ENZIMI U MLIJEKU

Endogeni (prirodni enzimi mlijeka)

— potječu od mliječne žlijezde vimena:
• neki dospjevaju iz krvi u mliječnu žlijezdu
• drugi iz citoplazme sekretornih stanica
Sastav:
• proteini vrlo složene strukture
na koje se veže neproteinski dio:
- čvrsto povezan (prostetska skupina)
- lagano disociran (kofaktor ili koenzim)

Endogeni enzimi u mlijeku:

- neki se nalaze povezani (u sastojcima mlijeka)
- neki se nalaze slobodni (u plazmi ili serumu mlijeka)
- neki se mogu naći i kao povezani i kao slobodni

Glavni endogeni enzimi mlijeka

Ime Optimum Nalaze se
enzima pH T (°C) u mlijeku:

Laktoperoksidaza ≈ 6,5 ≈ 25 serum

Plazmin ≈8 ≈ 37 micele kazeina
Lipoprotein lipaza ≈9 ≈ 33 micele (≈ 80%)
Katalaza ≈7 ≈ 37? leukociti
Ksantin oksidaza ≈8 ≈ 37 membrana m.m.
Alkalna fosfataza ≈9 ≈ 37 membrana (30-50%)
2

1
 Funkcija enzima:
• biokemijski katalizatori pojedinih reakcija
• djeluju vrlo specifično:
Enzim
• određeni tip enzima
• određeni tip reakcije
Supstrat

Aktivnost enzima:
• najviše ovisi o T i pH- sredine
• bitna je prisutnost nekih vitamina i minerala
Enzim
(vitamina B skupine / Mn, Mg, Fe...)- kofaktori
• ionska jakost sredine (Ca2+ioni, NaCl...)
• koncentracija i dostupnost supstrata i enzima
• prisutnost stimulatora ili inhibitora aktivnosti
S1 + S2
3

Utjecaj temperature:
• podnose niske T (mala aktivnost i kod 0 °C)
• optimalna aktivnost pri 30 – 45 °C
• inaktivacija iznad 80 °C (denaturacija enzima)
- može biti reverzibilna (ovisno o trajanju T, vrsti enzima i dr.)

Aktivnost
enzima
(%)

2
 Utjecaj trajanja toplinske obradbe mlijeka
na inaktivaciju endogenih enzima
minute

Laktoperoksidaza

T (oC)
Alternativna inaktivacija (oksidacija, vrlo visoki tlak, ⇑ aeracija)
5

U mlijeku je identificirano:
- oko 60 različitih endo enzima

• mogu uzrokovati promjene sastojaka mlijeka

(loša senzorska svojstva mlijeka- lipaze i proteinaze)
• mogu oštetiti tehnološke osobine mlijeka
(stabilnost kazeina/ loše sirenje /↓ prinos sira)
• mogu biti dokaz djelotvornosti pasterizacije
(fosfataze ili peroksidaze/ niska ili visoka pasterizacija)
• neki posjeduju i antibakterijske osobine
(laktoperoksidaza, lizozim/↑ u kolostrumu- zaštita za teliće)

3
 LIPAZE
• esteraze koje kataliziraju hidrolizu masti
• lipoliza (užeglost mlijeka i proizvoda)
– slobodne kratkolančane masne kiseline
(neugodan miris, okus gorčine, ↑ oK)
Glavna prirodna lipaza:
Lipoprotein lipaza (≈ 80% u kazeinu)
• mala količina povezana i u membrani m.m.
• u svježem mlijeku (inaktivne lipaze)
Lipaza ima više u mlijeku:
- pri kraju laktacije
- u staromuznih krava - pri kontaminaciji
lipolitičkim MO
- kod upale vimena
7

Optimalno djelovanje lipaza:

• T oko 30 °C (aktivnost)
• dugo čuvanje mlijeka (razgradnja kazeina- LPL)
• zamrzavanje (ošteti se membrana m.m)
• mehanička obrada (pjena ili pucanje membrane m.m.)
• homogenizacija (veća dodirna površina m.m., LPL- kazeina)
Inaktivacija:
• 63 °C/ 7’ ili 75 °C/ 2’’ Egzogene
• 80 °C/ trenutno bakterijske lipaze
• ekstremne pH- vrijednosti termostabilne

Reaktivacija:
• opasnost - za punomasne proizvode
• doprinos - zrenje sireva, aroma

4
 PROTEINAZE
• vrlo je malo prirodnih u mlijeku
Plazmin – povezan s micelama kazeina
(uz inaktivni plazminigen i aktivator plazminigena)
- veći udjel (kasna laktacija, starije krave , mastitis)
- dugo čuvanje mlijeka (razgradnja kazeina)
- alkalna serin proteinaza, vrlo termostabilna
- zadržava aktivnost i nakon pasterizacije (čak↑ ↑)
- djelomična hidroliza kazeina (↓ prinos sira)
- moguće želiranje UHT mlijeka (nakon dužeg čuvanja)
- doprinosi zrenju sireva (↑ onih uz VDG i pri ↑pH)

Inaktivacija: ≈ 75-80 °C/10 min. (reverzibilna)

(djelomično preživljava i UHT- sterilizaciju)

Prikaz djelovanja plazmin sustava u mlijeku:

TERMOLABILNI
Plazminogen Inhibitori
aktivatori, PA plazminogen
(micele kazeina) aktivatora
(mliječni serum)

Plazminogen Plazmin Inhibitori plazmina

(micele kazeina) (micele kazeina) (mliječni serum)
inaktivni aktivni

↑ PA)
TERMOSTABILNI (↑ Hidroliza proteina (↑
↑ β-kazeina)

Plazmin sustav micela

pH ≈ 4,6
mliječni serum

→10 x ↑ plazmina od slatke)

(kisela sirutka→
10

5
 FOSFATAZE
• esteraze koje kataliziraju hidrolizu organskih fosfata
(fosfornih monoestera, moguća defosforilacija kazeina)

Alkalna fosfataza (najpoznatiji endogeni enzim mlijeka)

• oko 30-50% u membrani m.m. (izvor- stepka)
• ostale u plazmi (u lipoproteinskim česticama)

Inaktivacija: 62 °C/ 30’ ili 72 °C/ 15’’

- reaktivacija: nakon 2-5 dana
Fosfataza test:
• dokaz ispravnosti niže toplinske obradbe
- niske, dugotrajne pasterizacije (65 °C/ 30’)
- srednje, kratkotrajne pasterizacije (72 °C/ 15’’)
Kisela fosfataza - vrlo termostabilna (opt. pH≈ 4)/inaktivacija- UHT
- učestvuje u zrenju sira (osobito od ovčjeg mlijeka)
11

PEROKSIDAZE
• najviše prisutni endogeni enzimi mlijeka
Laktoperoksidaza (antibakterijske osobine)
- katalizira hidrolizu H2O2 → H2O + O (akceptori kisika)
(oksidira - nezasićene m. kis./ tiocijanate - inhibitori mo)

Djelovanje: opt. pri 25 °C/ pH ≈ 6,5

Inaktivacija: > 80 °C/ nekoliko sekunda

reaktivacija: nakon dužeg vremena
Peroksidaza test:
• dokaz ispravnosti više toplinske obradbe
mlijeko + H2O2 → H2O + O
2KJ (dodan u mlijeko) + O → K2O + J2 (uz škrob – plava boja)

12

6
 KATALAZE
• oksidoreduktaze, koje kataliziraju hidrolizu H2O2
2H2O2 → 2H2O + O2
Katalaza test – mjere se mL izdvojenog plina (pri 25 °C/ 2h)
– katalazni broj
(povezan s brojem leukocita → SS)

• svježe mlijeko → 1,5-3 mL plina

• staromuzne krave → do 6 mL plina
• kolostrum i mlijeko novomuznih krava → 8-15 mL plina
katalazni broj – dijagnoza za mastitis
(oko 8 x veći nego u svježem mlijeku)

Inaktivacija: značajna pri 75-80 °C (reverzibilna)

Katalazni broj – nije dokaz ispravnosti pasterizacije
13

OKSIDOREDUKTAZE
- postoji više prirodnih oksidoreduktaza u mlijeku
(laktoperoksidaza i katalaza)
- znak loše mikrobiološke kakvoće mlijeka

Najvažnija prirodna u mlijeku:

Ksantin-oksidaza (relativno visoka koncentracija)
• glavni enzim membrane m. m.
(aktivnija - oslobađena od membrane /izvor- stepka)
• mali stupanj specifičnosti za određeni supstrat
• oksidacija (nez. m. k.) ili redukcija (nitrata u nitrite)
- oksi m. k. i nitriti – inhibitori rasta koliformnih bakterija
- nitriti - toksični za sporogene bakterije Clostridium
• može spriječiti rano ili kasno nadimanje sira
Inaktivacija: 72 °C/ 15’’ (svega 20-30%)
14

7
MIKROORGANIZMI
U MLIJEKU
Prof. dr. sc. Ljubica Tratnik 15

Mlijeko je savršena hrana

i za mikroorganizme !

• svježe mlijeko za bakterije

• kiselo mlijeko za kvasce i plijesni

16

8
Primarna mikroflora sirovog mlijeka:
• redovita mikroflora (potječe iz sisnog kanala)
• minimalno: oko 100-1000 mo/mL (“aseptično” mlijeko)

bakterije roda: Micrococcus > 60% ukupne

“koki vimena” – mikroflore (pa i 90%)
Streptococcus – neznatni broj (pa i 50%)
Corynebacterium – može biti priličan broj,
Microbacterium i dr. ali najčešće < 10%
Bacillus spore – najčešće < 10%
Staphylococcus epidermis – epiderma vimena

Više od 105 CFU/mL mlijeka

- znak dospjele mikroflore iz okoline
- nedostatak higijenskih uvjeta (IDF, 1974.)
17

• znatno povećan broj bakterija/mL mlijeka

potječe od upale vimena – mastitis (do nekoliko miliona)

Uzročnici mastitisa (patogene bakterije):

- najčešće
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus dysgalactiae
Streptococcus uberis
Corynebacterium
Escherichia coli pyogenes
Staphylococcus aureus
Corynebacterium pyogenes
(u nemužene stoke
između srpnja i kolovoza)
- rijeđe ↓prisutni
Streptococcus pyogenes
Mycobacterium bovis
Mycobacterium tuberculosis
Nocardia i Actinomyces sp.
Cryptococcus neoformans
Salmonella sp.
Listeria monocytogenes
Bacillus cereus
Clostridium perfringens

• mlijeko bolesnih krava se ne koristi !

(SS > 400.000)- (Pravilnik za sirovo mlijeko, 2000.)
18

9
Sekundarna mikroflora: kontaminacija
mlijeka
• dospjela u mlijeko iz okoline
• uglavnom bakterije, žive
rjeđe kvasci, ponekad i plijesni spore stanice

Ovisi o putu mlijeka:

mužnja
sabirna stanica


transport
mljekara
prerada

Bitni uvjeti: - higijena i sanitacija

- zdravstvene mjere
- sustav rukovanja mlijekom
τ
(otvoren ili zatvoren, T/ )
19

Izvori onečišćenja mlijeka:

• hrana i stelja: • osobe (nehigijena, infekcije):
Bacillus Campylobacter
Clostridium Salmonella
Listeria monocytogenes S. typhimurium

• feces stoke: • onečišćena voda:

Salmonella Aeromonas
Campylobacter Campylobacter
koliformne bakterije Salmonella

• oprema za mužnju:
gram-negativne
psihrotrofne bakterije
20

10
• farme (bez hlađenja) • vrlo opasne patogene
Enterococcus bakterije (psihrotrofne):
Streptococcus Escherichia coli 0157:H7
Lactococcus Yersinia enterocolitica
Bacillus Listeria monocytogenes
i brojne crijevne Listerioza - bolest i posljedice:
bakterije porodice: - ozbiljniji poremećaji, pobačaj,
Enterobacteriaceae često i smrt

• zarazne bolesti
ljudi ili životinja
Cornyebacterium diphteriae, Shigella dysenteriae,
Salmonella paratyphi, Bacillus typhi, Vibrio cholerae,
Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis
(najveća opasnost - epidemije)
21

Mikroorganizmi u sirovom mlijeku:

patogeni i nepatogeni 

Posljedice štetnih:
• za ljude: razni problemi u organizmu
- poremećaj probave
- opasne zarazne bolesti

• za mlijeko: razgradnja sastojaka

- laktoze (vrenje)
- citrata (vrenje)
- proteina (proteoliza)
- m. masti (lipoliza)

KVARENJE SIROVOG MLIJEKA ILI PROIZVODA 

22

11
Uzročnici vrenja u mlijeku:
Mliječno-kiselo vrenje
a) homofermentativne BMK
Laktoza → galaktoza + glukoza
Glukoza → mliječna kiselina
(laktat)

b) heterofermentativne BMK

Laktoza → galaktoza + glukoza

Glukoza → mliječna kiselina + etanol + CO2
(laktat)
BMK (bakterije mliječne kiseline)

23

Streptococcus koriste se u kulturama

thermophilus za fermentirane mliječne
proizvode i sireve
Lactococcus
Pediococcus
Leuconostoc • tipične BMK- brzo kvare mlijeko
Lactobacillus (uzrokuju zakiseljavanje mlijeka)

Streptococcus
Enterococcus (acidoproteolitičke)
• štetne Micrococcus (acidoproteolitičke, lipolitičke, TR)
(neke i patogene) Staphylococcus (acidoproteolitičke)

• kvarenje sirovog mlijeka ili proizvoda (TR)

24

12
 Koliformno-plinovito vrenje
Laktoza → galaktoza + glukoza
Glukoza → ml. kiselina + octena kiselina + etanol + CO2 + H2
(laktat) (acetat)

• glavne koliformne bakterije:

Escherichia coli Enterobacter aerogenes

• kvarenje mlijeka ili proizvoda (rano nadimanje sira)

25

Maslačno-kiselo vrenje
• sekundarno vrenje (nakon djelovanja BMK)
Laktoza → galaktoza + glukoza
Glukoza → octena kiselina + maslačna kiselina + etanol + butanol + aceton
(acetat) (butirat)
+ CO2 + H2
• glavna bakterija maslačne kiseline:
Clostridium tyrobutiricum
- sporogena, anaerobna bakterija
- endospore su vrlo termostabilne
- acidoproteolitička bakterija

• kvarenje mlijeka ili proizvoda (gorčina i kasno nadimanje sira)

26

13
 Limunsko-kiselo vrenje
Limunska kiselina  pirogrožđana kiselina
(citrat) (piruvat)
Pirogrožđana kiselina  acetilmetil karbinol + CO2
(piruvat) (acetoin)
Acetilmetil karbinol  oksidacija (- 2H)  diacetil
(acetoin)  redukcija (+ 2H)  2,3 butilen glikol

• tipične Cit+ BMK (fermentirani napitci, sirevi - aroma)

Leuconostoc spp.
Lactococcus lactis ssp. diacetylactis

• štetne Cit+ bakterije (koje metaboliziraju citrate)

- koliformne bakterije (aerobne, mezofilne bakterije)
- Bacillus subtilis (acidoproteolitička, sporogena bakterija)
27

Propionsko-kiselo vrenje
• sekundarno vrenje, nakon djelovanja BMK

Laktoza → galaktoza + glukoza

Glukoza → mliječna kiselina (laktat) BMK

BPK
Mliječna kiselina → propionska kiselina + octena kiselina + CO2 + H2O
(laktat) (propionat) (acetat)

• korisne bakterije Propionibacterium spp. (BPK)

- veći udjel CO2
- veće rupice
ementaler sira

28

14
 Alkoholno vrenje
Laktoza → galaktoza + glukoza kefir i kumis
Glukoza → etanol + CO2 BMK / kvasci

β-galaktozidaza (laktaza)
LAKTOZA → GLUKOZA + GALAKTOZA
“GLIKOLIZA”
GLUKOZA → PIROGROŽÐANA KISELINA
BMK
(piruvat)

kvasci
ETANOL + CO2

• proizvodnja etanola iz sirutke

Kluyveromyces marxianus (laktoza)- posjeduje enzim laktazu
Saccharomyces cerevisiae (hidrolizirana laktoza)- nema laktaze
29

Uzročnici razgradnje m. masti:

 lipoprotein lipaze (prirodni enzimi sirovog mlijeka)
≈ 80% u micelama kazeina, nešto u membrani m.m.

 lipolitičke bakterije:
(većina psihrotrofne bakterije)
napad na
Pseudomonas membranu
Aeromonas Egzogene
bakterijske lipaze
Acinetobacter termorezistentne oštećenje
Flavobacterium membrane
Corynebacterium
Bacillus (spore,TR)
 lipoliza 
Micrococcus (TR) (užegli okus i miris)
30

15
 Uzročnici razgradnje proteina:
 plazmin (endogena proteinaza mlijeka – u miceli kazeina)
- termostabilan- zadržava aktivnost i nakon pasterizacije
 proteolitičke bakterije:
(gorčina i “slatko grušanje”mlijeka)  proteoliza 

Pseudomonas - večina psihrotrofne bakterije

Serratia - uzročnici “truljenja” mlijeka
Proteus - jaka proteolitička moć
Acinetobacter - jaka i lipolitička moć
Alcaligenes (TR) - egzogeni enzimi - termorezistentni
Micrococcus (TR) (neki i na UHT proces/proteinaze > lipaze)

Bacillus - sporogene (opasnost za sireve)

Clostridium - acidoproteolitičke, neke i patogene
31

UVJETI RASTA MIKROORGANIZAMA

Mikroorganizmi u mlijeku:
• prolaze 4 faze:
1. mikrobiocidna faza
2. faza mješovite mikroflore
3. faza bakterija mliječne kiseline (BMK)
- brzo nadvladaju ostale (optimalna sredina)
4. faza kvasaca i plijesni (kisela sredina)

T/τ
• glavni utjecaji:
• prisutna vrsta ili soj (izvori)
• uvjeti rasta i preživljavanja (T, pH, O2…)
32

16
 Rast mikroorganizama:
- ovisi o bezbroj čimbenika:
- vrsta prisutnih MO
osobine / zahtjevi
- potrebne tvari rasta
O2 , CO2 , voda, hranjive tvari
- potrebni uvjeti rasta
pH-sredine, temperatura
- trajanje čuvanja mlijeka

Imunoaktivni sustav mlijeka i lag- faza bakterija

(privremena zaštita mlijeka od porasta broja živih stanica)
“bakteriocidna faza mlijeka” (oko 2-5 sati i više/uvjeti?)
33

Krivulja rasta bakterija

Log N

stacionarna faza
stacionarna faza
(podjednaki rast i ugibanje)

log- faza (ubrzano ugibanje)

log- faza (ubrzani rast)

lag- faza (suzdržani rast) Vrijeme

Prikaz krivulje rasta bakterija

34

17
 - bakteriocidne i bakteriostatičke tvari mlijeka (potječu iz krvi)
- Ig i drugi minor imunoaktivni glikoproteini i enzimi
- lag- faza bakterija (faza prilagodbe na mlijeko i uvjete)
mL

dani
čuvanja
“kritično doba””

Rast bakterija pri +4 °C u sirovom mlijeku

35

vrijeme /h

Utjecaj temperature na rast bakterija u sirovom mlijeku

36

18
 Brzina reprodukcije bakterija
ovisi o generacijskom vremenu
⇓
(od jedne stanice nastaju dvije)

Generacijsko vrijeme (uz optimalne uvjete za rast)

• za većinu bakterija u mlijeku
- oko pola sata pri pH sirovog mlijeka
• za većinu kvasaca i plijesni
- oko 1 - 2 sata pri pH oko 4 - 5
37

Brzina reprodukcije

N = broj bakterija/mL u vremenu (t)

N0= broj bakterija/mL u vremenu (0)
t = vrijeme rasta (h)
g= generacijsko vrijeme (h)
Vrijeme (h) N

0 1
0,5 2
1,0 4
Prikaz normalne 1,5 8
reprodukcije bakterija 2,0 16
11 10 milijuna
38

19
Inhibitorne tvari mlijeka:
• antibiotici (od liječene stoke)
• bakteriofagi (fagi- bakterijski virusi)

Utjecaj penicilina u mlijeku na aktivnost kulture

39

građa bakteriofaga

djelovanje faga (phagein = jesti)

40

20
Mjere protiv mikroorganizama u mlijeku:
• visoka higijena mužnje i rukovanja s mlijekom
• mlijeko što prije iznijeti iz staje i hladiti na što nižu T
• osigurati zatvoren sustav rukovanja s mlijekom
• što kraće skladištenje mlijeka (pri 4 °C ili nižu T)
• što kraći transport mlijeka uz obavezno hlađenje
• bezuvjetna sterilnost uređaja, aparature i opreme
• mlijeko što prije toplinski obraditi
• mlijeko što prije preraditi u proizvod
• mlijeko što prije preraditi u proizvod

Kontinuirane
linije u
proizvodnji
39 41
33

Sirovo mlijeko:
- mora potjecati od zdravih krava
- mora zadovoljiti propisane uvjete

Mikrobiološka kakvoća:
• sirovo mlijeko < 20.000 CFU/mL
(dobra sanitarna praksa/ IDF, 1974.)

EU- standard za sirovo mlijeko

• max. 100.000 CFU/mL

42

21