Virológia gyakorlatok

A virológia gyakorlatok célja, hogy a hallgatók betekintést nyerhessenek az állatorvosi virológiai

diagnosztika különböző módszereibe. A hallgatók a gyakorlatokon esetfeldolgozás során különféle
diagnosztikai eljárások végrehajtásával ismerkedhetnek meg az esetek hátterében lévő kórokozók
(vírusok) kimutatásának és a laboratóriumi diagnózis felállításának folyamatával. A gyakorlatok
menete a következő:

1. gyakorlat: mintafeldolgozás, vírusszaporítás szövettenyészeten és embrionált tyúktojásban

2. gyakorlat: citopatogén hatások, hemagglutinációs teszt
3. gyakorlat: nukleinsav izolálás, polimeráz láncreakció (PCR)
4. gyakorlat: PCR reakciók ellenőrzése, vírusneutralizációs próbák előkészítése
5. gyakorlat: vírusneutralizációs próba elbírálása, hemagglutináció-gátlási próba (HAG), az
eredmények és diagnózisok megbeszélése

1. gyakorlat: Mintavétel és laboratóriumi vizsgálat

Fertőző megbetegedések esetén kiegészítő laboratóriumi vizsgálatok szükségesek a fertőző ágensek

beazonosításához és a pontos diagnózis felállításához. A klinikai állatorvosoknak általában nem áll
rendelkezésükre az ehhez szükséges speciális felszerelés, ezért akkreditált vagy tapasztalt
szaklaboratóriumokkal kell együttműködniük. Laboratóriumi vizsgálatok szükségesek lehetnek,
amikor a tünetek és a kórbonctani elváltozások nem elegendőek egy diagnózis felállításához, illetve
amikor az a célunk, hogy egy állományból kimutassuk az endémiásan előforduló, rendszeresen
megbetegedést okozó mikrobákat. Kötelezőek a laboratóriumi vizsgálatok, ha azt a jogszabályok
előírják (bejelentési kötelezettség alá tartozó betegségek esetén: pl ragadós száj-és körömfájás,
afrikai sertéspestis, baromfipestis… stb.), zoonózis gyanú esetén (veszettség), továbbá mentesítési
eljárások során az állomány mentességének igazolásához (szarvasmarha leukózis, szarvasmarhák
fertőző rhinotracheitis vírusa, stb.), hivatalos tanúsítványok kiállításához, pl. állatállományok SPF
(specified pathogen free, meghatározott kórokozóktól való mentesség) minősítéséhez, különféle
kiállítások, versenyek előtt, illetve szállítási és utazási engedélyek kiállításához.

1. Mintavétel

A vizsgálat célja és módja (pl. diagnózis felállítása, alkalmazott diagnosztikai eljárások)

meghatározza a minta típusát, a beküldendő mennyiséget és a szállítás módját is. A mintavétel, a
minta laboratóriumba szállításának időtartama és körülményei fontos tényezők a sikeres diagnózis
szempontjából. A laboratóriumi munkát nagyban elősegíti a minta pontos megjelölése és a mintával
együtt beküldött, megfelelően kitöltött kísérőirat.

A kísérőirat olyan dokumentum, amelyben a mintát beküldő, vizsgálatot kérő állatorvos megrendeli
a laboratóriumi szolgáltatást, illetve biztosítja a laboratóriumi vizsgálatokhoz szükséges vagy azt
segítő információkat, a pontos kórelőzményt.

1
Az iratnak tartalmaznia kell a következőket:

- a beküldő állatorvos neve, címe és elérhetőségei (telefonszám, fax, e-mail) - az

állat tulajdonosának elérhetőségei (postai címe, telefonszáma, fax, e-mail) - a minta (állat)
adatai:
o az állat azonosítási száma, illetve neve o kora o neme
o rövid, releváns vakcinázási történet
- esetleírást - egyedi szinten o tünetek megjelenésének ideje o a tapasztalt tünetek o betegség
lefolyása
- esetleírás állomány szinten:
o tünetek megjelenésének ideje az állományban o a tapasztalt
tünetek o betegség lefolyása
- a minta típusának ismertetése:
o tampon (orr, bélsár, garat, kötőhártya) o vér (alvadásban gátolt,
szérum) o szervek (lép, máj, tüdő, vese, szív, bél, agyvelő,
placenta: a feltételezett betegségtől függően)
- feltételezett betegségek, kórokozók
- kért laboratóriumi vizsgálatok

A diagnosztikai szolgáltatást biztosító laboratóriumok elérhetővé teszik az általuk végzett

vizsgálatok, vizsgálati módszerek, és áraik listáját, segítséget nyújtanak abban, hogy milyen minták
szükségesek a vizsgálatokhoz és hogyan szükséges azokat eljuttatni a laborba, illetve a vizsgálatok
elvégzésének várható határidejét is jelzik. Az általuk kibocsátott eredményközlő dokumentum az
eredmények megfelelő magyarázatát is tartalmazza.

Mind a vizsgálat módjától, mind pedig a feltételezett betegségtől is függ, hogy milyen minta a
legalkalmasabb a laboratóriumi vizsgálatra, ezért a pontos kórtörténet nélkülözhetetlen. A vizsgálat
módja alapján megkülönböztetünk direkt- és indirekt eljárásokat. Direkt víruskimutatásra irányuló
vizsgálat általában a fertőzés korai szakaszában végezhető, ekkor magát a kórokozót vagy annak
valamely komponensét (antigén, nukleinsav) mutatjuk ki a mintából. A direkt víruskimutató
módszerek elvégezhetőek elhullott állat szervmintáiból, különböző testváladékokból (tej, vizelet,
bélsár, liquor, testüregi folyadék), illetve alvadásban gátolt vérből szeparált leukocitákból. Indirekt
víruskimutatás általában a fertőzés késői fázisában végezhető, ekkor a kórokozó ellen termelődött
ellenanyagokra irányulnak a vizsgálatok. Ezek a módszerek elvégezhetőek alvadásban gátolt
vérből, vagy savóból, tejből, liquorból, testüregi folyadékokból. A vizsgálatok egyedi és állomány
szinten is végezhetők. Egyedi vizsgálat esetén savópár vizsgálatot végeznek, a betegség korai és
késői szakaszából származó savók vizsgálatával. Állományok vizsgálatakor reprezentatív
mintavétel szükséges, hogy az eredményekből egész állományra érvényes statisztikai
következtetéseket lehessen levonni.

2
A direkt víruskimutató vizsgálatokra alkalmas minták a tünetek/feltételezett betegség alapján
jellemzőek és csoportosíthatók:

Vezető klinikai tünet/Minta Élő állat Elhullott állat

Légzőszervi betegség tamponminta: orr-, tüdő és nyirokcsomók, lép,

kötőhártya-, garat; alvadásban máj, vese
gátolt vér (EDTA, citrát,
heparin)

Emésztőszervi betegség bélsár (tampon); alvadásban bélszakaszok és bélfodri

Idegrendszeri betegség
Bőr-/nyálkahártya betegség
gátolt vér (EDTA, citrát,
heparin)
alvadásban gátolt vér (EDTA,
citrát, heparin); tampon
(kötőhártya-, orr-);
(cerebrospinalis liquor)
Elváltozást mutató
bőrterületek (biopszia),
papilloma, sarcoid, hólyagok
esetén hólyagfal és – tartalom,
kimaródások esetén tampon
nyirokcsomók; (lép, máj,
vese, tüdő)
agy- és gerincvelő különböző
részei; (lép, máj, vese, tüdő)
Elváltozást mutató
bőrterületek (biopszia),
papilloma, sarcoid, hólyagok
esetén hólyagfal és – tartalom,
kimaródások esetén tampon

Vetélés esetén a magzatot, vagy a szerveit, a placentát, magzatburkot és minden esetben az

anyaállatból vett vérmintát is a laborba kell küldeni.

Indirekt víruskimutatáshoz szükséges minták: savópár vizsgálat szükséges az

ellenanyagszintnövekedés kimutatásához, legalább 4 titernyi szignifikáns emelkedéssel lehet
igazolni a fertőzést. Az első vérminta vétele az akut fázisban, a tünetek megjelenésekor, míg a
második mintavétel 2-4 héttel később, a gyógyulási szakaszban történik

A mintákat a lehető legrövidebb időn belül, futárral vagy személyesen kell eljuttatni a
laboratóriumba. A határidő általában 24 óra, de ez függ a minta típusától is (pl: a
leukocitaszeparálást az alvadásban gátolt vérből, a vérvételt követő 6 órán belül el kell végezni). A
mintákat – különösen nyári melegben – jégakkukkal hűtve, 4°C-on kell szállítani. A csomagolásnak
olyannak kell lennie, amivel a minta szivárgása, illetve a minta és a környezet szennyezése
elkerülhető. Különösen fontos a csomag pontos címzése, mellyel elkerülhetjük a minták
elkeveredését, ezáltal késedelmes, vizsgálatra alkalmatlan állapotban laboratóriumba érkezését. A
hatékonyabb együttműködés (rövidebb vizsgálati határidő) érdekében érdemes a laboratóriumot
előre tájékoztatni a kért vizsgálatokról, illetve a minták laboratóriumba érkezésének időpontjáról.

3
 2. Laboratóriumi vizsgálatok

A víruskimutató módszerek között direkt- és indirekt eljárásokat különböztetünk meg. Direkt

víruskimutatáskor a komplett vírust, vagy pedig komponenseit (fehérjék, nukleinsav) tudjuk
azonosítani. A teljes vírust szövettenyészeten történő elszaporítással, azaz vírusizolálással lehet
kimutatni. Az antigént- (pl. Enzyme Linked Immunosorbent Assay [ELISA], hemagglutináció,
peroxidáz- vagy immunfluoreszcens [IF] teszt), a vírusfehérjéket (Western blot), illetve a vírus
nukleinsavát (pl. nukleinsav hibridizáció, polimeráz láncreakció [PCR]) speciális vizsgáló
módszerekkel mutatjuk ki a mintából. Indirekt eljárások közé a különböző szerológiai módszerek
tartoznak (ELISA, vírusneutralizáció, indirekt IF, hemagglutináció gátlás [HAG]), amelyek során
a fertőzésen átesett állatok savójában az ellenanyagok jelenlétét detektáljuk.

2.1. Direkt víruskimutatás - vírusizolálás

Célja: - Vírusok kimutatása - virológiai diagnosztika

- Vírusok nagy mennyiségben történő elszaporítása vírusanalitikai vizsgálatokhoz,
vakcinagyártáshoz

A vírusok obligát sejtparaziták, ezért in vitro szaporításukhoz, izolálásukhoz élő sejtek szükségesek.

Módszerek: - vírusok szaporítása sejt- és szövettenyészeten

- embrionált tojásoltás
- kísérleti állat fertőzése

2.1.1 Vírusizolálás szövettenyészeten

Elméleti háttér: A sejtek in vitro szaporítása és fenntartása.

2.1.1.1.Primer szövettenyészet készítése

Azok a szervek a legalkalmasabbak vírusszaporításra, amelyekben a vírusok in vivo körülmények

között is szaporodnak. Az aktív sejtosztódás szempontjából fiatal állatok (embrió, újszülött, vagy
pár napos állat) hámsejtekben gazdag szerveiből célszerű szövettenyészetet készíteni (vese, here,
thymus).

A szervet steril körülmények között kell az állatból eltávolítani és a feldolgozását néhány órán belül
meg kell kezdeni, mielőtt az önemésztés folyamata elkezdődne. A szerv feldolgozása során az első
lépés a kötőszöveti burkok eltávolítása, melyet a szerv állományának apró darabokra felvágása
követ. Ezután a szerv apróra vágott darabjait tripszin-verzén (EDTA) oldatban emésztjük. Az
emésztés során sejtszuszpenziót kapunk, amelyet a tripszinhatás felfüggesztéséhez jéggel hűtött
edényben gyűjtünk össze. A szuszpenzió centrifugálásával leülepítjük a sejteket, majd a tripszin-
tartalmú felülúszót leöntjük, a sejteket pedig tápfolyadékban reszuszpendáljuk.

A tápfolyadék – pl. Minimal Essential Medium (MEM) – komponensei révén izoionikus,

izoozmotikus, és izotónikus környezetet biztosít a sejteknek. A tápfolyadék különfélek sók
pufferolt, illetve aminosavakkal és szénhidrátokkal gazdagított oldatából áll, fehérjeforrásként és

4
mediátorként pedig foetális (neonatális) borjúsavót (foetal calf serum [FCS]) tartalmaz, ami a sejtek
osztódásához nélkülözhetetlen. A borjúsavót kolosztrumot nem fogyasztott borjakból nyerik
(ezáltal ellenanyagokat nem tartalmaz), és a tápfolyadék típusától, felhasználásától függően
különböző mennyiségben adjuk a tápfolyadékhoz: az 5-10 % FCS-t tartalmazó tápfolyadék az
úgynevezett szaporító közeg, a 2 % FCS-t tartalmazó tápfolyadék pedig a fenntartó közeg a sejtek
számára. A tápfolyadék tartalmaz antibiotikumot és antimycotikumot, mely megakadályozza a
baktériumok és gombák szaporodását a szövettenyészetben, illetve indikátort is, melynek
elszíneződése jelzi a sejtek anyagcseréjét.

A sejtszuszpenzió sűrűségét Bürker-kamrában határozzuk meg, és 200 000 sejt/ml értékre állítjuk
be. Ezután a szuszpenziót steril sejttenyésztő palackokba adagoljuk.

A szövettenyészeteket általában 37°C-os termosztátban, 5 % CO2 koncentrációjú környezetben

inkubáljuk. A sejtek néhány órán belül letapadnak a sejttenyésztő palackok aljára és osztódásnak
indulnak. Az összefüggő sejttenyészet 3-5 nap elteltével alakul ki. Az osztódás során a szomszédos
sejtek membránjának érintkezése kiváltja az ún. „kontakt gátlás”-t, mely a sejtosztódás leállásához
vezet. Végeredményben a sejtek egyrétegű szövettenyészetet alkotnak, mely egyenletesen bevonja
az edény alját. Ezt, mivel közvetlenül szervekből állítottuk elő, nevezzük primer
szövettenyészetnek.

A sejtek növekedési állapotát mikroszkóp segítségével naponta ellenőrizzük. Miután kialakul az

egybefüggő sejttenyészet, a szaporító tápfolyadékot fenntartó tápfolyadékra cseréljük, mely
kevesebb foetálsavót tartalmaz, és ezáltal lassítja a sejtek öregedését. A primer szövettenyészetek
2-3 hétig is életképesek maradnak a fenntartó tápfolyadékban, ez idő alatt fertőzhetjük, illetve
szükség esetén passzálhatjuk is őket.

2.1.1.2. Szubkultúrák előállítása (passzálás)

A primer sejttenyészetet az edény faláról tripszinnel leemésztjük, majd a sejteket friss

tápfolyadékban szuszpendáljuk és új, steril sejttenyésztő edényekbe adagoljuk, ahol ismét elegendő
hely lesz számukra az osztódáshoz. A palackokat inkubátorba helyezzük; a sejtek leülepednek és
osztódnak a kontakt gátlás kialakulásáig. Ezeket a sejtkultúrákat, mivel nem közvetlenül a
szervekből, hanem primer szövettenyészetből származnak, másodlagos szövettenyészetnek hívjuk.
A másodlagos tenyészetnek több előnye is van: homogénebb, minőségileg jobb sejtekből állnak.
Hátrányuk viszont, hogy vírusfertőzésre kevésbé fogékonyak.

További passzálások révén harmadlagos, negyedleges sejtkultúrákat készíthetünk, de néhány

passzálás után már csökken a sejtek osztódó képessége, vagy a fibroblaszt jellegű sejtek túlnövik a
hámjellegű sejteket, ezért a tercier, kvaterner szövettenyészetek vírusok szaporítására kevésbé
alkalmasak.

5
 2.1.1.3. Sejtvonalak

Diploid sejtvonalakat sejtklónozással állíthatunk elő: egyetlen sejt utódait izoláljuk, amelynek révén
genetikailag homogén sejtpopulációt lehet előállítani. A szöveteket szabályos időközönként
mikroszkóppal ellenőrizzük (morfológia, mitotikus aktivitás, kolónia-formáló képesség figyelembe
vétele), és sorozatos passzálások révén azokat a sejteket választjuk ki, amelyek szaporodóképessége
megfelelő.

-Sejtvonalak előnyei:
- homogén sejtek
- sejteket fagyasztva lehet tárolni (-80°C-on, vagy -196°C-on folyékony
nitrogénben), és évek múlva is ugyanúgy lehet használni őket

- Sejtvonalak hátrányai:
- némelyik vírusra kevésbé fogékonyak
- csak egyféle sejt áll rendelkezésre a vírusok szaporodásához

A legáltalánosabban használt sejtvonalak kereskedelmi forgalomban kaphatók, több száz

passzázson mentek keresztül. A sejtvonalakat különféle betűkkel és számokkal jelzik (pl. PK15:
sertésvese sejtvonal, MDBK: Madin-Darby-féle borjúvese sejtvonal).

Az aneuploid sejtkultúrák tumor eredetű sejtvonalak, amelyeknek igen nagy az osztódási

képességük és általában primordiális (ős-) sejttípusok. A celluláris vagy virális onc gén jelenléte
veszélyes lehet, ezért csak inaktivált vakcinák készíthetőek a tumorsejt-vonalakon szaporított
vírusokból. Ezek a sejtvonalak kevésbé fogékonyak néhány vírusfertőzésre. A diploid
sejtvonalakhoz hasonlóan ezeket is betűkkel és számokkal jelölik (pl. HeLa: humán méhnyaktumor
sejtek, BHK-21: hörcsög vesetumor sejtek, VERO, GMK: sárgahasú szavannacerkóf vesesejtek).

A vírusok szaporítása szövettenyészeten a minta feldolgozás után szövettenyészetre való oltásával

történik: a vírustartalmú minta-felülúszót a szövettenyészetet borító tápfolyadékhoz keverjük.

2.1.1.4. Mintafeldolgozás részletei (ahogy a gyakorlaton végezzük)

Szervminta:
1. Kb. 1 g szervminta felaprítása 1-2 mm-es darabokra steril olló és csipesz segítségével.
2. A szervdarabok dörzsmozsárba helyezése, és kb. 0,5 g steril kvarchomok hozzáadása.
3. A minta eldörzsölése.
4. 9 ml steril antibiotikumos PBS (foszfátsókkal pufferolt fiziológiás sóoldat) hozzáöntése.
5. Összekeverés, kb. 1 ml szuszpenzió mikrocentrifuga csőbe töltése.
6. A minta baktérium-mentesítő centrifugálása (5000 × g [7000 U/min], 5 perc).

6
Tamponminta:
1. A minta összekeverése vortex segítségével.
2. A tampon kicsavarása a csőbe steril csipesszel.
3. A folyadékból 1 ml mikrocentrifuga csőbe töltése.
4. A minta baktérium-mentesítő centrifugálása (5000 × g [7000 U/min], 5 perc).

Bélsárminta:
1. 0,1 g minta felhígítása 1 ml steril antibiotikumos PBS segítségével.
2. Összekeverés és homogenizálás vortex segítségével.
3. A minta baktérium-mentesítő centrifugálása (5000 × g [7000 U/min], 5 perc).

2.1.1.5. Szövettenyészet fertőzése vírustartalmú mintával

A vírustartalmú minta (felülúszó) szövettenyészetre oltását többféleképpen is végezhetjük, ezek

közül az adszorpciós és szuszpenziós technikák a legáltalánosabban használtak. Néhány különleges
esetben, pl. látens fertőzés vagy érzékeny vírus kimutatása esetén, fertőzött és egészséges sejtek
összekeverése révén (kokultiváció) lehet növelni a vírusizolálás esélyeit.

Az adszorpciós technikát akkor alkalmazzuk, ha a minta toxikus a sejtekre nézve. Elhullott állatból
származó szervminták toxikus anyagokat tartalmaznak (a szervek autolízise miatt), melyek a
szövettenyészeten aspecifikus sejtkárosító hatást (non-specific cytophatic effect [CPE]) okoznak.
A toxinok sejtkárosító hatásának elkerülésre a minta felülúszót a szövettenyészethez adjuk, majd
rövid (kb. 30 perc) inkubációs idő után (eközben a vírusok adszorbeálódnak a sejtek felszínéhez,
de a toxinok még nem károsítják a sejteket) a minta felülúszót eltávolítjuk a sejtek felszínéről.

A módszer lépésről lépésre:

1. A szövettenyészet ellenőrzése inverz mikroszkóppal.

2. A tápfolyadék eltávolítása mikropipetta segítségével (750 µl-es beállítással).
3. 200 µl inoculum (minta felülúszó) szövetre mérése.
4. Inkubáció: 30 – 60 perc, szobahőmérséklet.
5. Mosás I: 750 µl PBS szövetre mérése, majd eltávolítása.
6. Mosás II: az 5. pont megismétlése.
7. 2250µl (3×750 µl) fenntartó folyadék szövetre mérése.
8. A szövettenyészet inkubátorba helyezése.

7
A szuszpenziós technikát akkor alkalmazzuk, ha a minta toxinmentes (pl. orrtampon minta), vagy
ha olyan vírust gyanítunk a fertőzés hátterében, aminek nincsen virális polimeráz enzime, ezért
osztódó sejteket igényel a szaporodáshoz.

Az eljárás lépésről lépésre:

1. A szövettenyészet ellenőrzése inverz mikroszkóppal.

2. A tápfolyadék eltávolítása mikropipetta segítségével (750 µl-es beállítással).
3. Mosás I: 750 µl PBS szövetre mérése, majd eltávolítása.
4. Mosás II: 750 µl tripszin oldat szövetre mérése, majd eltávolítása.
5. Emésztés: 200 µl tripszin oldat szövetre mérése.
6. Inkubáció: 5 perc, szobahőmérséklet.
7. Az emésztés hatékonyságának ellenőrzése inverz mikroszkóppal.
8. 200 µl tápfolyadék sejtekhez adása, sejtek szuszpendálása. (Pipettával felszívva-kifújva.)
9. 200 µl sejtszuszpenzió átmérése üres szövettenyésztő edénybe (negatív kontroll).
10. 1500µl (2×750 µl) tápfolyadék sejtekhez adása mindkét edénybe.
11. 200 µl inoculum (minta felülúszó) sejtekhez adása.
12. A szövettenyészet inkubátorba helyezése.

2.1.2 Embrionált tyúktojás oltása

Néhány vírus (főleg a madarakat fertőző vírusok) szaporításához embrionált tyúktojást is

használhatunk. A tojásnak meghatározott kórokozóktól (pl. madárinfluenza, baromfipestis,
salmonella) mentes állományból (specified pathogen free [SPF]) kell származnia. Ezek a tojások
általában fehér héjúak, ami jó átvilágíthatósága révén lehetővé teszi a könnyebb lámpázást. A tojás
oltása előtt mindig meg kell győződni arról, hogy az embrió él-e, megfelelő fejlettségi stádiumban
van-e, illetve hol helyeződik el a tojásban. A tojás héját azon a területen, ahol oltani akarunk, jóddal,
etanollal vagy formaldehiddel fertőtleníteni kell, hogy a tojás felszínén előforduló baktériumok
beszaporodását elkerüljük. A tojáshéj átfúrása injekciós tűvel, vagy oltólándzsával történik.

A tojás oltása többféleképpen történhet, mivel a különféle vírusok az embrionált tyúktojás

különböző részeiben találják meg a szaporodásukhoz legjobban megfelelő környezetet. A
különböző oltásokhoz különböző fejlettségi állapotú tojásokat használunk.

- Szikzsákba történő oltásra az 5-7 napos tojások alkalmasak: csirkék agy- és gerincvelő
gyulladásának vírusa, madár Reovírusok, madár Adenovírusok.
- Allantoisüregbe és amnionüregbe (embrióba) történő oltáshoz 9-12 napos tojásokat használunk:
Orthomyxo-, Paramyxo- és Coronavírusok.

8
- Chorioallantois hártyára (CAM) történő oltáshoz 10-13 napos tojások alkalmasak: Pox-,
Herpesvírusok.
- Intravénás oltáshoz a 16-17 napos embriók alkalmasak: Orbivírusok (pl. Bluetongue vírus).
Az oltás után a héjon keletkezett lyukat paraffinnal vagy ragasztóval zárjuk le a bakteriális
fertőződés elkerülése érdekében, majd a tojásokat 33-37°C-os inkubátorba helyezzük. Az embriókat
naponta, lámpázással ellenőrizzük. Az embrió oltást követő 24 órán belüli elpusztulása nem
vírusfertőzés következtében történik. Vírusokra jellemző elváltozások (az oltás utáni 4-5. napon):
törpenövés, torzfejlődés, az embrió pusztulása. A chorioallantois hártyán a vírusok elszaporodását
göbök, vérzések, és szövetelhalás jelzi. Amennyiben az egyes vírusokra jellemző elváltozások
kialakulnak, vagy az embrió elpusztul, felbontjuk a tojásokat és annak megfelelő részeiből mintát
veszünk. A vírusszaporodás eredményéről az elváltozások vagy a tojásból származó minták
kiegészítő vizsgálata (PCR, haemagglutináló vírusok esetén az allantoisfolyadékból
hemagglutinációs próba) alapján győződhetünk meg.

Az eljárás lépésről lépésre:

1. Tojáslámpázás: a légzsák, a nagy erek és az embrió helyeződésének és az oltás helyének

bejelölése.

2. A tojáshéj fertőtlenítése Betadine oldatos papírvattával.

3. 200µl minta bemérése injekciós fecskendőbe.
4. A tojáshéj átszúrása injekciós tűvel a légkamra felől.
5. A tű bevezetése az allantois üregbe (kb. 1,5-2 cm mélyen).
6. Az inoculum (minta felülúszó) allantois üregbe juttatása.
7. A tű eltávolítása, a lyuk lefedése ragasztószalaggal.
8. A tojás inkubátorba helyezése.

1. ábra: Az embrionált tojás részei