Pogljavlje 4 – Osnovne metode molekularne bilo

Započelo otkrićem restrikcijskih endonukleaza – prepoznaju točno određeni slijed nukleotida do 4do
8 baza u dvolančanoj DNA i kidaju oba lanca dvostruke uzvojnice
Kidanje neke molekule DNA restrikcijskim endonukleazama daje fragmene točne određene veličine.
Elektroforeza je razvajanje molekula uz pomoć struje – molekule se kreću prema polu koji je
suprotnog naboja od molekule. DNA ima neg. Naboj zbog fosfatne skupine – putuju prema poz.
Elektrodi.

Što je molekula manja, lakše se provlači kroz pore gela. Molekule unosimo u male jažice.

Molekularno kloniranje – želimo analizirati neki fragment DNA. Da bi imali dovoljno materijala za
analizu, moramo ga klonirati. Unosimo fragment DNA u odgovarajući vektor (molekula DNA koja se
može samostalno replicirati u domaćinu). Fragment humane DNA spajamo s alfa vektorom te iz
spajamo a zatim dobijemo rek. Molekulu koju nosimo u E. coli. Replikaciojom DNA nastaju bakt. Koji
sadržavaju proizvedenu rek. DNA

Fragmente DNA je moguće povezati djelovanjem enzima DNA-ligaze. Imamo fragment DNA koji se
ugrađuje u .... slika

Djelovanjem enzima reverzne transkriptaze moguće je mRNA prevesti u cDNA - a na tu cDNa

stavljamo oligonukleotidne spojnice (odabiremo ih s obzirom na enzim jer su ti sljedovi koji
prepoznaje enzim). cDNA ugrađujemo u vektor

Vektori izvedeni iz bakteriofaga lambda često se koriste za molekula DNA

Plazmidi su male kružne molekule DNA koje se mogu neovisno umnažati u bakterrijama.
.......

..

Sekvenciranje DNA – Sangerova metoda – određivanje slijeda nukleotida

Kako to radimo? Da bi odredili slijed Dna potrebna nam je početnica ili klica ili primer ili proba. On će
odrediti odakle kreće, skojeg dijela genoma kreće sekvencioniranje. Sinteza kompl je
sekvecneiocniranje. Moramo imati DNA koju sekvencioniramo – neki predložak na kojem se sint.
Kompl lanac. Da bi mogli stvarati novi slijed DNA moramo imati gradevne elemente –
deoksinukleotide. Moramo i detektirati što se ugradilo u slijed.Da bismo to mogli očitat moramo
imati način za detekciju ugrađene baze, tj. nukleotida. Imamo 4 reakcijske smjese – razlikuje se samo
dideoksinukleotid (deoksinukleotid bez OH skupinu na 3 crtano mjestu). Ako nema Oh skupine tu
staje sinteza lanca – u epruveti ...

Kako možemo proizvesti protein koji nas zanima? Korištenjem ekspresijskog vekotra – mogućuju
proizvodnju euk. Ekspresijski vektor mora imati .........

Kvaščev dvohibridni sustav – služi za ispitivanje jesu li dva humana proteina u međusobnoj interakciji.

Osnovni principi kloniranja

Detekcija nukleinskih kiselina i proteina koristi se za: kartiranje gena na kromosomima, analiza
izražaja gena i određivanje položaja proteina unotar staničnih organela
Revolucionarna tehnika – PCR –tehnika lančane reakcije polimeraze

Prvo zagrijavamo DNA na 95 stupnjeva – uzrokuje razdvajanje lanca molekule DNA. Zatim do........

Moeklulu DNA određenog slijeda nuklewotida moguće je otkriti hibridizacijom sa spec. sondama