Đại học Quốc gia TP HCM

Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

Viện Tế bào gốc

KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN

VÀ TẠO DÒNG
CẤY CHUYỀN?
Passage / Subculture
CẤY CHUYỀN
Khi nào thì cần cấy chuyền?
When the cell density (cells/cm2
substrate) reaches a level such that all
of the available substrate is occupied,
or when the cell concentration (cells/mL
medium) exceeds the capacity of the
medium, growth ceases or is greatly
reduced.
 CẤY CHUYỀN
Khi nào thì cần cấy chuyền?

Cell Confluency (source: https://www.mirusbio.com/transfectopedia/methods)

NUÔI CẤY SƠ CẤP
 NUÔI CẤY THỨ CẤP

Nuôi cấy thứ cấp là nuôi cấy tế bào được tính từ sau lần cấy chuyền đầu tiên
SVF (stromal vascular fraction)
trước khi được đưa vào nuôi cấy
là một phức hợp gồm tế bào máu
ngoại vi, MSC, tế bào tiền thân nội
mô, tế bào cơ trơn, tế bào quanh
mạch (pericyte), nguyên bào sợi,
dưỡng bào, tế bào tiền thân tạo
mỡ,… [38, 115]. Sau vài thế hệ
cấy chuyền SVF trong điều kiện
tiêu chuẩn, quần thể tế bào trở
nên khá tương đồng của tế bào
trung mô – ASC [38].

Gentile, P., et al. (2012)

Siennicka, K., et al. (2016)
 CẤY CHUYỀN
Các bước cơ bản của cấy chuyền

• HÚT BỎ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CŨ

• RỬA BỀ MẶT GIÁ THỂ NUÔI (CÓ TẾ BÀO BÁM DÍNH)
• TÁCH CÁC TẾ BÀO BÁM KHỎI BỀ MẶT DỤNG CỤ NUÔI
• PHA LOÃNG CÁC TẾ BÀO BẰNG MÔI TRƯỜNG MỚI
Subculture of Monolayer. Stages in the subculture and growth cycle of
monolayer cells after trypsinization
 Cấy chuyền tế bào bám dính
Loại bỏ môi trường khỏi bình nuôi
Rửa bề mặt bình nuôi với PBS- (free Ca2+
Mg2+)

Bổ sung dung dịch trypsin/EDTA (0,5-

3ml/bình)
Ủ trong tủ ấm 370C

Khi tế bào co tròn, nổi lên tiến hành bổ sung

một lượng môi trường có chứa huyết thanh
Rửa loại bỏ trypsin bằng cách ly tâm 1000-
3000 vòng/phút

Tái huyền phù và pha loãng theo tỉ lệ thích

hợp
 Expansion of Mesenchymal Stem Cells

1.Subculture cells once they have reached approximately 80% confluence and are actively proliferating.
IMPORTANT: Subculture cells before reaching 100% confluency.
2.Carefully remove the medium from the 10-cm tissue culture plate containing the confluent layer of human
mesenchymal stem cells. Apply 3-5 mL of Trypsin-EDTA Solution (SM-2003-C) and incubate in a 37°C incubator
for 3-5 minutes.
3.Inspect the plate and ensure the complete detachment of cells by gently tapping the side of the plate with the
palm of your hand.
4.Add 5 mL Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium (SCM015 or SCM045) to the plate.
5.Gently rotate the plate to mix the cell suspension. Transfer the dissociated cells to a 15 mL conical tube.
6.Centrifuge the tube at 300 x g for 3-5 minutes to pellet the cells.
7.Discard the supernatant
8.Apply 2 mL Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium (pre-warmed to 37°C) containing 8 ng/mL FGF-2 to
the conical tube and resuspend the cells thoroughly.
IMPORTANT: Do not vortex the cells.
9. Count the number of cells using a hemocytometer.
10.Plate the cells at a density of 5,000-6,000 cells per cm2 into the appropriate flasks, plates, or wells in
Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium containing 8 ng/mL FGF-2.
11.Cells can be frozen in MSC growth media plus 10% DMSO (D2650) at a density of 2X106 cells/vial.
 CẤY CHUYỀN
Các phương pháp tách tế bào lên khỏi bề mặt dụng cụ nuôi

1. Trypsin/EDTA
2. EDTA (EthyleneDiamineTetraAcetic)
3. Scrape
4. …
 CẤY CHUYỀN
Vai trò của trypsin/EDTA
 CẤY CHUYỀN
Vai trò của EDTA

C10H16N2O8

 aminopolycarboxylic acid, colourless, water-soluble solid

 able to "sequester" metal ions such as Ca2+ and Mg2+
 CẤY CHUYỀN
Scrape

Scraper
 CẤY CHUYỀN
Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền

1. Density of Culture
 CẤY CHUYỀN
Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền

2. Exhaustion of Medium
 CẤY CHUYỀN
Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền

3. Time Since Last Subculture

Ideally, a cell concentration should be found

that allows for the cells to be subcultured
after 7 days, with the medium being
changed after 3–4 days.
(Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique
and Specialized Applications, Sixth Edition)
 CẤY CHUYỀN
Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền

4. Requirements for Other Procedures

(1) cells should not be subcultured while still

within the lag period
(2) cells should always be taken between
the middle of the log phase and the time
before which they have entered the
plateau phase of a previous subculture
 CẤY CHUYỀN
Cell Concentration at Subculture

As a general rule, most continuous cell lines subculture satisfactorily at a seeding

concentration of between 1 × 10^4 and 5 × 10^4 cells/mL
 Spinner bioreactor
Fig. 13.5. Stirrer Culture. A small stirrer flask,
based on the Techne design, with a capacity of
250–1000 mL. The cell suspension is stirred by
a pendulum, which rotates in an annular
depression in the base of the flask.
 CẤY CHUYỀN
Propagation in Suspension

 trypsin treatment is not required so subculture is quicker and less traumatic for the cells

 scale-up is easier

 replacement of the medium (feeding) is not usually carried out with suspension cultures
 passage number / generation number
The passage number is the number of times that the culture has been
subcultured, whereas the generation number is the number of doublings
that the cell population has undergone, given that the number of doublings in
the primary culture is very approximate.

Serial subculture and the relationship

between passage number,
generation number and split ratio.
(Figure modified from Fig. 12.5,
Culture of Animal Cells, 4th ed,
Freshney (2000) and reproduced by
permission of Wiley-Liss, a division of
John Wiley & Sons.)
TẠO DÒNG?
Cloning
 Cell line / Cell Clone /
Cell lineage / Cell Strain

Once a primary culture is subcultured (or passaged),

it becomes known as a cell line. This term implies
the presence of several cell lineages of either
similar or distinct phenotypes. If one cell lineage is
selected, by cloning (see Protocol 14.1), by
physical cell separation (see Chapter 15), or by any
other selection technique, to have certain specific
properties that have been identified in the bulk of the
cells in the culture, this cell line becomes known as
a cell strain.
Cell lineage denotes the developmental history of a tissue or organ from the
fertilized embryo. Cell lineage can be studied by marking a cell (with fluorescent
molecules or other traceable markers) and following its progeny after cell division.
 TẠO DÒNG?
Cloning

Cloning is to isolate pure cell strains or cloning may help to reduce

the heterogeneity of a culture
 continuous cell line / continuous cell strain
If a cell line transforms in vitro, it gives rise to a continuous cell line, and if selected or
cloned and characterized, it is known as a continuous cell strain.
Dilution Cloning
Cloning in Microtitration Plates
 Cloning in Suspension

Some cells, particularly hematopoietic

stem cells and virally transformed
fibroblasts, clone readily in suspension.
To hold the colony together and
prevent mixing, the cells are suspended
in agar or Methocel and plated on an
agar underlay or into dishes that need
not be treated for tissue culture.
Feeder Layers. Cells are irradiated
and trypsinized (or may be
trypsinized first and then irradiated
in suspension, or treated with
mitomycin C) and seeded at a low
density to enhanc e cloning
efficiency. (Photo courtesy of M. G.
Freshney.)
 TẠO DÒNG
Thu nhận dòng
Isolation of Monolayer Clones
 TẠO DÒNG
Thu nhận dòng
Isolation of Suspension Clones
 KHÓ KHĂN VÀ GIẢI PHÁP
TRONG CHỌN DÒNG TẾ BÀO

 Dòng tế bào có thời gian phân chia giới hạn, sau vài lần cấy
chuyền sẽ lão suy, thoái hóa: Clone không phát triển mãi, có thể
biến đổi, đặc điểm mong muốn thay đổi

 1 tế bào khó sống  cần có môi trường đặc biệt, bổ sung GF,
đồng nuôi cấy với feeder

 Đại thực bào và tế bào thần kinh không phân chia in vitro --> có
thể dùng như nuôi sơ cấp
 ỨNG DỤNG
CỦA TẠO DÒNG TẾ BÀO
Sản xuất kháng thể đơn dòng
 ỨNG DỤNG
CỦA TẠO DÒNG TẾ BÀO
Liệu pháp gene
 ỨNG DỤNG
CỦA TẠO DÒNG TẾ BÀO
Các ứng dụng khác trong mô hình thử nghiệm in vitro

 Nghiên cứu sinh học tế bào: chu trình tế bào

 Cải tiến di truyền: tăng năng suất tạo sản phẩm sinh học
 Dòng tế bào ung thư: thử nghiệm chất kháng phân bào
 Dòng fibroblast: thử nghiệm tính gây kích thích của mỹ phẩm
…