

Antigén

 antigén vagy immunogén: idegen anyag,

olyan idegen szerves molekula mely a
szervezetben immunválaszt vált ki.

 antitest vagy ellenanyag: a szervezet által

termelt molekula (immunglobulin, Ig), mely
specifikusan képes kötődni antigén(ek)
bizonyos jellegzetes részeihez

ELISA 3

Antitest

 A nyiroksejtek (limfociták) az
immunrendszerben fontos funkciókat ellátó
leukociták (fehérvérsejtek).
 A T és B limfocita sejtek a specifikus
immunválasz fő komponensei.
 B-limfociták termelik az antitesteket.

 Rendkívül sokfélék, különböző specificitással:

>109 különböző antitest; nagyon hasonló
molekulákat is képes megkülönböztetni

ELISA 4

2
 2016.02.24.

Antitest felépítése
Antigén kötő hely
Glükoprotein (kb.150kDa)
csukló
Szerkezet:
-2 könnyű lánc (L, light chain)
-2 nehéz lánc (H heavy chain)
amelyek diszulfid hidakkal és
nem-kovalens kötésekkel
kapcsolódó, összetett fehérjét
alkotnak

© New Science Press Ltd. 2003
V: variábilis régió
C: Konstans (constant) régió
Fab: fragment antigén kötő hely
Fc: fragment kristályosítható
(crystallizable), konstans régió

ELISA 5

Antitest felépítése
Az antigént megkötő hely specifikussága a
„kulcs illeszkedése a zárba” hasonlattal
jellemezhető.

ELISA 6

3
 2016.02.24.

Antitest típusok
IgG, IgD, IgE, monomer IgM, pentamer
monomer

IgA dimer

© New Science Press Ltd. 2003

ELISA 7

Antitest típusok (5) funkciója

• IgG - Az újszülöttet IgG-típusú immunoglobulinok védik a

mikroorganizmusoktól élete első heteiben. Antibakteriális és
antivirális hatású, ún. komplement-aktivitással azokat megköti, ill.
fagocitózissal a toxinjaikat semlegesíti. Fele a vérben, fele a
szövetnedvekben található. Emberben IgG1-4 alosztálya található.
• IgA - a nyál, a könny, az orrváladék, a légúti váladék illetve a
gyomor- és bélrendszer váladékának az ellenanyaga.
• IgM - Immunológiai aktivitása nagy, mert felületén számos
antigénkötőhely található.
• IgD - A legkisebb mennyiségben termelődő immunglobulin. Szerepe
egyelőre nem ismert.
• IgE - allergénnel kapcsolódva allergiás reakciót okoz: az általa
aktivált anyagokból ilyenkor különböző mediátorok szabadulnak fel,
amelyek a tüneteket okozzák.
ELISA 8

4
 2016.02.24.

Elsődleges és másodlagos antitest (az

indirekt ELISA alkalmazásában)
Antigén
pl. inzulin

Elsődleges antitest
„Egér anti-inzulin antitest”

Másodlagos antitest
„Kecske anti-egér antitest”

ELISA 9

Poliklonális antitest termelés

Antigén Az antigént
injektálása felismerő
egérbe. poliklonális
antitestek.

Az állat különböző
antitesteket termel
a különböző Az antigén elleni ellen-
antigének ellen a anyagok kiválasztása a
szérumban. plazmából.

Vérvétel az
állatból.

ELISA 10

5
 2016.02.24.

Poliklonális kontra monoklonális antitest?

• A poliklonális antitest „szennyezésként” jelen

lévő anyagok (pl. növényi sejt fehérjéi) ellen (is)
termel antigén(eke)t. Ily módon a teszt álpozitív
adatot eredményezhet (lehet, hogy a kiváltónak
vélt antitest nincs is jelen a mintában, csak a
„szennyezés”!
• Megoldás: a monoklonális antitestek
(monoclonal antibodies, MABs) előállítása

ELISA 11

Monoklonális antitest termelés

(hybridoma technológia)
Az antigen injektálása egérbe

B-limfociták Egér myeloma

gyűjtése az egér (tumor) sejtek
lépéből növesztése sejt-
kultúrában
A
B-
limfociták
fúziója
‐ myeloma: csontvelőrák  myeloma
(korlátlanul osztódó) sejtjei sejtekkel

Antitest termelő
hybridoma sejtek
ELISA 12

6
 2016.02.24.

B-limfocita és Egyetlen antigén

myeloma keveréke epitópot*
felismerő antitest
korlátlan
termelése
A fuzionált, antitest Az antigént
termelő hybridoma legjobban felismerő
sejtek kiválasztása antitesteket termelő
klón megtartása
epitóp: az antigén‐
molekula azon része, 
melyhez az antitest 
Az
kötődik individuális
antitest-
termelő
A hybridomák
sejtekből
antitest
klónok
termelésének
készítése
screenelése

ELISA 13

Antitest módosítások

Fluorofórok Streptavidin
fluorescein, rhodamine Biotin

ELISA

Szilárd anyagok Enzimek

alkalikus foszfatáz, torma peroxidáz
agaróz, mágnes, protein A
ELISA 14

7
 2016.02.24.

Az ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
• Az 1960‐as években kidolgozott radio‐immunológiai vizsgálatok 
helyett 1971‐ben Perlmann és Engvall (Stockholm University), 
valamint Schuurs és van Weemen (the Netherlands) egymástól 
függetlenül dolgozták ki és publikálták az EIA/ELISA módszert. 

Enzyme‐linked = enzim‐kapcsolt
Immunosorbent = immunológiai/immunoszorbens/immunanalitikai
Assay = vizsgálat/meghatározás/módszer

• A szellemes megoldás egy specifikus antitest – antigén (pl. vírus) –
antitest+enzim (konjugátum) összekapcsolódása esetén 
színreakciót eredményez (amennyiben az enzim egy színtelen „A” 
anyag /szubsztrát/ színes „B” anyaggá alakulását  katalizálja)

ELISA 15

Az ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
• ELISA immunreakción alapuló mérési eljárás, ahol az
immunkomplex antitest tagja enzimatikusan jelölt (enzim-
konjugátum*).

• Az immunkomplex egyik alkotója a szilárd (polisztirol)

mikrotiter lemez mintahelyéhez (lyuk / well (ang.)=kút)
kapcsolódik (ez lehet az antigén és az antitest is), amelyhez
adjuk az immun-komplex másik, jelzett tagját. Bizonyos
reakcióidő eltelte után a nem kötődött ligandumot**
lemossuk.
* konjugátum: conjugatio (lat.) összeházasítás; összekapcsolt antitest+enzim
**ligandum: a molekulában a központi atomhoz kapcsolódó atomok

ELISA 16

8
 2016.02.24.

Szendvics (direkt v. DAS) ELISA

DAS-ELISA (double antibody-sandwich ELISA) –
kettős antitest-szendvics ELISA
1. Az (antigénre specifikus)
antitestet a műanyag
felületéhez kötjük
2. Az antigén bekötődik az
antitesthez
3. Az antigént felismer egy
enzimhez kapcsolt (konjugátum)
antitestet
4. A szubsztrát reagál az
enzimmel, és
5. a keletkező (általában színes)
terméket detektáljuk.

ELISA 17

Az ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
• Az immun-komplex mennyiségét konjugált enzimének
szubsztrát-átalakító reakciója segítségével határozzuk
meg.

• A jelzéshez olyan enzimeket alkalmaznak, amelyeknek

stabil szerkezetű, szubsztrátjukat az enzim színes, jól
oldódó termékké alakítja (sárga v. lila).

• Az enzim-szubsztrát reakció mértékét, azaz az átalakult

szubsztrát mennyiségét általában fotometriásan mérjük.

ELISA 18

9
 2016.02.24.

Az ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
• Az immunológiai gyakorlatban
leggyakrabban tormaperoxidázt
(HRP – sárga színváltozás) vagy
alkalikus foszfatázt (AP – lila
színváltozás) alkalmazunk.

HRP

ELISA 19

Az ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
• Az ELISA egy jel-sokszorozó eljárás is
egyben, a jelölő enzim rövid idő alatt sokszor
(több ciklusban) képes szubsztrátjának
átalakításával indikátor molekulát előállítani. A
mérhető jel így több nagyságrenddel megnő
ahhoz képest, ha csak egyetlen jelölő molekulát
akarnánk kimutatni.

ELISA 20

10
 2016.02.24.

ELISA reagens immobilizálása mikrotiter

lemez felszínéhez
• Az ELISA vizsgálatokat műanyag (polisztirol)
mikrotiter lemezen (plate) végezzük.

Szendvics (direkt v. DAS) ELISA

Lépései:

1. A vírus-specifikus ellenanyag (antitest)

megkötődik a poliszitirol felületen
1 2 3 4
2. mosás, antitest-réteg alakul ki
3. vírus (antigén) felvitele, specifikusan
kötődik az ellenanyaghoz
4. mosás
5. az ellenanyaghoz kötött enzim
5 6 7 8 (konjugátum) hozzáadása
6. mosás
7. az enzim-szubsztrát hozzáadása
8. színreakció, majd fotométeres detektálás

A színreakció intenzitása
arányos a tesztelendő vírus
mennyiségével!

ELISA 22

11
 2016.02.24.

Szendvics (direkt v. DAS) ELISA

ELISA 23

ELISA rekció detektálása

ELISA mérések könnyen automatizálhatók
(ún. ELISA reader)

ELISA 24

12
 2016.02.24.

Az indirekt ELISA alaplépései

Indirekt ELISA
1. A vizsgálni kívánt antigén (pl. vírus) a műanyag
felületéhez kötődik,
2. Az antitest felismeri a specifikus antigént (vírus),
3. Az antitest felismeri a másodlagos antitestet (lásd:
„kecske anti-egér antitest”), ehhez van az enzim
kapcsolva,
4. A szubsztrát reagál az enzimmel,
5. a keletkező (általában színes) terméket mutatjuk ki.
Színes termék = az antigén jelenlétének
mérése
ELISA 25

Indirekt ELISA
Másodlagos
antitest
Szubsztrát

Színes termék

Elsődleges antitest

Különböző antigének a mintából

ELISA 26

13
 2016.02.24.

Indirekt ELISA

ELISA 27

Növényi vírusok kimutatása ELISA-val

Főként nyúlban termeltetett antitesteket használnak a
növényvírusok esetében, de a pontosabb monoklonális
antitestek köre is bővülő pl. PVY

Az ELISA diagnózis Az ELISA diagnózis korlátai:

előnyei:  Csak a vírusfehérje, és nem
 Specifikus a fertőzőképes vírus
 Gyors (néhány óra-nap) jelenlétét méri.
 Szemi-kvantitatív  Pozitív keresztreakciót
adhat.
 Érzékeny
 Csak az felhasznált
 Rugalmas (időben és antitestnek megfelelő vírust
térben) detektálja, mást nem.

ELISA 28

14
 2016.02.24.

Növényi vírusok kimutatása ELISA-val

DAS-ELISA: Double Antibody Sandwich ELISA mikrotiter

lemezen
Indirekt ELISA
TAS-ELISA: Triple Antibody Sandwich ELISA

A kereskedelemben széles körben kapható,

egyes vírusok kimutatására alkalmas reagens-
együttesek neve: „kit" (készlet)

ELISA 29

Növényi vírusok kimutatása ELISA-val

Product Package Contents .[Ab;Antibody]

Reagent Set,
500, 1000 tests coating Ab, conjugated Ab
Alk.Phos
96, 288, 480 coating Ab, conjugated Ab, buffers,
Full Kit, Alk Phos
tests positive control
Positive Control
Negative Control

ELISA 30

15
 2016.02.24.

ELISA kit-ek

ELISA 31

Növényi vírusok kimutatása ELISA-val

Példák Cat.No. ELISA
Abutilon Mosaic Virus ABMV KS-1001 DAS
African Cassava Mosaic Virus ACMV KS-1378 TAS
Agropyron Mosaic Virus AgMV KS-1455 DAS
Alstroemeria Carla Virus AlCV KS-1004 DAS
Alstroemeria Flower Banding Virus AlFBV KS-1005 DAS
Andean Potato Mottle Virus APMoV KS-1009 DAS
Apple Chlorotic Leaf Spot Virus ACLSV KS-1010 DAS
Apple Chlorotic Leaf Spot Virus ACLSV KS-1447 TAS
Apple Stem Grooving Virus ASGV KS-1012 DAS
Arabis Mosaic Virus & Grapevine Fan Leaf ArMV+GFLV KS-1014 DAS
Virus
Arracacha Virus B- OCA strain AVBO KS-1015 DAS
[B]
Banana Streak Virus BSV KS-1019 DAS
Banana Streak Virus BSV KS-1448 TAS
Barley Mild Mosaic Virus BaMMV KS-1020 DAS
Barley Yellow Dwarf Virus screen (BYDV-mav+pav+rpv) KS-1402 TAS

ELISA 32

16
 2016.02.24.

Növényi kórokozó baktériumok kimutatása

ELISA-val
Példák Cat.No. ELISA

Agrobacterium tumefacien (strain-specific) At KS-2002 DAS ELISA

Burkholderia cepacia Bc KS-2505 DAS ELISA
Burkholderia gladioli pv. allicola Bga KS-2003 Indirect ELISA
Burkholderia glumae Bg KS-2504 DAS ELISA

Clavibacter michiganensis subsp. insidiosis Cmi KS-2004 DAS ELISA

Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis Cmn KS-2539 DAS ELISA
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Cms KS-2008 Indirect ELISA
Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens Cff KS-2006 DAS ELISA
Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens Cff KS-2532 Indirect ELISA/IF
Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii Cfo KS-2007 DAS ELISA
Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii Cfo KS-2533 Indirect ELISA/IF
Erwinia amylovora Ea KS-2009 DAS ELISA
Erwinia amylovora Ea KS-2011 Indirect ELISA
Erwinia carotovora subsp. atroseptica Eca KS-2501 DAS ELISA
Erwinia carotovora subsp. atroseptica Eca KS-2510 TAS ELISA

ELISA 33

Növényi kórokozó gombák kimutatása

ELISA-val
Példák Cat.No. ELISA
Aspergillus & Penicillium spp. AsPe KS-2102 Indirect ELISA
Botrytis allii Boa KS-2129 Indirect ELISA
Botrytis cinerea Boc KS-2130 DAS ELISA
Botrytis cinerea Boc KS-2103 Indirect ELISA
Colletotrichum acutatum Coa KS-2105 Indirect ELISA
Colletotrichum spp. Cos KS-2106 Indirect ELISA
Monilinia fructicola Mof KS-2110 Indirect ELISA
Monilinia spp. Mos KS-2111 Indirect ELISA
Phoma medicaginis pinodella Mos KS-2115 Indirect ELISA
Pseudocercosporella (Eyespot) Pse KS-2117 Indirect ELISA
Pythium spp. Pythium KS-2143 DAS ELISA
Rhizoctonia solani I Rh.solani I KS-2126 DAS ELISA
Rhizoctonia solani II Rh.solani II KS-2127 DAS ELISA
Rhizoctonia solani III Rh.solani III KS-2131 DAS ELISA
Rhizoctonia spp. Rhiz KS-2144 DAS ELISA

ELISA 34

17
 2016.02.24.

Baktériumok kimutatása ELISA-val

DAS-ELISA kit a Ralstonia solanacearum
kimutatására, talajból

ELISA 35

Baktériumok kimutatása ELISA-val

DAS-ELISA kit a Ralstonia solanacearum
kimutatására, növényből

ELISA 36

18
 2016.02.24.

Baktériumok kimutatása ELISA-val

A Xylella fastidiosa kimutatás (válogatós edénynyaláb baktérium,

Peach phony disease) ELISA-val. Egy mélyedés (lyuk) egy
őszibarack fa mintáját képviseli; A színek a víztisztától a sárgáig
változók és jelzik a pozitív mintákban a kórokozó jelenlétét.
(Courtesy A. B. Gould).

ELISA 37

Növényi kórokozó gombák kimutatása

ELISA-val

Gyors módszer (semi-

quantitative), a terhességi
teszthez hasonló (Lateral Flow
Device) a Botrytis cinerea
kimutatására

ELISA 38

19