การสกัด DNA จากมนุษย์และสัตว์

จัดทาโดย

นายสิทธิศักดิ์ แผนไธสง รหัสนักศึกษา 59122229009

นางสาวอารีรัตน์ ศรีวรรณ รหัสนักศึกษา 59122229013
นายจิรัฐติกาล ปี่ทอง รหัสนักศึกษา 59122229018
นางสาวธารารัตน์ สมเกื้อ รหัสนักศึกษา 59122229022
นางสาวปุณฑริกา ดอกไม้ รหัสนักศึกษา59122229023
สาขา นิติวิทยาศาสตร์ ชั้นปีที่3

เสนอ

อาจารย์นภดล แช่มช้อย

รายวิชา การตรวจพิสูจน์ชีววิทยาและดีเอ็นเอ รหัสวิชาFRS3205

 คานา
รายงานนี้เป็นส่วนหนึ่งของวิชาการตรวจพิสูจน์ชีววิทยาและดีเอ็นเอ (FRS3205) ซึ่งมี
เนื้อหาเกี่ยวกับเรื่องวิธีการสกัดดีเอ็นเอจากมนุษย์ สัตว์หรือพืช ซึ่งกลุ่มของพวกเรานาเสนอวิธีการ
สกัดดีเอ็นเอของมนุษย์และสัตว์ ซึ่งมีหลากหลายวิธี หลากหลายขั้นตอน เช่น การวัดดีเอ็นเอ
ปริมาณต่า โดยใช้แสงยูวี วิธีProteinase/Phenol วิธี Polymerase Chain Reaction(PCR)
เป็นต้น ในแต่ละวิธีแต่ละขัน้ ตอน จะมีการอธิบายเนื้อหาอย่างละเอียด อธิบายถึงลักษณะความ
แตกต่างของดีเอ็นเอของมนุษย์และสัตว์ เพื่อให้เกิดประโยชน์แก่ผู้ที่สนใจ เกิดประโยชน์แก่
นักศึกษาสาขา นิติวิทยาศาสตร์ในการใช้เป็นแนวทางในการตรวจพิสูจน์ชีววิทยาและดีเอ็นเอ
ต่อไป

หากผิดพลาดประการใด ขออภัยมา ณ ที่นี้ด้วย

สมาชิกในกลุ่ม
 สารบัญ
เรื่อง หน้า
กรดนิวคลิอิก 1
DNA 2-4
วิธีวัดดีเอ็นเอปริมาณต่า 4-11
ทฤษฎีและหลักการข้องเทคนิคการทา Polymerase Chain Reaction 11-30
อ้างอิง 30
 1

การสกัด DNA จากมนุษย์และสัตว์

กรดนิวคลิอิก
กรดนิวคลีอิกคนพบครั้งแรกโดยนักเคมีชาวสวิส กลาวคือ สารนี้ทาหนาที่เปนตัวกาหนด
ลักษณะตาง ๆ ของสิ่งมีชีวิต เปนสารที่ทาหนาที่เก็บหนาเก็บขอมูลทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตและ
สามารถถายทอดไปสูลูกหลานได กรดนิวคลีอิกเปนโพลีเมอรของนิวคลีโอไทด (nucleotide ) คือ
ในโมเลกุลของมันประกอบดวยนิวคลีโอไทดหลาย ๆ หนวยตอเขาดวยกันเปนโพลีนิวคลีโอไทด
(polynucleotide) เมื่อนามาสลายใหเป็นโมเลกุลเล็กลงไปอีกจะไดผลผลิต 3 ชนิดเปนองค
ประกอบเสมอ คือ เบสไนโตรเจน (nitrogeneous base) น้าตาลเพนโทส (pentose) และกรด
ฟอสฟอริก ในธรรมชาติมีชีวโมเลกุลกลุมหนึ่งมีขนาดใหญประกอบดวยเบส น้าตาล และฟอสเฟต
เปนองคประกอบเรียกวา กรดนิวคลีอิก (nucleic acid) กรดนิวคลิอิกสามารถแบงออกเปน 2
ประเภทซึ่งแตกตางกันที่น้าตาล กรดนิวคลีอิกที่มีน้าตาลไรโบส (ribose) เปนสวนประกอบเรียกวา
กรดไรโบนิวคลีอิก (ribonucleic acid) หรือเรียกยอ ๆ วา อารเอ็นเอ (RNA) พวกที่ประกอบดวย
น้าตาลดีออกซิไรโบส เรียกวา กรดดีออกซิไรโบส (deoxyribonucleic acid) หรือ ดีเอ็นเอ (DNA)
ซึ่งมีอยูในนิวเคลียส ไมโตรคอนเดรียและคลอโรพลาสท ทาหนาที่เปนสารพันธุกรรม (genetic
material)
 2

DNA
ดีเอ็นเอ (Deoxyribonucleic acid, DNA) เป็นองค์ประกอบพื้นฐานของสารพันธุกรรม
ของมนุษย์และเป็นตัวกาหนดลักษณะต่าง ๆ ของบุคคล รูปแบบลายพิมพ์ดีเอ็นเอในบุคคลที่มี
ลักษณะจาเพาะ รูปแบบลายพิมพ์ดีเอ็นเอของแต่ละบุคคลไม่มีการเปลี่ยนแปลงตั้งแต่เกิดจนตาย
ดีเอ็นเอเป็นสารพันธุกรรมที่เกิดจากการเรียงตัวกันของนิวคลีโอไทด์ 4 ชนิด นิวคลีโอไทด์
ประกอบด้วยน้าตาลดีออกซีไรโบส เบสและหมู่ฟอสเฟต นิวคลีโอไทด์แต่ละชนิดแตกต่างกันที่ชนิด
ของเบสที่เป็นองค์ประกอบ ได้แก่อะดีนีน (adenine, A), ไทมีน (thymine, T), ไซโทซีน
(cytosine, C) และกัวนีน(guanine, G)
ดีเอ็นเอทาหน้าที่บรรจุข้อมูลทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตโดยบรรจุอยู่ในนิวเคลียสของทุก
เซลล์ ยกเว้นเซลล์เม็ดเลือดแดง ในมนุษย์มีการจัดเรียงดีเอ็นเอให้อยู่ในรูปโครโมโซม จานวน 23 คู่
รวม 46 แท่ง แบ่งเป็นโครโมโซมร่างกาย 22 คู่ (autosome) และโครโมโซมเพศ 1 คู่(sex
chromosome)
จากการศึกษาองคประกอบของเบสในดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตหลายชนิด พบวามีปริมาณ
เบสตาง ๆ แตกตางกัน และวิเคราะหโครงสรางดีเอ็นเอดวยวิธีการหักเหกระจายของรังสีเอ็กซ (X-
ray diffraction) ของ James Watson และ Francis Crick พบวาอะดีนีนจะจับคูกับไธมีน และ
กวานีนจะจับคูกับไซโตซีน (complementary base pairing) การจับคูกันอยางจาเพาะนี้อาศัย
พันธะไฮโดรเจน นอกจากนี้ยังพบวาโครงสรางดีเอ็นในธรรมชาติมีลักษณะเปนเกลียวคู (double
helix) ประกอบดวยสายดีเอ็นเอ 2 สาย ที่กลับทิศทางกัน (anti parallel) ดีเอ็นเอทั้ง 2 สาย จะ
พันเปนเกลียววนขวาในลักษณะรอบแกนร่วมเดียวกัน ถาสายหนึ่งวางตัวจากปลาย 5’ ไป 3’ (5’ -
3’) อีกสายหนึ่งจะวางตัวจากปลาย 3’ ไปปลาย 5’ (3’-5’) การพันเปนเกลียวคูเชนนี้จะกอให
เกิดรอง (groove) ในสายของดีเอ็นเอซึ่งมี 2 ขนาด คือ รองขนาดเล็ก (minor groove) และรอง
ขนาดใหญ (major groove) ทั้ง 2 สายจะเอาสวนที่เปนแกนหลักไวดานนอก และหันสวนที่เป
นเบสเขาไปไวตรงกลาง โดยเบสแตละตัวจะยึดกันดวยพันธะไฮโดรเจนในปจจุบันเปนที่ยอมรับ
กันวา DNA เกลียวคูตามที่เสนอโดย Watson และ Crick นี้เปนโครงสรางตามธรรมชาติของดีเอ็น
 3

เอ และเปนโครงสรางที่เสถียรที่สุดที่ไมสลายไดงาย ดังนั้นการอธิบายเกี่ยวกับปรากฏการณและ
การทางานของ DNA สวนใหญจะใชโครงสรางเกลียวคูเปนหลัก
คุณสมบัติของดีเอ็นเอ
ดีเอ็นเอมีสมบัติเฉพาะตัวหลายอยาง เชน
1.การเปนกรดดีเอ็นเอ แสดงสมบัติเปนกรดเนื่องจากมีหมูฟอสเฟตเปนจานวนมาก
2.ความหนืดของดีเอ็นเอจะเปลี่ยนแปลงไปเมื่อรูปรางของมันเปลี่ยนแปลงไป ถาแยกเป็น
สายเดี่ยวความหนืดก็ลดลง
3.การเสียสภาพและการกลับคืนสูสภาพธรรมชาติ การเสียสภาพธรรมชาติ หมายถึง
การทาใหดีเอ็นเอสองสายแยกออกเปนสายเดี่ยว ปจจัยที่ทาใหเสียสภาพธรรมชาติ คือ
ความรอน กรดดาง รังสีเอกซและสารเคมีบางชนิด ถาปรับสภาพแวดลอมเสียใหม ดีเอ็นเอ
สายเดี่ยวจะสามารถกลับเขาคูก่ ันและประกอบกันขึน้ เปนเกลียวคูใหมอีกครั้งได
4. สมบัติในการดูดกลืนแสงของดีเอ็นเอ เนื่องจากเบสในดีเอ็นเอจะสามารถดูดกลืนแสง
ในชวงคลื่นแสงอัลตราไวโอเลตไดดีที่สุดที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร

โครโมโซมของมนุษย์ประกอบด้วยดีเอ็นเอ 2 ส่วน คือ ส่วนแรกเป็นดีเอ็นเอที่ทาหน้าที่

ควบคุมการสร้างโปรตีนที่มีความสาคัญต่อกลไกต่าง ๆ ภายในร่างกาย คือ ส่วนที่เรียกว่ายีนหรือ
coding DNA ซึ่งมีจานวนร้อยละ5 ของดีเอ็นเอทั้งหมด ส่วนที่สองเป็นดีเอ็นเอที่ยังไม่ทราบหน้าที่
ชัดเจนและไม่ได้ทาหน้าที่ควบคุมการสร้างโปรตีน เรียกว่า noncoding DNA หรือ junk DNA ซึ่ง
มีจานวนร้อยละ 95 ของดีเอ็นเอทั้งหมด Junk DNA เป็นดีเอ็นเอที่นิยมใช้ในการตรวจสอบลาย
พิมพ์ดีเอ็นเอ เนื่องจากส่วนของ junk DNA มีลาดับเบสที่ซ้ากันอย่างต่อเนื่อง (tandem repeats)
หลายตาแหน่งบนแท่งโครโมโซม ถ้าบนโครโมโซมมีลาดับเบสซ้ากันเป็นจานวน 9-100 เบส และมี
จานวนซ้า ตั้งแต่10 แต่ไม่เกิน 1000 ครั้ง เรียกว่า มินิแซทเทลไลท์ (minisatellite) หรือ
variable number of tandem repeat (VNTR) ส่วนดีเอ็นเอ ที่มีลาดับเบสซ้ากัน เป็นจานวน 2-
6 เบส และมีจานวนซ้าอย่างต่อเนื่องไม่เกิน 100 ครั้ง เรียกว่า ไม-โครแซทเทลไลท์
 4

(microsattelite) หรือ short tandemrepeats (STR) ในบุคคลหนึ่งๆ จะมีจานวนซ้า ต่อเนื่องที่

แตกต่างกันทัง้ จานวนเบสและจานวนซ้าทา ให้สามารถแยกความแตกต่างของบุคคลได้
Forensic DNA เป็นศาสตร์ที่ว่าด้วยการตรวจพิสูจน์ดีเอ็นเอเพื่อนามาประยุกต์ใช้ในงาน
นิติเวชวิทยา เช่น การพิสูจน์ดีเอ็นเอเพื่อยืนยันความเป็นพ่อแม่ลูก ซึ่งในปัจจุบันพบว่าการใช้ดีเอ็น
เอ มีความสาคัญมากในการนา ดีเอ็นเอมาใช้ในการตรวจพิสูจน์ยืนยันบุคคลสามารถทาได้โดยการ
สกัดดีเอ็นเอจากชิ้นส่วนของอวัยวะต่าง ๆ ของร่างกาย เช่น เส้นผม เส้นขน เลือด อสุจิกระพุ้งแก้ม
เนื้อเยื่อของอวัยวะ ลายพิมพ์นิ้วมือ และกระดูก เป็นต้น
The Combined DNA Index System (CODIS) เป็นฐานข้อมูลคอมพิวเตอร์ที่เก็บ
รวบรวมข้อมูลรูปแบบของดีเอ็นเอโดยองค์การ Federal Bureau of Investigation (FBI) และ
หน่วยพิสูจน์หลักฐานของท้องถิ่นในประเทศสหรัฐอเมริกาเพื่อใช้เป็นระบบฐานข้อ มูลในการช่วย
ระบุบุคคลจากหลักฐานดีเอ็นเอในที่เกิดเหตุทั้งนี้มาตรฐานสากลนิยมตรวจเครื่องหมายดีเอ็นเอของ
มนุษย์จากโครโมโซมร่างกายจานวน 13 ตาแหน่ง ได้แก่ TPOX, D3S1358, D5S818, D8S1179,
D7S820, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, FGA, CSF1PO, TH01และVWA นอกจากนี้
ยังตรวจเครื่องหมายดีเอ็นเอจากโครโมโซมเพศจานวน 1 ตาแหน่งคือ AMEL
 5

วิธีวัดดีเอ็นเอปริมาณต่า
1.Ultraviolet (UV) spectrophotometer
เป็นเทคนิคใช้ในการตรวจวัดปริมาณดีเอ็นเอโดยวัดค่าการดูดกลืนแสง UV ของดีเอ็นเอที่
ส่วนใหญ่เกิดจากการดูดกลืนแสง UV ของ aromatic ring ของเบสพิวรีนและไพริมิดีน UV
spectroscopy มีหลักการในการวัดพลังงานที่ดูดกลืนเข้าไปเมื่ออิเล็กตรอนเปลี่ยนชั้น ระดับ
พลังงานไปอยู่ในระดับชั้นพลังงานที่สูงขึ้น (electronic transition) โดยปกติช่วงแสงช่วง UV จะ
มีความยาวคลื่นประมาณ 10-380 nm การวัดความเข้มข้นหรือปริมาณของดีเอ็นเอวัดจากค่าแสง
ที่ส่องผ่านตัวอย่าง (I) เปรียบเทียบกับค่าการดูดกลืนแสงก่อนผ่านตัวอย่าง (I0) ค่าการส่องผ่าน
ของแสงคานวณจากอัตราส่วนระหว่าง I/I0 และคานวณเป็นค่าร้อยละ (%Transmittance, %T)
ซึ่งค่าการดูดกลืนแสง (Absorbance, A) ได้จากการคานวณตามสมการของเบียร์แลมเบอร์ก
(Beer lamborg Thery) ดังสมการที่ (1) แล้วนาค่าที่ได้มาคานวณความเข้มข้น (Concentration)
และปริมาณ (Yield) ของดีเอ็นเอ ดังสมการ(2-3)
A = -log(%T/100%) (1)
DNAconcentration(µg/ml) = OD260×50 µg/ml (2)
DNA yield (µg) = Concentration (µg/ml)×Total volumn (µl) (3)
ส่วนประกอบที่สาคัญของเครื่อง UV spectrophotometer มีดังนี้
1.แหล่งกาเนิดรังสี(Source): ที่นิยมใช้กันแพร่หลายมีดังนี้
ก. หลอดไฮโดรเจนและหลอดดิวทีเรียมความดันต่า เป็นแหล่งกาเนิดรังสีต่อเนื่องที่ดีที่สุด
ตั้งแต่ช่วงความยาว คลื่นประมาณ 160-360 nm
ข. หลอดทังสเตนหลอดชนิดนี้มีราคาถูก ประกอบด้วย ลวดทังสเตนอยู่ในหลอด
สูญญากาศ ซึ่งให้รังสีที่มี ความยาวคลื่นตั้งแต่ช่วง UV จนถึงช่วง IR (infrared)
2.โมโนโครเมเตอร์ (Monochromator) : เป็นชิ้นส่วนสาคัญในการกาหนดคุณภาพของสเปคโตร-
โฟโตมิเตอร์ ทาหน้าที่แยกลารังสีที่มีความยาวคลื่นต่อเนื่องออกเป็นลารังสีความยาวคลื่นเดียว
 6

ในช่วง Visible light อาจใช้ปริซึมแก้ว ส่วนในช่วง UV ต้องใช้ปริซึมที่ทาด้วยควอตซ์ซึ่งมีราคา

แพง มักใช้โมโนโครเมเตอร์แบบ diffraction grating ซึ่งเป็นอุปกรณ์ที่มีร่องเป็นจานวนมากและ
ความกว้างของร่องใกล้เคียงกับความยาวคลื่นของรังสี
3.เซลล์บรรจุสารตัวอย่าง (Sample container) : ซึ่งจะทาหน้าที่บรรจุสารตัวอย่างเนื่องจากแก้ว
ธรรมดาดูดกลืนรังสีในช่วง UV จึงจาเป็นต้องใช้เซลล์ที่ทาด้วยควอตซ์แทน เซลล์ที่นิยมใช้มีความ
หนา 1.00 cm
4.อุปกรณ์บันทึกสัญญาณ (Recorder) : ซึ่งจะทาหน้าที่บันทึกสัญญาณ หลังจากที่นารังสีความ
ยาวคลื่นผ่านสาร ที่ต้องการวัดการดูดกลืน จะไปตกกระทบที่อุปกรณ์ตรวจวัดสัญญาณทาให้แปล
ผลส่งไปยังอุปกรณ์บันทึกสัญญาณ

ส่วนประกอบของเครื่อง UV-Visible Spectroscopy

ข้อดีของเทคนิค UV spectrophotometer
(1) วัดค่าดีเอ็นเอได้ง่าย
(2) ใช้ปริมาณดีเอ็นเอในการวัดต่าเพียง 1μl (ถ้าความเข้มข้นเพียงพอ)
ข้อเสียของเทคนิค UV spectrophotometer
(1) ความไวต่าโดยวัดได้ต่าที่สุดที่ 0.15 μg/ml
(2) ตัวเครื่องมีขนาดใหญ่ทาให้เคลื่อนย้ายหรือนา ไปใช้ในภาคสนามได้ยาก
 7

2.Nanodrop®

เป็นเครื่องมือที่ใช้วัดดีเอ็นเอปริมาณต่า ซึ่งเกิดจากการดูดซับเบสพิวรีนและไพริมิดีนที่เป็น
องค์ประกอบ หลักของดีเอ็นเอที่ความยาวคลื่น 260nm ซึ่งบริเวณแท่นหยดสารจะมีเส้นใยแก้ว 2
เส้นติดอยู่คือ fiber optic cable (the receiving fiber) ที่ติดอยู่ที่ตัวเครื่อง และ second fiber
optic cable (the source fiber) ที่สัมผัสกับสารตัวอย่าง ดังนั้น เมื่อหยดสารตัวอย่างลงบนแท่น
หยดสารทาให้สารละลายดีเอ็นเอเกิดการเชื่อมกันระหว่างช่องว่างโดย อาศัยแรงตึงผิวของ
สารละลายเมื่อ Xenon flash lamp ให้แสง UV ผ่านไปยังตัวอย่างดีเอ็นเอจะมีการดูดซับพลังงาน
แสงไว้จานวนหนึ่งซึ่งค่าที่ได้จะถูกส่งไปประมวลผลที่อุปกรณ์ตรวจวัดสัญญาณชนิด CCD array
และ คานวณค่าความเข้มข้นของดีเอ็นเอเทียบกับค่าการดูดกลืนแสงของ blank ดังสมการ (4)
−log (𝐼𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑦𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 )
Absorbance of DNA = (4)
(𝑖𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑦𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘 )

จากนั้นนาค่า Absorbance ที่ได้มาคานวณความเข้มข้นดีเอ็นเอดังสมการ (5)

C = (A*E)/b (5)
โดยที่
C คือ ความเข้มข้นของดีเอ็นเอ (ng/µl)
A คือค่าการดูดกลืนแสงของสารตัวอย่าง
E คือ Wavelength-dependent extrication coefficient (liter/mol/cm)
 8

ข้อดีของเทคนิค Nanodrop®
(1) ความไวตามทฤษฏีในระดับ 2ng/μl
(2) วิเคราะห์ได้ทั้งปริมาณและคุณภาพ
(3) ใช้ปริมาณตัวอย่างน้อย 0.5 ถึง 5 µl
(4) วิเคราะห์ตัวอย่างในช่วงความยาวคลื่นกว้างจาก200 ถึง 900 nm
(5) วิเคราะห์ตัวอย่างได้รวดเร็วโดยใช้เวลาน้อยกว่า 5 min ต่อตัวอย่าง
(6) สะดวกและง่ายต่อการใช้งาน โดยหน้าจอเป็นระบบสัมผัส
ข้อเสียของเทคนิค Nanodrop®
(1) ความไวในการตรวจวัดต่า
(2) ราคาแพง

3.Qubit® Fluorometer

เป็นเครื่องวัดความเข้มข้นดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอ หรือโปรตีนปริมาณต่าที่ผลิตจาก บริษัท

invitrogen ในการตรวจวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอต้องใช้สารละลายที่มีส่วนประกอบของ
 9

สาร fluorescent ชื่อ Picogreen ผสมกับ ดีเอ็นเอมาตรฐานเพื่อใช้ในการ calibrate เครื่อง

จากนั้นจะใช้สารละลาย มาตรฐานผสมกับสารละลายดีเอ็นเอที่ต้องการตรวจวัดและวัดค่าโดย
เครื่อง เครื่องจะคานวณค่าความเข้มข้นของดีเอ็นเอโดยอัตโนมัติ โดยหลักการตัวเครื่องประกอบ
ดัวยแหล่งกาเนิดแสงชนิด Blue LED และ Red LED ในการหาความเข้มข้นของดีเอ็นเอจะวัดค่า
Excitation ที่ 485 nm และ Emission ที่ 530 nm ซึ่งจาเพาะต่อสี Picogreen ที่ เข้าจับกับ
dsDNA ค่าการเรืองแสงของสี Picogreen จะถูกตรวจวัดโดยอุปกรณ์ตรวจวัดสัญญาณชนิด
Photodiode ค่าความเข้มข้นของสารละลายจะแปรผันตรงกับค่าการเรืองแสงที่วัดได้ในการวัดจะ
มีค่า background เกิดขึ้น เล็กน้อยจากสี Picogreen ที่ไม่จับกับ dsDNA และการปนเปื้อนจาก
ssDNA, RNA, PCR primer และdNTP แต่จะ ให้ค่าการเรืองแสงค่อนข้างต่าง ทาให้การวัดค่า
ความเข้มข้นของดีเอ็นเอมีความถูกต้องมากกว่าการใช้เครื่อง UV spectrophotometerความ
เข้มข้น ของดีเอ็นเอสามารถคานวณได้จากค่าการเรืองแสงของสารละลายดีเอ็นเอที่ต้องการทราบ
ความเข้มข้นเปรียบเทียบกับค่าที่วัดได้จากเครื่อง QubitFluorometer
DNA concentration (ng/µl) = QF value × (200)/X (6)
โดยที่
QF value คือค่าที่อ่านไดจ้ากเครื่อง Qubit® Fluorometer
X คือ ปริมาตรของสารละลายดีเอ็นเอที่ใช้ในการวัด (µl)
ข้อดีของเทคนิค Qubit® Fluorometer
(1) มีความแม่นยามากกว่าการอ่านค่าการดูดกลืนแสงด้วยเครื่อง UV-spectro
(2) ใช้ตัวอย่างเพียง 1 µl ในการตรวจวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอ
(3) ใช้เวลาในการวัดปริมาณดีเอ็นเอ 5 min ต่อตัวอย่าง
(4) ตรวจวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอได้ในระดับ 10 pg/µl ถึง 100 ng/µl (5)
เครื่องมีขนาดเล็กทาให้สะดวกในการเคลื่อนย้ายบนภาคสนาม
 10

ข้อเสียของเทคนิค Qubit® Fluorometer

(1) ต้องซื้อน้ายาตรวจวัดจากบริษัทเท่านั้น
(2) ไม่สามารถวิเคราะห์เชิงคุณภาพได้
การสกัดดีเอ็นเอเพื่อใช้ในงานนิติวิทยาศาสตร์
1.Classical method: Proteinase/Phenol เป็นเทคนิคที่ใช้ในการสกัดดีเอ็นเอโดยมี 3
ขั้นตอน
ขั้นตอนที่1 เป็นการทาให้เซลล์แตกด้วยบัฟเฟอร์ซึ่งมีส่วนประกอบของโซเดียมคลอไรด์
Tris-HCl pH8.0และเอนไซม์ proteinase k จะทาหน้าที่ย่อยโปรตีนในเยื่อเซลล์
ขั้นตอนที่2 เป็นการกาจัดสิ่งเจือปนออกจากดีเอ็นเอโดยแยกส่วนที่เป็นโปรตีนออกจาก
กรดนิวคลีอิกโดยด้วยสารฟีนอล คลอโรฟอร์มและไอโซเอมิลแอลกอฮอลล์โดยสารฟีนอลทาหน้าที่
ละลายโปรตีน คลอโรฟอร์มทาหน้าที่ละลายลิพิด และไอโซเอมิลแอลกอฮอลล์ทาหน้าที่ตกตะกอน
อาร์เอ็นเอ ทั้งนี้ส่วนที่เป็น โปรตีนจะอยู่ในชั้น organic phase และบริเวณ interphase ส่วน
สารละลายดีเอ็นเออยู่ส่วนบนในบริเวณ aqueous phase
ขั้นตอนที่3 เป็นการทาให้สารละลายดีเอ็นเอมีความเข้มข้นสูงขึ้นด้วยการตกตะกอนดีเอ็น
เอด้วย แอลกอฮอล์ซึ่งปกติจะใช้เอทานอลหรือไอโซโพรพานอลโดยอาจเติมไกลโคเจนเพื่อช่วย
ตกตะกอนดีเอ็นเอที่มีความเข้มข้นต่าจากนั้นล้างส่วนที่ปนเปื้อนดีเอ็นเอด้วย 70% เอธานอล
ปล่อยดีเอ็นเอให้แห้งที่อุณหภูมิห้องและ ละลายตะกอนดีเอ็นเอด้วยน้า
ข้อดีของการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธี Classical method: Proteinase/Phenol
(1) ดีเอ็นเอที่สกัดได้มีความบริสุทธิ์สูง
(2) ได้ดีเอ็นเอปริมาณสูง
(3) ราคาถูก
ข้อเสียของการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธี Classical method: Proteinase/Phenol
(1) ใช้เวลานาน
 11

(2) ปริมาณดีเอ็น ที่สกัดไม่คงที่

(3) ใช้สารเคมีที่เป็นอันตราย
2.QIAmp DNA mini kit ชุดสกัดดีเอ็นเอ QIAmp DNA mini kit เป็นชุดสกัดดีเอ็นเอจาก
ตัวอย่างเนื้อเยื่อของมนุษย์โดยการทาให้เซลล์แตกด้วยสารละลาย Guanidine hydrochloride
จากนั้นแยกบริสุทธิ์ดีเอ็นเอโดยใช้spin column ที่มี silica gel membrane ที่สามารถจับกับ ดี
เอ็นเอในคอลัมน์ QIAamp ในขณะที่สิ่งปนเปื้อนจะไม่จับกับคอลัมน์เช่น สารที่ เป็นตัวยับยั้งใน
การทาพีซีอาร์ (divalent cations) และโปรตีน ซึ่งสิ่งปนเปื้อนเหล่านี้จะถูกกาจัดออกอย่าง
สมบูรณ์ ในขั้นตอนการล้าง 2 ขั้นตอน ด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ สาหรับดีเอ็นเอที่บริสุทธิ์จะถูกชะ
ออกมาด้วยน้าหรือสารละลายบัฟเฟอร์
ข้อดีของการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธี QIAmp DNA mini kit
(1) แยกบริสุทธิ์ดีเอ็นเอที่มีคุณภาพสูงได้อย่างรวดเร็ว
(2) ใช้ระยะเวลาสั้น
(3) สามารถกาจัดสิ่งปนเปื้อนและสารที่เป็นตัวยับยั้งัในการทาพีซีอาร์ได้
(4) ใช้สารเคมีที่ไม่เป็นอันตราย
ข้อเสียของการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธีQIAmp DNA mini kit
(1) ราคาสูง
(2) ได้ดีเอ็นเอปริมาณต่า
 12

ทฤษฎีและหลักการข้องเทคนิคการทา Polymerase Chain Reaction

เทคนิคการทา Polymerase Chain Reaction โดยทั่วไปมักมีวัตถุประสงค์ที่จะให้ได้ยีนที่
ต้องการ และเพิ่มขยายยีนดังกล่าว ซึ่งเทคนิคนี้สามารถเพิ่มขยายดีเอ็นเอใหม่จานวนมากขึ้น
กว่าเดิมหลายล้านเท่า โดยการเพิ่ม ปริมาณยีนที่สนใจในหลอดทดลอง ดังนั้นเทคนิคนี้จึงเรียกอีก
ชื่อหนึ่งว่า In vitro enzymatic gene amplification วิธีนี้มีประโยชน์ในการตรวจหาชิ้นส่วนหรือ
เพิ่มชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการในส่งสิ่งตรวจ ค้นพบครั้งแรกโดย Kary Mullis และคณะ ในปี 1983
โดยใช้หลักการเลียนแบบธรรมชาติที่ว่าโดยอาศัยดีเอ็นเอต้นแบบเป็นจุดเริ่มตน และมีเอนไซม์พวก
DNA polymerase ช่วยทาให้สายดีเอ็นเอยาวออกไปโดยเลือกจับเอานิวคลีโอไทดตัวใดตัวหนึ่ง ใน
4 ชนิด dATP, dGTP, dCTP ,dTTP เข้ามาต่อเป็นเบสคู่สมกับดีเอนเอสายต้นแบบ (template)
ส่วนประกอบต่างๆ ในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอมีดังนี้คือ ดีเอ็นเอต้นแบบ (template DNA),
thermostable DNA polymerase, deoxynucleotice , triphosphate (dNTPs) ทั้ง 4 ชนิด ,
Oligonuclotide primer อย่างน้อย 1 คู่ และบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม ปริมาณดีเอ็นเอจะเพิ่มมากขึ้น
ได้ ต้องอาศัยปฏิกิริยาต่อเนื่องหลายๆรอบ ซึ่งแต่ละรอบจะประกอบด้วย 3 ขั้นตอน คือ
1. ขั้นตอน denaturation : เป็นขั้นตอนการทาให้ DNA สายคู่แยกเป็นสายเดี่ยว โดย
อาศัยความร้อนที่อุณหภูมิประมาณ 90-95 องศาเซลเซียส
2. ขั้นตอน Primer annealing : เป็นขั้นตอนที่มีการลดอุณหภูมิลงมาทที่ประมาณ 45-60
องศาเซลเซียส เพื่อให้ Primer สามารถเกาะติดกับดีเอ็นเอต้นแบบสายเดี่ยวตรงบริเวณลาดับเบส
คูส่ ม
3. ขั้นตอน Primer extension : เป็นขั้นตอนการขยายสายดีเอ็นเอโดยการต่อลาดับนิวคลี
โอไทดเข้าที่ปลาย 3 ของ Primer แล้วมีการขยายสายดีเอ็นเอสายใหม่จากทิศทาง 5 ไป 3 โดย
อาศัยเอนไซม Thermostable DNA polymerase เช่น Taq polymerase ซึ่งปกติใช้อุณหภูมิ
อยู่ในช่วง 70-75 องศา เซลเซียส
 13

ถ้าพิจารณาสายดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้น โดยเริ่มจากสายดีเอ็นเอต้นแบบ 1 คู่ เมื่อสิ้นสุดรอบที่ 1

จะได้สายดีเอ็นเอเป็น 2 คู่ เมื่อทาเช่นนี้หลายๆ รอบของ PCR ดีเอ็นเอก็จะเพิ่มขึ้นเป็น 2 เท่า ของ
ทุกๆรอบลักษณะทวีคูณเป็น 2n เมื่อ n เป็นจานวนรอบของปฏิกิริยา ดังนั้นถ้าปฏิกิริยาดาเนินไป
ได้ 20 รอบ จะได้ดีเอ็นเอ 220 ชุด หรือมีปริมาณของดีเอ็นเอประมาณ 1 ล้านเท่า
Advanced Techniques of PCR
Polymerase Chain Reactions (PCR) ได้ถูกนามาประยุกต์ใช้และการพัฒนา
ปรับปรุงวิธีต่างๆเพื่อให้สามารถนาไปศึกษาค้นคว้า วิจัยความรู้ใหม่ๆ ตลอดจนการแก้ไขปัญหาที่
ไม่อาจทาได้ในอดีต เนื่องจาก เทคโนโลยีของ PCR ได้ก้าวหน้าไปอย่างรวดเร็ว โดยเริ่มต้นตั้งแต่มี
การรายงานการเกิด PCR ครั้งแรกในปี 1985 ซึ่งเป็น simple PCR จนกระทั่งในปัจจุบันมีเทคนิค
ชั้นสูง (Advanced techniques of PCR) ออกมาใหม่ๆ ให้นามาใช้อยู่มากมาย
 14

PCR ชั้นสูงที่ได้มีการพัฒนาดัดแปลงเฉพาะเทคนิคพื้นฐานดังต่อไปนี้
1.Multiplex PCR

2. Nested PCR
 15

3. PCR cloning

4. PCR-SSCP
 16

5. RT-PCR

6.เทคนิค RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

 17

7. เทคนิค RAPD (Random amplified polymorphic DNA)

8. เทคนิค Quantitative Realtime PCR

 18

การเตรียมและขั้นตอนการ PCR
1. การเก็บสิ่งส่งตรวจหรือตัวอย่างเพื่อสกัดดีเอ็นเอ
ตัวอย่างที่ส่งตรวจอาจเป็นเนื้อเยื่อจากพืช สัตว์ หรือสิ่งส่งตรวจจากผู้ป่วยเช่น เลือด สาร
น้าต่าง ๆ ชิ้นเนื้อ อาจเป็น Fixed paraffin-embedded tissue สามารถเอามาสกัดสาร
พันธุกรรมที่เป็น DNA หรือ RNA ก็ได้โดยใช้วิธีง่ายๆ และรวดเร็ว ซึ่งมีหลายวิธีซึ่งสามารถสกัดเอา
DNA ปริมาณน้อยๆ ได้เนื่องจากเทคนิค PCR มีความไวสูง และอาศัย DNA ปริมาณน้อยๆ ได้ ทั้ง
สามารถเลือกเพิ่มจานวน DNA ช่วงสั้นๆ ได้ดี จึงสามารถใช้กับสิ่งส่งตรวจที่เป็นตัวอย่างที่เก็บไว้
เป็นระยะเวลานาน ทาให้มีประโยชน์นาไปใช้กับงานทางด้านโบราณคดีหรืองานนิติเวชได้
2. ดีเอ็นเอต้นแบบ (Template DNA)
DNA ต้นแบบที่มีลาดับเบสเป้าหมายหรือดีเอ็นเอเป้าหมาย (DNA Target) สามารถจะใช้
ในปฏิกิริยาของ PCR ในลักษณะ DNA สายเดี่ยวหรือ DNA สายคู่ก็ได้ แม้ว่าขนาดของดีเอ็นเอ
ไม่ใช่จุดที่มีปัญหามากนัก แต่การเพิ่มจานวนดีเอ็นเอโดยดีเอ็นเอมีขนาดสั้นๆอยู่ในรูปปลายเปิดจะ
มีประสิทธิภาพที่ดีกว่าเพราะ primer จะเข้าไปจับ ซึ่งช่วยให้ง่ายต่อการเพิ่มจานวนและลดผลผลิต
DNA ที่ไม่จาเพาะลง โดยทั่วไปควรทดสอบปริมาณ DNA ต้นแบบที่เหมาะสมเพื่อให้ได้ปริมาณ
DNA ที่ต้องการเพียงพอและมีความไวที่เหมาะสม
3. นิวคลีโอไทด์ตั้งต้น (Primer)
การเลือกออกแบบ Primer ที่จะใช้ต้องเลือกให้เหมาะสมกับแต่ละงานโดยอาศยหลักการ
จับคู่กันแบบจาเพาะของสายดีเอ็นเอที่ต้องการตรวจหากับ primer โดยลาดับนิวคลิโอไทด์ของ
primer เป็นตัวกาหนดความจาเพาะในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ดังนั้นจึงต้องทราบลาดับเบสที่
นามาสังเคราะห์ primer
ข้อแนะนาในการเลือกและออกแบบ Primer ได้แก่
1). ความยาวของ Primer : ควรมีความยาวประมาณ 18-30 นิวคลีโอไทด์ ขึ้นอยู่
กับงานที่ใช้
2). ควรเลือก Primer ที่มีการกรายของเบสอย่างสม่าเสมอ
 19

3). ควรเลือก Primer ที่มี GC-content อยู่ระหว่าง 50-60% ไม่ควรเลือก

primer ที่มีปรมาณ GC-content ที่สูงเกินไป
4). Primer ต้องมีความจาเพาะกับลาดับเบสเป้าหมาย (target sequence) ใน
ดีเอ็นเอต้นแบบนั้นคือ ลาดับนิวคลีโอไทด์ของ primer ต้องมีความจาเพาะเพียงแห่งเดียว
ในสายดีเอ็นเอต้นแบบ
5). หลีกเลี่ยงลาดับเบสที่จับกับลาดับเบสของตัวเอง
6). ควรหลีกเลี่ยงลาดับเบสของแต่ละ Primer ไม่ให้เป็นคู่สมกันเอง
7). ค่า Tm (melting temperature) ของแต่ละ primer ควรใกล้เคียงกัน
โดยทั่วไปควรอยู่ในช่วง 55-80 องศา เซลเซียส
8). Primer ควรมีลาดับคู่สมกับปลายด้าน 3 ของลาดับนิวคลีโอไทด์ในแต่ละสาย
ของดีเอ็นเอต้นแบบ
4. Thermostable DNA polymerase
Thermostable DNA polymerase ที่นิยมใช้กันมากที่สุดคือ Taq DNA polymerase
ซึ่งแยกได้จากเชื้อแบคทีเรียที่เจริญได้ในน้าพุร้อนที่มีชื่อ Thermus aquaticuse (Taq) ซึ่งมี
คุณสมบัติทนความร้อนได้ สูงและไม่เสียคุณสมบัติของเอนไซมในขั้นตอน denature และสามารถ
ในการเร่งปฏิกิริยาการสร้าง DNA ได้ที่อุณหภูมิสูงคือ 70-85 องศาเซลเซียส และอุณหภูมิที่
เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยาคือ 72 องศาเซลเซียส
Taq DNA polymerase เป็นโปรตีนทีมีน้าหนักโมเลกุล 94 กิโลดาลตัน ขาดคุณสมบัติ 3-
5 exonuclease activity จึงขาดคุณสมบัติในการตรวจสอบที่เรียกว่า proofreading ความ
เข้มข้นที่เหมาะสมของ Taq DNA polymerase อยู่ในช่วง 1.0-2.5 units ความเข้มข้นที่ใช้ขึ้นกับ
ปริมาณและลักษณะของดีเอ็นเอต้นแบบ, primer รวมทั้งสารประกอบอื่นๆ ด้วยการใช้เอนไซมที่
มากเกินไปจะทาให้เกิดผลผลิต PCR ที่ไม่จาเพาะขึ้น ทาให้เกิด nonspecific background มาก
แต่ถ้าใช้ความเข้มข้นน้อยเกินไปก็จะทาให้ได้ผลผลิตน้อย
 20

5. Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs)

ความเข้มข้นของ dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ปกติอยู่ระหว่าง 50-200 uM
ของแต่ละ dNTP แต่ถ้าเป็น dNTPs ทั้ง 4 ตัว จะมีส่วนประกอบรวมไม่เกิน 800 uM ถ้าหากมี
การใช้ dNTPs ที่มีความเข้มข้นที่สูงเกินไป จะเกิดการต่อลาดับเบสคู่สมที่ผิดพลาด การเตรียม
dNTPs ควรเตรียมเป็น primary stock solution ที่เจือจาง 10 mM แล้วแบ่ง aiquot เก็บที่ -20
องศาเซลเซียส
 21

6. บัฟเฟอร์ (Buffer)
ส่วนประกอบของบัฟเฟอร์ประกอบด้วย Tris-HCL, KCL, MgCL2 และ Glycerol ความ
เข้มข้นและภาวะที่เหมาะสมของส่วนประกอบต่างๆ ในบัฟเฟอร์มีดังนี้
6.1.ความเข้มข้นของ Magnesium ion (Mg 2+ )
Taq DNA polymerase ต้องการ magnesium ion เพื่อช่วยส่งเสริมให้ปฏิกิริยา
การขยายสายดีเอ็นเอดาเนินต่อไปได้ โดย magnesium ion จะทาหน้าที่เป็น co-factor
นอกจากนั้น magnesium ion ยังมีผลต่อการ ทางานของเอนไซมด้วย (enzyme
fidelity) และมีผลต่อการ anneal ของ primer ความเข้มข้นของ Magnesium ion ต้อง
ปรับเปลี่ยนให้พอเหมาะกับความเข้มข้นของ dNTPs โดยทั่วไปความเข้มข้นที่พอเหมาะ
ของ magnesium ion คือต้องเหลือ magnesium ในรูปอิสระประมาณ 0.5-1.0 mM
โดยทั่วไปมักใช้ magnesium ความเข้มข้นทั้งหมดเป็น 1.5 mM ความเข้มข้นของ
mahnesium ion ที่มากเกินไป ทาให้เกิดผลผลิตดีเอ็นเอที่ไม่จาเพาะ และพบว่าการปรับ
ค่า magnesium ion ก็ช่วยให้ primer มีการanneal ที่มีความจาเพาะขึ้นเช่นเดียวกับ
การเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ
6.2) pH
pH ที่เหมาะสมในการทางานสาหรับ Taq DNA polymerase คือที่ pH 7-7.5 ที่
อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส แต่ปกติ Taq DNA polymerase จะอยู่ใน Tris buffer ซึ่งมี
pH 8.5-9.0 ที่ 25 องศาเซลเซียส เนื่องจาก pH ของ Tris- buffer จะลดลงประมาณ
0.03 ของอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นแต่ละองศา ดังนั้นเมื่ออุณหภูมิเพิ่มขึ้นเป็น 72 องศาเซลเซียส
จะได้ pH 7.3
7. องค์ประกอบอื่นในปฏิกิริยา PCR
โดยทั่วไปส่วนประกอบของบัฟเฟอร์ที่ใช้ใน PCR คือ 10-15 mM Tris-HCL muj pH8.4
ที่ 25 องศา เซลเซียส, 50 mMKCL, 1.5 mM MgCL2 0.01% gelatin (W/V) หรืออาจใช้
non-ionic detergent อื่นแทน gelatin ได้ เช่น 0.01% NP40 และ 0.01% Tween 20 การ
 22

ทดลองบางแห่งใช้ DMSO ใส่ลงไปในปฏิกิริยาเพื่อลด secondary structure ของ DNA แต่พบว่า

10% DMSO ไม่เหมาะกับ Taq DNA polymerase เพราะไปยับยั้งปฏิกิริยาของ เอนไซมทาให้
ได้ผลผลิต PCR ทีน่ ้อยลง Gelatin หรอ Bovine serum albumin (BSA) ที่ความเขมขนต่าๆ
(100 ug/ml) สามารถช่วยคงสภาพของเอนไซมได้ แต่ BSA ถูกทาลายได้ง่ายที่อุณหภูมสูงและ
อาจตกตะกอนกับ Taq DNA polymerase

Temperature cycling
1. ขั้นตอน Denaturation อุณหภูมิที่ใช้ส่วนใหญ่ประมาณ 94-95 องศาเซลเซียส เป็น
เวลานาน 30-60 วินาที อย่างไรกการใช้เวลานานและอุณหภูมิที่สูงเกินไป จะทาให้เอนไซมและนิ
วคลีโอไทดฺสูญเสียคุณสมบัติได้ แต่ถ้า ใช้เวลาน้อยและอุณหภูมิที่ต่าเกินไป จะทาให้สายดีเอ็นเอ
แยกออกจากันได้ไม่ดี ทาให้ผลผลิต PCR ลดลง กรณีที่ DNA ต้นแบบมีปริมาณ G+C content ที่
สูงมาก ต้องเพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้นด้วย
2. ขั้นตอน Primer annealing โดยทั่วไปใช้อุณหภูมิในขั้นตอนนี้ประมาณ 55-72 องศา
เซลเซียสซึ่งใช้อุณหภูมิ annealing temperature ที่ต่ากว่า Tm ของ Primer ประมาณ 5 องศา
เซลเซียสการใช้อุณหภูมิที่สูงในขั้นตอนนี้จะช่วยในการเพิ่มความจาเพาะในการจับคู่ เวลาที่ใช้ใน
ขั้นตอนนี้ประมาณ 30 วินาที
3. ขั้นตอน Primer extension เวลาที่ใช้ในขั้นตอนนี้ขึ้นกับความยาว ความเข้มข้น และ
ลาดับเบสของ DNA ต้นแบบ โดยทั่วไปใช้เวลาประมาณ 1 นาที ที่อุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส
โดยปกติ Taq DNA polymerase สามารถเพิ่มความยาวของสาย DNA ได้ประมาณ 6,000 นิวคลี
โอไทด์ต่อนาทีที่อุณหภูมิ 72 อาศาเซลเซียส การใช้เวลาที่มากในขั้นตอนแรกจะมีประโยชน์สาหรับ
ดีเอ็นเอต้นแบบทีมี่จานวนน้อย
 23

จานวนรอบในการทา PCR (cycle number)

จานวนรอบในการทา PCR ขึ้นกับปริมาณดีเอ็นเอต้นแบบตั้งต้น ถ้าใช้จานวนรอบที่มากขึ้น
เท่าใด โอกาสที่จะได้ผลผลิต PCR ผิดพลาดก็มากขึ้นตามไปด้วย เนื่องจากผลผลิต PCR ที่ได้จะมี
ความจาเพาะเจาะจงที่น้อยลง และ Background มากขึ้น แต่ใช้จานวนรอบน้อยเกินไปผลผลิตที่
ได้ก็น้อยลงด้วย

การตรวจวิเคราะห์ผลผลิต PCR (PCR Product)

การตรวจวิเคราะห์ผลผลิตมีด้วยกันหลายวิธิ ที่นิยมใช้กันทั่วไปคือ
1. Gel electrophoresis โดยนาผลผลิต PCR ที่สร้างได้มาแยกตามขนาด DNA โดยใช้
กระแสไฟฟาแยก DNA บน agarose gel หรือ polyacrylamide gel เปรียบเทียบกับ DNA
มาตรฐานที่ทราบขนาดที่แน่นอน จากนั้นย้อมชิ้นดีเอ็นเอด้วย ethidium bromide แล้วนาไปส่อง
ดูด้วยแสงอัลตร้าไวโอเลต ผลผลิต PCR ที่ดีควรให้ชิ้นดีเอ็นเอที่ชัดเจน และตรงตามขนาดความ
ต้องการ แต่ถ้ามีขนาดเล็กและแถบดีเอ็นเอไม่ชัดเจน อาจเป็นดีเอ็นเอที่เป็น primer dimmer
2. Nucleic acid hybridization ในกรณีที่ดูผลจากเจลไม่ชัดเจน สามารถนาผลผลิต PCR
ที่ได้มาตรึงกับแผ่น nitrocellulose หรือ แผ่น nylon แล้วนามาทา southern blot , dot blot
หรือ slot blot โดยอาศัยตัวติดตาม (probe) ที่จาเพาะกับเบสคู่สมซึ่งติดฉลากด้วยสาร
กัมมันตรังสีหรือสารปลอดรังสี แล้วจึงนาผลไปดูการจับของผลผลิต PCR กับตัวติดตามได้
3. Direct sequencing ในกรณีต้องการรรายละเอียดของลาดับเบสหรือของผลผลิต PCR
ว่าถูกต้องแน่นอน หรือไม่ สามารถตรวจหาลาดับเบสโดยวิธี sequencing PCR ที่เป็นสายคู่
(double strand PCR products) หรือ อาจจะ sequencing PCR ที่เป็นสายเดี่ยว (single
stranded PCR products)
 24

ข้อควรระวังในการทา PCR
การปนเปื้อน (Contamination)
ถึงแม้ว่าเทคนิค PCR นี้จะเป็นวิธีทสามารถเพิ่มจานวนดีเอ็นเอได้มากหลายล้านเท่า แต่ก็
สามารถเพิ่ม จานวนดีเอ็นเอที่ปนเปื้อนเพียงเล็กน้อยได้มากเช่นกัน ทาให้เกิดผลบวกปลอมได้ การ
ปนเปื้อนอาจเกิดได้จาก หลายสาเหตุเช่น การสกัดแยกดีเอ็นเอ หรือจากการปนเปื้อนของผลผลิต
PCR ครั้งก่อน (carry over contamination) ซึ่งมักจะอยู่ในรูปละอองลอย (aerosol) ที่มัก
เกิดขึ้นขณะการเปิด-ปิดฝาหลอด และการปนตกตะกอน ละอองลอยนี้สามารถปนเปื้อนกับสิ่ง
ตางๆ ในห้องปฏิบัติการทั้งอุปกรณ์เครื่องมือและวัสดุต่างๆ รวมทั้งผิวหนัง ผม และมือผู้
ปฏิบัติการได้ ดังนั้น จึงควรมีการระวังการปนเปื่อนให้มากโดยเฉพาะการปนเปื้อนชนิด carry-
over contamination
วิธีการที่จะป้องกันการปนเปื้อนมีด้วยกันหลายอย่างเช่น
1.ควรแบ่งพื้นหรือห้องทางานในช่วงก่อนและหลังทา PCR (separate workspace)
2.แบ่งสารเคมีหรือน้ายาลงในหลอดเล็ก ๆ (Aliquot) เพื่อให้การนามาใช้แต่ละครั้งไม่ปนกัน
3.ใช้ Micropipette และ Filter tip ซึ่งเป็นทิปชนิดพิเศษที่ป้องกันการแพร่กระจายของละออง
ลอย โดยมีลักษณะ สาคัญคือมีไส้กรอง (membrane) อยู่ภายใน
4.มีตัวควบคุมที่เหมาะสมในการทา PCR โดยตัวควบคุมจะมีด้วยกัน 3 แบบ คือ แบบแรกเป็นตัว
ควบคุมที่ไม่มีดีเอ็นเอ (no template) เพื่อเป็นการควบคุมการปนเปื้อนของสารที่ใช้ (negative
control) แบบที่สองเป็นตัวควบคุมที่มี DNA ชนิดที่ไม่มีลาดับเบสเป้าหมายอยู่ (negative
control) และแบบที่สามเป็นตัวควบคุมที่มีดีเอ็นเอต้นแบบที่ต้องควบคุม(positive control)
5.การปฏิบัติงานด้วยขบวนการปราศจากเชื้อ (Sterile technique) และด้วยความระมัดระวังเช่น
การสวมถุงมือและ เปลี่ยนถุงมือบ่อยๆ
6.ลดขั้นตอนย้ายถ่ายสารละลาย (Minimize handling of the solutions ) เช่นลดขั้นตอนการ
ใช้ปิเปต โดยการทา master mix เมื่อต้องทา PCR หลายตัวอย่าง
 25

ข้อจากัดทางด้านเทคนิคของวิธี PCR
แม้ว่าเทคนิค PCR จะมีประสิทธิภาพสูง แต่มีข้อจากัดบางอย่างเช่น
1. ข้อผิดพลาดในการทางานของเอนไซม taq DNA polymerase มีความผิดพลาดในการ
นาเบสที่ไม่ใช่คู่สมมาต่อกับดีเอ็นเอที่กาลังสร้างขึ้นมาเท่ากับ 10-5 error/base เมื่อทา PCR ไป
30 รอบ โอกาสที่จะผิดพลาดจะพบ 1 ใน 3000 bp ของผลผลิต PCR
2. ความยาวของขนาด PCR ถึงแม้ว่า PCR จะสามารถทาให้ได้ผลผลิตที่มีขนาดยาว 10
kb ได้แต่ส่วนใหญ่จะ ได้ผลดีทีสุดเมื่อขนาดของ PCR ไม่มากกว่า 2 kb เพราะถ้ายาวกว่านี้ความ
ผิดพลาดจะมากขึ้น เนื่องจาก primer และ taq DNA polymerase ทางานไม่สมบูรณ โดยจะมี
การจับ dNTPs ที่ไม่ถูกต้องมาต่อเข้าภายในสาย DNA มากขึ้น
ปัจจุบันพบว่า PCR เป็นเทคนิคที่นาไปใช้ประโยชน์ได้หลายสาขาทั้งการแพทย์, การเกษตร,
โบราณคดี, อุตสาหกรรม และอื่นๆอีกมากมาย จึงนับว่าเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์มหาศาล
ปัจจุบัน PCR มีเทคนิคใหม่ๆ ที่เพิ่มขึ้นมากมายจึงเรียกว่า Advanced PCR อันได้ก่ Nested
PCR, Reverse transcriptase PCR (RT-PCR-SSCP, Multiplex PCR, Random Amplified
Polymorphism of DNA (PAPD) และ Realtime PCR เป็นต้น ทาให้มีความ หลากหลายในการ
เลือกใช้ให้เหมาะสมกับงานและได้ประโยชน์ยิ่งขึ้น

Advanced Techniques of PCR

Polymerase Chain Reactions (PCR) ได้ถูกนามาประยุกต์ใช้และการพัฒนาปรับปรุงวิธี
ต่างๆเพื่อให้สามารถนาไปศึกษาค้นคว้า วิจัยความรู้ใหม่ๆ ตลอดจนการแก้ไขปัญหาที่ไม่อาจทาได้
ในอดีต เนื่องจาก เทคโนโลยีของ PCR ได้ก้าวหน้าไปอย่างรวดเร็ว โดยเริ่มต้นตั้งแต่มีการรายงาน
การเกิด PCR ครั้งแรกในปี 1985 ซึ่งเป็น simple PCR จนกระทั่งในปัจจุบันมีเทคนิคชั้นสูง
(Advanced techniques of PCR) ออกมาใหม่ๆ ให้นามาใช้อยู่มากมาย PCR ชั้นสูงที่ได้มีการ
พัฒนาดัดแปลงเฉพาะเทคนิคพื้นฐานดังต่อไปนี้
 26

1. Multiplex PCR
เป็นเทคนิคการทา PCR ซึ่งทาการเพิ่มขยายดีเอ็นเอเป้าหมายโดยใช้ primer หลายคู่
พร้อมกันในปฏิกิริยาเดียวกันโดย primer แต่ละคู่ที่นามาต้องออกแบบให้ดี ไม่มี
complementary กัน และเมื่อนาไปทา PCR จะให้ผลผลิตที่มีขนาดความยาวที่แตกตางกัน การ
ทา multiplex PCR ต้องปรับสภาวะพอเหมาะของปฏิกิริยา เพื่อให้สามารถเพิ่มขยายจานวนดี
เอ็นเอจากทุก Primer ที่ใส่ลงไปได้เท่ากัน และเนื่องจากในปฏิกิริยานี้จะมี primer หลายคู่
2. Nested PCR
เป็นเทคนิค PCR ที่มีวัตถุประสงค์เพื่อต้องการให้ได้ผลผลิต PCR ที่มากขึ้น เทคนิคนี้ทาได้
โดยอาศัย PCR 2 ขั้นตอนด้วย Primer 2 คู่ โดย primer คู่แรกจะใช้ในตอน PCR ขั้นตอนแรก
และPrimer คู่แรกจะอยู่รอบนอกของดีเอ็นเอที่มีขนาดใหญ่กว่าดีเอ็นเอเป้าหมายแต่มีดีเอน
เป้าหมายอยู่ภายในลาดับเบสของผลผลิตของดีเอ็นเอ หลังจากนั้นนาเอาผลผลิตของ PCR ขั้นตอน
แรกไปทา PCR ขั้นตอนที่สองโดยใช้ primer คูท่ ี่ 2 ซึ่งออกแบบให้สาหรับเพิ่มขยายได้เฉพาะดีเอ็น
เอเป้าหมาย ซึ่งอยู่ถัดเข้าไปจาก primer คู่แรก การทา PCR ขั้นตอนที่สองนั้นอาจทาปฏิกิริยา
25-30 รอบ ในที่สุดก็ได้ผลผลิตดีเอ็นเอเป้าหมายที่เพิ่มขยายจานวนมากตามที่ต้องการเทคนิคนี้
นิยมนาไปใช้ในการประยุกต์เรือ่ งชันสูตรโรค
3. PCR cloning
คุณสมบัติของ PCR ทาให้เราสามารถสร้างดีเอ็นเอที่ต้องการออกมาได้เป็นจานวนมาก ดี
เอ็นเอดังกล่าวนี้สามารถนาไปทา cloning เข้าไปใน plasmid vector, M13 vector หรือ
vector ชนิดอื่นๆได้อาศัยคุณสมบัติการออกแบบ primer ที่เหมาะสม เช่นเพิ่มส่วนที่เป็น
restriction site ก็ทาให้เราสามารถนาเอา PCR นั้นมาตัดด้วย restriction enzyme แล้ว clone
เขาสู่ vector ที่ต้องการได้ การ cloning อาจจะอาศัย primer ที่ออกแบบเป็น blunt end หรือ
sticky end ก็ได้ข้อดีของการใช้ PCR ในการ cloning ก็คือสามารถ clone ได้อย่างรวดเร็วใน
ระยะเวลาอันสั้น โดยได้ fragment ที่ต้องการประหยัดเวลาในการเตรียมดีเอ็นเอตั้งต้นโดยเฉพาะ
อย่างยิ่งเมื่อต้องการ clone gene ที่มีดีเอ็นเอตั้งต้นปริมาณน้อยๆ ส่วนข้อเสียนั้นการโคลน ด้วย
วิธีนี้ และจาเป็นต้องรู้ลาดับหัว-ท้ายของยีนที่ เรากาลังจะโคลน
 27

4. PCR-SSCP
เป็นเทคนิคที่ผสมเอาหลักการของ Single-strand conformation polymorphism
(SSCP) ซึ่งเป็นวิธีที่ใช้ในการตรวจหาการเปลี่ยนแปลงของดีเอ็นเอเพียง 1 bp (base pair) ในสาย
ของดีเอ็นเอสั้นๆ เข้ากับวิธีของ PCR ดังนั้นการทา PCR-SSCP นั้นจะเริ่มจากการเพิ่มขยายดีเอ็น
เอเป้าหมายต้องการศึกษาการเปลี่ยนแปลงของลาดับเบสเพียง 1 bp ในสายของดีเอ็นเอประมาณ
100-500 bp ด้วยวิธี Simple PCR จากนั้นนาเอา PCR product มาทา SSCP นั้นจะอาศัย
หลักการที่ว่า denature PCR product ให้เป็น single strand แล้วจึงนาเอาดีเอ็นเอ นี้ไปแยก
ด้วย non-denaturing gel เพื่อดูการเคลื่อนที่ของดีเอ็นเอ ถ้าดีเอ็นเอสายนั้นมีการเปลี่ยนแปลง
ลาดับเบสไปเพียง 1 bp ก็จะทาใหการเคลื่อนที่ของดีเอ็นเอในเจลแตกตางไปจากเดิม ส่วนใหญ่
ของการทา SSCP นั้นมักจะใช้วิธีการ labeled labeled PCR product ด้วย และแยกบน5%
non-denaturing polyacrylamide gel แล้วทา 32P autoradiography
5. RT-PCR
เป็นเทคนิคการเพิ่มขยายยีนที่สนใจจากอาร์เอ็นเอแม่แบบ โดยหลักการคือ ทาการสกัด
อาร์เอ็นเอใหม่ ความบริสุทธิ์ จากนั้นเขาสู่ขั้นตอนการสังเคราะห์ cDNA โดยกระบวนการ reverse
transcription โดย อาศัย enzyme reverse transcriptase (RT) เอนไซมนี้ทางานโดยสร้างสาย
ดีเอ็นเอได้ทั้งจากแม่พิมพ์ที่เป็นดีเอ็นเอและอาร์เอนเอโดยทั่วไป RT ที่ใช้ในงาน cDNA เป็น
เอนไซม์ที่ได้มาจาก retroviruses สองตัว Avian myeloblastosis (AMV) และ Moloney
murine leukemia virus (MMIV) ซึ่ง RT จากไวรัสทั้งสองตัวมประสิทธิภาพในการสร้าง cDNA
ไม่แตกต่างกัน โดยขั้นตอนนี้อาจใช้ primer ที่เป็นgene specific primer (GSP) ซึ่งเป็น Primers
ที่สามารถใช้ในการสร้างสาย cDNA ที่จาเพาะที่สุด หรือจะใช้ Oligo (Dt) primer ซึ่งการใช้
primer ประเภทนี้จะมีอาร์เอ็นเอจาเพาะที่เป็น Poly (A)+ RNA เท่านั้นที่ถูกนามาใช้เป็นแม่แบบ
ในการสร้างสาย cDNA หรือการใช้ Random primer เป็น primer ที่ไม่มีความจาเพาะ จึง
สามารถเข้าจับกับอาร์เอ็นเอทุกชนิด ดังนั้น cDNA ที่เกิดขึ้นจึงมีความหลากหลายมากที่สุด
 28

จากนั้นเข้าสู้ขั้นตอนสุดท้ายในการทา PCR โดยอาศัยแม่แบบจาก cDNA ที่ถูกสร้างขึ้นมาแล้ว โดย

สร้างสายดีเอ็นเอขึ้นมาใหม่มีลักษณะรูปแบบการทาเหมือน PCR ธรรมดา ในท้ายที่สุดจะได้สายดี
เอ็นเอที่เพิ่ม จานวนมากมายจากสายอาร์เอ็นเอตั้งต้น
6.เทคนิค RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
เป็นการศึกษาการผันแปรของดีเอ็นเอในโครโมโซมของกลุ่มสื่งมีชีวิตชนิดต่าง ๆโดยการตัด
ดีเอ็นเอจาก โครโมโซมด้วย Restriction enzyme ที่เหมาะสมเพื่อให้เกิดเป็นแบบแผนที่จาเพราะ
และมีความแตกต่างใน ระหว่างกลุ่ม หรือสายพันธุ์ของสิ่งมีชีวิตต่าง ๆ แบบแผนของชิ้นดีเอ็นเอที่
ถูกตัดโดย restriction enzyme เหล้านี้จะถูกนามาวิเคราะห์ agarose gel electrophoresis
ในบางกรณีการดูแบบแผนของชิ้นดีเอ็นเอจากเจลไม่สามารถบ่งบอกความแตกต่างของ
แบบแผน เหล่านั้นได้อย่างชัดเจน สามารถนาเอาชิ้นส่วนของดีเอ็นเอหรือยีน หรือลาดับเบสที่
จาเพาะมาเป็นตัวตรวจสอบ (Probe) โดยวิธี southern blot hybridization เช่นการทา
Ribotyping หรือ DNA fingerprinting ทั้ง 2 วิธีสามารถนามาบ่งบอกความแตกต่างของชนิด
หรือความเป็นเอกลักษณ์ของสิ่งมีชีวิตนั้นได้ขึ้นอยู่กับการเลือกใช้ชนิดของ Restriction enzyme
ที่เหมาะสม
7. เทคนิค RAPD (Random amplified polymorphic DNA)\
เป็นการศึกษาการผันแปรของดีเอ็นเอในโครโมโซมของกลุ่ม ชนิดและเอกลักษณ์ของ
สิ่งมีชีวิตเช่นเดียวกัน แต่อาศัยเทคนิคหรือวิธีการที่แตกต่างจาก RFLP กล่าวคือจะอาศัยการเพิ่ม
ขยายชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ โดยอาศย PCR ที่มีการเลือกใช้ primer ของการเพิ่มขยายชิ้นส่วนดีเอ็น
เอที่เป็นชนิดสุ่ม (random primer) หลังจาก การเพิ่มขยายชิ้นส่วนของดีเอ็นเอแล้ว แบบแผนของ
ชิ้นส่วนดีเอ็นเอจะถูกนามาวิเคราะห์โดย agagrose gel electrophoresis เช่นเดียวกัน
ความสามารถในการบงบอกความแตกต่าง หรือความผันแปรในกลุ่มชนิดของสิ่งมีชีวิตได้มากหรือ
น้อยขึ้นอยู่กับชนิดของ primer ที่ใช้ ซึ่งถ้าการสุ่มมีความจาเพาะในส่วนของดีเอ็นเอที่ผันแปรมาก
ก็จะได้แบบแผนที่สามารถบ่งบอกความแตกตางได้มากนั่นเอง
 29

8. เทคนิค Quantitative Realtime PCR

เป็นการนาเทคโนโลยีฟลูออเรสเซนส์ผสมผสานกับการทา Thermal cycling แบบ Rapid
PCR ทาให้ สามารถเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมไปพร้อมกับการคานวณ และวิเคราะห์ผลในเวลา
เดี่ยวกันภายในหลอดทดลอง ในระยะเวลาอันสั้น โดยจะตรวจตามผลจากสัญญาณฟลูออเรสเซนส์
ที่เกิดขึ้นระหว่างทา PCR นอกจากนี้ยังสามรถทา Melting curve analysis สาหรับตรวจหาการ
กลายพันธุ์ (Mutation detection) และหาคุณลักษณะของผลิตภัณฑ์ PCR ได้ในเวลาอันรวดเร็ว
อีกด้วย
นอกจากนี้ยังสามารถนาไปประยุกต์ใช้กับการใช้งานเพื่อวัตถุประสงค์ต่าง ๆ ได้มากมาย
เช่น การ ตรวจหาและแก้ไขการเกิดการเพื่มปริมาณของดีเอ็นเอบริเวณที่ไม่จาเพาะ (Non-
specific amplification), การจาแนก Genotype ได้โดยไม่ต้องทาการแยกหาลาดับนิวคลีโอไทด์
(Sequencing Electrophoresis), การตรวจหาการเกิด Point Mutation และปัจจุบันยังเพิ่ม
คุณสมบัติ Dual-color detection เมื่อนามาใช้ร่วมกับ Color- compensation software ทา
ให้สามรถศึกษาการเกิดการกลายพันธุ์ที่มีความซับซ้อนมากยิ่งขึ้นได้อีกด้วย
 30

อ้างอิง
http://research.police.go.th/index.php/datacenter/research/2558/-2552-1/78--2552-
1/file
http://dmsc2.dmsc.moph.go.th/brdfiles/PCR%20%E0%B8%81%E0%B8%B4%E0%B
8%9A%E0%B9%84%E0%B8%97%E0%B8%A2.pdf
http://qsds.go.th/newqsds/file_upload/2014-07-04-7.pdf
https://home.kku.ac.th/uac/journal/year_10_2_2545/01_10_2_2545.pdf