細胞色素 P450（CYP450）是一個通用的酶家族，可催化各種重要的氧化反應，

包括羥基化，環氧化，硫氧化，CC 鍵斷裂和去飽和反應.1-3 CYP450 機器的誘

人特性是催化循環 1。 1 圖 1 中所示為烷烴（RH）羥基化，其中所有步驟均
自動協調。因此，CYP450 是一種生物納米機器，可以按照嚴格編排的順序運行。
CYP450 的活性位點位於蛋白質的疏水核心中，並通過底物和 O2 分子進入，產物
排出和水分子流經的進入通道 4 與酶的表面連接。還有一些戰略性水閘，由血
紅素及其鹽橋伴侶的丙酸酯側鏈操作，可及時入水。5 因此，P450 納米機器是
一個開放系統，可通過通道與外部分子世界進行通訊。干預催化循環的門（圖
1）。
當底物（RH）進入活性位點並與靜止狀態（I）相互作用時，開始循環。這將水
從口袋 2c 中帶走，並使 I 的水配體脫離，從而形成高紡絲的 FeIII-血紅素複合
物（II）。 II 具有更高的氧化還原電勢，6 可以使電子從還原伴侶細胞色素
P450 還原酶（CPR）轉移到 II，然後還原為亞鐵 FeII 複合物（III）。 III 是
一種很好的 O2 粘合劑，可迅速吸收 O2 分子並轉化為氧化亞鐵絡合物（IV）。
後者是一種良好的電子受體，通過 CPR 再次還原並轉化為過氧配合物 V（另請參
見《支持信息》（SI）中的參考文獻）。
靠近該連接點的某個地方，離開活性囊的水分子通過水閘重新進入，並形成使
V 質子化為 VI 的水通道。後者被稱為化合物 0（Cpd 0），仍被認為是推定的氧
化劑。7 帶負電荷的 Cpd 0 是良好的路易斯鹼。因此，它接受額外的質子，釋放
水分子，並形成化合物 I（Cpd I，VII）。 CPD I 是最終的氧化劑。它從 RH 中
提取一個氫原子，形成中間體 VIII，該中間體通過 R·反彈生成醇（R-OH）。然
後，R-OH 離開囊袋，被水分子取代；酶恢復到其靜止狀態並準備再次周轉。此
事件序列由許多 CYP450 共享。
雖然可以理解圖 1 中的每個步驟 1-3、6-8，但需要概述導致所有步驟依次編排
的因素。因此，重要的是要理解支配這些納米機器看似自動化的原理，如圖 1
中的問題所示。該帳戶解決了這些問題，並在結合分子動力學的最新研究的基
礎上概述了支配原理（ MD）和一些 CYP450 的量子力學/分子力學（QM / MM）
計算。

圖 2a 使用 CYP450BM3 來舉例說明多方面的計算問題。中心的物種是活性血紅素
物種和脂肪酸底物。該作用核心被戰略性殘基包圍：在左上方，我們發現了一
個酸-醇對（Glu267-Thr268），該對組織了一條轉移必要質子的水鏈（圖
1）。在右上方，Gln73 是通過底物的羧酸酯頭結合底物的三個殘基之一。在
Gln73 的下方，殘基 Phe87 使脂肪酸鏈捲曲，從而使其 ω-1ω-3 位置暴露於氧
化。在底部，Prop7- Arg398 相互作用（類似於其他 CYP450）可能是將水澆入
活性位點的原因。最後，在半胱氨酸配體（Cys400）附近，存在帶正電的殘基
（例如，Lys391），還原酶可以將其附著並將電子轉移到血紅素上。
一個人如何處理所有這些功能？這是該方法的簡要概述（有關詳細信息，請參
閱 SI）：
與底物結合，氧氣進入，還原酶附著和門控有關的功能由 MD 模擬處理。起始結
構取自蛋白質數據庫（PDB），並通過準備步驟進行處理，包括酶的質子化和溶
劑化，如圖 2b 所示，以至最終一個 30000-40000 個原子。水通道的形成和重組
通常需要 100 ns。底物結合需要 350-400 ns，而蛋白質-蛋白質相互作用（例
如還原酶-CYP450）需要 1000-1500 ns（1-1.5μs）。使用多軌跡方法執行較
長的仿真，其中每 200 ns 使用隨機速度選項重新啟動仿真。結論來自四個不同
的長期模擬。
為了處理週期的化學事件，我們從 MD 軌跡中選擇 CYP450 構象，即所謂的“快
照”。隨後，我們將這些快照進行 QM / MM 計算（另請參閱 SI 參考），該計算
將計算活性物種及其化學事件，並在其天然蛋白質環境中提供物種的幾何形狀，
電子結構，機理和能量。
我們從底物進入開始，這會啟動圖 1 中的催化循環。我們的大多數示例都使用
CYP450BM3，這是一種細菌酶，它通過肽鏈與還原酶結構域相連，如圖 3 所示。
其他一些 CYP450 是也用過。

YP450BM3 中的 CPR 通過肽鏈連接到 CYP450 域（見圖 3），是由三個還原域組成

的複雜實體，如圖 6a 所示。最終的還原單元是黃素單核苷酸（FMN）域，其中
還原劑為半醌狀態（SQ-），如圖 6b 所示。
上述水含量分析表明，底物進入將六配位的低自旋 FeIII 轉變為五配位的高自
旋狀態（分別在圖 1 中為 I 和 II）。在沒有第六配體的情況下，高自旋 FeIII
絡合物具有更高的氧化還原電勢，6 有利於電子從 SQ-接受。因此，儘管鏈接的
CPR 可能會頻繁接近血紅素，但僅當氧化還原熱力學允許它並且 FMN-血紅素距
離很短時，ET 才會發生。下面我們顯示了底物如何為 ET 事件啟用這些必要條件。
3.1。底物結合誘導的 ET
如圖 7 所示，ET 步驟面臨最初的主要困難。血紅素結構域-FMN 結構域複合物的
晶體結構表明，這些結構域被 17.4-18.4Å.9b，12 隔開。在生理相關條件下，
在這些距離處的 ET 速率比觀察到的速率常數明顯更慢（參見參考文獻
S64） ），13,14 例如，對於 CYP450BM3.14，kET = 100-300 s-1
因此，我們使用了 CYP450BM3 和 CPR 的 FMN 部分，並進行了 6 個不同的 MD 模擬。
9aSF 狀態的 MD 模擬（圖 8a）表明，受體（血紅素）和供體（FMN）保持較大的
距離，> 18.4。 Å，在整個 MD 模擬過程中。因此，在沒有襯底的情況下，ET 工
藝效率低下。但是，當將基板送入血紅素-FMN 系統時，距離縮短到 12Å（圖
8b）；使用 FMN-時，進一步縮短了時間。隨後的 QM / MM 優化（圖 8c）使距離
降至 8.8Å。 QM / MM 計算 9a 進一步揭示了一個弱吸熱 ET 事件（4.6 kcal /
mol）。
為了評估這些構象變化的作用，我們使用了 Marcus-Sutin 方程 15 計算了 SF 狀
態（其中供體-受體距離為〜18Å）和 SB 狀態（其中供體-受體距離為〜）的 ET
率。 8.8Å）。
我們在 SB 狀態下計算出的 kET 在以下範圍內
107-291 s-1，適合帶有結合底物的野生型（WT）酶的實驗 ET 速率。相對於觀
察到的速率，在 SF 狀態下計算出的 kET 降低了 5-6 個數量級，並且太低了。

因此，很明顯，底物結合會引起較大的構象 11 和其他變化，這些變化會導致
FMN-巢狀靠近血紅素並誘導成功的 ET 過程。首先嘗試理解為什麼在 SF 狀態下
FMN-血紅素距離這麼長是有啟發性的，這由圖 3 中三個螺旋的編排確定：C 螺旋
（綠色），它位於血紅素域;屬於 FMN 域的 α1-螺旋（橙棕色）；和 I-螺旋
（藍色），它在血紅素域中。底物進入血紅素和 I-螺旋之間，並增強了 C-螺旋
和 I-螺旋之間的相互作用，這導致 FMN 向血紅素移動了 10，並將電子傳遞到
FeIII 中心。
從圖 9 和圖 10 可以了解這種編排的一些細節。圖 9 顯示了 SF 狀態在初始和最終
MD 階段的 C 和 α1 方向。最初（圖 9a），由於 Glu494（在 α1 上）和 His100
（在 C 上）之間的氫鍵作用，兩個螺旋相互垂直。在模擬結束時，由於 H 鍵切
換的作用，這兩個螺旋結構重組為更穩定的平行取向（按 12.3 kcal / mol）
（圖 9b），從而使 Glu494 與 Cys97 緊密結合。這種新的相互作用將兩個螺旋推
開，並抬升了 α1 螺旋的遠端，這反過來又將 FMN 從血紅素上拉開（達到
18.4Å）。然而，在 SB 狀態下，C-螺旋和 α1-螺旋更喜歡垂直構象。圖 10 表明
發生這種情況是因為結合的底物引起了 C 螺旋和 I 螺旋之間的強相互作用。因
此，底物在這些螺旋之間結合，因此，I 螺旋扭結並通過緊密的 H 鍵相互作用
（I 上的 Lys98 與 C 上的 Asp250）與 C 螺旋更牢固地相互作用，從而將 Chelix
垂直於 α1 鎖定。這種相互作用還會引起 H 鍵變化的波紋，該變化從 C 螺旋延
伸到 α1-螺旋中的殘基，再延伸到 ET 環上與血紅素的半胱氨酸配體連接的 FMN
附近的殘基。這些相互作用，尤其是 Asn489-Gly396 和 Asn537-Pro386，將半胱
氨酸配體拉向 FMN，從而建立了所需的短 ET 距離。
因此，底物結合（圖 4 和 7-10）引起蛋白質碎片的廣泛運動（10-11Å）；這些
運動是有功能的（導致水分流失並促進 ET）並傳播催化循環。我們堅持上面的
deta

O2 是一個小分子，很容易擴散到活性部位。但是，只有在還原步驟和良好的 O2
粘合劑鐵絡合物 III（圖 1）形成後，O2 入口才能起作用。最初，FeII 鍵合位
點被底物佔據，這引發了以下問題：O2 如何置換底物並生成氧化亞鐵絡合物
IV？答案是基於三點 O2 模型的 CYP450BM3 含鐵物種的 MD 模擬（使用雙氧流
出）提供的（重現其四重矩;見 SI 中的 p S3）.16 因此，如圖 11a 所示，因為
模擬開始時，底物佔據了血紅素結合位點，在血紅素附近僅檢測到較低的 O2 濃
度（請參見圖 S4 中 O2 濃度與模擬時間的關係圖）。但是，如圖 11b 所示，較
長時間後，基板會移位，從而為 O2 分子提供了空間，其中一些接近鐵中心 2.5Å
之內。
O2 分子的累積密度與脂肪酸末端與血紅素中心的偏差相關（圖 S4 和圖 11b）。
換句話說，這種相關性表明 O2 的外流施加了“壓力”，使基板移位。這讓人聯
想到最近的發現，即氧氣濃度會影響 P450CAM 對樟腦羥基化的選擇性。
如圖 5 所示，基板入口會將水從型腔中排出。在沒有水的情況下，O2 配體的質
子化如何產生 Cpd 0 蒸騰作用？2,3,5 這需要一種機制，使水通過一種酶的水合
物重新進入血紅素囊（圖 5）。通過三個 CYP450 成員的 MD 模擬解決了這個難題：
CYP4503A45，CYP450CAM 和 CYP450BM3.9a
5.1。 CYP4503A4 中的水閘
較早的 MD 模擬 5 顯示，渡槽靠近血紅素的丙酸酯（Prop）側鏈，特別是
Prop7，與 Arg375 形成鹽橋。該鹽橋用作水閘：當底物進入血紅素部位並阻止
水傳輸時，它將關閉。圖 12a 顯示了封閉的澆口，其中 Prop7-Arg375 的距離約
為 2.7 和 2.6Å，並且兩個鹽橋配對分子進一步通過 Ser437（在 C 螺旋上）進行
H 鍵合。因此，水分子如何進入，什麼決定了它們的進入時間？
當在存在 FMN 域的情況下重複進行模擬時，就會出現此問題的答案，該 FMN 域
通過血紅素域的帶相反電荷的界面連接到血紅素上。因此，如圖 12b 所示，在
附著時，FMN 的殘基 Met490（以及 Asn489，未示出）與關守 Ser437 相互作用並
將其拉出。反過來，Ser437 拉下 Arg375，“打開芝麻”，門保持敞開狀態，水
分子流入血紅素腔，形成在酸-醇對之間伸展的有組織的水鏈（圖 S1），準備
輸送使 Cpd 0 和 Cpd I.1-3,5 所需的質子因此，打開門的鑰匙是 FMN，這使
Ser437 將交互夥伴從 Prop7-Arg375 切換到 Met490-Ser437-Arg375。
5.2。 CYP450BM3 和 CYP450CAM 中的水門控 CYP450BM39a 和 CYP450CAM（SI 中的
p S4）使用更長的模擬時間（1μs），對上述水門控機制 5 進行了總體驗證。
圖 13 顯示了在存在 FMN 的情況下 CYP450BM3 中的水流。9a 圖 13 的左圖顯示了
SF 狀態下的封閉渡槽和遠離血紅素的瀰漫性水雲。相反，在 SB 狀態（右圖
13），Prop7-Lys69 門打開，產生密集的，有組織的水團聚體，該水團聚體從
敞開的渡槽一直延伸到 FMN 域，並與酸-醇對連接，它將質子穿梭到氧化亞鐵絡
合物中。
還研究了由 CYP450CAM18 中的還原酶 Putidaredoxin 誘導的水門控機制，並揭
示了類似的機制來關閉和打開 Prop7- Arg289 門（SI 中的 p S4），包括形成與
D251-T252 連接的水鏈殘基對。 Hayashi 等[19]證明了 Prop7 的關鍵作用，他
們通過去除丙酸酯側鏈使 CYP450CAM 發生突變，發現該突變體功能異常。
這些研究為關閉和打開渡槽提供了統一的機制，可能是許多其他 CYP450 的典型
代表。5 由此可見，底物結合不僅使還原酶和血紅素結構域更接近，而且還形
成了連接兩個結構域和結構域的有組織的水鏈。關鍵的酸-醇對，因此在偶聯產
生 Cpd I 的 ET 和質子轉移事件中起主要作用。顯然，底物結合通過誘導熵升高
2c 和可切換的弱相互作用來主導 CYP450 機器的運行，從而使循環自動進行精心
編排。

6.誘變水通道的形成
Cpd 0 到 Cpd I 的轉化（圖 1）涉及遠端氧的質子化和水分子的釋放，從而產生
CpdI。該過程已通過實驗和計算進行了充分研究。3 但是，我們的 MD 研究 9b 顯
示了範式轉變的潛力。
CYP450 中的中心機理範例 1,2,20,21 考慮了酸-醇對，它構成了為質子提供水通
道以形成最終氧化劑 Cpd I 的水通道。因此，認為 Thr 突變為 Ala 會破壞質子
穿梭機制。每當 T→突變體進行氧化時，反應性都歸因於 Cpd 0 作為“第二氧化
劑”。然而，Cpd 0 是帶負電荷的物質，計算表明它是一種不良的氧化劑。
3,22 由於水分子是可移動的，且活性位點具有可塑性，我們可能想知道是否會
在水中生成替代的水通道。突變體。
我們最近在 CYP450BM3 的 T268A 突變體中發現 9b，表明即使在這種範式突變體
中也產生了水通道。圖 14 顯示了 WT CYP450BM3 及其 T268A 突變體對二甲基
（（4-甲基硫烷基）苯基）胺（Sub1）氧化的結果。7WT 酶以 15/1 的 S / Me 區
域選擇性氧化 Sub1 的兩個位點，而 T268A 突變體的 S / Me 比為 60/1。

同時，Me 氧化的動力學同位素效應（KIE）保持恆定在〜2，與 Sub2 的 KIE 相同。

區域選擇性變化而 KIE 保持不變這一事實被解釋為 Cpd 0 和 Cpd I 共存的證據：
Cpd 0 進行硫氧化，而 Cpd I 羥基化 Me 基，因此 S / Me 比反映 Cpd 0 / CPD 我
相對豐富。儘管如此，作者[7]並沒有排除結果可能反映活性部位可塑性對 Cpd
I 反應性的影響的可能性。
由於 QM 和 QM / MM 計算表明 Cpd 0 即使是硫氧化也是一種不良的氧化劑，22 我
們在 Sub1 存在的情況下對 Cpd 0（對於 WT 和 T268A 突變體）進行了兩組 200 ns
MD 模擬（對 WT 和 T268A 突變體），可用的水和質子化通道。令我們驚訝的是，
我們發現了兩條生產性水通道，一條用於 WT 酶，一條用於其突變體。圖 15 描
繪了兩個通道。的
WT 酶有一個傳統通道（藍色），由 Glu267-Thr268 對引導。 T268A 突變確實破
壞了該通道，但創建了一個新通道（右側為紅色）。該通道也從 Glu267 啟動，
並通過一些水分子連接到 Cpd 0 的遠端氧。隨後的 QM / MM 計算 9b 顯示，這兩
個通道導致了 Cpd I 的形成，且勢壘很低，T268A 通道也導致了部分解耦（由於
Fe（H2O2）的形成和 H2O2 的離開）。 7
從圖 16a 可以推斷出 T268A 突變體中較高的 S / Me 區域選擇性的原因，該圖表
明，儘管 WT 酶中 Sub1 的硫原子由於與 F87 的 π 相互作用而遠離 Cpd I，但在
T268A 突變體中水“流”將 Sub1 推離 F87，從而導致硫部分向 Cpd I 靠近。圖
16b 顯示了 T268A 突變體中 Sub1 的詳細視圖，該圖說明 Sub1 被水分子和鄰近殘
基共同阻礙 S 端朝向突變酶的 CpdI。確實，QM / MM 計算結果 9b 顯示，與野生
型酶相比，在 T268A 突變體中，亞硫酸鹽氧化屏障降低，而 Me 羥基化屏障提高。
由於在兩種情況下 Cpd I 都是氧化劑，因此 KIE（H / D）保持不變，並且是
Cpd I.9b 的典型特徵。因此，該研究提供了令人信服的證據，證明 Cpd I 確實
在 T→A 突變體中形成，並且是 Cpd I 的唯一氧化劑。
CYP450BM3 的催化循環。
這個故事的實際教訓是，單點突變是一種有助於破譯精確機制的精密手術的假
設有時可能是錯誤的。實際上，活性口袋具有靈活性和適應性，並為最終氧化
劑的生成途徑提供了很多機會。

正如我們在上面看到的，MD 模擬加上 QM / MM 計算表明，催化循環的“自動”

操作和 Sub1 氧化等區域選擇性 7 都源自弱相互作用的集合。脂肪酸氧化的區域
選擇性和立體選擇性的比較
CYP450SPα，CYP450BSβ 和 CYP450BM3 得出相同的結論.9c，d
7.1。區域選擇性
圖 17 說明了其中一些微小差異，它們產生了完全不同的結果。在 CYP450BM3 中
（圖 17a），脂肪酸的羧酸根由 Arg47，Gln73 和 Tyr51 結合在酶的表面附近，
而在 CYP450SPα 中（圖 17b），羧酸根由 Arg241 在 Cpd I 附近深處與鹽橋接。
因此，在 CYP450BM3 中，脂肪酸尾巴在 MD 模擬過程中向血紅素滑動，而 Phe87
導致尾巴捲曲並使 ω-1ω-3 亞甲基暴露於 Cpd I，後者僅以 36:30 的比例羥化
這些位點比例：34：23.Phe87 完全阻斷了 ω 端，但 F87A 突變主要將 ω 端暴露
於 Cpd I.確實，F87A 突變體表現出> 90％的 ω 區域選擇性.23
在 CYP450SPα 中（圖 17b），Arg241 和 Phe288 對羧酸根的抓握會增強 α-CH2
基團 24 的氧化，同時排除任何 β-CH2 的氧化。在相關的 CYP450BSβ 酶中，25
羧酸鹽頭部的持有者是 Arg242（與 CYP450SPα 中的 Arg241 相比，還有一個位
點），它也可以進入 β-CH2 基團；然而，缺乏 Phe288 會導致區域選擇性低於
CYP450SPα（> 99％）。26
7.2。對映選擇性
在 CYP450BM3 中，MD 軌跡也揭示了脂肪酸羥基化對映選擇性的起源。與 Phe87
相互作用的結果是，與 pro-S 氫相比，ω-1 和 ω-2 中的 pro-R 氫更靠近 Fe-O
中心（圖 17a）。發現 Phe87 是負責任的
圖 17.控制（a）CYP450BM3 和（b）CYP450SPα 的脂肪酸氧化的區域選擇性的殘
基的示意圖。
ω-3.9c 處的 R 對映選擇性也通過相應羥基化障礙的 QM / MM 計算驗證了這些結
論。9c
MD 模擬也揭示了 CYP450SPα 中 α-CH2 羥基化過程中的 S 對映選擇性，如圖 17b
所示，表明 Pro242 將 pro-Sα-CH 鍵鎖定在更靠近 Cpd I（2.6Å）的位置，並保
持 pro -Rα-CH 鍵距離更遠（3.3Å），因此在相應的能壘中產生了很大的差異
（〜9 kcal / mol）.9d
以上討論表明，一些相關 CYP450 的選擇性是活性位點組織和其中的關鍵殘基的
函數。因此，不同 P450 成員功能的出現是由演進過程中形成的活動站點體系結
構預先定義的！