LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới giảng viên, PGS.TS Trần Thu
Hương. Cô là người đã tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ em ngay từ những ý tưởng đầu
tiên về đề tài cho đến dòng cuối của đồ án. Chính sự tận tâm và nhiệt tình của cô
đã giúp em hiểu hơn về vấn đề, mở ra nhiều hướng tiếp cận đề tài nghiên cứu,
giúp em hoàn thiện bản thân mình trong chuyên môn cũng như kỹ năng viết.

Em cũng xin đặc biệt cảm ơn đến các anh chị trong Phòng Nghiên cứu và
ứng dụng hóa sinh, Trung tâm Nghiên cứu và chuyển giao công nghệ, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tích cực giúp đỡ chỉ dạy em trong quá
trình làm đề tài.

Tôi sẽ luôn ghi nhớ các bạn bè lớp Hóa Học-K60 đã luôn giúp đỡ, trao đổi,
góp ý cũng như cung cấp nhiều tài liệu cho đồ án tốt nghiệp này.

Tôi xin gửi lời tri ân đến gia đình và bạn bè đã luôn đồng hành, động viên,
khích lệ tôi trên con đường học tập. Hơn tất cả, tôi xin trân trọng cảm ơn bản thân
mình vì đã kiên trì nỗ lực hoàn thành con đường học vấn và đề tài này.

Và cuối cùng, với tất cả lòng vị tha, mong thầy cô và bạn đọc thông cảm,
chia sẻ và giúp đỡ tôi khắc phục những hạn chế trong đề tài này.

Hà Nội, ngày 17 tháng 06 năm 2019

Nội dung
DANH MỤC HÌNH VẼ ..................................................................................................3

DANH MỤC SƠ ĐỒ .......................................................................................................4

DANH MỤC BẢNG BIỂU .............................................................................................5

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................................................6

LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...........................................................................................1

1.1. Vài nét về họ Caprifoliaceae (Kim Ngân) ................................................................ 1

1.2. Cây kim ngân (Lonicera japonica Thunb) ............................................................... 4

1.3. Tổng quan về Lignan .............................................................................................. 26

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 34

2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 34

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................34

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .....................................................................................42

3.1. Thiết bị và hóa chất. ............................................................................................... 42

3.2. Chiết mẫu thực vật ..................................................................................................43

3.3. Phân lập và tinh chế các chất từ cao chiết etyl axetat của cây Kim ngân ..............45

3.4. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của chất đã phân lập được .....................................46

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 48

4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được .......................................................48

KẾT LUẬN ...................................................................................................................57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 58

DANH MỤC HÌNH VẼ

STT Tên hình vẽ Trang

1 Hình 1.1. Cây Kim ngân 13

2 Hình 1.2. Hoa Kim ngân. 14

3 Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của 1 54

4 Hình4.2. Phổ 13C-NMR của 1 54

5 Hình 4.3. Phổ DEPT của 1 55

6 Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của 2 58

7 Hình4.5. Phổ 13C-NMR của 2 58

8 Hình 4.3. Phổ DEPT của 2 59

 DANH MỤC SƠ ĐỒ

STT TÊN SƠ ĐỒ TRANG

Sơ đồ 4.1. Quy trình chiết các lớp chất từ mẫu

1 45
Kim ngân

2 Sơ đồ 4.2. Quá trình phân tách cặn EtoAc 47

DANH MỤC BẢNG BIỂU

STT Tên bảng biểu Trang

1 Bảng 4.1. Các dữ liệu phổ 1H- NMR và 13C- NMR của 55
hợp chất 1

2 Bảng 4.2. Các dữ liệu phổ 1H- NMR và 13C- NMR của 58
hợp chất 2
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

 Các phương pháp sắc kí

CC Column chromatography Sắc kí cột
FC Fast chromatography Sắc kí nhanh

Mini- C Mini chromatography Sắc kí cột tinh chế

TLC Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng

 Các phương pháp phổ

IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại

EI-MS Electron Mass Spectrometry Phổ khối lượng va chạm điện tử

ESI-MS Electron Ionization Mass Phổ khối lượng phun bụi

Spectrometry điện tử
1
H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt
Resonance Spectrometry nhân proton
13
C-NMR Carbon -13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt
Resonance Spectrometry nhân carbon-13

DEPT Distortionless enhancement Phổ DEPT

by polarization transfer

GC-MS Chromatography Mass Spectometry Sắc kí ghép khối phổ

𝛿(ppm) Chemical shift (parts per million) Độ chuyển dịch hóa học

J (Hz) Coupling constant ( Hertz) Hằng số tương tác ( Hertz)

s singlet

d doublet

dd doublet- doublet
m mutiplet

 Hoạt tính sinh học

MIC Minimal Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu
 LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, mức sống của
con người ngày càng được nâng cao hơn. Đặc biệt, trong lĩnh vực y – dược học,
từ những năm đầu của thế kỉ XIX, việc kết hợp giữa các phương pháp khoa học
kỹ thuật và các loại thực vật xuất phát từ thiên nhiên đã đưa con người tiến một
bước lớn trong việc phát minh ra nhiều loại thuốc, có khả năng chữa nhiều căn
bệnh được cho là nan y ở các thế kỉ trước đó.

Lignan là một trong những khám phá mang tính tích cực của con người.
Giới khoa học đang tiếp tục nghiên cứu sâu về các lignan vì những lợi ích bất ngờ
cho cơ thể con người và khả năng tham gia vào nhiều vấn đề sức khỏe. Chế độ ăn
giàu Lignan có lợi rất tốt cho sức khỏe, đặc biệt nếu được tiêu thụ suốt đời. Bằng
chứng thực nghiệm ở động vật đã cho thấy tác dụng chống ung thư rõ ràng của
lignans. Bên cạnh đó, lignan còn mang lại nhiều hoạt tính sinh học, nổi bật là hoạt
tính gây đọc với tế bào ung thư.
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, vì thế mà tài nguyên cây
thuốc của nước ta vô cùng phong phú, trong đó có nhiều loài giữ vai trò quan
trọng trong cuộc sống của con người. Từ lâu đời, các dân tộc ở Việt Nam đã biết
sử dụng cây cỏ làm thức ăn, làm thuốc chữa bệnh và còn dùng vào nhiều việc
khác. Chỉ tính riêng về cây thuốc ở Việt Nam, hiện đã biết tới trên bốn ngàn loài.
Mỗi vùng miền, mỗi dân tộc lại có các loài cây thuốc, cũng như cách sử dụng cây
thuốc theo các kinh nghiệm truyền thống khác nhau. Mặc dù vậy, do kết quả của
quá trình giao lưu, quảng bá và học tập lẫn nhau, đã có rất nhiều cây thuốc và bài
thuốc được nhiều người và nhiều nơi cùng biết tới – Kim ngân là vị thuốc như
vậy. Dược liệu Kim ngân hoa là hoa của loài Kim ngân hoa (Lonicera
japonica Thunb.) được phơi hay sấy khô. Đây là vị thuốc cổ truyền, trong Y học
cổ truyền dùng riêng hay dùng phối hợp, để chữa các bệnh như mụn nhọt, mẩn
ngứa, dị ứng, sởi, cảm cúm, viêm phổi, viêm gan [3]. Tuy nhiên, trên thực tế người
ta sử dụng hoa khô của nhiều loài thuộc chi Kim ngân (Lonicera L.), họ Kim
ngân (Caprifoliaceae), với tên “Kim ngân hoa”. Ở Việt Nam, trong số các loài
Kim ngân đã biết, loài Kim ngân hoa (L. japonica Thunb.) được nhắc tới nhiều
nhất [7]. Theo một số nghiên cứu khảo sát sự phân bố của các loài thuộc chi Kim
ngân Lonicera L tại Việt Nam khá rộng. Việc tập trung nghiên cứu, tìm hiểu hóa
dược của cây kim ngân là cần thiết, có lợi, tận dụng được nguồn nguyên liệu sẵn
có. Xuất pháp từ những lý do đó chúng tôi tiến hành nhiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu phân lập một số hợp chất Lignan từ kim ngân ( Lonicera
japonica Thumb.)”
Để góp phần nghiên cứu và phân lập một số hợp chất Lignan của cây kim
ngân các nhiệm vụ được đặt ra:

1- Xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phần chiết chứa
các hợp chất hữu cơ thiên nhiên từ cây kim ngân.

2- Nghiên cứu quy trình phân tích và phân tách các phần chiết nhận được
từ cây kim ngân.

3- Phân lập các hợp chất trong các phần chiết nhận được
4- Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập.
 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về họ Caprifoliaceae (Kim Ngân)

1.1.1. Đặc điểm thực vật

Caprifoliaceae là danh pháp khoa học để chỉ một họ thực vật có hoa, trong
một số tài liệu bằng tiếng Việt gọi là họ Cơm cháy, nhưng tên gọi này hiện nay
không thể coi là chính xác nữa khi các loài cơm cháy có tên gọi khoa học chung
là Sambucus đã được APG II xếp vào họ Adoxaceae cùng bộ. Tên gọi họ Kim
ngân là chính xác hơn do các loài kim ngân (nhẫn đông) có danh pháp Lonicera,
đồng nghĩa: Caprifolium vẫn còn trong họ này cho dù hiểu theo bất kỳ hệ thống
phân loại nào và theo bất kỳ định nghĩa nào (rộng hay hẹp) cho họ. Hơn nữa, tên
gọi khoa học của họ có nguồn gốc từ một trong số các từ đồng nghĩa của
chi Lonicera, nên tên gọi họ Kim ngân là hoàn toàn hợp lý.

Thế giới có 16 chi và 400 loài, phân bố chủ yếu ở bán cầu Bắc, ít có ở Đông
Nam Á, châu Úc và Nam Mỹ. Việt Nam có 4 chi và khoảng 25 loài.

Đặc điểm thực vật: Cây dây leo, cây bụi hay cây gỗ nhỏ hoặc cỏ. Lá mọc
đối, đơn hay kép lông chim, ít khi kép 3, không có lá kèm. Phần lớn có gỗ mềm và
có tủy rộng, đôi khi có tuyến mật trên cuống lá. Cụm hoa xim 2 ngả, dạng ngủ.
Hoa lưỡng tính, đều hay đối xứng 2 bên, mẫu 4 - 5, cánh hoa hợp thành ống và
thành 2 môi, các thùy thường xếp lợp. Nhị đẳng số, đính trên ống tràng và xen kẽ
với thùy tràng. Bộ nhụy gồm (8)5-2 lá noãn hợp thành bầu hạ hay thường là bầu
trung. Bầu 5-1 ô, mỗi ô chứa 1 -nhiều noãn đảo và treo. Khi nở, 1 môi quặt lại rất
rõ. Quả mọng, nang hay hạch. Hạt có phôi nhỏ và nội nhũ nạc lớn. Các
chi Diervilla và Weigela có quả nang.

1.1.2. Chi Lonicera ( Kim ngân )

Theo một số quan điểm trước thì trong họ Caprifoliaceae lại chia ra các
phân họ:
+ Diervilleae: gồm các chi Weigela, Diervilla.

1
 + Lonicereae: gồm các chi Leycesteria, Lonicera.
+ Triostomeae: gồm các chi Triosteum.

+ Linnaeeae: gồm các chi Symphoricapos, Linnaea, Dipelta, Heptacodium,

Kolkwitzia, Abelia, Zabelia.

Trong “Flowering Plants”, Năm 2009, tái bản lần thứ II có sửa chữa, của
Tác giả A. Takhtajan vẫn theo quan điểm của các nhà Thực vật học đi trước, đặc
biệt là việc ra đời hệ thống phân loại của A.L. de Jussieu năm 1789 [23]. A.
Takhtajan đặt tên họ Caprifoliaceae trên cơ sở hợp nhất 3 họ Diervillaceae Pyck
1998; Linnaeaceae Backlund 1998 và Loniceraceae Vest 1818 với tổng số gồm
275-300 loài của 12 chi [23,24,25]. Mặc dù vậy, Ông có đôi chút thay đổi trong
quan điểm của mình về hệ thống phân loại họ Caprifoliaceae, khi vẫn chia họ này
ra thành các phân họ, tuy nhiên các chi thuộc mỗi phân họ có sự thay đổi. Cụ thể
như sau:
+ Diervilleae: Weigela, Diervilla

+ Lonicereae: Leycesteria, Lonicera, Heptacodium, Symphoricarpos

+Triostomeae: Triosteum

+ Linnaeeae: Linnaea, Dipelta, Kolkwitzia, Abelia, Zabelia.

Sự thay đổi đó là ông xếp chi Heptacodium và Symphoricarpos từ phân họ

Linnaeeae sang phân họ Lonicereae. Trong đó tiêu chí để phân ra chi Lonicera là
tập hợp những loài có đặc điểm chung như sau: Bầu hạ, vòi nhụy dài, chủ yếu với
một đầu nhụy hình đầu. Chủ yếu là cây thân gỗ, hiếm khi thân thảo. Dạng cây
chủ yếu là cây bụi hoặc cây leo gỗ.

Có thể nói, trong thế kỉ XVIII, XIX là thời kì bắt đầu và phát triển rất mạnh
của Thực vật học, có rất nhiều quan điểm, nhiều trường phái khác nhau trong việc
xếp chi Lonicera vào họ nào, phân họ nào, ngay cả họ Caprifoliaceae có những
phân họ nào cũng có những sự khác nhau rất rõ rệt. Nhưng theo quan điểm của
đa số các nhà thực vật học nổi tiếng trên thế giới thì vẫn ủng hộ quan điểm của
Linnaeus và Jussieu đó là xếp chi Lonicera nằm trong họ Caprifoliaceae.
2
 Chi Kim ngân hay còn gọi là chi nhẫn đông (danh pháp khoa
học: Lonicera, đồng nghĩa: Caprifolium Mill.) là chi thực vật gồm một số loài cây
bụi hoặc dây leo trong họ Kim ngân (Caprifoliaceae) thực vật bản địa của Bắc
bán cầu. Có khoảng 180 loài kim ngân, ở Trung Quốc có độ đa dạng cao nhất với
hơn 100 loài, châu Âu và Bắc Mỹ mỗi nơi có khoảng 20 loài. Các loài phổ biến
gồm có Lonicera periclymenum (kim ngân châu Âu), Lonicera japonica (kim
ngân trắng hay kim ngân Nhật, phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam)
và Lonicera sempervirens. Kim ngân rất thu hút chim ruồi.

Lá kim ngân mọc đối, hình bầu dục, dài từ 1 đến 10 cm. Đa số các loài kim
ngân có lá sớm rụng, nhưng một số là cây thường xanh. Nhiều loài có hoa thơm,
hình chuông, trong có chứa mật ngọt ăn được. Khi bẻ cuống hoa sẽ thấy mùi
hương thơm. Quả kim ngân là loại quả đơn (mỗi quả phát triển từ một noãn) màu
đen, xanh lam, hoặc đỏ, trong có chứa vài hạt. Quả của đa số các loài kim ngân
có chứa chất độc nhẹ, một số loài (nổi tiếng nhất là Lonicera caerulea) có quả ăn
được.

Một số loài kim ngân được dùng làm thuốc Đông y như Lonicera
confusa[1] và Lonicera japonica.

Về cơ bản các tác giả khi nghiên cứu phân loại chi Lonicera đều
thống nhất mô tả đặc điểm chung của chi Lonicera, họ Caprifoliaceae như sau:
Cây bụi đứng hay bụi trườn, đôi khi là dạng leo; rụng lá hoặc thường xanh.
Cành rỗng với lõi màu trắng hoặc nâu; có chồi ngủ mùa đông, với 1 hoặc vài cặp
lá vảy. Lá mọc đối, hiếm khi mọc vòng, nguyên, hiếm khi xẻ răng cưa, lá kèm ở
giữa cuống lá vắng hoặc hiếm khi phát triển tốt. Cụm hoa dạng chùy, mọc ở nách
lá hoặc đầu cành, dày đặc hoặc thưa thớt, cụm hoa dạng xim 1 -, 2 - , hoặc 3 hoa.
Cụm hoa dạng xim đôi khi có cuống; hoặc không cuống, đôi khi hình thành cụm
hoa dạng đầu. Đài hoa 5 thùy. Cánh hoa màu trắng, màu vàng, đỏ, tím đỏ, thường
xuyên thay đổi màu sắc sau khi nở hoa, hình chuông, được mở rộng dần dần, 5
thùy, cánh hoa chẻ đôi và trên 4 thùy; ống dài hay ngắn. Nhị hoa 5, bao phấn đính

3
lưng. Buồng trứng 2 hoặc 3 (-5) ngăn; có lông hoặc nhẵn. Trái cây mọng, màu đỏ,
đen, hoặc màu xanh, đôi khi có phủ phấn trắng, thỉnh thoảng còn giữ lại lá bắc
con cùng với quả. Hạt từ 1 đến rất nhiều.

1.2. Cây kim ngân (Lonicera japonica Thunb)

Cây kim ngân còn có tên khác là: Dây nhẫn đông, Bóoc kim ngân (Tày),
Chữa giang khẳm (Thái), tên tiếng Anh là Japanese honeysuckle, Pháp là
Chèverfeuille du japon. Phân loại khoa học là

Giới: Plantae

Bộ: Dipsacales

Họ: Caprifoliaceae

Chi: Lonicera

Loài: Lonicera japonica

1.2.1. Đặc điểm thực vật

Dạng sống dây leo, thân non màu xanh hơi nâu, thân già màu nâu. Toàn
cây có lông màu vàng gồm lông che chở và lông tiết. Lá đơn, mọc đối. Phiến lá
hình trứng dài hoặc hơi bầu dục, đỉnh nhọn, gốc tròn, dài 5-7 cm, rộng 2,5-3,5 cm,
xanh đậm ở mặt trên, nhạt hơn ở mặt dưới. Gân lông chim, 3-4 cặp gân phụ, nổi
rõ ở mặt dưới. Cuống lá ngắn 7-9 mm, hình lòng máng, phình ra thành bờ mỏng
ôm thân. Cụm hoa dạng xim hai hoa mọc ở nách lá. Hoa không đều, lưỡng tính,
màu trắng khi mới nở, về sau chuyển sang màu vàng. Cuống hoa ngắn, gần như
không có. Trục phát hoa màu xanh, ngắn 2-3 mm ở các hoa cùa cành xa gốc, dài
(2,5-3 cm) hơn ở các hoa của cành gần gốc. Lá bắc hơi bầu dục, đỉnh nhọn, xanh
đậm ở mặt trên, nhạt hơn ở mặt dưới, dài 12-14 mm, rộng 5-6 mm. Lá bắc con 2,
hình tròn, đường kính gần 1,5 mm, nhiều lông dài. Đài hoa 5, rời, đều, hình tam
giác có mũi nhọn, màu xanh, dài 1-1,5 mm, tiền khai van. Tràng hoa 5, dính nhau
bên dưới thành ống bên trên chia 2 môi 4/1, ống và môi dài gần như nhau 2,2-2,5
cm, môi trên chia 4 thùy ngắn (6 mm) đều nhau, mặt ngoài cánh hoa có lông; tiền

4
khai ngũ điểm (Hình 4.18 I). Bộ nhị 5 nhị, rời, đều, đính gần miệng ống tràng,
xen kẽ cánh hoa; chỉ nhị hình sợi, màu trắng, dài 2,4-2,5 cm, có gai nhỏ; bao phấn
2 ô, hình thuôn dài, màu vàng, dài 4-5 mm, đính giữa, nứt dọc, hướng trong; hạt
phấn hình tam giác, có khuyết lõm, màu vàng, dài 60-70 µm. Bộ nhụy 3 lá noãn
dính nhau thành bầu dưới 3 ô, dài 1,5 mm, mỗi ô nhiều noãn, đính noãn trung trụ;
vòi nhụy hình sợi, màu trắng đỉnh màu xanh, dài 5-5,5 cm; đầu nhụy hình cầu,
màu xanh, bề mặt chia 3 khía.

1.2.2. Nguồn gốc và phân bố

Chi Lonicera L. có khoảng 10 loài ở Việt Nam, tất cả đều dùng làm thuốc.
Kim ngân hay nhẫn đông (danh pháp hai phần: Lonicera japonica) là loài thực vật
bản địa của miền Bắc Việt Nam, Trung Quốc (Hoa Bắc, Hoa Đông và Đài
Loan), Nhật Bản, Triều Tiên. Cây kim ngân mọc khá phổ biến ở miền Bắc Việt
Nam và được trồng rộng khắp tại Việt Nam. Tại một số nước, kim ngân là loài
cây xâm thực.
Mùa hoa: tháng 3-5, mùa quả: tháng 6-8.

Hình 1.1. Cây Kim ngân.

5
 Hình 1.2. Hoa Kim ngân.

1.2.3. Hóa thực vật của cây kim ngân

Cho đến nay, hơn 140 hợp chất đã được phân lập và xác định từ Lonicera
japonica. Một trong những thành phần hóa học quan trọng, tinh dầu được phân
tích thông qua phương pháp GC- MS, và các hợp chất chính thu được là linalool,
axit hexadecanoic, axit octadecadienoic, ethyl palmitate và dihydrocarveol. Đồng
thời, Lonicera japonica có rất nhiều flavones, axit hữu cơ, saponin triterpenoid và
iridoids (Bảng 2 và Hình 2). Một số trong số chúng hiển thị nhiều hoạt tính sinh
học in vivo hoặc in vitro (Bảng 3). Và các thành phần hóa học khác nhau của
Lonicera japonica sẽ cung cấp nền tảng tốt cho các nghiên cứu dược lý khác nhau.

6
1.2.3.1. Tinh dầu
Là một trong những thành phần quan trọng, tinh dầu tồn tại trong các bộ
phận trên không của Lonicera japonica, hoa (tươi và khô), lá và dây leo. Do môi
trường sống khác biệt, thời gian thu hoạch, bộ phận dược liệu, phương pháp chiết
xuất và chế biến, hàm lượng và thành phần của tinh dầu là khác nhau.

a, Môi trường sống khác nhau

Từ hoa khô của Lonicera japonica ở tỉnh Hà Nam (Trung Quốc), 27 hợp
chất đã được xác định, chủ yếu bao gồm aromadendrene, linalool và geraniol, và
hầu hết chúng thuộc về monoterpen và sesquiterpen. Nhưng từ hoa khô của
Lonicera japonica ở tỉnh Sơn Đông (Trung Quốc), hơn 65 hợp chất đã được xác
định, hợp chất chính là axit hexadecanoic và các hợp chất khác là aldehyd, ketone,
axit, este, v.v. (Wang, 2010). Năm 2009, Lin (2009) phát hiện ra rằng các hợp
chất chính của tinh dầu ở tỉnh Phúc Kiến (Trung Quốc) là axit hexadecanoic,
methyl linolenate, methylpalmita, v.v. Đồng thời, Ikeda và cộng sự đã nghiên cứu
các thành phần dễ bay hơi của tinh dầu từ hoa của Lonicera japonica tại Nhật Bản
với phương pháp GC-MS. 150 hợp chất, được tạo thành từ 36 hydrocacbon, 28
rượu, 21 aldehyd, 12 ketone, 38 este, 15 hợp chất khác đã được xác định. Các
thành phần quan trọng đặc trưng cho các chất bay hơi của hoa kim ngân được xác
định là linalool, (Z) -jasmone, (Z) -jasmin lactone, methyl jasmonate và methyl
epi-jasmonate. Ngoài ra, những thay đổi của các thành phần dễ bay hơi phát ra từ
những bông hoa sống suốt cả ngày đã được điều tra bằng phân tích không gian
động bằng cách sử dụng GC và GC-MS, và mùi mạnh nhất được phát hiện vào
giữa đêm (Ikeda và cộng sự, 1994). Năm 2010, Feng (2010) đã xác định hàm
lượng axit chlorogen từ Lonicera japonica trong các môi trường sống khác nhau
bằng TLC. Kết quả cho thấy thành phần lần lượt là 3,43%, 3,14%, 1,62% và
2,11% ở Sơn Tây, Sơn Đông, Hồ Bắc và Hà Nam. Vì vậy, môi trường sống khác
biệt sẽ thay đổi tỷ lệ của các hợp chất hóa học. Và các thành phần hóa học có mối
quan hệ mạnh mẽ với môi trường phát triển của y học cổ truyền Trung Quốc.

7
 b, Thời gian thu hoạch khác nhau
Yang và Zhao (2007) đã điều tra các thành phần của tinh dầu từ Lonicera
japonica thu hoạch từ giữa tháng Sáu và tháng Tám. Kết quả cho thấy 32, 54 và
74 hợp chất đã được xác định bởi GC- MS từ hoa vào tháng Sáu, tháng Bảy và
tháng Tám tương ứng. Các thành phần chủ yếu tăng là số phân tử thấp và các hợp
chất điểm sôi thấp. Nhưng các hợp chất có hàm lượng cao tương tự nhau mỗi
tháng, đó là linalool (13,47%, 13,47%, 7,92%), dibutylphthalate (10,26%, 7,54%,
7,67%) và carvacrol (7,92%, 10,09% và 6,67%). Sau đó, nồng độ axit chlorogen
cao nhất được tìm thấy ở giai đoạn ra hoa trắng thứ hai và ra hoa trắng hoàn toàn.
Kết quả chỉ ra rằng thời điểm tốt nhất để thu hoạch hoa Lonicera japonica cho
tinh dầu là giai đoạn ra hoa bạc và đối với axit chlorogen là giai đoạn ra hoa trắng
thứ hai hoặc trắng hoàn toàn (Wang et al., 2009).
c, Các chất đã thu được

Hơn 140 hợp chất thu được có thể kể đến là Chlorogenic acid và
Isochlorogenic acid (Yip et al. (2006), Caffeic acid (Choi et al. (2007)),
Hexadecanoic acid và Myristic acid (Huang et al. 1996), Iwanhashi and Negoroy
(1986) đã thu được các chất 3,5-O-dicaffeoylquinic acid, 4,5-O-dicaffeoylquinic
acid, 3,4-O-dicaffeoylquinic acid, 1,3-O-dicaffeoylquinic acid, 3-
Ferulicoylquinic, 4-Ferulicoylquinic. Năm 2009 Qi và cộng sự đã thu được 6 chất
mới từ cây kim ngân là 5-O-caffeoylquinic acid, 4-O-caffeoylquinic acid,
Caffeoyl-CH2-O-quinic acid, 1,5-O-dicaffeoylquinic acid, 1,4-O-dicaffeoylquinic
acid, Methylated dicaffeoylquinic acid.

Năm 2007 Choi và cộng sự từ hoa kim ngân đã thu được Oleanolic acid

28-α-O-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl(1→6)]-β-D-glu-
copyranosyol ester. Từ nụ hoa kim ngân người ta đã thu được 3,5-O-
dicaffeoylquinic acid methyl ester, Methyl chlorogenate (Lee et al. 2010), 3-O-
caffeoylquinic acid butyl ester ( Ren et al. 2008), 3-O-caffeoylquinic acid, 3-
caffeoylquinic acid methyl ester, 3,5-dicaffeoylquinic acid buthyl ester bởi Peng

8
et al. (2000), Vanillic acid 4-O-β-D-(6-O-benzoylglucopyranoside) bởi Lee et al.
(2010), Protocatechuic acid bởi Choi et al. (2007) và Yip et al. (2006),
Chlorogenic acid butyl ester bởi Wang (2008c), Chlorogenin tetraacetate bởi Lou
et al. (1996), 5-Feruloylquinic acids được tách bởi Shanghai Institute of
Pharmaceutical Industry (1975), Methyl 3,5-di-O-caffeoylquinic acid, Methyl
3,4-di-O-caffeoylquinic acid bởi Chang et al. (1995), Caffeic acid methyl ester
bởi Ma et al. (2005) ………

1.2.3.2. Axit hữu cơ

Axit hữu cơ là một thành phần quan trọng khác của Lonicera japonica, và
nó chủ yếu chứa axit chlorogen (1), axit isochlorogen (2), axit caffeic (3), axit
hexadecanoic (4), v.v. (Zhang et al., 2000). Năm 1996, axit hexadecanoic (4) và
axit myristic (5) đã được phân lập từ chiết xuất chloroform của Lonicera japonica
(Huang và cộng sự, 1996), và axit tetraacetyl-phthalein được chiết xuất từ dịch
chiết của Lonicera japera et al., 1996). Đồng thời, sáu chất đồng phân của axit
isochlorogen đã được xác định, bao gồm axit 3,5-O-dicaffeoylquinic (6), axit 4,5-
O-dicaffeoylquinic (7), axit 3,4-O-dicaffeoylquinic (8), 1,3-O-dicaffeoylquinic
acid (9), 3-ferulicoylquinic (10) và 4 - ferulicoylquinic (11) (Iwanhashi và
Negoroy, 1986). Là một thành phần hoạt tính sinh học chính của hoa, axit
chlorogen (1) đã được chú ý nhiều. Các nghiên cứu cho thấy axit chlorogen có
hoạt tính kìm khuẩn mạnh hơn đối với vi khuẩn Gram âm so với vi khuẩn gram
dương. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của axit chlorogen (1) đối với shigella và
salmonella là 0,125 mg/ml, gần như tương đương với 0,1 mg/ml kanamycin (Xu,
2008). Và các giá trị MIC kháng khuẩn lại với vi khuẩn Escherichia coli, Sarcina
luteus, Bacillus subtillis và Staphylococcus aureus là 0,025 g/ml, 0,025 g/ml, 0,1
g/ml và 0,8 g/ml (Wu, 2005). Trong khi đó, với liều 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,4
mg/ml, 0,8 mg/ml và 0,8 mg/ml, axit chlorogen (1) đã thể hiện hoạt tính kháng
virut đáng kể đối với virut hợp bào hô hấp, virut coxsackie B3 - liên kết 7 virus,
3 virus liên quan đến adeno và virus Coxsackie B5 tương ứng (Hu et al., 2001).

9
Liều độc 0%, nồng độ hiệu quả tối thiểu và chỉ số điều trị so với cytomegalovirus
ở người lần lượt là 100 𝜇G/ml, 1 𝜇G/ml và 100 (Chen và cộng sự, 2009).

10
11
 Quercetin 3-O-β-D glucopyranoside

Isorhamnetin 3- O-β-D glucopyranoside

Luteolin 7-O-β-D glucopyranoside

12
1.2.3.3. Flavones

Cho đến nay, khoảng 30 flavones đã được phân lập từ Lonicera japonica. Gao và
Mu (1995) phân lập quercetin-3-O-β-D-glucoside, luteolin-7-O-α-D-glucoside,
luteolin-7-O-β-D-galactoside và hyperoside từ chiết xuất n-butanol. Corymbosin
và 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxylflavone được phân lập từ các chiết xuất
chloroform (Huang và cộng sự, 1996). Năm 2005, Kumar và cộng sự cô lập hai
biflavone mới, 3’-O-methyl loni-flavone [5,5”,7,7” -tetrahydroxy 3’ -methoxy 4’,
4’”-biflavonyl ether] và loniflavone [5,5”,7,7”,3’-Pentahydroxy 4’,4”’-
biflavonyl ether], từ lá của Lonicera japonica ở Ấn Độ (Kumar et al., 2005). Đồng
thời, phương pháp so màu được sử dụng để so sánh hàm lượng của flavones từ

13
môi trường sống khác nhau. Kết quả cho thấy hàm lượng thu được hơn 4,31% từ
Lonicera japonica ở Rizhao (Sơn Đông). Và hàm lượng lần lượt là 1,83%, 2,02%,
2,47% và 0,65% tại Pinyi (Sơn Đông), Fenqiu (Hà Nam), Xinmi (Hà Nam) và
Nanjin (Giang Tô). Xing và cộng sự (2002) đã sử dụng phương pháp quang phổ
tử ngoại để xác định hàm lượng flavones trong các bộ phận khác nhau của cây.
Kết quả chỉ ra rằng hàm lượng trong lá là cao nhất và một số bộ phận là hoa, thân
và sự phân phối của flavones cũng tương tự như axit hexadecanoic (4). Vì vậy, lá
và hoa của Lonicera japonica cũng sẽ được sử dụng trong TCM để điều trị các
bệnh khác nhau.

Do khó khăn trong việc tách và tinh chế flavone, các tác dụng dược lý của
các hợp chất này đã không được nghiên cứu một cách có hệ thống, ngoại trừ
hyperoside và chiết xuất thô. Tang (2008) đã phát hiện ra rằng hyperoside kết hợp
với β-Lactams hoặc quinolone có thể tăng cường tác dụng kháng khuẩn đối với
một số vi khuẩn gây bệnh phổ biến. Ở sub-MIC (<0,5 mg / ml), hyperoside có thể
tăng cường tác dụng kháng khuẩn của quinolone ưa nước đối với vi khuẩn
SA26592 (pUT-norA). Nó cũng có thể làm giảm tổn thương tế bào do CCl 4 gây
ra trong tế bào gan L-02 với việc giảm ALT, AST và MDA, và tăng GSH và tỷ lệ
sống sót của tế bào. Nó cũng cho thấy một tác dụng bảo vệ gan đáng kể ở chuột
bị nhiễm CClb. Các chỉ số sinh hóa và kiểm tra mô bệnh học gan của chuột được
điều trị bằng hyperoside 30 mg/kg gần như tương tự với động vật bình thường.

1.2.3.4. Iridoids
Trong những thập kỷ qua, hơn 30 iridoids đã được tìm thấy từ Lonicera japonica
và HPLC với máy dò tán xạ ánh sáng bay hơi hoặc phát hiện đa phổ có thể được
sử dụng để phân tích các hợp chất này. Năm 2008, 9 iridoids là loganin, sweroside,
secoxyloganin, secologanin, kingiside, ketologanin, 7α-morroniside, 7β-
morroniside và secologanoside, với 12 alkcaloit muối bên trong pyridinium
lonijaposides A-L được phân lập từ nụ hoa. Và trong một thử nghiệm in vitro,
lonijaposide C cho thấy hoạt động ức chế chống lại sự giải phóng glucuronidase

14
trong bạch cầu đa nhân của chuột (PMNs) do yếu tố kích hoạt tiểu cầu (PAF) gây
ra với tỷ lệ ức chế 69,5% ở mức 10𝜇M ,trong khi các hợp chất lonijaposide A và
B cung cấp cho các hoạt động ức chế với tỷ lệ ức chế 11,0% và 35,8% ở cùng
nồng độ, tương ứng. Điều này cho thấy rằng đơn vị ethanol-2-yl ở N-1 và dạng
axit của C-11 có thể làm tăng hoạt động (Song và cộng sự, 2008). Sau đó, bốn
glycoside iridoid mới, được đặt tên là L- phenylalaninosecologanin, 7-O-(4-β-D-
glucopyranosyloxy-3-methoxy-benzoyl) secologanolic acid, 6’-O-(7-α
hydroxysweros và (Z)-aldsecologanin cũng được phân lập, cùng với một loại đã
biết, mới được đặt tên (E)-aldosecologanin được phân lập từ thân và lá (Machida
et al., 2002). Từ những nụ hoa khô của Lonicera japonica, 10 iridoids và
loniceracetides A, B (secoiridoid glycoside) đã được xác định (Kakuda et al.,
2000).

Sử dụng dược điển hỗ trợ, Ehrman và cộng sự (2010) sàng lọc các hợp chất
có thể hoạt động chống lại bốn mục tiêu liên quan đến kháng viêm. Kết quả cho
thấy iridoids, là thành phần hoạt động, đã trình bày khả năng chống viêm rõ rệt
chống lại COX, P38 và JNK. Đồng thời, các nghiên cứu dược lý cho rằng iridoids
cũng có khả năng chống khối u, chống viêm, hoạt động chống oxy hóa và tác dụng
bảo vệ gan tốt (Shang, 2010).

1.2.3.5. Saponin

Hầu hết các saponin từ Lonicera japonica thuộc loại oleanane và

hederagenin. Năm 1988, Kawai và cộng sự (1988) trước tiên nghiên cứu các
saponin của các bộ phận trên cao của Lonicera japonica. 15 hợp chất hóa học đã
được tìm thấy và bốn hợp chất được đặt tên là 3-O-α-L-arabinopyranosyl-28-O-
[β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl] oleanolic acid, 3-O-[α-L-
rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-larabinopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranosyl
hederagenin, 3-O-[α-L-rahmnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosyl]-28-O-[β
-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl] axit oleanolic, 3-O-[α-L-
rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosyl]-28-O-[6-acetyl-β-D-

15
glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl] hederagenin. Đồng thời, thử nghiệm
dược lý đã chứng minh rằng monodesmoside cho thấy hoạt động tán huyết mạnh,
nhưng bisdesmosides cho thấy hoạt động tán huyết yếu. Năm 1996, Lou và cộng
sự (1996) đã phân lập ba hợp chất triterpenes từ nụ hoa của Lonicera japonica là
3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosy hederagenin 28-O-β-D-
xylpyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester, 3-O-α-L-arabinopyranosy
hederagenin 28-O-α-D-rhamnopyranosyl(1→2)[β-D-xylpyranosyl(1→6)-β-D-
glucopyranosyl ester, 3-O-α-L-rhamnopyranos(1-2)-α-L-arabinopyranosy
hederagenin 28-O-α-D-rhamnopyranosyl (1→ 2) [β -D-xylpyranosyl (1→ 6)-β-
D-glucopyranosyl ester. Sau đó vào năm 2000, 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→ 4)-
β-L-glucopyranosyl(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosy
hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl este,
hederagenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranoside, 3-O-β-
D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosyl
hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl este, 3-O-α-
L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosy hederagenin 28-O-β-D-
glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl ester (107) đã được xác định (Chen
et al., 2000).

Sau đó vào năm 2003, một loại triterpenoid saponin mới, loniceroside C đã được
phân lập từ các bộ phận trên không, cho thấy hoạt tính chống viêm in vivo ở liều
50, 100, 200 mg/kg (po) chống lại phù tai chuột với tỷ lệ ức chế lần lượt là 15%,
31% và 28,7%. Thuốc aspirin dương tính (100 mg / kg, p.o.) là ức chế 15% (Kwak
et al., 2003). Và vào năm 2008, hai saponin triterpeniod mới, loniceroside D và
loniceroside E, đã được phân lập từ hoa khô và chồi của Lonicera japonica (Lin
et al., 2008).

1.2.3.6. Các hợp chất khác

Từ Lonicera japonica, 15 nguyên tố vi lượng đã được tìm thấy, như Fe, Mn, Cu,
Zn, Ti, Sr, Mo, Ba, Ni, Cr, Pb, V, Co, Li, Ca (Wu, 1988). Năm 2006, Kumar và

16
cộng sự. đã xác định sáu hợp chất hóa học mới, lonijaposides A1-A4 và
lonijaposides B1-B2 (Kumar et al., 2006). Và tên của lonijaposide A1 tương tự
với lonijaposide A, nhưng cấu trúc hóa học của chúng thì khác. Năm 2008, Li đã
phân lập một hợp chất mới shuangkangsu với hoạt tính chống vi rút rõ rệt chống
lại virut cúm B (P <0,5), virut cúm A3 (P <0,5) và virut hợp bào hô hấp (RSV) (P
< 0,005), tương ứng (Li, 2008a) (+) - N- (3-methylbutyryl-β-D-glucopyranoyl)-
nicotinate, (+) - N- (3-methylbut-2-enoyl-β-D-glucopyranosyl)-nicotinate và 3
nucleoside cũng đã được tìm thấy từ nụ hoa của Lonicera japonica (Song, 2008).

1.2.4. Hoạt tính sinh học

1.2.4.1. Hoạt động chống viêm
Gần đây, ngày càng có nhiều thí nghiệm, in vivo và in vitro, cho thấy các
chiết xuất khác nhau của Lonicera japonica có thể ức chế các phản ứng viêm khác
nhau và ức chế các yếu tố gây viêm khác nhau.

Năm 1998, Lee và cộng sự. (1998) đã đánh giá hoạt tính chống viêm của
n-butanol (BuOH, 4.2% dựa trên trọng lượng khô) của Lonicera japonica. Với
liều uống 400 mg/kg, nó cho thấy các hoạt động chống viêm đáng kể chống lại
chứng phù tai AA, phù tai dầu croton, phù chân CGN, mô hạt dạng hạt bông chuột
và mô hình viêm AIA ở chuột, sự ức chế là 27 %, 23%, 26%, 18% và 42%, tương
ứng. Và tỷ lệ ức chế của thuốc dương tính, aspirin (100 mg/kg) là 27%, 13%,
13%, 0% và 58%.

Các đặc tính chống viêm của chiết xuất nước từ hoa Lonicera japonica
được đánh giá trong các tế bào A549. Chiết xuất này ức chế trực tiếp cả hoạt động
COX-1 và COX-2, biểu hiện của protein COX-2 và mRNA do IL-1 tạo ra. Nhưng
liều cao hơn của chiết xuất được yêu cầu để ngăn chặn sự biểu hiện của mRNA
so với protein. Kết quả này chỉ ra rằng dịch chiết đã hoạt động theo cách dịch hoặc
sau dịch mã ở liều thấp hơn và sao chép hoặc sau phiên mã ở liều cao hơn (Xu et
al., 2007). Kang và cộng sự đã xem xét ảnh hưởng của phần nước của Lonicera
japonica đối với hoạt hóa tế bào mast do trypsin gây ra (HMC-1). Sau khi được

17
kích thích với trypsin (100 𝜇M), Lonicera japonica có thể ức chế tiết TNF-α, biểu
hiện mRNA của tryptase và phosphoryl hóa ERK do trypsin gây ra ở liều phụ
thuộc. Tuy nhiên, nó không ảnh hưởng đến hoạt động của trypsin ngay cả với
1000 𝜇G/ml. Tất cả đều chỉ ra rằng Lonicera japonica có thể ức chế sự kích hoạt
tế bào mast do trypsin gây ra thông qua sự ức chế phosphoryl hóa ERK hơn là ức
chế hoạt động của trypsin (Kang et al., 2004). Mặt khác, tác dụng chống viêm của
chiết xuất nước trong chứng phù chân chuột đã được kích hoạt protein 2 (PAR2)
đã được nghiên cứu. Kết quả chỉ ra rằng với liều 50, 100 và 200 mg / kg op, nó
cho thấy sự ức chế đáng kể cả sự thay đổi độ dày của bàn chân và tính thấm của
mạch máu do PAR2 gây ra, tỷ lệ ức chế là 41,8%, 69,1%, 70,9% và 40,2%, 69,7%,
68,8%, tương ứng. Các chất chiết xuất từ nước (100 mg/kg) cũng ức chế đáng kể
hoạt động của chất chủ vận PAR2 do myeloperoxidase (MPO) gây ra và biểu hiện
TNF-α trong mô chân. (Tae và cộng sự, 2003)

Su et al. (2006) đã sử dụng quy trình chiết CO2 siêu tới hạn, nhiệt độ 35◦C,
áp suất 12 MPa, CO2 chảy 4,0 kg/giờ và thời gian 1,5 giờ, để thu được 1,08% dầu
dễ bay hơi từ Flos lonicerae. Các nghiên cứu dược lý cho thấy tác dụng chống
viêm mạnh mẽ của dầu dễ bay hơi trên mô hình sưng tai ở chuột.

Tất cả các báo cáo này đều ủng hộ việc sử dụng Lonicera japonica truyền
thống và cho rằng đây là một chất chống viêm an toàn và nhẹ để điều trị các chứng
rối loạn viêm khác nhau.

1.2.4.2. Hoạt tính chống vi-rút

Từ những năm 1980, hoạt động chống vi-rút của Lonicera japonica đã và
chống NDV. Đồng thời, là loại thuốc truyền thống quan trọng, Lonicera japonica
đã được sử dụng để điều trị một số bệnh do virus ở Trung Quốc. Các hoạt động
dược lý này đã được hỗ trợ cho việc sử dụng truyền thống và bản chất thuốc của
Lonicera japonica trong TCM. Thứ nhất, Ma vsg cộng sự (2002) đã chọn bốn
mươi bốn loại dược liệu, được sử dụng để điều trị các bệnh truyền nhiễm đường
hô hấp ở Trung Quốc, và đã thử nghiệm các hoạt động chống vi-rút chống lại vi-

18
rút hợp bào hô hấp (RSV) bằng phương pháp xét nghiệm tế bào chất (CPE).
Lonicera japonica cho thấy các hoạt động chống vi rút mạnh đối với RSV, nồng
độ ức chế 50% (IC50) là 50,0 𝜇g/ml và chỉ số chọn lọc (SI) là hơn 20,0. Chang
và cộng sự (2003) đã áp dụng thử nghiệm ức chế sự hình thành hợp bào để nghiên
cứu các tác nhân chống HIV của 80 chiết xuất MeOH của mẫu thu tại Hàn Quốc.
Xét nghiệm này dựa trên sự tương tác giữa glycoprotein vỏ bọc HIV-1 gp120 41
và protein CD4 màng tế bào của tế bào lympho T. Hoa của Lonicera japonica cho
thấy sự ức chế 5,8 ± 1,7% ở nồng độ 100 𝜇G/ml. Và vào năm 2008, Xi (2008) đã
đề xuất rằng chiết xuất Lonicera japonica cho thấy một tác động trị liệu rõ ràng
đối với chuột Pneumonia bị nhiễm virus cúm A. Các chỉ số phổi của nhóm
Lonicera japonica và nhóm ribovirin thấp hơn nhóm mô hình với sự khác biệt có
ý nghĩa (P <0,01), nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa (P>0,05) giữa hai nhóm
này.

Lonicera japonica có thể làm giảm các thay đổi mô bệnh học, sự nhân đôi
của virus và hàm lượng axit nucleic của virut cúm (P<0,01), so với nhóm mô
hình). Đồng thời, TNF-α, IL-1β biểu hiện của nhóm Lonicera japonica và nhóm
ribovirin thấp hơn nhóm mô hình với sự khác biệt đáng kể (P <0,01).

Sau đó vào năm 2009, Chen et al. (2009) đã chứng minh rằng chiết xuất
Lonicera japonica và axit chlorogen có hoạt tính chống cytomegalovirus đáng kể
và liều độc 0%, nồng độ tác dụng tối thiểu (MEC) và chỉ số điều trị (TI) của hai
hợp chất này đối với cytomegalovirus ở người là 3000 𝜇g/ ml, 1 và 100 𝜇g/ml, 1
𝜇g/ml, 100, tương ứng. Thử nghiệm in vitro, Lonicera japonica cho thấy 104 và
72 lần TI cho kháng HSV (virus Herpes simplex) -1F và chống HSV-1HS-1 thành
acyclovir (ACV).

Nhưng xét nghiệm in vivo, hoạt động chống virut của Lonicera japonica
đã bị đóng cửa đối với ACV (Wang, 1999). Đối với beta herpesvirus 1, Lonicera
japonica cho thấy sự ức chế đáng kể sự nhân đôi của cytomegalovirus ở chuột
lang ở cấp độ tế bào. TI và chỉ số nhân đôi ức chế (100 và 2,61) (Wang et al.,

19
2005). Hoạt tính chống vi rút (H9N2) và chống AIV (LED = 3,90 mg / ml, in
vitro) của flavones từ nụ hoa của Lonicera japonica cũng được tìm thấy (Li et al.,
2001; Wang et al., 2006). Đồng thời, là thành phần chính, Lonicera japonica đã
được sử dụng rộng rãi trong các đơn thuốc TCM, được Cục Quản lý Nhà nước
TCM của Trung Quốc xuất bản, để ngăn chặn và kiểm soát SARS coronavirus
vào năm 2003. Và từ số liệu thống kê của bệnh viện Bắc Kinh Youan thuộc đại
học y khoa thủ đô, tần suất thực tế của Lonicera japonica để điều trị cúm A thuộc
nhóm virut cúm A-H1N1 đứng thứ hai trong 113 loài từ tháng 5 đến tháng 11 năm
2009 (Zheng, 2010).

Trong các tế bào Vero, ba chiết xuất khác nhau của Lonicera japonica (tỉnh
Hồ Nam), bao gồm tinh dầu dễ bay hơi (P1), chiết xuất axit chlorogen (P2) và
chiết xuất flavones (P3), đã được thử nghiệm về hoạt tính chống vi rút của virus
dại Pseudo (PRV) và Virus gây bệnh Newcastle (NDV). Ở liều 232,7 𝜇G/ml,
116,35 𝜇G/ml, 58,18 𝜇G / ml, 29,09 𝜇G/ml, tỷ lệ xen kẽ của P1 đối với PRV và
NDV là 40,13%, 17,83%, 13,16%, 2,24%, và 75,40%, 32,01%, 12,05%, 2,34%,
trong CPE tương ứng và đèn LED của P1 (Liều tối thiểu hiệu quả) là 232,7 𝜇g/ml
và 232,7 𝜇g/ml. Tỷ lệ xen kẽ của P2 (3.125 mg/ml, 1.563 mg kg, 0.781 mg/ml và
0.391 mg/ml) đối với PRV và NDV là 63,74%, 46,27%, 13,10%, 3,51% và
65,23%, 36,71%, 32,61%, 28,96% trong CPE tương ứng. Tỷ lệ xen kẽ của P3
(1.954 mg/ml, 0.977 mg/kg, 0.489 mg/ml và 0.244 mg/ml) đối với PRV và NDV
là 94,00%, 78,42%, 42,30%, 3,36% và 78,07%, 27,63%, 16,37%, 6,73%, tương
ứng. LED chống lại PRV và NVD của P2 và P3 là 0,997 mg/ml, 3.097 mg/ml
(P<0,05) và 0,781 mg ml, 1,563 mg/ml. Các nghiên cứu này cho thấy rằng chất
chiết xuất làm giảm tổn thương CPE và vô hiệu hóa virus phụ thuộc ở liều lượng,
cách ức chế virus trực tiếp và thúc đẩy chống vi-rút tế bào (Wang, 2008c).

Là một loại thuốc chống vi rút khác, một số tannin của Lonicera japonica
đã được điều tra. Axit 3,5-di-O-caffeoylquinic (6) và methyl 3,5-di-O-
caffeoylquinic (30) có tác dụng ức chế mạnh đối với HIV-1 RT và HDNAP-. Tỷ

20
lệ IC50 của hai hợp chất này đối với HIV-1 RT và HDNAP-α là 2.0 và 2.2. Trong
khi axit 3,4-di-O-caffeoylquinic (8) và methyl 3,4-di-O-caffeoylquinic (31) cho
thấy tác dụng ức chế cao hơn đối với HDNAP-α so với HIV-1 RT (Chang et al.,
1995). Trong khi đó, 13 axit caffeoylquinic khác, axit caffeic (3) và axit ester
methyl ester (32) được phân lập từ Lonicera japonica cũng trình bày các hoạt
động chống vi-rút chống lại virus đường hô hấp (Ma et al., 2005)

1.2.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt động kháng khuẩn, như một tính chất quan trọng khác của Lonicera
japonica, đã được nghiên cứu toàn diện. Năm 2009, Rahman và cộng sự. đánh giá
khả năng kháng khuẩn của tinh dầu từ hoa và chiết xuất ethanol từ lá. Một tác
dụng kháng khuẩn đáng chú ý của dầu và chất chiết xuất đã được tiết lộ đối với
Listederia monocytogenes ATCC 19116, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus
cereus SCK 111, Staphylococcus aureus (ATCC 6538 và KCTC 1916), và
Salmonella aerogenes KCTC 2190 và Escherichia coli ATCC 8739. Đường kính
của vùng ức chế là 20.3, 17.8, 15.2, 16.3, 14.1, 15.3, 14.0, 12.4, 12.1, và 16.2,
15.4, 14.0, 15.0, 14.1, 14.1, 14.2 10,3 mm, tương ứng. Giá trị MIC là 62,5, 62,5,
250, 125, 250, 125, 250, 500, 500, và 125, 125, 250, 125, 125, 250, 250, 500,
500 𝜇G/ml. Những phát hiện này cho thấy rằng dầu và chiết xuất từ Lonicera
japonica có thể là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho ngành công nghiệp thực
phẩm hoặc dược phẩm (Rahman và Kang, 2009). Và các hoạt động kháng khuẩn,
chống lại Bacillus cereus và Staphylococcus aureus, của nụ hoa từ Lonicera
japonica đã được tìm thấy bằng phương pháp thử nghiệm đĩa khuếch tán agar
trong ống nghiệm. Đường kính của vùng ức chế là 6,3 và 7,2 mm, và hoạt động
này có thể liên quan chặt chẽ với sự tồn tại của các thành phần phenolic (Shan et
al., 2007). Trong khi đó, Lonicera japonica cũng đã cho thấy hoạt tính kháng
khuẩn rõ rệt đối với mười bốn chủng, bao gồm Staphylococcus aureus,
Streptococcus hemolyticus, Escherichia coli, Bacillus dysenteriae, Bacillus
comma, Bacillus typhosus, Bacillus paratyphosus, Pseudomonas aeruginosa,

21
Klebsiella pneumoniae, Bacillus tuberculosis, Streptococcus mutans,
Bacillus adhaerens, Bacteroides melanogenicus and Haemophilus
actinomycetemcomitans v.v. Và nghiên cứu kháng khuẩn chống lại các loại huyết
thanh khác nhau của Streptococcus mutans đã chứng minh rằng chiết xuất
Lonicera japonica có thể ức chế 87,5% chủng với MIC 25 mg/ml (Sun, 2002;
Song et al., 2003).

Sau đó, hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất nước và rượu từ Lonicera
japonica đã được điều tra. MIC và MBC của chiết xuất nước trên Staphyloccocu
saureus là 19,25% và 38,50%; MIC và MBC của chiết xuất rượu trên Salmonella
và Staphyloccocu aureus lần lượt là 9,80%, 19,60% và 19,60%, 39,20% (Kang et
al., 2010).

Trong khi đó, dịch cô đặc từ Lonicera japonica cho thấy tác dụng loại bỏ
hợp lý đối với plasmid R từ Pseudomonas aeruginosa in vivo. Tỷ lệ loại bỏ là 8%
(Wang et al., 2000). Cuối cùng, Tang et al. chỉ ra rằng flavonoid từ Lonicera
japonica cũng có tác dụng kháng khuẩn mạnh, đặc biệt đối với Staphylococcus
aureus kháng Methicillin (MIC 5 mg / ml) (Tang, 2008).

1.2.4.4. Hoạt động chống oxy hóa

Chio và cộng sự đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa của hoa Lonicera
japonica trong năm 2007. Phần EtOAc thể hiện các tác động khử / ức chế rõ rệt,
như sau: Giá trị IC50 là 4,37, 27,58± 0,71, 0,47 ± 0,05 và 12,13 ± 0,79 𝜇g/ml trong
1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), tổng các gốc tự do oxy hóa (ROS), gốc
hydroxyl (OH) và xét nghiệm peroxynitrite (ONOO−), tương ứng. Và các hợp
chất chính của phần EtOAc, luteolin, axit caffeic, axit protocatechuic,
isorhamnetin-3-O-n β-D-glucopyranoside, quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside,
và luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside, cũng đã chứng minh các hoạt động khử
được đánh dấu, với các giá trị IC50 là 2.08-11.76 𝜇M cho các gốc DPPH và 1.47-
6.98 𝜇M cho ONOO− (Choi et al., 2007). Và kết quả của các xét nghiệm chống
oxy hóa khác chỉ ra rằng các giá trị khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox

22
(TEAC) và tổng hàm lượng phenolic đối với chiết xuất methan của chồi thực vật
từ Lonicera japonica là 589,1 𝜇mol Trolox / 100 g trọng lượng khô (DW) và 3,63
gallic axit tương đương / 100 g DW. Những nghiên cứu này cho thấy Lonicera
japonica có thể là chất chống oxy hóa tự nhiên tiềm năng và tác nhân hóa học có
lợi (Cai et al., 2004).

Sau đó, hoạt động chống oxy hóa của các polysacarit với các trọng lượng
phân tử khác nhau được tách ra từ Flos lonicerae bằng cách phương pháp
UltraFiltration (UF) cũng được nghiên cứu. Khả năng khử của các polysacarit có
mối tương quan trực tiếp giữa hoạt tính chống oxy hóa và nồng độ của một số
chiết xuất thực vật nhất định và phần siêu lọc có tác dụng ức chế đáng kể đối với
các gốc superoxide được tạo ra trong hệ thống PMS / NADA / NBT. Sử dụng cho
chuột, chiết xuất polysacarit thô (50-400 mg/kg) có thể làm giảm hàm lượng lipid
peroxidate malony dialdehyd (MDA), cải thiện hoạt tính của glutathione
peroxidase (GSH-Px) và catalase (CAT) trong huyết thanh và mô (Li, 2008b).

Lan và cộng sự (2007) đã sử dụng phương pháp sinh hóa để nghiên cứu
hoạt động và khả năng khử trên các gốc tự do của enzyme bảo vệ màng, được
chiết xuất từ nụ hoa, lá và thân cây của Lonicera japonica trong thời gian thu
hoạch khác nhau. Hoạt động của enzyme đã tăng lên kể từ tháng Tư và đạt mức
cao nhất vào tháng Sáu. Hoạt tính của enzyme chiết xuất từ lá cao hơn so với từ
hoa và cây thân cây, và khả năng làm sạch của dịch chiết từ nụ hoa trên các gốc
tự do OH và H2O2 mạnh hơn so với lá và thân cây.

Trong khi đó, khả năng làm sạch trên các gốc tự do của năm cây thuốc
Lonicerae từ một số tỉnh của Trung Quốc đã được nghiên cứu. Tất cả các mẫu cho
thấy khả năng làm sạch trên ba loại gốc tự do (O2−, −OH, H2O2) ở một mức độ
nào đó, và các mẫu từ Hà Nam và Sơn Đông cho thấy khả năng làm sạch mạnh
hơn so với các loại từ tỉnh Giang Tô. Thứ tự giảm dần của khả năng làm sạch từ
các loài khác nhau là Lonicera macranthoides, Lonicera japonica, Lonicera
similis, Lonicera Fulvotomentosa và Lonicera hypoglauca (Li et al., 2002b).

23
1.2.4.5. Bảo vệ gan
Trong dimethylnitrosamine (35 mg / kg o.p. 7 ngày) gây ra bệnh xơ gan,
chiết xuất ethanol 75% của Lonicera japonica cho thấy hiệu quả bảo vệ gan đáng
kể bằng các phân tích bệnh lý. 19 hợp chất, như 8-phenyl-8-azbicyclo[4,3,0]non-
3-ene-7,9-dione, 3-[1,3]dioxolan-2-yl-4-methoxy-6-nitro-benzo[d]isoxazole,
(E)-2-(5,5,5-Yip richloro-3-penten-1-yl)-1,3-dioxolane, 3,3-diphenyl-
cyclopropene, 2-(methoxy-imino)-hexanedioic acid, gamma-lactone-2
methoximinegluconic acid, 2-(6-heptynyl)-1,3-dioxolane, và bis(o-
methyloxime)-4-ketoglucose, đã được phân lập và xác định bằng phương pháp
GC-MS methol từ chiết xuất ethanol 75% (Sun et al., 2010). Nhưng, Hu và cộng
sự cho rằng tổng số flavones của Lonicera japonica có tác dụng bảo vệ đáng kể
đối với tổn thương gan miễn dịch ở chuột. Sử dụng ig * 10d, tổng số flavone (100,
200, 400 mg / kg) có thể làm giảm đáng kể các chỉ số ở gan và lá lách tăng, và cải
thiện các thay đổi mô bệnh học trong gan bị nặng hơn. Ngoài ra, chiết xuất này
có thể làm giảm nồng độ cao NO và iNOS8 trong homogenate gan và ức chế sự
biểu hiện của TNF- trong mô gan. Cơ chế này có thể là do làm giảm các chất trung
gian gây viêm (Hu et al., 2008).

1.2.4.6. Hoạt động chống khối u

Các cơ chế gây ra sự chết rụng tế bào có lập trình gây ra bởi liệu pháp quang
động (PDT) trong tế bào ung thư biểu mô CH27 ở phổi, được nuôi cấy với chiết
xuất rượu từ Lonicera japonica như chất cảm quang, đã được khám phá. Chiết
xuất này cho thấy độc tính tế bào quang đáng kể trong các tế bào CH27 ở khoảng
nồng độ 50-150 𝜇G / ml, với lượng ánh sáng là 0,41,2 J / cm2. Sự chết rụng tế
bào có lập trình gây ra bởi PDT kết hợp với chiết xuất Lonicera japonica đi kèm
với ngưng tụ DNA, ngoại hóa phosphatidylserine và hình thành cơ thể tự chết
rụng, nó cho thấy sự chết rụng tế bào độc lập caspase-3 thông qua kích hoạt AIF.
P38-con đường có thể liên quan đến sự chết rụng tế bào được lập trình gây ra bởi
PDT với Lonicera japonica trong các tế bào CH27. Những điều này chứng minh

24
rằng chúng gây ra sự chết rụng tế bào CH27 có lẽ liên quan đến khả năng thay đổi
biểu hiện protein và phân phối protein sốc nhiệt 27 (Leung et al., 2008). Khi chiết
xuất dung dịch Lonicera japonica (100 𝜇G/ ml) được sử dụng cho các tế bào
HepG2, các dung dịch của các tế bào được xử lý có liên quan đến sự tăng
phosphoryl hóa kích thích của JNK và P38 so với giá trị cơ bản, tương tự như hồ
sơ kích hoạt MAPK của PCA. Các thí nghiệm tiếp theo cho thấy chiết xuất nước
này cũng làm giảm khả năng sống sót của tế bào HepG2 xuống 50%. Vì vậy, Yip
nghĩ rằng dịch chiết Lonicera japonica có thể kích hoạt sự chết tế bào HepG2 theo
cách phụ thuộc vào JNK (Yip et al., 2006).
1.2.4.7. Tác dụng ngừa thai

Tác dụng chống mang thai tốt của chiết xuất Lonicera japonica đã được
tìm thấy ở chuột, chó và khỉ. Các chiết xuất đã đánh dấu tác dụng ức chế đối với
deciduoma của pseudopregnant ở chuột, với sự giảm đáng kể mức độ
progesterone huyết tương ở chuột mang thai sau khi dùng trong 24 giờ. Những
kết quả này ngụ ý rằng tác dụng gián đoạn của chiết xuất có thể liên quan đến việc
giảm mức độ progesterone huyết tương và hành động giống như tuyến tiền liệt
(Cao et al., 1986a, b).

1.2.4.8. Hoạt động hạ huyết áp và chống huyết khối

Năm 1998, Pan và cộng sự đã phát hiện ra rằng Lonicera japonica có thể
ức chế sự gia tăng lượng đường trong máu và hàm lượng lipoprotein cholesterin
mật độ cao (HDL-C) trong máu, làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh
và chỉ số tích tụ xơ vữa động mạch ở alloxan do chuột gây ra (ALX) ., 1998).
Trong khi đó, Fan và cộng sự đã quan sát tác dụng chống huyết khối của các hợp
chất axit hữu cơ trong Lonicera japonica đối với tổn thương oxy hóa của HUVEC
(Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của con người). IC50 của các hợp chất đồng phân
của axit chlorogen (2), axit caffeic và axit isochlorogen (3) là 0,0286 mg/ ml,
1,707 mg/ ml, 2,411 mg/ ml, 0,026 mg/ ml, 0,328 mg/ ml và 0,539 mg/ ml tương
ứng. Tác dụng bảo vệ đối với tổn thương oxy hóa của HUVEC bởi H 2O2 chỉ ra

25
một cách phụ thuộc vào liều lượng. Axit caffeic và axit isochlorogen có khả năng
chống lại tổn thương oxy hóa rõ rệt và axit chlorogen có tác dụng bảo vệ phòng
ngừa (Fan et al., 2007).

1.2.4.9. Hoạt động chống lipase

Bằng cách sàng lọc 75 cây thuốc trên lipase tụy mới (triacylglycerol lipase,
EC 3.1.1.3), Sharma et al. cho rằng chiết xuất 80% methanolic của toàn bộ cây từ
Lonicera japonica (0,2 mg / ml) có hoạt tính chống lipase rõ rệt và sự ức chế là
40,9% (Sharma et al., 2005).

1.3. Tổng quan về Lignan

1.3.1. Tổng quan và phân loại

Lignan là nhóm các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ các dẫn xuất của
các cinamic acid, cinamyl alcohol, propenyl benzene và allyl benzene có liên quan
đến sự chuyển hóa hóa sinh với phenylalanine, cấu trúc của lignan được chia
thành các đơn vị C6C3 hợp thành mà người ta phân biệt:

Lignan 2 đơn vị C6C3

Secquineolignan 3 đơn vị C6C3

Dineolignan 4 đơn vị C6C3

Sesterneolignan 5 đơn vị C6C3

Lignan do 2 đơn vị C6C3 hợp thành. Năm 1961, Freudenberg và Weiges đề
nghị cách đánh số như sau: Nhóm C6C3 đánh số từ 1 – 9

Nhóm còn lại đánh số từ 1’- 9’. Các vị trí 7, 8, 9 có thể thay thế tương ứng
α, β, γ. Cũng do đó, các vị trí 7’, 8’, 9’ được thay tương ứng bởi α’, β’, γ’ . Trên
cơ sở đó Haworth đề xuất nhóm hợp chất có nguồn gốc từ 2 đơn vị C6C3 có liên
kết β - β’ ( γ -γ’) với nhau gọi là lignan (lignane, lignans).
26
 Nếu 2 nhóm C6C3 liên kết với nhau bởi các liên kết khác chắng hạn 3 - 3’
thay cho 8 - 8’ ta được Neolignan

3,3’- Neolignan

Nếu tạo một vòng bổ sung giữa giữa hai nhóm C6C3 gọi là cyclolignan

2,7’- cyclolignan

Hai nhóm C6C3 liên kết với nhau bằng các liên kết 8 - 8’ và một nguyên tố
O được epoxylignan.

7,7’- epoxy lignan

Lignan được tìm thấy chủ yếu từ rễ, lõi, cành lá, quả, nhựa các cây hạt trần,
hạt kín. Theo các nghiên cứu khoa học, lignan là chất phytoestrogens có tiềm năng
27
chống ung thư (cancer) buồng trứng, tuyến tuyền liệt, vú, tử cung), lignan chiết từ
khoai tây kích thích hệ miễn dịch, tác động to lớn tới bào mòn sỏi túi mật (theo
bác sĩ Wilkinson-bệnh viện Sowthompton-Anh), lignan có tác dụng ngăn chặn
chu kỳ APM. Phosphodiesterase, làm nảy mầm chất ức chế đặc biệt dẫn xuất brom
của nó với các chỉ số E C850 và SI thích hợp có tác dụng chống HIV bằng cách ức
chế bản sao ngược của tế bào HIV- 1 và kết hợp với DNA polymerase và RANase.

Lignan pinoresinol và laricresnol là thành phần quan trọng trong thực đơn
ăn kiêng của bệnh nhân tiểu đường. Đông y Trung Quốc sử dụng lignan để điều
trị viêm gan và bảo vệ gan. Dựa trên hoạt tính oxi hóa mạnh, khoa học đã tìm ra
nhiều hóa chất nguồn gốc lignan đa dạng, công sinh với nhiều loại virut để tạo
hướng phát triến mới trong y dược.

1.3.2. Các dẫn xuất quan trọng của Lignan

 Dẫn xuất axit cacboxylic

 Dẫn xuất lactone

Hibalactone từ T.baccata
28
  Dẫn xuất este

Chống lại tác dụng của tế bào HIV -1RT

 Dẫn xuất xeton

 Dẫn xuất ancol và phenol

Cùng với sự tạo phức Fe3+ - ADP-O2 tác dụng oxi hóa chất béo.

29
  Dẫn xuất của ete

1.3.3. Tổng hợp lignan

Theo I.Mulez

Theo Sibi

30
Theo Bath

Theo Enders

a: L.aeledritde, THF, -78OC

b: LiAlH4, THF, 60%

c: MsCl, pyridine

31
Theo Wikstromol

32
33
 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thực vật thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc vào tháng 6 năm 2018 và
được giám định bởi PGS.TS. Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản lưu tại Phòng
Nghiên cứu và ứng dụng hóa sinh, Trung tâm Nghiên cứu và chuyển giao công
nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp chiết và phân tách các hợp chất trong mẫu thực vật

2.2.1. Chọn dung môi chiết

2.2.1.1. Chiết mẫu tạo cao chiết tổng
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp
đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất
nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau.
Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng
trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.

Theo các tài liệu đã nghiên cứu trên thế giới thì thành phần hóa học chủ yếu
của cây Kim ngân là các hợp chất axit hữu cơ, flavonoid, iridoids. Đây là các hợp
chất có độ phân cực từ trung bình đến phân cực mạnh, có khả năng tan trong nước
do thành phần của chúng có chứa một hoặc nhiều gốc hydroxyl. Chính vì thế để
tạo dịch chiết tổng từ lá cây Kim ngân thường lựa chọn dung môi methanol.

Methanol là một dung môi thuộc nhóm ancol, được xem là dung môi vạn
năng, có khả năng hoà tan được các chất không phân cực, đồng thời cũng có khả
năng hòa tan các chất phân cực do tạo liên kết hydro với các nhóm phân cực khác.
Dịch chiết methanol được cất loại dung môi dưới áp suất giảm sẽ thu được cao
chiết toàn phần metanol chứa hầu hết hợp chất của các mẫu nghiên cứu. Methanol

34
còn có ưu điểm là một dung môi đa năng và giá thành thấp. Với phương pháp
chiết, thu hồi dung môi sẽ giảm thiểu được lượng dung môi thải ra môi trường.

2.2.2. Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập sắc ký
2.2.2.1. Chiết siêu âm

Chiết bằng phương pháp ngâm chiết cổ truyền có sử dụng thiết bị siêu âm.
Sóng siêu âm với tần số 20 KHz được sử dụng để tăng hiệu quả chiết. Sóng siêu
âm có tác dụng làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình
khuếch tán của chất tan. Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc
tế bào, thúc đẩy quá trình chiết. Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thường được
sử dụng trong chuẩn bị mẫu phân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết
Soxhlet cổ điển. Khi đó, người ta nhúng bình chiết vào một bể siêu âm có chứa
nước, sóng siêu âm phát ra từ các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và đi
vào hỗn hợp chiết.
Đây là một phương pháp chiết có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với các
phương pháp chiết khác (chiết ngâm cổ truyển, chiết đun hồi lưu...) như:

+ Thời gian chiết xuất ngắn: 90phút/mẻ. So với phương pháp chiết ngâm
thông thường có thời gian chiết xuất dài (24 tiếng/mẻ) thì việc chiết siêu âm tiết
kiệm được thời gian chiết.

Nhiệt độ chiết xuất khoảng 45-50oC không làm thay đổi các hoạt chất trong
nguyênliệu thực vật.

+ Chiết siêu âm tiết kiệm dung môi chiết do sóng siêu âm tăng khả năng
hòa trộn của các thành phần, tạo điều kiện thuận tiện cho việc chiết xuất, có khả
năng chiết xuất chọn lọc và quá trình chiết triệt để.

2.2.2.1. Sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) là một phương pháp hiện đang được
sử dụng rất rộng rãi trong các ngành khoa học hoá học, sinh học, hoá dược với
nhiều mục đích khác nhau do các đặc tính ưu việt của nó: độ nhạy cao, lượng mẫu

35
phân tích nhỏ (thường từ 1 đến 100x10-6 g), tốc độ phân tích nhanh, kỹ thuật phân
tích dễ thực hiện. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) có thể được dùng để phân
tích định tính hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng
như hỗ trợ cho các phương pháp sắc ký cột để xác định và kiểm soát điều kiện
phân tách. Đối với sắc kí bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy
sắc kí cho Rf tốt là quan trọng nhất. Cụ thể với yêu cầu khảo sát hỗn hợp thì chọn
dung môi sao cho các vệt tròn, sắc nét, rải đều trên toàn bản và có Rf càng xa nhau
càng tốt.

a
Rf 
b

Hình 2.1 Sắc ký lớp mỏng

2.2.2.2. Sắc ký cột

Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi trên
silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết,
phân lập và tinh chế các hợp chất.

Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí nén để dung
môi rửa giải đi qua cột nhanh hơn.

Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện để tinh chế lượng nhỏ các mẫu
chất.

36
 Hình 2.2 Sắc ký cột

Sắc kí cột thường được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường
và pha đảo. Silicagel pha thường có kích thước là 0,040-0,063 mm (240-430
mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 𝜇m, Fujisilisa Chemical Ltd.)

2.2.2.3. Phương pháp kết tinh lại

Phương pháp này được sử dụng để tách và làm sạch chất rắn. Việc làm sạch
chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu
và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn.

2.2.3. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc (các phương pháp phổ)
2.2.3.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR).

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các
liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu
liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó, dựa vào phổ
hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ
như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300- 3450
cm-1, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng 1700-1750 cm-1…

37
2.2.3.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS).
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân
tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion
mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và
dựng lại được cấu trúc hoá học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối
lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự

phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ
biến là 70eV.

- Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ

phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều
so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các píc đặc
trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
- Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên
tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được
cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho
phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.

- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký
kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc ký khí-khối phổ), LC-MS (sắc ký
lỏng-khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích
thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược).

2.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,
NMR).

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu
nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai
chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả
cấu trúc lập thể của phân tử.
38
 Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là
sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ
trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch
hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa
vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
2.2.3.3.1. Phổ 1H-NMR

Phổ proton có thể xem là phổcó ñộ nhạy cao nhất trong kỹ thuật 1D-NMR
vì hàm lượng H-1 trong tự nhiên chiếm đến 99.98% ( trong khi ñó hàm lượng C-
13 trong tự nhiên chỉ chiếm 1.108% ). Vì thế đây là một phổ rất quan trọng và có
thể cung cấp nhiều thông tin quý giá về cấu trúc của hợp chất.Phổ 1H-NMR là
một kỹ thuật sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ.
Phổ proton cho ta biết được số loại proton có trong phân tử (không phải là
số proton, mà chỉ là số loại proton ). Mỗi loại proton ñó sẽ có tính chất khác nhau
(như proton liên kết với vòng benzen sẽ khác với proton liên kết với Csp 3) vì thế
sẽcó độ dịch chuyển khác nhau trên phổ proton.

Người ta sử dụng TMS (tetramethylsilan) làm chất chuẩn trong phổ proton
và độ dịch chuyển của proton trong TMS được chọn là 0 pmm. Một điểm đặc biệt
của phổ proton là ngoài cho biết loại proton trong phân tử, phổ còn cho biết mối
quan hệ giữa các proton ở gần nhau thông qua sự ghép spin và hằng số ghép. Hai
proton liên kết với hai carbon kề nhau sẽ tương tác với nhau thông thường qua 3
liên kết H-C-C-H và dạng mũi ghép spin sẽ theo nguyên tắc (n + 1) ( ví dụ CH 3-
CH2- thì proton CH2- sẽ có dạng mũi 3 và proton CH3- sẽ có dạng mũi 4 do cạnh
đó là ba proton )và sẽ có cùng hằng số ghép ( coupling constant).

Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hoá học của các proton được xác định
trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng
như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch
hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp
chất.

39
 2.2.3.3.2. Phổ 13C-NMR
Carbon -12 là đồng vị phổ biến của Carbon, là hạt nhân không hoạt động
NMR vì nó có spin =0. Tuy nhiên ñồng vị của nó Carbon-13 (13C) có số khối lẻ
và có spin hạt nhân với I=1/2
Việc nghiên cứu hạt nhân carbon 13 thông qua phổ NMR là 1 kỹ thuật quan
trọng ñể xác định cấu trúc cảu hợp chất hữu cơ. Khi sử dụng với phổ proton NMR
và phổ IR ta có thể xác định cấu trúc hoàn thiên của một hợp chất chưa biết cấu
trúc. Phổ Carbon 13 NMR có thể sử dụng xác định carbon không tương đương và
nhận biết các nguyên tử carbon có thể có mặt trong hợp chất. Do đó phổ carbon
13- NMR cung cấp thông tin trực tiếp về bộ khung Carbon của phân tử.

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng
ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-
NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0 - 230ppm.
Biểu đồ tương quan chia thành 4 phần:

+ Carbon không no xuất hiện ở trường cao nhất, gần với TMS nhất (δ = 8-
60 ppm)

+ Hiệu ứng độ âm điện δ = 40-80 ppm

+ Nguyên tử Carbon của alken và vòng thơm δ =100-175 ppm

+ Carbon Carbonyl, xuất hiện ở các trường thấp nhất δ = 155-220 ppm

2.2.3.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ
DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH 3 nằm
về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135. Trên phổ DEPT 90 chỉ
xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.

Ngoài việc sử dụng các loại phổ, người còn sử dụng kết hợp với các chuyển
hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh kết hợp khác. Đặc biệt
đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều

40
khó xác định chính xác được chiều dài các mạch. Đối với phân tử có các đơn vị
đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông
thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so
sánh LC-M hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.

41
 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Thiết bị và hóa chất.

3.1.1. Hóa chất

- Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: nước javen, acid acetic 5%, xanh
methylen, đỏ son phèn...
- Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập: methanol (MeOH), ethyl
acetat (EtOAc), n-hexan, dicloromethan (DCM)…

- Dung môi phân tích: MeOH, n-hexan, EtOAc, H2O

- Sắc ký cột: chất hấp phụ là Silicagel.

- Các thuốc thử: dung dịch H2SO4 10%, hoặc phát hiện bằng đèn tử ngoại,
phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm.

3.1.2. Trang thiết bị

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel
Merck (Darmstadt, CHLB Đức) DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên
nền nhôm.

- Sắc ký cột thường (CC), sắ c ký cô ̣t nhanh (FC) và sắ c ký cô ̣t tinh chế
(Mini-C) được thực hiện trên silica gel Merck (Darm-Stadt, CHLB Đức) cỡ ha ̣t
63-200 μm, 63-100 μm và 40-63 μm.

- Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) được ghi trên thiết bị LC-MS-
Orbitrap-XL (Thermo Scientific).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt
nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT và phổ cộng hưởng từ hạt
nhân hai chiều (2D NMR) HMBC được ghi trên thiết bị Bruker AV 500
spectrometer. Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu diễn theo ppm.
Tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero.

Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử
dụng bao gồm:
42
 - Bình chiết 5 lít
- Micropipet

- Máy cô quay chân không

- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254nm và 368 nm

- Tủ sấy chân không

- Máy sấy, bếp điện

- Bình sắc ký loại phân tích và điều chế

- Cột sắc ký pha thường các loại đường kính

- Cột sắc ký pha ngược trung áp

- Máy phun dung dịch thuốc thử

3.2. Chiết mẫu thực vật

3.2.1. Xử lý mẫu
Mẫu Kim Ngân gồm phần thân và lá tươi được phơi khô, sau đó sấy bằng tủ
sấy ở nhiệt độ 500C và được nghiền thành bột thu được 2 kg bột khô.

3.2.2. Điều chế các phần chiết từ kim ngân

Mẫu Kim Ngân đã phơi khô và xay thành bột mịn (2 kg) được ngâm chiết
với metanol (5 L x 3 lần) trong bể siêu âm Ultrasonic 2010 ở nhiệt độ 40-50 oC (3
x 30 phút). Dịch chiết sau 3 lần được gom lại sau đó được cô đặc bằng máy cất
quay với áp suất giảm thu được 125 g cặn chiết metanol.
Cặn chiết này được phân bố lại trong 1 L nước nhằm giải phóng các chất
kém phân cực ra khỏi dịch chiết rồi chiết chúng bằng các dung môi theo độ phân
cực tăng dần, trước hết là hexane, sau đó đến ethyl acetate. Lắc phân bố lần lượt
với hexane (1L x 3 lần) và ethyl acetate (1L x 3 lần). Thu gom các dịch chiết
rồi cất loại dung môi thu được cao chiết hexane (35 g) và cao ethyl acetate (45
g).

43
Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết các lớp chất trong cây Kim ngân

Lá và thân cây kim ngân nghiền

nhỏ (2 kg bột khô)

- Ngâm chiết với metanol 100% (5L×3 lần)

trong bể siêu âm ở nhiệt độ 40-50oC ( 3× 30𝑝)

- Lọc dịch chiết qua giấy lọc

Dịch chiết metanol

- Cất loại dung môi dưới áp suốt giảm

thu được 125g cặn chiết methanol

- pha loãng bằng 1L nước cất

Dịch chiết methanol-nước

Lắc với hexane (1L×3 lần)

Dịch chiết hexane Dịch chiết còn lại

sau khi chiết
hexane
Loại hexane bằng máy cất Lắc với Ethyl acacetate
quay với áp suất giảm, (1L×3 lần)

t < 60oC.

35g cao chiết

Dịch chiết EtoAc Dịch còn lại
hexane
sau khi chiết

Loại EtoAc bằng máy cất

quay với áp suất giảm,

45g cao EtoAc

44
3.3. Phân lập và tinh chế các chất từ cao chiết etyl axetat của cây Kim ngân

3.3.1. Khảo sát định tính cao chiết EtOAc bằng sắc ký bản mỏng
Pha khoảng 5mg cao chiết EtOAc trong 5ml MeOH. Sau đó, dùng capilla
để hút chất, chấm lên bản mỏng (DC-Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm) sao cho vết
chất cách mép dưới của bản 1,0 cm và cách đều 2 mép bên là 0,5 cm . Sau khi sử
dụng qua nhiều hệ dung môi và các tỉ lệ khác nhau (điclometan/n-hexan (9:1; 7:1;
5:1, v/v); etyl axetat/n-hexan; điclometan/etyl axetat; chlorofom/n-hexan;...),
nhận thấy hệ dung môi đichlomethane : methanol cho sự tách tốt nhất đối với cặn
ethyl axetate.

Phát hiện các vết chất dưới ánh sáng thường , sau đó soi bản mỏng dưới
đèn tử ngoại UV (λ = 254 nm), cuối cùng phun bản mỏng với dung dịch
vanilin/H2SO4, FeCl3 và hơ bản mỏng trên bếp điện để nhận biết vệt chất.

3.3.2 Phân tách cặn Ethyl Axetate bằng CC

Sắc ký cột sử dụng cột thủy tinh có đường kính 5cm, dài 80cm lót đáy cột
bằng một miếng bông thủy tinh có thể cho dung dịch rửa giải đi ra. Dùng 45g cao
chiết EtOAc cho qua cột 120g silica gel nhồi ướt (tỉ lệ chất/silica gel= 1/8). Hệ
dung môi rửa giải là dichloromethane/methanol với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0%
đến 100%. Hứng các phân đoạn vào các ống nghiệm 15ml, theo dõi quá trình rửa
giải bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với các hệ dung môi thích hợp. Các ống nghiệm
hiện vết giống nhau trên sắc kí lớp mỏng gộp lại thành phân đoạn lớn, qua kiểm
tra bằng SKLM, những ống nghiệm có sắc ký đồ giống nhau được gom lại, thu
được 5 phân đoạn, kí hiệu là F1→ 5, cô quay dung môi thu được 5 phân đoạn có
khối lượng là F1 (15,0g), F2 (9,5g), F3(5,0g) và F4 (8,0g), F5 (4,5g).
Tiếp tục chạy sắc kí cột pha đảo RP-18 (với cột nhỏ hơn) phân đoạn F3 với
hệ dung môi methanol- nước 2:1, thu được 3 phân đoạn nhỏ F3.1(1.5g), F3.2
(0.8g) và F3.3(0.5g). Hợp chất 1 (5 mg) được tinh chế từ phân đoạn F3.2 qua cột
sắc ký gel pha thường với hệ dung môi dichloromethane-methanol: nước 5:1:0,1.

45
Phân đoạn F3.3 được tinh chế trên cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi methanol-
nước 1,5:1 thu được hợp chất 2 (6 mg).

Sơ đồ 3.2. Quá trình phân tách cặn EtOAc

Cặn EtOAc (45 gam)

- CC, silicagel (Merck, 40-63 μm)

Các phân đoạn -Rửa giải gradient dung môi:

điclometan-methanol

F1 F2 F3(5.0g) F4 F5

-Sắc ký cột pha đảo RP-18, hệ dung môi

methanol-nước 2:1

F3.1 F3.2(0.8g) F3.3(0.5g)

-CC,silicagel
- CC pha đảo RP-18
- hệ dung môi
- Hệ dung môi methanol-
dichloromethane:methanol:
nước 1.5:1
nước 5:1:0.1

Chất 1(5mg) Chất 2(6 mg)

3.4. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của chất đã phân lập được

3.4.1. Chất 1
Chất 1 thu được khi tinh chế phân đoạn F3.2 có dạng keo không màu, [α]D -
84.0 (MeOH; c 0.16). C26H32O11, M = 520.5.

46
 1
H NMR (500 MHz, CD3OD):  4.78 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-7), 3.69 (1H, d,
J = 5.0 Hz, Ha-9), 4.26 (1H, m, Hb-9), 4.73 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-7), 3.72 (1H,
d, J = 5.0 Hz, Ha-9), 4.26 (1H, m, Hb-9), 7.05 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 7.16 (1H,
d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.94 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-6), 6.97 (1H, d, J = 1.5 Hz,
H-2), 6.79 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.83 (1H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-6), 4.89
(1H, d, J = 7.0 Hz, H-1), 3.87 (3H, s, OCH3), 3.89 (3H, s, OCH3).
13
C NMR (125 MHz, CD3OD):  55.3 (C-8), 87.0 (C-7), 72.2 (C-9'), 55.5 (C-

8'), 87.5 (C-7'), 72.6 (C-9), 133.8 (C-1), 111.0 (C-2), 146.2 (C-3), 148.2 (C-4),

116.2 (C-5), 119.8 (C-6), 137.5 (C-1'), 111.7 (C-2'), 147.5 (C-3'), 151.0 (C-4'),

118.1 (C-5'), 120.0 (C-6'), 102.8 (C-1''), 74.9 (C-2''), 77.8 (C-3''), 71.3 (C-4''),

78.2 (C-5''), 62.5 (C-6''), 56.4 (OMe), 56.8 (OMe).

3.4.2. Chất 2
Chất 2 thu được khi tinh chế phân đoạn F3.3 có dạng keo không màu,
C28H36O13 , M= 580,58
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ 6.73 (2H, s, H-2', 6'), 6.67 (2H, s, H-2, 6),
4.87 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1''), 4.77 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-7), 4.72 (1H, d, J = 4.5
Hz, H-7'), 4.28 (2H, dd, J = 15.0, 9.0 Hz, H-4b, H-9b), 3.91 (2H, dd, J = 9.0, 3.0
Hz, H-4a, H-9a), 3.86 (6H, br s, 3',5'-OCH3), 3.85 (6H, br s, 3,5-OCH3), 3.79 (1H,
dd, J = 12.0, 2.5 Hz, H-'''a), 3.67 (1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6''b), 3.49 (1H, m,
H-2''), 3.43 (2H, m, H-3'', H-4''), 3.21 (1H, m, H-5'').
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ 133.2 (C-1), 104.7 (C-2, 6), 154.6 (C-3,
5), 136.3 (C-4), 87.3 (C-7), 55.7 (C-8), 73.0 (C-9), 139.7 (C-1'), 105.0 (C-2', 6'),
149.5 (C-3', 5'), 135.8 (C-4'), 87.8 (C-7'), 55.9 (C-8'), 73.1 (C-9'), 105.5 (C-1''),
75.9 (C-2''), 78.0 (C-3''), 71.5 (C-4''), 78.5 (C-5''), 62.7 (C-6''), 57.2 (3',5'-OCH3),
57.0 (3,5-OCH3).

47
 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

4.1.1. Hợp chất 1 (pinoresinol-4-O-β-D-glucoside):

Hợp chất 1 thu được từ phân đoạn F3.2 từ cặn chiết EtOAc của cây Kim
ngân là chất keo không màu.

Việc xác định cấu trúc chất 1 dựa vào phổ 13C- NMR, DEPT và 1H- NMR

Hình 4.1. Phổ 13C-NMR của 1

48
 Hình 4.2. Phổ DEPT của 1
Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử cacbon trong đó 12 tín hiệu
cacbon tại  111.6-151.0 (6 nhóm CH, 6 C bậc bốn) khẳng định sự có mặt của 2
vòng thơm thế 1,3,4. Ngoài các tín hiệu điển hình của phân tử đường glucose tại
độ dịch chuyển  102.8, 74.9, 77.8, 71.3, 78.2, 62.5 còn xuất hiện tín hiệu của hai
nhóm metin và hai nhóm metylen đính với oxy tại  87.0, 87.5 (CH) và 72.2, 72.6
(CH2), hai nhóm methoxy tại  56.4 và 56.8.

49
 Hình 4.3. Phổ 1H-NMR của 1

Hợp chất 1 thu được dưới dạng chất keo không màu. Phổ 1H-NMR xác định
sự có mặt của 2 vòng thơm thế kiểu 1,3,4 bởi các tín hiệu proton hệ spin ABX tại
 6.97 và 7.05 (d, J=2.0 Hz),  6.79 và 7.16 (d, J=8.0 Hz),  6.83 và 6.94 (dd,
J=2.0, 8.0 Hz) và tín hiệu của phân tử đường được xác định bởi proton anome tại
 4.90 (1H, d, J=7.0 Hz). Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu của hai nhóm methoxy
tại  3.87 và 3.89, hai nhóm oxymethine tại  4.72 (1H, d, J=4.0 Hz) và  4.78
(1H, d, J=4.0 Hz).

Từ các dữ kiện đã phân tích ở trên có thể nhận định 1 là một hợp chất có dạng
khung lignan monoglucoside. So sánh cách dữ kiện phổ thu được với các số liệu
phổ trước đó cho phép xác định 1 là pinoresinol-4-O-β-D-glucoside [1].

50
Bảng 4.1. Các dữ liệu phổ 1H- NMR và 13C- NMR của hợp chất 1

Vị trí Chất 1

H (m, JHz) C

1 133.8 (C-1)

2 7.05 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2) 111.0 (C-2)

3 146.2 (C-3)

4 148.2 (C-4)

5 7.16 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5) 116.2 (C-5)

6 6.94 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz,H-6) 119.8 (C-6)

7 4.78 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-7) 87.0 (C-7)

8 55.3 (C-8),

9a 3.72 (1H, d, J = 5.0 Hz, Ha-9) 72.6 (C-9)

9b 4.26 (1H, m, Hb-9)

1' 137.5 (C-1')

2' 6.97 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-2) 111.7 (C-2')

3' 147.5 (C-3')

4' 151.0 (C-4')

51
 5' 6.79 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5) 118.1 (C-5')

6' 6.83(1H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz,H-6) 120.0 (C-6')

7' 4.73 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-7) 87.5 (C-7')

8' 55.5 (C-8')

9'a 3.69 (1H, d, J = 5.0 Hz, Ha-9) 72.2 (C-9')

9'b 4.26 (1H, m, Hb-9)

1'' 4.89 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-1) 102.8 (C-1'')

2'' 74.9 (C-2'')

3'' 77.8 (C-3''),

4'' 71.3 (C-4''),

5'' 78.2 (C-5'')

6'' 62.5 (C-6'')

OCH3 3.87 (3H, s) 56.4 (OMe)

OCH3 3.89 (3H). 56.8 (OMe)

δ của hợp chất pinoresinol-4-O-β-D-glucoside đo trong CD3OD, 250.13

MHz (proton), 62.90 MHz (cacbon) a đo trong CD3OD, b125 MHz, c 500 MHz.

4.1.2. Hợp chất 2 (syringaresinol-4-O--D-glucopyranoside):

Hợp chất 2 thu được từ phân đoạn F3.3 từ cặn chiết EtoAc của cây Kim
ngân là chất keo không màu.

Hợp chất 2: (syringaresinol-4-O--D-glucopyranoside)

52
 Hợp chất 2 có những tín hiệu phổ 1D-NMR tương đồng với 1 chứng tỏ đây
cũng là một lignan monoglucoside. Điểm khác biệt là tín hiệu proton hệ spin ABX
được thay thế bởi 2 tín hiệu singlet proton vòng thơm tại 6.73 và 6.67 và có thêm
tín hiệu nhóm methoxy. Các số liệu phổ thu được của 2 hoàn toàn trùng khớp với
số liệu đã công bố của hợp chất syringaresinol-4-O--D-glucopyranoside [2].

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của 2

53
Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của 2

Hình 4.6. Phổ DEPT của 2

54
 Bảng 4.2. Các dữ liệu phổ 1H- NMR và 13C- NMR của hợp chất 2

Vị trí Chất 2

H (m, JHz) C

1 133.2 (C-1)

2 6.67 (2H, s) 104.7 (C-2)

3 154.6 (C-3)

4a 3.91 (2H, dd, J = 9.0, 3.0 Hz) 136.3 (C-4)

4b 4.28 (2H, dd, J = 15.0, 9.0 Hz)

5 154.6 (C- 5)

6 6.67 (2H, s) 104.7 (C-6)

7 4.77 (1H, d, J = 4.0 Hz) 87.3 (C-7)

8 55.7 (C-8)

9a 3.91 (2H, dd, J = 9.0, 3.0 Hz) 73.0 (C-9)

9b 4.28 (2H, dd, J = 15.0, 9.0 Hz)

1' 139.7 (C-1')

2' 6.73 (2H, s) 105.0 (C-2'),

3' 149.5 (C-3')

4' 135.8 (C-4')

5' 149.5 (C- 5')

6' 6.73 (2H, s) 105.0 (C-6'),

7' 4.72 (1H, d, J = 4.5 Hz) 87.8 (C-7')

55
 8' 55.9 (C-8')

9' 73.1 (C-9')

1'' 4.87 (1H, d, J = 7.5 Hz) 105.5 (C-1'')

2'' 3.49 (1H, m) 75.9 (C-2'')

3'' 3.43 (2H, m) 78.0 (C-3''),

4'' 3.43 (2H, m) 71.5 (C-4'')

5'' 3.21 (1H, m) 78.5 (C-5'')

6''a 3.79 (1H, dd, J = 12.0, 2.5 Hz) 62.7 (C-6'')

6''b 3.67 (1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz)

3,5-OCH3 3.85 (6H, br s) 57.0 (3,5-OCH3).

3',5'-OCH3 3.86 (6H, br s) 57.2 (3',5'-OCH3)

*δ của hợp chất syringaresinol-4-O--D-glucopyranoside đo trong CD3OD,

250.13 MHz (proton), 62.90 MHz (cacbon) a đo trong CD3OD, b125 MHz, c 500
MHz.

56
 KẾT LUẬN
1. Đã thu thập mẫu và xác định được tên khoa học của cây Kim ngân là
Lonicera japonica Thunb.

2. Đã xây dựng được một quy trình điều chế các cặn chiết từ bột cây kim
ngân là ethyl acetate, chứa lớp họat chất mà chúng tôi quan tâm nghiên cứu.

3. Bằng các phương pháp sắc ký và phổ kết hợp, đã phân lập được 2 hợp
chất từ cặn ethyl axetate của cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb). Các gợp
chất đó là :

- Chất 1 là pinoresinol-4-O-β-D-glucoside

- Chất 2 là syringaresinol-4-O--D-glucopyranoside

57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ardó, L., Yin, G.J., Xu, P., Váradi, L., Szigeti, G., Jeney, Z., Jeney, G.,
2008. Chinese herbs (Astragalus membranaceus and Lonicera japonica)
and boron enhance the nonspecific immune response of Nile tilapia
(Oreochromis niloticus) and resistance against Aeromonas hydrophila.
Aquaculture 275, 26–33.
2. Bassoli, B.K., Cassolla, P., Borba-Murad, G.R., Constantin, J., Salgueiro-
Pagadigorria, C.L., Bazotte, R.B., da Silva, R.S.d.S.F., de Souza, H.M.,
2008. Chlorogenic acid reduces the plasma glucose peak in the oral glucose
tolerance test: effects on hepatic glucose release and glycaemia. Cell
Biochemistry and Function 26, 320–328.
3. Cai, Y.Z., Luo, Q., Sun, M., Corke, H., 2004. Antioxidant activity and
phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated
with anticancer. Life Sciences 74, 2157–2184.
4. Cao, C.P., Huang, Z.N., Qian, P.L., Pan, X.X., 1986a. Studies on the anti-
pregnant effect of the Lonicera japonica thunb extract. Pharmaceutical
Industry 17, 115–117 (in Chinese).
5. Cao, C.P., Huang, Z.N., Qian, P.L., Yan, D.P., Shen, Y.P., Pan, X.X.,
1986b. Pharmacological study of pregnancy termination effect of Lonicera
japonica thunb. Pharmaceutical Industry 17, 319–321 (in Chinese).
6. Chang, C.W., Lin, M.T., Lee, S.S., Karin, C.S., Liu, C., Hsu, F.L., Lin, J.Y.,
1995. Differential inhibition of reverse transcriptase and cellular DNA
polymerase-a activities by lignans isolated from Chinese herbs, Phyllanthus
myrtifolius Moon, and tannins from Lonicera japonica Thunb and
Castanopsis hystrix. Antiviral Research 27,367–374.
7. Chang, J., Sheng, P.P., Zhang, X.M., 2003. The toxicological assessment
of Lonicera japonica on food safety. The Chinese Academic Medical
Magazine of Organisms 2, 63–64 (in Chinese).

58
8. Choi, C.W., Jung, H.A., Kang, S.S., Choi, J.S., 2007. Antioxidant
constitutes and a new triterpenoid glycoside from Flos lonicerae. Archives
of Pharmacal Research 30, 1–7.
9. Chen, C.X., Wang, W.W., Ni, W., Chen, N.Y., Zhou, Jun, 2000.
Triterpenoid glycosides from the Lonicera japonica. Acta Botanica
Yunnanic 22, 201–208 (in Chinese).
10.Chen, C.Y., Qi, L.W., Li, H.J., Li, P., Yi, L., Ma, H.L., Tang, D., 2007.
Simultaneous determination of iridoids, phenolic acids, flavonoids, and
saponins in Flos lonicerae and Flos lonicerae japonicae by HPLC-DAD-
ELSD coupled with principal component analysis. Journal of Separation
Science 30, 318–3192.
11.Chen, J.J., Fang, J.G., Wan, J., Feng, L., Zhang, Y.W., Zhao, J.H., Zhao,
J.J., Wang, N., Chen, S.H., 2009. An in vitro study of the anti-
cytomegalovirus effect of chlorogenic acid. Herald of Medicine 28, 1138–
1140.
12.Chen, X.C., 2008. Utilization of Lonicera japonca. Forest By-Product and
Speciality in China 92, 37–39 (in Chinese). Committee for the
pharmacopoeia of PR China, 1995. Pharmacopoeia of PR China,
Part I. Chemical Industrial Press, Guangdong Science and Technology
Publishing House (in Chinese).
13.Committee for the Pharmacopoeia of PR China, 2010. Pharmacopoeia of
PR China, Part I. China Medical Science and Technology Press, PR China
(in Chinese).
14.Du, H.F., Zhang, Y., Wen, D.Q., Yang, D.J., 2009. Identify the contents of
fresh flower of L. japonica using GC–MS with the different extraction
methods. TCM Research of Chongqing 60, 13–15 (in Chinese).
15. Ehrman, T.M., Barlow, D.J., Hylands, P.J., 2010. In silico search for multi-
target anti-inflammatories in Chinese herbs and formulas. Bioorganic &
Medicinal Chemistry 18, 2204–2218.
59
16.Fan, H.W., Li, Y.B., Sun, M., Zhu, Q., 2007. Antithrombus effect of
honeysuckle and its organic acid compounds in vitro. Pharmacology and
Clinics of Chinese Materia Medica 23, 34–36 (in Chinese).
17.Feng, Y., 2010. Study on the quality of Lonicerae japonica flos from
different habitats. Chinese Medicine Journal Research Practice 24, 34–35
(in Chinese).
18.Gao, Y.M., Mu, H.J., 1995. Studies on the chemical constitutes of Japanese
Honeysuckle (Lonicera Japonica). Chinese Traditional and Herbal Drugs
26, 568–656 (in Chinese).
19.Gu, G.G., et al., 2007. Sheng Nong Ben Cao Jing. Harrbing Publishing
House, Harrbing (in Chinese).
20.He, S.Q., Hu, Q.F., Yang, G.Y., 2010. Research of honeysuckle. Yunnan
Chemical Technology 37, 72–75 (in Chinese).
21.http://www.satcm.gov.cn. State Administration of Traditional Chinese
Medicine of the People’s Republic of China (in Chinese).
22.http://www.zysj.com.cn (in Chinese).
23.Hu, C.M., Jiang, H., Liu, H.F., Li, R., Li, J., 2008. Effects of LJTF on
immunological liver injury in mice. Anhui Medical and Pharmaceutical
Journal 12, 295–296 (in Chinese).
24.Hu, K.J., Sun, K.X., Wang, J.L., 2001. Inhibited effect of chlorogenic acid
on virus in vitro. Journal of Harrbing Medical University 35, 430–432 (in
Chinese).
25.Huang, L.Y., Lv, Z.Z., Li, J.B., 1996. Studies on the chemical constitutes
of Japanese Honeysuckle. Chinese Traditional and Herbal Drugs 27, 645–
647 (in Chinese).
26.Huo, X.F., Tang, Y.P., Zhang, Q.L., Luo, S.H., 2003. Effect of chlorogenic
acid on the macrophages induced by lipoplysaccharide. Acta Academiae
Medicine Zunyi 26, 507–508 (in Chinese).

60
27.Ikeda, N., Ishihara, M., Tsuneya, T., Kawakita, M., Yoshihara, M., 1994.
Volatile components of honeysuckle (Lonicera japonica Thunb.) flowers.
Flavour and Fragrance Journal 9, 325–331.
28.Iwanhashi, H., Negoroy, I., 1986. Inhibation by chlorogenic acid of
haematincatalysed retinoic acid 5,6-epoxidation. Journal of Biochemistry
239, 641–646.
29.Jeong, J.J., Ha, Y.M., Jin, Y.C., Lee, E.J., Kim, J.S., Kim, H.J., Seo, H.G.,
Lee, J.H., Kang, S.S., Kim, Y.S., Chang, K.C., 2009. Rutin from Lonicera
japonica inhibits myocardial ischemia/reperfusion-induced apoptosis in
vivo and protects H9c2 cells against hydrogen peroxide-mediated injury via
ERK1/2 and PI3K/Akt signals in vitro. Food and Chemical Toxicology 47,
1569–1576.
30.Ji, L., Pan, J.G., Xu, Z.L., 1990. The GC–MS analysis of volatile oil from
Lonicera japonica thunb. Chinese Journal of Chinese Materia Medica l5,
680 (in Chinese).
31.Jiao, S.G., 2009. Research and comprehensive utilization of honeysuckle.
Qilu Pharmaceutical Affairs 28, 487–489 (in Chinese).
Kakuda, R., Imai, M., Yaoita, Y., Machida, K., Kikuchi, M., 2000.
Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica.
Phytochemistry 55, 879–881.
32.Kang, O.H., Choi, Y.A., Park, H.J., Lee, J.Y., Kim, D.K., Choi, S.C., Kim,
T.H., Nah, Y.H., Yun, K.J., Choi, S.J., Kim, Y.H., Bae, K.H., Lee, Y.M.,
2004. Inhibition of trypsin-induced mast cell activation by water fraction
of Lonicera japonica. Archives of Pharmacal Research 27, 1141–1146.
33.Kang, X., Li, D.S., Deng, C., Yuan, J.L., 2010. Study on antimicrobial
activity of extracts from Lonicera japonica Thunb. Journal of Anhui
Agricultural Science 38, 14935–14936 (in Chinese).

61
34.Kawai, H., Kuroyanngi, M., Umehara, K., Ueno, A., Satake, M., 1988.
Studies on the saponins of Lonicera japonica Thunb. Chemical &
Pharmaceutical Bulletin 36, 4769–4775.
35.Kim, D.I., Park, J.D., Kim, S.G., Kuk, H., Jang, M.S., Kim, S.S., 2005.
Screening of some crude plant extracts for their acaricidal and insecticidal
efficacies. Journal of Asia-Pacific Entomology 8, 93–100.

62