khối phổ MS PDF

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019

Tác giả luận văn
Nguyễn Phương Nga

LỜI CẢM ƠN
Để luận văn này đạt kết quả tốt đẹp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp
đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng
đồng nghiệp và bạn bè.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đào Việt Hà và TS.
Phạm Đức Thịnh đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện cho tôi
hoàn thành bản luận văn này.
Tôi chân thành cảm ơn đề tài Nghiên cứu độc tố của một số loài cá rạn
và thân mềm có nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam (mã số:
KHCBBI.02/18-20) của Viện Hải dương học đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực
hiện Luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa Học, Học viện
Khoa học và Công nghệ, Phòng Quản lý Tổng hợp đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi giúp tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.
Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của
Lãnh đạo Viện Hải dương học cũng như các anh chị em trong phòng Hóa
sinh trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân
và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành luận văn.
Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019

Tác giả luận văn
Nguyễn Phương Nga

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
AcOH : Acetone
ACN : Acetonitril
ATTP : An toàn thực phẩm
APCI : Atmospheric pressure chemical ionization
CFP : Ciguatera Fish Poisoning
CTX : Ciguatoxin
CTXs : Ciguatoxins
DW : Distilled water
đvdt : Đơn vị diện tích
ESI : Electrospray ionization
EI : Electron ionization
FAB : Fast-atom bombardment
HR-FABMS : High-resolution fast atom bombardment mass
spectrometry
H-NMR : Proton NMR spectroscopy
COSY : Correlated Spectroscopy
GC : Gas chromatography
HPLC : High-performance liquid chromatography
HRMS : High Resolution Mass Spectrometry
IP : Identification point
IS : Ion spray
LC : Liquid Chromatography
LOD : Limit of Detection
LOQ : Limit of Quantitation
MeOH : Metanol
MeCN : Acetonitrile
MRM : Multi Reaction Monitoring
MS : Mass spectrometry
NĐTPB : Ngộ độc thực phẩm biển
PTN : Phòng thí nghiệm
RF : Radio frequency
SIM : Selected Ion Monitoring
SPE : solid phase extraction
SRM : Selected Reaction Monitoring
TFA : Trifluoroacetic acid
TEM : Temperature
Danh mục các bảng
Bảng 1.1. Các độc tố ciguatoxins và ion phân tử tương ứng phân tích bằng
sắc ký khối phổ………………………………………………...……………17
Bảng 2.1. Định danh và ký hiệu mẫu..............................................................25
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện chiết rút đối với dịch chiết........…..36
Bảng 3.2. Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích với pha tĩnh là
Agillent……………..………………………………………………….……41
Bảng 3.3. Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích với pha tĩnh là
Wakosil………………………………………………………………………43
Bảng 3.4. Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Agilent Poroshell 120 EC-
C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi)……………………………...45
Bảng 3.5. Hàm lượng CTXs trong các mẫu Chình biển ở Việt Nam và Nhật
Bản………………………………………………………………………...…48
Bảng 3.6. Kết quả so sánh phương sai các mẫu cơ tại Việt Nam và Nhật
Bản…………………………………………………………………………...50
Bảng 3.7. Kết quả so sánh phương sai các mẫu gan tại Việt Nam và Nhật
Bản…………………………………………………………………………...50
Bảng 3.8. Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu cơ tại Việt Nam và Nhật
Bản………………………………………………………………………….. 51
Bảng 3.9. Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu gan tại Việt Nam và
Nhật Bản……………………………...………………………………. …….52
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G. toxicus…………...……….10

Hình 1.2. Cấu trúc Pacific (P-CTX-1) và Caribbean (C-CTX-1)
ciguatoxin…………………………………………………………………....11
Hình 1.3. Mô phỏng chuỗi thức ăn biển…………………………………… 12
Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS...............................................................14
Hình 1.5. Khối phổ và thời gian lưu của 16 dẫn xuất CTXs ………...……..22
Hình 3.1. Sắc ký đồ CTX-1B chuẩn...............................................................38
Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu cơ có cùng thời gian lưu so với mẫu chuẩn...........38
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu gan có cùng thời gian lưu so với mẫu chuẩn.........38
Hình 3.4. Sắc ký đồ một số mẫu dương tính khi phân tích CTXs bằng
LC/MS-MS trên pha tĩnh Agilen. (A: C026; B: C029; C: C034; D: G035; E:
G036)……………………………………..……………………….………...40
Hình 3.5. Sắc ký đồ một số mẫu dương tính khi phân tích CTXs bằng
LC/MS-MS trên pha tĩnh Wakosil. (A: G028; B: G027; C: C026; D: C027; E:
G030)………………………………………………………………………...42
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu C034 khi phân tích CTXs trên 02 pha tĩnh (A: pha
tĩnh Agilent; B: pha tĩnh Wakosil)……………………………… ………….43
Hình 3.7. Đánh giá độ đặc hiệu trên cột Agilent (A: sắc ký đồ mẫu cá chứa
độc tố; B: sắc ký đồ Acetone; C: Sắc ký đồ chuẩn CTX-1B)………... …….44
1
MỤC LỤC
MỤC LỤC........................................................................................................1
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 7
1.1. NGỘ ĐỘC CIGUATERA ..................................................................... 7
1.1.1. Khái niệm .................................................................................... 7
1.1.2. Đối tượng gây ngộ độc ................................................................ 7
1.1.3. Triệu chứng lâm sàng ................................................................. 7
1.2. ĐỘC TỐ CİGUATOXİNS .................................................................... 9
1.2.1. Bản chất, cấu trúc hoá học ......................................................... 9
1.2.2. Cơ chế hoạt động ...................................................................... 11
1.2.3. Nguồn gốc và sự tích luỹ sinh học ............................................ 11
1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ
..................................................................................................................... 12
1.3.1. Nguyên lý hoạt động ................................................................. 13
1.3.2. Sự kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ ................................. 16
1.3.3. Ứng dụng sắc ký khối phổ trong phân tích độc tố Ciguatoxins
..................................................................................................................... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 25
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .................. 25
2.2.1. Nguyên liệu, thiết bị .................................................................. 25
2.2.1.1. Dung môi, hóa chất........................................................... 25
2.2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích ............................................... 26
2
2.2.2. Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ cơ và gan của Chình
biển .............................................................................................................. 27
2.2.3. Xác định độc tố CTXs bằng phương pháp LC/MS-MS .......... 32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 36
3.1. KẾT QUẢ CHİẾT RÚT VÀ TİNH SẠCH ĐỘC TỐ CTXS TỪ MỘT
SỐ BỘ PHẬN CỦA CHÌNH BİỂN (CƠ, GAN) ....................................... 36
3.2. THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ CTXS TRONG CƠ,
GAN, CHÌNH BİỂN ................................................................................... 37
3.3. QUY TRÌNH THỰC NGHİỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ CTXS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS.................................................................... 46
3.4. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM (ĐỐI
CHIẾU VỚI KẾT QUẢ KIỂM CHỨNG CỦA NHẬT BẢN).................. 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 56
3
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ciguatera (CFP) là dạng ngộ độc thực phẩm biển (NĐTPB) do ăn phải
các loài cá rạn san hô vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt chứa độc tố ciguatoxin
(CTX) và các dẫn xuất độc tố này.
Độc tố CTXs được sản sinh ra do một loài vi tảo sống đáy là
Gambierdiscus toxicus và được tích lũy qua chuỗi thức ăn biển. Đến nay đã
phát hiện hơn 400 loài cá rạn có nguy cơ ngộ độc CFP.
Mặc dù tỉ lệ tử vong thấp (0,1%), nhưng CFP hiện nay là một trong
những mối lo ngại lớn của thế giới về mặt an toàn thực phẩm (ATTP), do độc
tố có hiệu ứng dài hạn (vài tháng cho đến cả năm), là gánh nặng đối với dịch
vụ y tế, chăm sóc sức khoẻ cộng đồng. CFP cũng gây nên tâm lý hoang mang,
bất ổn cho người tiêu dùng, dẫn đến thiệt hại về kinh tế đối với ngành công
nghiệp thuỷ hải sản nội địa và xuất khẩu của nhiều quốc gia.
Trước đây, tình trạng ngộ độc CFP chỉ xảy ra ở Nam Thái bình dương,
Caribbe và Ấn Độ, nhưng đến nay đã lan khắp châu Á, châu Âu và Bắc Mỹ.
Ở Mỹ, từ thập niên 1970 đến nay, các vụ ngộ độc CFP đã tăng gấp 5 lần lên
hơn 250 vụ mỗi năm. Trong khi đó, do nhập khẩu phần lớn hải sản, Hồng
Kông mỗi năm xảy ra hàng trăm vụ ngộ độc CFP so với mức chưa đến 10 vụ
vào những năm 1980. Tỷ lệ mắc và phân bố CFP trên thế giới ngày càng gia
tăng, theo thống kê của FAO, hàng năm có khoảng 20,000 - 30,000 vụ ngộ
độc CFP được ghi nhận, phần lớn tập trung tại các vùng biển nhiệt đới và cận
nhiệt đới.
Ở Việt Nam, theo thông tin từ y tế địa phương, từ 2007 đến nay, hàng
năm đều ghi nhận được rải rác các vụ ngộ độc nghi ngờ CFP, xảy ra chủ yếu
ở các vùng ven biển Quảng Ngãi, Ninh Thuận, Bình Thuận,…
Năm 2012, hội thảo ATTP của EU đã báo cáo ghi nhận độc tố nghi ngờ
CTXs trong cá Hồng nguồn gốc Việt Nam. Đến tháng 5/2017, EU chính thức
cảnh báo về ATTP đối với mặt hàng cá Hồng xuất khẩu của Việt Nam.
4
Dù được rất nhiều sự quan tâm, hướng nghiên cứu về độc tố CTXs của
thế giới vấp phải trở ngại lớn về phương pháp cũng như nguồn chất chuẩn rất
quý hiếm. CTXs là những hợp chất polyete tan trong các dung môi hữu cơ,
bền nhiệt (nhiệt độ cao và đóng băng) và bền pH (axit hay kiềm), không nhạy
với ánh sáng tia cực tím, nên không thể phân biệt bằng trực quan. Gần đây,
nhóm nhà khoa học Nhật Bản đã công bố về kết quả phát triển phương pháp
mới phân tích độc tố CTXs trong mẫu thịt cá sử dụng hệ thống sắc ký lỏng
khối phổ kép (LC/MS-MS).
Tuy nhiên đến nay vẫn chưa có công bố về công trình nghiên cứu độc
tố này tại Đông Nam Á, gây khó khăn trong việc giám sát và cảnh báo vấn đề
ATTP. Hơn nữa, quá trình nghiên cứu CFP tại Việt Nam gặp nhiều khó khăn
như về đặc tính sinh học loài, nguồn gốc, cơ chế tích lũy và lan truyền độc tố
trong chuỗi thức ăn biển rất phức tạp, đặc biệt là chưa có phương pháp phân
tích phù hợp do thiếu trang thiết bị phân tích hiện đại chuyên sâu và chưa tiếp
cận, cập nhật phương pháp phân tích của thế giới.
Hiện nay, Viện Hải dương học đã xây dựng được quy trình phân tích
độc tố trong cá Hồng nhưng chưa có quy trình phân tích đối với loài Chình
biển, vì vậy, học viên chọn đề tài luận văn “Xây dựng quy trình thực nghiệm
phân tích độc tố Ciguatoxins trong Chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng
đầu dò khối phổ kép (LC/MS-MS)”. Nội dung phân tích độc tố CTXs trong
đề tài này sẽ sử dụng quy trình phân tích độc tố CTXs cập nhật mới nhất của
Nhật Bản. Tuy nhiên, quy trình thực nghiệm trên cần được hiệu chỉnh phù
hợp với điều kiện hệ thiết bị hiện có của Việt Nam cũng như thành phần hoá
sinh của Chình biển để đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả phân
tích.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Dựa trên quy trình phân tích Ciguatoxins của Nhật Bản, tiến hành hiệu chỉnh
để xây dựng được một quy trình thực nghiệm vừa phù hợp với điều kiện trang
thiết bị tại Việt Nam vừa phù hợp với thành phần hóa sinh của Chình biển để
đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả phân tích.
5
3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1. Đối tượng nghiên cứu
- 14 cá thể cá Chình, thuộc 4 loài Chình biển (cá Lịch vân vòng, cá Lịch vân
sóng, cá Lịch chấm tia, cá Lịch mõm trắng) được thu mua tại đảo Lý Sơn
(Quảng Ngãi), mỗi cá thể tách lấy 2 phần cơ và gan.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp chiết rút: dung môi Acetone được lựa chọn để hòa tan chất
phân tích, tách chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu.
- Phương pháp tinh sạch: thử nghiệm các điều kiện tinh sạch theo phương
pháp chiết lỏng – lỏng và phương pháp chiết ly pha rắn SPE.
- Xác định độc tố CTX: phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS).
- Xử lý số liệu thực nghiệm, đánh giá hiệu quả của quy trình thực nghiệm
bằng phương pháp thống kê F-test, T-test trong phần mềm Excel.
4. Nội dung nghiên cứu
- Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ một số bộ phận của Chình biển (cơ,
gan).
- Lựa chọn pha tĩnh tối ưu để xác định độc tố CTX trong mẫu đã chiết bằng
phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS).
- Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố CTX bằng phương pháp
LC/MS-MS.
- Đánh giá kết quả của quy trình thực nghiệm trên cơ sở so sánh, đối chiếu với
kết quả kiểm chứng tại PTN của Nhật Bản.
5. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu
Trên cơ sở vận dụng những tiến bộ khoa học - kỹ thuật và công nghệ
mới của thế giới, đây là hướng nghiên cứu mới, tiên phong tại Việt Nam. Mặt
khác, kết quả của đề tài là dẫn liệu khoa học tin cậy phục vụ an toàn thực
phẩm biển, và là tiền đề cần thiết để có những công trình công bố quốc tế về
độc tố CTX trong sinh vật biển tại Việt Nam.
6
7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu

Trước những năm 2010, kỹ thuật sắc ký lỏng đầu dò khối phổ đơn
(single LC/MS) sử dụng chế độ quét ion chọn lọc (SIM) được áp dụng để phát
hiện độc tố này. Sau đó, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, sắc ký
lỏng khối phổ sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử (Electrospray
ionization – ESI) được ứng dụng để định lượng độc tố CTXs với nguyên lý
chọn lọc phân tử được proton hóa [M+NH4]+ hoặc [M+H]+ để cắt các phân tử
nước trong bộ lọc khối tứ cực thứ 2 (Q2) của chế độ ghi phổ nhiều ion chọn
lọc (Multi Reaction Monitoring, MRM). Tuy nhiên, các ion sau khi mất đi
phân tử nước lại không đủ độ nhạy để phát hiện được ở nồng độ tương đương
0,01 ppb CTX-1B (giới hạn ATTP của US FDA). Khắc phục nhược điểm này,
nhóm nghiên cứu của Yogi đã phát triển thành công phương pháp sử dụng
LC/MS-MS với chế độ SIM và MRM có độ nhạy cao hơn, sử dụng cách bắt
cặp phân tử CTX với một số ion dương hoặc âm (H+, Na+, K+, NH4-, SO42-,
OH-…). Phương pháp này được đánh giá có ưu thế về độ nhạy và tính ứng
dụng trong phân tích định lượng độc tố CTXs, mặc dù đầu dò khối phổ độ
phân giải cao (HRMS) ghép nối với hệ sắc ký đã được chứng minh được khả
năng phát hiện các đồng phân của độc tố CTXs trong điều kiện thiếu vắng
chất chuẩn.
Tuy nhiên, tuỳ thuộc vào thông số kỹ thuật của từng hệ thống thiết bị
LC/MS-MS, đòi hỏi quá trình thăm dò, thử nghiệm nhằm tối ưu hoá quy trình
phân tích bao gồm công đoạn tách chiết, loại tạp chất trong mẫu, điều kiện
phản ứng (nhiệt độ, áp suất…) và hệ dung môi pha động (đẳng dòng hay đổi
dòng), cột sắc ký… phù hợp để có được LOD và LOQ tốt nhất đối với phân
tích độc tố CTXs. Báo cáo này trình bày quy trình thực nghiệm tối ưu hoá
phương pháp phân tích độc tố CTXs trong mẫu Chình biển sử dụng hệ thống
sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ kép Shimadzu LCMS 8040 tại phòng
thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về An toàn thực phẩm và
môi trường (khu vực miền Trung) tại Viện Hải dương học.
7
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. NGỘ ĐỘC CIGUATERA
1.1.1. Khái niệm
Ciguatera Fish Poisoning (CFP) là một dạng ngộ độc thực phẩm biển ở
người do tiêu thụ các loài cá rạn vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới đã tích lũy
độc tố Ciguatoxin (CTX). Độc tố CTX được biết đến có nguồn gốc từ loài vi
tảo giáp sống đáy Gambierdiscus toxicus [2].
Theo một bài báo cáo được FAO công bố năm 2004, hơn 400 loài cá
được biết đến là nơi di truyền ngộ độc CFP.
1.1.2. Đối tượng gây ngộ độc
Con người đều được cho là nhạy cảm với độc tố CTX [3]. Dân cư ở các
vùng biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới có khả năng ảnh hưởng cao nhất do tần
suất cao tiêu thụ các loài cá độc. Tuy nhiên, sự gia tăng mức tiêu thụ sản
phẩm thủy sản cùng với sự gia tăng giao thông liên khu vực của các sản phẩm
thủy sản đã mở rộng phạm vi địa lý của các vụ ngộ độc CFP [3].
1.1.3. Triệu chứng lâm sàng
“Ciguatera” là một hội chứng lâm sàng với chuẩn đoán chủ yếu vẫn
dựa trên tiền sử tiêu thụ cá rạn san hô và biểu hiện lâm sàng được xác định
bởi cả triệu chứng tiêu hóa và thần kinh [2].
Sự khác biệt về địa lý cũng sẽ gây ra sự khác biệt về triệu chứng của
các bệnh nhân.
Khởi phát của triệu chứng CFP thường bắt đầu bằng các vấn đề của
đường tiêu hóa như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau bụng trong vòng 12 giờ
sau khi ăn phải cá có độc tố. Các triệu chứng thường thuyên giảm trong vòng
24 giờ [2]. Các vấn đề về tim mạch cũng có thể xuất hiện trong suốt giai đoạn
cấp tính này, thường là nhịp tim chậm và hạ huyết áp.
Từ vài giờ đến hai tuần sau khi ngộ độc cá ciguatera, những vấn đề về
thần kinh như đau đầu, đau cơ, dị cảm (tê và ngứa ran ở vùng ngoại vi và tứ
chi), rối loạn cảm giác nhiệt độ (sự đảo ngược cảm giác nhiệt độ với các vật
8
thể lạnh sẽ cảm thấy nóng và ngược lại),… có thể xuất hiện [2]. Các triệu
chứng thần kinh chủ quan khác được báo cáo như vị kim loại, ngứa, đau khớp
và đau cơ (đau cơ đặc biệt là ở chân) và cảm giác răng lung lay [2]. Có thể
xuất hiện triệu chứng chấn động não đến 10 ngày sau khi bị ngộ độc. Đau đầu
nhiều vị trí, đau dữ dội và kéo dài cũng là biểu hiện khi ngộ độc ciguatera.
Những triệu chứng liên quan đến hệ thần kinh trung ương (tê liệt, mất điều
hòa, choáng váng và nhầm lẫn) thường là dấu hiệu của các trường hợp
nghiêm trọng nhất. Một loạt các triệu chứng rối loạn thần kinh đã được báo
cáo sau khi ngộ độc ciguatera bao gồm mệt mỏi, lo lắng, trầm cảm, hysteria,
rối loạn trí nhớ, thiếu hiệu quả về tinh thần.
Vấn đề tiêu hóa cấp tính thường giải quyết trong vòng 1 hoặc 2 ngày
và các rối loạn tim mạch đảo ngược trong vòng 48 – 72 giờ. Sự phục hồi từ
các triệu chứng thần kinh là lâu hơn và ít dự đoán hơn, từ 1 tuần đến 6 tháng.
Ngứa, đau khớp và mệt mỏi có thể kéo dài trong nhiều tháng hoặc
nhiều năm. Sự mệt mỏi có thể dẫn đến suy nhược như một hội chứng mệt mỏi
mãn tính. Mãn tính có thể phản ánh sự tồn tại lâu dài của ciguatoxins trong cơ
thể.
Sự tồn tại của các triệu chứng ở một số bệnh nhân trong vài năm đã
được ghi nhận và không có gì bất thường. Khoảng 65% số bệnh nhân có triệu
chứng từ 6 tháng hoặc lâu hơn với báo cáo tái phát lên đến 2 năm. Ở Thái
bình dương, các báo cáo đã ghi nhận về sự tiến triển nhanh chóng của triệu
chứng thần kinh khi ngộ độc CFP, dẫn đến suy hô hấp, hôn mê và đôi khi tử
vong [2].
Trên cơ sở các quan sát cho thấy rằng việc tiếp xúc nhiều lần với độc
tố ciguatera có liên quan đến một bệnh lâm sàng nặng hơn, người ta đã đưa ra
giả thuyết rằng CTX tan trong chất béo có khả năng tích tụ trong cơ thể người
và làm giảm ngưỡng chịu đựng của cơ thể. Tuổi thọ và cân nặng càng lớn
càng làm tăng khả năng lưu giữ độc tố, cũng có liên quan đến thời gian và
mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng nhiễm độc. Các hành vi về thể chất
hoặc chế độ ăn uống (ví dụ: tập thể dục, uống rượu hoặc uống quá nhiều
9
caffein) hoặc tiếp xúc lại với độc tố CTX có thể gây tái phát lại các triệu
chứng ngộ độc.
1.2. ĐỘC TỐ CİGUATOXİNS
1.2.1. Bản chất, cấu trúc hoá học
Ciguatoxin là các polyether gồm 13 – 14 vòng liên kết với nhau bằng
các liên kết ether tạo thành một cấu trúc bền vững. CTX tan trong lipid nên
khi vào cơ thể dễ dàng tấn công vào các màng tế bào, gây ngộ độc nhanh
chóng. Phân tử CTX tương đối bền nhiệt, không bị phá hủy hay biến tính khi
chế biến thức ăn. Độc tố này không mùi, không vị và thường không thể phát
hiện bằng các thử nghiệm đơn giản.
CTX trong cá có nhiều đồng phân liên quan chặt chẽ với nhau. CTX
phân lập từ vùng biển Pacific (P-CTX) được xác định các đặc trưng cấu trúc
trước các CTX phân lập từ Caribbean (C-CTX). 02 dạng này có sự khác biệt
tương đối cả về cấu trúc phân tử và độc tính [2]. P-CTX được Scheuer và cs.
phân lập đầu tiên từ cá Chình năm 1967. Một thập kỉ sau, Yasumoto và
cs.,1977 đã phát hiện ra nguồn gốc của CTX ở quần đảo Gambier và đặt tên
cho sinh vật sản sinh độc tố là Gambierdiscus toxicus [2].
Cấu trúc chính của P-CTX phân lập từ cá Chình được mô tả hoàn chỉnh
năm 1989 [2] và được gọi là Gambiertoxin 4B hoặc P-CTX-4B (Hình 1.1).
10
P-CTX 4B
P-CTX-3C
51-Hydroxy P-CTX-3C
Hình 1.1. Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G. toxicus [2]

11
P-CTX-1: R1 = CH2OHCHOH; R2 = OH
C-CTX-1
Hình 1.2. Cấu trúc Pacific (P-CTX-1)

và Caribbean (C-CTX-1) ciguatoxin [2]
1.2.2. Cơ chế hoạt động
Do có thể hòa tan trong chất béo, nên khi hấp thu vào máu đến các tế
bào, CTXs sẽ tấn công vào màng tế bào, khử cực màng tế bào, mở cực màng
tế bào thần kinh cho ion Na+ vào bên trong tế bào tạo ra sự kích động thần
kinh, làm hư hại sự tái tạo tế bào thần kinh.
1.2.3. Nguồn gốc và sự tích luỹ sinh học
Những quan sát chi tiết của Randall (1958) về hành vi kiếm ăn của các
loài cá ở Thái bình dương đã đưa ông đến giả thuyết rằng độc tố CTXs do vi
12
sinh vật sống đáy sản xuất, sau đó được tiêu thụ bởi các loài cá bé và chuyển
qua các loài cá lớn hơn theo chuỗi thức ăn. Bọn vi tảo giáp sống đáy thuộc chi
Gambierdiscus xuất hiện ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế
giới. Loài tảo này sản sinh CTX và/hoặc tiền chất của CTX (Gambiertoxin).
G. toxicus là trọng tâm chính của các nghiên cứu độc tính của CTX trong
nhiều năm, tuy nhiên sau đó, có thêm các nghiên cứu về một số loài
Gambierdiscus mới như G. belizeanus [4], G.yasumotoi [5], G. pacificus, G.
australes, G. polynesiensis [6]. Ngoài sự khác biệt về mức độ độc tính của
loài, độc tính của từng chủng Gambierdiscus có thể rất khác nhau và phụ
thuộc vào một số yếu tố môi trường [2].
Tảo giáp dinoflagellate thuộc chi Gambierdiscus xuất hiện ở vùng biển
nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới trên thế giới. Loài tảo này sản sinh ciguatoxin
và/hoặc tiền chất của ciguatoxin (gambiertoxin) [3]. Các gambiertoxin được
chuyển từ sinh vật đáy sang các loài ăn thực vật (cá, động vật không xương
sống…) và sau đó đến cá ăn thịt thông qua chuỗi thức ăn biển. Độc tố sẽ lớn
dần theo chuỗi thức ăn. Con người khi ăn phải cá ăn thực vật hoặc cá ăn thịt
bị ô nhiễm sẽ gây ra triệu chứng ngộ độc CFP. Các yếu tố ảnh hưởng đến
nồng độ CTX tích lũy trong cá bao gồm tốc độ ăn vào, hiệu quả của quá trình
đồng hóa, mức độ và tính chất của bất kỳ biến đổi sinh học độc tố, tốc độ suy
giảm và tốc độ tăng trưởng của cá [7].
Hình 1.3. Mô phỏng chuỗi thức ăn biển [7]

1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ
Hiện nay sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LC-MS được sử dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, môi trường, thực phẩm, vật liệu công
nghiệp và một số mảng khác.
13
1.3.1. Nguyên lý hoạt động

Nhìn chung, sắc ký lỏng LC cho phép tách các thành phần khác nhau
trong cùng một mẫu dựa vào sự khác biệt về tính ái lực (lực lưu giữ chất) đối
với pha tĩnh của cột và với pha động, và tùy thuộc vào tính chất của từng
thành phần mà phát hiện chúng bởi đầu dò UV, huỳnh quang, độ dẫn điện...
Bằng cách sử dụng những đầu dò này, việc tiến hành phân tích định tính các
hợp chất chủ yếu dựa trên thời gian lưu, phân tích định lượng dựa vào chiều
cao và diện tích đỉnh. Phương pháp sắc ký có thể cho phép phân tách xuất sắc
các chất; tuy nhiên, việc định danh và định lượng một cách đáng tin cậy sẽ
gặp khó khăn trong trường hợp có nhiều thành phần rửa giải cùng lúc từ cột
sắc ký cũng như khi phải tiến hành phân tích đồng thời tất cả các chất có mặt
trong mẫu.
Mặt khác, khối phổ MS là phương pháp phát hiện có độ nhạy cao; đầu
tiên các loại chất phân tích được ion hóa bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, sau
đó trong chân không các ion phát sinh này được phân loại dựa trên cơ sở tỉ lệ
khối lượng trên điện tích của mỗi ion (tỉ lệ m/z) và sau cùng tiến hành đo
cường độ của chúng. Phổ khối lượng thu được cho thấy một mức độ xuất hiện
các ion sao cho mỗi ion đi kèm với một số khối, do đó, MS hỗ trợ rất lớn
trong việc phân tích định lượng. Số khối thu được trực tiếp từ khối phổ, là
một thông tin đặc trưng cho (từng) phân tử. Tuy nhiên, đó là khi các thành
phần trong mẫu được phân tích độc lập với nhau. Nếu nhiều chất phân tích
đồng thời được tiêm vào thì việc giải phổ trở nên cực kì khó khăn.
LC-MS là một hệ thống thiết bị tập hợp vừa khả năng phân tách chất
xuất sắc của LC và vừa khả năng định lượng xuất sắc của MS. Một phổ khối
thu được bằng cách sử dụng chế độ quét (scan analysis) sẽ cho biết khối
lượng phân tử và thông tin về cấu trúc, trong khi thời gian lưu được cung cấp
bởi các đầu dò LC nhằm thực hiện phân tích định tính. Ngoài ra, chế độ quét
ion chọn lọc SIM (Selected Ion Monitoring) sẽ căn cứ vào số khối – là một
thông số cung cấp độ chọn lọc cao. Ngay cả trong trường hợp sự phân tách
bằng sắc ký lỏng không đáp ứng đủ, có thể tiến hành phân tích định lượng
nhằm tránh ảnh hưởng của tạp chất. MS tổng hợp giữa khả năng phân tích đa
14
dạng các chất cùng với tính chọn lọc nên được đánh giá là đầu dò rất hiệu quả
trong sắc ký lỏng.
Hệ thống phân tích khối phổ kế gồm có bộ phận đưa mẫu vào (như hệ
thống HPLC, GC…), bộ phận ghép nối giữa bộ phận tiêm mẫu và những bộ
phận của hệ thống MS, nguồn ion hóa mẫu, các thấu kính tĩnh điện giúp tạo
ion một cách hiệu quả, khối phổ kế phân tách ion theo tỉ lệ m/z và các ion sau
lọc sẽ đi vào đầu dò. Căn cứ phương pháp phân tách ion, có nhiều loại khối
phổ kế khác nhau. Hệ thống khối phổ có chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển
kèm với sử dụng bộ phân tích khối tứ cực (còn gọi là bộ lọc khối tứ cực)
thường được dùng như một đầu dò trong sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LC-
MS. Một số kỹ thuật ion hóa ở áp suất khí quyển như ion hóa đầu phun điện
tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI),…; và chúng được
dùng vừa như bộ phận ghép nối với HPLC và vừa như nguồn cung ion. Sau
khi desolvat hóa, tại đây các ion tạo thành được điều hướng bởi bát cực để di
chuyển bộ phân tích khối tứ cực. Trong bộ phân tích khối tứ cực, điện thế một
chiều và xoay chiều RF (radio frequency - tần số vô tuyến) được xen kẽ vào
trên đường di chuyển của các ion, do đó chỉ các ion đáp ứng đúng tỉ lệ m/z lựa
chọn trước mới có thể đi qua các cặp đối diện của các thanh này. Số lượng ion
đi đến đầu dò sẽ được chuyển đổi thành tín hiệu và được ghi nhận bởi máy vi
tính.
Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS

15
- Chế độ quét (SCAN)

Khi thao tác với chế độ scan (quét), đầu dò sẽ nhận được tất cả các
mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình
phân tích. Chế độ này thường dùng để định danh hay phân tích khi chất phân
tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN
thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.
- Chế độ khảo sát ion chọn lọc (Selected Ion Monitoring – SIM)
Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion
đặc trưng cho chất cần xác định. SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa
chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư
viện có sẵn. Chế độ SIM có thể được dùng để định lượng; ví dụ, trong khoảng
khối từ 50 - 300 như trên, mảnh ion 150 là đặc trưng và cao nhất thì có thể chỉ
chọn riêng m/z 150 ra để định lượng. Có thể chọn được nhiều ion một lần, và
càng nhiều ion thì càng tốt về độ nhạy và độ chính xác. Đối với đầu dò khối
phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng
phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
- Chế độ khảo sát ion cô lập (Selected Reaction Monitoring – SRM) và
khảo sát đa ion cô lập (Multiple Reaction Monitoring – MRM)
Đối với khối phổ ba tứ cực – máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-
MS); 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và
MRM.
SRM là cô lập ion cần chọn để phân mảnh và cô lập 01 mảnh ion con
cần quan tâm trong các mảnh ion sinh ra, đưa vào đầu dò để phát hiện. Thực
tế, do yêu cầu kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan
tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM.
Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô
lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô
lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để
phát hiện.
16
1.3.2. Sự kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ

Hệ thống GC-MS là một thành công trong kết hợp các thiết bị phân tích
với nhau, mặc dù kỹ thuật LC và MS trực tuyến đã được đặt nhiều kì vọng
cao, nhưng công dụng của LC-MS chỉ mới được đưa vào thực hiện gần đây.
Khối phổ kế là thiết bị trong đó chất cần phân tích được hóa hơi thành
ion sau đó được phát hiện ở chân không cao (0,1 Pa > p > 10 - 5 Pa). Trong
LC-MS, việc kết nối đơn thuần phần LC với MS sẽ làm cho pha lỏng hóa hơi
và lượng lớn khí được bơm vào hệ thống MS sẽ giảm độ chân không đến
điểm mà tại đó những ion cần phân tích không thể đến được đầu dò. Đối với
sắc ký lỏng, ngay cả với tốc độ dòng 1 mL/phút và phụ thuộc vào loại dung
môi thì việc hóa hơi có thể làm tăng thể tích của dung môi lên 1000 lần, do đó
sản sinh ra một lượng khí cực lớn. Tuy nhiên, lượng pha động có thể bay hơi
phải được giới hạn trong LC-MS, nên nhiều loại giao diện ghép nối được
nghiên cứu và phát triển để xử lý vấn đề này nhưng hiện nay giải pháp này
vẫn bị hạn chế về độ nhạy, độ bền và sự tiện lợi.
1.3.3. Ứng dụng sắc ký khối phổ trong phân tích độc tố Ciguatoxins
Khối lượng phân tử của CTX được xác định bởi phương pháp khối phổ
độ phân giải cao (HR-FABMS) với giá trị của ion [M+H]+ là 1061,6 [8]. Vài
thập kỷ gần đây, kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) phát triển với
ưu điểm vượt trội về lượng rất nhỏ mẫu cần phân tích cấu trúc. Kết quả
nghiên cứu cho thấy, cấu trúc phân tử của CTX bao gồm nguyên tử carbon,
protons (hydrogen) và oxy với đặc trưng của gốc Me (methonin); và hoàn
toàn không có mặt proton nitrogen [8]. Kỹ thuật ion hóa điện tử (electron
ionization - EI) và bắn phá nhanh nguyên tử (fast-atom bombardment - FAB)
cùng bộ phân tích khối hỗn hợp tứ cực đã được sử dụng để ghi phổ khối của
16 độc tố CTXs ở chế độ ion dương [M+Na]+ và đã xác định cấu trúc hoá học
của chúng (Bảng 1.1). Kết quả phân tích phổ khối lượng bắn phá nguyên tử
nhanh có độ phân giải cao (HR-FABMS), độc tố CTX-4A và -4B có khối
lượng phân tử là 1061,6 đ.v.c., cường độ hấp phụ cao nhất ở bước sóng 226
nm (trong dung môi MeOH) [8]. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H-
NMR) COSY (đo phổ giữa proton của các nguyên tử C kế cận nhau) có thể
17
phân biệt giữa CTX-4A và -4B bằng sự khác biệt của độ dời hoá học
(chemical shift, ) của proton H-48 [9], [10], [11].
Bảng 1.1. Các độc tố ciguatoxins và ion phân tử tương ứng
phân tích bằng sắc ký khối phổ
Tên quy Ion phân tử Nguồn tự Nguồn tài

Tên khác
ước [M+H]+ nhiên liệu
Pacific ciguatoxins
P-CTX-1 CTX-1B 1111,6 Cá ăn thịt [12], [13]
CTX-2A2; 52- [12], [13],

P-CTX-2 1095,5 Cá ăn thịt
epi-54-deoxyCTX [14]
CTX-2B2; 54-
P-CTX-3 1095,5 Cá ăn thịt [12], [13]
deoxyCTX
49-epi- Gambierdicus
CTX-3B 1023,6 [15]
CTX-3C toxicus
M-seco-
1041,6 G. toxicus [15]
CTX-3C
CTX-3C 1023,6 G. toxicus [15], [16]
2,3-
Cá ăn thịt/G.
dihydroxy CTX-2A1 1057,6 [17], [16]
toxicus
CTX-3C
51-
hydroxyC CTX-2C1 1039.5 Cá ăn thịt [17]
TX-3C
G. toxicus /cá [8], [16],

CTX-4B GT-4B 1061.6
ăn thực vật [18]
18
52-epi-
ciguatoxin CTX-4A; GT-4A 1061.6 G. toxicus [16], [18]
-4B
Caribbean ciguatoxins
[19], [20],
C-CTX-1 1141,6 Cá ăn thịt
[21]
[19], [20],
C-CTX-2 56-epi-C-CTX-1 1141,6 Cá ăn thịt
[21]
C-CTX-
1127,6 Cá ăn thịt [20], [21]
1127
C-CTX-
1143,6 Cá ăn thịt [20], [21]
1143
C-CTX-
1157,6 Cá ăn thịt [20], [21]
1157
C-CTX-
1159,6 Cá ăn thịt [20], [21]
1159
Indian ciguatoxins
I-CTX-1 1141,6 Cá ăn thịt [22], [23]
I-CTX-2 1141,6 Cá ăn thịt [22], [23]
I-CTX-3 1157,6 Cá ăn thịt [22], [23]
I-CTX-4 1157,6 Cá ăn thịt [22], [23]
Khối phổ được sử dụng để phân tích CTXs cả khi cần xác định đặc tính
và cấu trúc của các đồng phân khác nhau, chủ yếu sử dụng kỹ thuật FAB và
ion hoá. Lewis và cs.,1994 [24] đã đề cập đến kỹ thuật dùng nguồn sương ion
(IS) cho điều tra phổ của độc tố này. Rất nhiều nguồn ion được ứng dụng, chủ
yếu mục đích để xác định khối lượng phân tử và giả phân tử của các ion độc
tố P-CTX-1 với các m/z khác nhau như 1111,8 đối với [M + H]+; 1133,8 đối
19
với [M + Na]+; 1129,8 đối với [M+H+ H2O]+ và khi đã bị cắt đi lần lượt 05
phân tử nước (m/z 1094; 1076, 1058; 1040 và 1022).
Phân tích khối phổ thu nhận được bằng kỹ thuật IS cung cấp thông tin
phổ và các mảnh phổ tương tự như trong kỹ thuật FAB, và có thể phát hiện
được CTX-1 tinh sạch (tương đương với độ nhạy của HPLC-FLD). Tuy
nhiên, rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến các ion này khi thử nghiệm phân tích
các dịch chiết thô từ cá được thêm P-CTX-1 ở nồng độ 1,5 ng/g mẫu ban đầu.
Tuy nhiên, đây vẫn được coi là một cách đơn giản, nhạy để kiểm chứng kỹ
thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ. Khi sử dụng phương pháp này để phân
tích dịch chiết độc tố có độ tinh sạch cao từ ruột Chình biển Lycodontis
javanicus gây ngộ độc CFP đã cho phép xác định 14 đồng phân gồm 02 ở m/z
1095,7; 06 ở 1111,6 hoặc 06 ở 1127,7 với ưu thế của P-CTX-1, -2 và -3.
Ngoài các ion chính, mỗi đồng phân này lại cho các mảnh ion [M+NH4]+ và
[M+Na]+. Ở đây, cũng ghi nhận là hệ dung môi MeCN:H2O bổ sung 1 nM
ammonium acetate cho kết quả tốt hơn so với bổ sung 0,1% TFA, và sử dụng
bơm hỗ trợ hệ HPLC-MS sẽ giúp tín hiệu ghi nhận tăng gấp 20 lần so với
HPLC-MS truyền thống [13]. Thành công chứng minh được đặc tính phân
mảnh này vô cùng hữu hiệu để xác định các đồng phân mới của độc tố CTXs.
Trong một công bố khác, HPLC-MS được ứng dụng để xác định đặc
tính của 12 đồng phân C-CTXs trong dịch chiết tinh sạch của loài cá Vẩu
Caranx latus [25]. Trong trường hợp này, bơm cao áp HP 3300 được kết nối
với đầu dò tứ cực API Qstar Pulsar (PE-Sciex). Ion tương ứng với [M+NH4]+,
[M+H]+ và [M+H-H2O]+ và [M+H-2H2O]+ được ghi nhận với cường độ nhất
khi formic acid được bổ sung vào dung dịch đệm. Ngược lại, khi dùng TFA,
hầu như thiếu vắng có mặt của phân tử ion [M+NH4]+. Ngoài ra, formic acid
luôn cải thiện đường nền và khối phổ thu nhận được cao gấp 5 lần so với
TFA. Kỹ thuật phân tách pha đảo trở nên hiệu quả hơn trên cột sắc ký Zorbax
C3 (2,1 × 150 mm, Agilent) so với cột Aquapore C18 RP 300 (1 × 50 mm),
đặc biệt là có thể phân tách được các đồng phân gần nhau. Với chế độ sắc ký
thay đổi nồng độ pha động (gradient) là hệ dung môi MeCN:H2O khi có và
không có mặt formic acid 0,1%; đã xác định được 05 đồng phân CTXs mới ở
20
m/z của [M+H]+ lần lượt là 1159,6; 1143,6; 1157,6; 1127,6; và một loạt dẫn
xuất và C-CTX-1 mà trước đây chưa bao giờ được ghi nhận.
I-CTXs đầu tiên được xác định bởi Hamilton và cs. [26] trong cá Hồng
đốm bạc Lutjanus bohar và Lutjanus sebae và kiểm chứng bằng HPLC-MS
tương tự như phương pháp phân tích C-CTXs [25] có một số thay đổi ở điều
kiện sắc ký. Quá trình phân tách được thay đổi sang chế độ đẳng dòng trên cột
sắc ký Zorbax 300SB (2,1×150 mm; 3,5 μm, Agilent) với hệ pha động
MeCN:H2O:isopropanol (80:19:1 về thể tích) có 5 μM ammonium acetate
hoặc 0,1% formic acid. Kết quả, ion phân tử của I-CTX thu được hoàn toàn
tương đồng với ion phân tử của C-CTX ở m/z 1141,6; mặc dù thành phần/tỉ lệ
của các phân tử và ion phân tử có khác biệt với ưu thế của giả ion phân tử
[M+H-H2O]+ trong các dẫn xuất I-CTXs. Sau đó, đã phát hiện thêm 03 đồng
phân khác là I-CTX-2, -3 và -4. I-CTX-1 và -2 có khối phổ hoàn toàn giống
C-CTX-1 trong loài cá Hồng L. bohar.
Tiếp theo, Lewis và cs. công bố kết quả ghép nối giữa HPLC với khối
phổ kép tandem mass spectrometry (MS/MS) [27]. Khi phân tích CTX tinh
sạch với pha động 50% MeCN có 0,1% TFA, sản phẩm ion của MRM được
tối ưu cho mất đi gốc -NH3 từ phân tử ion [M+NH4]+, sau đó tiếp tục mất đi
03 phân tử H2O và đã thu nhận các mảnh khối phổ với m/z lần lượt 1128,7 >
1094,0/1076,0/1058,0 (P-CTX-1); và 1158,6 > 1123,6/1105,6 (C-CTX-1).
Phương pháp này cho đường chuẩn trong khoảng làm việc và cải thiện độ
nhạy rất nhiều LOD 0,04 và 0,1 ng/g đối với P-CTX-1 và C-CTX-1. Quá trình
sắc ký được thực hiện trên cột pha đảo Vydac (2,1 × 250 mm, 5 μm;
Separation Group) với dịch giải cột là MeCN:H2O có bổ sung 0,05% TFA.
Hệ sắc ký lỏng 1100 Agilent kết nối với 4000 QTRAP hybrid mass
spectrometer (Applied Biosystems) được thử nghiệm để kiểm chứng P-CTX-
1 và C-CTX-1 trên cơ sở khối phổ và thời gian lưu đối chiếu với độc tố chuẩn
và đã phát hiện được độc tố một cách đặc hiệu [2]. Đối với C-CTX-1, 03 quá
trình chuyển tiếp MRM được chọn lọc với giả phân tử ion [M+H-H2O]+ đóng
vai trò ion tiền thân (m/z: 1123,5 > 1105,6/1087,6/1069,6). Đối với P-CTX-1,
02 nhóm chuyển tiếp được giám sát với sự có mặt của tín hiệu phản hồi.
21
Trước tiên, coi phân tử ion [M+H]+ là chất tiền thân (m/z: 1111,6 >
1093,6/1075,6/1057,6), sau đó dựa vào mảnh ion [M+NH4]+ (m/z: 1128,6 >
1093,6/1075,6/1057,6). Chế độ sắc ký được thực hiện trên cột pha đảo Luna
C8 (2) (2,0 × 150 mm, 5 μm; Phenomenex) và chương trình sắc ký thay đổi
nồng độ của pha động MeCN:H2O có 0,1% formic acid.
Gần đây, phương pháp HPLC/MS-MS cải tiến được công bố bởi Lewis
và cs. [28] với phương pháp tách chiết nhanh từ 2 g mẫu thịt cá ban đầu với
giới hạn định lượng là 0,1 ng/g – hoàn toàn có thể ứng dụng phân tích các
mẫu cá gây ngộ độc CFP từ biển Thái bình dương. Ở quy trình này, chế độ
sắc ký được thực hiện trên cột Luna C18 (2.1 × 250 mm, 5 μm; Phenomenex)
với chương trình thay đổi nồng độ pha động 95% MeCN:H2O có 2 mM
ammonium formate và 0,1% formic acid. Hệ khối phổ kép 3 tứ cực (triple
quadrupole) API 4000 QTRAP (Applied Biosystems) với cặp chuyển đổi
MRM đối với P-CTX-1 trên cơ sở sự phân mảnh của giả ion phân tử
[M+NH4]+ sau khi lần lượt mất đi nhóm chức -NH3 và các phân tử H2O (m/z:
1128,7 > 1093,7/1075,7/1057,7).
Ngay sau đó, Stewart và cs. đã công bố phương pháp cải tiến nhằm tách
chiết nhanh và phân tích HPLC/MS-MS các độc tố P-CTX-1, -2 và -3 trong
mẫu cá nghi ngờ gây ngộ độc CFP [29]. Chế độ sắc ký được thực hiện trên
thiết bị Prominence LC (Shimadzu Corp.) gắn cột Gemini C6-phenyl (2,0 ×
50 mm; Phenomenex) và AB/Sciex API4000Q (AB/MSD Sciex). Hệ dung
môi pha động Acetonitrile:H2O thay đổi dòng với cải tiến bằng cách có mặt
của 2 mM ammonium acetate và 0,1% formic acid. Chế độ sang lọc nhiều ion
(MRM) tương tự như Lewis và cs [28], với khoảng phổ để xác định CTX-2 và
-3 (m/z: 1128,7 > 1093,7/1075,7/1057,7 (P-CTX1); 1112,7 >
1077,6/1059,6/1041,6 (P-CTX-2 và -3).
22
Hình 1.5. Khối phổ và thời gian lưu

của 16 dẫn xuất CTXs [30]
Nhìn chung, HPLC-MS và HPLC/MS-MS đã được chứng minh hiệu
quả trong định danh và xác định đặc tính các đồng phân độc tố CTXs trên
toàn thế giới. Hơn nữa, sự cải tiến các thiết bị phân tích đã nâng cao độ nhạy
và độ chọn lọc do đo lường được chính xác phổ hoặc chuỗi các mảnh ion con
theo đặc tính từng mảnh.
Tuy nhiên, xét về tiêu chí an toàn thực phẩm (0,01 ng/g và 0,1 ng/g đối
với P-CTXs và C-CTXs), HPLC-MS vẫn bị hạn chế khi cần kết quả định
lượng chính xác từ những mẫu có kết quả rất gần với giới hạn này. Cải tiến
thiết bị phân tích và quy trình chuẩn bị mẫu trước khi phân tích sẽ khắc phục
được khó khăn do một số tạp chất trong mẫu cá làm giảm LOD và LOQ.
Kỹ thuật ion hóa
Trong khi các nghiên cứu nhằm tìm hiểu tính chất đặc điểm phổ khối
của các độc tố nhóm CTXs có thể sử dụng các kỹ thuật ion hóa khác nhau với
các loại nguồn ion khác nhau, các nghiên cứu nhằm định tính, định lượng
những độc tố này trong cá sử dụng phổ biến nhất là ESI. Với đặc điểm là kỹ
23
thuật ion hóa “mềm”, phổ ESI-MS thường cho các pic có cường độ lớn tương
ứng với những ion sơ cấp giữ nguyên cấu trúc nguyên bản của đối tượng phân
tích (chẳng hạn như ion [M-H]– ở chế độ ion âm hay ion [M+Na]+ ở chế độ
ion dương), tạo điều kiện thuận lợi cho việc bắn phá tiếp để tạo ra các ion thứ
cấp đặc trưng khi phân tích MS/MS ở chế độ MRM nhằm nâng cao độ đặc
hiệu của phương pháp. Vì vậy, với kỹ thuật ESI-MS/MS được dùng rất phổ
biến để phân tích các độc tố nhóm CTXs ở cả chế độ ion âm và ion dương [1].
Các điều kiện cụ thể của bộ nguồn ESI được công bố dao động tùy thuộc vào
thiết bị LC/MS-MS cụ thể được sử dụng để xây dựng phương pháp.
Lựa chọn phân tích khối
Các phương pháp sử dụng đầu dò khối phổ, nhất là khối phổ hai lần, đã
và đang được sử dụng ngày càng phổ biến để phân tích đồng thời cả định tính
và định lượng độc tố nhóm CTXs. Theo yêu cầu về độ tin cậy, một phương
pháp phân tích bằng khối phổ hai lần (MS/MS) được chấp nhận là đủ đặc hiệu
khi đối tượng nghiên cứu được định danh ít nhất bằng 4 điểm định danh
(identification point - IP) trong đó 1 ion sơ cấp được tính 1 IP, một ion thứ
cấp được tính 1,5 IP, và tỷ lệ cường độ các peak thu được từ các ion thứ cấp
của mẫu thử phải nằm trong khoảng dao động cho phép so với tỷ lệ này của
chuẩn phân tích trong cùng điều kiện và thời điểm. Như vậy, để đáp ứng các
yêu cầu về độ tin cậy kể trên, các phương pháp phân tích độc tố nhóm CTXs
bằng LC/MS-MS đều sử dụng tối thiểu 1 ion sơ cấp, tối thiểu 2 ion thứ cấp
của các độc tố này khi phân tích, trong đó cường độ 1 ion thứ cấp được dùng
làm đáp ứng để tính toán kết quả định lượng, ion sơ cấp và ion thứ cấp còn lại
cung cấp thông tin định tính và đảm bảo độ đặc hiệu. Chế độ ion dương với
nguồn ion hoá phun điện tử (ESI+) được áp dụng để định tính và định lượng
CTXs, trong đó các ion thứ cấp m/z từ [M+NH4]+ sau khi lần lượt mất đi
nhóm chức -NH3 và các phân tử H2O (m/z: 1128,7 > 1093,7/1075,7/1057,7)
được dùng để định tính độc tố này.
Như vậy, cho tới nay, chế độ ion dương là chế độ được áp dụng phổ
biến để định danh riêng từng độc tố bằng cách so sánh với chất chuẩn, kết hợp
thời gian lưu với các thông tin phân tích MS/MS. Tuy nhiên, với đặc trưng là
24
một kỹ thuật phân tích phổ phức tạp, có nhiều thông số phải tối ưu hóa, với
mỗi thiết bị LC-MS cụ thể sẽ cần phải thực hiện lại việc khảo sát tối ưu hóa
các điều kiện phù hợp với đặc điểm kỹ thuật nội tại của thiết bị để có được kết
quả phân tích tốt nhất.
Điều kiện sắc ký
Trong các nghiên cứu phân tích độc tố CTXs bằng LC/MS-MS, pha
tĩnh sử dụng chủ yếu là cột pha đảo C18.
Chủ yếu sử dụng pha động với 2 thành phần dung môi chính là MeCN
và H2O ở 2 vùng pH: pha động có pH acid và pha động có pH kiềm.
+ Thành phần của pha động có pH kiềm thường là hỗn hợp MeCN -
H2O có chứa amoniac. Tỷ lệ amoniac trong pha động được duy trì cố định ở
một mức nhất định: 0,05 % (tt/tt) [31], 6,7 mM [32], [33]. Ngoài ra, pha động
ở pH kiềm còn sử dụng amoni bicarbonat được chỉnh pH về khoảng 11 bằng
amoniac [34].
+ Thành phần pha động ở vùng pH acid là hỗn hợp ACN - H2O có chứa
acid formic và amoni format [31] hoặc chỉ chứa acid formic [33], [35]. Các
pha động có thành phần dung môi MeCN - H2O được sử dụng ở cả chế độ rửa
giải gradient và rửa giải đẳng dòng.
LOQ (µg/kg) 4,65 3,55 5,12
Nhận xét:
- Dung môi phổ biến dùng để chiết độc tố CTXs là Acetone.
- Chương trình sắc ký để tách độc tố nhóm CTXs là sắc ký pha đảo với
pha tĩnh hay sử dụng là C18.
- Kỹ thuật khối phổ 2 lần cho LOD thấp với độ nhạy của phương pháp
rất cao (đơn vị ppb) [1]. Đây là một ưu điểm nổi trội của phương pháp
LC/MS-MS so với các phương pháp trước đây trong xác định độc tố CTXs có
mặt trong mẫu cá.
25
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng: Tổng số 14 cá thể cá Chình thu mua tại một số vùng biển
miền Trung Việt Nam bao gồm Lý Sơn (Quảng Ngãi), Trường Sa (Khánh
Hoà). Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm tại Viện Hải dương học
trong điều kiện bảo quản bằng đá lạnh với thời gian sớm nhất.
Tại phòng thí nghiệm, mẫu được rửa sạch, định danh khoa học, sau đó
cá tách thành 02 phần (cơ, gan), bảo quản trong các túi plastic riêng ở điều
kiện -20°C cho đến khi sử dụng thí nghiệm. .
Thiết bị bảo quản mẫu: Tủ lạnh sâu MDF-549-PB (Panasonic, Nhật)
Bảng 2.1. Định danh và ký hiệu mẫu
Kí hiệu mẫu Kí hiệu mẫu

Tên loài Tên loài
Cơ Gan Cơ Gan
Cá Lịch vân vòng C026 G026 Cá Lịch vân vòng C033 G033
Cá Lịch vân vòng C027 G027 Cá Lịch vân sóng C034 G034
Cá Lịch vân vòng C028 G028 Cá Lịch vân sóng C035 G035
Cá Lịch vân vòng C029 G029 Cá Lịch chấm tia C036 G036
Cá Lịch vân vòng C030 G030 Cá Lịch chấm tia C037 G037
Cá Lịch vân vòng C031 G031 Cá Lịch mõm trắng C038 G038
Cá Lịch vân vòng C032 G032 Cá Lịch mõm trắng C039 G039
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.2.1.1. Dung môi, hóa chất
Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích dành cho
LC/MS-MS.
- Methanol (Wako, code: 131-01826, độ tinh khiết: 99,8%)
- Acetone (Wako, code: 016-00346, độ tinh khiết: 99,5%)
- Diethyl ether (Wako, code: 055-01155, độ tinh khiết: 99,5%)
26
- Hexan (Wako, code: 085-00416, độ tinh khiết: 96%)

- Acetone nitril (Wako, code: 014-00386, độ tinh khiết: 99,5%)
- Ethyl acetate (Wako, code: 051-00356, độ tinh khiết: 99,5%
- Amonium formate (Wako, code: 014-03125)
- Formic acid (Wako, code: 063-04192, độ tinh khiết: 99 %)
- Nước trao đổi ion (Hệ thống máy khử ion nước cất Ultral Clear GP
UV UF TM, hãng sản xuất: Evoqua – Đức)
2.2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích
Thiết bị:
- Máy sắc ký lỏng khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa
phun điện (ESI) gồm máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng LC20AD-XR
(Shimadzu, Nhật), bộ ổn nhiệt cột CTO-20A và bộ tiêm mẫu tự động SIL
20AC-XR kết nối thiết bị hệ phổ khối ba tứ cực MS/MS 8040 (Shimadzu,
Nhật), hệ thống sử dụng khí nitơ từ bộ sinh khí AB-3G của Shimadzu.
- Máy ly tâm lạnh Mikko (Hermle, Đức, code: 58080029)
- Cân phân tích Sartorius CP224S (Sartorius, Thụy Sĩ) với d = 10 -4 g.
- Thiết bị đồng nhất mẫu Ika T10 (Ika, Đức)
- Máy lắc xoáy, Ika Vortex 2 (Ika, Đức)
Ngoài ra, còn các thiết bị phụ trợ khác bao gồm nồi cách thủy, máy lọc
nước trao đổi ion, hệ thống cô quay chân không, tủ âm sâu bảo quản mẫu…
thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về “ATTP
và môi trường (khu vực Miền Trung)” tại Viện Hải dương học.
Dụng cụ phân tích:
- Cột sắc ký pha đảo hiệu năng cao Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100
× 2,1 mm, 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) (Agilent, Đức)
- Cột sắc ký pha đảo Wakosil 3C18 HG (Wako, Nhật Bản)
27
- Cột chiết ly pha rắn Florisil (InertSep FL-PR 500 mg, GL Science
Inc.)
- Cột chiết ly pha rắn Florisil (InertSep FL-PR 200 mg, GL Science
Inc.)
- Cột chiết ly pha rắn PSA (InertSep PSA, 200 mg, GL Sciences Inc.)
- Dụng cụ chính xác: Bộ micropipette (Eppendorf, Đức) thể tích 2-20,
10-100, 10-200, 100-1000 µL; pipet thủy tinh chính xác từ 1-10 mL.
- Ống ly tâm Teflon có nắp xoắn (15 và 50 mL), ống eppendorf (2 mL).
- Lọ đựng mẫu loại 1,8 mL, màu nâu dùng cho hệ tiêm mẫu LC tự động
- Các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm như ống đong, cốc
thủy tinh, phễu, giấy lọc…
2.2.2. Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ cơ và gan của Chình biển
Trong quy trình tách chiết độc tố CTXs từ mẫu cá, ba yếu tố quan trọng
chi phối độ chính xác của kết quả phân tích LC/MS-MS bao gồm dung môi
tách chiết; làm sạch dịch chiết ban đầu và loại các tạp chất nhóm lipid.
a) Dung môi tách chiết
Do bản chất thân dầu của các độc tố CTXs ở dạng ester hóa, dung môi
sử dụng để chiết các độc tố này ra khỏi thịt cá cần có độ phân cực phù hợp để
đảm bảo hiệu suất chiết, đồng thời cũng phải hạn chế được việc chiết theo
cùng các thành phần khác trong cá để đơn giản hóa giai đoạn làm sạch mẫu
cũng như hạn chế sai số, nhất là dương tính giả và âm tính giả trong giai đoạn
phân tích. Trong giai đoạn đầu sau khi CTXs được phát hiện và định danh,
acetone (AcOH) được dùng để chiết độc tố từ cá để định lượng bằng thử
nghiệm sinh học trên chuột [30]. MeOH và hỗn hợp MeOH - nước với các tỉ
lệ nhất định cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác để chiết độc tố
CTXs từ cá trước khi phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng với các đầu dò MS
hay MS/MS [30], [1].
28
b) Phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu (clean-up)

Tùy thuộc vào dung môi chiết sử dụng trong giai đoạn đầu và loại kỹ
thuật phân tích sẽ sử dụng, dịch chiết thô từ mẫu cá có thể được xử lý làm
sạch theo nhiều quy trình khác nhau, nhưng về cơ bản là sử dụng 2 kỹ thuật
chiết lỏng - lỏng và chiết ly pha rắn (solid phase extraction – SPE).
 Chiết lỏng – lỏng
Đây là một kỹ thuật tách đơn giản nhất và trung thực nhất được sử
dụng để làm sạch hoặc để tách một cấu tử riêng hoặc một loại các cấu tử khỏi
mẫu mẹ. Mẫu rắn hoặc lỏng được chiết bằng dung môi hữu cơ thích hợp. Đối
với các mẫu nước, dung môi chiết phải không tan trong nước. Độ phân cực
của dung môi nằm trong một khoảng rộng từ các ankal như pentan, hexan,
hoặc xiclohexan đến nitrobenzene và n-butanol, cũng như các dung môi có
chứa clo (đặc biệt là dicloruametan, cloroform) thường có lợi thế tách chiết.
Có hai quá trình chiết lỏng – lỏng là chiết không liên tục (chiết phân đoạn) và
chiết liên tục.
 Chiết ly pha rắn (Solid Phase Extraction – SPE)
Tuy nhiên, độc tố dạng thô thu được bằng phương pháp chiết lỏng –
lỏng chứa nhiều tạp chất có khối lượng phân tử tương đương với chất cần
phát hiện. Thường hay bắt gặp hiện tượng các đỉnh MS không tách biệt, dính
chồng nhau dẫn đến không thể xác định chính xác MW của mảnh ion. Do đó,
bên cạnh chiết lỏng – lỏng, dịch chiết sơ bộ ban đầu từ thịt cá được tiếp tục
làm giàu mẫu và làm sạch bằng phương pháp chiết ly pha rắn (SPE) trước khi
phân tích bằng LC/MS-MS.
Chiết ly pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan
giữa hai pha lỏng và rắn; trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước
hoặc dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và
xốp) – pha rắn. Pha rắn (pha tĩnh) thường là các hạt silica gel xốp trung tính,
hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã được ankyl hoá nhóm -OH bằng các
gốc hydrocarbon mạch thẳng (-C2, -C4, -C8, -C18…), hay nhân phenyl, các
polyme hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính được nhồi vào cột chiết nhỏ
29
hoặc nén ở dạng đĩa dày 1-2 mm, đường kính 3-4 cm (đĩa chiết). Một số loại
cột SPE pha thường thông dụng như Silica, NH2, CN, Diol, Florisil…; trong
đó cột SPE 2,3 lớp của hỗn hợp các chất nền là tối ưu nhất để làm sạch dịch
chiết độc tố CTXs. Dung môi giải hấp phụ thường là hỗn hợp CHCl-MeOH,
hexan-MeOH, AcOH-MeOH hay EtOAc-MeOH với tỉ lệ thể tích nhất định
hoặc Acetoniltril (MeCN).
c) Phương pháp loại tạp chất nhóm lipid trong dịch chiết
Với một số mẫu có hàm lượng chất béo cao (gan, ruột cá…), cần thực
hiện bước thứ tiếp theo nhằm loại tạp chất béo. Trong trường hợp này, các cột
pha đảo như Silica C18, C8, C4, NH2, CN, PHE, PSD, HLB thường được sử
dụng dựa vào tương tác kỵ nước giữa pha rắn và mẫu. Hai loại sắc ký pha đảo
cột nhồi thường được dùng là một loại pha tĩnh là chất mang (pha nền) silica
gel gắn với các dây alkyl bằng liên kết hóa học (silica gel biến tính hóa học)
và loại còn lại là các hạt nhựa nhồi cột. Ngoại trừ trường hợp đặc biệt, loại
chất mang silica gel pha đảo thường được dùng vì khả năng tạo số lượng lớn
đĩa lý thuyết. Phải sử dụng các hạt nhựa nhồi cột trong trường hợp pH của pha
động dùng trong việc phân tách nằm ngoài khoảng cho phép để được sử dụng
của silica gel hoặc nếu các nhóm silanol chưa được alkyl hóa nằm trên bề mặt
của silica gel gây hiệu ứng bất lợi cho việc phân tách và vấn đề này không thể
được giải quyết bằng cách thay đổi thành phần pha động. Dù vậy, đó là những
trường hợp tương đối hiếm gặp. Các nhóm chức alkyl điển hình gắn trên
silicagel bằng phương pháp hóa học gồm octadecyl, octyl và trimethyl. Mạch
alkyl càng dài, lực lưu chất càng mạnh. Tuỳ lực lưu chất kỵ nước đối với hợp
chất mục tiêu, cột có lực lưu chất yếu hơn được chọn nếu hợp chất cần phân
tách không thể rửa giải trong một thời gian thích hợp ở điều kiện khi pha
động cung cấp lực rửa giải mạnh nhất (dung môi hữu cơ 100%). Ngược lại, sử
dụng cột có lực lưu chất mạnh hơn nếu chất cần phân tách không được lưu
giữ trong một thời gian thích hợp ở điều kiện khi pha động cung cấp lực rửa
giải yếu nhất (100% dung dịch đệm). Pha động cơ bản thường là một hỗn hợp
gồm nước/dung dịch đệm và dung môi hữu cơ. Ba tác nhân chủ yếu ảnh
hưởng đến sự phân tách là loại dung môi hữu cơ là tỉ phần dung môi hữu cơ
30
và độ pH của dung dịch đệm. Acetonitrile (MeCN) và MeOH là các dung môi
hữu cơ được dùng phổ biến nhất. MeCN cung cấp lợi ích kép là có độ nhiễu
thấp do độ hấp thu UV ở mức kém và tuổi thọ của cột được kéo dài, và cho
phép việc phân tích diễn ra ở áp suất thấp. Tuy nhiên, MeOH có thể được
dùng phổ biến hơn nhờ vào tính chọn lọc, thể hiện ở trường hợp tách được
nhiều chất mà MeCN không tách được do sự khác biệt về hằng số phân ly của
các chất trong 02 dung môi này. Mặt khác, tỉ phần của dung môi hữu cơ được
chọn sao cho đạt được sự phân tách theo mong muốn và tốc độ rửa giải nhanh
nhất, tăng tỉ phần của dung môi hữu cơ để tăng tốc độ rửa giải và ngược lại,
giảm tỉ phần hữu cơ sẽ giảm tốc độ rửa giải nhưng sự phân tách diễn ra tốt
hơn. Khi chỉ có các hợp chất trung hòa được phân tích, thời gian lưu không bị
ảnh hưởng bởi pH của pha động, vì vậy việc phân tích thông thường được
dùng bởi dung môi nước lẫn hữu cơ. Tuy nhiên, điều kiện về độ pH cũng phải
được đáp ứng khi phân tích các acid và base.
Đối với độc tố CTXs, cột Sephadex LH-20, CIS packed column và
LiChrosorb RP-18 hay được sử dụng để làm sạch dịch chiết ở bước này với
dịch giải hấp phụ là MeOH-nước ở các tỉ lệ thể tích nhất định (6:4, 7:3, 8:2,
9:1…). Bước cuối cùng trong tinh sạch độc tố CTXs là sử dụng cột pha đảo
chuỗi polymer ODS (InertSep C18, 200 mg).
* Thực nghiệm chiết tách và loại tạp dịch chiết độc tố CTX từ cơ và gan
của Chình biển
Quy trình chiết tách được thực hiện theo Suzuki và cs., 2017 [1], mẫu
được chiết trong dung môi Acetone với tỉ lệ w/v : 1/3.
- Cân mỗi mẫu khoảng 5 gam, đồng nhất và cho vào ống ly tâm nhựa,
thêm 15 mL acetone, ngâm qua đêm.
- Ly tâm ở 3000 v/p trong 5 phút thu dịch trong, lặp lại 02 lần chiết với
cùng thể tích acetone.
- Thu gom toàn bộ dung dịch acetone của 02 lần chiết. Khi acetone
được sử dụng làm dung môi chiết ban đầu để tách độc tố nhóm CTXs ra khỏi
mô cơ cá, dung môi này sẽ được bay hơi, thu được cặn.
31
- Hoà tan cặn trong 4 mL diethyl ether, lắc đều trong phễu chiết thuỷ
tinh, để lắng cho đến khi dung dịch phân thành 02 lớp, thu lớp trên (diethyl
ether) (công đoạn này thực hiện 2 lần).
- Bay hơi toàn bộ diethyl ether bằng hệ thống cô quay chân không để
thu nhận cặn rắn. Hoà tan cặn này trong 1 mL MeOH-DW (tỷ lệ 9:1, v/v),
thêm vào 2 mL hexane, để loại tạp lipid. Lắc đều trong phễu chiết thuỷ tinh,
để lắng cho đến khi dung dịch phân 2 lớp, thu nhận lớp dưới (MeOH-DW).
Cô quay chân không đuổi MeOH, thu được cặn thô chứa độc tố.
* Thực nghiệm khảo sát quy trình tinh sạch dịch chiết độc tố từ thịt cá
Việc sử dụng acetone làm dung môi chiết độc tố với thể tích và số lần
chiết như đã trình bày ở phần trên cho phép chiết CTXs khỏi mô cá, tuy nhiên
cần xem xét mức độ sạch của dịch chiết trước khi phân tích LC/MS-MS.
Để đánh giá sự cần thiết của giai đoạn làm sạch dịch chiết, quá trình
chiết với acetone được tiến hành trên 6 mẫu cá (03 mẫu cơ, 03 mẫu gan). Mục
đích của bước thử nghiệm này là để xác định điều kiện tối ưu trong chiết rút
và tinh sạch độc tố.
Dịch chiết acetone trên mỗi mẫu được đánh giá độ sạch trong các điều
kiện sau:
- Điều kiện 1: trộn đồng thể tích dịch chiết với ACN.
- Điều kiện 2: để dịch chiết ở 4°C trong 24h.
- Điều kiện 3: các mẫu xuất hiện vẩn đục ở điều kiện 1, ly tâm lấy dịch
trong, thêm ACN kiểm tra, nếu còn vẩn đục, thêm ACN đến khi không còn
xuất hiện vẩn đục, lại ly tâm lấy dịch trong bảo quản tiếp trong điều kiện 2.
- Điều kiện 4: các mẫu xuất hiện vẩn đục ở điều kiện 2, ly tâm ở 14.000
vòng/phút trong 5 phút ở 4°C, sau đó lấy dịch trong thêm ACN đồng thể tích,
trộn đều.
- Điều kiện 5: pha loãng đồng thể tích dịch chiết với H2O, chiết với 5
mL isopropylacetat, lấy lớp isopropylacetat cô cạn, hòa cắn trong 5 ml AcOH
rồi thêm 5 mL ACN trộn đều.
32
- Điều kiện 6: thực hiện như điều kiện 5, nhưng sau khi hòa cặn trong
AcOH để dịch AcOH ở 4°C trong 24h.
- Điều kiện 7: cho dịch chiết qua cột chiết pha rắn Florisil (InertSep
FL-PR 500 mg, GL Science Inc.), rửa cột bằng 1 ml H2O, rửa giải bằng 2 ml
AcOH, trộn đồng thể tích dịch rửa giải với ACN.
- Điều kiện 8: tiến hành như điều kiện 7 trên cột chiết pha rắn Florisil
(InertSep FL-PR 200 mg, GL Science Inc.).
- Điều kiện 9: tiến hành như điều kiện 7 trên cột chiết pha rắn Cột chiết
pha rắn PSA (InertSep PSA, 200 mg, GL Sciences Inc.)
- Điều kiện 10: Tiến hành lần lượt cả điều kiện 7 và 8
- Điều kiện 11: Tiến hành lần lượt cả điều kiện 7, 8 và 9.
Từ kết quả khảo sát, đánh giá thực nghiệm, lựa chọn điều kiện làm sạch
dịch chiết cho phép loại tốt các thành phần tạp bị chiết theo độc tố, đồng thời
bảo toàn được lượng độc tố có trong dịch chiết ban đầu. Kết hợp điều kiện
làm sạch dịch chiết với điều kiện chiết độc tố từ cá đã lựa chọn để thiết lập
quy trình xử lý mẫu cá cho phân tích CTX-1B.
2.2.3. Xác định độc tố CTXs bằng phương pháp LC/MS-MS

Trong khuôn khổ luận văn này, điều kiện khối phổ đã được tối ưu hoá
dựa vào quy trình của Yogi và cs. 2011 [30], có cải biến phù hợp độ nhạy
chung của hệ sắc ký lỏng khối phổ tại phòng thí nghiệm Hoá sinh Biển, Viện
Hải dương học, cụ thể:
- Ion sơ cấp lựa chọn là [M+Na]+ của CTX-1B có m/z 1133,6.
- Điều kiện sắc ký theo Yogi và cs., 2011, có các cải biến để giảm thiểu
áp suất lên bơm LC, ion spray voltage (IS) là 5500V và nhiệt độ buồng ion IS
là 500°C (TEM). Nguồn năng lượng ion GS1 và GS2 lần lượt là 80 và 30, giá
trị tối ưu của DP (thể tách chùm) là 400, năng lượng bắn phá ion sơ cấp CE là
12V để đáp ứng cường độ peak tốt nhất trên đầu dò khối phổ MS.
33
- Sử dụng chế độ chạy SIM (Selected Ion Monitoring): Trong chế độ

SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần
xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước
đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn.
Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo
sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
- Các thông số chạy mẫu:
+ Chế độ chạy: Q3 SIM
Event Tên chất m/z
1 CTX-1B 1133,60
2 54 deoxy-CTX-1B 1117,60
3 CTX-4A/4B 1083,60
4 CTX-3C 1045,60
+ Nhiệt độ cột: 40°C

+ Thời gian chạy mẫu: 27 phút/mẫu
+ Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút
+ Pha động:
 Kênh A: Nước cất và hỗn hợp dung dịch (5 mM
HCOONH4, 0,1% HCOOH) theo tỉ lệ 95:5 (v/v)
(475 mL:25 mL)
 Kênh B: MeOH
 Chương trình:
Thời gian (phút) 0 10 20
% MeOH 80 95 95
34
+ Pha tĩnh: Giữ nguyên các điều kiện khối phổ đã được kiện toàn
như đã trình bày ở trên, luận văn chỉ tiến hành khảo sát phân tích trên 02 pha
tĩnh khác nhau và lựa chọn pha tĩnh tối ưu nhất.
 Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm

kích cỡ hạt nhồi)
 Wakosil 3C18 HG (150 × 2 mm; 3,2 – 3,7 mm kích cỡ hạt

nhồi)
Theo quy trình của Yogi và cs. 2011 [30], pha tĩnh được sử dụng là
Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi), tuy
nhiên, do thiết bị LCMS được sử dụng trong quy trình của Yogi là cùng hãng
Agilent nên độ tương thích cao, đồng thời cột này cũng có giá thành cao, nên
để phù hợp với điều kiện thiết bị cũng như điều kiện kinh tế của Việt Nam,
luận văn sẽ thử nghiệm thêm hiệu quả phân tích trên cột Wakosil.
* Định lượng CTX trên thiết bị LC/MS-MS
Theo đặc thù của phương pháp sử dụng, đường chuẩn là 1 điểm, nên
luận văn này không định lượng theo phương pháp đường chuẩn mà định
lượng theo phương pháp so chuẩn, hàm lượng CTX được xác định dựa trên
diện tích peak và hàm lượng của mẫu so với chất chuẩn theo công thức:
Speak (mẫu) x wchuẩn

wmẫu =
Speak (chuẩn)
Trong đó: wmẫu : hàm lượng của mẫu (ng/mL)
wchuẩn: hàm lượng của chất chuẩn (ng/mL)
Speak (mẫu): diện tích peak của mẫu đo được trên sắc ký đồ (đvdt)
Speak (mẫu): diện tích peak của chất chuẩn (đvdt)
35
* Đánh giá độ đặc hiệu

Tiến hành phân tích mẫu chuẩn CTX-1B, mẫu cá có và không có độc tố
đã xử lý theo quy trình được xây dựng bằng các điều kiện LC/MS-MS đã thiết
lập. Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp bằng cách so sánh thời gian lưu
của đỉnh các độc tố thu được trên sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn, mẫu thử với thời
gian lưu các peak chuẩn trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, so sánh đáp ứng với đầu
dò MS/MS, với các mẫu cá có độc tố, sai số thời gian lưu nằm trong khoảng
cho phép theo quy định của phương pháp (Suzuki và cs., 2017).
Do nguồn chất chuẩn rất hiếm nên luận văn này chỉ khảo sát độ chính
xác của phương pháp bằng ảnh hưởng của nền mẫu trong ngày trên kết quả
định lượng độc tố trên các mẫu cá có độc tố và mẫu chuẩn, và không xác định
độ nhạy.
36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ CHİẾT RÚT VÀ TİNH SẠCH ĐỘC TỐ CTXS TỪ MỘT SỐ
BỘ PHẬN CỦA CHÌNH BİỂN (CƠ, GAN)
Kết quả thực nghiệm được tổng kết trong bảng 3.1. Ở điều kiện 1 và 2
cho thấy ngoài độc tố còn nhiều thành phần khác cũng chiết theo sang dịch
AcOH dẫn tới xuất hiện vẩn đục khi trộn đồng thể tích với ACN (tác nhân tủa
protein mạnh) hay bảo quản trong thời gian dài ở nhiệt độ thấp (nhiều khả
năng làm giảm độ tan biểu kiến trong Acetone của các chất được chiết cùng).
Việc xuất hiện vẩn đục ở điều kiện 1 và 2 có thể kết luận được là do các chất
chiết cùng sang Acetone gây ra vì dung dịch chuẩn độc tố vẫn trong ở các
điều kiện này. Như vậy, giai đoạn làm sạch dịch chiết trong điều kiện thích
hợp là cần thiết trước khi phân tích độc tố bằng LC/MS-MS.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện chiết rút đối với dịch chiết
Dung dịch
Mẫu Cơ 1 Cơ 2 Cơ 3 Gan 1 Gan 2 Gan 3 chuẩn 10
ng/g
Điều
Quan sát cảm quan
kiện
1 Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Trong
2 Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Trong
3 Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục -
10 Trong Trong Trong Vẩn đục Vẩn đục Vẩn đục -
37
11 Trong Trong Trong Trong Trong Trong -
Ghi chú: “-”: không thử

Nhận xét:
- Đánh giá hiệu quả của các phương pháp làm sạch mẫu thông qua đánh
giá cảm quan, quan sát độ trong, đục của dịchchiết mẫu.
- Kết quả đánh giá ở điều kiện 1 đến 6 cho thấy sau khi tạo tủa với
ACN vẫn còn những phần tạp chất. Điều này cho thấy ACN không loại được
tốt tạp chất có trong dịch chiết.
- Kết quả đánh giá ở điều kiện 7 đến 11 cho thấy khi xử lý dịch chiết
qua các cột chiết li pha rắn cho phép loại bỏ một cách hiệu quả các tạp tủa
được với ACN thông qua việc lưu giữ chọn lọc độc tố trên cột.
- Như vậy, thông qua đánh giá cảm quan về trạng thái của dịch chiết
AcOH khi chịu tác động của: Tác nhân tủa protein (ACN), chiết lỏng - lỏng,
chiết pha rắn - SPE. Có thể thấy sơ bộ, đối với 2 mẫu cơ, 2 cột chiết ly pha
rắn SPE Florisil InertSep FL-PR 500 mg, GL Science Inc.) và Florisil
(InertSep FL-PR 200 mg, GL Science Inc.) là giải pháp làm sạch dịch chiết
cho phép loại các thành phần chiết sang cùng hiệu quả hơn. Tuy nhiên, đối
với mẫu gan, cần phải thực hiện tiếp 1 công đoạn làm sạch bằng cột chiết pha
rắn PSA (InertSep PSA, 200 mg, GL Sciences Inc.). Vì vậy, đây là 02 phương
pháp được lựa chọn tối ưu hóa thêm để xây dựng điều kiện làm sạch dịch
chiết AcOH đối với mẫu cơ và gan cá Chình.
3.2. THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ CTXS TRONG CƠ, GAN,
CHÌNH BİỂN
Trong thử nghiệm này, trước khi phân tích bằng hệ LC/MS-MS, các mẫu
cơ cá Chình được xử lý qua 02 cột SPE Florisil (InertSep FL-PR 500 mg, GL
Science Inc.) và Florisil (InertSep FL-PR 200 mg, GL Science Inc.); mẫu gan
được xử lý qua 03 cột SPE lần lượt là SPE Florisil (InertSep FL-PR 500 mg,
LG Science Inc.) Florisil (InertSep FL-PR 200 mg, LG Science Inc.), và PSA
38
(InertSep PSA, 200 mg, GL Sciences Inc.), so sánh với cá mẫu cơ/gan từ chất
chiết thô không xử lý trên cột SPE.
Kết quả, ở các mẫu qua xử lý SPE, có sự xuất hiện của đỉnh có cùng thời
gian lưu với độc tố CTX-1B chuẩn (Hình 3.2, 3.3), trong khi đối với dịch thô
chưa qua xử lý SPE, không có sự xuất hiện các đỉnh tương ứng (số liệu không
trình bày trong báo cáo).
Hình 3.1. Sắc ký đồ CTX-1B chuẩn
Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu cơ có cùng thời gian lưu so với mẫu chuẩn
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu gan có cùng thời gian lưu so với mẫu chuẩn
39
Điều kiện phân tích độc tố bằng LC/MS-MS

Phân tích được thực hiện trên hệ phổ khối ba tứ cực LCMS Shimadzu
 Điều kiện sắc ký sử dụng 02 cột và so sánh độ đặc hiệu:

- Cột:
+ Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ
hạt nhồi)
+ Wakosil 3C18 HG (150 × 2 mm; 3,2 – 3,7 mm kích cỡ hạt
nhồi)
- Pha động:
+ Kênh A: Nước cất và hỗn hợp dung dịch (5 mM HCOONH4,
0,1% HCOOH) theo tỉ lệ 95:5 (v/v) (475 mL:25 mL)
+ Kênh B: MeOH
+ Chương trình:
% MeOH 80 95 95
- Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút

- Thể tích mẫu tiêm: 10 µL.
- Nhiệt độ cột phân tích : 40⁰C
 Điều kiện detector MS/MS: Tương tự như điều kiện detector MS/MS
sử dụng đã được phòng thí nghiệm hiệu chỉnh, tối ưu hoá.
Độ đặc hiệu
Phương pháp phân tích độc tố được đảm bảo độ đặc hiệu nhờ so sánh
thời gian lưu của các peak xuất hiện trên sắc ký đồ mẫu thử với các peak
chuẩn tương ứng trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, theo dõi sự xuất hiện ion sơ cấp
[M+H]+ (m/z 1111,6 với CTX-1B).
40
Hình 3.4. Sắc ký đồ một số mẫu dương tính khi phân tích CTXs
bằng LC/MS-MS trên pha tĩnh Agilent.
(A: C026; B: C029; C: C034; D: G035; E: G036)
41
Bảng 3.2. Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích
với pha tĩnh là Agilent
Mẫu Thời gian lưu (phút)
CTX-1B 10,675
G037 10,752
G036 10,705
G035 10,975
G031 10,817
G030 10,831
G028 10,834
G027 10,794
C034 10,646
C030 10,717
C029 10,687
C027 10,631
Trung bình (TB) 10,755 ± 0,095
RSD (%) 0,88%
42
Hình 3.5. Sắc ký đồ một số mẫu dương tính khi phân tích CTXs
bằng LC/MS-MS trên pha tĩnh Wakosil.
(A: G028; B: G027; C: C026; D: C027; E: G030)
43
Bảng 3.3. Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích
với pha tĩnh là Wakosil
Mẫu Thời gian lưu (phút)
CTX-1B 13,899
G035 15,602
G030 13,760
G028 13,811
G027 13,913
C034 15,340
C030 14,784
C027 14,662
C026 14,124
Trung bình (TB) 14,443 ± 0,655
RSD (%) 6%
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu C034 khi phân tích CTXs trên 02 pha tĩnh
(A: pha tĩnh Agilent; B: pha tĩnh Wakosil)
44
Nhận xét:
- Kết quả trình bày trong bảng 3.2, sử dụng pha tĩnh Agilent Poroshell
120 EC-C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) cho thấy mẫu chuẩn và
thử có thời gian lưu giống nhau, giá trị tR là 10,755 ± 0,095 phút.
- Kết quả trình bày trong bảng 3.3, sử dụng pha tĩnh Wakosil 3C18 HG
(150 × 2 mm; 3,2 - 3,7 mm kích cỡ hạt nhồi) cho thấy thời gian lưu có độ lệch
chuẩn là 6%.
- Ngoài ra, khi so sánh sắc ký đồ cùng một mẫu trên cả 02 pha tĩnh
Agilent và Wakosil, ngoài sự khác biệt về thời gian lưu thì độ nhọn và độ gọn
của chân peak trên sắc ký đồ pha tĩnh Agilent tốt hơn.
- Vì vậy, pha tĩnh Agilent có độ đặc hiệu cao hơn đối với phân tích
CTX-1B do có độ chính xác hơn về thời gian lưu so với pha tĩnh Wakosil.
Hình 3.7. Đánh giá độ đặc hiệu trên cột Agilent (A: sắc ký đồ mẫu cá chứa
độc tố; B: sắc ký đồ Acetone; C: Sắc ký đồ chuẩn CTX-1B)
Đánh giá trên mẫu trắng: Acetone và dịch chiết của các mẫu cá không
phát hiện có độc tố đều không xuất hiện đỉnh tại cùng thời gian lưu và chế độ
MRM như của chất chuẩn CTX-1B (Số liệu không trình bày trong báo cáo).
Vì thế phương pháp cho phép phân tích các độc tố này trong cá mà không bị
ảnh hưởng bởi dung môi chiết mẫu (Acetone) và nền cá.
Như vậy, về độ đặc hiệu, phương pháp đã xây dựng đảm bảo độ đặc
hiệu để phát hiện định tính và định lượng CTX-1B trong cơ cá.
45
Kiểm tra tính tương thích hệ thống

Để đảm bảo độ thích hợp của hệ thống LC/MS-MS trong các điều kiện
của phương pháp đã xây dựng khi phân tích định tính và định lượng độc tố
CTX-1B dung dịch chuẩn 10 ng/mL của độc tố này được phân tích lặp lại 6
lần và đánh giá các tiêu chí sau: độ lặp lại của thời gian lưu; độ lặp lại của
diện tích pic ion thứ cấp m/z 1133,6; tỷ lệ đáp ứng pic theo 2 ion thứ cấp m/z
1133,6 và 1117,6.
Bảng 3.4. Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Agilent Poroshell 120 EC-
C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi)
Chỉ tiêu đánh giá (n = 6) CTX-1B

10,858 ± 0,132
Thời gian lưu (phút)
RSD: 1,22 %
Diện tích pic (counts) 71500 ± 400
ion m/z 1133,6 (ion sơ cấp) RSD: 0,6 %
Tỷ lệ đáp ứng giữa ion m/z 9,0 ± 0,1
mẹ và ion m/z thứ cấp 1 (%) RSD: 1,4 %
Nhận xét:
Kết quả trình bày trong bảng 3.4 cho thấy, với cả 6 lần lặp lại, thời
gian lưu (RSD đều nhỏ hơn 10%), và diện tích peak và diện tích peak theo
ion thứ cấp m/z 1117,6 dùng cho định lượng (RSD đều nhỏ hơn 2%) ổn định
sau 6 lần tiêm lặp lại, đồng thời tỷ lệ đáp ứng giữa 2 ion thứ cấp m/z 1133,6
và 1117,6 dao động cao nhất chỉ 1,4 % so với giá trị trung bình. Như vậy,
các điều kiện LC/MS-MS sử dụng với cột Agilent Poroshell 120 EC-C18
(100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) thích hợp để phân tích định tính,
định lượng độc tố trong cá chình.
46
3.3. QUY TRÌNH THỰC NGHİỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ CTXS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS
Trên cơ sở các số liệu thu nhận được trong quá trình thực nghiệm, quy
trình được đề xuất cho tách chiết và làm sạch độc tố CTXs từ mô cá Chình
được mô tả trong sơ đồ sau:
Mẫu 5g (Cơ/gan cá chình)
+ 15 mL Acetone (để qua đêm)

Ly tâm
Hỗn hợp Acetone, CTXs và tạp chất
Cô quay đuổi Acetone

+ 4 mL Diethyl ether
Dung dịch phân thành 2 lớp
→ Diethyl ether (lớp trên)

Cô quay đuổi Diethyl ether
+ 1 mL MeOH-DW (9:1, v/v)
+ 2 mL Hexan
Dung dịch phân thành 2 lớp
→ Lấy lớp dưới (MeOH-DW)

Cô quay đuổi MeOH-DW
+ 2 mL EtOAc – MeOH (9:1, v/v)
Cho qua cột InertSep FL-PR, 500 mg
Dịch
Cô quay chân không

+ 3 mL ACN
Cho qua cột InertSep FL-PR, 200 mg
47
Dịch
+ 3 mL ACN
Cho qua cột InertSep PSA, 200 mg*
Dịch trong
Cặn
+ 2 μL MeOH
LC/MS-MS
(*) Nếu mẫu là cơ cá thì không cần cho qua cột PSA.
- Phân tích LC/MS-MS
+ Ion sơ cấp lựa chọn là [M+Na]+ của CTX-1B có m/z 1133,6.
+ Điều kiện sắc ký: ion spray voltage (IS) là 5500V và nhiệt độ
buồng ion IS là 500°C (TEM). Nguồn năng lượng ion GS1 và GS2 lần lượt là
80 và 30, giá trị tối ưu của DP (thể tách chùm) là 400, năng lượng bắn phá ion
sơ cấp CE là 12V để đáp ứng cường độ peak tốt nhất trên đầu dò khối phổ
MS.
+ Chế độ chạy: Q3 SIM
Event Tên chất m/z
1 CTX-1B 1133.60
2 54 deoxy-CTX-1B 1117.60
3 CTX-4A/4B 1083.60
4 CTX-3C 1045.60
48
+ Nhiệt độ cột: 40°C

+ Thời gian chạy mẫu: 27 phút/mẫu
+ Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút
+ Pha tĩnh: Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1 mm; 1,9
mm kích cỡ hạt nhồi)
+ Pha động:
 Kênh A: Nước cất và hỗn hợp dung dịch (5 mM

HCOONH4, 0,1% HCOOH) theo tỉ lệ 95:5 (v/v)
(475 mL:25 mL)
 Kênh B: MeOH
 Chương trình:
Thời gian (phút) 0 7 17 27
% MeOH 80 80 95 0
3.4. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM (ĐỐI
CHIẾU VỚI KẾT QUẢ KIỂM CHỨNG CỦA NHẬT BẢN)
Trên cơ sở quy trình thực nghiệm xây dựng được, luận văn đã phân tích
độc tố CTXs trong các mẫu Chình biển thu thập được, và đối chiếu với kết
quả phân tích tại PTN Viện Nghiên cứu Thủy Sản của Nhật Bản. Kết quả thu
được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hàm lượng CTXs trong các mẫu Chình biển
phân tích tại PTN Việt Nam và PTN Nhật Bản
Hàm lượng (ng/mL) Hàm lượng (ng/mL)

Mẫu Mẫu
Việt Nam Nhật Bản Việt Nam Nhật Bản
C026 0,58 0,55 G026 0 0

49
C027 0,28 0,22 G027 12,21 10,15
C028 0,36 0,33 G028 20,89 19,98
C029 0,79 0,77 G029 2,54 1,80
C030 0,32 0,29 G030 189,41 80,10
C031 0 0 G031 5,24 3,12
C032 0 0 G032 0 0
C033 0 0 G033 0 0
C034 0,95 0,89 G034 0 0
C035 0 0 G035 2,94 2,20
C036 0 0 G036 0,77 0
C037 0 0 G037 4,70 3,98
C038 0 0 G038 0 0
C039 0 0 G039 0 0
Những mẫu có hàm lượng bằng 0 (ng/mL) là do không có peak trên sắc
ký đồ.
Để đánh giá giữa hai dãy số liệu từ thực nghiệm phân tích CTX-1B
trong mẫu Cá chình tại Việt Nam và Nhật Bản có sự khác biệt về trung bình
tổng thể mang ý nghĩa thống kê hay không, tiến hành xử lý thống kê bằng
phần mềm Excel với phương pháp thống kê t-test: là phương pháp kiểm định
giả thuyết về sự khác biệt giữa hai trung bình tổng thể khi hai tổng thể độc lập
và số lượng các quan sát trong mẫu là nhỏ.
- Trước tiên cần so sánh phương sai của hai dãy số liệu của Việt Nam
và Nhật Bản, sử dụng phương pháp kiểm định giả thuyết với giả thuyết H0 là
hai dãy số có phuơng sai bằng nhau và H1 là hai dãy số có phương sai không
bằng nhau. Kết quả kiểm định bằng chức năng F-test two samples for
variances (bảng 3.6, 3.7) trong phần mềm Excel cho thấy:
50
Bảng 3.6. Kết quả so sánh phương sai các mẫu cơ

Việt Nam Nhật Bản

Trung bình 0.234286 0.217857
Phương sai 0.108073 0.097264
Cỡ mẫu 14 14
Df 13 13
F 1.111122
P(F<=f) one-tail 0.426104
F Critical one-tail 2.576927
Bảng 3.7. Kết quả so sánh phương sai các mẫu gan

Trung bình 17.05 8.666429
Phương sai 2496.694 453.8761
Cỡ mẫu 14 14
df 13 13
F 5.500827
P(F<=f) one-tail 0.002115
F Critical one-tail 2.576927
+ Đối với mẫu cơ (bảng 3.6), giá trị F thực nghiệm = 1,11 nhỏ hơn giá trị F
= 2,57, theo tính toán thống kê thì chấp nhận giả thuyết H0, tức là
lý thuyết
phương sai của hai dãy số bằng nhau.

+ Đối với mẫu gan (bảng 3.7), giá trị F thực nghiệm = 5,50 lớn hơn giá trị F
lý thuyết = 2,58, theo tính toán thống kê thì chấp nhận giả thuyết H1, tức là
phương sai của hai dãy số khác nhau.

51
- Tiếp tục kiểm định giả thuyết hai dãy số liệu có khác biệt về trung
bình tổng thể hay không, sử dụng chức năng thống kê T-test two sample
asuming equal variance (bảng 3.8) với phương sai hai tổng thể không khác
nhau và chức năng thống kê T-test two sample asuming unequal variance
(bảng 3.9) với phương sai hai tổng thể khác nhau trong phần mềm Excel, với
giả thuyết H0 là hai dãy số có trung bình tổng thể không khác biệt và H1 là hai
dãy số có trung bình tổng thể khác biệt.
+ Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu cơ cho thấy giá trị kiểm
định tthực nghiệm = 0,14 nhỏ hơn giá trị tlý thuyết = 2,06, như vậy chấp nhận giả
thuyết H0, không có sự khác biệt có ý nghĩa về trung bình của hai dãy số.
Bảng 3.8. Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu cơ

Trung bình 0.234285714 0.217857143
Phương sai 0.108072527 0.097264286
Cỡ mẫu 14 14
Pooled Variance 0.102668407
Hypothesized Mean
Difference 0
Df 26
t Stat 0.135653314
P(T<=t) one-tail 0.446570089
t Critical one-tail 1.70561792
P(T<=t) two-tail 0.893140178
t Critical two-tail 2.055529439
+ Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu gan cho thấy giá trị kiểm
định tthực nghiệm = 0,58 nhỏ hơn giá trị tlý thuyết = 2,10, như vậy chấp nhận giả
thuyết H0, hay nói cách khác không có sự khác biệt có ý nghĩa về trung bình
của hai dãy số.
52
Bảng 3.9. Kết quả kiểm định sự khác biệt ở các mẫu gan

Mean 17.05 8.666429
Variance 2496.694 453.8761
Observations 14 14
Hypothesized Mean
Difference 0
Df 18
t Stat 0.577484
P(T<=t) one-tail 0.285383
t Critical one-tail 1.734064
P(T<=t) two-tail 0.570766
t Critical two-tail 2.100922
Như vậy, so sánh với quy trình phân tích độc tố CTXs trong mẫu cá
biển được áp dụng tại Nhật Bản (Yogi và cs., 2011, Suzuki và cs., 2017), quy
trình thực nghiệm được xây dựng tại Việt Nam có sự tương đồng khi phân
tích các mẫu tách chiết từ mô cơ Chình biển thu tại Việt Nam. Tuy nhiên, có
sự khác biệt trong trường hợp phân tích các mẫu gan tại Việt Nam và Nhật
Bản. Cụ thể, trong tổng số 14 mẫu gan, kết quả phân tích tại Nhật Bản cho kết
quả hàm lượng CTX -1B thấp hơn so với tại Việt Nam; đặc biệt, sự sai khác ở
01 mẫu G030 là 2,3 lần. Trong nghiên cứu của Suzuki và cs. (2017) hệ số thu
hồi của độc tố CTX-1B trong quy trình chiết tách và làm sạch đối với một số
mẫu xuất xứ tại Việt Nam là khá thấp (37 %). Ở các dịch chiết vẫn còn tạp
chất lipid (gan, ruột…), thường xảy ra hiện tượng nhiễu đường nền cao, và
hiện tượng các peak dính hoặc giãn rộng chân cùng với thời gian lưu của chất
trên pha tĩnh sẽ kéo dài hơn. Trong trường hợp của nghiên cứu này, có thể
trong dịch chiết vẫn còn một hoặc một số tạp chất có khối lượng phân tử rất
gần với CTX-1B dẫn đến kết quả cao hơn.
53
Như vậy, có thể nói, quá trình loại tạp chất nhóm lipid hiện nay chưa
thực sự hiệu quả đối với các mẫu gan cá Chình. Một số công đoạn nhằm cải
thiện độ sạch của dịch chiết trong trường hợp mẫu chứa nhiều tạp chất nhóm
lipid cần được tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện.
54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. Kết luận
Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đối với 28 mẫu (14 mẫu cơ và 14
mẫu gan) từ 14 cá thể Cá chình thu mua tại một số vùng biển miền Trung Việt
Nam bao gồm Lý Sơn (Quảng Ngãi), Trường Sa (Khánh Hoà), luận văn đã
thu được các kết quả sau:
1/ Độc tố CTXs, sau khi chiết rút bằng dung môi Acetone, được làm
sạch bằng phương pháp chiết ly pha rắn qua 02 cột Florisil (InertSep FL-PR
500 mg, GL Science Inc.) và Florisil (InertSep FL-PR 200 mg, GL Science
Inc.) đối với mẫu cơ; qua 03 cột Florisil (InertSep FL-PR 500 mg, GL
Science Inc.), Florisil (InertSep FL-PR 200 mg, GL Science Inc.) và PSA
(InertSep PSA, 200 mg, GL Sciences Inc.) đối với mẫu gan.
2/ Đã thử nghiệm phân tích độc tố CTX-1B trong các dịch chiết từ mẫu
cá chình trên hệ thiết bị LCMS 8040 của Shimadzu theo quy trình của Oshiro
và cs. 2014; sử dụng 02 pha tĩnh là Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1
mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) và Wakosil 3C18 HG (150 × 2 mm; 3,2 - 3,7
mm kích cỡ hạt nhồi), và xác định pha tĩnh Agilent có độ đặc hiệu cao hơn
đối với phân tích CTX-1B do có độ chính xác hơn về thời gian lưu so với pha
tĩnh Wakosil.
3/ Đã xây dựng được quy trình thực nghiệm phân tích độc tố
Ciguatoxins (CTXs) từ một số loài Chình biển tại Việt Nam bao gồm xử lý
mẫu, tách chiết, tinh sạch độc tố và lựa chọn pha tĩnh tối ưu của phép phân
tích trên hệ LC/MS 8040 Shimadzu của phòng thí nghiệm trọng điểm về An
toàn thực phẩm và môi trường biển (khu vực miền Trung) tại Viện Hải dương
học. Cụ thể, các điều kiện phân tích LC/MS-MS như sau:
- Pha tĩnh: cột Agilent Poroshell 120 EC-C18.
- Pha động: hệ dung môi gồm 2 kênh
+ Kênh A: Nước cất và hỗn hợp dung dịch (5 mM HCOONH4,
0,1% HCOOH) theo tỉ lệ 95:5 (v/v) (475 mL:25 mL)
55
+ Kênh B: MeOH
+ Chương trình chạy gradient tối ưu là:
% MeOH 80 95 95
4/ Đã đánh giá tính hiệu quả của quy trình thực nghiệm xây dựng được
trên cơ sở đối chiếu, so sánh kết quả phân tích độc tố CTX-1B trong 28 mẫu
Chình biển với kết quả kiểm chứng tại phòng thí nghiệm về độc tố biển, Viện
nghiên cứu Thuỷ sản Nhật Bản. Kết quả, áp quy trình thực nghiệm xây dựng
được tại Việt Nam, có thể phát hiện sự có mặt hàm lượng nhất định độc tố
CTX-1B trong Chình biển. Tuy nhiên, ở các mẫu có nhiều tạp chất nhóm
lipid, cần tiếp tục cải thiện công đoạn làm sạch để đảm bảo tính chính xác của
kết quả phân tích.
II. Kiến nghị
1/ Cần tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện một số công đoạn nhằm cải
thiện độ sạch của dịch chiết trong trường hợp mẫu chứa nhiều tạp chất nhóm
lipid, nhất là các mẫu gan, hoặc nội tạng cá.
2/ Tiếp tục nghiên cứu thêm quy trình phân tích đồng thời các CTXs
khác bằng hệ thống LC/MS-MS.
56
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Suzuki, T., Dao, V.H., Uesugi, A., Uchida, H., 2017, Analytical challenges
to ciguatoxins, Curr. Opin. Food Sci., 18, pp: 37 – 42.
2. Luis M. Botana, 2008, Seafood and Freshwater Toxins: Pharmacology,
Physiology and Detection, CRC Press-Taylor & Francis; Boca Raton, FL,
USA, pp. 479 – 500.
3. H. Ray Granade, 2012, Bad Bug Book - Handbook of Foodborne
Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins, FDA, pp. 194 – 199.
4. Faust, M.A., 1995, Observation of sand-dwelling toxic dinoflagellates
(Dynophyceae) from widely differing sites, including two new species, J.
Phycol, 31, pp. 996 – 1003.
5. Holmes, M.J., 1998, Gambierdiscus yasumotoi sp. Nov. (Dinophyceae), a
toxic benthic dinoflagellates from southeastern Asia, J. Phycol, 34, pp. 661 –
668.
6. Chinain, M., M.A. Faust, S. Pauillac, 1999, Morphology and molecular
analyses of three toxic species of Gambierdiscus (Dynophyceae): G.
pacificus, sp. nov., G. australes, sp. nov., and G. polynesiensis, sp. Nov., J.
Phycol, 35, pp. 1282 – 1296.
7. Richard J. Lewis, Michael J. Holmes, 1993, Origin and transfer of toxins
involved in ciguatera, Publisher: Elsevier.
8. Satake M, Ishibashi Y, Legrand A, Yasumoto T., 1997, Short
Communication: Isolation and structure of ciguatoxin-4A, a new ciguatoxin
precursor, from cultures of dinoflagellate Gambierdiscus toxicus and
parrotfish Scarus gibbus, Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, pp: 2103 – 2105.
9. Proctor WG, Yu FC., 1950, The dependence of a nuclear magnetic
resonance frequency upon chemical compound, Phys Rev, 77, 717.
10. Harris RK, Becker ED, Cabral de Menezes SM, et al., 2001, NMR
Nomenclature. Nuclear Spin Properties and Conventions for Chemical Shifts
(IUPAC Recommendations 2001), Pure Appl Chem, 73, pp: 1795 - 1818.
57
11. Harris RK, Becker ED, Cabral de Menezes SM, et al., 2008, Further
conventions for NMR shielding and chemical shifts (IUPAC recommendations
2008), Pure Appl Chem, 80, pp: 59 - 84.
12. Lewis RJ, Sellin M, Poli MA, Norton RS, MacLeod JK, Sheil MM. 1991,
Purification and characterization of ciguatoxins from moray eel (Lycodontis
javanicus, Muraenidae), Toxicon, 29, pp: 1115 – 1127.
13. Lewis R, Jones A., 1997, Characterization of ciguatoxins and ciguatoxin
congeners present in ciguateric fish by gradient reverse-phase high-
performance liquid chromatography/mass spectrometry, Toxicon, 35, pp: 159
– 168.
14. Lewis R, Norton R, Brereton I, Eccles C., 1993, Ciguatoxin-2 is a
diastereomer of ciguatoxin-3, Toxicon, 31, 637.
15. Satake M, Murata M, Yasumoto T., 1993, The structure of CTX3C, a
ciguatoxin congener isolated from cultured Gambierdiscus toxicus,
Tetrahedron Lett, 34, pp: 1975 – 1978.
16. Roeder K, Erler K, Kibler S, Tester P., 2009, Characteristic profiles of
Ciguatera toxins in different strains of Gambierdiscus spp, Toxicon, doi:
10.1016/j.toxicon.2009.007.039.
17. Satake M, Fukui M, Legrand A, Cruchet P, Yasumoto T., 1998, Isolation
and structures of new ciguatoxin analogs, 2, 3-dihydroxyCTX3C and 51-
hydroxyCTX3C, accumulated in tropical reef fish, Tetrahedron Lett, 39, pp:
1197 – 1198.
18. Yasumoto T, Igarashi T, Legrand A, Cruchet P, Chinain M, Fujita T,
Naokis H., 2000, Structural elucidation of ciguatoxin congeners by fast-atom
bombardment tandem mass spectroscopy, J. Am. Chem. Soc. 122, pp: 4988–
4989.
19. Vernoux J, Lewis R., 1997, Isolation and characterization of Caribbean
ciguatoxins from the horse-eye jack (Caranx latus), Toxicon, 35, pp: 889 –
900.
58
20. Pottier I, Hamilton B, Jones A, Lewis R, Vernoux J., 2003, Identification

of slow and fast-acting toxins in a highly ciguatoxic barracuda (Sphyraena
barracuda) by HPLC/MS and radiolabeled ligand binding, Toxicon, 42, pp:
663 – 672.
21. Lewis R, Vernoux J, Breretons I., 1998, Structure of Caribbean
ciguatoxin isolated from Caranx latus, J. Am. Chem. Soc.,120, pp: 5914 –
5920.
22. Hamilton B, Hurbungs M, Vernoux J-P, Jones A, Lewis RJ., 2002,
Isolation and characterization of Indian Ocean ciguatoxin, Toxicon, 40, pp:
685 – 693.
23. Hamilton B, Hurbungs M, Jones A, Lewis RJ., 2002, Multiple ciguatoxins
present in Indian Ocean reef fish, Toxicon, 40, pp: 1347 – 1353.
24. Lewis R, Holmes M, Alewood P, Jones A., 1994, Ionspray mass
spectrometry of ciguatoxin-1, maitotoxin-2 and-3, and related marine
polyether toxins, Nat. Toxins, 2, pp: 56 – 63.
25. Pottier I, Vernoux J, Jones A, Lewis R., 2002, Characterization of
multiple Caribbean ciguatoxins and congeners in individual specimens of
horse-eye jack (Caranx latus) by high - performance liquid
chromatography/mass spectrometry, Toxicon, 40: 929 – 939.
26. Hamilton B, Hurbungs M, Vernoux J-P, Jones A, Lewis RJ., 2002,
Isolation and characterization of Indian Ocean ciguatoxin, Toxicon, 40: 685
– 693.
27. Lewis R, Jones A, Vernouxs J., 1999, HPLC/tandem electrospray mass
spectrometry for the determination of Sub-ppb levels of Pacific and
Caribbean ciguatoxins in crude extracts of fish, Anal. Chem., 71: 247 – 250.
28. Lewis RJ, Yang AJ, Jones A., 2009, Rapid extraction combined with LC-
tandem mass spectrometry (CREM-LC/MS/MS) for the determination of
ciguatoxins in ciguateric fish flesh, Toxicon, 54: 62 – 66.
59
29. Stewart I, Eaglesham G, Poole S, Graham G, Paulo C, Wickramasinghe

W, Sadler R, Shaw G., 2010, Establishing a public health analytical service
based upon chemical methods for detecting and quantifying Pacific
ciguatoxin in fish samples, Toxicon, 56: 804 – 812.
30. Yogi, K., Oshiro, N., Inafuku, Y., Hirama, M., Yasumoto, T., 2011,
Detailed LC-MS/MS analysis of ciguatoxins revealing distinct regional and
species characteristics in fish and causative alga from the Pacific, Anal.
Chem, 83, pp: 8886 – 8891.
31. Bagnis R, Kuberski T, Laugier S., 1979, Clinical Observations on 3,009
Cases of Ciguatera (Fish Poisoning) in the South Pacific, Am. J. Trop. Med.
Hyg, 28: 1067–1073.
32. Lewis RJ., 2000, Ciguatera management, SPC Live Reef Fish Inf. Bull, 7:
11–13.
33. Laurent D, Joannot P, Amade P, Maesse P, Colmet-Daage B., 1992,
Knowledge on ciguatera in Noumea (New-Caledonia). Fourth International
Conference on Ciguatera Fish Poisoning, Tahiti, French Polynesia, pp. 520.
34. Wong C-K, Hung P, Lee KLH, Kam K-M., 2005, Study of an outbreak of
ciguatera fish poisoning in Hong Kong, Toxicon, 46: 563 – 571.
35. Faust M., 1995, Observation of sand-dwelling toxic dinoflagellates
(Dinophyceae) from widely differing sites, including two new species, J.
Phycol, 31: 996 – 1003.

khối phổ MS PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

khối phổ MS PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Lời cam đoan

Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019

Nguyễn Phương Nga

Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019

Nguyễn Phương Nga

Hình 1.1. Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G. toxicus…………...……….10

3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1. Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G. toxicus [2]

Hình 1.2. Cấu trúc Pacific (P-CTX-1)

Hình 1.3. Mô phỏng chuỗi thức ăn biển [7]

1.3.1. Nguyên lý hoạt động

Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS

- Chế độ quét (SCAN)

1.3.2. Sự kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ

Tên quy Ion phân tử Nguồn tự Nguồn tài

P-CTX-1 CTX-1B 1111,6 Cá ăn thịt [12], [13]

CTX-2A2; 52- [12], [13],

CTX-3C 1023,6 G. toxicus [15], [16]

G. toxicus /cá [8], [16],

I-CTX-1 1141,6 Cá ăn thịt [22], [23]

I-CTX-2 1141,6 Cá ăn thịt [22], [23]

I-CTX-3 1157,6 Cá ăn thịt [22], [23]

I-CTX-4 1157,6 Cá ăn thịt [22], [23]

Hình 1.5. Khối phổ và thời gian lưu

LOQ (µg/kg) 4,65 3,55 5,12

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Kí hiệu mẫu Kí hiệu mẫu

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

- Hexan (Wako, code: 085-00416, độ tinh khiết: 96%)

b) Phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu (clean-up)

2.2.3. Xác định độc tố CTXs bằng phương pháp LC/MS-MS

- Sử dụng chế độ chạy SIM (Selected Ion Monitoring): Trong chế độ

Event Tên chất m/z

+ Nhiệt độ cột: 40°C

Thời gian (phút) 0 10 20

 Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm

 Wakosil 3C18 HG (150 × 2 mm; 3,2 – 3,7 mm kích cỡ hạt

Speak (mẫu) x wchuẩn

* Đánh giá độ đặc hiệu

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

11 Trong Trong Trong Trong Trong Trong -

Ghi chú: “-”: không thử

Hình 3.1. Sắc ký đồ CTX-1B chuẩn

Điều kiện phân tích độc tố bằng LC/MS-MS

 Điều kiện sắc ký sử dụng 02 cột và so sánh độ đặc hiệu:

Thời gian (phút) 0 10 20

- Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút

Kiểm tra tính tương thích hệ thống

Chỉ tiêu đánh giá (n = 6) CTX-1B

Mẫu 5g (Cơ/gan cá chình)

+ 15 mL Acetone (để qua đêm)

Hỗn hợp Acetone, CTXs và tạp chất

Cô quay đuổi Acetone

Dung dịch phân thành 2 lớp

→ Diethyl ether (lớp trên)

Dung dịch phân thành 2 lớp

→ Lấy lớp dưới (MeOH-DW)

Cô quay chân không

Event Tên chất m/z

+ Nhiệt độ cột: 40°C

 Kênh A: Nước cất và hỗn hợp dung dịch (5 mM