9

โครงการวิจัยรหัส ว-ท(ด) 159.52

การทดสอบระหวางหองปฏิบัติการเพื่อตรวจประสิทธิภาพอิมมูโนโครมาโตกราฟคสตริป
สําหรับตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนอยางรวดเร็ว
Collaborative Study to Validate the Efficiency of Rapid Immunochromatographic Strip for
the Detection of Zearalenone Contamination
ุ 1 รัชนี ฮงประยูร2 วราภา มหากาญจนกุล3 สุวรรณา กลัดพันธุ1 ชนัญญา ชวยศรีนวล1 และ กิตติศักดิ์ อินทรเสวก4
ธนภูมิ มณีบญ
Thanapoom Maneeboon1 Ratchanee Hongprayoon2 Warapa Mahakarnchanakul3
Suwanna Kladpan1 Chananya Chuaysrinule1 and Kittisak Insawake4
1
ฝายเครื่องมือและวิจยั ทางวิทยาศาสตร สถาบันวิจัยและพัฒนาแหงมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร กรุงเทพฯ
2
ภาควิชาโรคพืช คณะเกษตร กําแพงแสน มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน จ.นครปฐม
3
ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะอุตสาหกรรมเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร กรุงเทพฯ
4
ศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน จ.นครปฐม

บทคัดยอ

งานวิจัยนี้มีจุดประสงคเพื่อทดสอบประสิทธิภาพชุดตรวจสอบสารพิษซีราลีโนนแบบอิมมูโนโครมาโตกราฟ
ฟคสตริปสําหรับใชคัดกรองการปนเปอนซีราลีโนนแบบเชิงคุณภาพในขาวโพดซึ่งเปนวัตถุดิบอาหารสัตวที่สําคัญ
โดยการทดสอบความใชไดในระดับหองปฏิบัติการ (In-house validation) และการทดสอบประสิทธิภาพระหวาง
หองปฏิบัติการ (Collaborative study) โดยพบวาชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริปที่ไดพัฒนาขึ้นมี
คา Cut-off ของซีราลีโนนที่ละลายใน PBS เทากับ 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร และในขาวโพดเทากับ 100
ไมโครกรัม/กิโลกรัม มีความจําเพาะเจาะจงสูง (Specificity) ตอสารพิษซีราลีโนน และไมเกิดปฏิกิริยาขาม
(Cross-reactivity) กับสารพิษเชื้อราชนิดอะฟลาทอกซิน บี1 ดีออกซิไนวาลีนอล ฟูโมนิซิน บี1 ออคราทอกซิน
เอ และ ที-2 ทอกซิน โดยใหผลทดสอบที่มีความถูกตองและสอดคลองกับผลการทดสอบจากวิธี HPLC ใชเวลา
ในการทดสอบเพียง 15 นาที ผลการทดสอบประสิทธิภาพระหวางหองปฏิบัติการโดยหองปฏิบัติการจํานวน 5
แหง ในการตรวจสอบซีราลีโนนตัวอยางขาวโพดจํานวน 3 ตัวอยาง ที่มีคาการปนเปอนเทากับ not detected,
85.3 และ 205.1 ไมโครกรัม/กิโลกรัม พบวาหองปฏิบัติการทั้งหมดสามารถรายงานผลการทดสอบไดอยาง
ถูกตอง ผลการประเมินความพึงพอใจในชุดตรวจสอบพบวาผูใชงานมีความพึงพอใจโดยรวมในระดับมากที่สุด
เมื่อวิเคราะหตนทุนการผลิตในระดับหองปฏิบัติการของอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป (ขนาดบรรจุ 50 สตริป)
พบวามีตนทุนการผลิตเทากับ 1,800 บาท/ชุด ผลการวิจัยนี้แสดงใหเห็นวาชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟค
สตริปที่พัฒนาขึ้นนี้สามารถใชการคัดกรองการปนเปอนสารพิษซีราลีโนนในวัตถุดิบอาหารสัตวได สามารถทําได
รวดเร็ว มีตนทุนการทดสอบตอตัวอยางไมสูงมาก และสามารถทําการทดสอบหลายตัวอยางพรอมกันได

คําสําคัญ : ซีราลีโนน, อิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป , ชุดตรวจสอบแบบรวดเร็ว,

การทดสอบประสิทธิภาพ, การทดสอบระหวางหองปฏิบัติการ
 10

ABSTRACT

The objective of this research is to evaluate the efficacy of an immunochromatographic

strip for qualitative screening of zearalenone in maize, an important feed raw material.
In-house validation and inter-laboratory collaborative study were conducted. A result of
validation study showed that a developed immunochromatographic strip had a visual cut-off
value at 50 ng/ml in PBS buffer and 100 µg/kg in maize sample. The specificity of the test kit
was 100% for zearalenone and 0% for other mycotoxins (i.e., aflatoxin B1, deoxynivalenol,
fumonisin B1, ochratoxin A and T-2 toxin). Significantly good agreement was observed between
the developed immunochromatographic strip and HPLC analysis. Qualitative result was
accomplished in less than 15 min. A collaborative study in 5 laboratories was performed to
validate the immunochromatographic strip. Three ground maize samples containing levels of
zearalenone at not detectable (Blank sample), 85.3 and 205.1 µg/kg were tested. Result of
analysis demonstrated satisfactory result from all laboratories participated. The overall results
of user satisfaction were at the highest level. Cost estimation of total production cost of the
developed strip test showed 1,800 baht per vial of 50 strips. These results demonstrates that
the developed immunochromatographic strip is suitable for the routine screening of
zearalenone in feed raw materials as well as offers a rapid and cost-effective methodology with
high sample throughput.

Key words: Zearalenone, Immunochromatographic strip, Rapid test kit,

Method validation, Collaborative study
 11

กิตติกรรมประกาศ

โครงการวิ จั ย นี้ ไ ด รั บ ทุ น อุ ด หนุ น วิ จั ย จากสถาบั น วิ จั ย และพั ฒ นาแห ง มหาวิ ท ยาลั ย เกษตรศาสตร

ปงบประมาณ 2552

ขอขอบคุณศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน จ. นครปฐม

และฝายเครื่องมือและวิจัยทางวิทยาศาสตร สถาบันวิจัยและพัฒนาแหงมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร กรุงเทพฯ ที่
ใหการสนับสนุนเครื่องมือวิทยาศาสตรและอุปกรณตางๆ ที่จําเปนในการวิจัยครั้งนี้

ขอขอบคุ ณหองปฏิบั ติ การภาครั ฐ และภาคเอกชนที่ใหความอนุเคราะหเขารว มกิจกรรมการทดสอบ

ประสิทธิภาพชุดตรวจสอบอิมมูโนมาโตกราฟฟค สตริป ระหวางหองปฏิบัติการ (Collaborative study) ไดแก
- อาจารยวชิระ สิงหคง ศูนยสงเสริมและตรวจสอบการผลิตตามมาตรฐานความปลอดภัยทางอาหาร
มหาวิทยาลัยราชภัฏกําแพงเพชร จ. กําแพงเพชร
- นางลักษณกนก สินธุประสพชัย หองปฏิบัติการชีวเคมี -พิษวิทยา สถาบั นสุ ขภาพสัตวแหงชาติ
กรมปศุสัตว กรุงเทพฯ
- นายปกรณ จาละ ห องปฏิ บั ติการตรวจวิเ คราะหส ารพิษจากเชื้ อรา หนว ยชัน สูตรโรคสัต ว
คณะสัตวแพทยศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน จ. นครปฐม 0

- นางสาววารุณี บัวลา บริษัทหองปฏิบัติการกลาง (ประเทศไทย) จํากัด สาขาฉะเชิงเทรา

- นางสาวพัชรี ไทยเจริญ บริษัทหองปฏิบัติการกลาง (ประเทศไทย) จํากัด สาขาขอนแกน
 12

บทนํา
ซีราลีโนน (Zearalenone) เปนสารพิษที่สรางจากเชื้อราฟวซาเรียมหลายสายพันธุ (Fusarium spp.)
เชน Fusarium garminearum, F. roseum, F. moniliforme และ F. sporotrichioides ที่ปนเปอนใน
ขาวบารเลย ขาวสาลี ขาวโพด เมล็ดดอกทานตะวัน และธัญพืชอื่นๆ (L’vova et al., 1993) สารพิษชนิดนี้มีฤทธิ์
เชนเดียวกับกลุมฮอรโมนเอสโตรเจนจึงสงผลตอระบบสืบพันธุของสัตว ทําใหเกิดอาการผิดปกติ เชน การบวมของ
อวัยวะเพศ การปลิ้นของทวารหนัก การพัฒนาเตานมเร็วกวาปกติ การแทงและการตกเลือด พบอาการรุนแรง
เกิดขึ้นในสุกรขนาดเล็กที่ไดรับอาหารที่มีซีราลีโนนระดับ 1,000 ไมโครกรัม/กิโลกรัม นอกจากนี้ยังสงผลใหมีอัตรา
การผสมติดต่ํา ในแมสุกรที่ไดรับซีราลีโนนระดับ 1,000–5,000 ไมโครกรัม/กิโลกรัม (Diekman and Green,
1992) การสรางสารพิษซีราลีโนนจากเชื้อราฟวซาเรียมไมคอยพบในระยะกอนการเก็บเกี่ยว แตในสภาพแวดลอม
ที่เหมาะสม ไดแกอุณหภูมิต่ําหรือปานกลาง โดยเฉพาะที่อุณหภูมิประมาณ 27 องศาเซลเซียส จะสงเสริมการผลิต
สารพิษชนิดนี้กับเมล็ดพันธุขาวโพดหรือเมล็ดธัญพืชในโรงเก็บ สารพิษซีราลีโนนมีความคงทนตอความรอนและ
สามารถคงอยูไดแมวาจะเก็บไวเปนระยะเวลานาน หรือผานกระบวนการแปรรูปหรือการเติมสารบางชนิด เชน
propionic acid หรือ mold retardants ก็ตาม
ตั้งแตป พ.ศ 2543 มีรายงานการปนเปอนของสารพิษซีราลีโนนในผลผลิตการเกษตรและพบวามีการ
ปนเป อนรุ น แรงมากที่ สุ ดในป 2545 โดยตรวจพบการปนเปอนในตัว อยางวัตถุดิบ ทุกชนิด ทั้งกากถั่ว เหลือ ง
ขาวโพด ผลิตภัณฑจากถั่วลิสง ปลายขาว รํา มันสําปะหลัง และปลาปน แตในป 2546 ไมมีรายงานวาพบการ
ปนเปอนของซีราลีโนนในวัตถุดิบ ยกเวน ในผลิตภัณฑจ ากถั่วลิส งซึ่งตรวจพบในตั วอย างสู งถึงรอยละ 16.67
จากจํานวนตัว อย างทั้ งหมด 1,373 ตัว อยาง โดยจํานวนวัตถุดิบ ที่ป นเปอนซีราลีโ นนในระดับสูงกวา 100
ไมโครกรัม/กิโลกรัม มีมากถึงรอยละ 15.22 ซึ่งพบมากในถั่วเหลือง ขาวโพด กากถั่วลิสง และกากมันสําปะหลัง
(บุญทรัพย และศยามล, 2550 และ บุญทรัพย และสมนึก, 2551) นอกจากนั้นยังมีรายงานวาสารพิษชนิดนี้มี
คุณสมบัติเปนสารกอมะเร็งซึ่งสงผลตอสุขภาพคนโดยตรง
Immunochromatographic assay (ICA) หรือ lateral flow assay หรือที่เรียกงายๆ วา strip test
เปนวิธีการที่อาศัยความจําเพาะในการทําปฏิกิริยาระหวางแอนติเจนกับแอนติบอดีซึ่งสามารถใชในการตรวจหา
สารพิษในตัวอยางที่เตรียมใหอยูในสภาพของเหลวได ปฏิกิริยานี้เกิดขึ้นบนวัสดุที่มีลักษณะเปนแถบ ปลายขาง
หนึ่งตรึงแอนติบอดีที่เชื่อมตอกับอนุภาคทองไว (colloidal gold-labeled antibody conjugate) หลังจาก
หยดตัวอยางที่มีแอนติเจนลงไป แอนติเจนจะทําปฏิกิริยากับ conjugate และเคลื่อนที่ไปยังบริเวณที่มีการตรึง
(immobilize) แอนติบอดีตัวที่ 2 ซึ่งจําเพาะกับแอนติเจน ทําให antigen-antibody complex ถูกจับไวที่แถบ
แรกนี้ เกิดปฏิกิริยาเปนแถบสีมวง เรียกวา test line สวนของเหลวที่เหลือยังคงเคลื่อนที่ตอไปจนถึงแถบที่ 2 ซึ่งมี
การตรึงแอนติบอดีที่จําเพาะตอแอนติบอดีตัวแรก ดังนั้นจึงทําใหเกิดสัญญาณของปฏิกิริยาขึ้นอีก 1 แถบ ไม
ตัวอยางนั้นจะมีหรือไมมีแอนติเจนก็ตาม เรียกแถบที่ 2 นี้วา Control line (ภาพที่ 1) ขอดีของวิธีการนี้คือ ใชงาน
งาย ราคาถูก และรวดเร็ว แตก็มีขอเสียตรงที่ความไวของปฏิกิริยาจะต่ํากวาวิธี ELISA
ในป พ.ศ. 2552 รัชนีและคณะ ไดทําการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่จําเพาะตอซีราลีโนนและได
นําไปใชในการพัฒนาวิธีตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนในอาหารและวัตถุดิบแบบรวดเร็วตนแบบชนิดอิมมูโน
โครมาโตกราฟฟคสตริป (กิตติศักดิ์, 2552) โดยไดรับการสนับสนุนการวิจัยจากสถาบันวิจัยและพัฒนาแหง
มหาวิทยาลั ย เกษตรศาสตร ซึ่ งชุ ดตรวจสอบตน แบบนี้ใหผ ลการทดสอบที่ดีในหองปฏิบัติการ แตการนําชุด
ตรวจสอบไปใชจริงทางการคานั้น จําเปนอยางยิ่งที่จะตองพัฒนาใหมีประสิทธิภาพใหเปนที่ยอมรับ โดยการ
พัฒนาวิธีทดสอบใหมีขั้นตอนที่ชัดเจน ไดมาตรฐาน ทําไดสะดวกและรวดเร็ว แตยังคงความถูกตองและความ
 13

แมนยํา ทั้งนี้จักตองอาศัยความรวมมือของหองปฏิบัติงานอื่นๆ (Collaborative study) ที่มีความสามารถในการ

ตรวจสอบสารพิษประเภทเดียวกันเพื่อนําชุดตรวจสอบดังกลาวไปทดลองใชเพื่อเปรียบเทียบผลดวย แลวจึงนําผล
การทดสอบความพึงพอใจและขอแนะนําจากหองปฏิบัติการที่เขารวมการทดสอบเพื่อนําไปปรับปรุงเพื่อใหไดชุด
ตรวจสอบที่มีประสิทธิภาพสอดคลองกับความตองการของผูใชงาน

ภาพที่ 1 หลักการของอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป แบบ competitive assay

ที่มา: Krska and Molinelli (2009)
 14

วิธีวิจัย

1. การผลิตชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป สําหรับตรวจสอบซีราลีโนน

1.1 การเพิ่มปริมาณ MAb-ZN1 ในสภาพ in vitro และการเตรียม MAb บริสุทธิ์โดยใช Affinity

column chromatography (รัชนี และคณะ, 2552ข)
ใชไฮบริโดมาโคลน ZN1 ที่สรางโมโนโคลนอลแอนติบอดีตอซีราลีโนน (MAb-ZN1) (รัชนี และคณะ,
2552) โดยเลี้ยงเพิ่มปริมาณเซลลในสภาพ in vitro ในอาหาร complete medium โดยเพิ่มปริมาณของอาหาร
ประมาณ 1 เทา ทุกๆ 3 วัน จนปริมาตรของของอาหารเกือบเต็มฟลาสกเลี้ยงเซลล เมื่อสีของอาหารเปลี่ยนเปนสี
เหลือง ปนตกตะกอนเซลลที่ความเร็ว 2,000 รอบตอนาที นาน 5 นาที เก็บสวนอาหารเลี้ยงเซลลซึ่งมีแอนติบอดี
ไวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส
การเตรียม MAb บริสุทธิ์ใชวิธี Protein G column chromatography โดยนําอาหารเลี้ยงเซลลที่
ผลิต MAb-ZN1 มาผานคอลัมนที่บรรจุ Protein G Sepharose gel (Zymed, No. 10-1242) ตามวิธีของผูผลิต
โดยเก็บสารละลายแอนติบอดีในแตละ fraction ดวยหลอดทดลองปริมาตร fraction ละ 1 มิลลิลิตร ที่มี 2M Tri-
HCl pH, 8.0 รองรับอยู นําแตละ fraction ที่ไดมาวัดความดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร คํานวณ
ความเขมขนของอิมมูโนโกลบูลินจาก

ความเขมขนของอิมมูโนโกลบูลิน (มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) = คาความดูดกลืนแสง / 1.4

เก็บรักษา MAb ที่แยกไดไวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส (Liddell and Cryer, 1991)

1.2 การตรวจวิเคราะหความบริสุทธิ์ของอิมมูโนโกลบูลินที่แยกได
ตรวจสอบความบริสุทธิ์ของอิมมูโนโกลบูลินโดยใชวิธี sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide
gel electrophoresis (SDS-PAGE) โดยใช 6% stacking gel และ 12% running gel นําตัวอยางที่ตองการ
ตรวจสอบมาผสมกับ 2X loading buffer แลวนําไปตมในน้ําเดือดนาน 10 นาที เมื่อครบเวลาใหแชตัวอยางใน
น้ําแข็ง หยอดตัวอยางลงในเจลปริมาตรหลุมละ 15 ไมโครลิตร ใชกระแสไฟฟา 50 โวลต นาน 30 นาที จากนั้น
เปลี่ยนเปน 100 โวลต นาน 100 นาที ยอมสีเจลดวย staining solution นาน 10 นาที จากนั้นลางดวย
destaining solution จนกว า จะเห็ น แถบโปรตี น ชั ด เจน เปรี ย บเที ย บขนาดกั บ แถบโปรตี น มาตรฐาน
(Fermentas; Protein ladders #SM0431)

1.3 การตรวจสอบการทําปฏิกิริยาของอิมมูโนโกลบูลินบริสุทธิ์โดยวิธี Indirect PTA- ELISA

เคลือบ plate ดวย ZEA-BSA ใน carbonate coating buffer ความเขมขน 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร
หลุมละ 50 ไมโครลิตร บมไวที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 1 ชั่วโมง ลางดวย PBST 200 ไมโครลิตร/หลุม
3 ครั้ง ครั้งละ 5 นาที เติม blocking solution (1% skim milkใน PBST) ปริมาตร 100 ไมโครลิตร บมที่ 37
องศาเซลเซียส นาน 1 ชั่วโมง ลาง plate เติมตัวอยางแตละ fraction โดยเจือจางแบบ 2 เทา เริ่มตนที่ระดับการ
เจือจาง 1:1,000 จนถึง …… 1: 512,00 ปริมาตร 50 ไมโครลิตร บมที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 1 ชั่วโมง ลางดวย
PBST แลวเติม goat anti-mouse IgG ที่เชื่อมกับ alkaline phosphatase (GAM) ปริมาตร 50 ไมโครลิตร บม
อีก 1 ชั่วโมง ที่ 37 องศาเซลเซียส ลางดวย PBST ตรวจดูปฏิกิริยาดวยการเติมสับสเตรท p-nitrophenyl
phosphate (PNPP) ปริมาตร 100 ไมโครลิตร อานผลของปฏิกิริยาที่ความยาวคลื่น 405 นาโนเมตร โดยกําหนด
คาที่เปนบวกคือคาการดูดกลืนแสงที่มากกวาสองเทาของคาที่อานไดจากการทําปฏิกิริยาของ negative control
 15

(ใช BSA ความเขมขน 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เคลือบ plate และทําปฏิกิริยากับ IgG แตละ fraction ที่เจือจาง
1:1,000)

นําโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ผลิตไดมาผลิตเปนชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริปสําหรับ
ตรวจสอบซีราลีโนนตามวิธีการของ กิตติศักดิ์ (2552)

2. การทดสอบประสิทธิภาพอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ภายในหองปฏิบัติการ (Intra-laboratory

validation)

การทดสอบประสิ ท ธิ ภ าพของอิ ม มู โ นโครมาโตกราฟฟ ค สตริ ป ใช ห ลั ก เกณฑ ข อง EURACHEM

(EURACHEM working group, 1998) เพื่อแสดงความนาเชื่อถือของชุดตรวจสอบวามีความถูกตองแมนยํา การ
ทดสอบความสามารถของการวิเคราะหจะทําการทดสอบคาตางๆ

2.1 การหาคา Cut-off ของชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป

คา Cut-off ของชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป หมายถึง คาต่ําสุดของซีราลีโนนที่ชุด
ตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ที่ทําใหแถบสีชมพูที่ T-line ไมปรากฏ โดยทดสอบชุดตรวจสอบกับสาร
มาตรฐานซีราลีโนนที่ละลายในสารละลายเมธานอล (70% v/v) ที่ระดับความเขมขน 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50,
60, 100, 150 และ 200 นาโนกรัม/มิลลิลิตร โดยผสมสารมาตรฐานซีราลีโนนแตละความเขมขนกับสารละลาย
บัฟเฟอร PBST ในอัตราสวน 1:1 ทําการทดสอบความเขมขนละ 3 ซ้ํา

2.2 การหาคาความถูกตอง (Accuracy) และแมนยําของ (Precision) ชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโต

กราฟฟคสตริป
การทดสอบความใชไดของชุดตรวจสอบเพื่อหาคาความถูกตองและแมนยําดําเนินการโดยใชตัวอยาง
ขาวโพดที่เติมสารมาตรฐานซีราลีโนน (Spiked sample) ใหมีความเขมขน 10 ระดับ คือ 0, 10, 20 30, 40, 50,
60, 80, 100, 120, 200, 300 และ 500 ไมโครกรัม/กิโลกรัม ซึ่งคิดเปนความเขมขนซีราลีโนนในสาระลายเทากับ
0, 5, 10 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 150 และ 250 นาโนกรัม/มิลลิลิตร ตามลําดับ ทําการวิเคราะห
ความเขมขนละ 3 ซ้ํา

2.3 การหาคาความจําเพาะของชุดตรวจสอบ (Specificity)

เนื่ อ งจากการปนเป อนสารพิ ษเชื้อราในธรรมชาติใ นวัต ถุดิบ การเกษตร โดยเฉพาะขา วโพดนั้ น
เปน แบบ Co-contamination คือ มีการปนเปอนสารพิษเชื้อราไดมากกวาหนึ่งชนิด จึงมีความจําเปน ตอง
ตรวจสอบการเกิดปฏิกิริยาขามกับสารพิษเชื้อราชนิดอื่นของชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป โดยใช
ตัวอยางขาวโพดที่เติมสารพิษเชื้อราชนิดอื่น ไดแก อะฟลาทอกซิน บี1 (Aflatoxin B 1 ) ดีออกซีไนวาลีนอล
(Deoxynivalenol) ฟูโมนิซิน บี1 (Fumonisin B 1 ) ออคราทอกซิน เอ (Ochratoxin A) หรือ ที-2 ทอกซิน (T-2
toxin) รวมกับสารพิษเชื้อราซีราลีโนน โดยเติมสารพิษเชื้อราแตละชนิดใหมีความเขมขน 50 ไมโครกรัม/กิโลกรัม

2.4 การตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนในตัวอยางขาวโพดดวยชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟ
ฟคสตริป เปรียบเทียบกับวิธีทางเคมี
ทําการตรวจสอบปริมาณซีราลีโนนในตัวอยางขาวโพดอาหารสัตว และตัวอยางวัสดุอางอิงรับรองซีรา

ลีโนน (ERM BC717, Belgium) รวมจํานวน 7 ตัวอยาง เปรียบเทียบผลการทดสอบดวยชุดตรวจสอบอิมมูโน
 16

โครมาโตกราฟฟคสตริป และปริมาณซีราลีโนนที่ไดจากการวิเคราะหดวยวิธี HPLC (Seager et al., 2003) โดย

ชั่งตัวอยาง 20.00+0.01 กรัม ใสในโถปนขนาด 1 ลิตร เติม NaCl 2 กรัม และสารละลายอะซิโตไนไตรลรอยละ
90 ปริมาตร 50 มิลลิลิตร ปนดวยความเร็วสูงสุดโดยปนนาน 2 นาที ตั้งทิ้งใหตกตะกอน 5 นาที กรองสารละลาย
ผานกระดาษกรอง Whatman No.1 จากนั้นเจือจางสารละลายตัวอยางปริมาตร 10 มิลลิลิตร ดวยน้ํากลั่น
ปริมาตร 40 มิลลิลิตร แลวทําการกรองอีกครั้งดวยกระดาษกรอง GF/C นําสารละลายที่ไดมาทําการ Clean –
up โดยใชอิมมูโนแอฟฟนิตีคอลัมน ZearaleTest (Vicam, USA) เก็บสารละลายในขวดสีชาแลวนําไประเหยแหง
ที่อุณภูมิ 50 องศาเซลเซียส ในสภาวะที่กาซไนโตรเจน ละลายกลับดวยสารละลายผสมที่ใชเปนเฟสเคลื่อน ที่
คือ อะซิโตไนไตรล : น้ํา DI: เมทานอล (46: 46: 8) ปริมาตร 200 ไมโครลิตร ฉีดสารละลายตัวอยางปริมาตร 10
ไมโครลิตร เขาเครื่อง HPLC (Waters, USA) ที่มีดีเทคเตอร ชนิดฟลูออเรสเซนส และคอลัมน Symmetry C18
(5 µm, 3.9 x 150 mm) (Waters, USA) โดยใชอะซิโตไนไตรล : น้ํา DI: เมทานอล (46: 46: 8) เปนเฟสเคลื่อนที่
(Mobile phase) อัตราการไหล 1 มิลลิลิตรตอนาที อุณหภูมิของคอลัมน 35 องศาเซลเซียส อานคาโดยใช
Excitation wavelength 274 นาโนเมตร และ Emission wavelength 236 นาโนเมตร ระยะเวลา (Run
time) เทากับ 10 นาที

3. การทดสอบประสิ ท ธิ ภ าพอิ ม มู โ นโครมาโตกราฟฟ ค สตริ ป ระหว า งห อ งปฏิ บั ติก าร (Collaborative

study)

การทดสอบประสิทธิภาพชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ระหวางหองปฏิบัติการ โดย

ติดตอหองปฏิบัติการวิเคราะห/ตรวจสอบสารพิษเชื้อราในอาหาร ทั้งภาครัฐและภาคเอกชน เพื่อสอบถามความ
ตองการเขารวมกิจกรรมการทดสอบและชี้แจงรายละเอียด

3.1 การจัดเตรียมตัวอยางทดสอบ
ตัวอยางขาวโพดที่จะจัดสงใหหองปฏิบัติการใชเพื่อทดสอบประสิทธิภาพชุดตรวจสอบ ประกอบดวย
ตัวอยางขาวโพดที่ไมมีการปนเปอนซีราลีโนน (Blank sample) ตัวอยางขาวโพดปนเปอนสารซีราลีโนนที่ผลิตโดย
การปลูกเชื้อรา Fusarium graminearum สายพันธุที่สรางซีราลีโนน และตัวอยางวัสดุอางอิงรับรองซีราลีโนน
(Zearalenone-certified reference material)

3.2 การจั ด เตรี ย มชุ ด ตรวจสอบอิ ม มู โ นโครมาโตกราฟฟ ค สตริ ป สํ า หรั บ จั ด ส ง เพื่ อ ทดสอบ
ประสิทธิภาพระหวางหองปฏิบัติการ
ติดตอหองปฏิบัติการที่อยูในขายที่มีการทดสอบดานอาหาร อาหารสัตวและผลิตภัณฑที่เกี่ยวของจาก
ระบบฐานขอมูลหองปฏิบัติการของสํานักบริหารและรับรองหองปฏิบัติการ
จัดสงวัสดุอุปกรณแกหองปฏิบัติการแตละแหง โดยประกอบดวย
- ชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป
- ตัวอยางทดสอบที่บรรจุในถุงอลูมิเนียมฟอยล จํานวน 3 ตัวอยาง
- วิธีการทดสอบและแบบรายงานผล 1 ชุด (ภาคผนวก)
- แบบประเมินความพึงพอใจตอชุดตรวจสอบ 1 ชุด (ภาคผนวก)

จัดสงชุดตรวจสอบในกลองโฟมที่ภายในบรรจุถุงเจลใหความเย็นเพื่อรักษาสภาพชุดตรวจสอบและ
ตัวอยางทดสอบ กรณีจัดสงไปยังหองปฏิบัติการตางจังหวัดใชบริการนําสงสินคาของบริษัทรับขนสงสินคาเอกชน
 17

โดยชุดตรวจสอบจะสงถึงหองปฏิบัติการภายใน 24 ชั่วโมง กําหนดใหตรวจวิเคราะหและสงผลกลับภายใน 14 วัน

หลังจากไดรับชุดตรวจสอบ

ภาพที่ 2 ชุ ด ตรวจสอบอิ ม มู โ นโครมาโตกราฟฟ ค สตริ ป ที่ จั ด ส ง ให ห อ งปฏิ บั ติ ก ารที่ เ ข า ร ว มการทดสอบ

ประสิทธิภาพระหวางหองปฏิบัติการ

4. การวิเคราะหตนทุนการผลิตอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป เชิงพาณิชย

วิเคราะหตนทุนการผลิตอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ในระดับหองปฏิบัติการ รวมถึงวิเคราะหขอมูล

เบื้องตนทางเศรษฐกิจ ไดแก สํารวจตลาดของอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ในประเทศไทยเพื่อประมาณการ
มูลคาตลาด กลุมลูกคาเปาหมาย และแนวโนมในอนาคต
 18

ผลและวิจารณ

1. การผลิตชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป สําหรับตรวจสอบ ZEA

เลือกไฮบริโดมาโคลน ZN1 (4D2/B11) นํามาเพิ่มปริมาณในสภาพ in vitro และทําใหบริสุทธิ์โดย

ใช Protein G column chromatography เก็บ fraction และวัดคา O.D. 280 โดยใชเครื่อง AKTA prime plus
(GE Healthcare, USA) พบวาเมื่อนําน้ําเลี้ยงเซลลจากโคล ZN1 มาแยกแอนติบอดีบริสุทธิ์ ได IgG จาก 4
fraction คือ Eluate 1-4 มีความเขมขน 0.77, 4.16, 0.92 และ 0.12 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร ตามลําดับ เมื่อนําแต
ละ fraction มาทําปฏิกิริยากับ ZEA-BSA โดยวิธี Indirect PTA-ELISA พบวามีคาไตเตอรเทากับ 16,000;
128,000; 32,000 และ 8,000 ตามลําดับ (ตารางที่ 1) และเมื่อนํา fraction ตางๆ มาวิเคราะหความบริสุทธิ์ของ
IgG โดย วิธี SDS-PAGE พบวามีความบริสุทธิ์มาก (ภาพที่ 3)

ตารางที่ 1 ผลการแยกอิมมูโนโกลบูลินบริสุทธิ์จาก MAb-ZN1 ดวยวิธี

Fraction คาการดูดกลืนแสง Dilution factor ความเขมขนโปรตีน ไตเตอร

ที่ 280 nm (มิลลิกรัม/มิลลิลิตร)
W1 3.395 1 0.679 8,000
W2 0.441 1 0.315 4,000
W3 0.000 - 0.00 0
W4 0.000 - 0.00 0
W5 0.000 - 0.00 0
E1 1.073 1 0.77 16,000
E2 1.455 4 4.16 128,000
E3 1.288 1 0.92 32,000
E4 0.172 1 0.12 8,000
E5 0.000 - 0.00 0
E6 0.000 - 0.00 0
E7 0.000 - 0.00 0
E8 0.000 - 0.00 0
E9 0.000 - 0.00 0
E10 0.000 - 0.00 0
อาหารเลี้ยง 0.509 10 3.64 8,000
เซลล
หมายเหตุ W คือ fraction ที่เก็บจากการลางคอลัมนดวย washing buffer
E คือ fraction ที่ไดจากการชะ IgG บริสุทธิ์ดวยจากคอลัมน

จึงไดนําโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ไดมาผลิตเปนอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริปสําหรับการทดสอบความ
ใชไดภายในหองปฏิบัติการ (In-house validation) และการทดสอบประสิทธิภาพระหวางในหองปฏิบัติการ
(Collaborative study)
 19

4.5 140,000
OD 280 , Protein concentration (mg/ml) 4.0 OD280
120,000
Protein concentration
3.5 Titer
100,000
3.0

Antibody Titer
2.5 80,000
2.0 60,000
1.5
40,000
1.0
0.5 20,000

0.0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Fraction
ภาพที่ 1 ผลแยกอิมมูโนโกลบูลนิ บริสุทธิจ์ าก MAb-ZN1 ดวยวิ(ml)
ธี Affinity column chromatography

M C W1 W2 E1 E2 E3 E4

116
66.2 Heavy chain
45
35
Light chain
25

18.4
14.4

ภาพที่ 3 ผลการวิเคราะหความบริสุทธิ์ของ IgG ที่เตรียมไดจากวิธี Affinity column chromatography โดยวิธี

SDS-PAGE
M โปรตีนมาตรฐาน (Fermentus, SM0431) 3 Eluate fraction 1
C อาหารเลี้ยงเซลลไฮบริโดมา ZN1 4 Eluate fraction 2
1 Washing fraction 1 5 Eluate fraction 3
2 Washing fraction 2 6 Eluate fraction 4
 20

2. การทดสอบความใช ไ ด ข องอิ ม มู โ นโครมาโตกราฟฟ ค สตริ ป ภายในห อ งปฏิ บั ติ ก าร (In-house

validation)

2.1 การหาคา Cut-off ของชุดตรวจสอบ

ภาพที่ 4 แสดงความไวของชุดตรวจสอบในการตรวจวิเคราะหซีราลีโนนระดับความเขมขนตางๆ
โดยสารละลายมาตรฐานซีราลีโนนความเขมขนนอยกวา 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร จะทําให T-line ปรากฏสีแดง
คือใหผลการทดสอบเปนลบ (Negative) และความเขมของแถบสีชมพูที่ T-line จะเขมขึ้นเมื่อความเขมขนของซี
ราลีโนนในสาระลายทดสอบลดลง และที่ระดับความเขมขนของสารละลายมาตรฐานซีราลีโนนความเขมขน
เทากับหรือมากกวา 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร เสน T-line จะหายไป ซึ่งแสดงถึงคาต่ําสุดของซีราลีโนนที่ชุด
ตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริปสามารถตรวจวัดได (Limit of detection) โดยเมื่อคํานวณโดยการคูณ
ดวยระดับการเจือจางจะไดเปนความเขมขนในตัวอยางเทากับ 100 ไมโครกรัม/กิโลกรัม (ระดับการเจือจางที่ใชใน
การสกัด คือ 2.0) นั่นคือ คา Cut-off ของชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป สําหรับในตัวอยาง
ขาวโพด คือ 100 ไมโครกรัม/กิโลกรัม

0 1 10 20 30 40 50 60 100 150 200

- - - - - - + + + + +

ภาพที่ 4 การทดสอบหาคา Cut-off ของชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป โดยใชสารมาตรฐานซีราลี

โนนที่ละลายในสารละลายเมธานอล (70%, v/v) ที่ระดับความเขมขน 0- 200 นาโนกรัม/มิลลิลิตร ซึ่งที่ความ
เข มข น ของซี ร าลี โนนเท ากั บ 50 นาโนกรั ม/มิล ลิลิตร จะทําใหไมปรากฏแถบสีช มพูที่ T-line ( - หมายถึง
Negative, + หมายถึง Positive)

2.2 การตรวจสอบความถูกตองและแมนยําของชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป
ตารางที่ 2 แสดงผลการตรวจสอบปริมาณสารพิษซีราลีโนนในตัวอยางขาวโพดที่เติมสารมาตรฐาน
ซีราลีโนน พบวาตัวอยางขาวโพดที่มีปริมาณซีราลีโนน 0-80 ไมโครกรัม/กิโลกรัม ใหผลการทดสอบเปน Negative
และในตัวอยางขาวโพดที่เติมสารมาตรฐานซีราลีโนนตั้งแต 100 -500 ไมโครกรัม/กิโลกรัม ใหผลการทดสอบเปน
Positive แสดงถึงชุดตรวจสอบที่ไดพัฒนาขึ้นนี้สามารถใชตรวจสอบสารพิษซีราลีโนนในตัวอยางขาวโพดไดอยาง
ถูกตองและแมนยํา โดยคา Cut-off ของชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป สําหรับในตัวอยางขาวโพด
 21

คือ 100 ไมโครกรัม/กิโลกรัม ซึ่งคิดเปนปริมาณซีร าลีโนนในสารละลายสกัดเทากับ 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร

สอดคลองกับการทดสอบขางตนที่ทําการทดสอบโดยใชสารละลายมาตรฐานซีราลีโนน

ตารางที่ 2 การตรวจสอบปริมาณซีราลีโนนตัวอยางขาวโพดที่เติมสารมาตรฐานซีราลีโนน (Spiked sample) โดย

ชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป

Zearalenone-spiked Zearalenone in extracted Immunochromatographic

maize solution (ng/mL) strip assay
(µg/kg)
0 0 -, -, -
10 5 -, -, -
20 10 -, -, -
30 15 -, -, -
40 20 -, -, -
50 25 -, -, -
60 30 -, -, -
80 40 -, -, -
100 50 +,+,+
120 60 +,+,+
200 100 +,+,+
300 150 +,+,+
500 250 +,+,+
( - หมายถึง Negative, + หมายถึง Positive)

2.3 การตรวจสอบการเกิดปฏิกิริยาขามกับสารพิษเชื้อราชนิดอื่นของชุดตรวจสอบ (Cross-

reactivity)
ชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป มีความจําเพาะตอซีราลีโนนในตัว อยางขาวโพด
โดยสารพิษเชื้อราที่เติมลงไป ไดแก อะฟลาทอกซิน บี 1 (Aflatoxin B1) ดีออกซิไนวาลีนอล (Deoxynivalenol)
ฟูโมนิซิน บี 1 (Fumonisin B 1 ) ออคราทอกซิน เอ (Ochratoxin A) และ ที-2 ทอกซิน (T-2 toxin) ไมสงผลตอ
ประสิทธิภาพของชุดตรวจสอบ โดยชุดตรวจสอบใหผลการทดสอบซีราลีโนนในทุกตัวอยางไดอยางถูกตอง คือ
Negative (ตารางที่ 3) แสดงถึงปริมาณซีราลีโนนในตัวอยางมีคาต่ํากวาคา Cut-off คือ 100 ไมโครกรัม/กิโลกรัม
เชนเดียวกับตัวอยางขาวโพดที่เติมซีราลีโนนเพียงชนิดเดียว (ภาพที่ 4)
 22

ตารางที่ 3 การตรวจสอบสารพิษซีราลีโนนในตัวอยางขาวโพดในสภาวะที่มีสารพิษเชื้อราชนิดอื่นโดยใชชุด
ตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป

Mycotoxins spiked maize Immunochromatographic strip assay

Zearalenone 50 µg/kg - ,- ,-
Zearalenone 50 µg/kg + Aflatoxin B 1 50 µg/kg - ,- ,-
Zearalenone 50 µg/kg + Deoxynivalenol 50 µg/kg - ,- ,-
Zearalenone 50 µg/kg + Fumonisin B 1 50 µg/kg - ,- ,-
Zearalenone 50 µg/kg + Ochratoxin A 50 µg/kg - ,- ,-
Zearalenone 50 µg/kg + T-2 toxin 50 µg/kg - ,- ,-
( - หมายถึง Negative, + หมายถึง Positive)
ZEA + AFB1

ZEA + OTA
ZEA + DON
ZEA + FB1

ZEA + T-2
ZEA

ภาพที่ 4 การตรวจสอบการเกิดปฏิกิริยาขามกับสารพิษเชื้อราชนิดอื่น (Cross-reactivity) ของชุดตรวจสอบอิมมู

โนโครมาโตกราฟฟคสตริป (ZEA = ซีราลีโนน, AFB1 = อะฟลาทอกซิน บี1, DON = ดีออกซิไนวาลีนอล, FB1 =
ฟูโมนิซิน บี1, OTA = ออคราทอกซิน เอ และ T-2 = ที-2 ทอกซิน)

2.4 การตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนในตัวอยางขาวโพดดวยชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟ
ฟคสตริปเปรียบเทียบกับวิธีทางเคมี
จากผลการทดลองแสดงในตารางที่ 4 พบวาในตัวอยางที่มีปริมาณซีราลีโนนมากกวาหรือนอยกวา
100 ไมโครกรัม/กิโลกรัม ผลการทดสอบที่ไดจากชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป สอดคลองกับผล
การวิเคราะหดวยเครื่อง HPLC แตในตัวอยางขาวโพดตัวอยางที่ 4 ซึ่งมีปริมาณซีราลีโนน 91.7 ไมโครกรัม/
กิโลกรัม ใหผลการทดสอบที่ไมคงที่คือ ใหผล Positive 2 ครั้ง และใหผล Weakly positive 1 ครั้ง (แถบสีชมพูที่
 23

T-line จางมาก) ซึ่งเปนปริมาณซีราลีโนนซึ่งใกลเคียงกับคา Cut-off ของชุดตรวจสอบชุดนี้ คือ 100 ไมโครกรัม/

กิโลกรัม ทําใหผลการทําซ้ํามีการคลาดเคลื่อน ดังนั้นในการใชงานจริงผูใชงาน (User) ควรมีการยืนยันผลการ
ทดสอบที่ไดจากชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ดวยวิธีการวิเคราะหเชิงปริมาณอีกครั้ง

ตารางที่ 4 การตรวจสอบปริมาณซีราลีโนนในตัวอยางขาวโพด โดยใชชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป

และวิธีทางเคมีดวยเครื่อง HPLC

Samples HPLC analysis Immunochromatographic

(µg/kg) strip assay (n=3)
1 nd - ,- ,-
2 46.0 - ,- ,-
3 91.7 +,±,+
4 166.9 +,+,+
5 340.8 +,+,+
6 376.6 +,+,+
CRM 85.3 - ,- ,-
( - หมายถึง Negative, + หมายถึง Positive, ± หมายถึง Weakly positive)
Limit of detection (LOD) ของวิธีทางเคมีดวยเครื่อง HPLC เทากับ 3 ไมโครกรัม/กิโลกรัม

3. การทดสอบประสิทธิภาพอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริประหวางหองปฏิบัติการ (Collaborative study)

มีห องปฏิ บั ติการที่ตอบรับ เข าร ว มการทดสอบประสิทธิภ าพอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ระหวาง

หองปฏิบัติการ จํานวน 5 แหง แบงเปนหองปฏิบัติการจากหนวยงานภาครัฐ 3 แหง และหนวยงานภาคเอกชน 2
แหง ดังนี้
1. ศูนยสงเสริมและตรวจสอบการผลิตตามมาตรฐานความปลอดภัยทางอาหาร มหาวิทยาลัย
ราชภัฏกําแพงเพชร จ. กําแพงเพชร
2. หองปฏิบัติการชีวเคมี-พิษวิทยา สถาบันสุขภาพสัตวแหงชาติ กรมปศุสัตว กรุงเทพฯ
3. ห องปฏิ บั ติก ารตรวจวิเ คราะห ส ารพิษ จากเชื้ อรา หน ว ยชัน สู ตรโรคสัตว คณะสั ตว-
แพทยศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน จ. นครปฐม
0

4. บริษัทหองปฏิบัติการกลาง (ประเทศไทย) จํากัด สาขาฉะเชิงเทรา

5. บริษัทหองปฏิบัติการกลาง (ประเทศไทย) จํากัด สาขาขอนแกน

การทดสอบประสิทธิภาพของอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ระหวางหองปฏิบัติการ เพื่อพิสูจนความ

ใชไดของชุดตรวจสอบที่ผลิตขึ้นในสภาวะแวดลอมที่ตางกัน โดยใชตัวอยางทดสอบขาวโพดที่ปนเปอนซีราลีโนนที่
ทางโครงการวิจัยไดจัดเตรียมใหที่มีคาการปนเปอนเทากับ not detected (Blank sample) และ 205.1
ไมโครกรัม/กิโลกรัม และตัวอยางวัสดุอางอิงรับรองซีราลีโนน (ERM BC717, Belgium) ที่มีคาการปนเปอน
เทากับ 85.3 ไมโครกรัม/กิโลกรัม โดยทําการทดสอบตัวอยางละ 3 ซ้ํา และใชทําการทดสอบกับสารละลาย 70%
Methanol เพื่อใชเปนชุดควบคุม ผลการทดสอบแสดงดังตารางที่ 5
 24

ตารางที่ 5 ผลการตรวจสอบปริมาณซีร าลีโ นนในตัว อยางดวยชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป

ของหองปฏิบัติการที่เขารวมการทดสอบประสิทธิภาพระหวางหองปฏิบัติการ

Samples Result of HPLC Result of immunochromatographic strip assay (n=3)

analysis (µg/kg) Lab 1 Lab 2 Lab 3 Lab 4 Lab 5
A nd - ,- ,- - ,- ,- - ,- ,- - ,- ,- - ,- ,-
B 85.3 - ,- ,- - ,- ,- - ,- ,- - ,- ,- ± ,- , ±
C 205.1 +,+,+ +,+,+ +,+,+ +,+,+ +,+,+
Control - - ,- ,- - ,- ,- - ,- ,- - ,- ,- - ,- ,-
- หมายถึง Negative, + หมายถึง Positive, ± หมายถึง Weakly positive
nd หมายถึง not detected
Control หมายถึง การวิเคราะหโดยใช 70% Methanol แทนสารสกัดตัวอยาง

ผลการทดสอบในตัวอยางที่ A และ C ซึ่งมีคาการปนเปอนเทากับ not detected และ 205.1

ไมโครกรัม/กิโลกรัม พบวาหองปฏิบัติการทุกแหงใหผลการทดสอบเปน Negative และ Positive ตามลําดับ ใน
ทั้ง 3 ซ้ํา ของการทดสอบ ซึ่งสอดคลองกับปริมาณซีราลีโนนที่วิเคราะหไดดวยเครื่อง HPLC สําหรับการผลการ
ทดสอบในตัวอยาง B ซึ่งเปนตัวอยางวัสดุอางอิงรับรองซีราลีโนนที่มีคาการปนเปอนเทากับ 85.3 ไมโครกรัม/
กิโลกรัม มีหองปฏิบัติการจํานวน 4 แหง ที่ใหผลการทดสอบเปน Negative ในทั้ง 3 ซ้ํา ของการทดสอบ และมี
หองปฏิบัติการ 1 แหง ที่รายงานผลเปน Weakly positive จํานวน 2 ซ้ํา (แถบสีชมพูที่ T-line จางมาก) และ
Negative จํานวน 1 ซ้ํา ของการทดสอบ ซึ่งเปนปริมาณซีราลีโนนซึ่งใกลเคียงกับคา Cut-off ของชุดตรวจสอบชุด
นี้ คือ 100 ไมโครกรัม/กิโลกรัม ทําใหผลการทําซ้ํามีการคลาดเคลื่อน ดังนั้นในการใชงานจริง ผูใชงาน (User) ควร
มีการยืนยันผลการทดสอบที่ไดจากชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ดวยวิธีการวิเคราะหเชิงปริมาณ
อีกครั้ง

ผลการประเมินความพึงพอใจตอชุด ตรวจสอบสารพิษซีร าลีโนนแบบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป

ภายหลังการใชงานของหองปฏิบัติการที่เขารวมการทดสอบประสิทธิภาพระหวางหองปฏิบัติการ แสดงในภาพที่ 5
โดยหองปฏิบัติการมีความพึงพอใจตออิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ในหัวขอที่ทําการประเมินสวนใหญในระดับ
มากที่สุด โดยมีความเห็นวามีวิธีการใชงาย มีความถูกตองแมนยํา มีความรวดเร็ว มีความสะดวกในการใชงาน
อุปกรณที่ใชผลิตมีความเหมาะสม ผูผลิตมีความนาเชื่อถือ และความพึงพอใจโดยรวม สําหรับความพึงพอใจใน
หัวขอเรื่องคา Cut-off ของชุดตรวจสอบ ผูทําการประเมินมีความพึงพอใจในระดับมาก เมื่อสอบถามในหัวขอ
ราคาจําหนายของอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ขนาดบรรจุ 50 ชิ้น สําหรับการตรวจสอบ 50 ตัวอยาง สวน
ใหญรอยละ 60 มีความพึงพอใจในราคา 5,000 บาท/ชุด และทางหองปฏิบัติการมีความตองการใหมีการผลิตอิมมู
โนโครมาโตกราฟฟคสตริปสําหรับการตรวจสอบสารพิษอะฟลาทอกซินมากเปนอันดับที่ 1 (รอยละ 60) รองลงมา
คืออิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริปสําหรับตรวจสอบสารพิษฟูโมนิซิน (รอยละ 20) และ ดีออกซีไนวาลีนอล (รอย
ละ 20)
 25

ภาพที่ 5 ความพึงพอใจภายหลังการใชงานชุดตรวจสอบสารพิษซีราลีโนนแบบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป
ของหองปฏิบัติการที่เขารวมการทดสอบประสิทธิภาพระหวางหองปฏิบัติการ

ภาพที่ 6 การทดสอบประสิทธิภาพชุดตรวจสอบสารพิษซีราลีโนนแบบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริปใน
หองปฏิบัติการศูนยสงเสริมและตรวจสอบการผลิตตามมาตรฐานความปลอดภัยทางอาหาร มหาวิทยาลัยราชภัฏ
กําแพงเพชร จ. กําแพงเพชร
 26

3. การวิเคราะหตนทุนการผลิตอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป

จากผลการสํารวจตลาดของชุดตรวจสอบสารซีราลีโนนแบบรวดเร็ว พบวาปจจุบันที่นิยมมี 2 ประเภท

คือ ชุดตรวจสอบแบบ ELISA และชุดตรวจสอบแบบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป นอกเหนือจากการตรวจสอบ
ดวยวิธีทางเคมี เนื่องจากเปนวิธีที่การตรวจสอบที่ทําไดสะดวก รวดเร็ว และมีราคาตอตัวอยางถูกกวาวิธีทางเคมี
สําหรับชุดตรวจสอบซีราลีโนนแบบ ELISA และแบบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ในทองตลาดลวนนําเขาจาก
ตางประเทศทั้งสิ้น

ตลาดของการตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนสวนใหญ ประกอบดวย ผูผลิตอาหารสัตว ฟารมปศุสัตว

และหองปฏิบัติการตรวจสอบคุณภาพอาหารคนและอาหารสัตว ซึ่งตองมีการตรวจสอบคุณภาพวัตถุดิบกอนเขาสู
กระบวนการแปรรูปเปนอาหารสัตวสําเร็จรูป และกอนใหสัตวบริโภค ทั้งนี้เนื่องจากสารพิษซีราลีโนนนี้มีอันตราย
ตอสั ตว อยางยิ่ง โดยทํ าให เกิ ดการแทงลู กและผลผลิตสัตวล ดลง สงผลกระทบตออุตสาหกรรมการเลี้ยงสัตว
ปจจุบันสหภาพยุโรปไดกําหนดคา Maximum residual limit (MRL) ของซีราลีโนนในขาวโพดเลี้ยงสัตวที่ไมผาน
กระบวนการแปรรูป อยูที่ 350 นาโนกรัมตอกรัม (สถาบันอาหารแหงชาติ; 2550) การตรวจสอบวัตถุดิบกอนเขาสู
หวงโซอาหารของฟารมปศุสัตวจึงมีความจําเปนเพื่อลดความเสี่ยงและการสูญเสียทางเศรษฐกิจของผูประกอบการ
อันเกิดจากสารพิษซีราลีโนน ผลจากการสอบถามขอมูลกับเจาหนาที่วิเคราะหประจําหองปฏิบัติการควบคุม
คุณภาพของของบริษัทผูผลิตอาหารสัตวจํานวน 9 แหง พบวา มีการตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนทุกแหง โดย
ใชชุดตรวจสอบแบบ ELISA ทั้งนี้เนื่องจากเปนขอกําหนดของกรมปศุสัตว กระทรวงเกษตรและสหกรณ การรอง
ขอของลูกคา และดําเนินตามนโยบายควบคุมคุณภาพของบริษัท โดยจํานวนตัวอยางที่วิเคราะหตอเดือน มีตั้งแต
10 ถึง 200 ตัวอยางตอเดือน ซึ่งคาใชจายในการวิเคราะหประมาณ 300-350 บาท/ตัวอยาง (ตารางที่ 6)
 27

ตารางที่ 6 ขอมูลการตรวจสอบ/วิเคราะหการปนเปอนซีราลีโนนของบริษัทผูผลิตอาหารสัตว

การตรวจสารพิษ การใชงานชุด
เหตุผลที่ตรวจ ยี่หอชุดตรวจสอบ
ซีราลีโนน ตรวจสอบ
ราคา/

ขอกําหนดจาก

Romer Labs

R-Biopharm
นโยบาย QC
ลูกคารองขอ
กรมปศุสัตว
บริษัท จํานวนตัวอยาง ตัวอยาง

Neogen
ไมตรวจ
/เดือน (บาท)

ตรวจ

ไมใช

ใช
บริษัทไทย ฟูดส อาหารสัตว / / / / / 100 300
บริษัทเซ็นทราโก อาหารสัตว / / / / 30 300
บริษัทกรุงไทย อาหารสัตว / / / / / 10 300
บริษัทแหลมทองสหการ / / / / / / 200 300
บริษัท กรุงเทพฯอาหารสัตว จํากัด / / / / / 100 -
ศูนยวิทยาศาสตรเบทาโกร / / / / >100 -
บริษัท สหฟารม จํากัด / / / / / / 100 350
(โรงงานนารายณอาหารสัตว)
บริษัท สหฟารม จํากัด / / / / / / 100 350
(โรงงานอาหารสัตวพัฒนานิคม)
บริษัท สหฟารม จํากัด(หองปฏิบัติการ / / / / / / 100 350
วิเคราะหวิจัย)

27
 28

จากขอมูลขางตนบงชี้ลักษณะการใชงานของกลุมลูกคาที่ตองมีการใชงานชุดตรวจสอบซีราลีโนนเปน
ประจําทุกเดือนซึ่งเปนโอกาสอันดีหากมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตรสามารถผลิตชุดตรวจสอบซีราลีโนนแบบอิมมูโน
โครมาโตกราฟฟคสตริปออกสูเชิงพาณิชยไดเปนผลสําเร็จ จากขอดีของชุดตรวจสอบแบบอิมมูโนโครมาโตกราฟ
ฟคสตริป ที่เปนการทดสอบแบบเชิงคุณภาพ (Qualitative determination) ที่ใชงานไดงาย ใหผลการทดสอบ
รวดเร็ว เหมาะสําหรับใชคัดกรอง (Screening test) ตัวอยางปริมาณมากได โดยสามารถบอกไดวาตัวอยางอาหาร
สัตวนั้นมีการปริมาณซีราลีโนนในระดับที่ต่ํา/สูงกวา คา cut-off ของชุดตรวจสอบ ผูประกอบการจะเกิดประโยชน
ในแงของลดตนทุนในการตรวจสอบคุณภาณสินคา ยิ่งไปกวานั้นปจจุบันชุดตรวจสอบสารซีราลีโนนแบบอิมมูโน
โครมาโตกราฟฟคสตริป ที่มีการจําหนายทางการคาในประเทศไทยมีเพียง 1 ยี่หอ เทานั้น คือ ชุดตรวจสอบจาก
บริษัท Abraxis ® (ประเทศสหรัฐอเมริกา) ซึ่งการนําเขาในจํานวนไมมากยังมีราคาแพง คือ ชุดละ 35,000 บาท
โดย 1 ชุด ประกอบดวยอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป จํานวน 50 สตริป (สําหรับทดสอบ 50 ตัวอยาง) เมื่อคิด
ราคาตอตัวอยางแลวเทากับ 700 บาท/ตัวอยาง นอกจากนี้คา cut-off ของชุดตรวจสอบยังมีคาที่สูงมาก คือ
1,000 ไมโครกรัม/กิโลกรัม ซึ่งไมเหมาะสมกับการใชงาน ซึ่งใชคัดกรองตัวอยางที่มีการปนเปอนซีราลีโนนในระดับ
ที่สูงมากถึง 1,000 นาโนกรัม/กรัม (Abraxis, 2009)

เมื่อทําการวิเคราะหตนทุนการผลิตอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป สําหรับการตรวจสอบสารพิษซีราลี
โนนในระดับหองปฏิบัติการ ขนาดบรรจุ 50 สตริป (สําหรับการทดสอบ 50 ตัวอยาง) พบวามีตนทุนประมาณ
1,800 บาท/ชุด หรือเทากับ 35 บาท/ตัวอยาง (ตารางที่ 7) แบงเปนคาโมโนโคลนอลแอนติบอดีและคาสารเคมี
คาอุปกรณสําหรับประกอบเปนชุดตรวจสอบ คาใชจายในการตรวจสอบคุณภาพ คาแรง และคาสาธารณูปโภค
จะเห็นไดวาจากตนทุนการผลิตดังกลาวหากมีการขยายขนาดการผลิตในระดับพาณิชยจะทําใหตนทุนการผลิต
ลดลง ทําใหโอกาสในการแขงขันกับชุดตรวจสอบจากตางประเทศเพิ่มขึ้น นอกจากนี้องคความรูที่ไดจากการวิจัย
นี้สามารถนําไปตอยอดเพื่อใชในการผลิตอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป สําหรับการตรวจสอบสารชนิดอื่นได
ซึ่งจะชวยลดการพึ่งพาเทคโนโลยีจากตางประเทศและเพิ่มศักยภาพแขงขันในการเปนผูผลิตอาหารของประเทศใน
อนาคต

ตารางที่ 7 ตนทุน การผลิตอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป สําหรับการตรวจสอบสารพิษซีราลีโนนในระดั บ

หองปฏิบัติการ

รายการ ตนทุนตอชุด
(1 ชุด บรรจุ 50 สตริป)
-คาโมโนโคลนอลแอนติบอดีและคาสารเคมี 900
-คาอุปกรณสําหรับประกอบเปนชุดตรวจสอบ 250
-คาใชจายในการตรวจสอบคุณภาพ 150
-คาแรง 300
-คาสาธารณูปโภค 200
รวม 1,800
 29

สรุปผล

การทดสอบความใชไดในระดับหองปฏิบัติการ (In-house validation) ของชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมา

โตกราฟฟคสตริปสําหรับการตรวจสอบการปนเปอนสารพิษซีราลีโนน พบวาชุดตรวจสอบที่พัฒนาขึ้นนี้สามารถใช
คัดกรองตัวอยางที่การปนเปอนซีราลีโนน (Cut-off) เทากับ 100 ไมโครกรัม/กิโลกรัม มีความจําเพาะเจาะจงสูง
(Specificity) ตอสารพิษซีราลีโนน และไมเกิดปฏิกิริยาขามกับสารพิษเชื้อราชนิดอื่น ไดแก อะฟลาทอกซิน บี1
ดีออกซิไนวาลีนอล ฟูโมนิซิน บี1 ออคราทอกซิน เอ และ ที-2 ทอกซิน เมื่อนําชุดอิมมูโนโครมาโตกราฟฟค
สตริปไปใชในการตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนในตัวอยางขาวโพดโดยเปรียบเทียบกับผลการทดสอบที่ไดจาก
วิธี HPLC พบวาผลการทดสอบที่ไดมีความถูกตองและมีความสอดคลองกัน

เมื่อทํ าการทดสอบเพื่ อยืนยั นประสิทธิ ภาพอิมมูโ นโครมาโตกราฟฟคสตริป โดยการจัดกิ จกรรมการ

ทดสอบประสิทธิภาพระหว างหองปฏิบัติการ (Collaborative study) โดยหองปฏิบัติการจากหนวยงาน
ภาครัฐบาลและภาคเอกชน รวมจํานวน 5 แหง ในการตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนในตัวอยางขาวโพด
ทดสอบที่ทางโครงการวิจัยไดจัดเตรียมใหจํานวน 3 ตัวอยาง ไดแก ตัวอยาง A, B และ C ที่มีคาการปนเปอน
เทากับ not detected, 85.3 และ 205.1 ไมโครกรัม/กิโลกรัม พบวาหองปฏิบัติการทุกแหงรายงานผลการ
ทดสอบของตัวอยาง A และ C ไดอยางถูกตอง สําหรับการผลการทดสอบในตัวอยาง B ซึ่งเปนตัวอยางวัสดุ
อางอิงรับรองซีราลีโนนที่มีคาการปนเปอนเทากับ 85.3 ไมโครกรัม/กิโลกรัม ซึ่งมีคาใกลเคียงกับคา Cut-off ของ
ชุดตรวจสอบนั้นมีหองปฏิบัติการจํานวน 4 แหง ที่ใหผลการทดสอบไดอยางถูกตอง คือ Negative และมี
หองปฏิบัติการ 1 แหง ที่รายงานผลเปน Negative จํานวน 1 ซ้ํา และอีก 2 ซ้ํา รายงานผลเปน Weakly
positive (แถบสี ช มพู ที่ T-line จางมาก) จากผลการทดสอบที่ ไ ด จ ากการทดสอบความใช ไ ด ใ นระดั บ
หองปฏิบัติการและผลทดสอบประสิทธิภาพระหวางหองปฏิบัติการ แสดงใหเห็นวาอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป
ที่ไดพัฒนาขึ้นนี้มีประสิทธิภาพสามารถใชงานไดจริงแตในกรณีที่ตัวอยางมีปริมาณซีราลีโนนในระดับที่ใกลเคียงกับ
คา Cut-off ของชุดตรวจสอบ (100 ไมโครกรัม/กิโลกรัม) คือมีคาการปนเปอนในชวง 80-120 ไมโครกรัม/
กิโลกรัม จะพบวาความแมนยําของผลการทดสอบจะลดลง ดังนั้นในการใชงานจริงผูใชงาน (User) ควรมีการ
ยืนยันผลการทดสอบที่ไดจากชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป ดวยวิธีการวิเคราะหเชิงปริมาณอีก
ครั้ง เมื่อประเมินความพึงพอใจของผูใชงานตอชุดตรวจสอบสารพิษซีราลีโนนพบวาผูใชงานมีความพึงพอใจใน
ภาพรวมในระดับมากที่สุด เนื่องจากใชงานงาย มีความถูกตองแมนยํา มีความรวดเร็ว มีความสะดวกในการใช
งาน อุปกรณที่ใชผลิตมีความเหมาะสม ผูผลิตมีความนาเชื่อถือ โดยราคาจําหนายที่ตองการสําหรับชุดตรวจสอบ
ขนาดบรรจุ 50 ชิ้น สวนใหญมีความพึงพอใจในราคา 5,000 บาท/ชุด

ผลการวิเคราะหตนทุนการผลิตในระดับหองปฏิบัติการของชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟฟคสตริป
ขนาดบรรจุ 50 สตริป พบวามีตนทุนสําหรับการผลิตเทากับ 1,800 บาท/ชุด โดยแบงเปนตนทุนคาโมโนโคลนอล
แอนติบอดีและคาสารเคมี คาอุปกรณสําหรับประกอบเปนชุดตรวจสอบ คาใชจายในการตรวจสอบคุณภาพ
คาแรง และค า สาธารณู ปโภค และผลจากการสํารวจความตองการของตลาดพบวา กลุ มลู กคาที่สําคัญ คือ
ผูป ระกอบการด านอาหารสั ตว และฟาร มปศุสัตวซึ่งตองมี การตรวจสอบซีราลีโ นนในวัตถุดิบ และอาหารสัตว
สําเร็จรูปเปนประจํา และคูแขงทางการคายังมีนอยมากและมีราคาคอนขางสูง ทั้งนี้หากมีการขยายขนาดการผลิต
ในระดับพาณิชยยอมจะทําใหตนทุนการผลิตลดลงเปนอยางมากซึ่งถือเปนขอไดเปรียบของชุดตรวจสอบในการ
ขยายระดับการผลิตในระดับเชิงพาณิชยในอนาคต
 30

เอกสารและสิ่งอางอิง

กิตติศักดิ์ อินทรเสวก. 2552. การพัฒนาชุดตรวจสอบสารซีราลีโนนแบบรวดเร็วในวัตถุดิบอาหารโดยใช

เทคนิคอิมมูโนโครมาโทกราฟ. วิทยานิพนธปริญญาโท. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร

รัชนี ฮงประยูร, สุวรรณา กลัดพันธุ, วราภา มหากาญจนกุล, กิตติศักดิ์ อินทรเสวก และ ศรีหรรษา มลิจารย.
2552. รายงานฉบับสมบูรณโครงการวิจัย การพัฒนาอิมมูโนโครมาโตกราฟคสตริปเพื่อตรวจสอบการ
ปนเปอนของซีราลีโนนอยางรวดเร็ว. แผนงานวิจัย เรื่อง การพัฒ นาชุดตรวจสอบสารพิษเชื้อราใน
อาหารเพื่อ คุณ ภาพชีวิต ที่ดีและลดการพึ่ง พาเทคโนโลยีจ ากตา งประเทศ ไดรับทุนอุดหนุนวิจัย มก.
ปงบประมาณ 2552

_____, สุวรรณา กลัดพันธุ, วราภา มหากาญจนกุล, ประพฤกษ ตั้งมั่นคง และ สมลักษณ พุมระชัฏ. 2552ข.
รายงานฉบับสมบรูณ:การพัฒนาวิธีตรวจสอบ Ochratoxin A และ Zearalenone ดวยวิธีอลิสา.
สถาบันวิจัยและพัฒนาแหงมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร กรุงเทพฯ

บุญทรั พย สู งโคตร และ ศยามล พวงขจร. 2550. การสํารวจหาปริม าณสารพิษจากเชื้อรา ออคราทอกซิน
(Ochratoxin) ซีราลีโนน (Zearalenone) ในกากถั่วเหลือง. สาสนไก. 55(12) ,51-54

_____ และ สมนึก อรรคไกรสีห. 2551. การสํารวจหาปริมาณสารพิษจากเชื้อราออคราทอกซิน (Ochratoxin)

และซีราลีโนน (Zearalenone) ในขาวโพด. สาสนไกและสุกร. 6(64) 39-41.

สถาบันอาหารแหงชาติ. 2550. ฐานขอมูลกฎระเบียบและมาตรฐานอาหารตางประเทศ: สหภาพยุโรป. เขาถึงได

จาก http://www.mof.or.th/export_market/foreing_foodlaw_website-2.html.

Abraxis. 2009. A Screening Test for Rapid Detection of Zearalenone is available at http://
www.abraxiskits.com/uploads/products/docfiles/131_PN53215AUSER.pdf

Bar-Vetro, I., L. Solti, J. Gyongyosi, E. Szabo and A. Wolfing. 1996. Sensitivity ELISA test for
determination of Ochratoxin A. J. Agric.Food Chem. 44: 4071-4074

Diekman and Green. 1992. Mycotoxins and reproduction in domestic livestock. Journal of
Animal Science. 70(5): 1615-1627

EURACHEM Guide, 1998. The Fitness for Purpose of Analytical Methods; A Laboratory Guide
to Method Validation and Related Topics, 1st ed., Available from internet:
http://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/valid.pdf, cited Jan. 2012, 61 pp.
Krska, R. and A. Molinelli. 2009. Rapid test strips for analysis of mycotoxins in food and feed.
Anal Bioanal Chem. 393:67–71
 31

Liddell, J. E. and A. Cyer.1991. A Practical Guide to Monoclonal Antibody. John Wiley and
Sons, Inc. New York. 188 p.

L'vova, L.S., N.I.U., Orlova, Z. K. Bystriakova, M.D. Omel'chenko and V.V. Remele. 1993.
Propagation of toxigenic fungi and mycotoxins in various grains. Prikl. Biokhim.
Mikrobiol., 29, 70-79.

Saeger, S. D., L. Sibanda and C. V. Peteghem. 2003. Analysis of zearalenone and α-zearalenol in
animal feed using high-performance liquid chromatography. Analytica Chimica Acta.
487(2): 137-143.
 32

ภาคผนวก
 33

แผนการทดลองเพื่อการทดสอบประสิทธิภาพ KU-ZEA2
: ชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟคสตริปสําหรับตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนอยางรวดเร็ว

วัสดุและอุปกรณ
1. ชุดตรวจสอบ KU-ZEA2
2. ตัวอยางทดสอบ 3 ตัวอยาง
3. กระดาษกรอง Whatman No. 1
4. แบบบันทึกผลการทดลอง
5. แบบประเมินความพึงพอใจ

วิธีการทดลอง
- กอนใชงานใหนําชุดตรวจสอบ KU-ZEA2 ที่เก็บไวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ในสภาพแหง มาวาง
ไวใหมีอุณหภูมิเทาอุณหภูมิหอง
- ทําการตรวจสอบการปนเปอนสารพิษซีราลีโนนดวยชุดตรวจสอบ KU-ZEA2 โดยใชตัวอยางทดสอบ
3 ตัวอยาง และใช 70% Methanol เปน Control ตามวิธีดังนี้

1. การสกั ด ตั ว อย า ง
1.1 ชั่งตัวอยางที่บดละเอียดแลวปริมาณ 5 กรัม
1.2 เติมสารละลาย 70% Methanol ปริมาตร 10 มิลลิลิตร
1.3 เขยาอยางแรงดวยมือประมาณ 3 นาที หรือเขยาดวยเครื่องเขยาที่ความเร็วรอบประมาณ 150 รอบ
ตอนาที นาน 20 นาที ตั้งทิ้งไวใหตกตะกอน 5 นาที
1.4 กรองผานกระดาษกรอง Whatman #1

2. การเตรี ย มสารละลายบั ฟ เฟอร PBST

4 4

ผสมสารละลายบัฟเฟอร PBS กับ 0.1% Tween ในอัตราสวน 9 : 1 ผสมใหเขากันแตอยาใหเกิด

ฟองอากาศ

3. การตรวจสอบสาร Zearalenone ในตัวอยาง

3.1 เติมสารละลายบัฟเฟอร PBST จากขอ 2 ปริมาตร 200 ไมโครลิตร ลงในหลุมทดสอบใน ELISA
plate จํานวน 3 หลุม ***
3.2 เติมสารสกัดจากขอ 1.4 ปริมาตร 200 ไมโครลิตร ลงในหลุมทดสอบ ผสมใหเขากันโดยใชปเปตดูด
ขึ้น-ลงประมาณ 3-4 ครั้ง โดยไมทําใหเกิดฟองอากาศ (สําหรับ Control ใหใช 200 ไมโครลิตร ของ
70% Methanol แทนสารสกัดตัวอยาง)
3.3 จุม Strip KU-ZEA-2 ลงในสวนผสม ระวังอยาใหสวนผสมลนออกจากหลุม ทิ้งใหเกิดปฏิกิริยาเปน
เวลา 10 นาที (ภาพที่ 1)
3.4 นํา Strip KU-ZEA-2 วางไวบนกระดาษสีขาวที่สะอาด ประมาณ 2 นาที
3.5 อานการเกิดปฏิกิริยาและบันทึกผล

* หมายเหตุ เปนการทํา Triplicate โดยสารสกัดจากแตละตัวอยาง ใหทําการตรวจสอบดวยชุด KU-ZEA-2

จํานวน 3 ชิ้น
 34

ตัวอยางแสดงการใชชดุ ตรวจสอบ KU-ZEA2

การอานผล

Negative ( - ) คือ ปรากฏเสนสีชมพูที่ T-line และ C-line ตัวอยางมี Zearalenone ต่ํากวา 100 ppb
T C

Positive ( + ) คือ ปรากฏเสนสีชมพูเฉพาะที่ C-line ตัวอยางมี Zearalenone มากกวา 100 ppb

T C

Weak positive ( +/- ) คือ ปรากฏเสนสีชมพูจางๆ เฉพาะที่ T-line C-line และปรากฎเสนที่ C-line
ตัวอยางมี Zearalenone ใกลเคียงกับ 100 ppb (ควรยืนยันดวยวิธีทางเคมี เชน HPLC เปนตน)

Invalid คือ ไมปรากฏเสนสีชมพูที่ C-line Strip ใชการไมได หรือมีขอผิดพลาดเกิดขึ้น

ใหทําการทดสอบใหม
 35

แบบบันทึกผลการทดลอง

การทดสอบประสิทธิภาพ
KU-ZEA2 : ชุดตรวจสอบอิมมูโนโครมาโตกราฟคสตริปสําหรับตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนอยางรวดเร็ว

1. วันที่ไดรับชุดตรวจสอบ__________________________ วันที่ทําการทดสอบ________________________
ผูทดสอบ___________________________________________________________________________
หนวยงาน___________________________________________________________________________

2. ระบุวิธีการสกัดตัวอยาง เครื่องเขยา (Shaker) เขยาดวยมือ

3. ผลการทดสอบ

ตัวอยาง ผลการทดสอบที่อานไดจากชุดตรวจสอบ KU-ZEA2 หมายเหตุ

ซ้ําที่ 1 ซ้ําที่ 2 ซ้ําที่ 3
Control

หมายเหตุ - หมายถึง Negative คือ ปรากฏเสนสีชมพูที่ T-line และ C-line

+ หมายถึง Positive คือ ปรากฏเสนสีชมพูเฉพาะที่ C-line
+/- หมายถึง Weak Positive คือ ปรากฏเสนสีชมพูจางๆ ที่ T-line และปรากฎเสนที่ C-line

วิจารณผล/หมายเหตุ

...................................................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................................................
 36

แบบสอบถามความพึงพอใจ
KU-ZEA2 : อิมมูโนโครมาโตกราฟคสตริปสําหรับตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนน
ภายใตโครงการ การทดสอบระหวางหองปฏิบัติการเพื่อตรวจประสิทธิภาพอิมมูโนโครมาโตกราฟคสตริป
สําหรับตรวจสอบการปนเปอนซีราลีโนนอยางรวดเร็ว

ขอมูลทั่วไป
1. ชื่อ-สกุล…………………………………………………………………………………………………………………………………………………...
2. ชื่อตําแหนง…………………………………………………………………………………………………………..……………….………………….
3. หนวยงาน…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
4. ที่อยู……………………………………………………………………………………………………………………………..………………………….
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..………

5. ประเภทงานที่รับผิดชอบ
งานการเรียนการสอน งานควบคุมคุณภาพ
งานบริการวิเคราะห อืนๆ(ระบุ)……………………………………………………

6. ชนิดสารพิษเชื้อราทีต่ รวจวิเคราะห (ตอบไดมากกวา 1 ขอ)

Aflatoxin DON Fumonisin
Ochratoxin T-2 toxin Zearalenone
อื่นๆ(ระบุ)……………………………………………………………………………………………

7. วิธีการที่หนวยงานของทานใชทดสอบสารพิษจากเชื้อรา
Screening test ไดแก …………………………………….........................................................
วิธีทางเคมี ไดแก …………………………………………………………………..…………………………..

8. จํานวนตัวอยางที่ตรวจ…………………………ตอสัปดาห

9. วิธีการที่ทานใชเพื่อการควบคุมคุณภาพผลการทดสอบ (ตอบไดมากกวา 1 ขอ)

% Recovery ความถี่……………………… Duplication ความถี่…………………………...
Control sample ความถี…่ ………………… อื่นๆ(ระบุ)…………………………………..……...

10. เหตุผลที่ทานเลือกใชงาน อิมมูโนโครมาโตกราฟคสตริป/Strip test ในการทดสอบ

(โปรดเรียงลําดับตามความสําคัญ โดยใหอันดับที่สําคัญที่สดุ เปนหมายเลข 1)
ราคา การบริการของตัวแทนจําหนาย
วิธีการใชงาย วิธีการเก็บรักษา
ชวงการทดสอบ (Range) มีขอมูลสนับสนุนที่นาสนใจ LOD, Method, Validation
ความเที่ยงตรงและแมนยํา ความนาเชื่อถือของผูผลิต
ความรวดเร็วในการทดสอบ อื่นๆ…………………………………………………………

มีตอดานหลัง…..
 37

หลังการใชงาน KU-ZEA2 ความคิดเห็นของผูเขารวมการทดสอบประสิทธิภาพระหวางหองปฏิบัติการ

1. หลังจากที่ทานทดลองใช KU-ZEA2 ทานมีความพึงพอใจมากนอยเพียงใดในประเด็นตอไปนี้ (5 = มากที่สุด)

คะแนน
5 4 3 2 1 หมายเหตุ
1.วิธีการใชงาย
2.คา Cut-off ที่เหมาะสม
3.ความถูกตองแมนยํา
4.ความรวดเร็ว
5.ความสะดวกในการใชงาน
6.ความเหมาะสมของอุปกรณที่ใช
7.ความนาเชื่อถือของผูผลิต
8. ความพึงพอใจโดยรวม

ความคิดเห็น/ขอเสนอแนะ..........................................................................................................................
…………………………………………………………………………………………………………….…….…………………………......
…………………………………………………………………………………………………………..…………………………………......
………………………………………………………………………………………………………………….…………………..…………..

2. ทานคิดวาราคาของ KU-ZEA2 (1 ชุดมี 50 ชิ้น) ที่จะมีจําหนายในทองตลาดควรมีราคาประมาณเทาใด

5,000 บาท 10,000 บาท 15,000 บาท
อื่นๆ……………………………

3. ทานคิดวาทางคณะผูวิจยั ควรผลิตอิมมูโนโครมาโตกราฟคสตริปของสารพิษชนิดใด ออกจําหนายในอนาคต

Fumonisin T-2 toxin DON
Aflatoxin อื่นๆ…………………………………………………….

4. ทานยินดีเปนภาคีในการเขารวม Interlaboratory Collaboration หรือไม

เขารวม ไมเขารวม

ขอขอบพระคุณที่ใหความรวมมือในการตอบแบบสอบถาม