NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

CÔNG NGHỆ■ VỊI SINH

:
(+iu'*y Ổ-ỔỊUdã dếtc vái
TẬP a t&ct (Uêtc cã<x cAúmỹ, tâ i
Xin vui lòng:
• Không xé sách
• Không gạch, viết, vẽ lên sách

VI SINH VẬT HỌC

CÔINC NGHIỆP
 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ Hồ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCK KHOA

N guyễn Đ ức L ượng

C Ô N G N G H Ệ V I S I N H

TẬP 2

V I S I N H V Ậ T H Ọ C

C Ô N G N G H I Ệ P T H ix v i è

' ‘S S S J -
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUÔC GIA J /
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2002
 MỰC LỤC
LỜ I N Ó I ĐẦU 7
Những chữ 1'ict tát dùng trong sách 8
Chương ĩ
NHỮNG NGUYÊN LÝ c ơ BẢN TRONG VI SINH VẬT HỌC
CÔNG NGHIỆP 9
1.1 Nguyên lý quá trình sản xuất trong công nghệ vi sinh vật 9
1.2 Nguyên lý trao đối chất ở tế bào vi sinh vật 12
1.3 Nguy én lý điều hòa trao đối chất ơ vi sinh vật 14
1.4 Nguyên lý sinh tống hợp thừa ớ vi sinh vật 16

Ch ương 2
CÁC QUÁ TRÌNH TRAO ĐÓI CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI SINH VẬT CÒNG NGHIỆP 19
2.1 Các quá trình trao đổi chất ởvi sinh vật 19
2.2 Một số nguyên liệu thường được dùng trong nuôi cấy vi sinh
vật 44
2.3 Mỏi trường nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và trong xương
thực nghiệm 52

Chương 3
NHỮNG VẨN ĐỀ KỲ THUẬT VÀ PHƯƠNGPHÁP CHƯNG 58

I. GIỐNG CHO SÁN XUẤT 59

3.1 Tạo giông vi sinh vật 59
3.2 Kỹ thuật nâng cao chất lượng giông vi sinh vật 64
3.3 Bảo quản giống vi sinh vật 71

II. THỈẾT KẾ QUÁ TRÌNH LÊN MEN 74

3.4 Giới thiệu chung 74
3.5 Thiết kế quá trình 74

III. THIẾT BỊ LÊN MEN 84

3.6 Thiết bị có cánh khuấy 84
3.7 Thiết bị có hệ thống thổi khí 85

ĩ ^
 IV. THƯ NHẬN SAN PHẤM LEN MEN 90
3.8 Thu nhận sinh khỏi vi si nil vật 91
3.9 Thu nhận các sán pháni trao đoi chàt bậc hai 92

Chươníị 4
CÒNG NGHỆ SÁN XUAT VI SINH VẬT 95

I. CÔNG NGHỆ SAN XUẤT NẤM MEN BANH MÌ VÀ NAM MEN

DÙNG CHO THựC PHẨM GIA s ú c 96
4.1 Công nghệ sán xuãt nám men bánh mì 9G
4.2 Công nghệ sán xuất nấm men cho gia súc 115

II. CỐNG NGHỆ SẢN XƯAT PROTEIN ĐƠN BÀO 115

4.3 Protein đơn bào và protein đa bào 115
4.4 Công nghệ sán xuất protein đơn bào 119
4.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa cùa tao đơn bào 119
4.6 Một sô khác biệt giữa Chlorella và spirulina 129
4.7 Công nghệ sàn xuất tảo 130
4.8 ưng dụng sinh khôi tảo 133

III. SẢN XUẤT SINH KHỐI VI SINH VẬT TỪ DẲU MÓ VÀ KHÍ

ĐỐT 134
4.9 Vài dòng lịch sử 134
4.10 Vi sinh vật phân giài cacbua hydro 134
4.11 Vi sinh vật phân giái khí thiên nhiên 135
4.12 Cơ chế chuyến hóa 135
4.13 Công nghệ sản xuất sinh khối từ dầu mỏ 136
4.14 Công nghệ sản xuất sinh khối vi sinh vật từ khí đốt 137

IV. SẢN XUẤT SINH KHỐI PHỤC v ụ NÔNG NGHIỆP 139

4.15 Thuốc trừ sâu sinh học . 139
4.16 Sản xuât phân sinh học 151

Ch ương 5
CÔNG NGHỆ SẢN XưẤT CÁC CHẤT KHÁNG SINH 163
5.1 Các chất kháng sinh 163
 5.2. Vài đòng lịch sư 165
5.3 ( ’õ n g n g h ệ s;m XLiiìt khãnKrs i nh Ỉ V n i ã l i n 167
5.4 Các loại kháng sinh khác 178

Chương ()
CÒNG NGHi; EXZYM 187
6.1 Khái niệm vố iMizyni 187
6.2 Oỉiu t ạo của en7Ạ'm 188
6.U Động thái cua phan ứng on/vm 190
6 .-Ẳ Các yêu í ỏ ánh hường (li*n hoạt tmh (“lizym 193
C.5 Vi sinh vật tham gia >inh lông hợp f.Dzyin 197
G.6 Cơ chẽ sinh tòng hợp iMi/.ym ơ vi sinh vạt 206
6.7 Cơ chê (ĩiổu hòa sinh tỏng hợp on/yiii 211
6.8 Phương pháp nuôi cây vi sinh vật thu nhận enzyui hòa tail 216
G.9 Phương pháp ĩ hu nhạn I’liz vm không hòatan 231
G.10. ứng tlụng enzym 246

d ì ỉfan lị 7
CÒNG NGHỆ SAN Xl-ẤT CÒN VA CAC SAN PHÁM LẺN MEN
'kCHlvACỎN 273
< 7.1 ( ’ỏng nghệ sản xuát cỏn từ nguyônliệu chứa tinh bột 273
(^7 .2 Còng nghệ sán xuat bia 285
^ 7 .3 Còng nghệ sàn xuàt rượu vang. ^ 300

Ch ươn 8
CÔNG NGHỆ SAN XUẤT AXITHỮU c ơ 307
8.1 Công nghệ sán xuất axit axetic 307
8.2 Công nghệ sàn xuất axit lactic 322
8.3 Công nghẹ sàn xuất axit xi trie 336

Chương 9
CÔNG NGHỆ SẢN XưẤT AXIT AM IN 341
9.1 Nhửng phương pháp san xuất axit ainin ^ 342
9.2 Sàn xuât nxit amin bang còng nghệ vi sinh vật. 343
Chu'<mi> w
CONo NGHỆ SAX XV AT VITAMIN 355
10.1 (Ymg n^lu; sail xuat vitamin Bu 3f)5
10.2 ( ’ông nghẹ san xu.'it Kibofhivin(vitamin Bj) :.uu

Cììươniị ì ì
CÒNG NCỈIÍỆ SAN X l:ẢT CU AT KÍCHTIIICH ;ỉ« 5
11.1 CViu tạo, tinh chát cuagiberelin 3(55
11.3 Vi sinh vật tons hợp gibrivliu 368
11.1 (’ong nghệ sau xuất tfibiMvlin 3(iK
11.5 Làm sạch £ibeivlin 370

TÁI L ỈỆ Í7 TÌỈAM Kỉ ỉAO 371

 LỜI NÓI ĐẦU

GIẢO TRÌN H CÔNG N g h ệ VI SĩN H VẬT TẬP 2 là tài liệu giúp ích
cho việc học tập và đào tạo kỹ sư, cao học CÚCI các ngành Công nghệ sinh
học, Công nghệ thực phẩm. Giáo trình này trước đây đã được in ấn nội bộ
dưới dạng bài giảng và được bổ sung sứa chữa nhiều lần. Trong lần bicn
soạn và bổ sung đ ể xuất bản lần này, chúng tôi cổ gắng đưa them vào
nhũng kiến thức cơ bán và mới nhất ở những chương đầu ti.cn, hy vọng
cung cấp them kiên thức cho bạn dọc.
Chủng tôi thành thật biết ơn tất cả các bạn đồng nghiệp đã động viên,
góp ỷ đc lần xuất bán này hoàn chính hơn. Hy vọng rằng chúng tôi SC nhận
được những góp ỷ chân thành cúa mọi người quan tâm đến công nghệ vi
sinh đế giáo trình UC công nghệ vi sinh vật được hoàn thiện hơn trong
nhũng lần tái bàn sau.
Mọi góp ý xin gửi vế: Bộ môn Còng nghệ sinh học, Trường Đại học
Bách khoa, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. 268 Lý Thường Kiệt, Q.ĨO.
TP. HCM, Tel: 8639341 0913742766.
Tác giả
PG S. TS. N g u y ễn Đ ức L ư ợng
 Những chữ viết tắ t dùng trong sách

DNA: axit dczoxyribonucleic

RNA: axit ribonucleic
AMN, ADP, ATP: adcnozin, mono (di, tri) photphat
ATC: chu trình axit trỉcacboxylỉc (chu trình krcbs.)
COA: coenzym A
CMC: cacboxylmctyl cellulose
EMP: Emden M cyerhoff Parnas
GMP (GDP, GTP): gunanozin mono (di, tri) photphat
Mol: Phân tứ gatn
NAD/NAD.H: Nicotinamit adcnozin dinuclcotid ì dạníị khù
NADP/NADP-H----- ---- ------- — .........photphat Ị dạng khứ
 Chương JL

NHỮNG NGUYÊN LÝ c ơ BAN

TRONG V I SIN H V Ậ T HỌC
CÔNG NGH IỆP

1.1 NGUYÊN LÝ QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT TRONG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT

Quá trình sản xuất các sẩn phám sinh học (sinh khối, các sán phâni
trao đổi chất) từ vi sinh vật hoàn toàn khác với các quá trình sán xuất các
sản phẩm sinh học từ thực vật vn động vật. Chính vì thế’ người ta (lùng từ
lên men (ferm entation) đề chỉ một quá trình srin xuât có đặc thù riensj này.
Quá trình lên men là một quá trình hết sức phức tạp. Nó bao gồm từ
quá trình tuyến chọn giông, nâng cao chát lượng giống, báo quan giống, quá
trình lên men, quá trình thu nhận và tinh chè sàn phẩm. Trong dó nhiều
quá trình giồng nhau cá về mặt nguyên lý và quá trình vận hành, khác
chăng chỉ ở khâu giông và quá trình thu nhận, tinh sạch sàn phẩm. Các
quá trình trên được tóm tắt như sau:

Hình 1.2: Nguyên lý các quá trình cơ bản trong công nghệ ví sinh vật
10 CHƯƠNG 1

Quá trình tạo giống đòi hỏi phái có kiến thức sâu về hình thái, cấu
tạo, phân loại vi sinh vật. Ngoài ra còn phải có kiến thức về khả năng thực
hành vừng vàug về kỹ thuật phòng thí nghiệm vi sinh, kỹ thuật di truyền.
Quá trìn h tạo giòìig là công việc đòi hỏi tính kiên trì, tính cẩn thận, tính
trung thực râ t cao vì giông sè quyết định chiều hướng tạo ra sản phàm vi
sinh vật.
Quá trình sản xuất thử, thử nghiệm là quá trìn h kiểm tra đặc tính
giông. Công việc này là khâư đầu tiên giúp nhà sản xuất xác định được
hướng đầu tư, khá năng sản xuất và phát triển sản xuât. T ất cả các giống
mới tạo lập cắn phải qua giai đoạn này trước khi đưa vào sán xuất theo qui
mô công nghiệp. Tuy nhiên, nếu ta có giông mà đà biết được tấ t cá đặc
điểm (nhất là các giông đã qua sán xuất cỏng nghiệp) thì có thề không cần
qua giai đoạn san xuất thử, thứ nghiệm.
Quá trìn h sản ximt theo qui mô công nghiệp là quá trình điều khiển sự
ánh hưởng của một ioạt các yếu tố như pH, nhiệt độ, Iiồng độ chất khô,
hoạt tính nước, lưu lượng không khí tới quá trìn h lên men. Tất cả các quá
trìn h này phai được kiếm soát chặt chẽ trong một phạm vi sản xuất lớn là
cá một quá trình hèt sức phức tạp và rát khó khãn. Công việc này đòi hói
kiến thức sâu không chi về mặt sinh lý vi sinh vật mà còn đòi hỏi cả kiến
thức sâu về hóa học và lý học, cũng như kiến thức về điều khiển học.
Quá trình sán xuất theo qui 111ò công nghiệp là quá trình điều khiển đề sự
biểu hiện của feaotype cua vi sinh vật ở mức độ cao nhất. Khi đó ta thu nhận
được sản phẩm có năng suất và chất lượng cao nhất, đồng thời các sản phẩm
này còn phải đảm bảo an toàn vẻ mặt sinh học, hóa học và lý học.
Quá trìn h thu nhận và tinh chế sán phẩm hoàn toàn là quá trình áp
(iụng các phương pháp cơ học, lý học, hóa học và cá sinh học nhằm thu
nhận và tinh chế sản phẩm theo các tiêu chuẩn đã được qui định trong các
văn bán pháp qui của nhà nước và quôc tế.
Như vậy, công nghệ vi sinh là một công nghệ bao gồm bốn bước. Các
hước này có mối lièn quan hữu cơ với nhau trong một chuỗi sản xuất liên
hoàn từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối.
Mục đích cuôì cùng của cả bôn giai đoạn trong công nghệ vi sinh vật là
sail phẩm (sinh khôi hay sản phẩm trao đổi c h âu đáp ứng đầy điì các yêu
cầu cùa người tiêu dùng. Do đó, quá trình sản xuất các sản phẩm từ vi sinh
vật cần phái áp dụng GMP (thực hành sản xuất tốt), tiêu chuẩn ISO-9000
hay HACCP để đảm bảo sự an toàn trong sản xuất và an toàn sản phẩm.
Như vậy, thực chất của quá trình sản xuất các sản phẩm từ vi sinh vật
NHŨNG NGUYÊN LÝ c ơ BẢN TRONG VI SINH VẶT HỌC CÔNG NGHIỆP 11

theo (jui mò công nghiệp là phai ticVn hành (ÍU‘U khien ha quá trình cơ ban:
- Quá í rinh diếu khièn genotype (kiếu gen)
- Quỉí trình cliổu khiên fenotype (kiôu hình)
- Quá trình (ìiổu khiến kỳ thuật thu nhận, tinh che sán phàm.
Quá trình diều khiển genot-vpe là cá ít lột quá trình tạo giống, mill" cno
clii.it lưựng giống và báo quán chất lượng giống. Quá trình này đòi hỏi kiòn thức
sâu vổ sinh học. (li truyền học và kỷ thuật di truyền. Mục đích của quá trinh
này là thu dược gi õng có chất lượng tốt, (láp ứng đáy dú các yóu cầu tron í* sán
xuàí. Cõng việc này thường tiên hành troii^ các phòng' thi nghiệm. Đỏi khi
người ta coi đáv lìì những nghiên CLrti cơ brill, vì rhực chất của công việc là
nhừng nghiên cứii thuộc lình vực tố bno. Tát cá các quá trình (liều khièn nhiìì
trong phạm vi tẽ bào mà trọng tâm là nlìừng vấn dề về gcn. Khi làm chủ được
hoạt (lộng cùn gon trong tè bào, ta sẽ làm chu dược chiêu hướug phàn ứng sinh
hóa. Iỉoạt ctộns' cua gen là hoạt (lộng (lieu khum sự tổng hợp các cnzyni. Hoạt
(ỈỘ11Í? này thường tuân thù theo nguyên tác:

m ột gen —> m ột enzym —> m ột phản ứng sinh hóa —» sản phẩm

ơ (láy cnn n h à n m ạ n h . thỏm vổ cấu triíc cua gcu. Nõu "(Ml t h a y đỏi cấu
ỉrur thì sè (lấn toi sự sai lộcli t.ron^ cấu trúc cua enzvin. Nòu các axit amin
Iniiiịí cáu trúc (*n/vm bị thay doi nam trong vùng trung táiiì hoj.it ítộ 11 hay
Irunií lỉim iliõu kỉìiòn (írmiĩĩ Íí’un kiêm hàmi thì Si'* lãm (líio lộn toìm bộ
rhirn Iníớn" cua Ị‘h;in iVtis^ và s;in phàm ruòi cùng. Do (.lo, công việc diổu
k lì i 1*11 ií(Mi là còn tí VÌ(‘C q u a n t r ọ n " nlìât i r o n s t o à n 1)0 t iên t r ì n h s á n xuát.
Nluíng công tiõp tỈ11M> chi la nluiiiií viị*c làm tlô toi ưu hóa cliồu kiệu
sao cho việc biou liiộn ,u;i 1*011 tỏỉ niiàt. Ky thuật kliicn genotype*
chũiiỉỊ tói sẽ trình bìty k '’ ứ nhứng chưưng sau.
Quá trình íliều khiên fenotvpe là quá trinh tối ưu hóa c;,c ctiồu kiọn có
nnlì hướng đến biỏu hiện của en/vin. Mọi quá trình trao (lôi cliât cùa sinh
vật (lều liên quan ítèn oilzy 111. trong (ló biêu hiện rõ nhát la ơ vi sinh vật. o
thực vật, ngoài onzyni ra côn có hộ (lịch (Ịimnh tê bào co ánh hưởng (lèn
tiỉio đối chat- cùa tè’ bào. ơ động vật, ngoài cMi/ynì. hệ (lịch, quá trình trao
(lõi chất CÒ11 phụ thuộc vào hộ thần kinh.
ơ người, ngoài euzyin, hẹ dịch, hệ thẩn kinh, còn có ý thức có anh
hương ràt 1ỚI1 đôn quá í linh tnio đối ehàt cua tê bào.
Xhư vạv. vi ộc (tiều khi (Ml (ịiiá trinh trao đối chàt ư tò bào vi sinh vật là
(lõiì gian Iihât vì chúng chi phụ thuộc rât nhiổu vào Iiìột yêu tô (ló là enzvm.
12 CHƯƠNG 1

Việc biểu hiện hoạt động cưa enzym phụ thuộc rấ t nhiều vào cả yếu tố bèn
trong lẫn bên ngoài cùa tế bào, trong đó các yếu tô như pH, nhiệt độ, nồng độ
chất khò, chất hoạt hóa, chất kiềm hàm, nồng độ enzym được coi như vốu tố
điều khiển của quá trình. Quá trình điều khiển này thường được thực hiện ỡ
giai đoạn sản xuất thử và giai đoạn sàn xuất công nghiệp. Như vậy, thực chất
việc điều khiến fenotype là điếu khiển kỳ thuật sản xuất trong còng nghệ vi
sinh vật, đó là quá trình lên men. Giai đoạn uày có tính chat quvết định đến
chiều hướng kinh doanh và mức độ kinh doanh.
Quá trình thu nhận và tinh chê sán phầm là quá trình áp dụng hàng
loạt các phương pháp cơ học, hóa lý đê nhằm vào mục đích cuôi cùug cua
quá trình sảa xuất là sau pliẫỉiì. Sán phẩm này phai đáp ứng cá vổ số
lượng, chất lượng, an toàn sinh học và các điều kiện kỷ thuật.

1.2 NGUYÊN LÝ TRAO Đổl CHẤT ở TẾ BÀO VI SINH VẬT

Vi sinh vạt là cơ thê đơn bàơ, hay nói cách khác, vi sinh vật được câu
tí\o từ một tế bào (ngoại trừ một sỏ nâm sợi). Do dó, khi nghiên cứu vi .sinh
vật thực chất là nghiên cứu tế bào. vồ m ặt sinh lý, cơ thố đơn bào khác với
cơ thê đa bào ở diêm quan trọng nhãt chính là sự tác (lộng trực tiếp cùa
môi trường tới tô' bào. Trong khi (lổ cơ thể đa bào được cấu tạo từ các- tò
bào. các tê bào vừa bị ảnh hường trực tiốp vừa bị ành hường gián tiòp từ
mòi trường.
Điếm khác biệt trong quá trình trao đối chất cúa tế bào vi sinh vật có
iihừng điểm riông rất rò uét.
Như vậy, theo sơ đồ trang 13, quá trình trao đối chất ỡ vi sinh vật xáy
ra hai quá trình: quá trình đồng hóa và quá trìn h dị hóa. Qu:'. trình dồng
hóa thúc đấy quá trình sinh trưởng và quá trình sinh sán cúa tô bào.
Quá trình dị hóa là quá trình phân giải các chất. Quá trình dị hóa có
thể xáy ra trong tê bào (do các enzym nội bào thực hiện), có thè xáy ra
ngoài tê bào (do các enzyin ngoại bào thực hiện). Các quá trìn h dị hóa
trong tế bào vi siah vật nhằm cung câp năng lượng và nguvêxi liệu CỈ10 quá
trìn h tổng hợp cùa tẻ bào. Các quá trình dị hóa ngoài tế bào chủ vếu cung
cấp nguyên iiệu cho quá trình tổng hợp cua tế bào.
Các enzyni ngoại bào tham gia dị hóa ngoài tế bào được tòng hợp
trong tế bào và thoát ra khỏi tế bào, thực hiện các phản ứng ngoài tế bào.
Các enzym này được tống hợp và tham gia các phân ứng ngoài tế bào cỏ
những đặc điểm rấ t riêng chi có ữ vi sinh vật. Quá trình tổng hợp và quá
trìn h phán hủy cùa các enzym này tuân theo qui luật cám ứng của cơ chất.
NHÙNG NGUYÊN LÝ c ở BẢN TRONG VI SINH VẬT HỌC CÔNG NGHIỆP 13

Hình 1.2: Sơ đổ quá trình trao dối chất ở vỉ sinh rật

Do ảnh hưởng cùa điều kiện tự nhiên rát khắc nghiệt, các sình vật
thường phải trải qua quá trình đấu tran h đế sinh tồn. Vi sinh vật thường
phải đôi phó với điều kiện khắc nghiệt cua điều kiện sống nhiều hơn các
sinh vật khác. Chính vì th ế chúng phái có khả nảng thích nghi rấ t cao.
Khả năng này giúp vi sinh vật loại trừ dần những quá trình trao dôi chất
không thích hợp và hoàn thiện dần các quá trình giúp nó thích nghi với
môi trường. Một trong những đặc điểm của quá trìn h trao đổi chất dễ nhận
biết n h ất là khả năng tiến hành trao đổi chất theo hướng hợp lý n h ất và
kinh tế nhất. Có nghĩa là khi vi sinh vật tiến hành quá trình trao đổi chất
thường không tạo ra những sản phẩm dư thừa. Các sán phẩm tạo ra trong
quá trình trao đổi chất đủ đẻ tiến hành những quá trìn h sinh hóa cơ bản
trong tế bào. Như vậy trong sản xuất công nghiệp vi sính vật, ta thu nhận
được một số của quá trình tổng hợp là các sản phẩm thường không có ý
nghĩa lớn đối với bản thản vi sinh vật; nhưng với người sản xuất các sản
phẩm này có ý nghĩa quan trọng trong quá trình kinh doanh và kê hoạch
phát triển kinh doanh.
14 CHƯƠNG 1

N hư vậy, trong quá trìn h trao đổi chat ciia vi sinh vật sẽ tạo ra các
dạng sản phẩm sau:
- Sinh khối vi sinh vật (các vật chất có trong tế bào vi sinh vật, người
ta còn gọi sản phẩm này là sản phẩm bậc một)
- Các vật chất được tạo ra trong quá trình trao đổi châ't, tế bào tách
chúng ra môi trường, chúng không tham gia quá trìn h tạo ra sinh khôi tế
bào. Người ta gọi nhóm sản phẩm này là sản phẩm trao đổi châ't bậc hai.
Các sản phẩm trao đối chât bậc hai bao gồm cả các sản phẩm đồng hóa và
dị hóa.
- Ngoài ra còn một dạng sản phẩm khác được gọi là các sản phẩm của
sự chuyến hóa (transformation products). Các sản phẩm của sự chuyền hóa
thường là những chắt trung gian không bền về m ặt hóa học và chúng còn
tiếp tục được chuyến hóa trong chuồi chuyển hóa của tê bào.
Cơ chất — — — Ti ển sản phẩm

I I Tể bào

Sản phắm bậc hai Sản phẩm chuyển hóa

{sản phẩm trao đổi chất)

Sản phẩm bậc 1

(sinh khối)

H ình 1.3; Sơ đồ các sản phẩm trong trao đổi chất của vi sinh vật

1.3 NGUYÊN LÝ ĐIỂU HÒA TRAO ĐÔI CHẤT ở VI SINH VẬT

Như phần trê n đã trìn h bày, trong tự nhiên, các vi sinh vật khi tiến
hành quá trìn h trao đổi chất không bao giờ tạo ra quá nhiều chất này hay
chất khác mà chỉ ở mức độ cần th iế t n h ất định cho sinh sản, phát triển và
duy trì loài. Như vậy, trong tự nhiên sẽ không có quá trìn h tạo ra sự dư
thừa các sản phẩm trao đổi chất.
Điều khiển cho sự không tạo ra những dư thừa của quá trình trao đổi chất
của vi sinh vật trong tự nhiên là quá trình phức tạp nhưng rất chặt chẽ.
Các nhà khoa học cùng đã tìm ra ba cơ chế điều hòa quá trìn h trao dổi
chất ở vi sinh vật. Ba cơ chế điều hòa bao gồm:
NHỮNG NGUYỀN LÝ c ơ BẢN TRONG VI SINH VẬT HỌC CÔNG NGHIỆP 15

7* Điều hòa hoạt tính cnzym nhờ sự ức chê cua sản phấm cuối cùng
Cơ chê này được gọi là sự kìm hãm theo cơ chẻ ngược. Theo cơ chế
này, sần phẩm cuôi cùng của một quá trình phản ứng sẽ gây ra sự ức chế
quá trình phản ứng. Các sán phẩm cuối cùng có thế là các sản phẩm được
tạo thành trong quá trình trao đổi chát, cùng có thể là những chát đưa vào
môi trường nuôi cấy. Các sản phẩm này sè tham gia gây ức chế hoạt tính
của enzym đầu tiên tham gia phản ứng đẩu tiên của chuỗi phản ứng.
Các enzym bị ức chê thường là nhừng enzym di lập thể. Khi có sự tác
động củạ sản phẩin cuôi, các enzym này sẽ bị thay đổi cấu hình không gian
và như vậy các trung tâm hoạt độnTg bị thay đổi câu hình không phù hợp
với cấu hình không gian của cơ chât. Khi đó tốc độ phản ứng sẽ giảm hay
bị triệt tiêu.
Về lý thuyết, muôn chuỗi phản ứng này tiếp tục xảy ra thì phai triệt
tiêu sản phẩm cuôi. Tuy nhiên trong thực tế, cơ chế ức chế bởi sản phấm
cuôi thường xảy ra rấ t nhanh và có hiệu quả tức thì.
Trong quá trình sông, vi sinh vật thường sử dụng các sán phẩm cuôi
cho quá trình phát triển và sinh sán. Cũng có thề các sán phẩm CUỐI chỉ là
một sản phẩm không cần th iết cho các quá trình trên. Do đó sự tồn đọng
của nó lại là chát dinh dưỡng cho các vi sinh vật khác. Và như vậy trong
thiên nhiên có sự thay đổi nhịp nhàng giữa quá trình tạo ra và mát đi.
Điều hòa quá trình này là do sản phârn cuôi tạo ra, khi thiếu sán phẩm
CUỐI, phản ứng được tạo ra. Khi sản phẩm được tạo ra dư so với nhu cầu của
vi sinh vật, sản phẩm cuối sẽ ức chê quá trình tạo ra chúng. Khi hết, cơ
chế ức chê này không còn duy trì và cơ chê tạo ra sản phẩm cuối được t á i .
]ập. Cứ như vậy, sự điều hòa trở nên nhịp nhàng suôt quá trình phát triển
của vi sinh vật.
Trong quá trình sản xuất, ta có th ể điều khiến quá trìn h này bằng việc
làm tăng hay làm giảm lượng sản phẩm cuốỉ của phản ứng.
2- Điều hòa cơ chế kiềm chẽ sự tổng hợp enzym
Sản phẩm cuối cùng ức chế sự tổng hợp enzym (enzym tham gia sự tạo
ra sán phẩm cuô'i này). Trong quá trìn h tống hợp ra enzym tham gia tạo ra
sản phẩm cuối, việc đọc thông tin đi truyền này sẽ bị phong tỏa. Nếu nồng
độ sản phẩm cuối nhiều, quá trình phiên âm sẽ bị ngưng trệ. Khi nồng độ
sản phẩm cuối ít dần, quá trình phiên âm lại được phục hồi và quá trìn h
tổng hợp enzym lại được thực hiện.
Điều hòa tổng hợp enzym bằng cơ chế này thường xảy ra từ từ, không
nhanh như sư ức chế
16 CHƯƠNG 1

3- Điều hòa cơ chế kiềm dị hóa sự tổng hợp enzym bằng cơ chất phản ứng
Trường hợp các enzym tham gia quá trìn h dị hóa được điều hòa bằng
cơ chê kiềm dị hóa, các enzym tham gia vào quá trình dị hóa được gọi là
enzym cảm ứng. C hất mà enzym tham gia phân hủy gọi là cơ chất cảm ứng.
Các cơ chất này có khả năng kích thích sự tổng hợp ra các enzym cảm ứng
tương ứng. Do đó, các enzym tương ứng chỉ được tạo ra khi trong môi
trường nuôi cây có m ặt các cơ chất tương ứng.
Thực tế, trong môi trường không chỉ tồn tại một loại cơ chất mà có rấ t
nhiều cơ chất. Các cơ chất này đều có khả năng kích thích sự tạo ra enzym
cảm ứng, còn quá trìn h tổng hợp enzym lại phụ thuộc hoàn toàn vào tính
chất của cơ chất-. Cơ chất nào dễ dàng bị phân hủy thì sẽ dễ kírh thích sự
tạo ra enzym cảm ứng tương ứng trước. Lần iượt như vậy cho đến khi tấ t cả
các cơ chát được phân hủy và tấ t cả các enzym được tạo thành.
Trong nhừiig trường hợp glucose có m ặt trong môi trường' sẽ xảy ra
hiện tượng cơ th ể sinh vật tăng nhanh quá trìn h sinh tổng hợp enzym
phán hủy glucose. Các qưá trình khác bị ức chế cho đến khi không CÒ11
glucose trong môi trường. Sự ức chế quá trìn h tổng hợp các loại enzym khác
bời glucose trong trường hợp này gọi là hiệu ứng glucose.
Toàn bộ quá trình kiềm dị hóa có liên quan chặt chẽ đến quá trìn h
phién âm trong cơ chế sinh tổng hợp protein. Trong tự nhiên có rấ t nhiều
vi sinh vật điều khiển quá trình sinh tống hợp theo cơ chế này.

1.4 NGUYÊN LÝ SINH TổNG HỢP t h ừ a ở VI SINH VẬT

Phần trên chúng tôi đã trình bày quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật
thường tuân theo nguyên tắc kinh tế và hài hổa. Các vi sinh vật không khi
nào tống hợp ra những chất quá thừa so với nhu cầu phát triển của chúng.
Trong thực tế có sự sinh tổng hợp thừa, không những thừa mà còn
thừa rấ t nhiều so với nhu cầu của chúng. Sản phẩm thừa này của vi sinh
vật rấ t cần th iế t cho các quá trĩnh sản xuất các sản phẩm từ vi sinh vật. ở
đây có điều gì mâu thuẫn? Hoàn toàn không. Cơ chế sinh tổng hợp thừa có
liên quan rấ t nhiều đến cấu trúc không gian của enzym và liên quan rấ t
nhiều đến cơ chế di truyền ở vi sinh vật.
Các enzym thường tồn tại loại cấu trúc không gian. Trong cấu trúc
không gian của enzym tồn tại hai trung tâm: một trung tâm phản ứng với
cơ chất và một trung tâm chịu sự kiểm soát của chất kiềm chế. Cấu trúc
không gian của trung tâm hoạt động trong enzym có hình dạng giống như
cơ chất mà chúng tham gia phản ứng. Sự trùng lặp về cấu trúc không gian
NHỮNG NGUYÊN LÝ c ơ BẢN TRONG VI SINH VẬT HỌC CÔNG NGHIỆP 17

này giửa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzym tạo ra phản ứng dị
hóa. Trong trường hợp enzym bị ức chê ngược bởi sản phẩm cuôì thì sản
phẩm cuối này được coi như chất kiềm chế. Chất kiềm chê này tiếp xúc với
trung tâm kiềm chế (trung tâm dị lập thể) sè làm thay đổi câu trúc không
gian của trung tâm phản ứng và khi đó câu trúc không gian của trung tâm
phản ứng không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất. Khi đó
phản ứng sẽ khó xảy ra.
Như vậy, muốn phản ứng xúc tác luôn luôn được thực hiện thì trung
tâm di lập thế phải luôn luôn được biến đồi đề chúng không còn tương tác
được với chất kiềm chế (sản phẩm cuối chẳng hạn). Khi đó cấu trúc không
gian của trung tâm hoạt động không còn bị biến dạng mà chúng hoàn toàn
tương ứng với cơ chất. Như vậy sản phẩm của những phản ứng sè được tạo
ra liên tục. Sản phẩm này được tạo ra không có sự kiểm soát của chất kiềin
chế được gọi là sản phẩm thừa đối với vi sinh vật.
Một vân đề khác cũng cần được làm sáng tỏ để hiếu hơn cơ chế sinh
tổng hợp thừa - đó là vi trí của các axit amin trong câu trúc của enzym.
Enzym là protein. Protein lại được cấu tạo từ các axit amin thông qua các
iiên kết peptid. Trong câu trúc không gian của protein, enzym có hai trung
tâm như đã trìn h bày ở phần trên. Chỉ có các axit amin nằm trong câu trúc
không gian của các trung tâm này mới có ý nghĩa trong các phản ứng mà
chúng tham gia. Các axit amin nằm gần cấu trúc không gian của các trung
tâm hoạt động này không tham gia vào phản ứng. Do đó sự sai lệch về thứ
tự sắp xếp hay sô" lượng các axit amin nằm trong các trung tâm hoạt động
này đều dẫn đến sự sai lệch về chiều hướng phản ứng hay tốc độ phản ứng.
Sự thay đổi về axit amin trong trung tâm kiềm chế sẽ làm m ất khả năng
kết hợp với châ't kiềm chế. Khi đó trung tâm hoạt động sẽ không thay đổi
cấu trúc không gian và quá trình phản ứng sẽ liên tục xảy ra. Kết quả là ta
sẽ nhận được sản phẩm thừa liên tục.

Cơ chất Chất ức chế

(sản phẩm cuối)

Trạng thái hoạt động

Hình 1.4: ức chế bằng sản phẩm Ịcuếị ■'r v '

Ị T b ị ư v í ệ H Ề
18 CHƯƠNG 1

Trong thién nhiên luỏn xay ra nhiều đột biến khác nhau. Các đột biến
này thường không định hướng. Chi cần một trong hàng triệu đột biến đó là
đột biến điêm xảy ra ở bộ ba nucleotid mả ìióa cho một axit ainin nào đó
nàni trong các trung tâm hoạt dộng sẽ làm sai lệch mà di truvển và cuối
cùng là làm thaỹ đối cáu trúc không gian cùa trung tâm kiềm hãm. Từ đó
các chát kiềm hà 111 không có khá năng phong t oa trung tãin kiềm hàin và
vì vậv, các Kim phâm sẽ liên tục được tạo ra từ các trung tàm hoạt động.
Điếm cuôi cùng trong vấn đề điều hòa này là trong cấu trúc của DNA
tồn tại gon kiềm chế {gen repressor) và các gen diều khiến igcn operator).
Các gen kiổm chế sè điều khiển tống hợp ra các chất kiềm hànì. Vì nhừng
lý do dột biến, các chát kiềm hãm bị thay đối càu trúc không gian. Sự thay
đối câu trúc không gian này cũa chất kiềm hàm í chúng biêu hiện như một
aporcprcssor) có thể khiến gen operator như ln một chát hoỉorcprcssor. Két
quả, sự tống hợp RNAt tương ứng sẽ bị kiềm hàm và sự tổng hợp euzvm
này cũng bị kiềm chế. Mặt khác, khi chất kiẻm hãm thay đổi cấu trúc
không gian sẽ không còn khá năng tương tác với trung tâm dị lập thế và
như vặv sè m ất khầ nâng kiềm hãm hoạt động cua trung tâm hoạt động.
Kết qua là các sán phàm sẽ dược tạo ra liên tục.
Như vậv. muôn cho vi sinh vật tống hợp thừa một sán phẩm nào đó, ta
phái tác động vào trung tâm dị lập thê đè chúng khóng còn có khá nãng
hoạt dộng, hoạt* tác động vào chất kiềm hãm iàni chúng không có khả năng
tương tác với trung tám dị lập thế. Tóm ỉại, muôn có quá trình tông hợp
enzvm hay tông hợp sàn phẩm thừa ta phái giai tòa sự kiềm chế. Giải tòa
đưực sự kiổĩìì chõ sè tạo điều kiện thuận lợi nhát cho quá trình sinh tống
hợp thừa ca onzvni và sán phẩm trao dối chất.
 Chương

CÁC QUÁ TRÌNH TRAO Đ ổ i CHAT

VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI C Ấ r VI
SINH VẬT CÔNG NGHIỆP

2.1 CÁC QUÁ TRÌNH TRAO Đổl CHẤT ở VI SINH VẬT

Vi sinh vật là nhừng cơ thể đơn bào. Các cơ thế đơn bào phải tiến
hành tấ t cả các chức năng cơ bản của sự sống. Các chức năng đó bao gồm
quá trình trao đổi chât, sinh sản và phát triển.
Trao đổi chất là một chức năng rấ t quan trọng nhằm duy trì sự sông
của cơ thể, giúp cơ thể phát triển đề sinh sản, duy trì nòi giông, ơ vi sinh
vật, quá trình trao đổi chất có râ t nhiều điểm khác biệt với quá trình trao
đối chát ở động vật và thực vật.
2.1.1 N hữ ng đ ặc đ iểm cơ b ả n tro n g tra o đổ i c h ấ t ở vỉ sỉn h v ậ t
Vì ỉà cơ thề đơn bào nẻn vi sinh vật thường tiến hành các quá trình
trao đổi chât trực tiếp với môi trường bên ngoài. Trong khi đó trong cơ thề
đa bào, quá trình trao đổi chât thường được chuyên môn hóa ở những cơ
quan n h ất định. Do đó, cơ thề đơn bào thường có những đặc điểm riêng như
sau:
1 - Khả năng chuyến hóa vật chất trong quá trình trao đổi chât ở vi
sinh vật rấ t lớn. Trong thời gian tế bào vi sinh vật có th ể chuyển hóa
được khôi lượng vật chất lớn gấp hàng ngàn lần so với khôi lượng của
chúng. Nhờ khả năng chuyến hóa mạnh như vậy nên tốc độ p hát triển và
tăng sinh khối của chúng cũng tăng gấp hành trăm lần so với ban đầu. Sự
tăng khôi lượng ở thực vật và động vật thường thấp hơn rấ t nhiều. Đặc
điếm này giúp ta tiến hành các biện pháp kỹ thuật trong sản xuất công
nghiệp nhằm giải quyết trong thời gian ngắn sự chuyển hóa vật chr' K-hông
có giá trị kinh tế sang các sản phẩm vi sinh có giá trị kinh tế cao.
2 - Quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật chủ yếu do hệ thông enzyni của
20 CHƯƠNG 2

tế bào quyết định và toàn bộ bề m ặt củá tế bào được huy động vào quá
trìn h này. Qua bề m ặt tế bào, các chất dinh dưỡng sẽ được đi vào tế bào và
các sản phẩm trao đổi chất sẽ ra khỏi tế bào. Tế bào vi sinh vật lại rấ t
nhỏ. Như vậy tổng diện tích bề m ặt của hàng tỷ tế bào/mẻ sè rấ t lớn.
Chúng ta tưởng tượng trong thiết bị lên men dung tích hàng chục m:\ tổng
th iế t diện tiếp xúc của bề mặt sẽ là con sô* lớn đến mức nào. Do đó, vật
chất trao đổi qua bề m ặt tế bào sẽ rấ t lớn và như vậy tốc độ trao đổi chất
rấ t cao. Trong khi đó, vật chất chuyển hóa ở động vật phải đi qua bề m ặt
phía trong của ruột non, sau đó mới tiếp xúc với bề m ặt của từng tế bào
trong mô bào. Tương tự như vậy, vật chất chuyển hóa trong cơ th ể thực vật
phải đi qua bề m ặt lông hút ở rễ hoặc các lỗ thoát khí ỏ bề m ặt lá, sau đó
mới tiếp xúc được với bề m ặt tế bào. Quá trìn h vận chuyển vật chất trở nên
rấ t chậm, và do đó, tốc độ chuyển hóa vật chất ở động vật và thực vật
thường chậm hơn- ở vi sinh vật.
3“ Quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật là một quá trìn h rấ t nhạy cảm.
Sự chuyển đổi kiểu trao đối chất xảy ra rấ t nhanh và rấ t hiệu quả. Ví dụ,
đối với tê bào nấm ínen Saccharomyces cereưisỉae hay vi khuẩn Bacillus
subtilis, rấ t dề dàng chuyển từ trạng th ái chuyển hóa vật chất khi có m ặt
oxy sạng trạn g thái chuyển hóa vật chất khi không có m ặt oxy. Sự chuyển
đổi kiểu trao đổi chát này phụ thuộc rấ t nhiều ỏ sự tổng hợp và điều khiển
hoạt động của các enzym tương ứng với kiểu trao đổi chất.
4- Trong quá trìn h trao đổi chất, vi sinh vật thường có xu hướng sử
dụng những vật chất dề tiêu hóa, sau đó mới sử dụng các vật chất khó tiệu
hóa. Như vậy quá trìn h p hát triển trong môi trường nuôi cấy sẽ tạo ra
nhiều quá trìn h thích nghi và nhiều quá trìn h tăng trưởng.
Bình thường, nếu trong môi trường tồn tại môi trường đồng n h ấ t (một
loại môi trường chính dễ đồng hóa), thì tế bào vi sinh vật sẽ có chu kỳ sinh
trưởng qua bốn giai đoạn:
• Giai đoạn thích nghi
• Giai đoạn tăng trưởng
• Giai đoạn cân bằng
• Giai đoạn tử vong (hay giai đoạn giảm sinh khối).
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÕI TRƯỜNG NUÔI CẤY v s v CÒNG NGHIỆP 21

Sinh khối
m
Ghi chú:
1- giai đoạn thích nghi
2- giai đoạn tăng nhanh
3- giai đoạn cân bằng
4- giai đoạn suy vong
1

Thời gian (giờ)

0
Hình 2.1: Đường cong sinh trưởng của vỉ sinh vật trong môi trường đơn giản
Bất kỳ loài vi sinh vật nào củng trải qua bôn giai đoạn phát triển
trên. Tuy nhiên giữa các loài vi sinh vật ỉại khác nhau ở thời gian dài,
ngắn trong các giai đoạn. Có vi sinh vật cần thời gian thích nghi, sinh trưởng
ngắn, có vi sinh vật lại cần thời gian của những giai đoạn này dài hơn.
Trong trường hợp môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng cùng loại
nhưng mức độ tiệu thụ khác uhaư sẽ xảy ra hiện tượng hai hoặc nhiều giai
đoạn thích nghi về sinh trưởng. Các giai đoạn này sẽ lập đi lặp lại cho đến
khi hết các chất này mới đến giai đoạn cân bằng và giai đoạn giảm sinh khôi.
Ví dụ, trong môi trường cùng một lúc tồn tại glucose và saccharose như
những nguồn cung câp cacbon duy n h ât cho sự phát triốn của vi sinh vật
thì vi sinh vật sẽ tiến hành sử dụng glucose trước, khi hot glucose sè tiến
hành sứ dụng saccharose. Và như vậy đường cong sinh trưởng sè có hai giai
đoạn thích nghi và hai giai đoạn tăng trương.

Ghi chú:
Sinh khối
1 - giai đoạn thích nghi lấn 1
(gtf)
2- giai đoạn tăng nhanh lấn 1
3- giai đoạn thích nghi lần 2
4- giai doạn tăng nhanh lần 2
5- giai đoạn cân bằng
6' giai đoạn suy vong

Thời gian (giờ)

0
Hình 2.2: Đường conq sinh trường của ui sinh vật trong môi trường chứa
nhiều chất dinh dưỡng cùng loại nhưng khả năng phân giải khác nhau
22 CHƯƠNG 2

Trong thực tế. vi sinh vật thường tiến hành trao đôi chất theo kiêu
này vì trong mỏi trường thường chứa nhiều chât dinh dường chứ ít khi chứa
đơn thuần chi một chất dinh dường.
5- Vi sinh vật có khá năng ‘‘tự chế biến” các chát dinh dưỡng cho mình
nhờ hệ enzym của chính chúng. Trong môi trường không phái lúc nào cũng
có sắn các chất dinh dường đế tiêu hóa, còn rất nhiều loại chất mà vi sinh
vật phải tự biến đổi chúng để chuyển chúng thành nhừng chất có kích
thước nhỏ hơn hoặc Iihửng chất có câu tạo phân tứ nho hơn dề dàng qua
màng tê bào và dề dàng tiêu hóa hơn. Đế làm 'lược điều này vi sinh vật
phái tự tống hợp các enzym ở trong tẽ bào và sau (ió các enzym nàv phái ra
khỏi tế bào và thực hiện các phản ứng phân giái ngoài tẽ bào.
Các enzym được tông hợp trong tẽ bào và thực hiện phân ứng ngoài tẻ
bào dược gọi là enzym ngoại bào, khác với enzvni nội bào là các enzym
được tống hợp ờ trong tế bào và thực hiẹn các phán ứng ớ trong tế bào.
Phan ứng enzym ngoài tê bào còn (lược gọi là dị hóa ngoài tê bão. CÒI1
phán ứng phân giáí bới enzym trong tê bào (lược gọi là quá trình dị hóa
trong tê bào. Như vậy ớ vi sinh vật có hai quá trình (lị hóa:
- Quá trinh (lị hóa trong tè bào thường cung Cấp cho tế bào ca nâng
lượng và ca vật chất phục vụ cho quá trình tổng hựp cua tế bào.
- Quá trình (lị hóa ngoài tê bào chù yéu cung cáp vật chất phục vụ cho
trinh tông hợp ciia tế bão.
Năng lượng dược tạo ra trong quá trình này thường được giai phóng ra
ở dạng nhiệt nàng. Chính nhiệt năng này làm nóng môi trường. Ớ môi
trường bán rắn <độ ấm thường khoáng 55 - 65 QW), nhiệt độ có thê lên tới
70 c, ơ môi trường ỉóng nhiệt độ thường thấp hơn. Đòi với quá trình trao
dối chát, năng lượng này có ý nghĩa rấ t lớn vì khi nhiệt độ tàng sẽ có xu
hướng tăng hoạt tính enzym ở một giới hạn nhiệt tối ưu. Các enzym hoạt
động trong tế bào vi sinh vật thường hoạt động ở nhiệt dộ ôn hòa như
nhiệt độ của CƯ thế sinh vật. Nhưng khi enzym thoát khỏi tế bào (tự thoát
ra do quá trình trao đổi chát hoặc tiến hành trích ly trong các quá trìn h kỷ
thuật) thường hoạt động ỡ nhiệt độ cao hơn nhiệt độ cúa tế bào. Mặt khác,
chính nãng lượng này làm ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật ưa ấm (rát
nhiều vi sinh vật ưa ấm thuộc loại hoại sinh hoặc loại gây bệnh), do đó làm
hạn chế sự cạnh tranh giữa các loài vi sinh vật trong cùng một môi trường.
Quá trình dị hóa ngoài tẻ bào vi sinh vật xảy ra trong trường hợp cơ
chất có kích thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất.
Muốn tiêu hóa được cơ chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành
CÁC Q UẢ TR IN H TĐC VÀ M ÕI TRƯỜNG NUÔI C Á Y v s v CÒNG N G H IỆ P

c;ic chát có kích thước nho hơn. (Ill cỏ thè XÍUIÌ n h ậ p được vào trong Tô
bào th ôn g qun t h à n h va màn<í te bào
Như VÍ1V khi cỏ mạt CUÍÌ cơ chât. tô bào sẽ tống hợp onzvni tương ứng.
Cơ chê này gọi là cơ chẽ cam línu. Có ch<‘ C’iini ứng chì có thè xav ra khi có
mật cùa cơ chat. Khi (lo chinh CƯ chát lam chai kích thích (lè tỏ bào tạo ra
enzym tương ứng, thực hiện các phan ỨI1<Í plir\r ưiai. Cơ chế này xây ra
thường xuyên ứ V) sinh vật. Cơ chè cam ứiiỊí It khi hoậc không xav ra ớ các
tê bào sinh vật đa bao.
Chât tạo ra cư chõ tỏng hợp 1*11y,ym (lược gọi là chât CiiI1Ì ứng. Enzyni
(lược tạo ra từ cơ chè này ílược Ịĩọi là tMizvm cam ứng. Cơ chó cam ứng có V
nghìn rất ìớn trong quá trinh phát triÔỈ1 cùa vi sinh vại VI (lặc điéin tự chv
bión chất dinh (lương (ý vi sinh vật gáu liồn với sự tạo thành cùa (*uzym
càin ứng.
(Sán phẩm co kich thưoc nhò)

Hình 2.3: Cúc tịUO trình dị hòa à II si nil lật

Cùng cần lưu ý quá trình dị hóa ngoài tè bàơ, tạo ra ciic s;in phàm có
khi không phục vụ gì cho quá trinh chuyên hóa vặt chát cua tẻ bào Ỉ1ÙI chi
có ý nghĩa làm thay đối môi trường có lợi rìio quá trình phát triên cua vi
sinh vật hoậc cho thực vật cùng phát triên trong mòi trường đó. Tuy nhiên,
nếu ta nắm được CƯ chế này sè giúp ta dieu khiên các quá trình vi sinh vật
còng nghiệp thuận lợi hơn rat nhiéu.
2.1.2 D inh dư ỡ ng tro n g công n g h ệ vi sin h v ậ t
Các chất dinh (lưỡiiị,r trong quá trình công nghệ vi sinh vật thường lấy từ
dịch lên men. Do (ló, hiểu bièt quá trình chuyến hóa các chất dinh đường cũng
như việc cung cáp đầy đủ và càn đối các thành phản đinh dường trong dung
dịch lèn men là một trong nhửng yếu tố quyết định đến nAng sưât sinh học.
24 CHUƠNG2

Các chất dinh dưỡng đưa vào dịch iên men phái đám báo đủ và cân bang về
năng lượng và các vật liệu cẩn thiết cho quá trình xây dựng tế bào.
T hành phần dịch lên men hay môi trường lên men gồ 111 có nguồn dinh
dưỡng cacbon, Iiitơ, khoáng, các yếu tỏ vi lượng và các chát kích thích sinh
trưởng.
Tuy nhiên cũng cần phải lưu ý tới từng loại vi sinh vật cụ thế đề quyết
định xây dựng một “khẩu phần” dinh dưỡng thích hợp, vì tùy từng ỉoài vi
sinh vật mà ta cung cấp số lượng các chất dinh dường khác nhau. Ngoài ra
còn phái chú ý đến đặc điêni sinh ỉý cùa chúng và điều kiện lèn men ta
định tiến hành.
1- Nguồn dinh dưỡng cacbon
• S ự c h u y ể n h ó a h y d r a tca c b o n

Trong tế bào, cacbon chiếm khoáng 50r/ lượng chất khô. Cacbon có
m ặt trong protein, enzym, axìt amin, trong tất cá các san phám trao đổi
chất của tế bào. Do đó, trong sự sòng của tò bàu khòng thế vắng m ặt
cacbon và càng không thế thiếu chúiiíí trong Iihừng cấu trúc vật chất cụ
thể.
Vi sinh vật là giới sinh vật duv nhất có khá năng đỏng hóa rất nhiổu
nguồn cacbon khác nhau. Có lẽ chi trừ kim eưưitg và than chì ra, còn lại vi
sinh vạt có kha năng sử dụng tất ca cát’ 11£^LIỎ11 cacbon đế tiến hành các quá
trình trao đối chất, phát triôn và sinh san. Kha năng sứ dụng các nguồn
cacbon của vi sinh vật không phái là giống nhau ở các loài vi sinh vật khác
nhau. Kha năng này cùng không phái giỏng nhau ở những nguồn cacbon
khác nhau: có những nguồn cacbon vi sinh vật dề dàng sứ dụng, có những
nguồn cacbon vi sinh vật rât khó sử dụng, thậm chí phái huy dộng nhiều
loài vi sinh vật c'ing tham gia, phân hủy từ từ và sứ d mg từ từ.
Thông thường vi sinh vật ờ trong tự nhiên hay o trong điều kiện nuòi
cây nhân tạo sẽ tiến hành phân hủy các nguồn cacbon có câu tạo đơn gián,
có mức độ oxy hóa mạnh trước sau đó sò tic 11 hành phân hủy các nguồn
cacbon phức tạp và có mức độ oxy hóa thấp. Do đó, giá trị dinh đưởng và
khả năng hấp thụ của vi sinh vật từ các nguồn dinh dưỡng cacbon phụ
thuộc vào những yếu tô sau:
• Phụ thuộc vào ỉoài vi sinh vật
• Phụ thuộc vào cấu trúc và thành phần hóa học của nguồn cacbon
• Phụ thuộc vào mức (lộ oxy hóa của nguồn cacbon
• Phụ thuộc vào sự có mặt của các nguồn cacbon trong môi trưởng
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÔI TRUỞNG NUÔI CẤY vsv CÔNG NGHIỆP 25

• Phụ thuộc vào điều kiện nuôi cây hay điều kiện vi sinh vật đó đang
tồn tại và phát triển.
Trong quá trình phát triển và sinh sản, vi sinh vật cần có nguồn
cacbon và sô lượng nguồn cacbon khác nhau. Nhìn chung, vi sinh vật dễ
hấp thụ n h ất nguồn cacbon từ hydratcacbon. Hyđratcacbon được vi sinh vật
sử dụng đê đáp ứng các nhu cầu sau cho sự phát triển và sinh sản của
chúng:
• Hydratcacbon cung càp năng lượng cho vi sinh vật.
• Hydratcacbon cung cấp các tiền chất cho vi sinh vật.
• Hydratcacbon tạo ra các quá trình oxy hóa khử nhờ vi sinh vật. Từ
đó tạo ra các sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuôi cùng đề xây dựng tế
bào, các sản phẩm tổng hợp hay sản phẩm bậc hai tích lủy trong môi
trường nuôi câv.
Trong các loại hydratcacbon, glucose là chât được tuyệt đại đa sô các vi
sinh vật đồng hóa và là lìguồn cacbon duy nhất tham gia vào nhiều pháa
ứng trong ba chu trình chuyển hóa chúng: con đường Einbden-Meyerhof,
Pentose và E ntner Doudoroíĩ.
/- Con đường Embden-Mdyerfiof
Năm 1930, ba nhà khơa học người Đức là G. Embdeii' o. Meyerhof và
o. Warburg dã tiến hành những phản ứng hóa học riêng rẽ trong hàng loạt
các quá trình phản ứng trong quá trình lén men và dã đưa ri\ được con
áưm g đường phân glucose. Sau này người ta thường gọi là con đường
Embden-Meverhof. Con đường này được các tác giá đưa ra trong mười phán
ứng khác nhau từ glucose đến piruvat và được thực hiện bởi rát nhiều
enzym. Cho đến nay tât cá các enzyin đà được tách, tinh chế dưới dạng kết tinh.
Con đường chuyên hóa glucose theo Ettibden-Meyerhof được chia ra
làm hai giai đoạn:
• Giai đoạn đầu, được gọi là giai đoạn “đầu tư năng lượng” bao gồm 5
phán ứng đầu tiên.
Ở giai đoạn này đường được hoạt hóa bởi photphoril hóa. Phản ứng
này tạo ra một moi đường 6 cacbon đă được photphoril hóa, fructozo - 1,6 -
biphotphat. Đường này sau đó được cắt thành hai mol triose photphat. Hai
mol triose-photphat dược hình thành một mol glucose sau hai lần
photphori] hóa ớ mức độ cơ chất sê tạo thàn h 4 mol ATP trên một mol
glucose.
26 CHƯƠNG 2

• Giai đoạn thứ hai. là giai (ỉoạn 'phát sinh tiàng lượng” l>no gổni 5
phán ứng tiếp theo.
ơ giai đoạn này các triose-photphat sẽ được hoạt hóa tiôp dế tạo
th àn h hai hợp chât chứa các lién kết photphat cao nàng 1 .;} -
biphotphoglyxerat và photphoenolpiruvat. Ca hai hợp chàt nai) (liMi có một
AG 1 cua phán ứng thuy phân cao hơn ATP. ( ’ác chãt nàv (lược coi như hợp
chàt siêu cao năng lượng.
Hni chàt này sẽ chuyền phophate cao nồng ADP (lố tạo thành ATP.
Quá trinh này được gọi là sự photphoril hóa ớ mức cơ chất. Toàn bộ hai quá
t r ì n h t r ê n ta có th è th a m k h a o ứ H .2 .4 .
CH.OH

Glucose

H OH

ATP
Buòc 1 *

Hoat hoa nho

------ Buoe 2
photphoril hoa
ATP Đau tu 2ATP
Pha đnu tự
nang luong

OH H

Buớc 4

H C -O -I’ CHO
I I
c= o CH - OH
Buớc 5

Dihidroxiaxeton photphate
Cr\>c
Bước 6 [
2NDPH + 2H*

O r c - o-p tạo ra một hợp chất

I “siêu năng lượng’
1.3-biphotpho*glixerate CH — OH

CH2 — o—p
CÁC QUẢ TRÌNH TĐC VÀ MỎI TRƯỜNG NUÔI CÁY v s v CÔNG NGHIỆP 27

í 2 ATP Photphoril hóa ở

mức dộ cao
Bước 7

COOH —
I
3-photphotglyxerate CH - OH
I
C H ,— O'

Bước 8
Tạo ra hợp chất
cao năng

Pha phót sinh B ước 9

náng luong
COOH-
I
c — o —p Photphoenolpiruvat
II
CH,

Buóc 10 Photphoril hóa ỏ

2 ATP múc độ cơ chốt

co o -
I
c — o Piruvat
I
CH,

Hình 2.4: Các sán phàm triuig giun chủ yen vúu con dường đường phàn

2- Con dường pcntozophotphnt

Con đường pentozophotphat là COI1 đườỉig trao đối chất của tế bào tạo
ra ba dạng sán phấm chính:
• Tạo ra ATP
• Tạo ra coenzym dạng khứ
• Các chât có phân tử lượng nhó tham gia vào các quá trìn h tống hợp.
Trong đó đáng chú ý là tạo ra ribose là thành phần rấ t cần thiết cho
quá trình tổng hợp ADN. ARN, ATP, NAD* và NAD.P.
Con đường pentozophotphat qua hai giai đoíìn chuyên hóa:
• Giai đoạn oxy hóa: Giai đoạn này cô ba phàn ứng. Hai trong ba phàn
úlig cua chúng là quá trình oxy hóa. Các pháiì ứng này đều là quá trình khử
NADP+ thành NADH.
Phản ứng đầu tiên có sự tham gia cua enzym glucozo-6 -photphat
28 CHƯƠNG 2

dehydrogenase. Khi đó glucozo-photphat (G-6 -P) sẽ bị oxy hóa th àn h lacton.

Lacton tiếp tục bị thủy phân nhờ enzym lactonase đặc hiệu đê trở th àn h 6 -
photphogluconat (6 -PG). 6 -photpho-gluconate tiếp tục bị oxy hóa tạo ra
NADPH và pentose.
CO^ trong trường hợp này bi loại ra khỏi phản ứng. Quà trìn h uày
được thực hiện như sau:

0 = 0
I
H - c — OH
I
HO- c - H
!
H - c - OH
I
H — c ----------
I ỉ
c h 2o - p c h 2o - p

glucozo--6-photphate 6-Photphog!ucono-lacton

lactose

coo-

CH2OH H - c — OH
I NADP
1
c = o
o

HO -
I
1

I
1
H — c — OH
H - c - OH
Photphogluconate dehydrogenase
I 1
H - c - OH 1
I H - c - OH
CH..O - p 1
1
Ribulozo-5-photphate c h 2o - p
6-Photphoglucono-lacton
Hình 2.5: Pha oxy hóa
Kết thúc giai đoạn oxy hóa sẽ tạo ra hai mol NADPH, oxy hóa một
cacbon thành c o . và tống hợp một mol pentozo-photphat từ một niol
glucozo-6 'photphat.
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÒI TRƯỜNG NUÔI CẤY v s v CÕNG NGHIỆP 29

• Giai đoạn không oxy hóa:

Ribulozo-5-photphat tiếp tục được chuyển hóa đế tạo thành rìbozo-5-
photphat (Ri-5-P) nhờ enzym photpho-pentoseizomerase.

c h 2oh c h 2oh
I t
c = o c = o
I Photphopentozo epimerase J

H -C - OH HO - c — H
I I
H - C - O H H — c — OH
1 I
c h 2o - p c h 2o - p

Ribulozo-5-photphate Xilulozo-5-photphate

Cứ một mol X-5-P phản ứng với một moi R-5-P khi có sự xúc tác của
transketolase, sẽ tạo thành một triose photphat, GAP, một loại đường chứa
7 gốc cacbon, sechoheptulozo-7-photphat (S-7-P).

c h 2oh
I
c = o
*CH,OH Ọ
' o '
c=0 C -H li HO - c —H
I H — c — OH transkelolase c — H Ị
HO- c - H * : ' H —c —OH + H - C - OH
H - C - O H 7 L *
I , r u n - p H - C - C H
H - C - OH
I H —cì —O
_
H CH2° p
U 0I _ QU
Au
uh2u
r\ — ID t
' Glyxeraldehit-3-photphat Ỵ1
c h 2o - p CHzO - p
Xiluiozo-5-photphat Ribozo-5-photphat Sedoheptulozo-7-photphat

Hai sản phẩm mới tạo th à n h sẽ tác dụng với nhau nhờ enzym
transaldolase và tạo ra đường photphat chứa 4 gốc cacbon và m ột đường
photphat chứa 6 gốc cacbon.
30 CHƯƠNG 2

CH-OH CH2OH
I I
c = o 0 c = 0
11
I' 9II 1
c — H
c -

0
X
o
HO - H 1 H

1
1
C — H
I

0 -

0
X
1

1
I + 1
c - OH H c OH '

0 -
H - + — — H - c - OH

1
1

X
o
I »
H - c - OH CH20 - p 1 H - c- OH
I ch 2o —p
H — c — OH
I Eritrolzo-4-photphat _ . - . . . .
' ^ Fructozo-6-photphat
CH.O - p K
Kết quá phản ứng trên tạo ra một loại đường chứa 4 gốc cacbon, một
loại đường chứa 6 gốc cacbon.
Phản ứng nhờ transketolase tác động lên một phân tử X-5-P khác, khi
(ló chúng chuyển inột đoạn glicolaldehit sang E-4-P để tạo ra một sản phấm
chứa 6 gôc cacbon dó là GAP và F- 6 -P.
c h 2oh
I
c =
o
c h 2o h ỵ ỉ I
I 0 _ H C -H H O - C - H
c — o ị transketolase * Ị
I + H - C - OH - - H - c - OH + H — C — OH

H O - C - H h - Ộ - O H C H .O -P
I 1 _ G lixe ra!de hit-3p ho tp ha t I
H - c - OH CH,0 - p ^ H20 _ p
0 |~j Q p Fructozo-6-photphat

Con đường chuyèn hóa này dòi hói ba phân tứ pentozophotphat, trong
dó hai phân tử (lùng cho phàn ứng ciia transketoiaso đắư tiên và một p h â n
tứ cho phár. ứng thứ hai. Tóm tắ t toàỉi bộ quá tr u l l trên như sau:
3 glucozo 6-p h o tp h at + 6 N A D P *-------► 3 pentozo 5-photphat + 6 NADPH +
+ 6H + + 3 C 0 2

Đôi với vi sinh vật pentozophotphat có ý nghía rất quan trọng vì lì ó

thực hiện ba chức năng sau:
1 - Cung cap NADPH cho quá trình sinh tổn# hựp cđc sán phẩm khử
2 - Cung càp ribozo-5-P cho quá trình tổng hợp nucleotiđ và axịt nucleic
3- Tham gia quá trinh phím húy các đường pentose trong axit nucleic.
CAC QUA THINH TDC VÀ MOI TRUONG NUOf CÀY v s v CÓNG NGHIẺP 31

(\>ti d ù ittiỉị E u ttic r - D o iid o n tff

Dõi voi nỉnítiLí vi i !1ỈI vật k h ô n g có k h a n ã n g s i n h t ỏ n g h ợ p e n z v m G-
phof phofructokinasf s«‘ không thô thực hiộn coil (iườiiịc Embclon-Meyerhof
11»;* phai thực hic*n con iliíonu K»tnor-I)ou(!oroff. Các vi sinh vật thuộc nhóm
n;i\ chu you là Ithửníỉ vi sinh vật hióu khí trong (ló có các vi khuàn hiỏu
kill như Ỉ^CỊIÍỈOÌIÌI>nus,
Tluvi cun (luu II lí Kiitnor-Doudoroff. <ĩlucozo-(i-photphat hị o\y hóa thành
(>-pỉiol pho^luroL inv S;m (ló (ỉiíoV phân cat trực tiêp thành Ịĩlixeialđehit-3-
pilot Ị>hat và piruvat.
Tron" mrừttíí hựp lỉàv. piruvat (lược tạo thành trực tiỏp. (lo (ló có nhiều
bưỏc t;i</ ATI* bị bo quít. ThíM> CU11 (lường c h u y ê n h o a n ày, khi p h à u giai m ộ t
í^]Iict>st* chi tạo Ill’ll một phân ttí ATP từ một phán từ glucose. Sứ dĩ có hiện
lưộiiií nuy la vì ííluco/.o-G-photphat bị oxy hóa thành piruYMt trước khi bị
aldnluso piiiilầ giai.
l)i(Mn khác nơa EỊÌỨM con đường Entiu*r-I)rm<loroff và Kml)(l(Mi-Moyorh()f
1,1 XADPIÍ (lược t;»o r;i từ XADP chứ khíMiíí phiii !à NADH 1ừ XAD. ớ dây
NADIMI k'i linns' pilot phoril Kóíi cua XADIL NAI)* và dạng khứ NADM
thư. >11^ (lược s ứ ( lụ ng t r o n g các p h í i n ỚJ1£ t r a o (lôi c h à i p h á t s i n h r a A T P
côn \A l) P f và NADPII (lược sứ dụng trniìỊí các phan ứng sinh tổng hợp tạo
ra CỈÍC Ị)hân tứ cẩn thièt cho tê hào.
V ng hí a quan tnm<í nhất cua 0O11 d ườ n" này là tạo ra một CƯ chê t ống hợp
l i m X A D P I I và Cíit’ ch;Iĩ (*ũ h ã n có n a m góc* cacl mn (lung t r o n g các q u á t r ì n h
t-íii.ií hợp khi Iiliu câu cua ti* bao vổ các chat này lớn hơn nhu í‘ầu về ATP.
N A D P " có till* (lược t ạ o t‘í» t ừ N A D + th('() p h á n ứ n g sau:
KAIV + ATP ----- ►NADP* + ADP
M ặ t kh K\ hai Oiizym d ạ n g k h ử c ủ n g có t h ‘: c h u yó n h ỏ a từ d ạ n g n à y
sail" dạng khiíc thoo phán ứng:
NADPH + NAD+ NADP + NADH
* Sự cô đ ịn h CO -2 tự dưỡng
Vi sinh vật được chia ra ỉàm hai nhóm theo phiíơng thức dinh (lưừng:
vi sinh vật tự dưỡng và vi sinh vật dị dường.
- Các vi sinh vật thuộc nhóm dị dường phai iộ thuộc rât nhiều vào các
chất dinh dường có sẩn trong môi trường.
- Ngược lại các vi sinh vật tự dường hoàn toàn đáp ứng các nhu cẩu
dinh dưỡng cho mình bằng phương thức tự tổng hợp chât (linh (lưỡng từ
những chất vô cơ.
32 CHƯƠNG 2

Có rấ t nhiều vi sinh vật tự dường có thể tự thỏa mãn nhu cầu về cacbon
cho mình bằnh phương pháp tự cố định C02. Quá trình cố định C 0 2 có thể xảy
ra trong điều kiện hoàn toàn khồng có ánh sáng nhờ việc sử dụng nàng lượng
từ ATP và khả năng khử của NADPH, được tạo ra từ pha sáng khi tiến hành
quang hợp hoặc trong quá trình oxy hóa các hợp chất vô cơ.
Các cơ th ể sinh vật (thực vật và vi sinh vật) có khả nảng cô' định COy
chỉ có một con đường duy nhất. Con đường này được gọi là chu trình
Calvin.
ĩ- Các loại enzym trong chu trình Calvin
Các sinh vật tự dưỡng C 0 2 khác với các sinh vật khác là chúng có khẩ
nâng sinh tổng hợp hai loại enzym đặc biệt: enzym ribulose biphotphat
cacboxilase và enzym photphoribulokinase.
• Enzym ribulose biphotphat cacboxilase:

1 ,2,3-photphogiyxerat ATP (từ phản ứng ánh sáng)

r (36 cacbon) NADPH (từ phản ứng ánh sáng
hay dòng điện dự trữ)

6-ribulozo-1 -5-biphotphat
(30 cacbon) 1,2,3-biphotphoglyxerat

12 NADPH

. 6-ribulozo-5-photphat 12-glyxeratdehit-3-photphat

Fructozo-6-photphat
(6 cacbon)

ị
Tham gia vảo quá trinh
sinh tổng hợp

H ình 2.6: Chu trình Calvin

CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY vsv CÔNG NGHIỆP 33

Enzym này tham gia vào phản ứng đầu tiên của C 0 2 và
ribulozobiphotphat để tạo thành hai phân tử axit 3-photphoglixeric (PGA).
Một trong hai phân tử này chứa nguyên tử cacbon từ C 0 2.
PGA là sản phẩm trung gian đầu tiên có th ể xác định được trong quá
trìn h khử C 0 2. Nguyên tử cacbon có m ặt trong PGA có cùng mức độ oxy
hóa như khi nó có m ặt trong C 02.
Bước tiếp theo là sự khử PGA tới mức độ oxy hóa của hydratcacbon
(CH 20). Tuy nhiên, chỉ có một trong sô' các nguyên tử cacbon của GAP là
bắt nguồn từ C 02, còn hai nguyên tử kia lại b ắt nguồn từ ribulose
biphotphàt.
Các phản ứng khác trong chu trình Calvin đều bao gồm sự sắp xếp lại
để thu được các phân tử ribuỉose biphotphat mới, cùng với một sô" cacbon đi
vào sự tổng hợp tế bào mới.
• Enzym photphoribulokinase: Đây là enzym tham gia vào quá trìn h '
photphoril hóa ribulose-5-photphat với ATP.
2- Các phản ứng cơ bản trong chu trình Calvin
Trong chu trình Calvin, phân tử C 0 2 tham gia vào chu trình là 6 phân tứ.
Để sát nhập 6 phân tử C0 2 phải cần đến 6 phân tử ribose biphotphat. Các
phân tử này đóng vai trò như những chất nhận. Từ phản ứng này sẽ thu nhận
12 phân tử axit 3 -photphoglyxeric (có tổng sô" 36 nguyên tử cacbon). 12 phân tử
này sẽ dùng làm khung cacbon để tạo thành sáu phân tử ribose biphotphat mới
(trong tổng số 30 nguyên tử cacbon) và một phân tử hexose cho tổng hợp tế
bào. Sau đó xảy ra một loạt các phản ứng sắp xếp lại bao gồm các hợp chất
trung gian c 3, c 5, c 6 và c 7, cuối cùng cho ta sáu phân tử ribulozo-5-photphat.
Bước cuối cùng là quá trình photphoril hóa ribulose-ố-photphat với ATP nhờ
enzym photphoribulokinase để tạo thành ribulose biphotphat,
* Dinh dưỡng hydratcacbon và sự tạo th àn h sinh khối
Quá trìn h tạo ra sinh khôi của vi sinh vật là một quá trìn h rế t phức
tạp. Một phản ứng hay một chuỗi phản ứng không th ể tạo ra được sinh
khôi mà là rấ t nhiều phản ứng trong rấ t nhiều chuỗi phản ứng mới tạo nên
tổng thể vật chất trong tế bào, trong cơ th ể và như th ế mới gọi là sinh
khôi.
Tuy nhiên, trong nội dung này chúng tôi chỉ đề cập đến một lượng vật
chất chiếm tỷ lệ lởn n h ất trong tế bào đó là cacbon, để làm sáng tỏ vân đề
khi tham gia vào tổng thể vật chất của tế bào, hyđratcacbon sẽ đóng vai
trò và mức độ tham gia như th ế nào.
34 CHƯƠNG 2

Trong công nghệ sản xuất sinh khôi ở vi sinh vật, nấm men
Saccharomyces cerevisiae được ứng dụng rộng rãi và được sản xuất với sô"
lượng nhiều nhât. Trong đó, sản xuất sinh khối nấm men dùng trong công
nghệ sản xuất bánh mì chiếm một khôi lượng lớn nhất trong tổng sô' sinh
khôi nấm men đang sản xuất hiện nay trên th ế giới.
Công thức hóa học tổng quát của nấm men là:
C 39 2 1H 6 365O 20 70 N 5 9 7P 4 0 S 5

trong đó: 34,1% polysaccharit; 5,0% trehalose

10,8% axit nucleic và các nucleotit; 4,5% photpholipit
2,5% triglixerit; 1,0% sterol; 3,1% tro; 39,0% protein.
Như vậy tổng sô" hydratcacbon chiếm khoảng 39,1% tổng vật chất khô
của tế bào. Trong đó các polysaccharit chiếm khoảng 34,1% và trehalose
chiếm khoảng 5%.
H àm lượng protein chiếm 39% bao gồm cả các axit amin nằm ở trạng
thái dự trữ.
• Các thí nghiệm của các nhà khoa học cho thấy sự tạo thành
polysaccharit ở nấm men theo phương trình sau:
616.7 glucose + 1233,4 ATP + 616,7 H20 ------► (C6H10O5)616,7 + 1233,4 ADP
+ 1233,4 Pvc
584.8 g lucose + 877,2 ATP + 584,8 H20 ------► 292,4 C 12H22OH + 877,2 ADP
+ 877,2 Pvc
Ghi chú:
• Số lượng ghi trong công thức trên được tính bằng mmol.
• VC: vô cơ.
• Công thức tạo th àn h protein được tính dựa trên công thức chung của
protein C4,28H9,63O2,5iNlf30S(),02 như sau:
865.8 glucose + 2968,6 ATP + 2435,3 NAD + 1334,6 NADPH2 + 1205,2 NH3
+ 0,01 H2 SO4 + 503,2 C 0 2 + 0,6 H20 ----- ► 100g protein + 43,4 HCOOH +
2968,6 ADP + 2968,6 p vc + 2435,3 NAD H2+ 1334,6 NADP + 1210,7 H20
Ghi chú: CO2 xuất hiện ở vế trá i phương trìn h là do phản ứng từ
glucose đên axit amin thuộc các họ aspactat và glutam at xảy ra qua quá
trìn h phản ứng piruvat cacboxylase.
• Công thức tạo thành các axit nucleic:
Nucleic trung bình có dạng: C9,47H13,70O8,07N3.63P1t0
Trọng lượng phân tử: 338,51.
CÁC QUÁ TRÌNH TDC VÀ MỎI TRƯỜNG NUÔI CẤY v s v CÔNG NGHIỆP 35

Phản ứng tạo axit nucleic từ glucose biêu diễn như sau:
468.0 glucose + HCOOH + 3277,2 ATP + 770,0 NAD + 385.1 NADPH? + 1133,0 NH 3
+ 312,0 C 0 2 + 1135.3 H20 ------ ► 1 0 0 g A R N + 3277,2 ADP + 2965.2 p vc
+ 7 7 0 ,0 N AD H 2 + 385.1 N A D P + 3 1 2 ,0 C 0 2

• Sự tạo thành các chât béo trung tính từ glucose:

Công thức tồng quát của chất béo trung tính:

Trọng lượng phân tử: 751,31.

Sự tạo thành các chất béo trung tính như sau:
1552,4 glucose + 253,0 ADP + 253,0 Pvc + Ĩ830.1 NAD + 5452,1 NADPH 2
+ 254.5 0 2 ------ ► 100g triglixerit + 253 ATP + 2830,1NADH2 +
+ 5452,1 NADP + 2978,3 CO 2 + 3360,8 H20
• Sự tạo thành photpholipit từ glucose:
Công thức trung bình của photpholipit:

C39,52H75.63O9.22N(>,79Pi .0
Trọng lượng phân tử: 751,31.
Sự tạo thành photpholipit.:
1217,9 gỉucose + 188,9 HCOOH + 917,2 ATP + 4168,9 NAD + 4248,6 NADPH 2 +
104,5 NH 3 + 205,8 0 2 + 63,0 H -----► tOOg photpholopit + 917,2 ADP + 784,1 Pvc
+ 4168,9 NAD H2 + 4248 NADP + 2236,1 CO 2 + 2013.0 H20
• Phương trình biểu diễn sự sinh trưởng của nấm men từ sự tiêu hóa glucose:
Từ tấ t cả các phương trình đã trình bày trên ta có thè rút ra một
phương trình tổng quát quá trình phát triẻ 11 của nấm men từ glucose:
801 glucose + 721,0 O2 ------ ► 100g sinh khôi + 761 ATP + 655 CO 2
• Nguồn dinh dưỡng cacbon
Các chất hữu cơ dùng làm nguồn dinh dưỡng cacbon cho sự phát triển
của vi sinh vật bao gồm những châ^t sau:
1 - Các nguyên liệu đườiig như m ật rả, các loại nước trái cày, các loại
đường đơn, đường kép.
2- Các nguyên liệu chứa tinh bột. Đối với các nguyên liệu chứa tinh
bột, vi sinh vật muốn tiến hành đồng hóa phải có cơ chế tạo ra enzym
amylase. Tinh bột là hợp chất cao phân tử, vi sinh vật không sử dụng trực
tiếp được. Muốn đồng hóa được tinh bột bắt buộc phải qua giai đoạn thủy
phân tinh bột thành các loại đưòng (tùy mức độ thủy phân). Muôn vậy vi
36 CHƯƠNG 2

sinh vật phải tổng hợp được hệ enzym amylase. Hệ enzym này phải thay
phiên nhau phân hủy tinh bột đề tạo thành sản phẩm cuôi cùng là đường
glucose. Từ đó glucose sẽ đi vào các chu trin h chuyên hóa hoặc các con
đường chuyến hóa như trình bày ở phần trên.
Sự phân hủy tinh bột thường xảy ra ớ ngoài tê bào vi sinh vật. Quá
trìn h này gọi là quá trìn h dị hóa ngoài tẽ bào. Quá trìn h này được thực
hiện bơi enzym ngoại bào. Sau đó sản phẩm có trọng lượng phân tứ nhò
hơn sẽ xâm nhập vào tế bào và sẽ tham gia vào các quá trình trao đối chât
nội bào. Quá trình này được trìn h bày trong H.2.7:

Hình 2.7: Quá trình chuyển hóa tinh bột nhờ vi sinh vật
Tuy nhiên không phải tấ t cả các vi sinh vậtvđều có khả năng đồng
hóa tin h bột mà chỉ sô nào có khả năng sinh tổng hợp enzym a và p
amylase ngoại bào mới có khả năng thủy phân tinh bột đến glucose và khi
đó mới có khả năng chuyển hóa tinh bột.
3- Nguồn nguyên liệu chứa các hợp chất cellulose:
Ngoại trừ bông vải ra, cellulose trong tự nhiên thường nằm trong hỗn
hợp với hemicellulose, pectin hoặc lignin. Các hợp chất này vì th ế thường
có những tên gọi tương ứng là hợp chất pectinocellulose hay hợp chất
lignocellulose. Do đó việc phân hủy các hợp chất này trở nên rấ t khó khăn
và phức tạp.
CÁC QUÁ TRÌNH TDC VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY v s v CÔNG NGHIỆP 37

Các chât pectin thường dẻ phân giải hơn các chất lignin. Trong sinh iý
của thực vật, lignin thường không đóng vai írò gì th ậ t quan trọng mà
chúng giông như pectin, gán các bó sợi cellulose th àn h một khôi
lignocellulose hay ppctinocellulose.
Các chất hemicellulose được câu tạo bới các gốc gỉucose. Nhưng sô
lượng của chúng rât ít, ít hơn rất nhiều so với sô gôc glucose có trong
cellulose. Ngoài ra chúng còn chứa manose và galactose.
Riêng cellulose lại có nhừng cấu tạo và tính chất rấ t đặc biệt. Gốc
glucose trong câu trúc của cellulose thường tồn tại ờ cấu trúc khòng gian
dạng ghế bành. Có nghĩa là glucose sè không phân bố theo một m ặt phắng
nhất định mà phân bỏ theo không gian đa chiều. Chính vì th ế chúng tạo ra
sự vững chắc cho cellulose. Troag diều kiện tự nhiên, cellulose tồn tại ơ hai
dạng: dạng kết tinh và dạng vô định hình. Dạng kết tinh là dạng bổn
vừng, ớ đó các sợi cellulose được uôi kết với nhau theo kiếu đan chéo và tạo
nên sức bền cơ học cao. Các loại cây lâu năm thường chứa nhiều cellulose
dạng kết tinh, còn các loại cây ngắn hạn í loại thảo mộc) thì ngược lại chứa
nhiều cellulose dạng vô định hình. Chính vì th ế trong điều kiện tự nhién,
cellulose rấ t khó bị phá hủy. Cellulose chỉ bị phá húy bởi vi sinh vật trong
những điều kiện thích hợp. Một khó khăn quan trọng nừa Irong quá trình
phân giải cellulose là quá trình phán giải này đòi hỏi rất nhiều loại enzym
khác nhau (pectinase, Ịignase, hemicellulase, cellulase). Riéng enzym
cellulase cũng tồn tại hàng chục loại khác nhau. Một loài vi sinh vật không
có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp một loạt các enzym như vậy. Một
loài vi sinh vật chi có thê tống hựp một trong sô' đó. Vì thế, trong thiên
nhiên các vi sinh vật phân giải các hợp chât chứa cellulose thường cộng
sinh với nhau, tạo nên Iihừng phản ứng trong chuỗi phản ứng p h â n giải
chúng. Nếu ở nơi nào dó có đầy đủ các vi sinh vật có khả nãng sinh tổng
hợp các loại enzym như trình bày ỡ trên thì quá trình phản giải các hợp
chất chứa cellulose sẽ xây ra rất nhanh. Ngựợc lại, nơi nào thiếu một vài
loại enzym trên, quá trình xảy ra râ t chậm.
Cơ chế chuyển hóa cùa cellulose được Reese đưa ra như sơ đồ sau:

Endoglucanse
Oligome
Cellobiohydrase
Cellulose Cellulose Cellobiose
kết tinh biến tính
Ị Celtobiase
Glucose

Hình 2.8: Sự chuyển hóa cellulose

38 CHƯƠNG 2

Toàn bộ quá trìn h chuyển hóa các hợp chất chứa cellulose được biếu
diễn trong H.2.9:

Hình 2.9: Quá trinh chuyến hỏa các hợp chất chứa cdluloHC ở vị sinh vật
2- Nguồn dinh dưỡng nitơ
Nitơ tham gia vào thành phần của rất nhiều vật chất có trong tỏ bào như:
• Protein
• Enzym
• Axit nucleic
• Các hợp chất protein với các chất khác
Đặc biệt chúng có nhiều ơ protein. T ất cả các protein đều được cấu tạo
từ các axit am in. Các axit amin được tạo thành do quá trình trao đổi cacbon
và nitơ. Quá trình tổng hợp ra axit amin rất phức tạp. Tuy nhiên các nhà
khoa học đưa chúng vào hai loại phản ứng:
• Phản ứng anìin hóa.
• Phản ứng chuyền amin.
1- Phản ứng ainin hóa thường rấ t phức tạp và chứng phái trái qua hai
giai đoạn:
• Giai đoạn đầu, các iminoaxit được tạo thành nhỡ liên kết giữa axit
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY v s v CÔNG NGHIỆP 39

piruvit với NH 3.
• Giai đoạn kế tiếp, có sự tham gia của enzym dehydrogenase. Ví dụ:
H 3 C - C 0 - COOH + NH3 ---- ► H3C — c = (NH) — COOH + OH2
axit piruvic Ị NADH (+ H )
T alanin - dehydrogenase
H3C -C H -C O O H
I
nh2
alanin

2- Phản ứng chuyển amin xảy ra ở rấ t nhiều trường hợp. Ví dụ:

COOH COOH
I COOH ị
CH - NH2 ĩ ' COOH

Ị , * 0 = £ * P " .
ỆoỔh R ÌOOH R
axit aspartic xetoaxit axjỊ oxaloaxetic axit amin

Các axit amin được tạo ra sẽ được các tế bào tống hợp ra các loại
protein của tế bào.
Các nguồn nitơ được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật thường ở hai dạng:
• Nguồn hữu cơ: nguồn này rấ t phong phú vì nitơ có ở hầu hết các cơ
quan của thực vật và động vật.
• Nguồn vô cơ: không phải chất vô cơ nào chứa nitơ cũng dùng được
cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Khả năng sử dụng các nguồn nitơ vô cơ
ở vi sinh vật rấ t khác nhau. Riêng nitơ trong không khí tuy có lượng rất
lớn nhưng rấ t khó được vi sinh vật đồng hóa; chỉ có Azotobacter và
Rhizobium mới có khả năng cố định dạng nitơ này.
Nguồn nitơ hữu cơ được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật chủ yếu là
protein. Các protein thường có trọng lượng phân tử lượng lớn, rấ t khó xâm
nhập vào tế bào của vi sinh vật. Muôn sử dụng được nguồn nitơ này, vi sinh
vật phải tiến hành phân giải chúng thành các axit amin. Tuy nhiên các
axit amin ồ ngoài tế bào vi sinh vật (ở môi trường nuôi cấy) thường không
được vi sinh vật sử dụng trực tiếp mà phải trả i qua một trong hai giai đoạn
chuyển hóa chúng thành NH 3 hoặc phải tiến hành khử cacboxil.
Quá trìn h khử amin thường xảy ra trong điều kiện hiếu khí. Khi đổ
NH 3 sẽ được tách khỏi axit amin nhờ enzym dezaminase.
Enzym dezaminase hoạt động m ạnh ờ pH 6,5 - 7,5. Như vậy chỉ có
những vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym dezaminase mới có
khả năng sử dụng nitơ từ axit amin. Nói chung các vi sinh vật đều có khả
40 CHƯƠNG 2

năng sinh tổng hợp enzym này.

Khi NH 3 được tạo thành sẽ xâm nhập vào tế bào và tiến hành quá
trìn h tổng hợp axit amin trong tế bào như phần trìn h bày trên.
Quá trìn h khử cacboxil chỉ xảy ra khi trong môi trường pH chuyển
sang vùng axit. Khi đó các axit amin sẽ bị khử cacboxil và tạo thành các
amin. Quá trìn h khử này thường tạo ra các chất độc. Ví dụ, khi lyzin bị
khử sẽ tạo ra độc tố cadaverin, khi ocnitin bị khử sẽ tạo ra độc tô" putrexin.

Hình 2.10: Quá trình chuyển hóa nguồn nitơ hữu cơ ở vi sinh vật
Quá trìn h khử amin được thực hiện theo phản ứng sau:
dezaminase
R -C H -C O O H + 02 - - - R -C - C O O H + NH,
I I 3
nh2 0

Phản ứng này thường xảy ra trong môi trường, do đó, việc sử dụng các
axit amin thường rấ t dề dàng.
Nguồn nítơ vô cơ được sử đụng nhiều loại khác nhau, trong đó, urê, các
loại n itrat, nitric, các muối amon được sử dụng nhiều hơn cả.
Ưrê là chất vô cơ chứa ni tơ được sử dụng khá rộng râi. Ưrê rấ t dề tan
trong nước, và rấ t dề bị phân hủy bồi enzym urease.
(NH 2)2C0 + h 20 -urease ► 2 NH 3 + co2
Trong nuôi cấy vi sinh vật người ta sử dụng urê như là nguồn nitơ và
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY v s v CÔNG NGHIỆP 41

như là chát điều chỉnh pH.

Các loại nitơ rat rấ t khó được vi sinh vật sử dụng. Vi sinh vật không sử
dụng trực tiếp nguồn nitơ này.
H N O a---- ► H N 0 2 ---- ► (HNO)v ---- ► NH2OH---- ►NH:,
Riêng đôi với các muối amon, các vi sinh vật đều có khá năng sử dụng
chúng rấ t dễ dàng. Tuy nhiên vi sinh vật cũng không thế sử dụng nguyên
thế các muôi amon. Các muôi amon phải được chuyên thành NH.Ị. NH 3 sau
đó xâm nhập vào tế bào và thực hiện quá trìn h tạo ra axit amin.

Hình 2.11: Quá trình chuyển hóa nguồn Tíitơ vô cơ ở vỉ sinh vật
3- Nguồn dinh dưỡng khoáng
Các chất khoáng có vai trò quan trọng trong quá trìn h trao đổi chát ở
vi sinh vật.
• Các chất khoáng tham gia vào quá trìn h vận chuyển vật chất qua
màng và thành của tế bào vi sinh vật (ví dụ, như các polyphotphat tham
gia quá trìn h vận chuyển glucose qua màng).
• Một số chất khoáng tham gia vào th àn h phần cấu tạo của protein,
enzym của vi sinh vật.
• Một sô' chất khoáng tham gia vào quá trình điều hòa pH của môi
trường nuôi cấy vi sinh vật.
Các chất khoáng được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật có thể là
những chât khoáng ở dạng hợp chât, đơn chât; có th ể ở dạng vô cơ hay ở
42 CHƯƠNG 2

hợp chất hữu cơ.

• Một số chất khoáng tham gia vào các hợp chất cao nàng lượng và chất có
hoạt tính sinh học.
Bảng 2.1: N hu cầu của vi sinh vật đối với một số loại muối khoáng
Nồng ổộ cẩn thỉết (g//)
Loại muối khoáng
Đối vđỉ vi khuấn Đối với nấm và xạ khuẩn

k 2h p o 4 0 ,2 -0 ,5 1 -2

k h 2p o 4 0 ,2 -0 ,5 1 -2

PO

*Ư1
ro

1
1
M gS 04.7H20 0

0
MgS0<.4H20 0,005 - 0,050 0 ,0 2 - 0 ,1 0

Na2M o04 0,001 - 0,005 0,001 -0 ,0 0 2

ZnS 04.7H20 0 ,0 2 - 0 ,1 0

CoC)? 0,03 0,05

CaCI2 0,01 - 0 ,0 3 0 ,0 2 - 0 ,1 0

CaSƠ4 0,001 - 0,003 0,001 - 0,050

a) Nguồn dinh dường photpho: Photpho tham gia vào thành phần các
hợp chát cao năng lượng (ATP, ADP, AMP), thành phần của axit nucleic
(AND và ARN), tham gia vào các hợp châ't với lipit, với protein.
Vai trò quan trọng của photpho chính là ở liên kết giàu năng lượng
-P-O-P- trong polyphotphat.
Các polyphotphat chia làm hai nhóm:
• Nhóm hòa tan trong axit
• Nhóm không hòa tan trong axit.
Trong tế bào vi sinh vật, nhóm hòa tan trong axit thường ở trạn g thái
tự do, không liên kêt với một hợp chất nào. Trong phân tử nhóm này chứa
từ 3 - 25 gô'c photphat.
Nhóm thứ hai là những phức chất polyphotphat nucleic hoặc là các
phức chất với thành phần khác của tế bào như protein. Các polyphotphat
chứa nhiều năng lượng giống như ATP. Polyphotphat có thể chuyển năng
lượng cho ATP và ngược lại theo phương trìn h sau:
ADP + ( PO 3 )n ADP + ( PO 3 )n+l
Ngoài chức năng cung cấp năng lượng ra, các polyphotphat còn tham
gia vận chuyển đường glucose. Trong trường hợp này polyphotphat sẽ
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY v/sv/ CÔNG NGHIỆP 43

chuyền gốc photphat cho đường glucose. Từ đó glucose sẽ biến đôi theo con
đường photphoric.
Các hợp chât polyphotphat không hòa tan trong axit thường được sử
dụng đề tống hợp protein và axit nucleic. Tê bào sứ dụng polyphotphat tan
và không tan trong axit chỉ ở giai đoạn phát triển. Khi sự p hát triển của vi
sinh vật ở trạn g thái cân bằng thì quá trình này dừng lại. Sự tồn tại hai
dạng polyphotphat hòa tan và không hòa tan trong axit thường không ổn
định ơ các tế bào vi sinh vật. M ặt khác tỷ lệ giữa hai loại polyphotphat này
trong tế bào cũng rấ t dao động và hoàn toàn phụ thuộc vào điều kiện nuôi
cấy. Trong mỗi điều kiện khác nhau, enzym (ịepolymease polyphotphat hoạt
động với mức độ hoàn toàn khác nhau.
Trong quá trình nuôi cây, người ta thường sử dụng photpho ở dạng hừu
cơ và photpho ở dạng vô cơ. Vi sinh vật sử dụng râ't mạnh dạng photpho
hòa tan, còn dạng photpho không hòa tan vi sinh vật ít sử dụng hoặc
không sử dụng.
Số lượng photpho trong môi trường có ảnh hưởng rấ t lớn đến sự phát
triển của vi sinh vật. Nếu số lượng quá cao, vi sinh vật khó phát triển, nếu
ít quá sè không đủ cho quá trình trao đổi chất và như vậy sẽ ảnh hưởng rât
lớn đến sự đồng hóa các hydratcacbon.
b) Nguồn các chất khoáng khác: Các chát khoáng khác có th ể tồn tại
tự 'lo trong tế bào chât và cũng có thế tồn tại trong các hợp chât và trong
các enzym. Vai trò của các chất khoáng như magie, natri, sắt, nhôm, kali,
líti, nubidi, mangan, chì... rấ t khác nhau. Nhìn chung chứng đóng nhừng vai
trò quan trọng sau:
• C hất khoáng làm thay đổi trạn g thái keo của tế bào chất. Dưới tác
dụng của chúng, trạng thái keo trong bề m ặt màng, thành tê bào luôn thay
đổi và vì vậy có ảnh hưởng rấ t lđn đên hoạt động của enzym.
• Chất khoáng làm thay đổi tính thẩm thâu của màng tế bào, làm
tăng nhanh hoặc làm giảm mức độ vận chuyển vật chất qua màng tế bào.
• Các kim loại thường là những chất hoạt hóa enzym, do chúng tham
gia vào cấu trúc phân tử của enzym. Các enzym có sự tham gia của kim loại
được gọi là metaloenzym. Để thực hiện chức năng này, các cation kim loại
tham gia cụ th ể nhừng vấn đề sau:
- Kim loại là thành phần trung tâm hoạt động của enzym.
- Kim loại làm ổn định phân tử enzym, tăng khả năng xúc tác của
enzym
44 CHƯƠNG 2

- Kim loại tác dụng lên cơ chất, làm thay đổi cấu trúc điện tử và làm
tản g khả năng tiếp xức với enzym, từ đó làm tăng phản ứng
- Kim loại làm tăng sự kết hợp giữa coenzym và apoenzym
- Kim loại thực hiện chức năng cầu nối giữa enzym và cơ chất đê tạo
th à n h các hợp chất trung gian
Nhu cầu về các chất khoáng khác nhau ở các vi sinh vật rất khác
nhau. Ta có thể tham khảo ở bảng 2-1

2.2 MỘT số NGUYỀN LIỆU THƯỜNG Được DÙNG TRONG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

2.2.1 Nước
1-Yêu cầu chất lượng nước
Nước là th àn h phần cơ bản n hất và thường được sử dụng với số lượng
rấ t nhiều trong nuôi cấy vi sinh vật. Do đó, chất iượng nước phải được bảo
đảm đê không xảy ra những phản ứng hóa học khi tiến hành lên men hoặc
không đê xảy ra những tác động của vi sinh vật lạ xâm nhập từ nước vào
quá trình lên men. Chất lượng nước phái được xem xét ở ba chỉ số:
- Độ cứng.
- Khả nàng oxy hóa
- Vi sinh vật, đặc biệt là những vi sinh vật gây bệnh
• Độ cứng của nước được thể hiện bằng sự có m ặt của ion Ca++ và M Ị++
có trong nước. Muôi cacbonat, cúa hai ion này biểu hiện độ cứng tạm thời.
Còn các ion khác như ion C l, S 0 4 NO.) là biểu hiện độ cứng vĩnh cửu.
Độ cứng của nước được tính bằng mg đương iưạng trong 1/ nước,
lm g đương lượng tương đương 20,04mg Ca*2 hoặc 12,16 mg Mg*2/l nước
lm g đương lượng/llít tương đương 2 ,8 °, từ đó suy ra:
1 ° tương đương 0,35663 mg đương lượng
Nước được dùng trong lên men phải có độ cứng chung khôag quá 7mg
đương lượng.
• Độ oxy hóa của nước cho biết mức độ nhiềm bẩn củạ nước bởi các
chất hữu cơ. Chỉ số này được biểu hiện bằng mg c y iít.
• Chỉ sô về vi sinh vật là một chỉ 30 quan trọng, nó biểu hiện sự
nhiềm bẩn sinh học. Nước chứa nhiều vi sinh vật sè không được sử dụng
trong các quá trình lên men (nhất là các quá trìn h lên men không qua
th an h trùng môi trường). Chỉ tiêu vi sính vật trong nước dùng trong quá
trình lên men được xác định như sau:
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VẢ Mỏi TRƯỜNG NUÔI CẤY vsv CÔNG NGHIỆP 45

- Tổng số vi sinh vật hiếu khí: < 1000 tế bào/lít.

- Chuẩn độ Coli (m/): không quá 300
- Chỉ sô' Coli (tb//>: không quá 3
Ngoài ra còn một sô' chỉ tiêu quan trọng khác cần phải xác định là:
- Cặn khô: 1000 mg/ỉ
- Cặn sunfat: 500 mg//
• Cặn clorua: 350 mg/l
2-Những phương pháp xử lý nước dùng trong công nghệ vi sinh vật
• Nước dùng trong các nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu kỹ thuật ở các
phòng thí nghiệm thường đã qua chưng cất. Nước chưng cất đảm bảo tuyệt
đôi về chất lượng hóa học cũng như chất lượng vi sinh vật.
• Nước dừng trong các quá trình lên men theo qui mô công nghiệp
phải đảm bảo đúng tiêu chuẩn nước uống. Nước này phải không có màu,
mùi, vị lạ, không chứa kim loại nặng (thủy ngân, bari, chì ...) và phải đảm
bào đúng các tiêu chuẩn trình bày ở phần trên. Để đảm bảo đúng những
yêu cầu đã ghi trên, nước bắt buộc phải qua giai đoạn xử lý.
• Hiện nay phương pháp xử lý nước bằng cột trao đôi ion được sử dụng
rộng rãi vì chúng có nhiều ưu điểm.
Về lý thuyết, phương pháp này làm sạch tấ t cả các loại muôi vô cơ
trong nước. Các loại muối sẽ được lọc qua lớp cation, sau đó được lọc qua
anionit.
Trong xử lý nước hiện nay người ta sử dụng ba loại cation:
- N atri, ký hiệu là NaR.
- Hydro, ký hiệu là HR.
- Amon, ký hiệu là NH 4R.
Trong đó R là gốc cation không tan trong nước.
Nếu sử dụng n atri cationit, phản ứng sẽ xảy ra như sau:
Ca(HCO ;ì)2 + 2 NaR = CaR 2 + 2N aHC0 3
Mg(HC0 3)2 + 2NaR = MgR2 + 2NaHC0 3
CaCl2 + 2NaR = CaR 2 + 2NaCl
Nếu sử dụng hydrocationit, phản ứng sẽ xảy ra như sau:
Ca(HC0 3)2 + 2 HR = CaR 2 + 2C0 2 + H20
Mg(HC03>2 + 2 HR = MgR2 + 2C 0 2 + H20
CaCl2 + 2HR = CaR 2 + HC1
46 CHƯƠNG 2

Nếu sử dụng amon cationit phản ứng sẽ xảy ra như sau:

Ca(HCO ,)2 + 2 NH 4R = CaR 2 + 2 NH 4HCO;Ị
Mg(HCO,)‘, + 2 NH,R = MgR2 + 2NH 4HCO.,
CaCl, + 2NH„R = CaR, + 2 NH 4CI
Có một sô' điếm khác biệt khi sử đụng các loại cationit trên cần hết
sức lưu ý:
- Khi dùng NaR^, toàn bộ độ cứng sẽ được khử nhưng độ kiềm trong
nước sè thay đối.
- Khi dùng HRv, độ cứng và độ kiềm được khử nhưng sè tạo th àn h các
axit trong nước.
- Nếu dùng NH 4R, độ cứng giảm đi nhưng các muối amon tạo ra sẽ
biến thành NH;i theo phản ứng:
NH 4CI = NH.-Í + HC1
NH;i dược tạo th àn h khi tiếp xúc với oxy sè dẫn đến sự ăn mòn kim loại.
Do đó, trong thực tế, người ta thường sử dụng các phương pháp phối
hợp đê hạn chế những nhược điểm của từng phương pháp.
Trong quá trình lọc, lượng cation sẽ giảm. Đế phục hồi các cationit
người ta thường tiến hành quá trình hoàn nguyên cationit.
Đế hoàn nguyên các cationit người ta sử dụng các chất có khả năng
cung cấp cation. Ví dụ:
- Đế hoàn nguyên NaR 2 người ta sử dụng NaCl.
- Để hoàn nguyên HR 2 người ta sử dụng H 2SO4 hay HCi.
- Để hoàn nguyên NH 4R người ta dùng dung dịch muôi amon.
Các phản ứng hoàn nguyên xảy ra như sau:
CaR 2 +2NaCl = 2NaR + CaCl2
MgR2 +2NaCl = 2NaR + MgCl2
CaCl2 +H 2S 0 4 = 2HR + CaSƠ 4
MgRa +H 2S 0 4 = 2HR + MgS0 4
CaR 2 +2NH 4CI = 2NH 4R + CaCl2
Sau đó người ta rửa các cation này.
Để làm mềm nước người ta thường sử dụng các h ạ t nhựa trao đổi ion.
Đây là những polyme hữu cơ bậc cao không tan trong nước mà chứng chỉ có
khả nâng trương trong nước. H ạt nhựa làm mềm nước thường có kích thước
nhỏ (trung bình 0,5 - 1,5 mm). Để làm mềm nưởc người ta thường dùng ion
n a tri hay ion hydro.
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÓI TRƯỜNG NUÔI CẤY vsv CỒNG NGHIỆP 47

Sau khi làm mềm nước, h ạt nhựa được hoàn nguyên (còn gọi là quá
trìn h tái sinh). Người ta tái sinh chúng bàng cách cho dung dịch nước muôi
(đối với n atri cationit), hoặc axit (đối với hydro cationit) và dung dịch
NaOH (đôi với anionit). Kết quả sẽ phục hồi khả năng trao đổi ion. Quá
trình trên được xảy ra như các phản ứng sau:
(Ca, Mg)R +2NaCl = Na2R + (Ca, Mg)Cl2
(Ca, Mg)R +2HC1 = H2R + (Ca, Mg)Cl2
(H C 03\ S O /2, CHA +NaOH = AOH + (HCO:ỉ, SO 4 2, C1 )Na
trong đó: A - là gốc của anionit không tan trong nước.
Các h ạ t nhựa trao đổĩ ion được nhồi vào trong các cột hình trụ thẳng
dứng có độ đày khoảng 1,5 - 2,0 m. Khi tiến hành xử lý nước, người ta thực
hiện các bước nhự sau:
- Đô nước vào cột trao đổi ion.
- Đưa dung dịch rửa chảy từ dưới lên để làm tơi xốp khối nhựa.
- Tiến hành quá trình hoàn nguyên nhựa.
- Sau đó rửa sạch và tiến hành làm sạch nước.
2.2.2 M ật £Ỉ (hay rí đường)
Mật rỉ là thứ liệu trong công nghệ sản xuất đường từ cây mía hay củ
cải đường. Trước đây m ật rỉ ít được sử dụng trong công nghệ vi sinh. Sau
này người ta thấy m ật rỉ có râ't nhiều ưu điểm đế tạo môi trường nuôi cấy
vi sinh vật. Những đặc tính quan trọng phù hợp với quá trìn h lên men của
m ật rỉ bao gồm:
- Chứa hàm iượng đường cao.
- Ngoài đường saccharose ra còn chứa rấ t nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các
chất thuộc vitamin và các chất kích thích sinh trưởng, trong đó có vitam in
H (Biotin) là chất kích thích sinh trưởng đối với phần lớn nấm men.
- Tuy nhiên, rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp cho quá
trình lên men. Muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men đòi hỏi phải có
các quá trình xử lý thích hợp. Các đặc điểm cần lưu ý ở m ật rỉ bao gồm:
• Rỉ đường thường có màu nâu sẫm. Màu này khó bị phá hủy trong
quá trình lên men. Sau lên men chúng sẽ bám vào sinh khối vi sinh vật và
bám vào sản phẩm. Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thường
rấ t tốn kém và rấ t khó khản. Giữa hai loại mật rỉ, loại m ật rĩ từ cây mía
có màu sẫm hơn màu m ật rỉ nhận từ sản xuất đường củ cải. Do đó ở một sô"
nước chĩ cổ m ật rỉ từ mía, người ta phải trộn thêm m ật rỉ từ củ cải hoặc
48 CHƯƠNG 2

phải xử lý trước khi tiến hành quá trình lên men.

• Hàm lượng đường khá cao (thường nằm trong khoảng 40-50%).
Lượng đường này chủ yếu là saccharose nẽn khi tiến hành lên men phải
pha loãng tới nồng độ thích hợp.
• Đặc điểm gây khó khăn lớn n h ất cho quá trìn h lên men là hệ keo
trong m ật rỉ. Keo càng nhiều, khả năng hòa tan của oxy càng kém và khả
năng trao đổi chất cua vi sinh vật càng kém. Do đó công việc quan trọng
n h ấ t khi sử dụng m ật rí là phải phá hệ keo này.
• Vì rỉ đường là chất dinh dưỡng khá lý tưởng nên chúng rấ t dễ bị vi
sính vật xâm nhập và phát triển. Như vậy chất lượng m ật rỉ cũng dễ bị
thay đổi theo thời gian bảo quản.
T hành phần hóa học và một số tính chất quan trọng của hai loại mật
rỉ được trìn h bày ở bảng 2 .2 .
Bảng 2 .2 : Thành phần hóa học và tính chất của hai loại mật rỉ
Hàm lượng mật rỉ
STT Thảnh phẩn Đơn vị tính
Củ cài Đường mía

1 Đưởng tổng số % 4 8 -5 2 4 8 -5 6

2 Chất hữu cơ khác % 12 - 17 9 , 0 - 12

3 Protein (Nx6,25) % 6 ,0 - 1 0 2 -4
4 K % 2 , 0 - 7 ,0 1,5 - 5 , 0

5 Ca % 0,1 - 0 , 5
Õ

Ó
co
I

6 Mg % 0,09 „ 0,06
ợ>
ro

7 p % 0,02-0,07
0
1

8 Biotin (vit. H) mg/kg 0 ,0 2 - 0 ,1 5 1 ,0 - 3 .0

9 Axit pantotenic mg/kg 5 0 -1 1 0 15-55

10 Inozitol mg/kg 5000 - 8000 2500-6000

11 Tiamin mg/kg 1,3 1,8

Để giải quyết những đặc điểm không thuận lợi có trong m ật rỉ đôi vđi
quá trìn h lên men, người ta thường sử dụng axit sunfuric đậm đặc với lượng
3,5 kg cho một tấ n m ật rỉ. Khi cho H 2SO4 vào m ật rỉ, ta có ba cách thực
hiện quá trìn h xử lý này:
• Cách thứ nhắt: Khi cho 3,5kg H 2S 0 4 vào một tấn m ật rỉ, người ta khuấy
đều ở nhiệt độ thường trong thời gian 24h, sau đó ly tâm thu dịch trong.
• Cách thứ hai: Khi cho 3,5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta đun
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÕI TRƯỜNG NUÔI CẤY v s v CÔNG NGHIỆP 49

toàn bộ lên 85°c và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch trong.
• Cách thứ bơ: Cho H^S0 4 đến khi pH của m ật rỉ đạt được giá trị là 4 ,
người ta đun nóng đến 120 - 125"C trong một phút để các chất vô cơ kết
tủa, sau đó ly tâm thu dịch trong.
Thực hiện một trong ba cách trên ta sẽ thu được dịch m ật rỉ đã loại
thế keo và màu. Từ dịch mật rỉ đã qua xứ lý này đem pha chế th àn h các
loại môi trường có nồng độ đường khác nhau. Ví dụ, môi trường nuôi cấy
thu nhận sinh khối, nồng dộ đường chi cần 2 - 4c/c. Trong khi đó môi trường
lên men cồn hoặc các axit hừu cơ, nồng độ đường lại từ 16 - 22%. Tuy nhiên
giá trị của mật ri trong quá trình nuỏi cây nâ'm men thu nhận sinh khôi
không chỉ do lượng đường saccharose có trong m ạt ri mà còn do các loại
muối khoáng, các chất kích thích sinh trưởng và các th àn h phần khác
quyết định.
2.2.3 Khoai mì
Trong nhiều quá trình lên men, khoai mì được coi như là loại nguyên
liệu chứa tinh bột rất thuận lợi. Ngoài thành phần dinh dường khá phù hợp
cho quá trình lên men, khoai mì còn chứa rất nhiều chất khoáng như kali,
natri, photpho, magiê và sắt. Vi sinh vật rât cần các chât khoáng này cho
quá trình phát triển và chuyển hóa đế tạo ra các sản phẩm thứ cấp. Mặt
khác khoai mì dùng làm thực phẩm cho người thường là loại thiếu dinh
dường, do đó giá cả thưởng rấ t rẻ và là loại dễ trồng, nên khoai mì được sử
dụng nhiều trong các quá trình lên men.
Một khó khăn lởn nhất là nếu sử dụng khoai mì tươi sẽ gặp khó khăn
rấ t nhiều trong khâu bảo quả vì khoai mì rấ t dễ bị hư.
Bảng 2.3: Thành phẩn hóa học trung bình của khoai mì
STT Thành phẩn Đơn vị tính Sô' IƯỢng
1 Protein % 1,1
2 Lipit % 0,2
3 Gluxit tổng số % 36.4
4 Cellulose % 1,5
5 Tro % 0,8
6 Kali mg/100g 394
7 Canxi mg/100g 25,0
8 Photpho mg/100g 30 0
9 Sắt mg/100g 1,2
10 Vitamin B1 mg/100g 0,03
11 Vitamin B2 mg/100g 0,03
12 Vitamin pp mg/1 OOg 0,6
13 Vitamin C ‘ mg/100g 34
14 Axit folic mg/100g 520
50 CHƯƠNG 2

Do đó trong công nghệ lên men người ta thường sử dụng các loại bột
khoai mì khô.
Muốn sử dụng bột khoai mì làm môi trường cho vi sinh vật tiến hành
các quá trìn h chuyển hóa, khoai mì phải được đường hóa, chuyền tin h bột
th à n h đường glucose. Quá trình đường hóa có thế được thực hiện bằng
enzym hoặc bằng thủy phân hóa học.
2.2.4 Ngô m ảnh
Ngô m ảnh là một loại nguyên liệu rấ t thông dụng trong các quá trình
lên men. Ngô m ảnh chứa rấ t nhiều gluxit, protit và cả lipit.
Ưu điểm lớn n h ất của ngô mảnh là loại vật liệu rời, tin h bột có trong
ngô m ảnh thường không tạo thành khối kết dính nên rấ t thuận lợi đế làm
mồi trường bán rán trong nuôi cấy bề mặt.
Một ưu điếm khác của ngô m ảnh là chúng có thể bảo quản được iâu, dề
mưa và giá rẻ.
Hiện nay ngô mảnh được sử dụng trong các quá trình nuôi cấy nấm sợi
thu nhận enzym ứng dụng trong sản xuất rượu, là nguyên liệu thay th ế
malt trong sản xuất bia, làm môi trường đế bảo quản nấm sợi, xạ khuẩn rất
tôt.
Bảng 2.4: Thành phần hóa học trung bình của ngô mảnh
STT Thành phẩn Đdn vỊ số lượng
1 Protein % 8,5
2 Lipit % 3,2
3 Gluxit % 71.8
4 Celỉulos % 1.7
5 Tro % 0,8
6 Natri mg/100g 10,4
7 Kali mg/100g 310,6
I 8 Canxi mg/1 OỌịi 30,0
I 9 Photpho mg/100g 190,0
ì
10 Magiê mg/100g 85
11 Sắt mg/100g 2,3
Kẽm mg/100g 1,4
13 Đổng mg/100g 0,16
í

\Vs 14
Mangan
Coban
mg/100g
mg/100g
0,5
22,4
v _ Moiipden mg/100g 35
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY vsv CÕNG NGHIỆP 51

2.2.5 Cám gạo

Trong các nguyên liệu có nguồn gốc từ tự nhiên, cám gạo được sử dụng
nhiều trong nuôi cấy vi sinh vật. Trong cám gạq chứa đầy đủ các chất rấ t
phù hợp cho sự phát triển của vi sinh vật, trong đó nám sợi p h át triển rấ t
mạnh trong môi trường cám.
Trong th à n h phần hóa học của cám, hàm lượng tinh bột chiếm một
khôi lượng rấ t lớn. Tuy nhiên loại tinh bột cua cám là tinh bột của gạo nên
chúng Tất dễ tạo ra sự kết dính khi ta tiến hành gia nhiệt trong quá trìn h
thanh trùng. Do sự kết dính này mà môi trường được tạo ra từ cám râ't dề
kết dính lại tạo nên một khôi khá chặt, ngán chặn sự chuyển vận oxy trong
khôi mởỉ trường. Chính vì th ế khi sản xuâ't môi trường nuôi cấy nấm sợi,
người ta thường cho vào môi trường khoảng 25% trâu. Trâu được sử dụng
trong trường hợp này không phải là vì giá trị dinh dưỡng vì thực chất trâu
rấ t nghèo chất dinh dưỡng. Người ta sử dụng trấu như một chất độn làm
tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong khôi môi trường.
Bảng 2.5 : Thành phần hóa học trung bình của cám
STT Thành phắn Đơn vị tính Khôi lượng

1 Protein % 12,2

2 Lipit % 22,7

3 Gluxit % 40,3

4 Cellulose % 6.3

5 Tro % 6,5

6 Canxi mg/100g 30,0

7 Photpho mg/100g 4,6

8 Sắt mg/100g 14,0

9 Vitamin B1 mg/100g 0,96

2.2.6 Đ ậu n à n h (đậu tương)

Đậu nành là một loại lương thực được trồng rấ t phổ biến ở nhiều nước
trên th ế giới. Ở Việt Nam, đậu nành được trồng nhiều ở Đồng Nai và một
số tỉnh phía Bắc. Đậu nành được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật chủ yếu
ở một số công nghệ lên men truyền thông. Đậu nành là nguyên liệu khá lý
tưởng cho công nghệ sinh học.
52 CHƯƠNG 2

Bảng 2 .6: Thành phần hóa học trung bình của đậu nành
STT Thành phẩn Đơn vị tính Số lượng

1 Protein % 34

2 Lipit % 18,4

3 Gluxit % 24,6

4 Cellulose % 4.5

5 Tro % 4,5

6 . Kali mg/100g 1504

7 Canxi mg/100g 165

8 Photpho mg/100g 690

9 ' Magỉẽ mg/100g 236

10 Sắt ’ mg/1 OOg 11

11 Kẽm mg/100g 3.8

12 Mangan mg/100g 1,2

2.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ TRONG
XƯỞNG THựC NGHIỆM

2.3.1 Môi trường nuôi cấy ngh iên cứu các đặc tính sin h lý, lỷ hóa của
vi k h ú ẩ n "
- Môi trường kiểm tra khả năng chuyển hóa glucose th àn h axit:
• Cao nấm men 3% • Glucose 10 %
• C aC 03 3% . Thạch 2%
- Môi trường kiểm tra khả năng chuyển hóa glycerol thành
dihydroxyaceton:
Gao nấm men 3% Glycerol 3% Thạch 2%
- Môi trường kiểm tra khả năng tạo sắc tố màu nâu:-
• Cao nấm men 2% • Glucose 2 %
• CaC0 3 z% . Thạch 2%
- Môi trường kiểm tra acginỉn dihydroỉase:
Pepton 5% Cao th ịt 5% Thạch 2%
CÁC QUẢ TRÌNH TDC VÀ MỎI TRƯỜNG NUÔI CẤY vsv CÔNG NGHIỆP 53

- Các loại môi trường nuôi cấy Vibrio:

Mối trường

1 2 3 4

Pepton 1% Pepton 1% Pepton 1% Pepton 1%

NaCt 1% Cao thịt bỏ 0.3% Glycerol 2% Natri íaurocolat 0,5%

pH 9,0 NaCI 5g NaCI 0,5g Na2C 0 3 0,1g

Thạch 2% Thạch 2% pH 9,2

- Môi trường kiểm tra khả năng sinh tổng hợp urease:
• L. Triptophan 0,3% • KH 2PO 4 0 , 1%
• K2HPO 4 0,1% . NaCl 0,5%
• Ưrê 0,2% *Etanol 95%Vlml -
- Một sô môi trường dùng đê phân lập Staphiỉococcus và Micrococcus:
* Môi trường Bultiaux:
• Cao th ịt bò 0 ,3 % • Pepton 1,5%
• Lactose 1,5% • Thạch 2%
* Môi trường Giolítti:
• Trypton 1c/c • Cao nấm men 0,5%
• Cao th ịt bò 0,5% • Manitol 2%
• LiCl 0,5% • NaCl 0,5%
• Glycerol 0 , 12 % • Na-piruvat 0,3%
• pH 6,5 - 6,8
- Môi trường kiểm tra khả năng lên men đường của Streptococcus'.
. Cao th ịt bò 0,1% • Pepton 1 %•NaCl0,
• Thạch 0,1% • Đỏ phenol 0,0018%
Bổ sung loại đường cần kiểm tra (khử trùng riêng)
. PH 7,6
- Môi trường nuôi Streptococcus đường ruột:
• Cao thịt bò 0,35% • Tryptose 1 ,8 %
• NaCl 0,6% • Thạch 2%
- Môi trường kiểm tra khả năng làm tan máu:
• Cao th ịt 0,3% • NaCl 0,5%
• Pepton 0,1% • Axit nalidixic 0,004%
• Thạch 1,5% • PH 7,4
54 CHƯƠNG 2

- Môi trường kiểm tra sô lượng Streptococcus lactis:

• Pepton 1% • NaCl 0,5%
• Cao th ịt 0 ,2 % • Cao nấm men 0,5%
• Glucose 0 ,2 % • Clohydrat xistein 0,03%
- Thạch 2% • PH 7 - 7,2
- Môi trường kiểm tra Leuconostoc:
• Trypton 1% • Cao nấm men 0,5%
• Saccharose 10 % • X itrat n atri 0,1%
• Glucose 0,25% • Thạch 1,5%
- Môi trường nuôi cấy Lactobacillus’.
Pha ba loại dung dịch sau:
Dung (lịch

1 2 3

Sữa loại cream 1600ml Thạch 20g Noớc ép cà chua 200ml

Quì (teinture de tournesol) 0,016g Pepton 10g Cao nấm men 5,6g

Glucose 110g Cao thịt 10g Đun nhẹ cho tan hết

NaCI 5g Trộn dếu ba loại dung dịch nảy với nhau

Hòa tan trong 40ml nuỡc cất dun nhẹ Điếu chỉnh pH = 7,0

- Môi trường thử khả năng lên men đường của Lactobacillus:
• Pepton 1 % . NaCl 0,5% . Cao th ịt 0 ,2 %
• Thạch 0,05% * Tween 800,1ml• Cao nấm men 0,5%
• Dung dịch A 0,5mg • Nguồn hydratcacbon Xc/c
Dung dịch A bao gồm:
• M gS0 4.7H20 11,5% • M nS0 4.4H20 2 ,8 %
- Môi trường nuôi propỉonibacterium:
• Pepton 0,1% . NaC10,5% . Cao th ịt 0,2%
• Xistein clohydrat 0,03% • Cao nấm men
- Môi trường nuôi cấy Corynebacterium:
• Pepton 0,5% . Na 2H P 0 4.12H20 0 ,1%
Điều chỉnh pH bằng 7,6
Sau đó thêm 20ml huyết thanh bò hoặc ngựa.
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY v s v CÔNG NGHIỆP 55

Môi trường thử khả năng lên men đường củắ Corynebacterỉum:
• Cao thịt 0,6c/c • Cazaminoaxit 4g • NaCl lg
• Thạch 4g • Đỏ phenol 0,0052g • Nước cất 200ml
- Môi trường đê phản lập Corynebacterium’.
• Cao th ịt 3g • NaCl 5g * Thạch 15g
• Tryptose lOg • Axit nalidixic 0,04g • Nưđc cất 1000ml
Điều chỉnh pH = 7,2
- Môi trường phân lập Listeria:
• Pepton lOg • Xitrat sắt amoniac Ig • Esculin lg
• Thạch 15g • Nước cất lOOOmỉ
- Môi trường nuôi cấy Bacillus cere li s:
• Cao thịt bò lg • Pepton lOg * Manitol lOg
• NaCl 10g • Đỏ phenol 0,025g
• Thạch 20g • Nước cất lOOOml
~ Mỗi trường tạo bào tử cùa Bacillus:
• Cao thịt bh 3g • Pepton 5g • NaCI 8g
• Glucose 0,1-g • CaCL.2HL
,0 0,08g • MnClj 5mg
• Dung dịch nguyên tỏ' khoáng lOOnil
• Thạch ‘20g • Nước cất 900ml
Dung dịch nguyên tô khoáng bao gồm:
• (NH,),SO, 20g *MgSO, 20g . M nS0<.H,0 0,5g
• Z n S O ^H .O 0,5g • CuS0 4.5H ,0 0,5g
• FeSO.,.7H:ỉO 0,005g • Nước cất 1000ml
- Môi trường nuôi cày Clostridium:
• Sừa loại cream 1000 ml • Clohydrat xistein 0 ,8 g
Điều chính pH = 7,3 - 7,4
- Mối trường Wiright nuỏi cây Clostridium-.
- Manit lOg • NaCl 0 ,2 g • K2H P 0 4 0,5g
. MgSO.t 0 ,2 g • C aS0 4 0 ,2 g • CaCO:ỉ 0,lg
• Nước chiết nám men 100 ml • Nước cất 900ml
- Môi trường tạo bào tử đối với Clostridium (môi trường Brown)
• Pepton 30g • (N H ^ 2S 0 4 lOg • Na tioglyct)lat lg
• Nưđc cất 1000ml • PH 7,2
56 CHƯƠNG 2

- Môi trường nuôi cấy Thiobacilỉus:

. N a .s , 0 ;ỉ.5H 20 5g • KNO.i 5g . NaHCO;, 0,2g
• MgCL 0 ,lg • CaCl‘2 vêt • FeCl 2 vêt
2.3.2 Môi trư ờ n g n u ô i c ấy xạ k h u ẩ n và n ấm sợi

1- Một sô mòi trường nuôi cây xạ khuẩn

Mồi trường

1 2 3 4

Glucose 20g Tinh bột 20g Pepton 4g Tinh bột tan I0g

KNO3 19 Glucose 20g Nuốc chiết thịt 5mi Pepton 10g

bNaCI 0.2g KNŨ3 Nuớc chiết nấm men 5ml NaCi 5g

1g

k 2hp O4 3g NaCi 0.5g Glucose I0g Thạch 20g

MgCOj 0.3g KpHPOí 0.5g Nưỏc 1000inl Nước cát 2000ml

CaC03 0.5g MgSOj 0.5g pH 7 pH 7.0

FeS0<.7H:0 0.001 g CaCO.ỉ 0.5g Thạch 30g '
I
Thach 20g FeS0«.7H;0 0.001 g í
I
I
Nlíóc 1000ml Thạch 30g

pH 6.8 Nưồc 1000ml

pH _ 7.0 - 7.2

2- Môi trường nuôi nấm sợi

- Mỏi trường Czapok (môi trường phán lập nấm mốc):
• N aN O , 3g . KC1 0 ,5 g K ,H P Ot lg
—>1

» MgSO, 0,5g
ơq

• F eSO i S a c c h a ro s e 30g
•
0
0
t

• Thạch 20g • Nước 1000m l pH 4 ,0

- Môi trường nuồi nấm mốc và nám men:

Mối trường
" ' "1 Hansen
Martin Martin cải tiên
(chú yêu dùng cho nấm men)

Pepton 5g Pepton 15g Pepton 10g

Glucose 10g k h 2po 4 4g I Mantose 50g
K,HP O4 tg MgS04.7H?0 0.5g K H .m 3g
MgS0d.7H?0 0,5g Dung dịch Rose Bengal 100ml MgS0,.7H,0 2g
Thạch 20g Thạch 20g Thạch 20g
Nưốc 1ŨŨ0ml NƯỎC 1000ml 1 Nưốc 1000ml
CÁC QUÁ TRÌNH TĐC VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY v s v CÔNG NGHIỆP 57

3-Môi trường nuôi cấy tảo

- Môi trường Beiferinck:
. NH4N 0 3 lg • K2HPO< 0,2g . M gS04.7H20 0 ,lg
• FeCl 3.6H20 0,001g • Nước 1000 ml
- Môi trường Molisch:
. (NH4)2HP 0 4 0,8g • K2HP 0 4 0,4g • MgS0 4.7H20 0,4g
• C aS0 4 0,4g *KHvP 0 4 0,2g • Nước 1000ml
- Môi trường nuôi cấy Chlorella:
. KNOa l,25g • K .H PO , l,25g . MgS0 4.7H20 1g
. CaCỊi 0,084g . H;1P 0 4 l,1142g • FeS0 4.7H20 0,05g
• ZnS0 4.7H20 0,09g . M nS0 4.4H20 0,0144g .M ()0 2 0,007g
• C aS0 4.5H*0 0,0157g *Co(N0 3)2.6H20 0,005g
• EDTA 0,5g • Nước 1000ml
- Môi trường nuôi tảo Silic:
Mối trương

1 2 Knop

NaNOi 100mg/l KNOa 100mg/i KNOs 1fl

Na?HPO< 20mg/l Na?HP0 4 . 1 2 H?0 10mg/l Ca(N03 ) 2 0.1g
MgSO, 7H20 0,5g KaSiQs 5mg/f K2 HPO4 0,2g
Nt ớc chiết đất 5ml/l MgS0<.7H20 0,1
FeCI3 .6H20 0,001g
Nước 1000mí
 Chương

NHỮNG VẤN ĐỀ KỸ THUẬT VÀ

PHƯƠNG PHÁP CHUNG
Quá trình lên men là hoạt động sông cùa tế bào vi sinh vật trong môi
trường. Quá trìn h này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trìn h sản xuất
công nghiệp.
Quá trình lẽn men trong điều kiện tự nhiên, được thực hiện bỡi các vi
sinh vật tự nhiên và vật chât lên men có trong tự nhiên. Cả vi sinh vật và
vật châ't sử dụng trong quá trìn h lẻn men tự nhiên rấ t phức tạp, không
đồng đều về chủng loại và về sô lượng. Mặt khác quá trìn h lên men trong
tự nhiên là quá trìn h không kiểm soát, do đó xáy ra hiện tượng giao thoa
trong khôi lên men. Quá trình lên men nàv là quá trìn h nhiều pha và
không định hướng. Sàn phẩm quá trìn h lên men là đa dạng, trong đó có
một chất nào đó sẽ vượt trội hơn. Như vậy, đây là quá trìn h lên men khóng
ốn định, chất lượng sán phẩm kém và không đồng nhát.
Quá trình lên men trong sán xuất công nghiệp, được kiếm soát từ
giỏng vi sinh vật, cư chất cùa phản ứng sinh học, quá trìn h phản ứng sinh
học và quá trình thu nhận, tinh chế sản phẩm. Bản chất ciia quá trìn h sàn
xuâl theo qui mô công nghiệp là sản phẩm của quá trìn h có định hướng rõ
ràng, qui trình sán xuất được kiểm soát từ khâu sản xuất giống đến quá
trình lén men và cuỏi cùng là quá trìn h thu nhận sản phẩm.
Như vậy, các quá trình lên men công nghiệp thực chất là thực hiện và
kiếm soát được những công việc cơ bản sau:
- Tạo giống và nâng cao chất lượng giống
- Tính toán, th iết kế và chế tạo các th iết bị lên men phù hợp với công
nghiệp và sản phẩm
- Thực hiện các kỹ thuật trong ỉên men
- Tách, thu nhận và tinh chê sản phẩm
NHỮNG VẤN DỂ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 59

I. GIỐNG CHO SẢN XUẤT

3.1 TẠO GIỐNG VI SINH VẬT

3.1.1 Vai trò của gỉông

Trong công nghệ vi sinh vật, giống đóng vai trò rấ t quyết định
1- Giông quyết định đến năng suất sinh học của nhà máy. Một giông
tốt bao giờ cũng cho năng suất sinh học cao. Các sản phẩm thu nhận được
trong quá trình sản xuất sẽ vừa có chất lượng cao vừa có sỏ' lượng nhiều.
Trong trường hợp này tính nổi trội trong một sản phẩm có ý nghía rấ t lớn
cả về kỹ thuật cũng như kinh tế. Khi ta có một giống vi sinh vật có khả
năng tạo ra một sản phẩm lên men nào đó với sô" lượng lớn hơn các sản
phẩm lên men khác sẽ giúp ta giảm chi phí cho quá trìn h sản xuất.
2 - Giông quyết định chất lượng sản phẩm sinh học. Một giốhg tốt là
giống cho châ't lượng sản phẩm hơn hẳn những giông khác, từ đó tăng khả
năng cạnh tran h trong thương trường.
3- Giông quyết định vốn đầu tư cho sản xuất. Một giống tốt sẽ giúp ta
không phải chi phí cho đầu tư xây dựng thêm nhiều nhà máy, cũng như
giảm những chi phí trong sản xuất rấ t nhiều. Ví dụ, một giám dô'c có trong
tay giống Corynebacterium Glutamicum nhưng chỉ có khả năng sinh tổng
hợp 60 g/1 môi trường axit glutamic. Một giám đốc khác cũng có giồng
Corynebacterium Glutamicum nhưng giống này lại có khả năng sinh tổng
hợp tới 120 g/1 axit glutamic, thì giám đô'c đầu tiên phải xây hai nhà máy
mới có năng suất sản phẩm sinh học bằng một nhà máy của giám đôc thứ
hai.
4- Giống quyết định giá thành sản phẩm. Một giông tốt thường cho
năng suất và chất lượng sản phẩm cao và như vậy giá th àn h tấ t nhiên sẽ
hạ hơn so với một giông có năng suất và chất lượng sản phẩm thấp.
Như vậy, giống cổ ý nghĩa rất lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật
3.1.2 Yêu cầu giông vi sinh vật trong công nghệ vi sin h vật
Trong các công nghệ lên men truyền thống, người ta thường sử dụng
các giống tự nhiên. Ở nhiều trường hợp, các giống có nguồn gốc tự nhiên
thường cho ra chất lượng sản phẩm khá tốt. Tuy nhiên, cũng có rấ t nhiều
trường hợp các giống từ nguồn gốc tự nhiên không cho sản phẩm có chất
lượng ổn định và năng suất sinh học thường không cao. Các giông từ nguồn
gốc tự nhiên chủ yếu được sử dụng vào quá trình thu nhận các sản phẩm
60 CHƯƠNG 3

của quá trìn h dị hóa. Còn trong các công nghệ thu nhận sản phẩm từ các
quá trìn h đồng hóa, ít khi người ta sử dụng giốiig vi sinh vật từ nguồn gôc
tự nhiên.
Trong các công nghệ lên men hiện đại. người ta phải sử dụng các
giông đã được biến đổi nguồn gốc di truyền để nâng khả năng chuyến hóa
vật chất của chúng, đồug thời nhằm mục đích ổn định chất lượng và năng
suất sán phẩm sính học.
Như vậy, giông vi sinh vật sử dụng trong công nghệ lên men hiện đại
phái đ ạt những chuẩn mực n h ất định mới được phép sứ dụng. Các yêu cầu
cơ bản đôi với giông dùng trong lên men hiện đại gồm:
1 - Giông vi sinh vật phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản
phẩm này phải có số lượng và chất lượng cao hơu các sản phẩm phụ khác.
Vì trong quá trình trao đổi châ^t, vi sinh vật xảy ra trong các thùng lẽn
nìen thường tạo ra nhiều sân*phẩm khác nhau. Do đó, giống vi sinh vật
dùng trong một quá trình sản xuất của một sản phẩm nào đó, thì sản phấm
này phài trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và châ't lượng.
2- Giống phải cho năng suất sinh học cao. Năng suất sinh học quyết
định cả vốn đầu tư và giá thành sản phẩm.
3- Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ
tiền và dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động.
4- Sản phẩm của quá trìn h lên men do giống đang áp dụng trong sản
xuảt phái dề dàng tách ra khỏi các tạp chát môi trường và sinh khối vi
sình vật giống.
5- Giông vi sinh vật sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại
phải là nhừng vi sinh vật thuần khiêt, không được nhiễm các vi sinh vật
lạ, phải 011 định vổ fenotype và genotype.
6 - Giông vi sinh vật phải có tính thính thích nghi cao, đặc biệt phải
thích nghi với điều kiện sản xuât công nghiệp, trong đó có sự ổn định nhiệt
độ, pH, áp suât thẩm thấu, hoạt tính của nước. Còn trong tự nhiên các điều
kiện nuôi cáy hay điều kiện sống của vi sinh vật thiếu ổn định.
7- Giông phải có tôc độ sinh sản và phát triển rất mạnh trong điều
kiện môi trường công nghiệp. Tính châ't này rấ t quan trọng, vì nếu bị
nhiềm các vi sinh vật lạ, thì giống dùng trong sản xuất phải có khả năng
lân áp sự phát triển của vi sinh vật lạ.
8 - Tôc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sán phẩm mong muôn.
Dặc điểm này giúp ta táng nhiều chu kỳ sản xuất.
NHỮNG VẤN ĐỂ KỸ THUẬT VẢ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 61

9- Giông phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản.

3.1.3 Kỹ th u ật tạo gỉôn g dùng cho sản xuất công n gh iệp
1- Phân lập giống trong tự nhiên
Thiên nhiên là nguồn vô tận cho phân lập các loại giông vi sinh vật.
Tuy nhiên, không phải ở chỗ náo ta cũng có thể nhận được các chủng vi
sinh vật giông như mong muôn. Có nơi tập trung rấ t nhiều vi sinh vật loại
này, lại có nơi tập trung rấ t nhiều vi sinh vật loại khác. Vi sinh vật thường
phán bô" trong thiên nhiên không đều. Chúng thường tập trung ở nhừng nơi
giàu chất dinh dưỡng và điều kiện phát triển thuận lợi. Do đó phải nắm
chắc một nguyên tác cơ bản là: ở đâu tồn tại một cơ chất nào đó thì ở đó có
nhiều vi sinh vật phân hủy cơ chất đó. Ví dụ, vùng trồng nho sè có nhiều
jtrái nho chín rụng, rơi xuống đất. Vùng đó sẽ tồn tại rấ t nhiều nấm men
saccharomyces tiến hành các chuyển hóa trái nho. Như vậy, ta sử dụng đất
vùng trồng nho này để phân lập saccharomyces sẽ dễ th àn h công hơn
những nơi khác.
Mệt đặc điểm quan trọng khác của vi sinh vật trong tự nhiên là các vi
sinh vật trong tự nhiên ít khi cho năng suất sinh học cao. Muốn có giống
tốt ta phải cải tạo giông này. Phần lớn các vi sinh vật sử dụng trong sản
xuất công nghiệp hiện nay là những giông đã được biến đổi hệ thống di
truyền. Do đó, các giông được phân lập trong điều khiên tự nhiên chỉ là
những giông gồc, từ đó ta tiến hành các biện pháp nâng cao chất lượng
giông để đáp ứng những yêư cầu về giống cho sản xuất.
Một đặc điểm khác của vi sinh vật trong tự nhiên cần quan tâm khi
tiến hành tạo giống là các gicíng được phân lập trong diều kiện tự nhiên
thường chưa thích hợp với sản xuất theo qui mô công nghiệp. Trong đi%íi
kiện tự nhiên, các ỳếu tô' về nhiệt độ, pH, độ ẩm môi trường, độ ẩm không
khí thay đổi liên tục. Ngược lại, trong điều kiện sản xuất công nghiệp, các
điều kiện trê n thường khá ổn định. Do đó giống thu nhận được từ điều kiện
tự nhiên phải qua một giai đoạn huấn luyện thích nghi, đáp ứng dược yêu
cầu đặt ra.
Việc chọn giống từ điều kiện tự nhiên thực sự là một công việc tìm
kiếm các chủng đột biến tự nhiên có những tính trạn g đi truyền trội phù
hợp với mục tiêu đề ra. Trong thiên nhiên luôn luôn xảy ra các quá trình
biến dị, trong đó có rấ t nhiều biến dị có lợi cho quá trìn h sản xuất. Điều
khó khăn là những biến dị này thường là những biến dị ngẫu nhiên không
định hướng, chúng lại luôn luôn lẫn với những vi sinh v ật không biến dị.
62 CHƯƠNG 3

Các th ể biến dị này có thế là thường biến và có thể là đột biến di truyền.
Những thể thường biến thường không bền vững, chúng rấ t dễ biến đổi sinh
lý đế trở lại tính trạng ban đầu. Còn các th ể đột biến di truyền thường bền
vững hơn và chúng có khả năng di truyền lại cho th ế hệ sau. Những đột
biến kiểu này lại rấ t ít xảy ra trong điều kiện tự nhiên. SôT lượng các đột
biến trong thiên nhiên thường không nhiều, do đó việc lựa chọn từ đó cho
ra những cá thể theo mong muốn riêng là một điều khó khăn. Tuy nhiên
việc tuyển chọn từ trong điều kiện tự nhiên chủ yếu là tạo giống ban đầu,
sau đó các nhà nghiên cứu về giống còn phải tiến hành các bước tiếp theo
để nâng cao chất lượng giống. Khi giống đạt được những yêu cầu cụ thể và
đảm bảo được tính ổn định, người ta mđi dám đưa vào sản xuất. Các bưđc
tiến hành tạo lập giống từ điều kiện tự nhiên như sau:
1 - Tìm vị trí để phân lập giống. Vị trí để phân lập giống phải là nơi
hay v ật phẩm có sự tập trung khá cao về m ật độ giông vi sinh vật mà ta
quan tâm . Chọn đúng vị trí hay vật phẩm dùng để phân lập coi như bửđc
đầu khẳng định khả năng th àn h công của công việc.
2 - Sau khi xác định được vị trí hay vật phẩm để phán lập, người ta cân
một gam hay một ml (nếu là vật phẩm dạng lỏng) đem phân lập.
3- Chuẩn bi các ống nghiệm chứa c*c môi trường tập trung. Môi trường
tập trung là môi trường chứa nhiều chia, dinh dưỡng có khả năng thích hợp
cho nhiều vi sinh vật cùng loài. Ở đó các vi sinh vật trong cùng một loài sẽ
phát triể n rấ t m ạnh, các vi sinh vật của các loài khác sẽ không phát triển
hoặc p h át triển rấ t kém. Mục đích của việc sử dụng môi trường tập trung là
loại dần những vi sinh v ật mà ta không quan tâm .
4- Sau khi pha loăng tới mức độ pha loãng n h át định vật phẩm phân
lập ta cây chúng trong những ông nghiệm hoặc vào hộp petri có môi trường
tập trung.
5- Song song đó ta chuẩn bị môi trường đặc hiệu và sau khi các vi sinh
vật đã p h át triển m ạnh trê n các hộp môi trường tập trung, ta chuyển
chúng sang môi trường đặc hiệu. Môi trường đặc hiệu là môi trường chỉ cho
phép các vi sinh vật mà ta quan tâm p hát triển còn các vi sinh v ật khác sẽ
bị ức chế không p h át triển được.
6 - Bước cuốỉ cùng là kiểm tra những đặc điểm của vi sinh vật mà ta
quan tâm . Mục đích là tuyển chọn từ những vi sinh vật cùng loài những cá
th ể có đặc điểm đặc trưng mà ta mong muốn.
1 2* Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
NHỮNG VÁN ĐỂ KỶ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 63

Khác với giống được phân lập trong.điều kiện tự nhiên, các giống vi
sinh vật phân lập trong điều kiện sản xuất có nhừng ưu điểm riêng:
1- Giống được phân lập trong điều kiện sản xuất có nhừng giông đã
qua quá trình sản xuất, đã có khả năng thích ứng với điều kiện sán xuất
(trong khi đó giông trong điều kiện tự nhíêxi chỉ quen với các điều kiện
không ổn định của thiên nhiên). Đặc điểm đã quen với điều kiện sản xuất
rất có ý nghĩa trong quá trình sản xuất vì đặc tính này đảm bảo tín h ổn
định của giống trong điều kiện nhân tạo.
2- Giống được phân lập trong quá trìn h sản xuất thường là những
giông đã được qua biến dổi gen và có những đặc điểm sinh hóa cao hơn hẳn
những chủng nguyên gốc. Do đó, việc phân lập chúng và tạo lập được giông
từ đây sẽ có năng simt và chất lượng sản phẩm sinh học cao.
3“ Trong các điều kiện sản xuất (dịch đang lên men, nước thải, chât
thải) thường tồn tại khá tập trung những giông vi sinh vật mà ta quan
tâm. Những giồng này đang trong quá trình sản xuất và sẽ theo chất thải,
nước thải ra ngoài. Như vậy trong nước thải, chất thải m ật độ các vi sinh
vật này nhiều n h ất trong tấ t cả các mẫu vật mà ta đã quan tâm. Nhiều
nghiên cứu rấ t thành công trong việc sử dụng nước thải , chất thải này để
phân lập lại. Ví dụ, để có giống dùng trong sản xuất bia, ta sẽ lây mầu
nước thải trong nhà máy bia hoặc bã men sau khi lọc, ép để làm vật phẩm
cho quá trình phân lập. Làm như vậy sè có khả năng thu nhận kết quả khả
quan hơn các mẫu vật phân lập từ nguồn khác.
Như vậy, trong công việc phân lập giông vi sinh vật từ quá trìn h sản
xuâ't có những bước sau:
a) Chọn vị trí và mầu vật phân lập: Trong quá trìn h sản xuất, giông vi
sinh vật có th ể bị thoái hóa. Trong tổng thể, có rấ t nhiều cá th ể bị thoái
hóa nhưng không phải tấ t cả, trong đó, có nhiều cá thể vẫn giữ được những
đặc tính mà ta quan tâm. Do đó nhiệm vụ là: từ tập hợp vi sinh vật có
trong quá trìn h sản xuất đó ta phân lập ra những giống còn giữ được những
đặc điểm ban đầu. Địa điểm và mẫu vật đem phân lập ở điều kiện sản xuất
bao gồm:
- Dịch đang tiến hành lên men
- Nước th ải của nhà máy
- C hất th ải của nhà máy
Trong đó dịch đang lên men cho xác suất thu nhận được kết quả cao hơn.
b) Sau khi xác định được vị trí và vật phẩm dùng để phân lập, ta chỉ
64 CHƯƠNG 3

còn thực hiện các bước sau giống như các bước trong phân lập giông từ điều
kiện tự nhiên
3' Phân lập giống trong những ổng giống đã thóai hóa
Các ống giông là tập hợp các tế bào vi sinh vật có cùng một nguồn gốc
di truyền. Tuy nhiên, do điều kiện bảo quản b ất bình thường mà ông giống
thay đổi một sô' đặc điểm sinh hóa, từ đó khó ứng dụng trong sản xuất.
Tuy nhiên cũng phải nhận thấy rằng, troug hàng tỷ tế bào có trong
ống giông đó không phải tấ t cả đã bị thóai hóa mà còn rấ t nhiều cá thể
vẫn bảo tồn được đặc tín h ban đầu. Việc ứng dụng cả ông giống này vào
trong sản xuất sè làm tăng nãng suất và chất lượng sản phẩm. Thực chất
của việc phân lập giống trong những cíng nghiệm giông đã thóai hóa ià quá
trình tuyển chọn lại giống từ các ống giông.
Công việc này hoàn toàn không phức tạp vì vị trí và vật phẩm phân
lập rấ t rõ ràng. Vâ'n đề còn lại Jà tiến hành các quá trìn h phân lập giống
như quá trình phân lập giống từ điểu kiện tự nhiên. Công việc này là công
việc Tắt thường xuyên ở nhiều phòng thí nghiệm và phòng kỹ thuật trên
th ế giới. Nhờ đó mà người ta luôn duy trì được giống tốt cho sản xuâ't.

3.2 KỸ THUẬT NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG GIÔNG VI SINH VẬT

Giông được tạo ra trong quá trìn h phân lập ở trên có những đặc tính
tốt theo mong muốn. Tuy nhiên chất iượng giống là một trong những tiêu
chí, luôn luôn phải được hoàn thiện và nâng cao. M ặt khác, các giông được
phân lập từ điều kiện tự nhiên thường không thích nghi ngay với điều kiện
sản xuất công nghiệp, do đó việc tạo khả năng thích nghi và nâng cao chất
lượng giông là điều bắt buộc trong công nghệ vi sinh vật.
3.2.1 Tạo khả n ăn g th ích n gh ỉ của giông vi sinh vật với đ iều k iện sản
xu ất côn g n g h iệp
Một đặc điểm rấ t quan trọng của vi sinh vật là khả uăng thích nghi
với điều kiện sống của chúng rấ t cao. Khả năng thích nghi của vi sinh vật
vượt hẳn. khả năng thích nghi của động vật và thực vật. Khả năng thích
nghi cao của vi sinh vật với điều kiện môi trường xung quanh do cơ thể ví
sinh vật là cơ thể đơn bào. Mọi tác động cùa môi trường đều có thể là
những tác động trực tiếp. Mặt khác, cơ thể vi sinh vật thực hiện những quá
trìn h trao đổi chất, sinh sản, phát triển rấ t nhanh trong một chu kỳ sốhg
râ t ngắn. Do đó, giai đoạn thích nghỉ phải được xảy ra nhanh và m ạnh
trong một giai đoạn không th ể dài mà phải rấ t ngắn so với chu kỳ phát
NHỮNG VẤN ĐẾ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 65

triển và chu kỳ sông của chúng.

Nguyên tắc cơ bản thứ hai trong việc tạo khả năng thích nghi là khi
đã tạo được khả năng thích nghi của giông vi sinh vật đốì với một tác động
môi trường nào đó phải luôn luôn duy trì tác động đó ở mức độ đã tạo ra
tính thích nghi. Nếu phá bỏ tác động này hoặc làm thay đổi mức độ tác
động này sẽ phá bỏ tính thích nghi. Khi đó giông rấ t dễ trở lại trạn g thái
ban đầu của nó. Thực chất của tính thích nghi là thường biến, thường biến
thì không di truyền. Do đó đặc điểm này không bền. Các bước tiến hành
tạo giông thích nghi được thực hiện như sau:
1- Đầu tiên lập bảng mức độ tăng dần (ví dụ như nồng độ chất khô),
hay giảm*dần (như pH) của yếu tố tác động.
2- Nuôi giống trong nhừng điều kiện tăng dần hoặc giảm dần thổo
thang bậc tăng dần hay giảm dần. Qua mỗi bậc tầng dần hay giảm dần cua
yếu tô" thích nghi, những cá thể nào không thích nghi được mức độ tăng
dần hay giảm dần đó sẽ chết. Những cá thể nào thích ứng được với sự tồn
tại của thang bậc tăng dần hay giảm dần đó sẽ tồn tại. Ta cứ làm như vậy
và cuô'i cùng th ế nào ta cũng thu được những cá thể mong muốn. Nhiều cơ
sở sản xuất và cơ quan nghiên cứu bằng cách này đã tạo ra được rấ t nhiều
giống có chất lượng tốt.
3- Sau cùng, người ta phải giừ giống trong điều kiện đă tạo được tính
thích nghi đó. Nếu thay đối điều kiện và mức độ của yếu tô" thích nghi, tính
thích nghi sè hoàn toàn biến m ất và giống lại trở lại đặc tính ban đầu.
Một trong những yêu cầu quan trọng của người làm công việc nâng cao
chất lượng giống bằng phương pháp huấn luyện thích nghi là phải có tính
kiên trì. Kiên trì trong huân luyện thích nghi và kiên trì cả trong quá
trình bảo quản để duy trì đặc tính thích nghi dó.
3.2.2 Làm biến dổi hệ thống di truyền tạo ra gỉấng có chất lưựng cao hơn
Di truyền học ngày càng đóng vai trò quyết định trong việc nâng cao
chất lượng gicmg và tạo ra gi ống mới. Hệ thông di truyền của một loài
thường khá ổn định trong suốt quá trình tồn tại và phát triển của chúng.
Tuy nhiên, nhiều yếu tố* tác động lên hệ thông này làm thay đổi tận gốc
bản chất di truyền của chúng. Những thay đổi này được giữ lại và truyền
cho những th ế hệ sau. Tuy nhiên, cũng phải khẳng định rằng không phải
bất kỳ một đột biến nào cũng dẫn đến sự bền vững và truyền lại. cho th ế hệ
sau. Nhiều đột biến dần tới việc cơ th ể bị chết. Chỉ một số không lớn lám
mới tồn tại và có khả năng di truyền. Do đó, người ta đã biết sử dụng các
66 CHƯƠNG 3

phương pháp khác nhau để tạo ra nhửng đột biến. Nếu trong th iên nhiên
các đột biến thường xảy ra ngẫu nhiên, thì trong các phòng thí nghiệm,
người ta đã tạo ra được những đột biến có tần số đột biến cao và có định
hướng rõ rệt. Loài người cho đến nay đã hoàn toàn làm chủ được những
biến đối này.
Kỳ th u ật di truyền được chia ra làm hai nhóm:
a) N hóm kỹ thuật di truyền cổ điển: bao gồm lai giông và kỹ th u ật tạo
đột biến nhân tạo
- Kỹ th u ật lai giông là phương pháp tạo giông mứi có lịch sử râ't lâu
đời bắt đầu từ những bức xúc của ngành chăn nuôi và trồng trọt. Sau đó
người ta có áp dụng trong việc chọn giông vi sinh vật. Nhìn chung, kỹ
th u ật chọn giông vi sinh vật theo phương pháp này không mấy th àn h công.
Phương pháp lai giông thường không phức tạp nhưng có nhược điểm lđn
nhâ't là giới hạn sự pha trộn đặc tính di truyền chỉ trong một loài nhất
định. Các loài vi sinh vật khác nhau thì không thể tiến hành quá trìn h lai
giông được.
- Kỹ thuật di truyền bằng phương pháp gây đột biến nhần tạo là kỹ
thuật tạo ra những đột biến điểm. Đột biến điểm là nhừng đột biến nằm
trong cấu trúc của các nucleotid, cụ thế là nằm trong các cấu trúc của các
bazơ chứa nitơ. Bằng phương pháp này, người ta tạo ra những giống vi sinh
vật có rấ t nhiều đặc tín h quí, được áp dụng rộng rãi trong sản xuất. Đây là
kỹ thuật được áp dụng rấ t nhiều trong công nghệ vi sinh vật.
b) Kỹ thuật di truyền hiện đại
Nhờ có những thành tựu trong việc phát hiện ra plasmid, các enzym
cắt, enzym nối và đặc biệt là những thành tựu trong việc th iế t lập được các
bản đồ di truyền nên kỹ thuật tái tổ hợp gen đã có những bước đột phá
quan trọng trong chọn giông.
Để hiểu rõ hơn những phương pháp hay kỹ th u ật di truyền trên , ta lần
lượt làm sáng tỏ chúng trong những phần trìn h bày sau.
I- Kỹ th u ật gây đ ộ t biến nhân tạo
Như phần trìn h bày trưđc, đột biến trong thiên nhiên thường xảy ra
với tần số rấ t thấp (khoảng 10'6 - 10 10) và không định hướng. Để tăng khả
năng đột biến, người ta tìm cách gây tác động vào hệ thống di truyền bằng
các yếu tô' hóa học, vật lý và sinh học để táng tầ n sô" đột biến.
Biện pháp này được gọi là kỹ thuật gây đột biến n h ân tạo. Các nhân
tô' tác động làm tăng tần số' đột biến được gọi là nhân tố gây đột biến, cơ
NHỬNG VẤN ĐỂ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 67

thế bị đột biến gọi là cá thể đột biến.

Các tác nhân gây đột biến hóa học
ct) Tác dụng cúa axìt nitric (HNOv)
Axit nitric là tác nhân hóa học dược sử dụng nhiều trong việc làm biến
đối câu trúc các bazơ chức nitơ trong câu trúc cùa axit nucleotic.
Dưới tác dụng của axit nitric, nhóm amin trong cấu trúc cua các bazơ
bị thay đổi bởi hydroxy hay bởi oxy. Quá trình nàv gây ra bởi các phán
ứng khử amin. Khi đó:
Adenin sẽ trớ thành hypoxantin
Guanin sè trớ thành xantin
Xytizin sè trở thành uraxil.
Tác dụng chú yếu của axit nitric ỉà gây nên các đột biến điểm kiểu khử
amin đôi với các bazơ. Ngoài ra, chúng còn có thể tác động làm đứt môi
liên kết hydro trong các sợi DNA đang phân chia tạo ra một loạt các biến
dổi khác như cáu trúc lai nhiễm sắc thế.
b) Tác dụng của Bromode xiuridinc và 5- bromuraxil
Các chất này là các bazơ đồng đáng với thymine. Chúng thường ở dạng
keto (một số trường hợp chúng ở dạng essoi sẽ bắt cặp với guanin.
Như vậy bromodeuriđine có khả năng bắt cặp với guanin. Khi đó A-T
sè được thay th ế bằng G-C, từ đó sau mỗi lần ổao chép sẽ tạo ra sự sao
chép sai.
c) Các chất methanesulfonate (EMS), methyl methancsulfonatc (M M S),
ethyỉen inline (EI)t nitrosoguanỉdỉnc (NG).
Các chát này gây đột biến bằng 3 cách:
• Thêm nhóm methyl (-NHs) hay ethyl (-C2Hr,) vào guanin tạo ra bazơ
đồng đẳng của adenin dẩn đến sự bắt cặp bổ sung sai
• Mất guanin đã bị alkyl hóa (mất purine) tạo ra lỗ hỏng trên DNA.
Khi tiến hành sao chép có thê tạo ra sự đứt mạch
• Liên kết chéo giữa các mạch của một hoặc các phân tử DNA khác
nhau làm m ất nucỉeotid.
Các tác nhân vật lý
Trong các tác nhân vật lý, tia tử ngoại thường được dùng nhỉều hơn cả
trong việc tạo giống vi sinh vật. Dưới tác dụng của tia tử ngoại, cysteine sẽ
được gắn thêm phân tử nưđc vào liên kết c = c của mạch vòng, thymine sẽ
bị đứt mạch c = o và nôi hai phân tử lại thành thymine dimer.
68 CHƯƠNG 3

Cả hai nhóm tác nhân hóa học và tác nhân ỉý học đều phụ thuộc vào
thời gian tác dụng, liều lượng (hay cường độ tác dụng).
Điều quan trọng là sau khi thực hiện cả hai phươiig pháp đều phải tiến
h ành công việc kiểm tra. Kiểm tra là công việc xác định xem những đột
biến nào tạo ra cho ta những đột biến theo mong muốtt.
2• Kỹ thuật d i truyền hiện đại
Kỹ thuật dí truyền hiện đại ià kỳ thuật tái tổ hợp gen. Nếu quá trình
lai giống trong kỹ thuật di truyền cổ điển bị hạa chế trong các quá trình
chuyển tải di truyền chi trong một loài thì trong kỹ thuật di truyền hiện
đại không giới hạn trong một ỉoài. Nếu kỹ thuật tạo đột biến (đột biến
điểm) bằng các tác nhân hóa học hay lý học trong kỹ thuật di truyền cổ
điền giới hạn ở sự không định hướng của các biến dối di truyền, thì trong
kỳ thuật di truyền hiện đại người ta có th ể dự đoán và thu được những đột
biến theo mong muốn.
Như vậy, có hai đặc điểm quan trọng của đi truyền hiện đại là không
bị giới hạn loài và các biến đổi di truyền có định hưóng. Chính vì thế, kỹ
th u ật di truyền hiện đại vừa tạo cho loài người nhiều kỳ vọng vào khả năng
thay đổi nhiều chiều nền kinh tế th ế giới, vào sự sắp xếp lại trậ t tự sinh
thái, vào khả năng làm chủ của loài người với thiên nhiên, đồng thời nó
cùng tạo ra những tra n h cải gay gắt giữa những khuynh hướng đạo đức
khác nhau, giữa khoa học và lợi ích kinh tế.
Kỹ thuật hiện đại dựa vào những phát hiện quan trọng trong th ế giới
sinh vật
a) P hát hiện ra plasmid. Đây là một loại DNA nằm ngoài nhân (nằm
trong bào tương ’ đóng vai trò như một chiếc thuyền, chuyên chở vật liệu di
truyền từ cơ thế này sang cơ thể khác để tạo lập ra một hệ thống di truyền
hoàn toàn mới cho cơ thê nhận. Plasmid chỉ có ở vi khuẩn và một vài sinh
vật có cấu trúc đơn giản khác. Người ta sử dụng ẹhúng như cácvector
chuyên tải vật chất di truyền rấ t hừu hiệu.
Các plasmid có nhừng đặc tính quan trọng như sau:
• Plasmid có kích thước nhỏ hơn DNA trong nhân
• Plasmid có mã di truyền hoàn toàn giống DNA trong nhân
• Plasmid có khả năng truyền lại một số đặc tín h di truyền đặc biệt
cho th ế hệ sau.
b) P hát h ;ện ra các enzyro cắt giới hạn. Các enzym này thuộc hai loại
exnuclease và endo nuclease. Chúng có khả náng cắt các gen có trong DNA
NHỮNG VẤN ĐỂ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 69

ra bắt đầu từ hai đầu của DNA hoặc có th ể trỏng DNA ỏ những vị trí xác
định. Người ta hình tượng hóa các loại enzym cịắt giới h ạn như những chiếc
kéo (’ủa các bác sĩ dùng trong phẫu thuật hay chiếc kéo của người thợ may.
c) P hát hiện ra enzym liên kết (ligase) các gen đã phân cắt lại với
nhau theo đúng trình tự đả được xác lập. Người ta hình tượng hóa các
enzym ligase như kim chỉ của bác sĩ phẫu thuạt hay của người thợ may.
Ngoài plasmid ra người ta còn dùng rấ t nhỉều vectơ khác đẽ chuyển tải
các gen từ cơ thề này sang cơ thế khác.
Hiện nay có hai xu hưđng thực hiện tái tổ hợp:
1- Xu hướng chuyển gen vi sinh vật sang động vật hay thực vật Iihằm
cải tiến các tính trạng hoặc làm tăng thêm tính trạn g mà ta cần cho cơ thế
động vật hay cơ thế thực vật. Bằng cách này người ta đả râ't thành công
trong chuyền tài đặc tính kháng sâu bệnh của bacillus subtilis sang cho cây
trồng hoặc chuyển khả năng chông chịù kim loại, hoặc tạo khả năng sinh
vaccine, hoặc tạo sức đề kháng với hạn hán hay đất phèn.
2- Xu hướng chuyền gen của các vi sinh vật khác sang cho vi sinh vật
và biến tế bào vi sinh vặt như những nhà máy sản xuất các chât cần th iết
cho con người. Người ta kỳ vọng rất nhiều ỡ xu hưởng chuyển gen thứ hai
bởi nhừng lý do cơ bán sau:
• Cơ thế vi sinh vật là cơ th ế dơn bào có chu kỳ sinh trưởng rấ t ngắn,
do đó chúng bắt buộc phải có một quá trìn h trao đổi chát rấ t mạnh. Người
ta vừa dề dàng nghiên cứu chủng vừa dề dàng thu nhận được một sán lượng
lớn các sàn phẩm trong một thời gian ngắn.
• Cơ thê vi sinh vật là CƯ thể rã't dễ đồug hóa nhiểu loại nguyên loại
khác nhau. Do đó nguyên liệu dùng cho quá' trình sản xuất dề kiếm và rẻ
tiền.
• Cơ thể vi sinh vật là cơ thê đơn bào và là cơ th ể sinh vật duy n h ất
có khả năng thực hiện các quá trình sản xuất công nghiệp để sản xuất
hàng loạt và có kiểm soát.
Để thực hiện việc chuyển gen từ cơ th ể này sang cơ thể khác, người ta
thực hiện các giai đoạn cơ bản sau:
a) Tách DNA của vật cho
Đây là công việc đầu tiên được quyết định bởi .tính trạng đặc biệt của
một gen nào đó trong DNA vật cho mà ta quan tâm. Trước khi tlịu nhận
gen này ta phải tách được DNA. Việc tách DNA được thực hiện trước tiên
bằng cách phá vờ thành tế bào. Nếu vật cho là vi sinh vật, người ta thường
70 CHƯƠNG 3

dùng lizogym; nếu cơ thề cho là tê bào thực vật, người ta thường dùng
enzym cellulase. Sau đó người ta dùng dosysulfate l c/í đế loại protein. Sau
‘2,5 giờ lắc trên máy lắc, người ta tiên hành ly tâin và đùng pipet hút lây
phần dịch trẽn. Sau đó cho thêm ẽte với liều lượng tương đương, lắc mạnh
và ly tâm trong 5 phút với tốc độ ly tâm 2000 vòng/phút. Khi đó DNA nằm
ớ lớp dưới của ông ỉy tảm. Bằng cách này ta tách dược DNA khỏi phenoỉ và
protein. Bỏ lớp dịch trên kết tủa DNA bằng cồn. Ta có thể nhận DNA bằng
cách dùng đấu đũa thúy tinh cuộn sợi DNA ở đau dũa thùy tinh. Nếu chưa
sử dụng ngay ta có thê bảo quán DNA bang cồn 10c/(/ V và để trong tù lạnh.
b) Chọn vcctơ chuyển gcn
Vectơ chuyến gen thường phải có nhừng yêu cầu cơ bản sau:
• Vectơ phải có trình tự sao chép đê có khá năng tự sao chép, tồn tại
độc lập
• Vectơ phải có trìn h tự điều hòa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phiẻn
mà gen.
• Vectơ phái đám bảo tính bền vững di truyền cùa DNA tái tô hợp ở
dạng độc lập hoặc gắn vào nhiễm sắc thế cua tế bào chú.
• Vectơ có nhừng gen đánh dâu để dễ dàng phát hiện ra chúng hoặc
các gen lạ gắn vào
• Vectơ có những gen làm vô hiệu hóa đoạn DNA không mong muốn bị
gán vào.
• Vectơ chứa nhiều bản sao để tách được ra khói tê bào với sô lượng
lứn và đani báo sự khuyếch đại của gen như promoter
Ta có thè chọn các loại vectơ là các plasmid, phage, cosmid đê chuyến
tãi các đoạn DNA của vật cho sang vật nhận.
cỉ Ticn hành việc chuyển gcn
Quá trình chuyền gen được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác
nhau. Hiện nay việc chuyền gen vào tê bào thực vật và tế bào động vật
thường được thực hiện bằng hai cách:
- Chuyển gen nhờ vector chuyến gen
- Dùng súng bắn gen.
Rièng đôi với tê bào thực vật, do kích thước quá nhỏ nên không thể
dùng phương pháp bắn gen được, do đó phương pháp chuyển gen nhờ vectơ
chuyến gen được thực hiện nhiều hơn.
Đẽ thực hiện được điều đó trước tiên người ta phải dùng enzym cắt giới
hạn các gen trong DNA của vật cho và chuyến chúng vào vectơ chuyển gen
NHỮNG VẤN ĐỂ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 71

có sự tham gia của ỉigase và một sỏ' chất làm tăng các quá trìn h này. Sau
đỏ nhờ vectơ chuyển đoạn gen này sang cơ thề nhận. Cuối cùng là kiếm tra
tính trạng mà ta quan tâm ở cơ thể nhận có được biểu hiện không. Thực tế
cho thấy việc chuyền gen từ cơ thề này sang cơ thể khác không phả', lúc
nào cũng thành công. Do đó,'công việc này đòi hỏi phải rấ t kiên nhẫn và
chính xác. Bằng' phương pháp này người ta đã tạo ra rấ t nhiều giông tôt
được áp dụng trong sản xuất.

3.3 BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT

Mục đích của bảo quản giông vi sinh vật ỉà sau quá trình bảo quản các
tính trạng quan trọng của giống không bị m ất hoặc bị giám.
Đề làm được điều đó, người ta tiến hành các biện pháp dựa trên
nguyên tắc làm giảm quá trình trao đôi chất và làm giảm quá trình hô hâp
của vi sinh vật.
Đế làm giảm quá trình trao đổi chât và làm giám quá trìah hô hấp của
vi sinh vật, người ta thường chứ ý đến các yếu tổ’ tác động mạnh lên hai
quá trình này, trong đó ba vếu tòi được quan tâm nhiều nhất là:
- N hiệt độ
- Độ ẩm
- Lượng không khí tiếp xúc trực tiêp.
Ngoài ra còn một số’yếu tố" phụ khác cũng được quan tâm đúng mức.
Trong công nghệ vi sinh vật, người ta thường sử dụng những phương
pháp sau dề báo quản giông vi sinh vật.
i- Phươtig pháp cấy truyền và bảo quản lạnh
Hầu hết các cơ sở sản xuất và rấ t nhiều cơ sở nghiên cứu áp dụng
phương pháp này trong giữ giống vi sinh vật. Nguyên tấn của phương pháp
này là dựa trên sự trao đổi chất theo một khoảng thời gian n h ất định. Sau
khoảng thời gian này lại lặp lại công việc trên. Cách làm này tỏ ra có hiệu
quả đối với nhiều giông vi sinh vật.
Trước khi đem bảo quản, người ta thường cấy truyền giống vi sinh vật
vào 3 - 5 ống nghiệm thạch nghiêng. Đốì với người mới vào nghề nên cây
năm ống nghiệm, trong đó một ống dùng cho nghiên cứu, một ống dùng cho
sản xuất hoặc kiểm tra, một ông dùng cho bảo quản. Đối với người đã làm
việc lâu năm trong lĩnh vực này chỉ cần cấy ba ống nghiệm là đủ.
Sau khi cấy truyền vào ba ống thạch nghiêng, người ta nuôi chủng ở
nhiệt độ thích hợp (thường nuôi ở nhiệt độ 28 - 32°C) cho đên khi tạo được
 72 CHƯƠNG 3

lượng sinh khối lớn nhất, sau đó cất giông trong nhiệt độ lạnh khoảng 4°c.
Sau khoảng một tháng cây truyền lại và lặp lại như trên. Chú ý , khi áp
dụng phương pháp, tuyệt đối tuân thủ chu kỳ cấy truyền và bảo quản lạnh.
Nếu kéo dài ra, giống sẽ rấ t dễ thoái hóa vì độ ẩm môi trường thạch rấ t dễ
giảm trong quá trình bảo quản lạnh.
2- Phương pháp bảo quản trong đất hoặc cát
Nguyên tắc của phương pháp bảo quản trong đất hoặc cát là làm giảm
độ ẩm của đất hoặc cát sau khi vô trùng. Độ âm thấp làm giảm khả năng
hô hấp của vi sinh vật và như vậy sẽ bảo tồn được tính trạng mà ta quan
tâm.
Phương pháp này chỉ áp dụng đối với các vi sinh vật có khả nãng tạo
bào tử và chỉ áp dụng để bảo quản giông dùng trong nông nghiệp hay xử lý
môi trường. Còn các giông vi sinh vật sử dựng vào những mục đích khác,
trước khi sử dụng phải tiến hành phân lập lại đế loại đất và cát ra khỏi tế
bào vi sinh vật.
Trước khi báo quản, các giông vi sinh vật phải được nuôi cấy tạo nhiều
bào tử. Đất hoặc cát phải được sây ở nhiệt độ trên 100°c để tiêu diệt vi
s in h v ậ t và l à m g iả m độ ẩ m đ ế n < 5 f/f w. Sau k h i c h u ẩ n bị xong h a i công
việc trên, tiến hành trộn bào tử vào đất hoặc cát đã qua sây và làm nguội
trong buồng vô trùng. Hỗn hợp này được đóng vào những bao nilon hoặc
■ vào bao bì chông âm, sau đó đem bảo quản. Ta có thể bảo quản chúng ớ
nhiệt độ thường hoặc nhiệt độ lạnh.
3- Phương p h á p bảo quản g iố n g trong h ạ t ngủ cốc
Nguyên tăc của phương pháp là người ta nuôi các vi sinh vật trực tiếp
trong hạt ngũ cốc đã hấp chín. Sau từ 3 - 5 ngày nuôi ở nhiệt độ 28 - 32°c,
bào tử được tạo thành, người ta đem sấy ở nhiệt độ < 40°c cho đến khi độ
ám còn lại < 8% w. Toàn bộ được đóng vào bao bì và đem bảo quản ở nhiệt
độ lạnh.
Phương pháp này thường thích hợp cho các loại nấm sợi. Người ta
cũng có thể thay các h ạt ngũ côc bàng các loại bột, trong đó bột mì được sử
dụng nhiều hơn cả.
4- Phương pháp bảo quản giống trong lớp dầu
Nguyên tắc của phương pháp này là người ta cách ly vi sính vật khỏi
không khí và như vậy sẽ hạn chê tôi đa quá trình hô hổp của vi sinh vật.
Trước tiên, giông vi sinh vật phải được nuôi trong ông nghiệm thạch
nghiêng. Khi giống đã phát triển tối đa, người ta đun ở nhiệt dộ < 40°c cho
NHỮNG VẤN ĐỂ KỶ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 73

dầu ớ trạn g th á t lỏng và đổ chúng trên bề m ặt lớp khuẩn lạc. Như vậy
khuẩn lạc sè nằm giừa lớp môi trường và lớp dầu.
Bằng cách này giông cũng được bảo quản trong thời gian dài.
5- Phương pháp bảo quản giống theo phương pháp đông khô
Nguyên tắc của phương pháp là làm giảm độ âm của canh trường nuôi
cấy (trong đó có sinh khỏi giông vi sinh vật) ở nhiệt độ thâp trong điều
kiện chân không. Đầu tiẻn, người ta phải nuôi vi sinh vật trong môi trường
lỏng. Khi m ật độ tế bào đạt được mức độ cao nhất, người chuyển chúng vào
những ông thủy tinh có dung tích 1 ml - 5 ml (có kill < lm l) và chuyền
chúng vào những máy đông khô. Máy hoạt dộng trong 24 giờ và sau đó hàn
kín nắp lại. Bằng phương pháp này ta có thê báo quàn giông được > 20
năm mà giông hoàn toàn không mất chất lượng.
Hiện nay trên th ế giới có rấ t nhiều ngân hàng giông vi sinh vật . Ớ đó
người ta thực hiện các phương pháp giữ giống hiện đại, trao dối và hán
giống. Nếu cần, ta có thể liên hệ các ngân hàng giống sau:
1- ABBOTT: Abbott laboratories, North Chicago. 1X1.60064
2- ATCC: American Tvpp Culture Collector 12301, Parklawn Drive
Rockwill Md20852 USA
3- C A N A D -212 D ivision O bioscience, N a ti o n a l R e s e a rc h council.
Ottawa, Canada
4- c c . Csirô Division of Plant Industry, Canberra City ATC, Australia
5- Ferri: Fermentation Research Institute Agency of Industrial
Research Agency of Industrial Science and Technology. Chiba- Japan
6- HIR: food and fermentation Division. Hokkaido Profectural
Industrial Research Institute Sapporo, Japan
7- IMASP: Museum of Cultures, Institute of Microbiology, Academy of
Science of Republic of China, Peking, China
8- NRRL. ARS- Culture collection, N orthern Regional Research
laboratory, D epartm ent of Agricultural 1815 N, University Street. Peoric
III - 61604- USA.
6- Phưctng pháp làm lạnh đông
Đôi khi người ta bảo quản giông bằng cách làm lạnh đông. Người ta
trộn sinh khôi vi sinh vật vào các chât phụ gia.
Các chẩt phụ gia thường cho vào trong quá trìn h lạnh đông baogồm
một trong những chất sau đây:
74 CHƯƠNùt 3

- Glycerin 15%
- Huyết th an h ngựa (loại không dùng chất bảo quản)
- Dung dịch saccharose 10% + gelatin 1% (pH = 6 ,8 - 7 )
- Dung dịch glucose hay lactose 10%
Tiến hành lạnh đông khoảng “ 20°c đến 25°c.
Thời gian cấy truyền như sau:
- Nếu giữ ở -15°c đến -2 0 ° c thì sáu tháng cấy truyền lại một lần
- Nếu giữ ở -3 0 °c thì chín tháng cấy truyền lại một lần
- Nếu giữ ở -4 0 °c thì một năm cấy truyền lại một lần
- Nếu giữ ở -5 0 °c đến -60°c thì ba năm cấy truyền lại một lần
- Nếu giữ ở -70°c thì mười năm cấy truyền lại một lần

II. THIẾT KẾ QUÁ TRÌNH LÊN MEN

3.4 GIỚI THIỆU CHUNG

Quá trìn h sản xuất một sản phẩm nào đó bao gồm quá trìn h tách
chúng ra khỏi nguyên liệu. Enzym là sản phàm tổng hợp nhờ sinh vật xảy
ra trong quá trình lên men. Như vậy, thiết kế quá trình lên men là nhằm
giúp quá trình tổng hợp sau đó thu được lượng enzym cao nhất có hoạt tính
lớn nhất.
Đối với những cơ thê đa bào như động vật và thực vật, ngoài enzym
thu được ra ta còn phải giải quyết một lượng chất thải rất lớn từ sinh khôi
trên. Trong khi đó, thu nhận enzym từ vi sinh vật khác hẳn với nguồn
động vật và thực vật ở chồ lượng sinh khối không nhiều, dễ thực hiện theo
qui mô công nghiệp, có khả năng cơ giới hóa, tự động hóa và hoạt tính
enzym vừa ổn định vừa cao. Mặt khác, bằng công nghệ gen ta có th ể hoàn
chỉnh hệ thống tổng hợp enzym ồ vi sinh vật dễ dàng và có hiệu quả hơn
hẳn đối tượng trên.

3.5 THIẾT KẾ QUÁ TRÌNH

Nhiệm vụ quan trọng của nhà máy công nghệ lên men ỉà làm sao cung
cấp đủ nhu cầu môi trường để tiến hành các quá trình sinh học. Nhu cầu
môi trường cho sự phát triển của sinh vật phải mang tính kinh tế, để cuối
cùng ta thu được hiệu quả kinh tế cao.
Nhiệm vụ đó nằm trong việc th iết kế môi trường, được xác định bởi
NHƠNG VẤN ĐẾ KỲ THUẬT VÀ PHUƠNG PHÁP CHUNG 75

nhu cầu môi trường cho quá trình sinh học.

1- Thiết k ế môi trường
Thiết kế mỏi trường là sự xác định điều kiện phản ứng cần thiết đế
tạo ra những sản phẩm theo yêu cầu có chất lượng tôt.
Điều kiện phản ứng bao gồm pH, nhiệt độ, oxy hòa tan, hoạt tính
nước, th àn h phần dinh dưỡng, cơ để tạo ra sản phẩm.
Cùng với thời gian, các yếu tô' môi trường trên có ảnh hưởng rấ t lớn và
mang tính quyết định đến số lượng, chất lượng sản phẩm cuối cùng.
Các sản phẩm tạo ra từ quá trình lên men vi sinh vật thường qua hai
giai đoạn:
- Sự phát triển vi sinh vật.
- Quá trìn h tạo thành sinh khối.
Hai giai đoạn này thường biểu hiện những đặc tính sinh học, hóa học,
lý học rấ t khác nhau trong quá trình lên men. Thông thường, quá trình tạo
sinh khối (sự phát triển của yi sinh vật không khi nào trùng với quá trình
sinh tổng hợp enzym của chính nó. Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy
quá trình sinh tểng hợp enzym bao giờ củng đạt cực đại trước khi quá
trình tạo sinh khối đạt cực đại. Như vậy, rỏ ràng nhu cầu về môi trường
của hai quá trìn h này là hoàn toàn khác nhau. Việc th iết kế môi trường cho
phù hợp từng giai đoạn là rấ t cần thiết nhằin thu nhận hiệu quả cao nhât.
2- Kỹ thuật lên men
Kỹ th u ật lên men bao gồm th iết kế, triển khai, xây dựng và điều hành
hoạt động quá trình theo kế hoạch đả định về mói trường theo dung tích
thiết bị lên men (ta hiểu thiết bị lẽn men như thùng chứa có khả năng
kiểm soát các điều kiện lên men và sinh khôi vi sinh vật).
Trong quá trình lên men dạng công nghiệp, có thể có nhừng tương
đồng rất iớn giữa nhừng kết quả đạt được ở phòng thí nghiệm nhưng với
quĩ mô lớn hơn râ't nhiều cả về khôi lượng giông vi sinh vật, cả về khôi
lượng nguyên liệu được đưa vào.
Trong thực tế, sự vận hành quá trình lên men công nghiệp có một sô'
đặc điểm khác biệt với các quá trình lên men được vận hành ở phòng thí
nghiệm. Khi ta tiến hành quá trìn h lên men với dung tích lớn hơn các dung
tích ở phòng thí nghiệm sẽ có sự thay đổi rấ t lớn trong quá trìn h chuyển
dịch nhiệt ìẽn men, chuyển dịch vật chất (nguyên liệu và sinh khối),
chuyển dịch vật chất sau lên men, sự khác biệt rấ t lớn về áp suất giữa bề
mặt và đáy thiết bi lên men. Tất cả những điều đó phải được tính toán và
76 CHƯƠNG 3

phải định hướng trước để khi điều hành quá trìn h sẽ không có sự sai biệt
nhiều. Cũng cần phải nhân mạnh một điều rấ t quan trọng khác là chúng ta
cần vận hành phản ứng sinh học trong quá trìn h lên men hoàn toàn khác
với việc vận hành một hoặc vài phản ứng hóa học trong bình phản ứng. Sự
khác biệt chính là chất tham gia các phản ứng ở quá trình lên men là cơ
th ể sống. Đã là cơ thể sống thì chúng rất nhạy cảm với các điều kiện môi
trường. Do đó việc vận hành phản ứng sinh học thường phức tạp hơn rất
nhiều so với vận hành bình phản ứng hóa học.
3* Phưcrng pháp vận hành quá trình lên men
Việc chọn lựa phương pháp vận hành quá trình lên men dựa trên kiếu
hình Jên men (lên men kín hay lên men hở) , phương thức lên men (lẽn
men theo chu kỳ hay lên men liên tục)
L ên m en tro n g th iế t bị lên m en k ín
Yêu cầu quan trọng nhâ't của việc vận hành thiết bị lên men kín là
môi trường lên men phải được vô trùng tuyệt đối trước khi vận hành quá
trình lên men, trong suôt. quá trình lên men và cho đến khi kết thúc quá
trình lén men. Mặt khác, ta cũng phải quan tâm đến sự thay đổi cùa pH
trong khi lèn men. sự thổi khí (nếu cần thiết) và sự tạo thành khí do quá
trình lên men. Các yếu tố này cũng đòi hỏi phải được vồ trùng. Trong khi
lên men liên tục, việc cho nguyên liệu vào và lấy sản phấm ra liên tục đòi
hỏi hạn chế sự nhiễm vi sinh vật rất cao.
Tất cả những điểm nêu trên đòi hòi tính ổn định rất cao. Có như vậy
ta mới thu được sản phẩm có chất lượng ổn định.
Đ ộ n g h ọ c củ a sự p h á t tr iể n
Phương pháp thống kê đóng vai trò quan trọng, giúp ta thiết kế môi
trường lên men. Tuy nhiên, các phương pháp xử lý số liệu hay vi tính sẽ
giúp ta làm việc này tốt hơn. Chính vi thế, các phương pháp phân tích toán
học thường được ứng dụng rộng rãi để đánh giá quá trình phát triển của vi
sinh vật.
Ty lệ phat triên đặc hiệu (specific growth rate), đươc biéu diễn bằng
chữ |i tuân theo luật Malthus (Malthus, 1798).

(3.1)

từ đó: n = Ẻ ^ /ề}. = d(ln-w)

w . dt (3.2)

trong đó: w - vi sinh vật hay lượng sinh khối; t - thời gian
NHỮNG VẤN ĐỂ KỲ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 77

Phương trình biểu diền sự phát triển* của vi sinh vật được biếu diền
qua mối tương quan giữa cơ châ't và vi sinh vật đang phát triển

— = K2 w s (3.3)
dt 2
trong đó: K2 - là hệ sô" tỷ lệ phản ứng bậc hai.
Phương trình trên có thể được thay đổi nếu s có thế được thay th ế
trong w. Khi đó hệ sô hiệu suất phát triển {growth yield coefficient) Y biểu
thị cho tỷ sô" chuyên hóa chất dinh dưỡng vào sinh khôi.
Y = _dw = dw /dt (34)
ds -d s /d t
Dấu (-) ở dưới chỉ sự giảm của sinh khối trong môi trường.
Sự thay đổi của giá trị Y là điều đương nhiên. Nhưng điều đó chỉ có ý
nghĩa khi Y được xác định trong một khoáng thời gian xác định nào đó.
Khi dó: Y = W~ W-? (3.5)
S0- S
ở đây: w0 - là lượng sinh khối ở thời gian t 0 = 0 (bắt dầu quá trình).
Từ đó ta có thể biểu diễn phương trình sau:
= K 2w | s > ~ M = K 2W(Ys +w0- w ) (3 6)
dt 2 H Y J Y
Như vậy nhóm (Y.So + WG) được xem như khả năng có được sinh khối
cao nhât. WM có th ể có trong toàn bộ hệ thống khi mà chất dinh dưỡng
được chuyến vào sinh khôi:
WM = w„ + YS0 (3.7)
Khi đó phương trình (3.6) sè có dạng
dw = K2w(wm-w )
đt Y
Dạng phương trình này hoàn toàn hợp lý. Tính hợp lý của nhừng
phương trình trên đã được kiểm chứng qua những thí nghiệm nghiên cứu và
quá trình lên men penicillin của W inkler (1991). Tính hợp lý của phương
trìn h bây giờ được biểu diền:
Mt = M -^ >1 (3.9)
[ w 0(WM - W 0 )J

w n -wM(exp-M-t) (3 10)
hay: w =
WM + W 0(exp-MT - 1 )

ở đó: M = K-2 ^ (3.11)

78 CHƯƠNG 3

Điều đó cho thấy tỷ lệ phát triển riêng giảm khi mà nồng độ sinh khối
tăng.
dw /dt = K 2 ( WM - W )
w Y
Từ phương trình (3.3), tỷ lệ phát triển riêng tăng tỷ lệ thuận với nồng
độ chất dinh dưỡng:
d w /dt „ 0 Ễ~
——— = ịi = K2S (3.13)
w
Trong thực tế đê hiếu kiểu tăng trưởng theo động học Blakman có rất
nhiều hạn chế, vì rằng khi nồng độ chát dinh dưỡng cao sè ức chê sự phát
triển của tế bào đồng thời làm giảm hoạt tính cúa nước.
Nhừng hạn chê trèn sè dẫn tới tý lệ phát triển riêng là Um được biểu
diễn theo phương trìn h sau:
K 9 ( wm - w )
n - —á— ------- đôi với M < |ÌM (3.14)

Kế cả khi
Vấn đề phát triển của tê bào tuân theo định luật ciia Monod. Ỏng ta
đã cho thấy rằng quá trin h chuyên hóa vật chất trong mỏitrường nuôi cấy
tế bào tuân theo định luật* michaelis- Menten (định luật động học enzym)

’ - & §
trong đó: Ks - ỉà hằng số Monod, và nó tương údìg với nồng độ cơ chất khi
mà tỷ số phát triển riêng bằng một nửa giá trị iớn nhất
Trong trường hợp s lớn hơn rấ t nhiều so với Kíị thì n =
Trong trường hợp s rấ t nhỏ (S nhỏ hơn so với Ks) thì sè có phương
trình:
|ivf s
n = ~ ~ (3.16)

Phương trìn h này tương quan với phương trình (3.13)

Í T ' = K2 <3.17)

Môi tương tác Monod dê bị lạm dụng, vì thê chúng phải được xác định
trên một thời gian nhất định để đạt được nồng độ sinh khối w

„ M.t = In M L 8)
l w0 J I WM J ( w 0 ( WM - W o ) J
Môi tương tác này cho thây khi nồng độ sinh khối đ ạt cao n h ất dóng
NHỮNG VẤN ĐỂ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 79

thời với sự giảm nồng độ châ't dinh dường trong môi trường. Tất nhiên, khi
đó hệ sô" tê bảo hòa Ks sè tàng lên.
Phương trình Monod cho ta một cơ sơ đã xác định nhiều phương án
khác nhau đế xác định sự ức chế cùa cơ chât:

(3.19)

ở đây: Ki - là hệ sô" ức chế

(3.20)

khi Kw là hệ sô' ức chế sinh khôi bằng sản phẩm tạo thành:
(3.21)

ồ đây: p - là nồng độ sản phẩm; Kp - là hệ sô' ức chế của sản phẩm.

Sự tạo thành sản phẩm
Quá trình lên men sẽ tạo ra sản phẩm và sinh khôi. Thực tô sản phẩm
phải được tạo ra từ sinh khôi và các chất dinh dưỡng hay cơ chất. Sản
phẩm được tạo ra thường tỷ lệ thuận với sinh khôi tạo th àn h
% = Kp.w - KdP (3.22)
đr
trong đó: Kp và K|) - là tỷ lệ sinh khôi tạo thành riêng và tỷ lệ sản phầin
hư hỏng riêng. Giá trị cả hai hệ sô' chịu ảnh hưởng bởi điều kiện bên ngoài
ví dụ nhự nhiệt độ chẳng hạn.
Hệ nuôi liên tục
a) Nuôi cấy liên tục nhiều bình phản ứng sinh học
Nuôi cấy iiên tực là một quá trình vận chuyển vật chât và quá trình
phản ứng sinh học xảy ra từ bình lên men này sang bình lên men khác.
Toàn bộ các quá trình này xảy ra trong một hệ thống kín từ đầu vào cho
đến đầu ra.
b) Nuôi ỉiên tục từ một bình phản ứng sinh học
Ta có th ể nuôi vi sinh vật trong một bình phản ứng sinh học liên tục.
ở đó, đầu vào phải có tốc độ bằng đầu ra. Điều khác là trong hệ lên men
liên tục nhiều bình phản ứng đòi hỏi thời gian dài hơn trong lên men liên
tục chỉ từ một bình phản ứng. Do đó việc áp dụng cũng tùy thuộc vào chu
kỳ sinh lý của vi sinh vật trong mỗi một quá trìn h riêng.
80 CHƯƠNG 3

Như vậy xuất hiện môi tương quan giừa nồng độ tê bào vi sinh \ ật, cơ
chất và tốc độ tăng trưởng riêng
Tỷ lệ tăng - tỷ lệ đầu vào + tỷ lệ tăng - tỷ lệ mát (3.23)
= 7xV w - f w (3.24)
dt M
trong đó: V - dung tích bình lên men; n - tỷ lệ tăng trường riêng
w - nồng độ sinh khối; f - tốc độ dòng chảy ra.
Trong bình lên men ổn định, sự phát triển của vi sinh vật sẽ tương
ứng với lượng sinh khôi ra khỏi bình phản ứng
f.w = \^.w (3.25)

và: ịi = Ậ = D (3.26)

ở đây: D - được gọi là tỷ lệ pha loãng.

Sinh khối sẽ giảm tới zero ở độ pha loăng zero, ở tỷ lệ pha loãng cao
sinh khôi sẽ giảm tới zero. Phần sinh khôi m ất đi sẽ nhanh hơn phần mới
tạo thành. Tương quan Monod sẽ gần với thực tế hơn. Trong những bình
phản ứng nồng độ sinh khôi sẽ tập trung ở tỷ lệ pha loãng:
w = Y [ s 0- D.Ks (Hm - D)] (3.27)
Tỷ lệ pha loãng giới hạn, nồng^íộ sinh khôi sẽ giảm xuống zero và tỷ
lệ pha loãng sẽ tương đồng:

Dc = — % (3.28)
Ks +S0
Thực tế tỷ lệ phát triển riêng của vi sinh vật có thể đạt tới tối ưu
trong điều kiện trên vì tỷ lệ pha loãng (Washout dilution rate Dc) có thể
nhỏ hơn tỷ lệ phát triển riêng UM và vì th ế nồng độ sinh khối có thể sẽ
nhỏ hơn giá trị cao nhất cùa YS0.
c) Kiểm soát quá trình
Quan trắc và kiểm soát quá trình hoạt động của hệ thông lên men liên
tục không ôn định thường khó hơn râ t nhiều so với quan trắc và kiểm soát
hoạt động của hệ thông lên. men liên tục ổn định. Tuy nhiên hệ thông kiểm
soát bàng máy tính có thê giải quyết được những vấn đề quan trọng. Bằng
biện pháp này ta có thể đưa toàn bộ hệ thống từ trạng thái không ổn định
trở vê trạng thái ôn định. Trong suôt quá trìn h này sản phẩm tạo thành sẽ
hoàn toàn tốt và tránh được sự nhiễm bởi vi sinh vật.
Sự cân bảng giữa tỷ lệ phát trien vi sinh vật và tỷ lệ vật chất chuyển
hóa trong hệ thông lên men liên tục có những môi liên quan khác đôi với
NHỮNG VẤN ĐỀ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 81

hệ thống lẽn men theo chu kỳ, trong đó có nhận định rằng, nồng độ sinh
khối ở quá trìn h lên men theo hệ thông liên tục thường thấp hơn hệ thống
lên men theo chu kỳ, và tỷ lệ phát triển riêng của sinh khôi không thể đạt
mức tối ưư.
Trong lên men theo chu kỳ ta dề dàng phân ra các phase riêng biệt
(pha tạo sinh khồi, pha tạo sản phẩm). Trong lên men theo hệ thông liên
tục, các pha thường không rõ ràng và đan xen với nhau. Trong lên men
theo chu kỳ, không có sự bổ sung chất dinh dường; ngược lại, trong lên men
liên tục, ta phải bố sung chất dinh dường liên tục, có như vậy quá trìn h mới
xảy ra liên tục.
Chính vì những khác biệt trên, người ta đã đưa ra nhừng tiến bộ về
việc kiềm soát các yếu tô môi trường, chi phôi quá trình lên men liên tục
như nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hòa tan, chất dinh dường cơ bản, trong đó,
việc kiểm soát nồng độ chất dinh dưỡng vào hệ thống đóng vai trò rấ t quan
trọng.
Một điểm lưu ý nữa là trong lên men liên tục, sinh khối ở đầu ra có
thể được tái sử dụng lại. Điều này có ý nghĩa kinh tế rất lớn. Tuy nhiên
việc làm này có thê sè gây ra những mối nguy nghiêm trọng, đó là sự tái
nhiễm vi sinh vật trong quá trình lên men.
Vận hành quá trình
Điều quan trọng của quá trình vận hành th iết bị lên men chính là
kiểm soát được nồng độ chất dinh dưỡng trong dịch lên men ở đầu vào. Hệ
thống này được hiểu như quá trình bình phản ứng cung cấp ựcd-bátch
process). Hệ thống này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất
men bánh mì, kháng sinh, enzym, axit amin và nhửng axit hữu cơ khác.
Việc cung cấp các chất dinh dường (phải là các chất có tính hòa tan
cao) vào các th iế t bị lên men được xem như một phương pháp kiểm soát tỷ
lệ phát triển của tế bào. Điều quan trọng nhất là làm sao kiểm soát và giữ
ổn định được phase tạo sản phẩm cuôì trong hệ thống lên men.
Trong’quá trình kiểm soát hệ thống, người ta còn sử dụng phương
pháp kiểm tra độ nhớt của dịch lên men. Độ nhớt của địch lên men thường
rấ t dễ thay đổi. Chỉ cần thêm một lượng nhỏ nước, độ nhớt này cũng thay
đổi mạnh. Độ nhớt dịch lên men càng thấp thì khả năng hòa tan của oxy
sẽ càng lớn, đồng thời nhiệt tạo ra trong quá trình lên men sẽ được giải
phóng nhanh hơn.
82 CHƯƠNG 3

a) Hiện đại hóa quá trình lẽn men

Mục tiêu của quá trình lên men là làm sao thu được sản phẩm có chất
lượng và số lượng cao nhất. Người ta đã sử ciụiig phương pháp toán học đế
làm việc này. Viộc cung cấp các chât dinh dường phù hợp cho sự phát triển
của vi sinh vật là chìa khóa của quá trình này. Việc tàng dung dịch sẽ làm
tăng lượng chất dinh dưỡng. Tuy nhiên 11Ó cũng sẽ làm giảm lượng sinh
khối và làm giảm sán phẩm của quá trình:
(3.29)
V
flS0+S>
+ ----2-J---- (3.30)
dt Y V

(3.31)

Các phương trình trên có thề kết hợp với giá trị ịi và Y trong phương
trình (3.2) (3.4 >(3.5). Và đây là cơ sở đế tối ưu hóa sự tạo th àn h sinh khối
và sán phá 111.
b) Thời gian cấp thêm chất dinh dưỡng
Từ phương trình (3.29) (3.31), hệ sô năng suất phát triển Y và tỷ lệ
phát triốn riéng |Li(s) và tý ỉệ tạo sản phâm riêng Kp(M) cần làm thực
nghiệm và nếu có thể, các giá trị hệ sô K|) trong điều kiện ảnh hưởng của
pH và nhiệt độ cũng cần được làm thực nghiệm.
c) Thời gian cấp thêm với chất ức chế
Quá trình lên men sè đạt được hiệu quá cao khi cơ chất lên men ức chẽ
sự phát triển có nồng độ cao nhưng lại tham gia vào quá trình trao đổi chất
ở nồng độ thấp. Có một số nồng độ cơ chất, ờ đó tỷ lệ phát triển riẻng là
cao nhất, ơ đó sản phấm tạo ra là chất ức chế sự phát triến cũng như sản
xuất ethanol hay penicilline là những sản phẩm cuối ức chế sự p hát triển
cùa vi sình vật.
4- Kiểm soát thích ứng
Kiêm soát thích ứng là hệ thông kiểm soát d đó người kiểm soát phải
hiếu biết toàn bộ quá trình và kiểm soát được chúng. Các dữ liệu được lấy
từ quá trình tự nó được sử dụng để kiểm soát quá trình.
Thuật ngữ người quan trắc quá trình chỉ rõ người biết thu nhận sô*
liệu, xử lý số liệu và điều khiển số liệu đó bằng vi tính.
5- Cơ sở hiểu biết quá trình kiểm soát
Nhờ có vi tính, quá trình kiểm soát <!â có những thuận lợi và bước tiến
NHỮNG VẤN ĐẺ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 83

bộ rấ t lớn. Nó còn giúp ta giừ lại những kinh nghiệm của kho kiến thức to
lớn của loài người.
Kiểm soát lên men được gọi là kiềm soát trạng thái bền vững sinh lý
có cơ sô lý thuyết của thuyết sinh lý học. Do đó người kiểm soát phải hiểu
biết sinh lý của vi sinh vật
6- Tỏi ưu hóa thống kê
Nội dưng bao gồm sự tạo thành sản phẩm trao đổi chất bậc hai, ví dụ
như ensym chẳng hạn. Tất cả phải được biểu diễn bằng mô hình toán học
và được tối ưu hóa bằng vi tính. Sự tối ưu hóa này giúp làm tăng năng suất
lên men. Chương trình thực nghiệm phải được làm rấ t cẩn thận, bởi vì chỉ
cần một sai sót nhỏ cũng có thế dẫn đến hậu quả to lớn khi ta tiến hành
tối ưu hóa bằng toán học và bằng vi tính.
a) Phân tích yếu tố
Bước đầu tiên dề giải quyết điều kiện của quá trình cần phải phân tích
các yếu tô ảnh hưởng tới quá trình. Điều đó có thế là cơ sơ cho sự hiếu biết
quá trình và từ đó ta sẽ phân tích các yếu tô' của quá trình. Các yếu tố của
quá trình không chỉ ảnh hưởng độc lập mà còn r<> anh hưởng dây truyền, ví
dụ, sự thay đổi thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy không chỉ
làm ảnh hưởng đến sinh lý và sự phát triển của vi sinh vật trực tiếp mà
còn làm thay đổi độ nhớt của môi trường, từ đó làm ảnh hưởng gián tiếp
đến sự phát triển của vi sinh vật, đến khả năng hòa tan của oxy và sự
truyền nhiệt trong dịch lên men. Phân tích các yếu tô" giúp ta hệ thông hóa
toàn bộ và tìm ra được những yếu tô ảnh hưởng chính đến quá trình. Từ đó
ta điều khiển chúng theo chương trình lập sẵn của hệ thông máy tính.
b) Tôi ưu hóa yếu tố đơn
Tối ưu hóa yếu tô' đơn là làm thay đôi một yếu tồ" theo mức độ khác
nhau và giữ cô' định tấ t cả các yếu tố khác. Lần lượt như vậy ta sè có nhừng
yếu tô' tôi ưu cho cả quá trình. Phương pháp này nhanh chóng cho ta những
kết quả cần thiết, song sẽ có những sự sai lệch rấ t lớn nếu như các yếu tô"
này có ảnh hưởng đan xen và qua lại với nhau.
c) Thiết kế các yếu tô' thí nghiệm
Phương pháp th iết kế yếu tô' thí nghiệm được thực hiện trong trường
hợp các yếu tô có ảnh hưởng đan xen nhau và tác động qua lại với nhau,
phương pháp này cũng đòi hỏi phải thực hiện nghiêm túc các thí nghiệm để
thu nhận được những kết quả th ậ t chính xác.
84 CHƯƠNG 3

d) Thiết kế các yếu tô' từng phần

Thiết kế các yếu tố từng phần trong thí nghiệm nhằm làm giảm số
lượng thí nghiệm cần thực hiện, trong đó có nhiều yếu tố không quan trọng
được loại bỏ. Khi đó ta chỉ xem xét những yếu tố mang tính quyết định cho
quá trình và lập ra ma trận của thí nghiệm. Thực hiện các thí nghiệm theo
ma trận và mô hình hóa chúng bằng phương trình toán học.

III. THIẾT BỊ LÊN MEN

Thiết bị lên men đóng vai trò rấ t quan trọng trong công nghệ vi sinh
vật. Đây là một lĩnh vực rấ t phức tạp và nhiều trường hợp thay đôi th iết bị
lên men hợp lý sẽ thu được kết quả lẽn men rấ t tốt. Việc th iết k ế chế tạo
th iết bi lên men có ảnh hưởng rấ t lớn đến quá trình sinh lý của vi sinh
vật.
Chúng ta phải hiểu rằng việc chuyển một giốhg vi sinh vật từ giông
gốc được phân lập từ điều kiện tự nhiên sang quá trìn h sản xuất cồng
nghiệp trải qua hai giai đoạn có tính quyết định đến sinh lý của vi sinh
vật:
1- Giai đoạn từ điều kiện tự nhiên không kiểm soát sang điều kiện
nuôi cây trong phòng thí nghiệm và sản xuất thử với các yếu tố ảnh hưởng
tới sinh lý của vi sinh vật hoàn toàn có kiểm soát.
2- Giai đoạn từ điều kiện có kiểm soát ở mức độ nhỏ trong phòng thí
nghiệm sang giai đoạn sản xuất lớn với qui mô lớn. Các thiết bị lên men
vài chục m3 đến hàng ngàn m3. Khi đó mọi yếu tố ảnh hưởng đến sinh lý
của vi sinh vật hoàn toàn khác với điều kiện trong phòng thí nghiệm.
Ví dụ, sự truyền nhiệt ồ thiết bị phòng thí nghiệm khác sự truyền nhiệt ở
th iết bị sản xuất; sự chuyển động vật chất (cơ chất, chất dinh dưỡng) trong
th iết bị phòng thí nghiệm khác trong thiết bị sản xuất, áp suất và khả
năng hòa tan của oxy cùng tương tự.

3.6 THIẾT BỊ có CÁNH KHUẤY

Các th iê t bị có lắp đặt cánh khuây đều được ứng dung trong quá trình
lên men hiếu khí cũng như trong lên men yếm khí. Cánh khuấy trong hai
trường hợp này có những tấc dụng như sau:
1- Cánh khuây lam tầng kỉiả Hãng tiêp xúc giữã chất dinh dưỡng và tế
bào vi sính vật. Có tiếp xúc giữa chất dinh dưdng với, tế bào vi sinh vật mđi
có sự trao dổi chất. s * â năng tiếp xúc càng nhiều, khá năng trao đổi chất
NHỮNG VẤN ĐỀ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 85

càng mạnh. Do đó, cả hai phương pháp lên men hiếu khí và kỵ khí đều cần
có cánh khuấy.
Sự tiếp xúc này có thể được thực hiện từ những vị trí xa nhau giữa
chất dinh dưỡng và vi sinh vật. Ví dụ, tế bào vi sinh vật ở vị trí rấ t xa chất
dinh dưỡng, nhưng do cánh khuấy hoạt động, cả tế bào và chất dinh dưỡng
sẽ chuyền động và có cơ hội gặp nhau.
Sự tiếp xúc này còn biểu hiện ở chỗ, trong khi tiến hành các quá trìn h
trao đổi chất, các chất sau đồng hóa và dị hóa sẽ tạo ra một lớp bao quanh
tế bào. Lớp bao quanh tế bào này sẽ làm cản trở sự chuyển vận các chất
vào tế bào. Khi cánh khuấy hoạt động, lớp bao qưanh này sẽ bị phá bỏ, như
vậy mức độ xâm nhập của các chất dinh dưỡng sẽ mạnh hơn.
’ 2- Trong trường hợp lên men trong điều kiện hiếu khí cánh khuấy làm
tăng khả năng hòa tan của oxy. Các khí sẽ ở lại lâu hơn do dòng chuyển
động của môi trường, và như vậy, khả năng hòa tan của oxy từ bọt khí sẽ
cao hơn.
Cánh khuấy làm tăng khả năng tách các khí CƠ2, H2S, từ quá
trình trao đổi chất, và như vậy, sẽ làm giảm ảnh hương xâu của các loại
khí này đến sinh lý của vi sinh vật.
3- Cánh khuấy làm tăng nhanh các quá trình sinh sản cúa vi khuẩn
nấm men và nấm sợi: do tác động cơ học mà các tế bào dề dàng tách ra và
sông độc lập.
Trong phòng thí nghiệm, người ta thường thay cánh khuây bằng
những máy lắc. Nhừng thiết bị có dung tích trên 1 lít người ta mới lắp
cánh khuây. Trong qui mô sản xuất công nghiệp người chỉ sử dụng máy
khuây chứ không sử dạng máy lắc.

3.7 THIẾT BỊ CÓ HỆ THỐNG THỔl KHỈ

Thiết bị có hệ thông thổi khí chỉ sử dụng trong các quá trìn h lên men
hiếu khí, Hệ thông thổi khí được lắp đặt trong các th iế t bị lên men có
những tác dạng sau:
1- Cung cấp oxy trong các trường hợp lên men hiếu khí, đặc biệt là quá
trình thu nhận sinh khôi (nấm men, nấm sợi hay vi khuẩn).
2- Cung cấp C 02 trong trường hợp nuôi cấy tảo đơn bào (Chlorelỉa
Spỉruỉina hay Scenedesmus).
3- Khuấy đảo môi trường làm tăng quá trình trao đổi chât, quá trình
phát triển và quá trình sinh sản.
86 CHƯƠNG 3

4- Giải phóng các chất khí được tạo ra từ quá trình trao đổi chât, làm
giảm ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men.
Việc cung cáp oxy hay CƠ2 cho quá trình lên men là một việc làm hết
sức phức tạp. Trong không khí, ngoài các thành phần của không khí còn
chứa rấ t nhiều vi sinh vật, do đó, không khí cung cấp cho quá trìn h lên
men đòi hỏi phải được sạch sè về vi sinh vật và các tạp chất khác.
3.7.1 Khử trùng và làm sạch không khí
Không khí trước khi đưa vào thiết bị lên men đề tiến hành các quá
trình lên men hiếu khí phải được làm sạch vi sinh vật và tạp chất. Có hai
trường hợp cung cấp không khí sạch.
1- Cung cấp oxy hay CO2 cho thiết bị lên men với dịch môi trường lỏng.
Đôi với môi trường lỏng, việc cung câ'p không khí qua những giai đoạn
theo sơ đồ sau:
Khõng khí

.Lọc1sơ bộ

r
Máy nén

T .......
Làm nguội không khí

X
Táchdáumờ

1 . thể
Lọc tổng

T
Lọc riêng

J.IL
Thiết bị lên men

Lọc sơ bọ được câu tạo bới hai lớp lưới bằng inox đươc đặt trước và sau
hai đầu hộp hình chữ n h ật hoặc hình trụ. Giừa hai tấm lưới lọc này được
xep đay cac manh sư hoặc cac vòng kim loai. Các ĩTiảnli sứ hoảc các vòng
kim loại được tẩm dầu nhờn để các loại bụi dễ bám vào đó. Phin lọc không
khí được làm theo bình trụ có hai vỏ bên trong được xếp vật liệu lọc bằng
bỏng thủy tinh, bông mỡ vải hay tấm amiang.
NHỮNG VẤN ĐẺ KỲ THUẶT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 87

K hông khi s a u k h i đ ã được lọc s ạ c h dược d ư a v ào t h i ê t bị l ê n m e n q u a

hẹ t h ố n g p h u n t i a đ ê t ạ o r a n h ữ n g b ọt k h í n h o . Bọt k h í c à n g n h ỏ t ố n g
t h i ế t d i ệ n ctia c h ú n g t i ế p xúc với d u n g d ị c h càng* l ớn. K h a n ă n g t n n c u a oxy
p h ụ t h u ộ c r ã t n h i é u v à o t h i ê t d i ệ n t i ê p xúc n à y .

2- CỉíììíỊ cấp O.VV cho quá trình lẽìi men bán rán
Nu ôi c a y b ề m ạ t t r ô n m ô i t r ư ờ n g b á n r ắ n được c u n g câp k h ô n g k hí cho
cả p h ò n g n u ô i cày. H ệ t h ố n g c u n g c ấ p oxy được b ố t r í ơ p h ò n g b è n h o ạ c ớ
trèi ầ h o ặ c ó' dư ới c ác g i á íìờ k h a y n u ô i cày.
K h ô n g k h í dược l à m s ạ c h b ằ n g c á c h đ ư a k h ò a g k h ỉ q u n bộ l ọc SƯ bộ đ ế
loại t ạ p c h ấ t v à m ộ t p h ầ n vi s i n h vật . S a u (ló k h ô n g k h í dược c u n g c ấ p t r ự c
tiếp cho các k h a y nuôi cấy.
3 .7 .2 K iể m tr a m ứ c d ộ s ạ c h c ủ a k h ô n g k h í
Motor

Hộp giảm
tốc độ

Vỏng chống
nhiẻm trùng

Cánh Khuấy
Spatget

/ Không khi vào

lỉìn h 3.1: Thiết bị lẽn men ì 00.000 lít

88 CHƯƠNG 3

0G

1YÍ Ì LR LR LR

1.2 1.3 1.3

Thiết bị dòng chảy tràn Thiết bị bình thường
có cánh khuấy ở đáy

LR

1.4 1.5
motor SB - thiết bị bình thuỡng
- khôngkhí có nhiéu cánh khuãy
LR - thanh cản M • motor G - khôngkhí
sz - chất phá bọt I - khỏng khí tự khuấy trộn

G G 0
_ÌJ L G
X
D- -□ F-»
í- G G
o~ -o
---
D- -©

o- -o
G—
I— F
w ị (jỊ)
mẵ M - motor
1
G Hệ thống dán hòi w - thùng quay
1 á
1. 7 1.8 1.9 1.10

G G
♦ ♦

\h
V >
1. 12 1.11

Hình 3.2: Một số thiết bị lên men và kiếu tliổi klii khuây đảo
NHỮNG VẤN ĐẺ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 89

Khi cung câ'p không khí cho quá trình lên men, bắt buộc phải kiểm tra
vi sinh vật và kiểm tra tạp chất theo định kỳ xem hệ thông cung câp
không khí có còn hoạt động tốt không. Nếu hệ thông cung câp không khí
hoạt động không tốt, toàn bộ dịch nuôi cấy trong các th iết bị lên men sẽ
như một m àng lọc giữ lại toàn bộ vi sinh vật và tạp châ't từ không khí.
Phương pháp kiểm tra thực hiện giông như phương pháp kiểm tra vi sinh
vật không khí đang được thực hiện trong nhiều phòng thí nghiệm

t
\

tr

T-u
7

T Ỹ.
F
)
2.9

—1

2.5

2.4

SK

>

±
u & ID TF ID
2.8
Máy tách khí 26
2.7

H ình 3.3: S ự vận chuyển khí trong một số thiết bị lẽn men
90 CHƯƠNG 3

A Ã

G 3.1
♦-4
32 3.3
Ọ
G
A
Ạ
1
A

l Ụt
T FỊF
34 3.5 TF
G G 3.6
X
“ *ì
Y T
G
fill 'Y‘ 1. van khí
2 Static mixer
—

F
3.7 3.8

Hình 3.4: Một sô thièt bị rà sự vận chuyến dòng môi trường trang thiết hị
lẽn men

IV. THU NHẬN SẢN PHAM l ê n m e n

Thu nhận các sản phẩm cua các quá trìn h sính học thường chia ra hai
nhóm rấ t rỏ rệt.
• Sản phẩm là sinh khối sinh vật.
• Sản phẩm là các chât được tạo thành trong quá trìn h trao đỏi chất.
Đối với thực vật và động vật, sản phẩm chính của mọi quá trìn h sinh
học thu nhận thuộc sinh khối. Một lượng không lớn lắm thuộc nhóm các
chất thuộc sản phẩm bậc hai.
Ngược lại, đối vđi vi sinh vật, sản phẩm bậc hai lại được loài người
khai thác và sử dụng nhiều hơn sinh khối.
NHỮNG VẤN ĐẺ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 91

3.8 THU NHẬN SINH KHỐI VI SINH VẬT

Trong công nghệ sản xuât sinh khôi vi sinh có hai dạng:
1- Sinh khôi gồm những tế bào sông. Loại sinh khôi này bao gồm sinh
khôi vi sinh vật dùng sản xuất bánh mì và sinh khôi vi sinh vật dùng sản
xuất thuốc trừ sâu sinh học, phân bón vi sinh vật và vaccine dùng cho
người và động vật. Các loại sinh khôi này đòi hỏi phải đảm báo tế bào ơ
dạng sống và có hoạt tính sinh học cao. Do đó việc thu nhận chúng bắt
buộc phải đảm bảo các đặc tính đó không bị thay đổi.
2- Sinh khối gồm những tế bào sinh chết. Loại sinh khôi này được sứ
dụng vào hai mục đích: làm thực phẩm cho người, gia súc và sán xuât
vaccine chết. Sinh khôi bao gồm các tế bào chết không cần đến sự hoạt
động của chúng, do đó việc thu nhận chúng trớ nên dễ đàng hơn.
Từ đó, ta có thế áp dụng những phương pháp cơ bản sau đế tách sinh
khôi ra khỏi dịch lên men:
1- Phương pháp lọc
Lọc là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất, qua lớp lọc.
Phần không qua lọc nằm trên lớp vật liệu lọc, dung dịch và nhừng phần
qua vật liệu lọc xuống dưới. Quá trình lọc là quá trình vật lý đơn thuần.
Trong thu nhận sinh khối, thông thường người ta dùng các giống vi sinh
vật có kích thước lớn. Vi sinh vật càng có kích thước lớn, càng giúp ta lọc
nhanh. Tuy nhiên phương pháp lọc chỉ áp dụng trong việc thu nhận sinh
khối tảo, còn các vi sinh vật khác ít được sử dụng vì kích thước của tảo đơn
bào rấ t lớn, các vi sinh vật khác lại quá nhỏ.
Tốc độ lọc thường rất chậm nên việc áp dụng đế thu sinh khối cũng ít
được quan tâm.
Tuy nhiên, việc áp dụng phương pháp lọc khung bản đã làm tăng năng
suất lọc lên rấ t nhiều. Phương pháp lọc này nhanh chóng được áp dụng
trong công nghệ sản xuât bia và một sô công nghệ sản xuất các sản phẩm
bậc hai khác.
2- Phương pháp ly tăm
Dựa trên trọng lượng riêng của vật chất, người ta dùng lực ly tâm tạo
ra hiện tượng tách pha lỏng yà pha rắn trong dịch nuôi cấy. Có hai kiểu ly
tâm đang sử dụng trong công nghệ vi sinh:
- Phương pháp ly tâm lắng
92 CHƯƠNG 3

- Phương pháp ly tâm lọc

Cả hai phương pháp đều có ưu và nhược đỉêm riêng của chúng. Ly tâm
lắng có ưu điểm là rấ t thuận lợi chốvìệc thu sinh khối vi sinh vật có kích
thước nhỏ. Ly tâm lọc rấ t thuận lợi đối với việc thu sinh khối vi sinh vật có
kích thước lớn. Hiệu suất làm việc của những máy ly tâm phụ thuộc rất
ỉihiềư ở to'c độ ly tàm. Do đó, tế bào vi sinh vật có kích thước và trọng
lượng riêng càng nhỏ, càng đòi hỏi phải sử dụng các máy ly tâm có tốc độ
quay lớn.
3- Phương pháp lắng
Lắng là phương pháp cơ học phàn riêng một hỗn hợp không đồng
nhất.
Trong công nghiệp người ta thường dùng những biện pháp sau trong
phương pháp lắng các tế bào vi sinh vật để vừa thu nhận sinh khối vừa thu
nhận dịch lên men.
- Để thu nhận các dịch đồ uống (bia, rượu vang, nước quả lên men),
người ta thường hạ nhiệt độ xuống khoảng từ 2 - 4°c. Ở nhiệt độ này các tế
bào vi sinh vật rấ t dễ kết lắng xuống đáy thiết bị lên men.
- Nếu chỉ để thu nhận các sản phẩm trao đổi chất bậc hai, người ta có
thê dùng các biện pháp kết tủa nhờ một phản ứng hóa học tương ứng. Sau
đó người ta thu nhận các sản phẩm kết tùa này mà không sợ bị lần sinh
khối vi sinh vật (phương pháp này thường áp dụng trong sản xuất một số
axit hữu cơ).

3.9 THU NHẬN CÁC SẢN PHẨM t r a o Đổl c h ấ t b ậ c h ai

Các sản phẩm trao đổi chât bậc hai thường lẫn trong dịch nuôi cấy vi
sinh vật, tuy nhiên, cũng có rất nhiều các chất trao đổi bậc hai còn nằm
trong tế bào vi sinh vật. Do đó, để thu nhận các sản phẩm này, người ta sử
dụng những biện pháp khác nhau và một số biện pháp giống nhau.
3.9.1 Thu nhận sản phẩm bậc hai trong m ôi trường nuôi cấy
Các sản phẩm trao đổi chất bậc hai ở trong môi trường nuôi cấy
thường nằm ở dạng hòa tan và ìẫn vào với rấ t nhiều vật chất hòa tan khác.
Do đó, việc tách một sản phẩm trong hỗn hợp rấ t nhiều sản phẩm là một
việc không mấy dễ dàng,
1- Phương pháp kết tủa
Phương pháp kết tủa thường được sử dụng dựa trên tính chất điện tích
NHỮNG VẨN ĐẾ KỸ THUẬT VẢ PHƯƠNG PHÁP CHUNG 93

của sản phẩm hoặc dựa trên những phản ứng hóa học đơn thuần.
Phần lớn đối với các protein, enzym, người ta thường dùng biện pháp
điều chỉnh pH đến điểm đẳng điện đế kết tủa. Phương pháp này thường
đem lại những kết quả rấ t tốt: kết tủa khá sạch. Tuy nhiên muôn có sản
phẩm tinh khiết phải tiến hành các biện pháp phân đoạn theo nhừng
phương pháp hóa lý riêng.
Đôi với kháng sinh, axit amin hay các axit hữu cơ, người ta thường
dùng những chất tương tác với chúng để tạo thành kết tủa, sau đó lại phá
kết tủa này, tinh chế chúng để tạo ra những sản phẩm sạch.
2- Phương pháp tinh ch ế sản phẩm
Sản phẩm trao đối chất bậc hai được tinh chế bằng nhiều phương pháp
khác nhau:
a) Sắc ký trao đổi ion
Các chất có hằng số’ phân lý khác nhau đối với cation và các anion.
Dựa trên tính chất này người ta gắn các sản phẩm vào các cation hoặc các
anion. Sau đó người ta iấy các sản phẩm này ra khỏi các cation hoặc anion
bằng những dung dịch muôi tương ứng.
b) Phương pháp lọc gel
Dựa trên tính chất các phân tử nhỏ hơn các ìỗ của gel sẽ chui vào bên
trong các lỗ, các chất có phân tử lớn hơn sẽ không bị trôi đi, người ta dùng
cách cho dung dịch lên men đi qua những cột gel để có thể tách cấc phân tử
ra theo kích thước của chúng.
c) Sắc k ý ái lực
Trong phương pháp này các chất mang chứa các nhóm hóa học có ái
lực đặc biệt với sản phẩm. Các sản phẩm sẽ được gắn một cách chọn lọc
đặc biệt với châ't mang. Tất cả các thành phần khác của dịch lên men sẽ đi
qua. Sau khi quá trìn h hấp phụ hoàn tấ t thì sản phẩm được rút ra bằng các
chất hóa học thích hợp.
3.9.2 Thu nhận các sản phẩm trong t ế bào vi sinh vật
Có rấ t nhiều chất được tạo thành trong tế bào vi sinh vật có hoạt tính
sinh học rấ t mạnh hoặc các chất có ý nghĩa rất lớn trong y học và trong
công nghệ thực phẩm.
Để nhận các sản phẩm này không thể áp dụng những phương pháp
thông thường mà phải tách chúng ra khỏi tế bào.
Mỗi loài vi sinh vật có cấu trúc hav tính chát cửa thành tế bào khác
94 CHƯƠNG 3

nhau, do đó, ta phải sử dụng nhiều phương pháp phá vờ tê bào đế thu nhận
các sản phẩm nội bào.
Cò ba nhóm phương pháp phá vỡ tế bào vi sinh vật:
- Phương pháp hóa học.
- Phương pháp ìý học.
- Phương pháp sinh học.
1- Phương pháp hóa học
Phương pháp hóa học thường sử dụng nhất là dùng axit để thủy phân
các thành phần thành tế bào. Tuy nhiên, cho axit quá nhiều có thể dẩn đến
những thay đổi về bản chất hóa học hoặc tính chất vật lý của các sản phẩm
có trong tế bào.
Người ta củng có thể sử dụng kiềm để làm việc này, nhưng nếu sản
phấm là nhừng axit thì người ta không sử dụng kiềm để xử lý.
2- Phưcrng pháp vật lý
Người ta sử dựng nhiều phương pháp vật lý khác nhau để phá vỡ
thành tế bào:
- Phương pháp lạnh đông nhanh và tăng nhiệt đột ngột. Sự thay đổi
nhiệt đột ngột, thành tế bào vi sinh vật rấ t dễ bị vỡ.
- Phương pháp nghiền trong những máy nghiền chuyên dùng hoặc
nghiền bi.
- Phương pháp tạo áp suất thẩm thấu cao. Ap suâ't cao sẽ tạo ra sự phá
vơ tế bào mà không gảy ra những thay đổi vật chất bên trong tế bào.
3- Phương pháp sinh học
Phương pháp sinh học được sử dụng nhiều n hất là phương pháp
enzym. Người ta dùng các enzym tương ứng với các cơ chất có trong thành
phần thành tế bào, thủy phân cơ chất và như vậy thành tế bào sẽ bị phá
vỡ.
Sau khi thành tế bào bị phá vỡ bằng một trong ba phương pháp trên,
người ta thu được dịch tế bào. Sau khi thu được dịch tế bào, người ta sử
dụng một trong những phương pháp làm sạch và tinh chế như đã trìn h bày
trẽn để thu nhận các sản phẩm ta cần.
Những phần trìn h bày của chương này bao gồm tấ t cả kiến thức cơ bản
có tín h chât khái quát để ta hình dung toàn bộ quá trìn h sản xuât các sản
phâm từ vi sinh vật. Các quá trình này sè được trình bày chi tiết trong
từng qui trình cụ thể ở những chương sau.
 Chương

CÔNG NGHỆ SẢN XUAT

V I SINH VẬT
Trong các quá trình sản xuất sinh học người ta thường quan tâm đến
hai rrhóm sản phẩm:
• Sinh khôi:
• Các sán phẩm trao đổi chất bậc hai.
trong đó, sinh khỏi là sản phẩm quan trọng nhất của quá trình sán
xuất nông nghiệp và chăn nuôi. Đôi với thực vật và động vật, sản phám
chính của quá trình sản xuất là sinh khôi.
Riêng trong lĩnh vực sản xuất, vi sinh vật, sinh khỏi không phải là
sản phâm chính nhưng lại là lình vực đem lại lợi uhuận cao nhất, troag dó
sinh khối nấm men dùng trong sản xuất bánh mì ở các nước châu Au được
sản xuât với số lượng lớn n h ất trong các dạng sinh khôi từ vi sinh vật.
cỏng nghệ sán xuât sinh khôi vi sinh vật thường không khác nhau
nhiều về nguyên lý điều hành, tuy nhiên lại có những điểm khác nhau rất
lớn về giỏng vi sinh vật, về môi trường, về điều kiện lèn men, về quá trình
thu nhận, ứng dụng sán phẩm. Các quá trình công nghệ sán xuất sinh khôi
từ vi sinh vạt bao gồm:
a) Công nghệ sản xuất sinh khối nấm men, sử dụng trong sail xuât
bánh mì, ihực phẩm gia súc.
b) Cóng nghệ sán xuât sinh khôi vi khuán đê sản xuất phân bon cỏ'
định đạm.
c) Công nghệ sản xuất sinh khối vi sinh vật đê sản xuât thuốc trừ sâu
sinh học.
d) Công nghệ sản xuất protein đơn bào.
e) Công nghệ sản xuất sinh khôi dùng làm thuốc chữa bệnh.
Mỗi một công nghệ có những kỷ thuật riêng. Do đó, việc xem xét kỹ
từng công nghệ.
96 CHƯƠNG 4

I. CÔNG NGHỆ SẢN XUÂT NÂM MEN BÁNH MÌ VÀ

NẤM MEN DỬNG CHO THựC PHAM g ia s ú c

4.1 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT NẤM MEN BÁNH MÌ

4.1.1 Vai trò của nấm m en trong sản xuất bánh mì

Trong công nghệ sản xuất bánh mì, giai đoạn lên men bột mì đóng vai
trò quyết định đến chất lượng bánh mì. Quá trìn h lên men được thực hiện
bởi nảm men. Khi đó nấm men sẽ chuyên hóa đường có trong bột mì thành
cồn và CƠ2 theo phương trìn h phản ứng sau:
CbH I20„ Nấnì mcĩ 2C,Hr,OH + 2COọ
Chính C 02 sè là tác nhân làm bánh mì nở. Khi CO2 được tạo thành sẽ
bị giữ lại trong các mạng gluten. Gluten trong bột mì là loại protein rấ t đặc
biệt, chúng có tính chất đàn hồi và tạo mạng. Các protein khác không có
đặc tính này. Khi nướng bánh mì ở nhiệt độ cao, CO-> sẽ táng thề tích;
mạng gluten sẽ căng ra và tạo thành nhừng túi chứa C 02. Khi nhiệt cao
hơn, C 0 2 sẽ được thoát ra khỏi túi chứa đó và tạo ra những lỗ xôp trong
bánh, kết quả là bánh có độ xô'p. Khả năng lên men càng mạnh, độ xốp của
bánh càng nhiều và bánh càng nở và thể tích bánh càng tăng. Tuy nhiên,
không phải thể tích bánh lớn quyết định đến chất lượng của bánh mì. Mức
độ tăng thế tích của bánh chỉ nói lên khả năng lên men bột mì của nấm
men. Các nước sản xuất bánh mì có yêu cầu mức tăng th ể tích rất khác
nhau. Điều này phụ thuộc vào thói quen khi sử dụng bánh mì.
Trong sản xuất bánh mì hiện nay ở các nước châu Âu, người ta sử dụng
ba dạng nấm men để làm nở bánh:
* Dạng nấm men lỏng.
* Dạng nấm men nhão (paste).
* Dạng nấm men khô.
1-Nấm men dạng lỏng
Nấm men lỏng có ưu điểm là dẽ sử dụng và hoạt lực làm nở bánh rất
cao. Tuy nhiên, nấm men lỏng cũng có nhược điểm rấ t lớn là khó bảo quản:
thời gian sử dụng chỉ nằm trong giới hạn 24 gicr sau khi sản xuất. Chính vì
thê, việc sản xuất và sử dụng nâm men dạng lỏng thường được tổ chức như
một phân xưởng riêng trong những cơ sở sản xuất bánh mì mang tín h chất
tự cung tự cấp mà không mang tính chất thương phẩm bán trê n th ị trường.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 97

Nâ'm men lỏng là một dạng sản phẩm thu nhận được ngay sau khi quá
trình lên men hiếu khí kết thúc. Người ta thu nhận dịch lên men có chứa
sinh khối nấm men đang phát triển này đề sản xuâ't bánh mì. Khi sử dụng
dịch nấm men này làm bánh mì, người ta thường phải sử dụng với khôi
lượng lớn (thường từ 1 - 10% so với khôi lượng bột mì đem sử dụng). Khi sử
dụng nấm men lòng cần lưu ý đến chất lượng dịch nấm men. Trong trường
hợp dịch nâni men này bị nhiễm các vi sinh vật lạ sẽ gây ra nhiều quá
trình lẽn men khác nhau khi ta tiến hành ủ bột mì. Mặt khác, ta sử dụng
toàn bộ dịch sau lên men cũng có nghĩa sử dụng cả sản phẩm trao đổi chất
của quá trình lên men này. Như th ế nếu dịch lên men bị lẫn quá nhiều các
sản phẩm ]fhác nhau từ quá trình lên men thu sinh khôi se làm giảm chât
lượng cảm quan của bánh mì.
Hiện nay nhiều cơ sở sản xuâ't bánh- mì ở các nước châu Âu và châu Mỷ
không sử dụng nấm men lỏng mà sứ dụng chú yếu nâ'm men dạng paste và
dạng khô.
2- Nấm men dạng paste (còn gọi là nấm men paste)
Nấm men paste là khôi nấm men thu được sau khi ly tâm nấm men
lòng. Nảni men paste thường có độ ẩm khoảng 70 - 75% w. Nấm men
paste thường có hoạt lực làm nở bánh kém hơn nấm men lỏng do trong quá
trình ly tâm và thời gian kéo dài, nhiều tế bào nấm men bị chết. Nếu được
bảo quản lạnh ở 4 - 7°c, ta có thể sử đụng nấm men paste trong khoảng 10
ngày. Như vậy, nếu chuyển nấm men lỏng sang nâĩĩi men paste ta kéo dài
được thời gian sử dụng và thuận lợi trong vận chuyến, ơ nhiều nước nhiều
cơ sở sản xuất bánh mì sử dụng nâ'm men paste. Ớ Việt Nam các cơ sở sản
xuất bánh mì cũng thường sử dụng nấm men paste. Liều lượng sử dụng nâVn
men paste khoảng 1 - 5%, tùy theo chât lượng nấm men.
3- Nấm men khô
Nấm men khô được sản xuất từ nâ'm men paste. Người ta sây nârn men
paste d nhiệt độ < 40°c hoặc sử dụng phương pháp sấy thăng hoa. Nấm
men khô thường có lực nở không cao nhưng có ưu điếm rấ t lớn là thời gian
sử dụng rấ t lâu và dễ dàng vận chuyển.
4.1.2 Công nghệ sản xuất
í- Nguyên liệu dùng trong sản xuất nấm men bánh mì
Để sản xuất nấm men bánh mì chất lượng cao, người ta sử dụng các
loại nguyên liệu sau:
98 CHƯƠNG 4

• Nước: nước sử dụng trong sản xuất nám men bánh mi là nưởc sử
dụng trong sinh hoạt (nước máy). Trường hợp sử dụng nước giêng hoặc nước
bề m ặt khác, phải xử lý chúng để chât lượng các loại nước này đạt chất
lượng nước máy đùng cho sinh hoạt của dân th àn h phô. Nước được coi như
nguyên liệu chính dừng trong sản xuất vl đây là công nghệ lên men chìm
hiếu khí.
Yêu cầu nước:
- Có độ cứng từ 4 - 8° (1° độ cứng tương đương 10 mg CaO/1)
- Không màu, không mùi, không vị.
- Các chất sau không được quá mức cho phép (mg/1): cr < 0,5;
s < v 2 < 80; As < 0,05; Zn < 5; Cu < 3; FeO < 3.
- E. coli: < .20 tế bào.
• Nguồn hydratcacbon: Hydratcacbon sử dụng trong sản xuất nấm
men bánh mì là đường có trong m ật rỉ. Như vậy m ật rỉ là nguyên liệu
chính thứ hai dùng trong sản xuất nấm men bánh mì.
Mật rỉ có hai loại: m ật rỉ từ quá trình sản xuất đường từ củ cải đường
và từ cây mía.
Mật rỉ từ cả hai nguồn nguyên liệu khác nhau này có rất nhiều đặc
điểm vật lý và hóa học giống nhau, Trong sản xuất nâm men bánh mì,
ngoài hàm iượng đường ra, người ta còn quan tâm đến ba vân đề có ảnh
hưởng quyết định đến chất lượng nấm men bánh mì:
- Hàm lượng biotin (vitamin H)
- Hệ keo
- Màu sẫm của m ật rỉ.
Biotin là một loại vitam in có ảnh hưởng rấ t lớn đến sự phát triển của
nấm men. Đối với nấm men, biotin được coi như chất kích thích sinh
trưởng rấ t tốt. Trong hai loại m ật ri trên thì m ật rỉ từ quá trìn h sản xuất
đường mía chứa lượng biotin cao hơn rấ t nhiều so vđi m ật rỉ từ quá trình
sản xuất đường củ cải. Chính vì thế, ở nhiều nước không trồng được mía,
người ta phải nhập m ật rỉ từ đường mía. Sau khi xử lý, người ta trộn hai
thứ m ật ri lại với nhau để đảm bảo hàm lượng biotin cho sự phát triển của
nấm men.
Hệ keo có trong mật rì được hình thành bởi protein và pectin. Hệ keo
thường tạo ra độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào
nấm men. Nếu hệ keo không bị phá đi ạẽ gây ra hiện tượng thóai h6a, tế bào
sẽ phát triển và sinh sản kém. Hiệu suất sinh khối thu nhận được rất thấp.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 99

Khó khăn thứ hai gặp trong quá trình sản xuất nếu m ật rỉ không loại
bỏ hết hệ keo nói trên ìà sản phẩm sinh khỏi nấm men thu nhận được sè
bị bám đầy các chất keo này, ta rát khó làm sạch sản phẩm. Màu sầin có
trong m ật rỉ là màu được tạo ra trong quá trình chê biến đường. Màu này
sẽ báin vào sinh khôi nấm men và tạo cho nârn nem có màu vàng thẫm.
Màu này không phải là màu tự nhiên của nâni men. Do đó, trước khi sử
dụng m ật rỉ như là thành phần chứa đường trong môi trường nuôi cấy
người ta phải loại bỏ các chất màu tồn tại trong m ật rỉ.
Các chất màu có trong mật rí bao gồm:
• Hợp chất caramen: hợp chất được tạo ra do sự m ât nước của đường
saccharose dưới tác dụng của nhiệt độ cao, Khi pH của dung dịch đường ổn
định, cường độ màu sê tỷ lệ thuận vứi nhiệt độ.
• Phức chất của phenol- Fe+2: phức chát này có màu vàng xanh. Hợp
chất này không bị loại hết trong giai đoạn làm sạch nước mía và tồn tại
trong m ật rỉ.
• Melanoidin: đây là sản phẩm ngưng tụ của đường khử với axit amin,
trong đó chủ yếu là axit aspartic.
• Melanin: đây là sản phẩm oxy hóa khử các axit amin dạng vòng có
trong m ật rỉ, trong đó chú yếu là tyrozin dưới sự xúc tác của enzym poly
pherroloxydase khi có m ặt của oxy và Cư+".
Trong sản xuất sinh khối nấm men bánh mì, người ta dùng HỵSO.ị với
lượng 3,5 kg/1 tân m ật rỉ đế xử lý hệ keo và màu của m ật rỉ. Các phương
pháp xử lý đã được trình bày ở chương 3.
Phương pháp này được gọi là phương pháp hóa học. Khi cho H2SO.t
vào, dưới tác dụng của nhiệt và oxy các axit bay hơi sẽ thoát ra ngoài. Một
sô' châ't khí độc sẽ được thoát ra ngoài. Ví dụ:
CaS03 + H.so,,----- ►CaSO<1 + H20 + S02í
Ngoài ra, H 2SO4 sẽ liên kết với các muối có trong m ật ri và tạo pH
thích hợp cho nấm men phát triển.
Thiết bị làm sáng m ật rì thường làm từ thép không ri. Chiều cao của
tháp này thường cao hơn đường kính đáy là tốt nhất. Bên trong tháp nên
lắp hệ thống cánh khuấy với tốc độ 30 - 35 vòng/phút và bộ phận gạn, lọc
cặn.
Lượng cặn thường chiếm khoảng 3 - 3,5% so với trọng lượng m ật rỉ.
Ngoài ra người ta còn dùng máy ly tâm để loại bỏ chất keo có trong m ật rỉ.
• Nguồn photpho và nitơ: Trong sản xuất nâm men bánh mì người ta
100 CHUƠNG4

t h ư ờ n g s ứ d ụ n g u r e a n h ư n g u ồ n c h ứ a n i t ơ v à d i a m o n p h o t p h a t n h ư n gu ồn
c h ứ a n i t ư v à p h o t p h o . N g o à i r a , CC r â t n h i ề u h ợ p c h à t vô cơ k h á c của
phot pho và nitơ đều có thè sứ dụng dê nuôi cây nâiìi men bánh mì. Tuy
nhiên, hai nguồu n i t ơ v à d i m n o n p h o t p h a t ( D A P ì l à n h ừ n g loại p h a n vỏ cơ
được sứ dụng nhiéu trong nòng nghiệp, dề mua và rè hơn rat nhiều so với
các chất khác nẽn chúng được sử dụng nhiêu trong san xuãt nam men bánh
1111. Lượng DAP sử dụng là 0,15- 0,3rÝ. Trước khi sứ (lụng DAP và urea,
ng ười t a t h ư ờ n g h ò a t a n c h ú n g t r o n g nước trước. U r e a đ e h ò a t a n n h ư n g lại
l à m g i a m n h i ệ t độ nước, D A P r à t k h ó h ò a t a n vì t r o a g k h i t ạ o r a DAP
người ta có sứ đụng một sô' chất phụ gia không tan.
N g o à i D A P và u r e a n h ư n g u ồ n c ư n g c ấ p n i tơ, n g ư ời t a c ò a s ứ d ụ n g các
h ó a c h ã t có c h ứ a nit-ơ n hư: (NH^K/SO.t, N H ị O I l .
Ngoài DAP được sử dụng như nguồn photpho ra, người ta còn sứ dụng
H; ;PO,, C a í H v P O , ) ,
• Nguồn kaỉi vù magic: Trong sàn xuât sinh khôi ná 111 men, người ta
s ử d ụ n g K X O ; ; và KC1 n h ư n h ữ n g n g u ồ n k a l i v à M g S O 4 . 7 H-.iO h o ặ c MgCl-j
n h ư n g u ồ n c u n g c ấ p nia gi e.

2- Vỉ sinh vật trong sản xuất nấm men bánh mì

Nâm men sử dụng trong sán xuất bánh mì là nấm men s ac ch a ro m y c e s
c e r e vi s i n e .

Vài nét ỈỊch sử; Loài người sử dụng nấm men đế làm nờ bánh mì từ
trước khi biêt được hình thái, cấu tạo và đặc tính sinh lý, sinh hóa cúa
chúng.
Lúc đầu, những người châu Àu đế bột mì lén men tự nhiên và làm
bánh. Người ta thấy nếu đố bột lên men tự nhiên thì khối lượng bột sẽ
nhiều hơn và khi nướng bánh sẽ có mùi thơm và VỊ chua hấp dần, nhưng
người ta không biết tại sao lại thê.
Sau đó, vào th ế kỹ 17 người châu Âu bắt đầu không cho bột mi lên
men tự nhiên nửa, mà sử dụng nấm men bia để nhào bột. Kết quả của việc
làm này là khối bột nở đều hơn, bánh thơm hơn, đặc biệt là không chua
như cho ủ tự nhiên.
Lúc đầu người châu Âu chỉ hớt lớp bọt ở trên dịch lên men và đem làm
bánh mì. Lớp bọt này chứa nhiều tê bào nấm men chết, do đó rấ t khó bảo
quan va đoi khi lam hư quá trình làm bánh. Ho đả cô gắng khắc phuc
nhược điêm này băng cách loại bỏ phần nước và cho thêm bột khoai tây vào
cạn men bia, lay vai êp bo được nhiêu nước trong cần 111611 bia
 CÔNG NGHỆ SẢN XUÁT VI SINH VẬT 1'1

Năm 1 8 5 0 b ắ t (láu giai đ o ạ n r ấ t q u a n t r ọ n g t r o n g s ự p h á t t r i ế n c ùa

công nghệ sán xuất nãm men bánh mi: ugưừi châu Ảu dã biêt san xuất sinh
khòi nấm men bánh mì dạng nhão (dạng paste). Lúc đáu họ lấy cận nấm
m e n t ừ q u á t r ì n h s a i l xưàt rượu, c h u y ê n c ậ n m e n n à y s a n g t h ù n g đ ự n g n ấ m
m e n , r ư a s ạ c h n à m m e n b à n g n ư ớc i ạ n h v à đ ư a v à o m á y é p vít.
N h à m á y (láu l i ê n v ừa s á n x u á t r ưựu v ừa s a n x u ấ t n à 111 m e n é p là n h à
Ìììáv ciia n ư ớ c Ao được x àv d ự n g t ạ i V i è n v ao n a m 1860. T ừ đó, p h ư ơ n g
- p h á p s á n x u â t n à y dược p h á t t r i è n r ấ t r ộ n g r ãi ơ c á c nimc c h â u Au. T h o o
p h ư ơ n g p h á p n à y , b ắ p được n g h i ổ n n h o , n á u với axi t y ê u v à (lược t h ú y p h a n
b ằ n g n i a lt đ ạ i m ạ c h . Người t a t h ư ờ n g c ho ha i p h â n bột b á p v à m ộ t p h ầ n
đ ạ i m ạ c h đ è t i ê n h à n h t h ú y p h â n . S a u 12 giò' t i ê n h à n h l è n m e n , k hi k h ố i
l ê n m e n sui r à t n h i ố u bọt. người t a l ấ y h ê t p h a n bọi n a y , l à m l ạ n h v à c h o
đi é p , c òn h u (lom c h u n g cất dô t h u r ư ự u - m ạ n h . H i ệ u s u â t cu a p h ư ơ n g p h á p
n à v t h ư ờ n g r ấ t t h â p . S i n h k h ỏ i n à n i m e n t h ư ờ n g c hi k h o a n g 9 - 1 0 ' í, rượu
là 3 0 ' r so với k h ỏ i l ư ợ ng n g u y ê n liệu.
N ã m 187S. L. P a s t e u r n g h i ê n cứu á n h h ư ớ n g cù a oxy đ ẽ n s ự p h á t t r i ò n
cứa n ấ m nitMi. K ế t q u a cho t h â y k h i có m ạ t cún oxy, h i ệ u s u à t t h u n h ậ n
n ấ m m o n r ất cao. Kot q u a n g h i ê n cứu cu a I,. P a s t e u r (!ược p h ố b i ò n r ộ n g
l ã i ờ các nước c h a u Au. K h ó k h a n n h ấ t t r o n g vi ệc c u n g c à p oxy c ho q u á
t r ì n h l ẽ n moil ()' giíìi (ỉoạn n ã y là người c h â u Au s ứ đ ụ n g m ô i t r ư ờ n g là loại
môi t r ư ờ n g n h ã o . Do (lố I>xy r ấ t k h ó p h â n t á n đổu v à k h ó t h ó i k h i c ho t o à n
bộ k h ố i n h à o n ày .
S a u (lo. 1 1 0 1 1 1 1886. người (lân c h á u Âu b a t đ ầ u t h a y đổi m ỏ i t r ư ờ n g .
Người t a k h ò n g đ ù n g nìôi t r ư ờ n g n h ã o n ử a m à s ử d ụ n g d u n g d ị c h nước
(lường. P h ư ơ n g p h á p n n y l â n d ầ u t i ê n được á p (lụng t ạ i n h à m á y G i a n t h a n
( nước A n h ) . Rột l úa Iìù h a y (lại m ạ c h lỉược t h u y p h â n t h à n h đ ườ ng . Người
t a lấ y nươc đ ư ờ n g n à v (le s á n x u ấ t n ấ m m e n . C ứ 100 k g b ộ t n g ư ời t a t h u
được 18 - 20 kg nấm men và 20 - 22 lít rượu. Tuy nhiên, chất lượng nấm
m e n v ầ n c h ư a tôt.
Năm 1900, người ta sứ dụng may ly tâm tôc độ cao đế tách nước ra
k h ỏ i n ấ m m e n v à p h ư ơ n g p h á p n u ô i c á y n ấ m m e n được h o à n t h i ệ n d ầ n .
Lúc đầu người ta nuôi cấy nấm men ở 15 - 17ưc, hiệu suất tăng hơn bình
thường từ 2 - 8rí . Sau đó người ta nuôi nấm men ớ nhiệt độ cao hơa í 25 -
SO^C) với dung dịch đường 4rí, lượng khí thổi vào là 50 - 80 m;i/ giờ cho một
m* m ỏ i t r ư ờ n g . K ế t q u á đ ạ t được r ấ t tốt : c ứ 100 k g b ộ t đ e m t h ú y p h à n và
nuôi nấm men sè thu được 30 - 40 kg nấm men và 12 - 15 lít cồn.
Sau đó, kỹ thuật nuôi nám men càng được cài tiến. Người ta thay bột
102 CHƯƠNG 4

thủy phân bằng m ật rỉ hoặc phế liệu nhà máy đường, nhà máy bánh kẹo.
Lượng đường dùng đẻ lên men cũng giảm hơn, lưu lượng khí được tăng lên
đế tăng khả năng hô hấp của nấm men.
Năm 1916, xuất hiện nhà máy đầu tiên thực hiện những cải tiến này.
Người ta cùng biết cho vào dịch lên men các muối vô cơ như muối amon hay
muối photpho và kết quá là hiệu suất thu nhận nâm men từ 35 - 45% đâ
tăng lên 55 - 65%.
Năm 1940 nhà máy men bánh mì lớn nhất châu Âu với công suất
16500 tấn/ năm được khánh thành ở Moscow. Từ đó đến nay, hầu như nưởc
nào ờ châu Âu cùng có hàng chục nhà máy lớn, nhó sán xuât nấm men
bánh mì.
Yêu cẩu chất lượng nấm men bánh mì
Nấm men Sacchromyccs cerevỉsiac dùng cho sán xuất bánh mì phải
đảm bảo nhửng yêu cầu sau:
- Tế bào nấm men có kích thước lớn, đều, có khá năag phát triển
mạnh và chịu được nhiệt độ cao.
- Có hoạt lực enzym zymase < 45 phút (giá trị nàv được xác định khi
cho nám men (2.5^0 lên men 20 ml dung dịch đường 5r;. giai phóng ra
được 10 ml CO,).
- Hoạt lực inantose < 70 phút (giá trị này biểu thị thời gian cần thiết
đề giãi phóng 10 nil C 0 2 khi lên men 20 ml dung dịch 5r; mantose với hàm
lượng nấm men 2,5%).
Chỉ sỏ này dùng đề đánh giá khả năng lèn men đường mantose của
nấm men.
- Lực n ơ b ộ t < 45 p h ú t (giá t r ị n à y biểu th ị thời g ia n Cíin t h i ế t đ ể làm
nở 280 gain bột với 160 mì dung dịch NaCl 2,59r và lượng nám men là 5 g).
trong khuôn hình bình hành có kích thước xác định:
• Diện tích đáy: 12,6x8,5 cm
• D iệ n tíc h t r ê n : 14,3 X 9 ,2cm
• Chiều cao: 8,5cm
- Độ bền của nấm men > 72 giờ (xác định sự thay đối thời gian làm nở
bột của nâ'm men lúc ban đầu và sau một thời gian bảo quản n h ất định.
Nếu độ bền của nấm men cao thì sau 72 giờ bầo quản ở nhiệt độ 0 - 4°c,
thời gian làm nở bánh không được tăng quá 5 phút).
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VỊ SINH VẬT 103

3- Cồng nghệ sàn xuất

Hình 4.1: Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất nấm men bánh mì
N hân giống nấm men là quá trình làm tăng dịch nấm men giông sau
mỗi chu kỳ nuôi. Cứ mỗi một chu kỳ nuôi, lượng dịch nấm men giống tăng
từ 5 - 10 lần dung tích trước đó.
Ta cứ tiến hành như vậy cho đến khi nào đạt được khôi lượng nấm
men giống cần thiết cho quá trình sản xuất.
104 CHƯƠNG 4

Điều kiện nuôi:

- Mỏi trường dịch nha hay môi trường nước đường có 2 - 4c/c đường, bổ
sung thêm một sỏ nuôi dinh dưỡng.
- Môi trường phải được thanh trùng và làm nguội trước khi chogiô
nấm men vào hay chuyển từ chu kỳ trước sang chu kỳ sau.
- N hiệt độ lên men là 26 - 30°c.
- pH dịch nuôi 4,0 - 4,5.
- Thời gian nuôi từ 10 - 24 giờ.
- Nuôi trên máy lắc hay thổi khí vô trùng tùy theo dung tích bình nuôi
cây. Ta có thể tham khảo bảng tóm tắ t sau:
Bảng 4.1: Điều kiện nhân giọng nấm men
Các giai đoạn Thể tích Điểu kiện nuôi cấy Hiệu suấỉ
nhân giống dịch nuôi Nống độ Thời gỉan LƯU lượng khí thu hổi
cấy (%) (h) <m3/m3.h) (%)
Phòng thí nghiệm Lắc hoặc sục khí
10ml - 10 lít 12 - 16 1 6 -2 4 8 - 10
(3 - 5 cấp) 1 -2
Giỏng thuần khiết không liên tục
50 - 1500 lít 10 14 10 - 18 15 -2 0
(2 * 4 cấp) 5 - 10
Giống sản xuất
5 - 15 m3 5 8 10 15 20 - 50 20 - 50
(2 - 3 cấp)

Nuôi nấm men thương phẩm theo chu kỳ

Trong giai đoạn nuôi và cấy cần phải lưu ý mấy vân đề quan trọng sau:
1- Thành phần môi trường: Môi trường nuôi cây nấm men thương
phẩm thường không khác nhiều so với môi trường nuôi cấy trong quá trình
nhân giống. Tuy nhiên, thành phần môi trường phái tuyệt đối ổn định để
chất lượng nấm men đồng đều ở tất cả các mẻ nuôi trong suốt quá trình
sản xuất và môị trường nuôi cấy môi trường phải vô trùng.
Lượng đường trong môi trường khoảng 2 - 3%, không nên nhiều hơn và
cũng không nên ít hơn, Nếu lượng đường cao sẽ vừa lãng phí và vừa tạo ra
những sản phẩm trao đổi chất khác, gây ức chế ngược đến quá trình tạo
s in h k h ố i. N ế u lượng đ ư ờ n g q uá n h ỏ s ẽ k h ô n g đ ủ n g u ồ n cacbon c ầ n t h i ế t
cho sự tạo sinh khối.
pH môi trường khoảng 4,2 - 5,4. Không nên hạ thấp độ pH của môi
trường xuông vì làm như vậy nấm men sẽ khó p h á t triển. Nếu pH cao quá
vừa ức c h ê n â m m e n p h á t t r i ể n , vừa tạ o đ iều k i ệ n cho vi k h u ẩ n n h i ễ m vào
dung dịch nuôi và phát triển, cạnh tranh chất dinh dưỡng, làm giảm chất
lượng nấm men.
2- Thiết bị nuôi nấm men vừa có dung tích thích hợp, vừa thuận lợi
cho việc nạp môi trường, phá bọt củng như thu nhận sản phẩm. Thiết bị
phai được lắp đặt hợp lý hệ thông thổi khí, hệ thông cánh khuây và tâm
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 105

cản dòng chuyển động của môi trường để làm tãng quá trìn h trao đổi chất
của vi sinh vật.
3- Việc cung cấp oxy cho quá trình tạo sinh khôi rấ t cần thiết. Oxy là
một trong nhừng yếu tô quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát
triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae. Vi sinh vật nhất là nám men
không có thế sử dụng oxy ở dạng hòa tan trong môi trường ìỏng.
d

J±L

d,

r ề

a) H/D = 2 đèn 5 H,/H = 0.6 đến 0.7

d/D = 0,3 đến 0,5 h./D = 0.8 đến 1
b/D = 0,3 đến 0-6 h /D = 1 dén 1.25
a/d = 0.3 đến 0,6 cựd = 2.3
d^d = 1,4
đ/c =1.5
<n>

Óng sục^
h)
Tám cản c)

Ống s ụ c y
e)
d)
Khí
Khi

Hình 4.2: Thiết bị nuôi cấy nấm men

 106
1 2 3 4 5 6 7 8 10 39 9 40 41 42 11 12 13 14 15 16 17 10 18 19
I. ĐIỂU CHẾ DUNG DỊCH ĐƯỜNG VÀ DUNG DỊCH MUỨI

1' H« thống chứa mật 2- Thúng nhỉn mật 3- Bom 4- Hệ thống báo quán men 5’ Thùng chửa dế trung hòa thành phán

6* Thùng chứa dâu 7- ĩhiổl bị pha loãng 8- Máy tách làm trong 9- Thiết bị ỉruyển nhiệt khung bần 10' Bơm

11' Thiết bị đo tuũng 35- Thting chứa muổi vô co 36, J7, 38' Thung hoa muôi 39,40.41,42- Thiết bị đo lutìng 44- Thùng chúa axil sunluric 47' Palăng điện

II. NUỚI CÂY MEN GIỐNG THUẤN KHIẾT

12- Thiổt b| thanh trùng 13' Thiết bj sinh sản nâm men nhó14' Thiết bị phát triôn men lởn 15- Thiểl bị nhân giống đáu

16- Thiết bị nhân giông giai đoạn 2 và 3 17- Thiết bi nhán giống giai đoạn 4 8- Máy tách 19' Thùng chứa khối nấm men

tu. NUÔI CÂY N&M THƯƠNG PHÂ'm

20* Thiết bị phát triẽn nấm giai đoạn sản xuất dấu 21- Thiết bị pháỉ triến nấm giai doạn sản xuất 2 22- Thiết bị ỉãng nổng d<5 nấm men

IV. TÁCH, RỬA NÂM MEN

24,26* Thùng chửa nấm men dã tửa 23.25,27- Mảy tẳch 28- Thùng chửa 29* Thùng chứa làm lạnh dịch men 30' Máy lọc chân khđng

V. TẠO HỈNH VA BAO GÓI MEN

31- Thùng pha trộn 31- Thùng pha trộn 32- Máy tự động tạo hình 33- Thiét bj vận chuyển 34- Xe chở

Hình 4.3ỉ Sơ đồ thiết bị và công nghệ sãn xuất nấm men bánh mì

107
108 CHƯƠNG 4

Lượng oxy hòa tan trong nước rất ít. Trong quá trìn h phát triẽn. nấm
nem sè nhận oxy hòa tan và như vậy lượng OXV hòa tail sẽ giám, do đó cần
phải cung cấp oxv từ bẽn ngoài thiêt bị.
Nãm men saccharomyces cerevisiae ìà loài vi sinh vật hiẽu khí tùy
tiện. Nếu chi thiếu oxy trong một thời gian ngắn, ngay lập tức chúng
chuyến quá trình lèn men hiếu khí sang quá trìn h lên men yêm khí. Như
vậy lượng sinh khôi sẽ tạo thành rãt ít và đường sẽ dược chuyến hóa theo
các chu t r ì n h dư ờng p h â n cá các chu t r ì n h k h á c đ ể cuối cù n g t ạ o ra nhừng
sán phàm trao đối chất bậc hai. Do đó, quá trình nuôi cấy nấm men thu
nhận siuh khỏi bát buộc phải được cung cấp oxy liên tục.
Vì nấm men chí có thể sứ dụng oxy ỡ dạng hòa tan nén khi tòc độ hòa
tan cùa oxy vào cỉung (iịch bằng tốc độ sử dụng oxv của tế bào nấm men thì
sinh khôi tè bào nấm men sẽ đạt cực đại.
Tốc độ hòa tan cùa oxy vào môi trường lỏng được tính theo cõng thức:

R = £ = K ^ iC -C V
dt
t r o n g đó: R - tốc độ h ò a t a n cùa oxy; c - n ồ n g độ OXV b ào hòa
C} - nồng độ oxy hòa tan ớ thời điếm kháo sát
K].rt - hằng sò tý lệ; t - thời gian.
Trong thiết bị lên men người ta phái lấp đặt hệ thống phàn phối khi
và hệ thông cánh khuây. Hệ thông phân phôi khí trong nuôi cấv nấm 1:1011
thường được lắp đặt ở dưới đáy thiết bị.
Khi số vòng quay cúa cánh khuấy và tốc độ thối khí tăng thi độ hòa
tan của oxy vào dung dịch mỏi trường sẽ tăng theo. Đồng thời làm táng sự
xáo trộn môi trường, thúc đáy quá trình trao đổi chất và sinh sán tăng
nhanh.
Tuy nhidn, việc tăng tốc độ khuấy và tốc độ thối khí chỉ đJĩímột giới
hạn nhât định. Nếu tốc độ của hai yếu tố này quá cao sẻ làm tăng nhanh
hiện tượng tự phân của tế bào và bọt sè tạo ra nhiều.
Việc cung cấp oxy cho những thiết bị nhỏ ở trong cac phòng thí
nghiệm thường rất khó khăn. Do đó người ta thường sứ dụng máy lãc đế
làm tăng sự hòa tan ciìa oxy vào môi trường.
Độ hòa tan của oxy bị chi phôi bởi nhiệt độ của môi trường. Khi nhiệt
độ của mỏi trường tảng thì độ hòa tan của oxy sè giảm. N hiệt độ thấp
thường làm tăng tốc độ hòa tan của oxy.
Nêu trong quá trình lên men, nhiệt độ môi trường tăng nhanh (do quá
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SỈNH VẬT 109

trình hó hấp cúa vi sinh vật) thì ngay lập Ắức phái thối khí mạnh đê làm
giám nhiệt cúa môi trường. Nêu không làm hạ nhiệt, dọ hòa tan của oxy sè
giam và uăng suát sinh khối sẽ giảm,
Trong trường hợp phải dùng nhừng chất hoạt động bề mặt, chát phá
bọt, hoặc một sô chất chống nhiễm trùng, độ hòa tan cúa oxy cùng giám.
Hiện nay có nhiều phương pháp xác định oxy hòa tan. Những phương
pháp phố bién nhãt như sau:
- Phương pháp hóa học
- Phương pháp cực phổ
- Phương pháp đo điện th ế oxy hóa - khử
- Phương pháp đo trên máy Vacbua.
Khi xác định lượng oxy hòa tan trong mỏi trường, người ta biếu hiện
giá trị này theo các đơn vị sau:
- Phần trăm so với khả năng bảo hòa
- Áp suất riêng phần
- Milimol hoặc miligam.
Nghiên cứu ảnh hưởng cúa oxy hòa tan đến sự phát triển cúa
saccharomyces cerevisiae cho thây: năng suãt tạo thành sinh khôi tăng đần
khi tăng hàm lượng oxy hòa tan. Nãug suất sinh khôi nấm men đạt cao
nhất khi lượng oxy hòa tan tăng từ 0,5 - 1 miliinol/l/phút. Khi lượng oxy
hòa ta n t ă n g d ê n 4 m ilim o l/ì/p h ú t, s in h khối giảm . N ếu t ă n g lượng oxy lên
nừa, sinh khôi sè giảm nhanh. Điều dó cho thây sự tăng oxy hòa tan không
phái ti lệ thuận với sự tăng sinh khôi .

Hình 4.4: Ảnh hưởng của oxy hòa tan đến sự tăng sinh khối của
sơcch aro my CCS cercv isia c
110 CHƯƠNG 4

Không khí trước khi đưa vào thiết bị lên men, phải được làm sạch khỏi
vi sinh và các tạp chất. Cách làm sạch thông thường đã được trìn h bày ở
chương 3

H ình 4,5: Máy lọc khí (theo F.G. Walter. ỉ 953)

Nhu cầu cung cấp oxy cho quá trình phát triển của nấm men khóng
phải lúc nào cũng giống nhau. Do đó, ta phải thay đổí mức độ cung cấp oxy
theo đúng nhu cầu thực của nấm men.
ơ giai đoạn tiềm phát, nấm men cần có thời gian thích nghi với điều
kiện mới. ơ giai đoạn này việc tạo thành axit amin, các peptid và axit
nucleic xảy ra nhanh hơn các quá trình khác. Thời gian này có th ể dài, có
th ể ngắn tùy thuộc vào từng loài nấm men. Giai đoạn này chường khoảng
0.5* 1 giờ. Giai đoạn này chỉ cần cung cấp lượng không khí khoảng
50m3/giờ/ lm 3 môi trường là đủ.
Ở giai đoạn tăng trưởng, nấm men tiến hành các quá trìn h trao đổi
chất rấ t m ạnh, khối lượng nấm men trong các th iết bị táng rõ rệt. Việc
tổng hợp enzym được xúc tiến nhanh. Hàm lượng RNA được tổng hợp
mhiều nhất. Giai đoạn này thường kéo dài khoảng 7 - 14 giờ và cũng ỉà giai
đoạn nấm men cần nhiều oxy nhất, do đó ỉượng oxy cung cấp phải gấp đôi
giai đoạn đầu tiên, khoảng 80» 100m3/ giờ/ m3 môi trường.
Giai đoạn k ế tiếp là giai đoạn cân bằng. Giai đoạn này có nhiều thay
dổi quan trọng. Lượng tế bào mới sinh gần bằng lượng tế bào chết. Các quá
trìn h trao đổi chất giảm m ạnh, do dó nhu cầu oxy không nhiều. Giai đoạn
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 111

này kéo dài khoảng 1- 2 giờ và ta phải giảm lượng không khí câ'p vào môi
trường. Lượng không khí cấp vào cho giai đoạn này từ 20- 50m3/ giờ/ 1 m3
môi trường.
Trong sản xuất nấm men bánh mì, người ta thường k ết thúc quá trìn h
nuôi nấm men ở giai đoạn hai, bởi vì, một trong những yêu cầu quan trọng
của nấm men bánh mì là số lượng tế bào nấm men sống phải chiếm đại đa
sô" nên không th ể đợi đến giai đoạn cân bằng mới tiến hành thu nhận sinh
khối, làm như vậy nấm men thu được sẽ chứa rấ t nhiều tế bào già.
Trong nuôi cấy nấm men bánh mì, người ta thường nuôi trong khoảng
thời gian 8 - 1 6 giờ. Tối đa là 16 giờ.

Khoảng thời gian thổi khí nhanh

từ 80-100mVl/1m môi trường
Hỉnh 4.6: Đ ường cong sin h trưởng và nhu cầu oxy trong sản xìỊất
nấm men bánh m ì
• Nuôi cấy nấm men bánh mì theo chu kỳ có bổ sung dịch nuôi cây
N u ô i cấy theo chu kỳ có nhược điểm :
1“ Tốn nhiều thời gian cho giai đoạn vệ sinh th iế t bi và điều kiện sản
xuất.
2- Sinh khôi nấm men thu nhận được bao gồm cả tế bào mới sinh
trưởng, tế bào trưởng thành và tế bào già.
3- Bị tác động m ạnh bởi chất dinh dưỡng vởi hàm lượng khá cao ngay
từ thời gian mới nuôi cấy.
Để khắc phục nhược điểm thứ 2 và thứ 3, người ta cải tiến phương
pháp bằng cách đưa chất dinh dưỡng vào thàn h nhiều đợt. Phương pháp
này giúp tế bào nâm men không chịu áp suất thẩm thấu cao. Cách bổ sung
112 CHƯƠNG 4

m ật rỉ đã xử lý được tóm tắ t trong bảng 4.2.

Bảng 4.2: Bổ sung mật rí L'à các chất dinh dường trong nuôi cấy theo chu kỳ
Rì đường (NH,)2SO, (NH4)2HP04 h 20 Thể tích dịch
Giờ nuôi cấy
<%) (%) (%) (m3) <m3)

0 5 10 10 5

0 - 1 4 - - - 27

1-2 4 15 15 2 27,5

2 -3 5 15 15 6 30

3 -4 6 15 15 6 37

4 -5 7 15 15 7 51

5 -6 8 15 15 8 59,5

6 -7 10 15 15 9,5 70

7 -8 12 - - - 70

8 -9 13 - - - 70

9 -1 0 14 - - - 70

10-11 12 - - - 70

11-12 ổn định - - - 70

Tổng sô' 2700 kg 130 kg 40 kg 43,5 kg 70 m3

Ghi chú:
- Ti lệ phần trăm so với tổng sô' châ't dinh dư ỡng cần cho vào
- Sô lượng trên dùng cho thiết bị nuôi cấy là 100 m 1, dung tích dịch
nuôi là 70m \
• N u ôi c ấ y n ấm m en th ư ơn g phẩm th eo phương p h áp liê n tụ c
Đế khắc phục cá ba nhược điểm của phương pháp nuôi cây theo chu kỳ,
người ta thực hiện phương pháp nuôi cấy liên tục. Ưu điểm lớn n h ất của
phương pháp này là Iiăng suất tăng và tế bào nấm men luôn luôn được đổi
mới chât dinh dưỡng.
Phương pháp nuôi cây liên tục còn cho phép ta kiểm soát và điều
khiên dê dàng quá trình. Điều lưu ý là việc cung câp oxy phải liên tục và có
cùng một mức độ- Đây là điểm khác biệt giữa phương pháp liên tục và
phương pháp theo chu kỳ. Mức độ cung câp không khí trong phương pháp
này là 80 - lOOm'V giờ/1 m* môi trường suôt quá trình nuôi cây.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 113

4.1.3 Thu nh ận sinh khôi nâ'm men dạng paste

Ngay sau khi kết thúc quá trình lên men, người ta phái thu nhận sinh
khối nấm men ngay. Nêu đê nấm Iĩien ỡ trong dịch Iiuỏi cấy sẽ làm biến
đổi chát lượng nấm men, trong đó hoạt tính zinase và maltase sè giám rất
mạnh.
Để tách nấm men khỏi dung dịch lên men, người ta thường dùng
phương pháp ly tâm. Người ta thường dùng máy ly tâm có sô vòng quay
2000 - 5000 vòng/phút. Năng suất của máy ly tâm này ỉà 35- 80m'Vgiờ.
Nảm men thường có tỷ trọng lớn hơn dung dịch lên men (tý trọng của nấm
men thường nàm trong khoảng 1,13 - 1,14 còn dịch nuôi cấy không chứa
nấm men là 1,01 - 1,03). Do tv trọng cúa nấm men lớn hơn nên chịu lực ly ,
tâm lớn hơn và bị đấy nhanh xuông bề mặt dưới của dĩa. Từ đó sinh khôi
nấm men sẽ xuống vòng tròn của thùng quay và theo đường ông chuyến
xuống thùng chứa nâni men. Nước sè bị đẩy về tâm và ra theo đường ông
nước thải.
Thiết bị ly tám nấm men thường được thiết kế riêng và có hệ thông
nước lạnh đế rửa nấm men trong suốt quá trình ly tâm. Người ta phải sư
dụng nước lạnh để tránh hiện tượng mất hoạt tính enzym của nấm I1Ì01Ì.
Quá trình tách và rửa nấm men được thực hiện bằng nhiều phương
pháp khác nhau. Các phương pháp đó được tóm tắ t như sau:
1- Khi nhận nấm men, người ta rửa nâm men trong một thiết bị cổ hệ
t h ố n g c ấ p nước l ạ n h liê n tục và t á c h nâ'm m e n liên tục t r o n g m á y ly tâm .
Phương pháp này được thực hiện ở những cơ sở sản xuất nhỏ.
2- Rữa nấm men trong hệ thông gồm 2 thiết bị bằng phương pháp hòa
tan gián đoạn. Phương pháp này có ba giai đoạn:
- Tách nấm men khỏi dịch.
- Tách nấm men từ nước rửa 1 và 2.
- Ly tám lần lần các phần trên,
c) Tách nấm men bằng cách ly tâm ba lần. Sau mồi lần iy tâm m ật độ
nâm men sẽ cao hơn trong sinh khôi thu được.
Bảng 4.3. Mật độ nấm men sau mỗi lần ly tâm
SỔ lấn ly tám Sinh khối (g/ i) Số lẩn ty tâm Sinh khối (g/1)
Chưa ly tâm 3 0 -4 0 Ly tâm lẩn 2 300 - 400
Ly tảm lấn 1 1 0 0 - 120 Ly tâm lần 3 500 - 600
114 CHƯƠNG 4

Nấm men sau ly tâm gọi là nấm men dạng nhão (nấm men paste),
còn chứa rất nhiều nước ở dạng tự do. Hàm lượng nước có nhiều trong sinh
k h ô i n à y sẽ l à m g iả m c h ấ t lượng n ấ m m e n , do đó, người t a p h ả i é p sinh
khôi này. Người ta thường dùng máy ép khung bản đề ép sinh khối nấm
men.
Cấủ tạo của máy này như sau: Các tấm bằng gang có rãnh thoát nước
được gắn chặt vào trụ bằng sắt. Giữa hai tấm gang có một khung, trên
khung đế tấm vải lọc. Các tấm được kẹp chặt bởi tấm đầu và tấm cuối. Tấm
sau cùng bị kẹp chặt. Tâm đằng trước có thể xê dịch ra trước về sau được.
Máy lọc ép khung bản thường có hình vuông hoặc hình chừ nhật. Kích
thước các tấm 300 - 1000mm. Nấm men sau khi ép có độ ấm khoảng 70 -
75%w. Sau khi ép người ta định hình chúng theo yêu cầu cúa thị trường.
Việc định hình thường được thực hiện bằng máy định hình. Các máy này
thường có công suất như sau:
- 1400 kg/giờ, sau đó cắt miếng có trọng lượng mỗi miếng lkg.
- 900kg/giờ, sau đó cắt miếng có trọng lượng mỗi miếng 500 g.
- 500kg/giờ, sau đó cắt miếng có trọng lượng mỗi miếng lOOg.
Sau khi cắt miếng, nấm men được băng tải chuyển sang bộ phận đóng
gói di động. Máy đóng gói có khả năng đóng 75 - 80 gói (loại 100g)/phút
hoặc 40 gói (loại 1000g)/phút.
Thời gian đóng gói không quá 3 giờ đế trán h nấm men m ất phẩm
châ't.
Sau khi đóng gói, nấm men được chuyển đến phòng lạnh 0 - 4°c, độ
ẩm không khí phải duy trì ở 82 - 96%w.
4.1.4 Thu nhận nấm m en dạng khô
Từ nấm men dạng paste, người ta đem sấy để thu được nấm men dạng
khô. Nấm men dạng khô thường có độ ẩm < 10%W7 Nếu độ ẩm nấm men
khô > 10% rấ t khó bảo quản.
Quá trìn h sấy trả i qua ba giai đoạn:
1- Tách nước tự do trong nấm men, paste còn khoảng 50 - 52% w.
Trong giai đoạn này nước m ất rấ t nhanh. N hiệt độ sấy < 40°c.
2- Tách nước tự do và một phần nưđc liên kết. Giai đoạn này thường
rấ t dài. Cuối giai đoạn này hàm lượng ẩm chỉ còn 16 - 20%.
3- Tách nước liên kết trong tê bào đến độ ẩm cuối cùng dưới 10% w.
Thời gian này cùng rất dài. Để giảm bớt thời gian sấy sinh khối, nấm men
thường được tạo hình sợi hay hạt.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 115

Hiện nay, người ta còn dùng máy sấy thăng hoa để sản xuất nấm men
khô. Tại một sô" cơ sở sản xuất, người ta trộn nấm men với dung dich muối
(NaCl) để làm tăng nhanh quá trình thoát ẩm và tăng khả năng chịu nhiệt
của nấm men.

4.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT NẤM MEN CHO GIA súc

v ề cơ bản công nghệ sản xuất nấm men cho gia súc không khác nhiều
so với công nghệ sản xuất nấm men bánh mì.
Những điểm khác nhau cần lưu ý:
• N£m men bánh mì cần sạch về vi sinh vật lạ và các tạp chất khác,
còn nấm men dùng cho gia súc thì không cần mức độ sạch như nấm men
bánh mì.
• Nấm men bánh mì đòi hỏi rấ t nhiều chỉ tiêu, trong đó có chỉ tiêu số
lượng tế bào nấm men sống và nẩy chồi cao. Nấm men dùng cho gia súc
không cần chỉ tiêu này mà chỉ cần có hàm lượng protein và các chất dinh
dưỡng cao là được.
Do đó, công nghệ sản xuất nấm men dùng cho gia súc thường đơn giản
hơn rấ t nhiều so với công nghệ sản xuất nấm men bánh mì

II. CÔNG NGHỆ SẢN XUAT p r o t e i n đ ơ n b à o

4.3 PROTEIN ĐƠN BÀO VÀ PROTEIN ĐA BÀO

Cụm từ “protein đơn bào” được dùng để chỉ nguồn protein mới tìm ra
từ những cơ th ể đơn bào (từ vi sinh vật), phân biệt nó với nguồn protein từ
động vật và thực vật (protein đa bào hay protein truyền thống).
4.3.1 P rotein đa bào
Protein đa bào là nguồn dinh dưỡng quan trọng nuôi sống loài người từ
khi xuất hiện trên trá i đ ất đến nay. Conngười đã biết khai thác nguồn
protein này từ những cá th ể hoang dại đến những cá thể thuần hóa và
không ngừng cải biến để phát triển protein nậy. Cho đến nay và mãi mãỉ
về sau, nguồn protein đa bào vẫn là nguồn protein quan trọng.
Tuy nhiên, do tốc độ phát triển dân sô" quá nhanh dẫn tới tìn h trạng
nguồn protein này không còn đủ để cung cấp cho nhu cầu ngày càng tề ng
của con người. Hiện nay trên th ế giới có khoảng 2/3 dân sô' đang đứng trước
thực trạng thiếu và đói protein. Ngược lại khoảng 1/3 dân số ỉại được cung
cấp số lượng protein dư thừa so với nhu cầu. Sự chênh lệch cung cấp proteip
116 CHƯƠNG 4

có nhiều nguyên nhân, trong đó có những nguyên nhân quan trọng sau:
- Sự phân phôi không đồng đểu nguồn protein đa bào giừa các quốc gia
v à g iữ a các v ù n g d á n cư t r o n g m ộ t quô'c gia. T ì n h t r ạ n g p h â n p h ô i k h ô n g
đều dẫn đến tình trạng nơi thừa nơi thiếu.
- Trình độ kỹ thuật về phát triển nguồn protein đa bào ở những quốc
gia khác nhau rấ t khác nhau, điều này dẫn tới tình trạng năng suâ't trong
sản xuât nông nghiệp và chăn nuôi rấ t khác nhau giừa các quốc gia và giữa
các vùng trong một quốc gia. Nơi nào có trình độ khoa học kỹ thuật tiên
tiến thì nơi đó nông nghiệp và chăn nuôi phát triển m ạnh, có đủ hoặc dư
thừa protein. Nơi nào trình độ khoa học kỹ thuật trồng trọ t và chăn nuôi
kém, nơi đó thiếu protein.
Điều kiện địa lý cũng góp phần làm m ất cân bằng về protein đa bào.
Trên trái đất chúng ta tồn tại rấ t nhiều vùng sa mạc tự nhiên hoặc những
vùng có khí hậu rấ t không thuận lợi cho trồng trọt và chăn nuôi, Rõ ràng
nhừng vùng này không th ể có đủ dinh dưỡng protein.
Nguyên nhân cuối cùng lại chính do con người gây ra. Con người tạo ra
hiện tượng ộ nhiễm mồi trường, từ đó gây ra bệnh tậ t cho động vật và cây
trồng. Con người tạo ra rừng thưa, đồi trọc, sông cạn và các vùng sa mạc
không thể phát triển chăn nuôi và trồng trọt. Nghiêm trọng hơn, nguồn lợi
thủy, hải sản ngày càng cạn kiệt do việc khai thác thiếu khoa học, do ô
nhiềm môi trường nước. Trên biển đã xuất hiện hiện tượng sa mạc biển,
m à ở đó T ắ t n h iề u lo à i s in h v ậ t b iế n m ấ t v à k h ô n g t h ể p h á t t r i ể n được.

Đứng trước thực trạng đó, các nhà khoa học đang cô" gắng tìm những
giải pháp hữu ích để tăng nhanh nguồn protein đa bào. Trong nhiều thập
kỷ qua, các thành tựu khoa học và kỹ thuật nông nghiệp đã đưa nền sản
xuâ't và chăn nuôi phát triển rấ t mạnh. Người ta đang hướng tới những
bước chuyển biến m ạnh mẽ trong nông nghiệp và chăn nuôi. Những biện
pháp đó đã được đưa ra như sau:
1- Cải biến hệ thống di truyền của cây trồng và vật nuôi. Đằng biện
pháp này các nhà khoa học hy vọng sê tạo ra được những giống cây trồng
và vật nuôi mới có năng suất cao hơn, phẩm chất các sản phẩm sinh học
tốt hcm. Chương trình đó là chương trình GMO (chương trìn h cơ thể biến
đôi gen), chương trình này mới được thực hiện chưa đầy 10 năm mà đả đem
lại những kết quả rấ t tốt. Tuy nhiên, chương trình này cũng gặp những
phản ứng khá gay gắt của một số người và một số tổ chức. Thực phẩm được
chế biến fcừ nguồn động vật và thực vật biến đổi gen này gọi là thực phẩm
biến đổi gen. Những người phản đối cho rằng việc sử dụng những thực
CỒNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 117

phẩm biến đổi gen có thế tạo ra những bệnh tậ t ở người và động vật, tạo ra
sự thay đổi nghiêm trọng về sinh thái. Tuy nhiên, cho đến nay nhiều nước
như Mỹ, Trung Quốc, một số nước khác vần phát triển m ạnh các loại đậu,
cà chua, bắp biến đổi gen.
2- Bên cạnh việc phát triển những kỷ thuật di truyền nhằm hoàn
thiện và nâng cao hơn chât lượng cây, vật nuôi biến đổi gen, các nhà khoa
học cũng không ngừng nghiên cứu nâng cao hơn những kỹ thuật truyền
thống trong trồng trọt và chăn nuôi. Biện pháp nâng cao năng suất cây
trồng, vật nuôi từ những kỷ thuật truyền thông đạt được nhừng th àn h tựu
đáng kể. Tuy nhiên cũng phải thừa nhận rằng, nền nông nhiệp và chăn
nuôi lệ thuộc rấ t nhiều vào thời tiết và bệnh tật. Hai khó khăn này cho
đến nay ta vẫn chưa giải quyết được và chưa hoàn toàn làm chủ được.
4.3.2 P rotein đơn bào
Protein đơn bào (SCP- Single cell protein) là thuật ngữ chỉ một loại
chất dinh dưỡng có trong tế bào và chỉ sản xuâ't từ vi sinh vật. Thuật ngừ
này không chỉ đơn giản là protein từ tế bào của cơ thê đơn bào, vì rất
nhiều vi sinh vật không phải là cơ thể đơn bào mà người ta vẫn khai thác
chúng. Do đó, thuật ngữ này nên được hiểu là nguồn dinh dường chứa nhiều
protein từ vi sinh vật (từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tảo).
ỉ- Lịch sử ph át triền
Thuật ngử protein đơn bào mới hình thành trong giới khoa học từ
những năm 50 của th ế kỷ trước. Thực tế loài người đã biết sử dụng loại
protein này và các chât có trong tê bào vi sinh vật từ rát lâu.
Loài người đã biết làm bánh mì, phomat, sữa chua, bia bằng hoạt động
sống của vi sinh vật, mặc dù không hiểu vi sinh vật là gì. Các sản phẩm
nêu trên luôn luôn hiện diện trong các bừa ăn như một phần không thề
thiếu dược.
Mãi đến th ế kỷ 17 người ta mới biết đến vi sinh vật như một giới sinh
vật thứ ba hiện diện song song với động vật và thực vật trên trái đất.
Việc sử dụng hoạt động sống của vi sinh vật trong các quá trìn h chế
biến thực phẩm trước th ế kỷ XX hoàn toàn mang tính truyền thống và dựa
trên sự hiện diện của chúng trong điều kiện tự nhiên. Trước th ế kỷ XX,
việc nghiên cứu và sản xuất protein đơn bào còn rấ t xa lạ với loài người,
nhất là sản xuất theo qui mô công nghiệp.
Đầu những năm của th ế chiến thứ nhất, nhà máy sản xuất sinh khôi
nấm men Torula được coi là nhà máy đầu tiên sản ximt protein đơn bào tại
118 CHƯƠNG 4

Đức. Sau th ế chiến thứ nhất, người Đức tạm ngưng sản xuất, nhưng đến
năm 1930, người Đức phục hồi và mở rộng việc sản xuất, đưa tổng sô' nấm
men hàng năm lên đến 15.000 tấn, sô' nấm men này là thực phẩm (dịch
soup và làm xúc xích) phục vụ cho quân đội.
Sau th ế thiến thứ hai, hàng loạt nhà máy sản xuất protein đơn bào
được xây dựng tại Mỹ, Anh và một số nước khác. Sau năm 1950, phong trào
sản xuất protein đơn bào đá lan rộng ra hầu hết các nước châu Au.
Tuy nhiên, các nhà máy sản xuất này vẫn d qui mô vừa và nhỏ.
Năm 1967, hội nghị về sản xuất protein đơn bào được tổ chức lần đầu
tiên tại Viện Kỹ thuật Massachuset (MIT). Có một dự án sản xuất protein
đơn bào qui mố công nghiệp với công suất lớn được trìn h bày tại hội nghị
này.
Năm 1973, hội nghị về sản xuất protein đơn bào lần thứ hai được tổ
chức tại MIT. Tại hội nghị này có râ't nhiều dự án sản xuất protein đơn bào
theo qui mô công nghiệp được trình bày, trong đó có một dự án sản xuất
protein đơn bào từ cacbua hydro lần đầu tiên được công bố.
2- ưu điểm của protein đơn bào
Sản xuất protein đa bào là một quá trìn h sản xuất mang tính truyền
thông và có nhiều nhược điềm như đã trình bày ở phần trên. Sản xuất
protein đơn bào có những ưu điểm rấ t rõ:
• Vi sinh vật là cơ thê có tốc độ sinh sản rấ t mạnh, khả nảng tăng
trưởng nhanh. Chỉ trong một thời gian rấ t ngắn ta có thể thu nhận được
một khối lượng sinh khối rấ t lớn; thời gian này được tính bằng giờ, còn ở
thực vật và động vật thời gian này được tính bằng tháng hoặc hàng chục
năm.
• Hàm lượng protein rấ t cao, cao hơn rấ t nhiều so với protein có trong
thực vật và động vật (hàm lượng protein ở vi sinh vật khoảng 20 - 80%
trọng lượng khô).
• Protein của vi sinh vật có chất lượng tương đương protein dộng vật
v à h ơ n h ẳ n p r o t e i n t h ự c v ậ t (ở đ ộ n g v ậ t , p r o t e i n c h ứ a đ ầ y đ ủ v à r ấ t c â n đ ố i
các axit amin; ở thực vật thường thiêu loại axỉt amin này hay axit amin
khác)
• Vi sinh vật có khả nảng hấp thụ, phân giải nhiều loại nguyên liệu rẻ
tiên, dê kiêm, thậm chí cả chât thải, nước thải của một quá trình sản xuất
nào đó.
• Hoàn toàn có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp (sản xuất hàng
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬ T 119

loạt, có kiểm soát và sản phẩm có chất lượng đ^ng nhất)

• Sản xuảt protein đơn bào không phụ thuộc vào khí hậu hay điều
kiệi) địa lý

4.4 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN ĐƠN BÀO

Công nghệ sản xuất protein đơn bào từ tảo đơn bào
Đầu những nâin 70 của thế kỷ trước (thế ký XX), nhửng nhà khoa học
người Pháp phát hiện ra tảo có khá năng phát triển nhanh và có hàm
lượng protein rấ t cao. Họ đã nghiên cứu rấ t kỷ và đã xây dựng được qui
trình công nghệ sản xuât tảo.
Cho đến nay chỉ có ba loại táo đơn bào được sản xuất theo qui mô lớn
và có lợi ích kinh tế cao:
- Chlorella
- spirulina
- Scenedesmus.
trong đó hai loài Chlorella và spirulina được sản xuất nhiều hơn. Những ưu
điểm cơ bán của tảo đơn bào được các nhà khoa học và các nhà sản xuât
quan tàm bao gồm:
1- Tảo đơn bào có hàm lượng protein rấ t cao (chiếm khoảng 70-75CỶ
chất khô).
2- Protein của tảo thuộc loại protein hoàn hảo và có chất lượng cao.
3- Cho đến nay người ta chưa tìm thấy độc tố nguy hiểm tồn tại trong
sinh khôi táo.
4- Táo là loài sinh vật tự dường, chúng hoàn toàn có thể tự tổng hợp
chất hừu cơ cho sự phát triến cúa mình từ các chất vô cơ, C 02, ánh sáng
như ở thực vật.
5- Tảo có kích thước tế bào lớn, chúng hoàn toàn đáp ứng tố t mọi yêu
c ầ u k ỹ th u ậ t* đ ặ c b i ệ t r ấ t t h u ậ n lợ i t r o n g ^ i a i đ o ạ n t h u n h ậ n .

6- Chúng không bị virus tấn công, sống trong những điều kiện đơn
giản.

4.5 ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA TẢO ĐƠN BÀO

Trong phần này, chúng tôi chỉ trình bày hai loại tảo được ứng dụng
nhiều trong sản xuất là Chlorella và spirulina. *
120 CHƯƠNG 4

4.5.1 Đ ặ c đ iể m s in h lý , s in h h ó a c ủ a C h lo r e lla
Táo Chlorella là loại tảo đơn bào, có hình cầu, không di động. Đường
kính tô bào từ 3- 10 Ịiin.
1- Phăn loại
Ngành: Chlorophyta
Lớp: Protococcophyta
Bộ: Chlorococcales
Họ: Oscystaceac
Giống: Chlorella
2- Cấu trúc tế bào
• Tỉiàiììì tc bào: Tế bào được bao bọc bỡi plasmaìemma. có chieu dày
khoáng 100Ẳ , trên đỏ có rất nhiểu lồ đê tham gia các quá trình trao đòi
chãt. Khi tiên hành sinh san. các bao vò cứa táo Chlorella không tham gia.
Các tẻ bào C011 dược sinh ra trong tế bào mẹvàchui qua lớp bao vonày.
Khi ra ngoài chúng hình thành bao vó mới.
Thành té bào Ohloreila chiếin khoảng 13 - 25'( trọng lượng khò cua tẻ
bào. Thành tè bào được cấu tạo chũ yếu từ protein và hydratcacbon.
• 77’ hào chát:
- Tỏ bào chất của táo Chlorella là một chất nhầy, trong suốt, (lạng hạt.
không màu.
- N ước Irong t ế bào chàt chiêm từ 5Ỏ - 80rí
- Protein là thành phần cơ bản cùa vật chất khỏ. chúng chiếm khoảng
70 - 7 f/r, troug đó có:
Cachon: 55-65'í; Oxy: ‘20-255; Nitd: 15-19<7; Hydro: 6 J-7 ,3 C'<
Một lượng uho lưu huỳnh và photpho
• Lục lạp: là cơ quan rất quan trọng cua tào,chúng tham gia vào các
quá trình quang hợp.
Lục ĩạp có chứa sác tò màu xanh giống như chlorophil gồm các sắc tỏ
a. b, c, d, e. Trong tè bào, lạc lạp thường nằni giừa tế bào hoặc ở th àn h té
bào.
• Nhớn: Tào Chlorella chỉ chứa một nhản. Đây là cơ quan quan trọng
nhât cùa té bào. Câu trúc cùa nhân cung giòng như cấu trúc nhân cùa các
sinh vật Eucaryote:
- Màng nhân
CÔNG NGHỆ SÀN XUẤT VI SINH VẶ T 121

- Dịch nhàn
- Hạch nhãn
- Mạng lưới nhiễm sắc thế ị chromatin).
3-Sinh sản của Chlorella
Khi phát trièn đến một thời kỳ sinh lý nhất dịnh và gặp điều kiện
thuận lợi, các chất nguyên sinh chia ra làm hai. Có thề chất nguyên sinh
c h i a 1 l ầ n , 2 l á n , 3 l ầ n đ ế t ạ o r a 2, 4 , 8 k h ô i c h ấ t n g u y ê n s i n h r i ê n g r ẽ .
Mồi phần nàv đểu chứa nhửng phần chia cùa nhân và lục lạp, và chúng
hoàn toàn tự tạo ra vò riêng cho mình. Khi phát triển đến một giới hạn
sinh lv nhất định, vỏ tê bào mẹ vờ ra, các tế bào con được phóng thích ra
ngoài. Sự tạo ra các tê bào con có thể chỉ trong vòng 24 giờ, do dó sô lượng
lão tro n g một thời gian ngắn sẽ tảng rât nhanh.

tào Chloreila đang phán chia

tảo Chlorella đă phân chia

Hình 4.7: Chu kỳ sinh sản và phát triển của tảo Chỉorelỉa

4- Thành phần hóa học cùa tê bào tào Chlorella

Các chất dinh dưỡng và yếu tố môi trường có ảnh hưởng rấ t lớn đến
thành phần hóa học của tế bào tảo. Thành phần hóa học trung bình trong
tè bào tảo như bảng 4.4 (pilove- 1985)
122 CHƯƠNG 4

Bảng 4.4: Thành phần hóa học của Chỉoreỉla

TT Thành phấn Sô' IƯỢng TT Thành phẩn SỔ lượng

(% tổng chất khô) (% tổng chất khô)

1 Protein tổng số 40-60 10 Chlorophyl b 0,58

2 Glucid 25-35 11 Axit nucleic 6,0

3 Lipit 10-15 12 Tro 10- 34

4 Sterol 0,1-0,2 13 Vitamin Bt 18,0 mg/ kg

5 Sterin 0,1- 0,5 14 Vitamin c 0,3- 0,6 mgV kg

6 Ca rotenoid 0,25 15 Vitamin K 6 mg/ kg

7 ỊỈ- ca roten 0,16 16 Vitamin Be 2,3 mg/ 100g chất khô

8 xantophyl 3,6- 6,6 17 Vitamin B2 3,5 mg/ 100g chất kbõ

9 Chlorophyl a 2,2
5-Đặc điểm sinh lý của Chlorella
Ảnh hưởng của ánh sáng
Tẩo là một loài vi sinh vật tự dưỡng quang năng nên ánh sáng là yến
tố quan trọng trong quá trình tự dưỡng của tảo.
Đôi với Chlorella, ánh sáng có ý nghĩa rấ t lớn. Cường độ ánh sáng
càng cao, khả năng phát triển của tảo càng mạnh
Cường độ ánh sáng thích hợp cho sự phát triển của tảo nằm trong
khoảng 500 - 10.000 lux (Shỉgetoh miyachi - 1983).
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Tảo Chlorella phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 25 - 35°c. Tuy nhiên
k h o ả n g n h i ệ t đ ộ t ố i ưu c h o t ả o C h l o r e l l a p h á t t r i ể n c ò n p h ụ t h u ộ c T ấ t n h i ề u
ớ độ chiếu sáng và thành phần môi trường.
Ảnh hưởng pH mồi trường
Tảo Chlorella phát triển ồ pH có độ axit yếu đến pH trung tính
(pH= 5,5 - 7,0). Tuy nhiên, tảo cung vần có khả năng phát triển ở pH thấp
(pH= 3 - 4)
Ảnh hưởng của sự khuây trộn môi trường
Khuây trộn môi trường trong nuôi cấy tảo là điều kiện bắt buộc. Mục
đích của khuấy đảo:
- Tăng khả năng tiêp xúc của tê bào tảo với chất dinh dưỡng, làm tăĐg
quá trìn h trao đổi chất
- Tăng khả năng tiếp xúc ánh sáng của tế bào
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 123

- Tăng khả năng thoát các chất khí tạo ra trong quá trình hô hấp của
tảo
- Hạn chế những vi sinh vật gây bệnh yếm khí có trong môi trường
- Đảm bảo chu kỳ sảng/tối (khi tảo nối lên và khi tảo chìm xuống), tạo
điều kiện tự nhiên thích hợp với quang hợp của tảo
Khi nuôi tảo, người ta lắp đặt những thiết bị khuấy có công suất nhỏ,
không cần hệ thông khuấy trộn với công suất lớn.
Nguồn dinh dưỡng của Chloreỉỉa
- Dinh dưỡng cacbon: Tảo Chlorella thường sử dụng C 02 như nguồn
cacbon chính trong quá trình trao đổi chât. C 02 trong nước tồn tại ở các
dạng như sau:
C0 2 + H20 — ► H 2CO3 — ► H+ + HCOa — 2H+ + CO3 2'
pH có ánh hưởng rấ t lớn đến sự tồn tại của các dạng hợp chât trên.
Chlorella hâ'p thụ CO2 chủ yếu d dạng không phân ly. Phản ứng tổng
hợp có thể viết dưới dạng:
H,CO t + 2H20 — ► (CH20) + H .o + 0 2 OH -
HCCV + OH“ — ** CO,2' + H20
C O /' + C 02 + 2H ,0 —► 2 HCCV
Ngoài C 02t tảo Chlorella còn có khả năng hấp thụ HCO3' hoặc
NaHC03 . Nồng độ CO2 cần cung cấp khoảng 3% (.Ephraim cohen - 1984).
Nếu trong môi trường có sẵn hoặc cung cấp HCO.V thì nồng độ CO2 chỉ cần
1,5% (Shigetoh Miyachi - 1983).
Ngoài CO2, nguồn cacbon vô cơ HCO3 , NaHCOs ra người ta có thể
cung cấp nguồn cacbon hữu cơ {Nguyễn văn Tựu- 1993) dạng acetate natri,
axit acetic hay glucose.
- Dinh dưỡng nitơ: Các hợp chất chứa nitơ mà Chlorella có thể sử dụng
bao gồm NOg, NOị , NH 4 , axit amin, urea, glutamin, asparagin, purin,
các dẫn xuất xanthin, hypoxanthin, axit uric.
Nguồn nitơ không ảnh hưởng nhiều đến sinh lý của Chlorella. Nếu
thiếu dinh dưỡng nitơ, Chlorella sẽ tăng sự tạo thành c h l o r i p h i l , ca ro ten ,
xantophil từ 1,5 - 2 lần trong 6 - 8 ngày đầu, sau đó sẽ giảm dần. Nếu thiếu
hoàn toàn nitơ trong môi trường, tế bào Chlorella không chết mà tồn tại ở
trạng thát tiềm sinh. Chlorella sẽ nhanh chóng phục hồi lại trạng thái
sinh lý bình thường khi ta bổ sung nitơ vào môi trường (Phạm Hữu Giục -
1991)
124 CHƯƠNG 4

- Dinh dưỡng phot pho: Photpho tham gia vào thành phần của hợp chất
cao năng ATP, axit nucleoic, hợp chất của màng tế bào. Tảo Chlorella hấp
thụ photpho ớ dạng vô cơ như HvPO<. Nếu thiếu photpho, Chlorella sẽ biến
đôi màu sắc rấ t nhanh, các quá trình trao đối chát giảm mạnh.
4.5.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của tảo Spirulina
Tảo Spirulina được nuôi cấy rộng rãi hơn tảo Chlorella.
Tảo Spirulina có dạng xoắn lò xo khoảng 5- 7 vòng đều nhau không
phân nhánh. Đường kính xoắn khoảng 35- 50 ^im, bước xoắn 60 um, chiều
dài thay đổi có thể đ ạt 0,25 mm. Nhiều trường hợp tảo Spiruiina có kích
thước lớn hơn.

Tảo là trung gian giữa vi khuẩn và tảo nhãn thực. Người ta cho rằng
táo Spirulina giống vớì vi khuẩn hơn, do đó táo Spirulína còn có té 11 là vi
khuẩn lam.
Tảo có khá nảng vận chuyển theo hình thức trượt xung quanh trục của
chúng. Vận tốc vận chuyến của chúng có thế đạt 5 micron/ giày.
/ ' Phản loai
- Ngành: Cyanophyta
- Lđp: Cyanophyceae
- Bộ: Osciiiatoriales
- Họ: Oscillatoriaceae (Nostocales)
- Giống: Spirulina
2* Cấu tạo
- Tao được câu tạo từ một sợi đa bào. mỗi tê bào của sợi có chiều rộng
5 jam, dài 2 mm.
T a o k h ô n g c o lụ c l ạ p m à ch ỉ c h ứ ath iỉa c o it p h à n bô đốu troiìg t ê bào.
- Táo không cỏ không bào
- Tao không có nhãn đièn hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 125

D N A (H ed en sk o g G và H ifsten A. 1980)
- Tảo lam cũng tồn tạ i ỏ d ạn g đơn bào.

3- Sinh sàn của spiru lin a

Tảo lam là vi s in h v ậ t xuất h iệ n cùng lúc với vi khuẩn trên trá i đ ất
(C iíĩeri o, T iboni o, 1985). H iện n a y người ta b iế t k h oản g 2 .5 0 0 loài. Tảo
lam p hân bô" rấ t rộn g và có k h ả n àn g chịu n h iệ t rất cao. Người ta p h át
h iện chúng số n g ở những suối nước n ón g đến 69°c.

Mormo?

Necnadỉa

Hình 4.8: Sơ đồ vòng đời của tảo Spỉrulina Platensís (Ciferri, ì 985, tr.562)
Tảo lam đơn bào s in h sản b ằn g cách p hân đôi tê bào. Tảo lam đ a'b ào
sinh sá n b ằ n g cách gãy ra từng khúc. Khúc n ày được gọi là khúc tản . Các
sợi tảo sin h sả n b ằn g kiểu này thường là chuỗi t ế bào xếp nối nhau, th ỉn h
th oáng có n h ữ n g t ế bào bất b ìn h thường có kích thước )ớn hơn. Sợi tảo
thường dứt n g a n g ở chồ có t ế bào dị h ìn h trèn , từ đó tạo ra những sợi mới.
Trong trường hợp gặp điều k iệ n k h ôn g thuận lợi, tảo lam củ n g có khả
n ă n g tạo bào tử g iô n g như ở vi khuẩn. Thường bào tử do những t ế bào dinh
dưỡng tạo ra. B ào tử chứa n hiều ch ấ t dinh dường ở d ạn g dự trữ và được bao
bọc bởi m ột lớp vỏ dày. K hi gặp điều k iệ n thuận lợi ch ú ng sẽ tạo ra m ột sợi
tảo mới.
Chu k ỳ p h á t triển của tảo rất n gắn. Chu kỳ n ày thường xảy ra trong
24 giờ như của tả o C hlorella.
126 CHƯƠNG 4

4- Thành phần hóa học của spiru lin a

Tảo S p iru lin a chứa hàm lượng protein rất cao, cao hơn tảo Chlorella.
N g o à i ra chúng chứa đầy đủ các vitam in (C lem en t, 1975; B u sson , 1971;
S a n tila n , 1982; P irt, 1984).
Bảng 4.5: Thà n h p h ầ n hóa học của tảo S p ir u ỉin a
Số thứ tự Thảnh phẩn Số lượng (% chất khỗ)

1 Protein tổng sô 60- 70

2 Gỉucid 13- 16

3 Lipit 7 -8

4 Axit nucleic 4,29

5 Diệp lục 0,76

6 Cà rốten 0,23

7 Tro 4- 5

Bảng số 4.6: Thà n h p h ầ n v ita m in của tảo S p ir u lin a

Số ỉhứtự Thành phẩn Số lượng

(% tổng chất khô)

1 Vitamin B i2 1.6

2 p- cà rốten 1.700

3 D -C a- panthothenate 11

4 Axit tolic 0,5

5 Inositol 3,5

6 Niacin (B 3) 118

7 Vitamin Be 3

8 Vitamin B ( 55

9 Vitamin E 190
CỒNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 127

_ •
B ả n g s ố 4.7: Thành phần khoáng của tảo Spiruỉỉna
Số thứ tự Thảnh phẩn Số lượng ;% tống chất khô)

1 Canxi 1.150

2 Photpho 8.280

3 Sắt 528

4 Natri 344

5 CIO 4.20C

6 Magie 1.663

7 Mangan 22

8 Kali 14,4

9 Salen 0.4

B ả n g sô' 4.8: Thành phần axit am in của tảo Spirulina

Số thử tự Thánh phấn M9 / 10g Sò lượng (% tổng chất khỏ)

1 Isoleucin 350 5,6

2 Leucin 540 8,7

3 Lysin 290 4.7

4 Methionin 140 2,3

5 Phenilalanin 280 4,5

6 Theonin 320 5,2

7 T ryptophan 90 1.5

8 Valin 400 6,5

9 Alanin 470 7,6

10 Arginin 430 6,9

11 Axit aspartic 610 9.8

12 Cystin 60 1,0

13 Axit glutamic 910 14,6

14 Glycin 320 5,2

15 Hỉstidin 100 1,6

16 Prolin 270 4,3

17 Serin 320 5,2

18 Tyrosin 300 4.8

128 CHÙƠNG4

5- Một sổ đặc điểm sinh lý của spiru lin a

Ả nh h ư ởn g củ a n h iệ t độ đ ến sự p h á t tr iể n của S p iru lin a
spirulina phát triển ở nhiệt độ khá cao. Chúng có khả năng phát triển
ở khoảng nhiệt độ 32 - 40nc. Nhiệt độ phát triển tốt n h ất cùa chúng
thường là ở 35°c (Zarouk, 1966)
ở nhiệt độ dưới 25°c, Spirulina phát triển chậm; ở nhiệt độ > 40°c,
tảo bị chết sau sáu ngày. Nhiệt độ tôi thiếu đẻ chúng tồn tại là 18“C (Orio
Ciferi, 1985).
Ảnh hư ởng củ a á n h sá n g đ ến sự p h á t tr iể n củ a tảo
Anh sáng là một trong nhừng yếu tô quan trọng nhất ánh hương đến
sự phát triến của tảo. Tảo ít bị chi phôi bới chu kỳ sáng/tối. spirulina đạt
giá trị sinh khối cao n hất khi được chiếu sáng liên tục (Che Kívit, 1977).
Cường độ ánh sáng thích hợp nhát cho Spiruỉina nằm trong khoảag
25.000 - 30.000 lux (Nguyễn Tiến Cư, 1993).
Ẩnh hưởng của pH đên sự phái triển của tảo
pH môi trường từ 8,5- 9 là pH tôi lit! cho Spirulina phát triển; ờ pH
này, các nguồn cacbon vô cơ được tảo đồng hóa nhiều nhất. Tuy nhiên, ớ
pH = 1 0 -1 1 tảo vần có khả nang phát triển, nhưng rất chạm.
- Nêu pH < 7: khi COv được dưa vào mói trường, tảo có thè sử dụng
C0 2 hòa tan là chú yếu.
- N êu pH £ 9: CCX h ò a ta n sẽ ch u y ể n s a n g H C O 3 và C O 3 :

CO, H ,C O ;ỉ H + + HCO3 2H + + c ơ ị
- Nêu pH = 10 - 1 1 , các nguồn cacbon trẻn lại trở về trạng thái ban
đầu
co! + H ,0 * - ~ C 0 , + 2 0 H
OH được giải phóng sẽ làm tăng pH.
- Nếu pH quá cao tấ t cả HCO3 và c tíị sẽ tạo thành CO‘>và OH
N g u ồ n d in h d ư ỡn g củ a S p ỉru lỉn a
* Dinh dường caebon
Nguồn cacbon được sử dụng để nuôi cấy tảo là CO2 và NaHCOa .
Môi trường có HCO 3 thường thuận lợi cho Spirulina phát triển hơn
CO3 . Trong quá trình nuôi cấy, nêu chỉ thổi CO2 mà môi trường không có
muối cacbonat nào khác thì sè làm giảm pH xuống còn 6 ,5 . Khi đó tảo sẽ
chêt râ t nhanh. Do đó, khi thổi khí CO2, phải kết hợp vói việc cung câp
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 129

muối bicacbonat vào môi trường sẽ tạo ra pH thích hợp cho tảo phát triển.
Trong thực tế sản xuất người ta thường cho 16,8 g/1 N aH C 0 3 thổi khí
khoảng 1%, nuôi ở nhiệt độ 33 - 35°c và dưới cường độ ánh sáng 50001ux
năng suât tảo đạt rấ t cao.
Như vậy nguồn cacbon chủ yếu là NaHCO;j , còn CO‘2 chỉ là nguồn bố
sung phụ (Nguyền Văn Tựa, 1993).
• Dinh dưỡng nỉ tơ
Trong quá trình phát triên của tảo Spirulina, nitơ đóng vaitrò rất
quan trọng. Nếu thiếu nitơ, sinh khôi tảo sè giảm rất nhanh.
Các* muôi nitrate là nguồn Iiitơ rất thích hợp cho tảo phát triển. Hàm
lượng n itrat cho vào môi trường phải nhỏ hơn 100 mg/ lít.
Ngoài ra, người ta còn sứ dụng NaHCOs như một nguồn nitơ. Tuy
nhiên liều lượng hóa chât này không được cao.
Urea cũng là nguồn nitơ thông dụng. Nồng độ urea đượcsử dụng là
l,5g/l.
• Dinh dường photpho
Photpho được tế bào táo sử dụng đề tổng hợp ATP, axit necleic, các
hợp chất cấu tạo khác. Nồng độ tôi đa của photpho từ 90 - 180 mg/1
(Zazouski, 1978).
Nghiên cứu khác cho thấy lượng photpho đưa vào có th ể cao đến 360
mg/1 (Nguyễn Hữu Thước, Trần Văn Tựu, 1985), khi đó hàm lượng protein
sẽ đạt được cao nhất.
• Dinh dưỡng các chất khác
Tảo cũng nhận Fe với liều lượng 0,56 - 56 mg/1 và trong môi trường
kali 5 g/1, Na 5 g/l.
Chế độ thổi khí
Chế độ thổi khí C 0 2 với liều lượng 2 % liên tục dưới một chế độ ánh
sáng mạnh và có m ặt của HCO3' sẽ là điều kiện tối ưu cho tảo phát triển.

4.6 MỘT s ố KHÁC BIỆT GIỮA CHLORELLA VÀ SPIRULINA

Tảo spirulina hiện nay được nuôi nhiẻu hơn tảo Chlorella vì giữa hai
loài tảo này, tảo spirulina có rất nhiều ưu điểm hơn hẳn tảo Chlorella.
1- Tảo spirulina có hàm lượng protein cao hơn hẳn Chlorella. Protein
trong tế bào Spirulina là 60 - 70%, Chlorella là 40 - 50%.
2- Kích thước tảo Spirilina lớn hơn kích thước tảo Chlorella. Mặt khác,
130 CHƯƠNG 4

tảo Spirulina, trong quá trình phát triển, có xu hướng nổi trên bề mặt,
trong khi đó, tảo Chlorella có kích thước nhỏ lại có xu hướng lắng chìm khi
không khuấy trộn. Thu hoạch tảo Spirulina bằng những phương pháp rất
đơn giản, trong khi thu hoạch tảo Chlorella phức tạp giống như thu hoạch
sinh khôi nấm meh/hoặc sinh khôi vi khuẩn.
3- Tảo Spirulina chứa rấ t nhiều loại vitamin, trong khi tảo Chlorella
chứa ít loại vitamin hơn.
4- Thành tế bào tảo spirulina mỏng, thành tế bào Chlorella dày. Do đó
hệ sô" tiêu hóa khi ta dùng tảo Spirulina cao hơn tảo Chlorella. Tảo
Spirulina phát triển trong mồi trường kiềm, còn Chlorella phát triển trong
môi trường axit yếu.
5- Khi dùng C 0 2 như nguồn cacbon, mà nguồn cacbon này trong điều
kiện kiềm đất dễ chuyển hóa sang dạng dễ hấp thụ theo phản ứng sau:
HCOã + OH~ ---- ► c o ỳ + H20
c o ị- + C 0 2 + H20 ---- *■ 2 HCOi
Spirulina hấp thụ C 0 2 theo chiều hướng này tốt hơn tảo Chlorella.

4.7 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TẢO

Hiện nay, trên th ế giới phát triển rấ t mạnh việc nuôi cấy tảo
Spirulina và Chlorella để thu nhận sinh khôi cho người và động vật, trong
đó spirulina được sản xuâ't nhiều hơn. Thực tế cho thấy, 1 ha bề m ặt nuôi
cấy tảo thu nhận được 10 - 15 tân tảo/năm, cao hơn rấ t nhiều so với trồng
lúa. Một trong những giống được sử đụng nhiều là Spỉrulina maxima. Tảo
lam này phát triển th àn h sợi, do đó rấ t dễ thu nhận, thậm chí bằng cả
phương pháp thủ công. Loại tảo này không chứa độc tố, các dân tộc quanh
hồ Sat và Mexico thường sử dụng loài tảo này như thực phẩm chính của họ.
Điều kiện bắt buộc cho việc nuôi tảo bao gồm:
• Phải có ánh sáng với cường độ chiếu cao. Thời gian chiếu sáng trong
năm nhiều.
• pH môi trường phải duy trì 8,5 - 9 (đối với Spirulina) và trung tính
(đối với Chlorella).
• Phải được cung cấp đủ các loại muối vi lượng.
• Phải khuấy đảo liên tục, tạo sự tiếp xúc thường xuyên với ánh 'sáng
(đối với Spirulina) hay phải tạo ra chu kỳ sáng/tối thích hợp (đối với
Chlorella)
Ở Mỹ, người ta nuôi Chlorella bằng một ông nhựa hình chừ Ư, với tổng
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 131

chiều dài 21 m, đường kính ông l,2m và chiều cao của ống là 6,25m. Khí
CƠ2 được bơm vào mỏi trường. Năng lượng mặt trời được chiếu vào ông
nhựa, tảo tiến hành quá trình quang hợp và phát triển.

Hình 4.9: Hồ nuôi tảo Chlorella tại N hật

ơ pháp, người ta thiết kế và xây dựng những hồ nuôi có diện tích 5.000
m2. Hệ thống nuôi tảo ở Nhật giống hệ thống nuôi tảo của Liên Xô cũ ở vùng
Kazastan. Hệ thống nuôi tảo hình trụ thường có kích thước <ị>= 6 - 8 km, chiều
cao 1 - l,2m, chiều cao dung dịch nuôi tảo bằng 70% chiều cao của hệ thống
nuôi.
Hiện nay, người ta phát triển một dạng nuôi tảo khác. Hệ thông này
do người Pháp th iế t kế và triển khai (hệ thống này có triển khai tại TP
HCM với điện tích khoảng 150 m2)

Khuấy đảo

Khuấy đảo

—— Khuấy đảo
132 CHƯƠNG 4

Việc nuỏi táo không cần nhừng thiết bị quá phức tạp và đát tiền,
nhưng cũng có nhừng hạn chế nhât định. Vì phai nuôi trong điếu kiện ánh
s á n g t ự n h i ê n n ê n t a r ấ t k h ó đ i ề u k h i ế n n h i ệ t độ, r ấ t k h ó đ i ề u k h i ê n á nh
sáng. Chinh điổu nảy gây ra hiện tượng nãng suất thường không òa định.
Khi sinh khối tảo đạt tối đa, người ta tiên hành thu nhận sinh khối
tảo. Việc thu nhận sinh khỏi tảo thường qua các bước cơ bàn:
- Làm đặc sơ bộ
- Lọc bằng ‘trọng lực
- Phá vờ tế bào
- Sây khô
- Nghiền
- Đóng gói
Đôi với táo có kích thước lớn, người ta có thể thu nhận bằng vải mịn.
Các cơ sớ nhò nuôi cây tảo thường sử dụng phương pháp này đê giảm chi
phí sàn xuất. Tại các cơ sở sản ximt có công suất lớn, người ta bắt buộc
phải sử dụng nhừng máy ly tâm hoặc những Hiáy lọc có công suất tương
ứng. Trong nuôi cây tảo, người ta đưa ra rất nhiều công thức nuôi cấy khác
nhau, trong đó có những công thức môi trường sau đáy dược sứ dụng nhiều.
7- Mỏi trường cơ bản nuôi cấy Spiruỉinu
• Môi trường cơ bản (mỏi trường Zarrouk):
K.HPOì 0 ,lg/ 200ml NaNO, 0 ,5 g/ 200ml
KvSO, 0,2g/ 200 ml NaCl 0,‘2g/ 200ml
M gS0,7H20 0,04g/ 200mì FeSO„ 0,0002g/ 200mỉ
CaCla2 H.O 0,008g/ 200 ml EDTA 0,016g/ 200ml
• Mỏi trường bổ sung 1:
H;ỉBO;ì 2,86g/l M nCl,.4H ,0 l,81g/l
ZnS0 4.7H20 0,22g/l CuS0 4.5H20 0,08g/l
MoC, 0 ,01 g/l
• Môi trường bổ sung 2 :
KaCr.2(S 0 4)3 24H.O 960g/ì N iS 0,.7H ,0 478gA
Tiz(S 0 4)3 400g/l Co(NO,)2.6 H2ơ 44gA
Cách pha chế môi trường như sau:
Cân chính xác 16,8g NaHCO.ị hòa tan trong 500ml nước cất. Hút 10 mi
dung dịch cơ bản, cho 500ml dung dịch NalICO;* vào. Hút lm l dung dịch bổ
sung 1 và lm l dung dịch bổ sung 2 , thêm nước cất cho đủ Hít.
CÒNG NGHỆ SAN XUẤT VI SINH VẶT 133

2- A/ò/ tnỉờììiị cư bán nuôi cấx Cỉiỉorclỉa

• T h à n h p h a n CO' b a n :
KNO ; 20,22 g/ 20 0n il N alỊ.PO , 12,42g/ 200ml
Na^HPOị.2HjO l , 7 8 g / 2 0 0 inì MgSOị.TH.O 4,93g/ 200ml
C a C l J. 2 H , G 0 . 2 9 4 g / 2 0 0 m l
* T h à n h p h ẩ n vi l ượng:
11:30:, 0,061 g/1 M n C l . 4H . j O 0,169 g/1
Z 1 1 S O 4 .7 I L O 0 , 28 7 g/1 CuSO,.5H.O 0,024 g/1
< N H , u M o 70 , , . 4 H _ . 0 0,01235g/l
C a c h p h a chô n h ư sau: C â n 0 , 0 0 5 g a m a c c t a l n a t r i h ò a t a n t r o n g 5 0 0
ml nước cất. i l ú t 10 nil từ flung dịch có t h à n h p h a n CƯ b a n, 1 1111 d u n g dịch
vi lượng. Đ ố t o à n bộ v ào 5 0 0 m l í lu n g d ị c h a c c t a t n a t r i . T h ê m n ư ớc c ât c h o
du lOOOml. D i e u c h i n h p H = 5,5 - 7,5.

4.8 ỨNG DỤNG SINH KHỐI TẢO

<1.8.1 ứ n g d ụ n g táo C h lo rella

Từ nám 1890. Beiferinski da phân lập và thuàn khiết được tào
Ch l or ol ln . L oà i t á o nny n h a n h c h ỏ n g đưực á p d ụ n g nuôi ớ n h ữ n g b ẽ nuúi có
(ỉung t í c h ỉứn t ạ i Cộng hò;i L i ê n b a n g Đức, M ỹ , N h ậ t , Dai L o a n . I s r a e l ,
Ti ộp. M e xi co, À n Dộ. T h á i l an , T r u n g Quỏc, t r o n g (ló T r u n g Q uố c là nước
san xuất nhiêu nhất. Sinh k h ỏ i tíio dược s ứ d ụ n g l à m nguồn bố sung
p r o t o i n c ho ng ười và gi a sue. N g oà i r a t a o C h l o r o l l a còn được s ư d ụ n g n h i ề u
(iò l àm s ạ c h mòi trường. T r o ng việc l à m s ạ c h môi t r ư ờ n g bao giờ người t a
c u n g k ế t h ợ p đỏ t h u n h ậ n s i n h k h ỏ i t á o c ho g i a súc.

4.8.2 ứ n g d ụ n g tảo s p iru lin a

Táo spirulina mới được’ phát hiện sau này nhưng dược ứng dụng rất
nhanh. Các nước nuôi tao Spirulina nhiều là Mexico, Mỹ, Nhật, Đài Loan,
Ân Độ và Israel. Sinh khỏi tao Spirulina được sử dụng chu yếu như nguồn
t-ung cấp protein cho người và gia súc. Ớ fthật, người ta sán xuất sinh khối
tào có nhãn hiệu Linablue Â, ở Mỹ có Phycobiliprotein.
Ngày nay, người ta phát hiện trong sinh khối tào chứa rất nhiều chât
có khá năng chong ung thư. Tíio spirulina cũng được sứ (lụng như một tác
nhân trong xứ lý mỏi trường.
134 CHƯƠNG 4

III. SẢN XUẤT SINH KHỐI VI SINH VẬT TỪ DAU

M ỏ VÀ KHÍ ĐỐT

4.9 VÀI DÒNG LỊCH sử

- Năm 1925, Tauson đã phát hiện thấy khả năng phân giải cacbua
hydro của vi khuẩn .
- Năm 1940, rất nhiều nhà khoa học trong các phòng thí nghiệm trên
th ế giới đi sâu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong thăm dò và khai thác
dầu khí.
- Năm 1961, Fush đã thống kê được 26 giông, trong đó có 75 loài vi
sinh vật có khả năng phân hủy mạch vòng.
- Năm 1962, công trình đầu tiên được công bô' về khả năng sử dụng
dầu mỏ khí đốt để nuôi cấy vi sinh vật thu nhận sinh khối giàu protein cho
gia súc. Trong báo cáo, người ta cho thấy n-parafln là cơ chất quan trọng
nhất cho công việc này.
Sau đó, các nhà khoa học Komagata, Nakase, Kasuio đã phân lập được
498 chủng nấm men có khả năng phân giải cacbua hydro.
Từ năm 1970 đến nay đã có râ't nhiều công bô" khoa học cho thấy ngoài
dầu mỏ, khí thiên nhiên cũng có khả năng được sử dụng đẻ thu nhận sinh
khôi. Người ta đã công bố 60 loài vi sinh vật có thể phân giải khí thiên
nhiên để tạo sinh khôi.

4.10 VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CACBUA HYDRO

Số lượng các loài vi sình vật có khả nãng phản giải dầu mở và khí đốt
được công bố ngày càng nhiều. Chúng thuộc các nhóm vi khuẩn, nấm men,
nấm sợi và cả sợi khuẩn.
1- Các chủng có khả năng phân giải cacbua hydro thuộc các loài sau:
Achrobacter, Alkaligenes, Bacillus, Bacterium, Corynebacteriuin,
Micrococcus, Flavobacterium, Pseudomonas, Micromonospora, Mycobacterium,
My cococcus, Nocardia
2- Xạ khuẩn: Streptomyces, Actinomyces
3’ Nâm men: Candida, Cytomyces, Debaryomyces, Endomyces,
Hansemula, Monilia, Scopuloriopsis
4- Nấm sợi: Acremonium, Aspergillus, Penicillium
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VỊ SINH VẬT 135

4.11 VI SINH VẬT PHÂN GIẢI KHÍ THIÊN NHIÊN

Vi s i n h v ậ t p h â n gi ả i k h í t h i ê n n h i ê n r â t n h i ề u , t r o n g đó c h ủ yéii l à
các l oà i Mycobacterium. Pseudomonas, Mcthanomonas,
t h u ộ c vi k h u ẩ n :
Bacillus, Corynebactcrium, Brevibacterium, Flavobacterium, Bacterium
C ũ n g c ầ n p h ả i t h ấ y r ằ n g , k h ô n g p h ả i t ấ t cả các g i ô n g t r è n đ ề u có k h ả
n ă n g p h â n g i ả i n h ư n h a u , chỉ có m ộ t s ố c h ủ n g n h ấ t đ ị n h t r o n g c á c g i ô n g
t r ê n có h o ạ t lực m ạ n h t r o n g q u á t r ì n h p h â n giải .

4.12 Cơ CHẾ CHUYỂN HÓA

S ự đ ồ n g h ó a c a c b u a h y d r o c ủ a vi s i n h v ậ t l à m ộ t q u á t r ì n h h ế t sức
p h ứ c t ạ p . Q u á t r ì n h n à y p h ụ t h u ộ c v à o n h ừ n g đ i ề u k i ệ n sau:
1- K h ả n ă n g c a c b u a h y d r o t h â m n h ậ p v à o vi s i n h v ậ t . C á c l oạ i d ầ u v à
k h í đô't có m ạ c h c a c b o n d à i , n g ắ n k h á c n h a u , do đó c h ú n g x â m n h ậ p v à o t ế
bào k h ô n g giốhg nhau.
2- Vi s i n h v ậ t có h ệ e n z y m t h a m g i a c h u y ể n h ó a các loại c a c b u a h y d r o
n à y với m ứ c đ ộ k h á c n h a u .
3- K h á n ă n g c h ố n g ỉại c ác đ ộ c t ố có t r o n g d ầ u m ỏ và k h í đ ố t. C á c
n g h i ê n cứu về k h ả n ă n g p h â n h ủ y c a c b u a h y d r o v à k h í đ ố t m ớ i được c ô n g
b ố t r o n g n h ữ n g n ă m g ầ n đ â y n ê n n h i ề u v ấ n đ ề về cơ c h ế c ủ a q u á t r ì n h n à y
c òn c hưn đ ược l à m rỏ. Vi dụ:
Cơ c h ế c h u y ể n v ậ n các c h ấ t t ừ d ầ u m ỏ v à o t ế b à o n h ư t h ế n à o ?
Cơ c h ế c h u y ể n hóa x ảy r a n h ư t h ế n à o ở m à n g v à t r o n g t ế b à o vi s i n h
vật?
T u y n h i ê n , các n h à k h o a h ọ c c ũ n g cô' g ắ n g đ ư a r a n h ừ n g cơ c h ế về m ặ t
lý t h u y ế t , t r ê u cơ s ở đ ó s è k i ể m c h ứ n g d ầ n q u a n h ữ n g n g h i ê n cứu t h ự c
nghiệm.
C á c q u á t r ì n h đó có t h ể t ó m t ắ t n h ư s a u :
1- Cacbua hydro--------- ► RƯỢU bậc 1 (hoặc bậc 2)--------- ► Alđehyt axit béo

2- P h â n h ủ y n - a l k a n

n-alkan hoặc RƯỢU bậc 2

Rượu bậc 1

t
Aldehyt

Dài ra hoặc ngắn

bớt 1,2n nguyên tử
Axit béo
 136 CHƯƠNG 4

3- Đôi với olefin

1.olefin

Aldehyt axit béo

,2 epoxyt

+ h2o
oxy hóa
1,2-diol — axit béo ngắn bớt 1 cacbon
C02

4- Cơ chế chuyển hóa k h i mctan: C á c vi s i n h v ậ t p h ả n g i á i k h í m e t a n

t h à n h CO^ v à H + h o ạ t đ ộ n g. Vi s i n h v ậ t sẻ s ừ d ụ n g H + đ ê k h ư í i ẻ p C O j tạo
t h à n h các c h â t h ữ u cơ t h e o n h ừ n g p h ư ơ n g t r ì n h t ó m t ắ t s a u:

C H , + 2 H 20 C02 + 8( H)
4 ( H ) + CƠ2 ( C H 20 ) + h 20
4(H)+ 0 2 H ,0
CH, + 0 " ” '(CU2Õ) + h 20

Khi t ạ o t h à n h các a x i t béo, c h ú n g s ẽ t h a m g i a v à o c á c q u á t r ì n h t r ao

. đỏi c h a i ở t ê b à o vi s i n h v ậ t t r o n g c h u t r ì n h K r e b s .

4.13 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT SINH KHỐI TỪ DẦU Mỏ

Trong t h à n h phần cacbua hydro thiếu r ấ t nhiều chất dinh dưỡng.

T r o n g đó c ác loại m u ố i k h o á n g là t h i ế u t r ẩ m t r ọ n g n h ấ t . VI t h ế t r o n g khi
nuoi vi s i n h v ậ t t r o n g m ỏi t r ư ờ n g n à y đòi h ó i p h ả i được c u n g c ấ p các chất
d i n h d ư ờ n g vi l ư ợ n g v à k h o á n g c ho c h ú n g p h á t t r i ể n .

4.13.1 M ộ t s ố m ô i tr ư ờ n g n u ô i c ấ y v i s in h v ậ t t r o n g d ầ u
ĩ- Môi trường d ùn g nuôi cấy vi kh uẩn (kg):
n- p a r a f i n 10 K 2H P 0 4 1
KNOị 1 M gS0 4 0,5
NaCl 0, 1 FeCl, 0, 01
Nước 1. 00 0 lí t
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 137

b) Môi trường dùng nuôi cấy nấm men:

n- p a r a íìn 12, 5 supephotphat 2,7
sulfatamon 0,45 nước amoniac (25r/r ) 4,0
KOI 0,5 FeSOị 0,01
MgSO.i.7H^O 0,5 Nước 1.000 lít
4 .Ỉ 3 .2 Đ iề u k i ệ n l ê n m e n
Q u á t r ì n h s ả n x u ấ t s i n h k h ô i vi s i n h v ậ t ( n ấ m m e n , vi k h u â n , n ấ m
sợi) gần như nhau. Sơ đồ công nghệ:
^ Giống vi sinh vât

.................................. / T
Một ống dửng bảo quan giỏng Cấy truyẻn Một ông đê kiêm tra

Một ống chọ sản xuát

Nhân g iổ n íịc h o sản xuát

Lên men

ILL
Tách sinh khôi
T
Rửa sinh khói
(rửa nhiếu lán)

Sấy sinh khõi

r
1 phàm
Thành

Sán xuất sinh khôi vi sinh vạt từ dắu mỏ có thê đi từ paraíìu và cùng
có t h ế đi t ừ d ầ u t h ô . N ế u đi t ừ d ầ u t h ò , c ô n g n g h ệ sè r ấ t p h ứ c t ạ p , m ặ c dù
g i á t h à n h cò r ẻ h ơ n .
Trong quá trình lên men luu ý pH luôn giữ ờ khoảng 5- 6 , thoi khí lièn tục.
Đ i ề u k i ệ n t h a n h t r ù n g k h ô n g đòi h ó i n g h i ê m n g ặ t n h ư t r o n g t r ư ờ n g
hợp môi trường chứa đường.
Sinh khối vi sinh vật thu nhận sau lẽn men thường lần các thành
p h ầ n c ủa d ầ u mờ. Do đ ó t a p h ả i r ử a n h i ề u l ầ n đ ể t á c h c h ú n g r a k h ỏ i s i n h
khối. Sinh khối thu được từ lên men dầu mò hiện nay chưa được phép sử
d ụ n g c ho n g ư ời m à c h ỉ p h ụ c vụ c h o c h ă n nuôi.

4.14 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT SINH KHỐI VI SINH VẬT TỪ KHÍ ĐỐT

S ử d ụ n g k h í đốt l à m n g u y ê n liệu đ ế s a n xuất s i n h k h ố i vi s i n h v ậ t có

n h i ề u ưii đ i ể m hơii s ử d ụ n g d ầ u inó N h ữ n g ưu đ i ế m đỏ có t h ể liệt k ê n h ư sau:
138 CHƯƠNG 4

- Khí đốt thường rẻ hơn dầu mo, do đó giá thành sinh khối thu được
cùng rẻ hơn.
- Sinh khối thu nhận được từ khí đốt thường sạch hơn rấ t nhiều so với
sinh khôi từ dầu mỏ.
Tuy nhiên, nếu sử dụng khí đốt như nguồn nguyên liệu để sản xuất
sinh khối cũng gặp hai khó khăn:
• Các vi sinh vật đồng hóa khí thiên nhiên đều là những vi sinh vật
hiếu khí. Khi ta cho CH 4 vào cùng O2 sẽ tạo thành một hỗn hợp khí rất dễ
nổ.
• Để đồng hóa 0 2 và CH4, chúng phải tan được trong môi trường và
phải tiếp xúc được với tế bào vi sinh vật. Độ hòa tan của 0 2 và CH 4 trong
điều kiện bình thường rấ t kém.
Hiện nay có hai phương pháp sản xuất sinh khôi vi sinh vật bằng khí
đốt:
Phương pháp thứ nhất: Người ta tạo môi trường dinh dưỡng gồm có
muối amon và các chất khoáng. Đưa môi trường này vào trong các bình lên
men. Tiến hành nuôi vi sinh vật có khả năng tạo sinh khối từ khí thiên
nhiên trong bình lên men này. Sau đó người ta thổi khí thièn nhiên và
không khí vào bình dung dịch lên men đã có sẵn vi sinh vật. Khí không
khí và khí thiên nhiên vào trong dung dịch lên men sẽ tiếp xúc với vi sinh
vật. Khi đó vi sinh vật sẽ dồng hóa khí thiên nhiên cùng với các chất dinh
dưỡng để tạo thành sinh khối.
Phương pháp thứ hai: Người ta th iết kế nhửng bình phản ứng có chứa
đầy chất mang. C hất mang này chứa đầy những vi sinh vật trong đó. Người
ta đưa không khí và khí thiên nhiên từ dưới lên. Khi không khí và khí
thiên nhiên đi qua lớp chất mang sẽ tạo ra sự đồng hóa của vi sinh vật.
Sinh khối dược tạo thành nhiều sẽ tách khỏi chất mang và rơi xuồng phía
dưới. Người ta chỉ việc nhận sinh khối từ đáy của th iết bị.
Thu nhận sinh khối theo phương pháp này thường hiệu suất không
cao. Tuy nhiên, phương pháp này lại rấ t có ý nghĩa khi xử lý CH 4 trong
môi trường khí. CH 4 có ảnh hưởng cao nhất đến sự tạo th àn h hiện tượng
hiệu ứng nhà kính. Các nhà khoa học cho rằng CH4 làm tăng hiệu ứng nhà
kính gấp 21 lần so với C 02. Phương pháp này loại trừ được CH 4 và thu được
sinh khối cùng một lúc. Đây là phương pháp khá lý tưởng trong kỹ thuật
môi trường.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 139

IV. SẢN XUẤT SINH KHÔÌ PHỤC

• v ụ• NÔNG NGHIỆP
•

Sinh khôi vi sinh vật sử dụng trong nông nghiệp bao gồm:
• Sinh khối làm thuốc trừ sâu sinh học.
• Sinh khôi làm phân sinh học.
• Sinh khôi làm thực phẩm gia súc.
Riêng phần sinh khôi làm thực phẩm gia súc đà được trình bày ở phần
sinh khối nấm men. Trong phần này chỉ tập trung vào kỹ thuật thu sinh
khối làm thuốc trừ sâu sinh học và kỹ thuật thu sinh khôi làm phân sinh
học.

4.15 THUỐC TRỬ SÂU SINH HỌC

4.Ỉ5.1 Thuốc trừ sâu

Hàng năm, sản lượng lương thực, rau quả trên th ế giới bị mất do sâu
bệnh vào khoảng 20 - 35 r/ct trong đó các nước châu Âu mất trung bình
khoảng 20%, các nước châu Á-mất khoảng 3 0 %. Từ năm 1960 đến nay,
nhiều nước trèn th ế giới đã sứ dụng ồ ạt các chất hóa học để diệt trừ sâu
bệnh. Việc sử dụng các loại thuốc hóa học ở thời kỳ đầu đein lại lợi ích rất
lớn là khả năng tiêu diệt sâu bệnh rất nhanh và rất có hiệu quả.
Sau 40 năm th ế giới sử dụng thuốc trừ sâu hóa học đã cho thấy những
nhưtc điểm khó chấp nhận được. Các nhược điểm đó bao gồm:
• Gáy hiện tượng ô nhiễm nước và ô nhiễm đất. Các chất diệt sâu
bệnh thường rấ t ít bị phân hủy trong điều kiện thiên nhiên trong thời gian
ngắn. Chúng tồn tại trong nước, trong đất và làm thay đổi khu hệ vi sinh
vật có ích trong đất, trong nước, từ đó làm giảm hoặc triệt tiêu khả năng tự
làm sạch cùa vi sinh vật trong thiên nhiên. Ngoài ra, các chất này còn làm
ngưng trệ nhiều quá trìn h chuỹển hóa vật chất trong nước, trong đất do vi
sinh vật tiến hành có lợi cho cây trồng (một trong những chất được sử dụng
à thời gian đầu những năm 60 của th ế kỷ trước là DDT. Chất này tồn tại
khá làu trong thiên nhiên khi ta phun chúng vào môi trường. Khoảng sau
hai năm chúng mới phân hủy hêt).
• Việc sử dụng thuốc hóa học không theo một chỉ dẫn cụ thể tạo ra sự
dư thừa. Thuốc dư thừa không chỉ tồn tại trong đất, trong nước mà còn bám
vào rau, quả và nông sản gây ra hiện tượng ngộ độc ngày càng nhiều. Do
đ ó , n h i ề u q u ố c g i a t r ê n t h ế g iớ i c ả n h b á o v à c ấ m s ử d ụ n g r ấ t n h i ề u lo ạ i
thuốc hóa học.
140 CHƯƠNG 4

M ộ t t r o n g n h ữ n g t i ế n bộ củ a n g à n h c ỏ n g n g h ệ s i n h h ọ c l à t ạ o r a được
t h u ố c t r ừ s â u s i n h học. S á n x u ấ t t h u ố c t r ừ s á u s i n h h ọc d ự a t r ê n n ề n t a n g
k h o a h ọ c l à s ự đ ấ u t r a n h s i n h t ồ n g i ừ a các l oà i t r o n g giới s i n h v ậ t . Các vi
s i n h v ậ t m u ố n t ồ n t ạ i p h á i t ạ o r a n h ừ n g vũ k h í , n g o à i k h a n ă n g t h í c h ughi
và k h ả n ă n g s i n h s á n p h á t t r i ẻ n m ạ n h . Vù k h í đó c h i n h l à n h ừ n g dộc tô
h a y k h á n g s i n h được t ổ n g h ợ p b ởi n h ữ n g vi s i n h v ật t r o n g s uỏ t q u á t r ì n h
p h á t t r i ể n ciia m ì n h .
N g ư ờ i t a đ ã b i ế t lợi d ự n g quy l u ậ t n à y c ủ a t h i ê n n h i ê n . C á c n h à khoa
h ọc t i ế n h à n h p h â n l ậ p , c ái t ạ o , n ả n g cao k h á n ă n g s i n h h ọ c t ô n g hợp
n h ữ n g c h á t độc, k h á n g s i n h c ù a vi s i n h v ật . T ừ đó n â n g l é n một. bước nừa
là s á n x u ấ t h à n g l o ạ t t h e o qui m ỏ c ô n g n g h i ệ p . V à n h ư v ậ y cỏiìg n g h ệ s á n
x u àt t h u ô c t r ừ s ả u s i n h h ọc t h a y t h ê d á n t h u ố c t r ừ s á u h ó a học.
T h u ô c t r ừ s â u s i n h h ọ c được s a n xunt v à á p d ụ n g v à o t h ự c t é nhiều
11 ù m q u a cho t h ấ y n h ừ n g ưu đ i ế m d ặ c b i ệ t .
• Thuỏc trừ sâu s in h học k h ô n g ánh hường đế n cây trồng.
• Thuôc trừ sâu s in h học k h ô n g làm í h a v (lôi hộ s i n h t h á i .
• T h u ô c t r ừ s á u s i n h h ọc d ề p h â n h u y . k h ô n g t ạ o r a d ư l ư ợ n g độc hại
c ho s á n p h á m .
Tuy Iihiẽn cùng p h ái n h ặ n t h à y r a n g , so với thuỏc t r ừ s á u h óa học,
thuôc tr ừ sâu sinh học tác đ ộn g tiêu diệt s â u b ệ n h c h ậ m h ơn . D â y là nhược
đ i ế m c ầ n p h a i k h á c p h ụ c vi người dân đ à q u e n với t á c d ụ n g n h a n h cùa
t h u ò c t r ừ s â u h ó a học. n ô n k h ó c h a p n h ậ n m ộ t s à 11 p h ẩ m c h ậ m t á c (lung.
Dê g a i q u y ôt v à n (lè n à y call p h á i ('ó n h ữ n g b i ệ n p h á p đ ò n g bộ g i ú p người
dãỉi t h ấ y được lợi ích n g ấ n h ạ n và d à i h ạ n t r o n g vi ệc s ử đ ụ n g t h u ố c t r ừ
s â u s i n h học.

4.15.2 Các loại th u ồ c tr ừ sâu sin h học

H i ệ n n a y t r ê n t h ê giới, Ii^ười t a s a n xuất c h ẽ p h ấ m t hu ỏc t r ừ s âu si nh
h ọ c t ừ vi k h u á n v à t ừ n á m sợi.
1- C h ể p h ẩ m thuốc trừ sáu sinh học từ vi khuẩn
Các chế phám thuòc trừ sâu từ vi khuáìì được sàn xuất nhiều nhất
t r o n g sô t h u ồ c t r ừ s â u s i n h h ọc được s à n x u á t h i ệ n n a y t r ê n t h ế giới. Cấc
chế phám này thường chữa khoáng 2-5 tỷ tế bào/1 gam. Ta có thế tóm tắt
c ác c h ế p h á m dưực s a n x u ấ t t ừ vi k h u â n t r o n g b ả n g 4.9.
2- Các chà pỉìấm thuốc trừ sâu từ nấm sợi
So với thuỏc trừ sàu từ vi khuấn, các chê phám thuốc trừ sâu từ nâiN
sợi ít hơn Cúc chò phàm cĩó bao gồin:
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 141

• Bcciuvcria bassiana: Chê phâm t ừ n á m sợi nàv được sán xưât nhiều ớ
Trung Quốc, Nga, Pháp, Mỹ. Chè phàm này có têu là Boverin. Sô lượng bào
t ứ t r o n g m ỗ i g a m c ủ a c h ế p h à m k h o a n g 1.5 ty. Đọc tò c ú a n ấ m n à y có t ê n
là b e a u v e r i x i n v à m ộ t loại e n z v n i p r o t e i n a s e
• Mcthurrhizium anisopliar: Nà 111 liàv sinh dộc tỏ destruxin A và B.
• Trichodcrma “ chế phâm trichođenmn.
Bảng 4.9: Các chê pỉiấtìì thuốc trừ sáu ỉừ vi khỉ/ẩn
STT Sản xuất từ vi khuẩn và tén chê phàm Hãng và nưđc sản xuất

1 Các chẽ phẩm tủ Baciltius Thuringtensis

Agritol Merck - Mỹ

Bakthane L.69 Rolìm and Hass - Mỹ

Baktospeine Roger Bellon - Pháp

Bakthurin Biokrma - Tiệp Khắc

Biospon 2802 Hoechst - Đức

Dendrobacillín Zavodbakt- Nga

Dipet Abbotttlab - Mỹ

Enterobacterin 3 Nga

Parasporin Grain processing Corp. - Mỹ

Sporeine Laboraotire L, B, E, c - Pháp

Thurieide Mỹ

2 Bacillus morita Nhật

3 Bacillus cereusvar galleriae Trung Q uòc

4 Bacillus cereus var furoi Nhật

5 Bacillus entimorbus Ditman “ Mỹ

6 Bacillus pốpilliae Mỹ

7 Bacillus sphaericus Mỹ

8 Bacillus insectus Nga

9 Bacillus pulvifaciens Nhật

3- Chế phẩm từ virut

Nhiều loài virut được sản xuất như chế phẩm diệt côn trùng, trong sô'
này đáng lưu ý nhất là các loại sau:
142 CHƯƠNG 4

Bảng 4 . 10: Các chế phẩm diệt côn trùng từ ưirut

STT Vi sính vặt và chế phẩm Hãng và nưổc sản xuất
1 Bỉostol Nutriííte Products Inc. - Mỹ
2 Viron International Minerals and Chemicals
Corp. - Mỳ
3 Polyvirocizde Mỹ
4 Spodoptera Mỹ
5 Chế phẩm tuyến trùng Biotrol NCS Mỹ

2- Kỹ thuật sản xuất thuốc trừ sâu từ Bacillus thuringlensis

Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thurỉngiensis (BT): Vi khuẩn BT là vi
khuẩn hình que và có những đặc điểm:
- K íc h th ư ớ c 3 - 6 X 0 ,8 - 1 ,3 |w n.

- Thuộc vi khuẩn gram (+).

- Tế bào thường đứng riêng rẽ hay xếp thành chuồi.
- Có tiên mao mọc xung quanh tế bào (tiên nao dài khoảng 6-8 um).
- Khi trưởng thành tạo một bào tử ỏ giữa
(kích thước bào tử: 1 - 1,8 X 0,8 - 0,9 |im.
- Chứa một tinh th ể độc hình quả trám có bản chất protein.
Độc tố của BT: BT có khả năng tạo ra 4 loại độc tố trong quá trình
phát triển của chúng:
- Ngoại độc tô' a (a - exotoxin) hay còn gọi ià photpholipase-C.
- Ngoại độc tố p (p - exotoxin) hay còn gọi là ngoại độc tố bền nhiệt.
- Nội độc tố ô (Ồ - endotoxin) hay còn gọi là tinh th ể độc.
- Độc tố tan trong nước.
T rong bốn loại độc tô' của BT, người ta quan tâm n h ấ t đến độc tố tan
trong nước và tin h th ể độc.
a) Độc tố tan trong nước được P.G. Fast tìm ra năm 1971. Độc tố này
có phân tử lượng là 30 000, gây ra nhiều bệnh lý ở côn trùng.
b) Ngoại độc tố p là độc tố bền nhiệt (ở 120°c sau 15 phút vẫn giữ
được hoạt tính). Độc tố này có trọng lượng phân tử 707-850. Ngoại độc tố Ậ
có chứà ad errin , p hotph at, ribose, glucose, và a x it allom uxic.
c) Ngoại độc tô a, còn gọi là photpholipase c hay loxitinase c. Enz^ptt
n à y đầu tiê n liê n k ế t với t ế bào, sau đó được tá c h ra và bị h o ạ t h ổ a bởi
ch ấ t k h ô n g b ền n h iệ t, có tr ọ n g ỉượng p hân tử th ấp .
d) Tinh th ể độc: nhà khoa học E. Berliner tìm ra lần đầu tiên vào năm
1915, sau đó n ă m 1927, n h à k hoa học o . M a ttes, đã tìm ra m ột lo ạ i tin h
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT Vi SINH VẬT 143

thể được tạo ra trong cơ thể BT khi BT bắt đầu tạo bào tử.
Mãi đến năm 1955, người ta mđi biết được tinh thể này là chât có bản
chất protein và có liên quan đến dộc tính của BT.
Tinh th ể độc có kích thước khá dài và rộng (dài khoảng 1 ^im và rộng
khoảng 0,5 ịim). Chúng chiếm khoảng 30% toàn bộ khôi lượng tế bào và
biểu hiện tính độc của BT.
Tinh th ể độc thường làm chết các ấu trùng bộ cánh vảy. Trong thành
phần tinh th ể độc có hai loại axit amin, có sô' lượng nhiều n hất là axit
glutamic và ãxit asparaginic.
Người ta xem tinh thể độc như một tiền độc tô' (protoxin). Nó chỉ trở
thành độc tổ’ thực sự khi có mặt trong ruột của một sô" côn trùng. Khi đó sẽ
hình thành những phần tử độc tô' với trọng lượng phân tử vào khoảng
5000. Tinh th ể độc thuộc loại bền nhiệt, thường gây ra sự hủy hoại đường
tiêu hóa của sâu bệnh. Khi đường ruột bị tê liệt bởi tinh thể độc, tế bào
thượng bì của ruột bị biến đổi. Tinh thể độc cú a BT chỉ gây độc với đường
ruột sâu bệnh còn với người và động vật, tinh th ể độc hoàn toàn vô hại.
Nhiều nghiên cứu cho thấy ở động vật có vú, pepsin trong đường tiêu hóa
đã làm biến đổi trạng thái độc của tinh thể độc sang trạng thái không độc.
Khi tinh thể độc vào được đường ruột côn trùng, có hai yếu tồ' tạo ra tính
độc đốì với côn trùng:
- pH của đường ruột côn trùng: pH ở ruột giữa và ở ruột trước của côn
trùng nằm trong vùng pH kiềm (> 8,9). Khi pH ở giá trị này, tinh thể bị vờ
ra và gây nhiễm độc cho máu của côn trùng.
- Một số côn trùng tạo ra protease trong đường ruột. Các enzym này sẽ
chuyển tiền độc tô của tinh thể thành độc tố.
N h ữ n g lo à i sâ u bị BT g iế t h ạ i
BT không thể giết nhiều loài sâu bệnh. Tuy nhiên chúng có khả năng
giết rấ t lớn một sô' loài côn trùng. Trên 200 loài côn trùng chúng có khả
nămg tiêu diệt, trong đó có nhiều loài tiêu biểu như sau:
- Sâu đo acrobat (Acrobasis Spp.)
- Bướm hại gai (Aỉbaiis urtiene)
- Sâu xám hại rau (Agrotis ypsỉlon)
- Bướm phấn Địa Trung Hải (Anagasta)
- Ong kén nhỏ (Apanteles glomeratris)
- Sâu đo rau vàng (Apochemia brisoidaria)
- Bướm trắn g gân đen (Aporia crataegi)
 144 CHƯƠNG 4

- Ngài cuốn lá (Archips argurospỉỉiis)

- Bướm tai châu (Arctiaenfa)
- Sâu bướm đốm (Argtrcstỉìia conjugclla)
- Sâu cuốn lá cây ăn quả (Argyroplose variegana)
- Sâu cắn ỉ á điền thanh (Barathra brassìcae)
- Ngài cuồn lá (Cocoecia pocỉana)
- Sảu bông (chloridca dỉspsaea)
- Sâu cuốn lá nhỏ ịCnapìialocrocis medinaỉis}
- Bướm vàng (Colias philodice eurythcme)
- Sáu róm thông (Dendroỉimus depresseỉỉa)
- Sâu róm (Euproctis chrysorrhoea)
- Sâu ống sáp (Galleria mellonella)
- Sâu hại lá lớn (Gastropacha quereifolia)
- Sâu non đục củ khoai tây (Gnorimoscchcsma opercuỉella)
- Sâu xanh hại bông (Hcliothis armigera)
- Sâu xanh hại ớt (Heliothỉs asuỉla)
- Sâu xanh hại cà chua (Hcliothis absolcla)
- Sảu hại ngô (Hcỉiothis zeac)
- Sâu đo đậu (Hemerophila atrineatia)
- Bướm hại táo tây (Hyponomeuta maỉineỉỉus)
- Sâu đục quả đậu (Laspeyresia migricana)
- Bọ lá khoai tây (Leptỉnotarsa dcccmlineata)
- Sâu cắn lá ngô (Lcucania separata)
- Sâu róm hại dâu (Lymantria monaeha)
- Sâu đục qua đỗ (Maruca telulatis)
- Sâu đục thân ngô (Ostrinia nubiỉaỉis)
- Sâu cuốn lá lúa lớn (Parnara guttata)
- Bướm cải (Pieris rapae)
- Bướm phấn trắng (Pieris rapae)
- Sâu tơ (Plutella niacuỉỉpennis)
- Mọt lúa mì (Sỉtophiỉus granarius)
- Sâu cưôn lá (Timetocera acellassa)
- Bướm vằn (Vanessa urticcae)

%
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT Vi SINH VẬT 145

- Sâu hồng (Zcuzcra ky ri na).

Kỹ thuật sản xuât BT
a) Phương pháp nuôi trên máy lắc
Môi trường nuôi cấy: Ta có thế sử dụng một trong những loại môi
trường nuôi cây sau đây đê sản xuàt BT qui mỏ nhỏ.
Môi trường ĩ:
Glucose 1,5g Cao ngô 4,5g Cao 11âm men 6 ,0 g
K.HPO, 3,5g NaOH 0,43g
CaCl, o.lg Nước 1000ml
M ô i trường 2:
Rỉ đường 10 g Cao ngó 8,5g
CaCOrt l.Og Nước 1000 ml
Môi trường 3:
Ri dường 18,6g Bột khỏ dầu bòng 17gg
CaCO; l.Og Nước lOOOmỉ
M ô i trường 4:
Tinh bột nhô 68 g Saccharose 64g
Cazein 19,4g Nâm men khô 6g
Dung dịch đệm photphat 60ml Nước 1000 ml
M ò ì trường 5:
Pepton log Glucose 5g Tinh bột ngỏ 5g
Cao nấm men 2g K.HPO, 1g
KH 2PO, 3,5g Nước 1000 ml
M ô i trường 6:
Pepton lOg Glucose 10 g
Cao ngô 2g MgS0 4 0,3g
F eS04.7U20 0,02 g ZnS0 4.7H20 0 ,02 g
CaC0 3 lg Nước 1000 ml
M ô i trường 7:
Đột đậu tương 15g Glucose 5g
Tinh bột ngô 5g MgSƠ4 0,3g
F eS0 4.7H20 0 ,02 g ZnS0 4.7H20 0 ,02 g
CaC0 3 lg Nước 1000ml
146 CHƯƠNG 4

Môi trường 8:
Pepton 6g Dịch thiíy phân cazein 4g
Cao ngô 4g Cao th ịt l,5g
Glucose lg Niíớc 1000ml
Môi trường 9:
Saccharose 2g Pepton 7,5g KH 2P 0 4 6,8g
M gS0 4.7H20 0,00223g Fe 2(S0 4)3 0 ,02 g
CaCì,.4H ,0 0,183g Nước 1000 ml
Môi trường 10:
Bột đậu tương 10 g Pepton 2g Dextrin 4g
CaCO;i lg (NH/j)2S04 0,3g
M gS0 4 0,3g K2H P 0 4 2g
Dầu đậu tương 4ml Nước 1000ml
Môi trường ĩ ĩ:
Khô lạc 5g Bột cá 5g
Cao ngô 5g Glucose 3g
Dầu đậu tương 2,5g Nước 1000 ml
Môi trường 12:
Khô lạc 20 g Bột cá 5g
Cao ngô lBg CaCO:ì 5g
M gS0 4 0,075g Dextrin 5g
k 2h p o 4 0,4g Dầu đậu tương 3ml
Nước 1000 ml
Điều kiện nuôi cấy chìm
• Máy lắc có tần sô lắc 100 - 200 lượt/phút. Khi lắc không khí qua nút
)ông và vào môi trường. Nhu cầu oxy trong nuôi cấy BT rấ t cíiO (khoảng 1 -
>% hay 50 - 250 mol/m2)
• Thời gian nuôi < 2 ngày (thường 18 - 20 giờ)
• N hiệt độ nuôi 30°c ± 2 ; pH= 6,5 - 7,2
Sau khi nuôi BT trong các môi trường có thành phần dinh dưỡng tối
ưu, người ta thu nhận BT bằng cách lọc ép. Sau khi thu sinh khối, người ta
tiến hành sấy chân không và thu được thành phẩm. Chất lượng sinh khối
phải đạt như sau:
- Kết thúc quá trìn h lên men phai dạt 2,44 tỷ tế bào trong 1 ml.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 147

- Sau khi sấy chân không (thường sấy ở 60°c trong 14 giờ) sô' lượng
bào tử sông phải đạt 12,1- 17,8 tỷ/gam chế phẩm
b) Nuôỉ cây trên môi trường đặc
Ta cũng có thể nuôi cấy BT trên môi trường đặc
Môi trường nuôi cấy:
Bột ngô dầu đậu tương 15 - 20 % Cám 70%
Trấu 9 - 14% CaCOg
M gS0 4 0,1% K2HPO 4 0,15%
NaOH 1%
Môi trường được thanh trùng, làm nguội và được gieo cấy giống vào.
Quá trình lên men: Toàn bộ môi trường sau khi trộn giống được tải ra
khay với chiều dày môi trường 3 - 5cm. Nuôi trong phòng vô trùng, ở nhiệt
độ 28 - 32°c trong thời gian 24 - 36 giờ.
Kết thúc quá trình lên men, đem chế phẩm BT thô sấy khô; sau đó
nghiền mịn và vô bao gói,
Chất lượng chế phẩm được qui định là 5 - 10 tỷ tế bào trong 1 gam
Ngoài ra, ta cũng có thể nuôi trong môi trường bán rắn với thành
phần môi trường như sau:
Cám 545 g Perlít xốp 380g Bột đậu tương 62g
Glucose 3 6g Vôi 3,6g NaCl 0,9g
CaCl2 0,29g Nước 160ml
Sau khi khử trùng và làm ngủội ta, trộn môi trường trên với dịch nhân
giống đã chứa BT; cứ 1 kg môi trường trộn với 400ml dịch giống (hỗn hợp
này có pH = 6 ,9 ) rồi đưa vào th iế t bị lên men. Thổi không khí có độ ẩm
95 - 100%, nuôi ở nhiệt độ 30 - 34°c trong thới gian 36 giờ. Sau khi kết
thúc quá trìn h lên men tiến hành sấy để sản phẩm cuối có độ ẩm 4% w.
c) Nuôi BT theo qui mô công nghiệp
Trong công nghiệp, BT thường được nuôi trong những thiết bị lên men có
dung tích rất lớn và được kiểm soát chặt chẽ chế độ thổi khí, pH và lượng các
chất dinh dưỡng. Thông thường, người ta dùng các thiết bị có dung tích 5000 -
10.000 lít với hệ thông thanh trùng, làm nguội, điều hòa oxy, pH hoàn toàn tự
động. Nhiệt độ lên men luôạ duy trì ở 28- 32°c, pH = 6,5 - 7,2, chế độ thổi khí
đảm bảo 5% dung tích môi trường (hay 250mol oxy/m3 môi trường). Thời gian
lên men 24 - 30 giờ. Kết thúc quá trình lên men người ta tách sinh khối và sấy
thăng hoa để thu nhận sản phẩm.
148 CHƯƠNG 4

2- Kỹ thuật sản xuất thuốc trừ sáu từ nấm bạch cương

Nấm bạch cương (Beauveria): là loại nâin gây ra bệnh bạch cương ở
tằm. Loài nâm này phát triền rất nhanh trên cơ thế tằm. Các sợi nấm
nhanh chóng phu đầy tạo ra một màu trắng ở tằm.
Nấm bạch cương có khả năng tạo bào tử trần, không màu hình cầu
hoặc hình trứng. Bào tử khi chín bay theo không khí, khi rơi vào con tàm,
chúng sẽ phát triền mạnh thành sợi màu trắng. Bào tử có kích thước
1,5 - 5 ,5 x 1,3 ^im. Sợi nấm có chiều ngang 3 - 5fim.
Khi phát triển trên tằm, chúng phá hủy lớp kitin của tằm, ăn sáu vào
trong cơ thể và phát triển trong cơ thề tằm.
Khi nấm bạch cương mới phát triển trên cơ thề tàm, cơ thề tằm huy
dộng hệ bạch huyết chống lại sự xâm nhập này. Nấm bạch cương khi đó sẽ
tông hợp độc tố có tên là bôverixin (beauvericin). Độc tô này sẽ phá vỡ các
tê bào bạch huyêt. Khi toàn bộ tẽ bào bạch huyết bị chết cùng là lúc con
tăm bị tiêu diệt.
Vai trò nấm bạch cương trong bảo vệ thực vật
Ngoài tằm ra, nấm bạch cương có khả năng giết hàng loạt sâu bệnh.
Lần đầu tiên, vào năm 1892, F. Tang đà nuôi cấy thành công nấm
bạch cương trên môi trường nhân tạo và dùng bào tử của nấm bạch cương
đê tiêu diệt sâu róm (porthetria dispcr).
Sau đó một năm, vào năm 1893, s. A. Forbers, và năm 1896, F. H.
Snow đã thành công trong việc sứ dụng bào tử nấm bạch cương để tiêu diệt
loài rệp (Blissus leucopteus).
Cơ sở sản xuất nấm bạch cương đầu tiên được xây dựng và được thực hiện
tại l rường đại học Kansas, Mỹ. Từ đó đến nay nhiều nước trên thế giới đã tổ
chức sản xuất nấm bạch cương dùng trong nông nghiệp để bảo vệ thực vật.
Một số loài côn trùng được xác định là bị tiêu diệt bởi bào tử của nấm
bạch cương như sau:
- Aporia crataegi - Aradue cinonamomeus - Araneina sp
- Balaninus glandium - Bembidion sp - Blissus leucopterus
- Bothynoders punctiventris - Byctisuss sp - Cacoecia crataegana
- Carpoeapsa pomonella - Chrysomete sp - Chrysopa vulgaris
- Cionus sp - Cleonus sp - Coccínella septempunetala
Cossus cossus - Crambus bonifatellus - Cryptocephalus sp
- Eurydema sp - Eurygaster integriceps - Galerucỉnae ruta
' Gnorimo schema ocellatellum - Hopịia sp - Insecta sp
CÓNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬT 149

- Ipidae sp - Ixades sp - Lama sp

- Laspeyresia sp - Leithrus apterus - Melasoma tremnlae
- Melolontha sp * Motodonta anceps - Nyỵmia phaeorrhoeaa
- Opphonus sp - Otiorrhynchus sp - Phyllobius sp
- Phytlotreta sp - pyrausta nubilatis - Rhizotrogus sp
- Scoiytus scolytus - Staphulynys sp - Stauropus fogi
- Tachina sp - Tenthredinidae * Tetranychus urticeae - Zeuzera pyrina
Trên thực tế, từ lâu người ta đã biết khả năng tiêu diệt nhiều sâu bệnh
cúíì nấm bạch cương. Song do điểu kiện kỹ thuật và nhừng kiến thức trước
thê ký XX và những nấm đầu của thè ký XX, do hạn chế về kiến thức và
điều kiện kỹ thuật người ta chưa có khá năng tìm hiểu sâu hơn về bản chât
gây dộc của nấm bạch cương. Mãi đến năm 1969 R. L. Hamill và các cộng
tác vi ên mới k ế t t i n h được độc tô* của Iiấỉỉi b ạc h cương. Họ đ ặ t t ê a cho độc
tò này là Bỏverixin.
Sau đó, 1971, Y. A. Ovchinikov (íà tống hợp được độc tỏ' này và đến
Ìiav, người ta đà biết được rỏ về độc tố này.
• Công thức hóa học của độc tô' Bôverixin: Cir>Hr)7CK,N
• Tên danh pháp xiclo (N.mctyỉ L phcnilalanin-D-X hydroxyzovaicryh;t
• Là một đepxipeptit, vòng
• Đ i ế m sôi 93 - 9 4 ('C
Kỹ thuật sản xuât
Trong trường hợp chưa có giống nấm bạch cương, ta có thể phân lập
chúng từ nhừng con tàm bị bệnh bạch cương. Môi trường dùng dô phân Ịập
là một trong những loại môi trường sau:
Mỏi trường ĩ:
Pepton lOg Nước mắm 20 ml Nước máy 1000 ml
Môi trường 2:
Glucose (hay mantose) 40g Pepton lOg
Nước cất 1000ml pH 5,6
Mòi trường mạch nha:
Dùng nước mạch nha 10 ,8 °Brix
Môi trường 4 (môi trường Czapex- Dox):
Saccharose 30g NaNO.i 2g K2HPO 4 lg
MgSOì.TILO 0,5g KC1 0 ,5 g

FeSO, 0,01g Nưđc lOOOm!

150 CHƯƠNG 4

Để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, người ta cho thêm vào môi
trường NaCNS (0,24- 0,4 M/l), hồng bengal (70 mg/1), streptom icin (40 - 50
mg/1), tetrexiclin, oxitetraxiclin, clotetraciclin (2 - 5 mg/1), cloromixelin (5
mg/1 , neomixin, poliraixin, baxitraxin (50 mg/l)
Khi phát triển môi trường thạch sabouraund, chúng tạo sắc tố màu đỏ
sẫm, sợi nâm có màu lông tơ dày và phủ kín bề m ặt môi trường.
Ta có thể nuôi nấm bạch cương bằng phương pháp bề m ặt hoặc phương
pháp chìm. Trong cả hai phương pháp đều phải duy trì n h iệt độ nuôi cấy ở
28 - 32°c và thời gian nuôi cây thường dài hơn so với nuôi cây BT cần
khoảng thời gian nuôi là 16 - 24 giờ. Nấm bạch cương cần thời gian nuôi là
5 - 7 ngày thì bào tử mới tạo ra nhiều).
Sau khi thu nhận được sinh khối (thường qua lọc đôi với môi trường
lỏng, hoặc thu nhận toàn bộ sinh khôi nếu nuôi ở môi trường rắn), người ta
tiến hành sây khô ở nhiệt độ thấp < 40°c, cho đến khi độ ẩm ^ 10 %, thu
được bào tử sống.
Chế phẩm được đóng vào các bao bì và đem sử dụng.
3- Kỹ thuật sản xuất thuốc trừ sâu từ virut
Có rấ t nhiều loài virut khi ký sinh trong cơ thề sâu bệnh sẽ tiêu diệt
sâu bệnh theo cơ chế sinh sản và làm tan tế bào chủ. Virut có đặc điểm là
thường ký sinh trong những cơ th ể chủ đặc hiệu, có nghĩa là chứng chỉ có
thế phát triển trong một sô' vật chủ nhất định. Dựa vào đặc điếiĩi này, các
nhà khoa học mới tiến hành phân lập, nuôi cấy các loại virut để tạo ra
những loại thuốc trừ sâu từ virut.
Các loài virut sử dụng trong việc phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng
thuộc ba loại:
• Virut đa diện dạng nhân (nuclear polyhedrosis virus)
• Virut thể h ạ t (granulosis virus)
• Virut đa diện dạng tế bào chất (cytoplasmic poỉyhedrosis virus)
Virut đa diện dạng nhân và virut thể h ạt được xếp vào giống
Baculovirus. Đây là những virus chứa DNA. DNA loại này có phân tử lượng
8 0 X 1 0 6. T ỷ lệ g u a n i n + s y t o z i n v à o k h o ả n g 3 5 - 3 9 % .

Virut đa diện dạng tế bào chất là virut chứa RNA. Trọng lượng phân
tử 12,7 X 106.
Virut đa diện có khả năng giết các loài sâu sau:
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẬ T 151

Antheraea eucalypti Antheraea pernyi Barathra brassieae

Bombyx mori Choristoneura fumiferanp Coỉias eurytheme
Denrirolimus spectabilis Diprion hercyniae Galleria meỉonella
Heliothis ploxiphaga Hefiothis viresceus Hemerocampa leucostigma
Kotochalỉa funodi Laphygma fungiperda Malacasoma fragille
Neodiprion sertifer Neodiprion swainei Pecíinophora gossypiella
Phryganida California Plusía gamma Porthetria dispa
Prodenia eriơania Prodenia lỉtura Plusia gamma
Porthetria đispa Prodenia litưa Prodenia ornithogalli
Sanwa walkeri spodoptera exigua Thichoplusia
Virut thể hạt có thê tiêu diệt các loài sâu sau:
Agrgyrotaenia veíulinana • Carpocapsa pomonella • Eucosma griseana
Hyphantria cunea • Pieris brassìcae • pieris rapae • Spodoptera sp
Đề sản xuất virut người ta không thề nuôi chúng trong một loại môi
trường nhàn tạo nào vì virut chi có thể sinh sản và phát triển trong cơ thế
chủ. Do đó, muôn có virut đề trừ sâu bệnh với mật độ virut nhiều, ta chỉ có
cách là nhiềm virut vào một loại sâu bệnh nhờ đó mà chúng ký sinh, virut
sẽ phát triến trong cơ thế sâu nang mà ta irtong muôn, đê thu nhận sinh
khối virut, sau đó nhiễm virut này sang sâu bệnh có trên cây. Virut sè xâm
nhập vào sâu bệnh và bắt đầu p h á hủy cơ thể sâu bệnh, nhờ đó cày trồng
được bảo vệ khỏi sự phá hủ> cùa sâu bệnh. Biện pháp này tò ra rất hữu
hiệu khi ta thực hiện thuốc trừ sáu lừ virut với mật độ virut cao. Phương
pháp này đòi hòi kỹ thuật cao, nếu không, hiện tượng nhiềm sẽ khó tránh
khỏi.

4.16 SẢN XUẤT PHÂN SINH HỌC

4.16.1 C á c lo ạ i p h â n s in h h ọ c
Trước đây, người ta hiểu phùn sinh học (hay phân vi sinh) chỉ đơn
giản là những chế phẩm sinh khôi vi sTnh vật có khả năng chuyển hóa
một cơ chất nào đó; khi bón vào đất sê làm tăng khả năng chuyển hóa này,
trong thiên nhiên giúp cây trồng phát triển mạnh hơn.
Ngày nay phân sinh học được hiểu rộng hơn. Phân sinh học không
phải chỉ là chê phẩm từ một loài vi sinh vật mà còn là một hỗn hợp nhiều
loài vi sinh vật khác nhau. Các loài vi sinh vật này có khả nàng cộng sinh
trong đất và làm tăng nhanh các quá trình chuyển hóa trong đất, giúp cây
152 CHƯƠNG 4

trồng tăng nâng suất. Như vậy phàn sinh học bao gồm 3 loại:
a) Phàn sinh học đặc hiệu
Loại phân này chỉ là chế phẩm vi sinh vật được sán xuât từ 1 loài vi
sinh vật. Loài vi sinh vật này chỉ tham gia chuyên hóa một ioại cơ chât.
Loại phân này được dùng theo một giới hạn mục đích nhất định.
Ví dụ:
• Phân nitrazin bao gồm các vi sinh vật cồ định nitơ
• Phân photphobacterin bao gồm nhừng vi sinh vật chuyển hóa lán
• Phân cellosporin bao gồm nhừng vi sinh vật chuyên hóa cellulose
Loại phân này được nghiên cứu khá kv và dược sãn xuất, ứng dụng rât
rộng rãi ở nhiều nước trên th ế giới.
b) Phàn sinh học hỏn hợp
Phán sinh học hỗn hợp là loại phán được sàn xuất bao gồm nhiều loại
vi sinh vật có khá năng sông cộng sinh và tham gia chuvến hóa nhiều loại
cơ chãt khác nhau. Khi bón loại phân này xuông đất, tất cã các loai ví sinh
vật trong loại phân này đều có khá năng phát triển và deu chuyến hóa vạt
clìàt tạo ra nhiều chất dinh dưỡng có lợi cho cây trồng.
Vi dụ:
• Phân EM (chê phãin vi sinh vật hừu hiệu).Chỏ' phàm này chứa hàng
chục loài vi si nil vật khá (í lì hau.
• Phân Ferment magma cung chứa hàng chục loài vi sinh vật khác
nhau.
c) Phán hữu cơ vi sình: là loại phân, ngoài sinh khòi vi sinh vật sóng
(lược nuôi Cíìy t r o n g C<T c h á t , còn chứa k hỏ i lượng rất 1ỚI1 c h ấ t hưu cơ. Các vi
s i n h v ậ t p h á t t r i ể n t r o n g p h à n n à y là h ồ n h ợp nhi ồu loài vi s i n h vật có ích
khác nhau. Chất hữu cơ trong loni phân này vừa là chất niiing để vi sinh
vật bám vào đó, vừa là chất đinh dường cho cay trồng phát triến.
Cá ba loại phân sinh học trên đều giông nhau ở một diêm, đỏ là chúng
đều chứa sinh khối vi sinh vật sông. Các vi sinh vật sông này quyết định
chát iượng cùa phân. Do đó việc sản xuất phân sinh học phái được hiẽu nluí
là quá trình sản xuất sinh khối vi sinh vật.
1- Phăn sinh học đặc hiệu
I

Đây là loại phản được nghiên cứu rát kỷ và đà sán xuât hàng loạt dựa trẽn
những đặc tính riêng của từng loài vi sinh vật. Loại phán này bao gồm ba loại'
• Phân cô định đạm.
CÔNG NGHỆ SÀN XUẤT Vi SINH VÁT 153

• Phàn lãn sính học.

• Phàn phân giãi celỉuiose.
Phân c ố định đạm
ci) Vi sinh vật cỏ dinh ni tơ: Mõi vật chãt tổn tại trong điều kiện thiên
nhiên đều có một chu trinh chuyèn hóa. Nitơ cũng vậy, nó có chu trình
chuyến hóa nhờ hàng loạt các loài vi sinh vật khác nhau, Sự cố định ni tơ từ
khòng khí là một mắt xích trong quá trình chuyến hóa đó.
• Vùniị ttiảtì hoàn cùa ììitư: Nitơ chiêm khoáng 78,16^f (theo thê tích)
hoặc 75.5'r (theo trọng lưựug) không khí.
Như vậv, trong bầu không khí bao quanh trái đất chúng ta lượng ni tơ
chĩếiầì khoang 4x 101■’ tấn nitơ.
Loại nitơ nàv khỏng được thực vật, động vật và người đồnghóa trực
tiếp vì nìtơ ư tlạng tự do này được lièn kết hai nguyên tứ Iìitơ nhờ ba dây
nối rất bền vửng (N=N). Năng ìượug Clia ba nôi này vào khoàng 225 kcal/m.
Muốn phá vờ liên kết ba này bằng con đường hóa học người ta phái
thực hiện nhĩrnK phản ứng ơ nhiệt độ từ 1000 ' - 4000". Vi dụ:
CiiCI. + Na 10 — CaCNa + ò
hoãc N, + o , -iíiíiS- N ơ . HNO,
- - M.,()

H ình Ế .ỉl
154 CHƯƠNG 4

Phản ứng liên kết giữa N 2 và H 2 cùng đòi hỏi nhiệt độ 600°c ở áp suất
1000 atm với sự xúc tác của Os, Ru để cuối cùng tạo th àn h amoniac. Từ sự
phát hiện phản ứng này, loài người đã rất thành công trong sản xuất các
loại phân nitơ từ không khí. Lượng nitơ này đã phần nào bù đắp sự thiếu
hụt nitơ trong đất do cây trồng lấy đi hằng nấm.
Mặt khác, các nhà khoa học cũng tìm ra được một con đường khác
nhận nitơ từ không khí trong tự nhiên ở điều kiện ôn hòa. Con đường đó là
sự cố định đạm nitơ nhờ vi sinh vật. Trong thiên nhiên tồn tại rất nhiều
loài vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trìn h này. Một sô vi sinh khác
lại tham gia hàng loạt quá trình giải phóng nitơ khỏi các hợp chất hữu cơ.
Như vậy, chính vi sinh vật tạo ra vòng tuàn hoàn nitơ trong thiên nhiên.
Vòng tuần hoàn này tổn tại liên tục từ khi xuất hiện sự sống trên trái đât
cho đến nay. Toàn bộ chu trìn h chuyển hóa này bao gồm các quá trình:
- Quá trình cô' định nitơ
- Quá trình tống hợp chát hữu cơ chứa ni tơ
- Quá trình phân giải
- Quá trình amon hóa
- Quá trình nitrat hóa
- Quá trình phản n itrat hóa trả N-> cho không khí
Toàn bộ quá trình trên ta có thể xem H.4.11.
b)Các vi sink vật tham gia sự cô định đạm nitơ bao gồm:
• Vi khuẩn nôt sần cô định nitơ cộng sinh với cây họ đậu
Vi khuẩn cộng sinh với cây họ đậu có tên là Rhizobium (trước năm
1889 được gọi là Bacillus radicicola). Người ta đã phát hiện được 1200 loài
cây thuộc bộ đậu (trong số 11.000 cây họ đậu có m ặt trên trái đât) có vi
khuẩn cố định nitơ cộng sinh.
Vi khuẩn nốt sần có kích thước khoảng 0,5-0,9 X 1,2-3,0 |in\. Chúng rất
dễ bắt màu và có khả năng di động nhờ tiêm mao (có loài đơn mao, có loài
đa mao).
Khi già chúng không chuyển động, thuộc loại hiếu khí- N hiệt độ phát
triển tối ưu là 24 - 26°c. Khi xâm nhập vào bộ rề của cây họ đậu, vi khuẩn
nốt sần thường thông qua các lông hút. Nhiều khi chủng thông qua những
vêt thương của rễ họ đậu. Khi đó, rễ cây họ đậu thường tiết ra những chât
có khả năng kích thích sự phát triển của vi khuẩn. Sô" lượng vi khuẩn nôt
sân ở trong đất quyêt định khả năng xâm nhập của chúng vào rễ cây-
Lượng tế bào vi khuẩn nốt sần trong đất đạt được 104 tế bào/gam sẽ rất
CÔNG NGHỆ SẢN XUẨT VI SINH VẬT 155

thuận lợi cho quá trình xâm nhập.

Khi có m ặt vi khuẩn nốt sần, rễ thực vật họ đậu sẽ tiế t ra một loại
enzym poligalacturonase. Enzym này phân hủy thành lông hút, khi đó vi
khuẩn nốt sần sẽ xâm nhập vào rễ, khi vào được trong rề, chúng tạo ra dây
xâm nhập mà trong đó chứa rất nhiều tế bào vi khuẩn nốt sần ở trạn g thái
sinh sản và phát triển rấ t mạnh. Dây xâm nhập này cứ ăn sâu vào phía
trong tế bào, vi khuẩn sẽ thoát khỏi dây xâm nhập, đi vào trong các tế bào
chât của tê bào thực vật, những tê bào này phân cắt nhanh và tạo ra trạng
thái giả khuẩn. Các loại giả khuẩn không có khả năng phân chia nhưng lại
có khả năng tăng khôi lượng. Như vậy nốt sần được hình thành. Nốt sần
gồm ba phần:
Vỏ nốt sần: gồm những lớp tế bào không bị vi khuẩn xâm nhiễm.
Vùng phân cắt mạnh: phay cũng không bị vi khuẩn xâm nhiễm.
Vùng mô bị xâm nhiễm: các tế bào vi khuẩn xâm nhập vào các tế bào
nốt sần. Những tê bào có vi khuẩn nằm xen kẽ các tế bào không chứa vi
khuẩn nốt sần. Những tế bào chứa vi khuẩn thường có kích thước lớn hơn
rất nhiều các tế bào không chứa vi khuẩn.
Sự cố định nitơ phân tử được quyết định bởi sắc tô" leghemoglobin.
Chúng đóng vai trò xúc tác cho quá trình cỏ' định nitơ phân tử. Trong mỗi
một gam nốt sần của cây họ đậu chứa tới 1,09 - 3,25 mg leghemoglobin.
Leghemoglobin chỉ thấy có trong tế bào nốt sần chứ không thấy có trong tế
bào vi khuẩn, do đó có nhiều công trình cho thấy chính tế bào nốt sần có
khả năng cô' định nitơ chứ không phải tế bào vi khuẩn. Tế bào vi khuẩn chỉ
làm nhiệm vụ kích thích để tạo ra nốt sần. Vấn đề này cho đến nay vẫn
chưa được làm sáng tỏ.
c) Phân vi khuẩn nốt sần: Đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy,
ở những nơi trồng cây họ đậu, hàng năm, vi khuẩn nốt sần có th ể làm giảm
cho đất khoảng 50 - 600 kg/ha (trung bình 75 - 200 kg).
Nhiều nước trên th ế giới như Nga, Trung Quốc, Balan, Bungari,
Hungari, Rumani, Pháp, Mỹ, Bỉ... đă tiến hành sản xuất phân vi khuẩn nốt
sần với hy vọng khi bón loại phân này vào đất sẽ làm tăng khả năng tạo
nốt sần cho cây họ đậu, như vậy sẽ làm tăng lượng nitơ trong đất và nảng
suất cây trồng sẽ cao, giảm được chi phí bón phân hóa học cho đất.
Nhiều thí nghiệm ở nhiều nước khác nhau đều thu được kết quả rất
tốt: những vùng đất mới, khi trồng đậu có bón phân vi khuẩn nốt sần có
thể làm tăng nâng suất lên 50 - 100% (trung bình tăng 15 - 25%)
156 CHƯƠNG 4

Đề sán xuất được phân vi khuẩn nốt sần, người ta nuôi chúng trong
dung dịch mỏi trường thích hợp (môì trường bao gồm dịch nước chìêt đậu
hay nước chiết cám, hoặc nước chiết ngô có cho thêm một số muối khoáng)
có pH = 6,5 - 7,5, ở nhiệt độ 24 - 26uc , trong thời gian từ 24 - 36 giờ. Kết
thúc quá trình nuôi này, người ta thường chuyển chúng sang than bùn dã
được xử lý kỹ và bón vào đất trồng. Phương pháp này thường gặp khó khăn
là sỏ lượng vi khuẩn nốt sần chết rấ t nhiều vì vi khuân nốt sần không tạo
bào tử, do đó việc bảo quản trở nên rấ t khó khăn.
d) Vi khuẩn hiểu khí sống tự do cố định ni tơ: Vi khuân hiếu khí sông
tự do bao gồm Azotobacter và Beiferincka, trong đó vi khuẩn Azotobacter
được quan tâm nhiều hơn cá.
Vi khuẩn Azotobacter là vi khuẩn hình cầu hoặc hình que, có kích
thước ‘2 ,0-7,Ox 1,0-2,5 |ain, chúng có nhiều tiêm Iiiao bao ounnh tp hào Khi
già chúng không có khả năng di động và kích thước tè bào nhô lại,
Azotobacter thuộc loài hiếu khí, tuy nhiẻu, trong điều kiệu thiếu khỏng khí
chúng vần có khá năng phát triến. Nhiều nghiên cứu cho thấy sò lưựng
Azotobacter thường có mặt ỡ vùng rề cây nhiều hơn ỡ vừng khác. Khi sống
trong đất, chúng có khá nãug hâ'p thụ nitơ không khí (đất xôp chứ không
phái ciất ngậm nhiều Iiước) và như vậy. chúng làm giàu nitơ cho đất. Có
nhiều nghiên cứu cho tháy khi Azotobacter dồng hóa 1 ganì vật chất sinh
năng lượng đồng thời chúng cũng có khá năng hấp thụ 10 - 15 ing nitơ
phán tử. Ngoài ra, Azotobacter còn có khả năng kích thích cây trồng nhờ
chúng tổng hợp ra tiamin. axit nicotinic, axit pantotenic. piridoxin và
biotin. Người ta sản xuất phân Azotobacter bằng phương pháp nuôi chìm
trong dung dịch bao gom nưức chiết đậu, hoặc nưđc chiết cám có cho thêm
v/c đường và một sỏ muối vi lượng, ở nhiệt độ 28 - 30"C. pH thích hợp nhất
cho chúng phát triển là 7,2 - 8.2. Thời gian nuôi từ 18 - 36 giờ. Kết thúc
quá trình nuôi, người ta hâp thu chúng vào than bùn và bón cho cây trồng.
Tác dựng của phán Azotobacter thường chậm và nãng suất cây trồng tăng
khoảng 10 r/f chứ không th ật sự cao lắm.
Các nghiên cứu hiện nay t.ập trung vào giả th iết cơ chế cò' định nitơ
phán tử của vi khuẩn. Hiện nay người ta đá hoàn toàn có khả năng thực
hiện những thí nghiệm để làm sáng tỏ những bí ẩn xảy ra trong tê bàơ,
trong đó, 11hừng thí nghiệm thu dịch trong tế bào vi khuẩn cố định đạm và
tìm kiếm các enzym tham gia việc cố đinh nitơ phân tử. Các nhà khoa học
cũng đà tìm ra râ t nhiều enzym thuộc nhóm Nitrogenase. Năng lượng cung
cấp cho quá trình này là ATP và chỉ được Azotobacter sử dụng. Đối với
CÒNG NGHỆ SẢN XUẤT VỊ SINH VẬT 157

Clostridium năng iượng cung cấp cho quá trình cô định nitơ lại là nxit
piruvic.
Hiện có hai giả thuyêt về vân dề cô định nitơ. Hai giá thuyết này (lựa
trên cơ sở của hai hướng chuyển hóa hoàn toàn khác nhau, đó là:
• Con đường khử
• Con đường oxy hóa.
Ta có thề tóm tắt hai sự chuyến hóa này như sau:
2H

H N -N H -•--------- - --------------- N =N -------------------------------------- ►N 20

h 2n - n h 2 2 N H 2OH ^ -------------------------------
r
(H N ơ 2 )?
h 2o

— 2H 4H

2NH3^
con đúóng khử con duòng oxy hóa

Con đường khử do X-N. Vinogratxki đưa ra năm 1894. Giá thuyẻt này
đà được nhiều thực nghiệm chứng minh là đúng. Các tác giá đều thông
nhất con đường khử phái đi qua những bước cơ bản sau:
N- N

ị
HN = NH íơiimit)

ị
H?N - N H 2(đ ỉd ra z m )

ị
HN3

Tham gia vào các quá trình trên là những enzym nitrogenase. Ngày
nay, người ta đã tách được enzym nitrogenase và nghiên cứu khá kỷ ioại
enzym này. Enzym này có hai khả năng xúc tác:
- Tham gia khử N 2 ---- ► NH ;1
- Tham gia khử hàng loạt chất khác như:
N20 ---- ►Na ---- ► H.O
n 3 — - nh2 + n 2
c 2h* — - c 2h 4
H C N ---- - CH 4 + NH 3 + (CH3 , NH2)
Ở đây cùng phái hiếu rõ rằng: vi khuẩn Azotobacter là ioài hiếu khí,
158 CHƯƠNG 4

quá trìn h khử lại xảy ra trong tế bào. Đây là hai quá trìn h đối lập. Các nhà
khoa học phải trả lời cho được tại sao lại xảy ra như vậy? Cuối cùng thì các
nhà khoa học cùng tìm ra được câu trả lời: trong tế bào Azotobacter có rất
nhiều lipo- protein, phía ngoài màng này chứa nhiều enzym hô hâ'p, những
enzym này tham gia tổng hợp ATP và tiêu thụ rấ t nhiều oxy, làm oxy
không chui vào phía trong. Như vậy, phía trong màng không có oxy, ở phía
trong tế bào các enzym nitrogenase sẽ tham gia quá trìn h khử N2.
Đặc điểm quan trọng của Azotobacter là khi trong môi trường có muôi
amon thì quá trình cô' định nitơ sẽ bị ngưng lại. Các enzym nitrogenase sẽ
bị ngưng lại dưới tác động của NH 3.
Quá trình cô" định nitơ của vi khuẩn nốt sần hoàn toàn khác với cơ chế
cố định nitơ của các vi khuẩn cố định ni tơ sống tự do (F.V. Turtchin, 1959).
Theo ông quá trình cô' định nitơ của vi khuẩn nốt sần theo H.4.12.

Khi vi khuẩn Rhizobium xâm nhập vào rễ cây sẽ tiế t ra nhân tô" B
(hiện chưa biết rõ bản chất cụ thể). Nhân tố B sẽ kích thích thưc yật tạo
thành mô chứa vi sinh vật. Sự cố định nitơ chỉ xảy ra trong thực vật hình
th àn h nhân tố A (hiện nay cũng chưa biết rõ bản chất của nhân tố A). Sản
phẩm đầu tiên của quá trìn h cô' định nàỳ là NH 3; NH 3 sẽ nhanh chóng kết
hợp với ketoaxit để tạo ra asparagin. Từ đó sẽ tạo ra protein của vi khuẩn
và của cây.
p. Bergersen (1966) lại đưa ra một giả thuyết cho rằng có thể quá
trìn h cố định nitơ xảy ra ở giả khuẩn thể (bacteroides). Khi đó cây chỉ cung
cấp dinh dưỡng cacbon và cung cấp năng lượng. Tác giả này cho biết trong
giả khuẩn th ể có đến 40% axit oxibutyric. Ổng giả thuyết rằng chính axit
này được dùng làm nguồn hydro trong các phản ứng khử N 2 th àn h NH 3 nhờ
nitrogenase. Tác giả này cũng cho thấy nitrogen iấy từ giả khuẩn thể và
lấy từ tế bào vi khuẩn giống nhau ở chỗ cả hai đều có khả năng khử N2
thành NH 3 và khả năng khử acetylen thành etylen.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẨT VI SINH VẬT 159

P h â n lâ n v i sin h
Lân là một trong ba thành phần dinh dường quan trọng của cây trồng.
Trong đất tồn tại hai dạng lân:
a) Lân vô cơ: thường ở dạng khoáng như apatit, photphoric, photphat
sắt, photphat nhôm. Các dạng lân vô cơ trên khó tan, cây trồng chỉ có khả
năng hấp thụ dạng lân hòa tan. Nếu pH thích hợp, lân khó tan sẽ chuyển
thành lân dễ tan nhờ hoạt động sống của vi sinh vật.
Năm 1900, J. Stoklasa đã dùng đất nông nghiệp đã tiệt trùng và trộn
với apatit. Sau đó ông cấy vi khuẩn Bacillus megatherium, Bacillus
mycoides, Bacillus bytyricus vào hỗn hợp đất và apatit, bón vào lúa yến
mạch. Ông nhận thấy năng suất của lúa tăng lên.
Sau đó nhiều nghiên cứu cho thấy rất nhiều loài vi sinh vật như
Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn n itrat hóa, nấm, xạ khuẩn, cùng có khả
năng phân giải Ca3(P 0 4)2 và bột apatit. Nhiều tác giả cũng cho thấy quá
trình lên men lactic, lên men butylic, lên men axit acetic cũng có khả năng
phân giải Ca 3(P 0 4)2* Trong sô" các loại nấm có nấm Aspergillus niger là có
khả năng phân giải lân mạnh nhâ't.
Cơ chế phân giải lân có liên quan rấ t nhiều đến sự tạo axit của các vi
sinh vật trong quá trình lên men, trong đó axit cacbonic đóng vai trò quan
trọng. Chính axit này (H 2CO3) làm Ca3(P 0 4)2 bị phân giải. Quá trìn h phân
giải diễn ra theo phương trình sau:
Ca3(P 0 4)2 + 4 H 2CO3 + H 20 = Ca(H 2P 0 4)2.H20 + Ca(HC0 3)2
Quá trình tan của lân không tan xảy ra khi có m ặt của các loại axit
khác như sau:
Ca3(P04)2 + 4HNO3 = Ca(H 2P 0 4)2 + 2Ca(N0 3)2
Ca3(P 0 4)2 + 2H 2S 0 4 = Ca(H 2P 0 4)2 + 2CaS0 4
b) Lân hữu cơ: thường nằm trong các hợp chất hữu cơ có trong xác
động vật và thực vật mà không có khả năng hấp thụ loại phân hữu cơ. Cây
trồng chỉ có th ể hấp thu lân vô cơ ở dạng hòa tan. Do đó, vi sinh vật trong
đất đóng vai trò rấ t quan trọng trong quá trình chuyển hóa này.
Năm 1911, J. Stoklase đã làm thí nghiệm như sau: Ông dùng axit
nucleic làm nguồn photpho và nitơ duy n h ất trong nuôi cấy Bacillus
mycoides, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris. Kết quả thí nghiệm cho thây
trọng lượng lân được phân giải là 23,3%; 15,5% và 18%. Khi cho thêm vào
môi trường muôi (NH4)2S04, sự phân giải lân sẽ tăng tương ứng là 51,2%.
37,8%; 42%. Sau đó là một loạt những nghiên cứu của Menkina (1952) trên
160 CHƯƠNG 4

vi khuẩn Bacillus megatherium var photphaticum, Sevratia carroliera. Quá

trìn h chuyến hóa lân hửu cơ có thể tóm tắt theo phương trình sau:
• N ucleoproteit ----- ► Nuciein ----- ► axit n u c le ic ----- ► N u cle o tid ------►H3PO4

« Lơxitin -------► g ly xe ro p h o tp h at — ► H3PO4

Tham gia phân giải lân hừu cơ bao gồm những vi sinh vật sau:
- Bacillus mycoides
- Bacillus megatherium var photphaticum
- Bacillus cereus
- Bacillus asterosporus
- Pseudomonas
Nhiều nước trên thê giới đang sản xuất loại phân lân vi sinh có tên
photphobacterin. Người ta nuôi các vi sinh vật có khẩ năng chuyển hóa lán
trên môi trường xốp (đối với Aspergillus niger) hoặc trong môi trường lỏng
(đối với các loại vi khuân), sau đó đưa chúng vào nhừng vật liệu giá thế như
than bùn, cám và trộn vào phân hữu cơ hoặc bón trực tiếp cho cáy trồng.
Biện pháp này đã làm tảng năng suất cây trồng rấ t rỏ.
Phân vi sinh phân giải cellu lose
Chất h»~íu cơ là thành phần rấ t quan trọng trong quá trìn h hình thành
và làm thay đổi độ phì của đất. Trong điều kiện tự nhiên chỉ có vi sinh vật
tham gia chính vào các quá trình làm thay đổi các chất hữu cơ. Sự chuyền
hóa các chất hữu cơ trong đất chủ yếu đi theo hai hướng:
- Vô cơ hóa các chất hữu cơ.
• Mùn hóa vật chất hữu cơ.
Thực vật hoàn toàn không thế hấp thu trực tiếp các chất hữu cơ, các
chất hữu cơ phải được chuyển hóa thành các chất vô cơ hòa tan, khi đó thực
vật mới có khả năng hấp thụ. Một phần khác của các chất hữu cơ sẽ được
chuyển hóa thành chất mùn.
Các chất hữu cơ thường không hòa tan trong nưđc (chát hữu cơ từ xác
động, thực vật và vi sinh vật), trong đó, xác thực vật thường chiếm số lượng
nhiều n h ất trong các chất hữu cơ từ nguồn sinh vật tạo ra. Trong xác thực
vật, hàm lượng lignocellulose và pectinocellulose chiếm đến hơn 50% tổng
sô' sinh khối thực vật.
Cellulose bị phân giải thành các thành phần cổ phân tử lượng nhỏ
hơn. C h ính nhữ ng th à n h p h ần nhỏ n ày k ết hợp với n hữ n g th à n h phần
khác có trong đ at tạo ra mùn. C h ất mừn đ iển h ìn h của đ ất seen o zem có
th àn h phần như sau:
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VI SINH VẶT 161

Hydratcacbon tan trong nước và pectin: 2,3%

Hemicellulose: 3,0% Cellulose: 0,4% Lignin: ‘4,2%
Axit humic: 29,6% Axit fulvic: 22,0% Humin: 36,5%
Các chất mùn có trong đất chiếm khoảng 0,5 - 9%, tùy theo loại đất.
Các chất mùn thường chứa nhiều nitơ. Cứ 1 ha đâ't dạng trung bình có
30.300 tấn mùn, chứa khoảng 1,5 - 15 tấn nitơ. Khi mùn được tạo thành, vi
sinh vật lại tiếp tục tham gia phân hủy mùn bằng quá trình amon hóa, sự
chuyển hóa này giúp đất tích lũy NH3. Sự tạo thành NHa trong đất xảy ra
rấ t chậm chạp và điều này rấ t có lợi cho cây trồng vì quá trình này là một
quá trình nhả từ từ NH 3 cho cây trồng theo phương trình sau:
• Chất mùn + Ơ2 ----- ►C 0 2 + H20 + NH 3
Dựa trên cơ sở khoa học này, nhiều công ty công nghệ sinh học trên
th ế giới tiến hành sản xuất phân vi sinh phân giải cellulose, trong đó người
ta chú ý nhiều đến sự phân giải của xạ khuẩn Actinomyces và nấm sợi
Tricoderma, Aspergillus. Các loài nấm sợi và xạ khuẩn được nuôi trong
những môi trường tương ứng để thu nhận sinh khối. Sinh khôi này được
trộn với than bùn và đưa vào đất trồng. Trong đất, các vi sinh vật này sẽ
tham gia chuyển hóa các hợp chất lignocellulose, pectinocellưlose và cùng
các vi sinh vật khác tạo thành mùn trong đất. Sau đó, các vi sinh vật khác
sẽ tiếp tục phân giải mùn trong các quá trình vô cơ hóa tạo ra NH 3 và các
hợp chất vô cơ tail khác, giúp cây trồng phát triển. Việc sử dụng xạ khuẩn
và nấm Trichoderma trong sản xuất phân vi sinh phân giải cellulose còn
tận dụng khả năng tạo kháng sinh và chất diệt côn trùng (mycotoxin) của
hai loài này trong việc phòng chống sâu bệnh. Do đó, sinh khối nấm
Trichoderma, Asperillus và xạ khuấn Actinomyces được sử dụng nhiều
trong sản xuất phân vi sinh phân giải cellulose. Phân vi sinh này có hiệu
quả khi bón cùng các loại phân chuồng hoặc phân rác sinh hoạt.
Trước đây người ta thường sản xuất phân vi sinh phân giải cellulose từ
vi khuẩn. Sau này, người ta thấy loại phân này kém hiệu quả hơn loại vi
sinh từ sinh khối nấm và xạ khuẩn.
4.16.2 Phân vi sinh hỗn hợp
Việc sử dụng phân vi sinh đặc hiệu chỉ có hiệu quả đối với phân cố
định nitơ và nhất là loại vi sinh cố định nitơ cộng sinh với cây họ đậu, còn
các loại khác, nếu biết phối trộn sẽ có hiệu quả hơn rấ t nhiều. Thực tế,
trong thiên nhiên, không thể có một loài vi sinh vật này có khả năng
chuyển hóa tấ t cả vật chất. Hoặc cũng không thể có một loài vi sinh vật
khác có khả năne chuyển hóa toàn bộ một loại vật chất. Người ta đã nrrhĩ
162 CHƯƠNG 4

đến cách làm sao đó phối hợp tính ưu việt c ủ a loài vi sinh vật này với tính
ưu việt của những loài vi sinh vật khác, từ đó tạo ra một hỗn hợp phân vừa
có khả năng phân giải vật chất vừa có khả năng tổng hợp chất kích thích
sinh trưởng, chống sâu bệnh và khả năng tạo th àn h mùn. Loại vi sinh hỗn
hợp này được sản xuâ't và phổ biến nhiều trong những năm 1990 trở lại
đây. Ví dụ, phân bón vi sinh hiệu Ferm ent magma của Mỹ, phân bón EM
của N hật, Cellosporin của Nga.
4 .1 6 .3 P h â n h ữ u c ơ v i s i n h
Phân bón hữu cơ vi sinh gồm hai thành phần chính: phần hữu cơ và
sinh khôi vi sinh vật, Khác với hai loại phân vi sinh trên, phân hữu cơ vi
sinh người ta vừa chú trọng đến chất lượng phần hữu cơ vừa chủ trọng
phần sinh khôi vi sinh, trong khi đối với hai loại phân trìn h bày ở trên
người ta chỉ chú trọng đến lượng sinh khôi vi sinh có trong phân (tổng số
vi sinh vật hữu hiệu có trong 1 gam hay trong 1 ml phân).
Để sản xuất dạng phân này, người ta quan tâm nhiều đến chất hữu cơ
nguyên liệu. Việc xử lý chất hừu cơ được thực hiện nhanh hơn nếu đưa vào
đó những chủng vi sinh vật thuần khiết có khả năng phân hủy chúng,
Ví dụ: trong khôi châ't hữu cơ này chứa nhiều lignocellulose hay
pectinocellulose, người ta sẽ cho vào đó những chủng vi sinh vật có khả
năng phân giải cellulose. Những chủng vi sinh vật này, sau khi phân giải
(phân giải một phần chứ không thể phân giải hoàn toàn), sẽ tăng sinh khôi
và tồn tại trong khôi hữu cơ này. Khi ta bón phân hữu cơ này vào đất
trồng, các vi sinh vật này tiếp tục phân hủy chất hữu cơ trong đất, kết quả
là đất sè tốt hơn cho cây trồng.
Như vậy, việc sản xuất phân hữu cơ vi sinh ở đây có hai quá trình lợi
dụng hoạt động sống của vi sinh vật:
- Quá trình chuyền hóa vật chất trong phân nhờ những vi sinh vật đặc
hiệu ta đưa vào.
- Quá trinh chuyến hóa vật chat trong đất khi ta bón loại phân này (có
chứa sinh khối vi sinh vật đặc hiệu trong phân).
Hiện nay, ở Việt Nam và các nước trên th ế giới đã sản xuất hàng triệu
tấn phân mỗi năm theo dạng này.
Thực chất của quá trình sản xuất phân bón dạng này là sản xuất sinh
khối vi sinh vật trên một loại môi trường hữu cơ (phân gia súc, các phê
phẩm nông nghiệp, công nghiệp hay rác sinh hoạt). Công nghệ sản xuất
rấ t đơn giản và không cần kỳ thuật phức tạp (không cần quá trìn h vô trùng
tuyệt đối như các loại phân đá trình bày).
 Chương

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT

KHÁNG SINH

5.1 CÁC CHẤT KHÁNG SINH

Chất kháng sinh (antibiotic) là những chất do sinh vật tạo ra và có

khả năng tiêu diệt các vi sinh vật khác với liều lượng đú nhỏ.
Như vậy, châ't hóa học nào đó được gọi là chất kháng sinh phải đảm
bảo hai yêu cầu cơ bản:
a) Phải được sinh vật tạo ra.
b) Với liều lượng nhỏ, có khả năng tiêu diệt sinh vật khác.
Trong thực tế có nhiều chất được sinh vật tạo ra, nhưng muôn tiêu diệt
vi sinh vật phải cần số lượng rất lớn.
Ví dụ 1: Cồn (C2H 5OH) được nâm men Saccharomyces cerevisiae tạo
ra, nhưng muôn tiêu diệt được sinh vật khác cần phải có số lượng rấ t lớn.
Chính vì th ế cồn không được ghép vào nhóm các chất kháng sinh.
Ví dụ 2: Những chất như asen, chì, thủy ngân đều có khả năng tiêu
diệt vi sinh vật ở nồng độ rất thấp, nhưng chúng lại không phải là những
sản phẩm do vi sinh vật tạo ra. Do đó, chúng hoàn toàn không phải là chất
kháng sinh.
Một vấn đề thứ hai cũng phải hiểu rõ là độc tố khác với kháng sinh ở
chồ nào? Về m ặt nào đó kháng sinh và độc tố giống nhau ở chỗ: có một số
độc tố là chất hữu cơ, kháng sinh là chất hừu cơ, nhưng rấ t nhiều độc tô" là
châ't vô cơ . Điểm khác nhau rấ t lớn giữa độc tô' và chất kháng sinh đó là
tírih gây độc đặc hiệu. Do sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường,
trải qua nhiều cọ xát với điều kiện môi trường nên sinh vật muốn tồn tại
được phải tiến hành các quá trình cạnh tranh. Đấu tranh sinh tồn là bản
chất của sự sông. Trong quá trình đấu tranh sinh tồn này, sinh vật nào
cùng có vủ khí riêng cho mình. Riêng vi sinh vặt tồn tại khả năng thích
nghi mạnh, khả nàng sinh sản và phát triển mạnh, khả năng tạo độc tó và
kháng sinh. Độc tô thường hoạt động riêng, hay nói cách khác là không có
164 CHƯƠNG 5

tín h đặc hiệu, còn kháng sinh là chất được sinh vật tạo ra, có tính đặc hiệu
rấ t cao. Kháng sinh được tạo ra đế chông lại một sinh vật nhất định nào
đó, do đó sự tạo thành chất kháng sinh trong cơ thể mang tính chất loài.
Kháng sinh do vi sinh vật tạo ra đế chống lại vi sinh vật khác.
H iện nay người ta tìm được rấ t nhiều loại kháng sinh khác nhau,
nhưng chĩ có 1 % trong sô" đó có giá trị thực tiễn trong y học và được sản
xuất theo qui mô công nghiệp. Hiện nay người ta đã biết đến hơn 8000
kháng sinh các loại và hàng năm có vài trăm chất kháng sinh mới được
tìm ra. Các loại kháng sinh này chủ yếu được tổng hợp từ:
• Streptomyces
• Penicillium
• Bacillus.
Các loại kháng sinh đã được sản xuất ở qui mô công nghiệp được trình
bày như bảng 5.1.
Bảng 5.1: Một sô chất kháng sinh được sản xuất theo quỉ mô công nghiệp
STT Chất kháng sinh Vi sinh vật

1 Baxitracine Bacillus licheniformis

2 Cephalosporin Cephalosporium sp.

3 Cloramphenicọt Hóa tdng hợp

4 Ciclohecimit Streptomyces griseus

5 Ciclocerin s . orchidaceus
6 Eritromicine s . erythreus
7 Grizeofulvin Penicillium griseofulvin

8 Canamicine s. kanamyceticus
9 Lincomicine s. lincolnensis
10 Neomicine S. fradiae
11 Nỉstatin ^S. noursei
12 Penicilin Penỉcilliunn chrysogesrum

13 Polimicine Bacillucpolymyxa
14 Streptomỉcine s. grỉseus
15 Tetracycline s. rimosus

Vi khuẩn gram (+) dễ mẫn cảm vđi kháng sinh hơn vi khuẩn gram (-).
Một chât kháng sinh nào đó tác dụng với vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT KHẢNG SINH 165

gram (-) gọi là kháng sinh có phổ rộng. Những kháng sinh này được sử
dụng nhiều trong y học.

5.2. VÀI DÒNG LỊCH s ử

Người đầu tiên tìm ra kháng sinh là A. Fleming. Năm 1928, khi
nghiên cứu các vi sinh vật gây bệnh, ông tình cờ phát hiện ra vi sinh vật
gây bệnh bị tiêu diệt bỏi một loại nấm sợi có màu xanh xám; ông trích ly
dịch này nhỏ lên những khuẩn lạc của vi sinh vật gây bệnh. Kết quả là vi
sinh vật đó bị chết.

Alexander Fleming và đĩa Petri chứa Penicillium notatum

do ông tìm ra năm 1928
Nấm tạo được chất tiêu diệt vi sinh vật đó là nấm Penicillium. Chất do
nâ'm tiết ra có khả năng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh gọi là Penicillium.
Một năm sau khi ông công bô' kết quả nghiên này thì nhiều người lại không
quan tâm.
Đến năm 1938, Howard Florey, Ernst Chain và Norman Heatley mới
đưa Penicillium vào sản xuất thử, và nẩm 1940, Dorothy Hodgkin đã xác
định được cấu trúc phân tử của Penicillium.
Năm 1941, Penicillium được sản xuất theo qui mô công nghiệp tạị Mỹ.
Năm 1942, Mary Hunt tìm ra được chựng Penicillium chrysogenum có
khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao gấp hai lần giống Penicillium
notatum tìm ra trước đó.
Năm 1959, các nhà khoa học Anh và Mỹ đã tách được vòng Penicilin,
mở đầu cho hàng loạt các loại kháng sinh tổng hợp.
166 CHƯƠNG 5

Từ năm 1946 - 1950, người ta phát hiện ra hàng loạt chất kháng sinh
và vào năm 1950, hàng loạt các nhà máy sản xuất kháng sinh ra đời, chủ
yếu là kháng sinh Penicilin.

Một phân xưởng lên men trong giai đoạn đầu của công nghiệp
sản xuất Penicillin
Thời gian đầu, các sản phẩm được sản xuất ớ dạng thô (thường là
những dịch ỉoãng sau khi tách sinh khôi bàng phương pháp lọc). Sau áày
phương pháp thu nhận và tinh chê được cải tiến dần và người ta thu nhận
được các loại có chất lượng cao hơn.

Thiet bị len men được Ịjệ ịỊịống làm lạnh cho phân xưởng ỉên
sử dụng nam 1945 men lớn ỏ nhà máy Cherokee, Danville, PA
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤĩ KHÁNG SINH 167

ở Việt Nam, người đầu tiên sản xuất kháng sinh ià GS. BS. Đặng Văn
Ngữ, trong điều kiện kháng chiến chôiig Pháp gian khổ tại Việt Bắc, GS đă
sản xuất thành công Penicilin phục vụ kịp thời cho điều trị thương bệnh
binh.
Lúc đầu, các thiết bị lên men còn rấ t dơn giản. Sau Iiăm 1950, nhờ cải
tiến thiết kế và chế tạo các thiết bị lên men nên đã làm thay đổi hẳn
phương pháp lên men. Trong những năm đầu sản xuất kháng sinh, người ta
chủ yếu lên men theo phương pháp bề mặt, ^au dó người ta thay bằng
phương pháp lên men chìm.
Cho đến nay công nghệ sản xuất kháng sinh đã hoàn toàn được hiện
đại hóa từ khâu chuẩn bị môi trường đến khâu cuối cùng và vô bao bì.
So với các dạng lên men khác thì lên men kháng sinh mới được xây
dựng và được sản xuất theo qui mô công nghiệp. Tuy nhiên, người ta cũng
đánh giá rằng công nghệ sản xuất kháng sinh cùng với công nghệ sản xuất
axit amin từ vi sinh vật là hai loại công nghệ có sự phát triển nhanh n h ất
và hoàn thiện nhất.
Do điều kiện chiến tranh và do điều kiện kinh tế, Việt Nam vẫn chưa
có một nhà máy sản xuất kháng sinh. Các loại kháng sinh sử dụng cho
người và gia súc hiện nay hoàn toàn phụ thuộc vào nước ngoài. Hy vọng
trong tương lai Việt Nam sẽ xây dựng được nhà máy sản xuất kháng sinh
hiện đại trên cơ sở những thành tựu khoa học trên th ế giới về lĩnh vực này.

5.3 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILIN

5.3.1 K háng sin h P e n ic ilin

Hiện nay có nhiều loại Penicilin. Một trong những loại kháng sinh
được sử dụng nhiều trong y học và được sản xuất nhiều là Benzylpenicilin
(hay còn gọi là kháng sinh Penicilin G).
Kháng sinh Penicilin có công thức câu tạo như sau:

< f_ 3 -C H 2- C O - N H - C H_- CH
/ § x C(CH3)2

CO— N ---- COOH

Trong công thức này, ta thấy Penicilin G được câu tạo bởi hai thành
phần chính là vòng P-lactanithiazolidine kết hợp với phenyl acetate.
Kháng sinh Penicilin có cấu trúc không gian như sau:
168 CHƯƠNG 5

Hình 5.1: Cấu trúc không gian của Penicilỉn

Penicilin có bán trên thị trường hiện nay bao gồm các loại:
• Penicỉlin có nguồn gốc tự nhiên (do nấm sợi tạo ra):

Q > - c h 2- c o - Penlcilin G

h 3c - c h = c h - c h 2 - c h - c o - Penicilin F

c h 3 - ( c h 2 )4 - c o - Penicilin - dihidro F

CH 3 -(C H 2 )6 -C O - Penicilin K

HO - Q - c h 2- c o - Penicilin X
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT KHÁNG SINH 169

Penicilin tổng hợp:

O ^ C H 2 -COOH axit phenylaxetic

Q - o - CH2 - COOH axit phenoxiaxeỉic

CH3-C H = C H -S -C H -C O O H axit alyl mecapto axetic

Penicilin bán tổng hợp:

O ~ 0 -C H -C 0 - propiciline

c h 2- c h 2

____/ 0 - c h 3

meticiline
Q - c° -
0 -C H 3

o II
Nv. X CO~
c r 'C H 2-

O -C H -C Q ampỉciline

NH.

CH - CO — cacbeciline

COOH
Penicilin G chỉ có khả năng chống vi khuẩn gram (+); chúng không
chông lại được vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và các chủng thuộc
Pseudomonas.
5.3.2 C ônế nghệ sản xuất
Hiện nay người ta sản xuất Penicilin theo hai phương pháp:
- Phương pháp lên men bề mặt.
- Phương pháp lên men chìm.
1- Phương ph áp lên men bề mặt
Trong những năm 30 đến những năm 50 của th ế kỷ XX, phương pháp
nuôi cây bề m ặt được áp dụng rộng rãi để sản xuất kháng sinh từ nấm
Penicillium chrysogenum... Công nghệ sản xuất penicilin bằng phương pháp
bề m ặt đươc sản xuất theo sơ đồ 5.1.
170 CHƯƠNG 5

Nguyên liệu Giống Penicitium

chrysogenum

Nhân giống
Chuẩn bị môi trường
nhân giống
ị
_ ^ L ê n men
Chuẩn bị môi trường
lẽn men
- J và"tinh chế
Tách

I
Sản phẩm penicilin

Sơ đồ 5.1ỉ Công nghệ sản xĩiất penicilin bàng phương pháp bề mặt
a) Giống Penicillium chrysogenum: là nấm sợi bào tử hở. Khi mới phát
triển trong môi trường đặc, chúng tạo ra hai dạng khuẩn ty: khuẩn ty khí
sinh và khuẩn ty dinh dưỡng màu trắng. Sau khi nuôi cấy một ngày, khuẩn
ty bắt đầu chuyển sang màu xanh xám và đính bào tử bắt đầu xuất hiện.
Thời gian này xuất hiện một ít bào tử trần từ tiền bào tử nằm trong các
đính bào tử. Các bào tử lần lượt được tạo thành theo thời gian nuôi cấy và
cưôi cùng từ màu thì màu của nấm penicillium sẫm hơn.
.B áo tử

Hình 5.2ĩ Nấm sợi Peniciỉỉium chrysogenum

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT KHÁNG SINH 171

Nâm Penicilliỉim thuộc họ hiêu khí bắt buộc, do đó trong quá trình
nuỏi cảy phải cung cap không khí liên tục. Người ta thường bảo quàn giông
ở dạng bào tử. Phương pháp bảo quàn thường sử dụng nhiều nhâ't là phương
pháp cấy truyền định kỳ trẽn thạch hàng tháng kết hợp với bảo quản lạnh.
Tuy nhiên phương pháp bảo quản bằng hạt ngũ cốc, bảo quản theo phương
pháp đông khỏ cũng được sử dụng tại nhiều cơ sở sản xuất.
b) Nguyên liệu sứ dụng trong sản xuất peniciỉin theo phương pháp bẻ .
mặt: Cám và hạt ngũ côc các loại thường được sử dụng như nguyên liệu
chính trong sản xuất peuicỉỉin bằng phương pháp bề mặt.
Nguyên liệu được bổ sung nước sao cho độ ẩm khôi nguyên liệu đạt 55 -
60% w. Sau khi làm ẩm xong, nguyèu iiệu được hấp thanh trùng ơ 121°c
(0,5 at) trong 30 - 45 phút. Ngay sau khi kết thúc thanh trùng, người ta tái
chúng ra nhừng khay hình chừ nhật có kích thước dài 1 - 1,2 m, rộng 0,6 -
0,8 m, cao 5 - 6 cm. Lớp môi trường cho vào đấy dày 2 - 3 cm đê đảm bảo
độ thoáng khí toàn bộ cả m ặt trên và mặt dưới của môi trường, ơ một sỏ cơ
sở sứ dụng nguyên liệu là các hạt ngủ cốc, ngưM ta cho lớp môi trường dày
hơn (khoảng 3 - 4 cm). Sớ dĩ có sự khác biệt này là do các hạt ngú côc
thường tạo ra các môi trường có độ thoáng khí tốt hơn cám.
Trường hợp sử dụng cám quá mịn, người ta phải độn thêm trấu xay
nhỏ (thèm khoảng 20 - 25c/c) hoặc cùi bắp đã xay nhỏ trước khi thanh
trùrg.
Để làm môi trường nhân giôxxg, người ta cũng làm như trên. Chi có
một điếm khác là sau khi làm ám môi trường đến độ âm nhàt định, người
ta phân phôi chúng vào các dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam
giác) với khôi lượng bằng 1/5 hay 1/6 dung tích của dụng cự, íỉậy nút bỏng
và đem thanh trùng ở 121°c (0,5 at) trong 30 phút- Sau khi đe nguội mới
cây giông vào.
c) Quá trình nhân giống: Quá trình nhân giống bắt đầu từ giông có
trong ống nghiệm. Trong các nhà máy, mỗi lần cấy truyền giông, người ta
thường cấy làm ba ông. Một ống đùng kiểm tra trước khi sản xuât, một ống
đùng để sán xuất và một ống dùng đề bảo quản.
Song song đó, người ta chuẩn bị một bình tam giác dung tích 200 - 250
ml và chuẩn bị 50 g môi trường như phần trình bày ở trên. Môi trường
được thanh trùng và làm nguội đên 30° c .
Đổ 10 ml đá thanh trùng và làm nguội vào ống giống, dùng que thủy
tinh đánh cho bào tử hòa trộn vào nước. Bằng biện pháp vô trùng (thực
hiện trong các tủ nuôi cấy vô trùng) chuyển toàn bộ vào bình tam giác trên,
172 CHƯƠNG 5

lắc cho th ậ t đều và chuyển chúng sang tủ ấm 30 - 37° c , Nuôi ở điều kiện
này cho đến khi bào tử nấm xuất hiện và phát triển đều khắp môi trường.
Ta gọi quá trình thực hiện như trên là quá trìn h nhân giống cấp 1 . Cứ
lần lượt thực hiện tiếp ta có giống câ'p 2, cấp 3 ... cho đến khi đủ 5 - 10%
giống cho sản xuất.
Cứ mỗi một cấp độ nhân giống từ cấp này sang cấp khác, khối lượng
môi trường tăng từ 10 - 15 lần. Trong trường hợp khôi lượng vượt quá 1 ký
người ta thường nuôi trên nhừng khay.
Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh hiện nay, người ta thường
dùng những chủng biến đổi gen. Công nghệ biến đổi gen đã tạo ra những
chủng siêu tổng hợp kháng sinh, Theo Talaro (1993), từ chủng loại
Penicillium chrysogenum đầu tiên chỉ có khả năng sinh tổng hợp 6 mg/i,
hiện nay người ta đã có những chủng biến dổi gen từ chủng gốc trên có khả
năng sinh tổng hợp 85.000 mg/I penicilin.
d) Quá trình lẽn men: Khi môi trường đã được khử trùng và làm nguội
đến 30° c , tiến hành trộn giống vào với tỷ lệ từ 5 - 10 %. Các khay được
xếp chồng lên nhau trên những giá đỡ có một khoảng cách n hất định để
thoáng khí và thoáng nhiệt.
Nấm Penicillium trong quá trình phát triển thường tạo ra ít nhiệt hơn
nấm Aspergillus. Tuy nhiên, để tăng cường khả năng phát triển và sinh
tổng hợp, người ta thường thổi khí bằng quạt gió có lắp hệ thông làm sạch.
Quá trình lên men kéo dài 6 - 7 ngày ở nhiệt độ 24 - 2 8 °c .
Trong lên men bề mặt, người ta cũng sử dụng môi trường lỏng. Môi
trường lỏng dùng trong nuôi cấy bề m ặt thu nhận penicilin bao gồm:
Cao ngô (bắp) 50g Lactose 30g NaNOa 3g
KH 2P 0 4 0,5g MgS0 4 0,25g
C6H 5CH2COOH 0 ,2 g ZnS0 4 , 0,044g Nước 1000 ml
Dung dịch lên men được khử trùng ỏ 121°c (0,5 at) trong 30 phút,
được phân phôi vào các khay có kích thước giống các khay nuôi cấy bề mặt
với môi trường bán rắn. Ở đáy các khay này không được đục lỗ vì phải chứa
môi trường lỏng. Chiều cao của dung dịch môi trường trong các khay là
3 - 4 cm. Người ta cũng tiên hành lên men trong khoảng thời gian là
6 - 7 ngày ở nhiệt độ lên men là 24 -28°c.
Váng nấm sợi, được giữ lại sau khi đã rút h ế t dịch lên men, được tiếp
tục sử dụng cho những lần lên men k ế tiếp. Ở những lần lên men tiếp theo
người ta chi việc đổ thêm dịch lên men vào. Các th í nghiệm cho thây chi
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT KHÁNG SINH 173

nên tái sử dụng váng nấm sợi này 3 - 4 lần* vì nhừng lần sau hiệu suất thu
nhận kháng sình sẽ giảm dần.
2- Phương pháp lên men chìm
Phương pháp lên men chìm là phương pháp được ứng dụng nhiều từ
những năm 1950 trở lại đây, thay th ế dần phương pháp nuôi cấy bề mặt.
(trong những năm gần đây, xu hướng trên th ế giđi lại quan tâm nhiều hơn
đến phương pháp nuôi cấy bề m ặt do một sồ' ưu điểm của nó).
Trong phương pháp nuôi cây chìm hay lên men chìm, người ta thường
sử dụng môi trường lỏng. Để làm môi trường lỏng, người ta sử dụng cao ngô
(bắp), glucose, hydrol, lactose, các muôi amon, thiosunfat, photphat kali
hoặc natri, các muối sunfat mangan, magiê, natri, đồng ...
a) Quá trình nhân giống: Quá trình lên men chìm người ta nhân giông
trong môi trường lỏng. Mục tiêu của quá trình nhân giống là thu nhận được
số lượng tế bào cao (thường tính tổng lượng tế bào/ml).
Môi trường nhân giống trong lên men penicilin khác với môi trường
sản xuất là chúng không chứa lactose (nếu có chỉ cần một lượng rấ t nhỏ),
một số khoáng chất và tiền chất.
Người ta thường nhân giống Penicillium trong môi trường có thành
phần sau:
Cao ngô (bắp) 2% Glucose 2% Lactose 0,5%
N itrat amon 0,125% Sulfat magiê 0,025% Sulfat natri 0,05%
Kali photphat monoboric 0,2% CaCOg 0,5%
Môi trường được thanh trùng ở 121° c trong thời gian 30 phút, để
nguội và nhân giống. Quá trình nhân giống được bắt đầu bằng việc chuyển
giông từ ống nghiệm sang những bình tam giác đã chứa sẵn môi trường
nhân giống.
Người ta thường nhân giông vào các bình lên men dung tích từ 1 lít
cho đến hàng ngàn lít. Dung tích ở những cấp độ nhân giông lớn, thiẽt bị
càng giống với th iế t bị sản xuất công nghiệp. Nhiệt độ trong quá trình
nhân giống duy trì ở khoảng 26 ± l° c và thời gian nhân giống ở mỗi cấp
độ khoảng 72 giờ. Tuy nhiên nhiệt độ này không hoàn toàn cô' định như
vậy mà có sự thay đổi theo giông vi sinh vật mà ta áp dụng vào sản xuất.
Khi nào ta thấy tổng lượng tế bào mới bắt đầu đạt được lớn nhất thì ta đưa
chúng sang giai đoạn sản xuất.
b) Quá trình lên men: Quá trình lên men trong môi trường lỏng bằng
174 CHƯƠNG 5

phương pháp lên men chìm để sản xuất penicilin trải qua hai pha:
Pỉia thứ nhất, hệ sợi phát triển rất mạnh, hay còn gọi là pha sinh
khối. Trong pha này các chất dinh dưỡng dề đồng hóa sẽ được tế bào nấm
hấp thụ rất mạnh. Tôc độ sinh sán của nâm xáy ra rấ t nhanh. Sự tạo
thành penicilin mới bắt đầu.
Pha thứ hai, hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần và đạt đến giá
trị khoảng 7 - 7,5. Trong pha này penicilin được tạo ra với mức độ cực đại.
Giông nấin mốc Penicillium chrysogenum là loại hiếu khí bắt buộc.
Hơn th ế nừa quá trình tổng hợp penicilin xảy ra trong điều kiện hiếu khí
mạnh. Do đó, trong suốt quá trình lên men, việc thổi khí là điều hết sức
cần thiết.
• Nhiệt độ nên duy trì khoảng 26°c± 1.
• pH duy trì ở 7 - 7,5.
10
pH

2 ị-

IM Penicillin — NH-NH. tmmm N sợi nấm

— pH Latoza ■M N hữu cơ

Hình 5.3

O ' -CH2 - CONHCH HC C(CH3)2

CO N CHOOH
• Chê độ thổi khí 1,2 - 1,5 thể tích/lít/phút.
Trong lên men để sản xuất penicilin hiện nay người ta sử dụng nhiều
loại môi trường khác nhau, tùy theo giông Penicillium được sử dụng. Một sô
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT KHÁNG SINH 175

môi trường thường sử dụng được liệt kê trong bảng 5 .2 .

Bảng 5.2: Thành phần một số loại môi trường thông dụng
STT Thành phấn Môi trường 1 Môi trưởng 2 Môi trường 3
1 Cao ngỏ 2,0 - 3,0 - 2,0 -3 ,0

o Khô hạt có dầu (lạc, đậu - 2,0 - 2,4

£
tương, hướng đương)
3 Lactose 5,0 5.0 1,0
4 Glucose hoặc hydrol 1.5 1.5 1,5
5 Dẩu thực vật 0,5 - 1,0 0 ,5 - 1 ,0 2.5 - 3,5
6 Amon nitrat 0,4 0,4 0,4
7 Su Ifat natri 0,05 0,05 0,05
8 Kali photphat 0,4 0.4 0,4
9 Magiê sulfat 0.025 0,025 0,25
10 Natrí hyposunfit 0.2 0,2 0,2
11 Canxi cacbonat 0,5 - 1,0 0 ,5 - 1 ,0 0 ,5 - 1,0
12 Tiển chất 0,2 -0 ,4 0,3 - 0,4 0,3 - 0,4

Axit

Base

Dung
Nước môỉ
nóng

ị chiết
Nước
lạnh

Penicillin
Durig môi
thu hổi

Hình 5.4: Sơ đồ thiết bị sản xuất penicillin

176 CHƯƠNG 5

Môi trường được thanh trùng ở 121° c trong 30 phút, sau đó làm nguội
và tiếp giống từ quá trình nhân giống vào. Quá trình này được thực hiện
sao cho đảm bảo được tính vô trùng.
Hiệu suất thu nhận penicilin phụ thuộc vào lượng sinh khối có trong
môi trường. Nhiều kết quả cho thấy khi penicillium p hát triển m ạnh, tạo
nhiều sinh khối thì hàm lượng penicilin thu được sẽ nhiều. Do đó các muối
dinh dưỡng phải được cung cấp đầy đủ. Mặt khác, còn cần cung câp nhiều
oxy vì nấm Penicillium rấ t cần oxy ỗ dạng hòa tan để p hát triển. Lượng
oxy phụ thuộc rấ t nhiều vào lượng các chất dinh dưỡng. Mối quan hệ này
thường tỷ lệ thuận với nhau.
Để thu được 100 kg muôi natri của penicilin G, cần phải cung cấp:
• 1200 kg đường • 60 kg dầu mơ • 770 kg cao ngô
• 220 kg axit phenylaxetic * 100 kg axit phenylacetic
• 3000 KW giờ điện • 4000 m 3 hơi nước • 50000 m 3 không khí
(Theo R. Kreutzpeldt, 1967)
5.3.3 Thu n h ậ n và tin h ch ế kháng sỉnh
Có ba phương pháp thu nhận và tinh chế penicilin từ môi trường nuôi
cấy (cả phương pháp bề m ặt và phương pháp chìm):
- Trích ly bằng dung môi hữu cơ.
- Hấp thụ.
- Trao đổi ion.
Trong ba phương pháp trên, phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ
được sử dụng nhiều hơn cả. Phương pháp này dựa trên những đặc điểm sau:
- Muôi của penicilin rấ t dễ tan trong nưđc.
- Axit penicillic rấ t dễ tan trong dung môi hữu cơ.
Quá trình chiết bằng dung môi hữu cơ được thực hiện qua hai giai
đoạn:
Giai đoạn thứ nhất: Trộn nước và dung môi để tăng bề m ặt tiếp xúc.
Làm như vậy để các phần tử kháng sinh tiếp xúc chặt chẽ với dung môi.
Tiến hành khuấy liên tục để đảm bảo quá trình tiếp xúc này đạt được mức
độ cao nhất.
Giai đoạn thứ hai: Sau khi tiếp xúc giữa kháng sinh và dung môi sẽ
tạo ra k ết tủa. Để tách kết tủa khỏi dung dịch người ta tiến hành ly tâm.
Phương pháp ly tâm vừa nhanh vừa có hiệu quả nhất.
Trong các phòng thí nghiệm và cả trong sản xuất công nghiệp, người
CÓNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT KHÁNG SINH 177

ta thường dùng những dung môi sau để tiến hành thu nhận kháng sinh:
- Các ancoỉ: butanol, isopropanol, propanol.
- Các ester: acetate etyl, butyl, amyl.
- Các ceton: metyl etyl aceton, metyl butyl ceton
- Cảc ete: ete isopropylic, dioxan
- Benzen, phenol, pyridin, dicloetan, clorofoc
Kỷ thuật thu nhận kháng sinh ngày càng được cải tiến nhờ vào những
tiến bộ không ngừng của kỷ thuật vật lý. Một trong nhừng phương pháp
được sử dụng rấ t có hiệu quả để thu nhận kháng sinh là phương pháp phân
tán tĩnh điện.
Phương pháp phân tán tĩnh điện thay th ế cho phương pháp trích ly
bằng dung môi.
Do th àn h phần môi trường rấ t phức tạp nên sự di chuyển các phần tử
penicilin tới dung môi rấ t khó khăn và xảy ra Tất chậm.
Phương pháp phân tán tĩnh điện nghiên cứu sự trộn dung môi hữu cơ
và dịch lên men bằng cách sử dụng phương pháp phun tĩn h điện.
Nguyên tắc của phươag pháp này là sử dụng một hiệu điện th ế cao (lên
đến 25 kV) để tạo những vi giọt của dung dịch chứa penỉcilin.

MÔI trường lèn

men vi khuẩn

A- bồn chửa môi trường lên men; B- thiết bị trao đổi nhiệt

C- Thiết bị xử lỷ sân phẩm lên men; D- Máy chiết Penicillin

H ình 5.5: Sơ đồ chiết penicillin

Một số ìượng rấ t lớn các vi giọt sẽ chuyển động rấ t nhanh. Kết quả là
tạo ra được vận tốc chuyển động vật chất và tốc độ trích ly sẽ tàng nhanh.
178 CHƯƠNG 5

Các giọt được tạo ra bằng phương pháp này sẽ được tăng tốc qua dung môi
hữu cơ và kết quả là vận tốc sẽ cao hơn.
Mặt khác, các giọt khi tạo thành sẽ được tích điện trường, chúng sẽ
xếp thành hàng tùy theo sự phân cực và lực hâp dẫn giông như lực hâp dần
giữa hai cực của nam châm, do đó làm tăng khả năng hội tụ của các hạt và
k ết auả là rút ngắn thời gian tách dung môi khỏi dung dịch lên men sau
khi trích hoàn toàn.
Phương pháp này có những ưu điểm sau:
- Do thời gian thực hiện ngắn nên không làm thay đổi hoạt chất sinh
học của vật chât cần thu nhận.
- Giảm chi phí cho quá trình trích ly.

Hình 5.6: Phương pháp phân tán tĩnh điện

5.4 CẤC LOẠI KHÁNG SINH KHÁC

5.4.1 K h á n g s i n g s t r e p t o m ỉ c ỉ n

Streptomicin được ứng dụng nhiều trong điều trị bệnh cho người, động
vật, thậm chí cho cả thực vật.
Năm 1944, Waksman tìm ra và cho đến nay nó mang nhiều tên khác
nhau như: Streptomicin, Strepocvin, Strizolin.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẨT KHÁNG SINH 179

Loại kháng sinh này có thể tiêu diệt nhiều vi sinh vật khác nhau (cả
gram (-) và gram (+)).
1- Cấu tạo phân tử
Streptomicin được câu tạo từ hai thành phần:
- Streptidin.
- Streptobiozamin.
Streptidin là dẫn xuất của inozit có chứa nhóm guanidin: 1,3-
diguanidino-2,4,5,6-tretaoxy xiclohexan.
Streptobiozamin là một dissacharid bao gồm streptose (pentose) và N -
metyl - L - glucozamin.
Streptidin nốí với Streptobiiozamin bằng cầu nôi glucozit nhờ hydroxyl
glucozit của N - metyl - L - glucozamin.

N - metyl - L - glucozamin

Streptomicin có chứa nhiều nhóm hydroxyl và amin. Chúng hòa tan

rất tốt trong nước. Chúng có khả năng tác dụng với các axit hữu cơ và vô cơ
đê tạo ra các muôi tương ứng.
Trong y học, người ta hay sử dụng hai loại muôi của streptom icin là
Ci2H39N 70 12 và C21H 39012N 7.3 HCLCaCl3.
2- Vi sinh vật tham g ia sinh tổng hợp Streptomicin
Năm 1944, Waksman và Schatz phân lập được chủng Streptomyces
griseus (sau này được đổi tên là Streptomyces Sreptomixin).
Nhừng chủng Str. Streptomixin tự nhiên thường không có khả năng
sinh tổng hợp Streptomicin m ạnh mà chúng phải qua quá trình thay đổi hệ
180 CHƯƠNG 5

thống di truuyền theo những phương pháp di truyền cổ điển và di truyền

hiện đại.
Mặt khác, các chủng S tr. Streptomixỉn thường rấ t không ổn định.
Chủng có khả năng đồng hóa mạnh nguồn cacbon như glucose, tinh bột,
dextrin, maltose, fructose, galactose, manose. Do đó, người ta thường sử
dụng tinh bột và glucose cho sản xuất Streptomicin. Một số nhà máy còn sử
dụng m ật rỉ trong sản xuất.
Trong môi trường chứa glucose, StnStreptom ixin đồng hóa glucose và
tạo ra Streptomicin theo cơ chế sau:

Glucose - 6 - p Glucose - 1 - p
— DTTP
(deoxitimidin riphotphat)

acginỉn
Deoxitimidi diphotphoglucose
{dTTP - glucose)

acginin

t
r ~

I
DTTP - đihidrostreptose

Glucose
Dihidrostreptose Streptidin - 6 - p

N * metylglucozamin
I
Dihidrostreptomicin - p

I
Streptomỉcin
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT KHÁNG SINH 181

3- Công nghệ sản xuất

Sản xuất streptom icin chủ yếu bằng phương pháp lên men chìm (xem
sơ đồ dưới đây).
a) Giông dùng trong quá trình sản xuất là Str.Streptom ixin. Giông này
được nuôi trong những điều kiện thuận lợi n hất để tạo ra nhiều bào tử và
được bảo quản theo phương pháp đông khồ. Bằng phương pháp này, giông
có thể giữ được trong 5 nãm mà hoạt tính không thay đổi.
b) Quá trình nhân giống cho sản xuất, ta có thể sử dụng một trong
những loại môi trường sau:
• Môi trường 1:
Tinh bộtlg Cazein 0,3 g K N 03 2,0 g
NaCl 2,0 g K2H P 0 4 2,0 g MgS0 4.7H20 0,05 g
C aC0 3 0,02 g FeS0 4.7H20 0,01 g Nước 1000 ml
• Môi trường 2:
Glucose 20,0 g kno3 1,0 g NaCl

k 2h p o 4 3,0 g MgCOs 0,3 g CaC0 3

F eS 0 4.7H20 0,001 g Nước 1000 ml
• Môi trường 3:
Tinh bột 20,0 g KNO,, 1,0 g N aC l
k 2h p o 4 0,5 g MgSƠ4 0,5 g
F eS 0 4.7H20 0,001 g Nước . 1000 ml
• Môi trường 4:
Tinh bột tan 10,0 g Pepton lOg
NaCl 5,0 g Nước cất 1000 ml
Nguồn cacbon: có thể sử dụng glucose, tinh bột, bột đậu xanh, đu>j
nành, bột ngô (bắp). Người ta dùng CaC0 3 để điều chỉnh pH.
Quá trìn h nhân giống giống như trong sản xuất kháng sinỈL penicilin,
chỉ khác về giông vi sinh vật và môi trường nuôi cấy.

V
 182 CHƯƠNG 5

Giống vi sinh vặt

Một ống kiểm tra Một ống dùng cho sản xuất Một óng giư giống

í
Nhân giống cho sản xuất

X
Lên men

I
...
Thu nhận chế phẩm thô

Tinh chế sản phẩm

(
Sản phạm

Sơ đồ 5.2: Sơ đồ công nghệ sản ỹuất strcptomicin

c) Quá trình lên m e n Môi trường lên men bao gồm các thành phần
• giông như môi trường nhâri giống, trong đó người ta cho thêm NaCl đế làm
tăng tính thầm thâu của tế bào. Khi đó streptomicin dề dàng thoát khỏi tế
bào ra môi trường hơn.
Nếu sử dựng cao ngô thì hàm lượng của chúng nhỏ hơn bột dậu tương
khoảng 1 0 - 1 5 lần. Nếu không có glucose ta có thể thay th ế bằng tinh bột.
Trong quá trìn h lên men xảy ra hai pha rấ t rõ (xem H . 5 .4 ):
- Pha tạo thành sinh khối.
- Pha tạo thành kháng sinh.
Ngoài kháng sinh Streptomicin ra, vi sinh vật còn tổng hợp một sô"
kháng sinh khác có tên manozidostreptomixin. Loại kháng sinh này có
hoạt tính nhỏ hơn sáu lần kháng sinh streptomicin.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT KHÁNG SINH 183

Ộ1 E
>
C
pH X

Ẹ
o
8 ọ.
Q
V-)
7 ự)
6 --
5 --
-100
ơ)
-- 80 !
cn
” c
60 '<o
- 40

” 20

Giờ lẻn men

LS’ 1 trên môi trường tổng hợp: 1- glucoza; 2- nitơ tổng số; 3* pH; 4- sinh khôi
5- hãm lượng kháng sinh (theo V.A, Severin, s.v. Gorkii; 1957)

Hình 5.8
Động thái cua quá trình lên men Streptomixin nhỏ Str. Streptomicini
Kháng sinh này thường gây rấ t nhiều khó khăn cho việc tách và tinh
chế streptomicin từ dịch lên men.
Để thu nhận streptomicin tinh khiết, người ta dùng enzym
manozidostreptomixinase để tách D-manose ra khỏi phân tử và giải phóng
streptomicin.
Sau đó streptomocin được tách ra bằng các dung môi, chuyển chúng
sang một dạng muôi nào dó, ly tâm, làm sạch và sấy khô (Một trong hai
dạng muối trình bày ờ phần a).
5.4.2 K h á n g s in h t e t r a x y c lin

I- Kháng sinh tetraxyclin

Đây là nhóm kháng sinh có chung một phân nhóm -N (CH 3)L>, nhóm
CONH2, nhóm phenohydroxyl và haỉ hệ^thông nôì đôi liên hợp chứa eton
và enol.
Nhóm tetraxyclin có nhiều loại. Các loại tetraxyclin được ứng dụng
nhiều trong chữa bệnh cho người và gia súc bao gồm:
Tetraxyclin; Clotetraxyclin; Oxytetraxyclin; Demetyltetraxyclin
Sản phẩm tetraxyclin hiện nay có trên thị trưởng được sản xuât bằng
184 CHUƠNG5

hai phương pháp:

- Phương pháp sinh học: lẽn men nhờ Staphilococcus.
- Phương pháp hóa học từ Clotetraxyclin.
Kháng sinh Tetraxyclin có khả năng tiêu diệt vi khuẩn gram (-) tốt
hơn tiệu diệt vi khuẩn gram (+).
Tetraxyclin tinh khiết có màu vàng và có VỊ đắng. Trong cơ thể người
chúng tồn tại lại và ít độc.
Clotetraxyclin (còn có nhiều tên khác như Aureoinixin, Biomixin,
Duomixin). Các kháng sinh này được tìm thấy từ năm 1948. Ở dạng tinh
khiết chúng có vị đắng và màu vàng kim. Khi nuôi cấy, kháng sinh này
thường ở dạng muôi với canxi và không tan trong nước. Clotetraxyclin có
hoạt tính m ạnh ở pH axit (pH = 3,5 - 4,0), chúng rấ t không bền vững trong
môi trường kiềm* Loại kháng sinh này dễ bị phân hủy trong cơ thể người
và ít độc.
Oxytetraxyclin được tìm thấy năm 1949. Loại tinh khiết thường có
màu vàng, vị đắng và ít độc.
Nhóm kháng sinh Tetraxyclin được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, chủ
yếu dùng như chất kích thích tăng trọng.
Trong sản xuất nhóm kháng sinh này, người ta thường sử dụng
Streptomyces aureofaciens và Str. Rỉmosus. Cả hai thuộc vi sinh vật hiẽu
khí, do đó trong quá trình nuôi cấy cần phải lắc hoặc thổi khí liên tục, aêu
ngưng thổi khí sẽ dẫn tới quá trình trao đổi chất bị rối loạn. pH thích hợp
đối với chúng là 6,6 - 7,2. Người ta thường dùng CaC0 3 để điều chỉnh pH
lên men.
2- Quá trình sản xu ất
Cũng giống như sản xuất các loại kháng sinh khác, quá trình sản xuất
Tetraxyclin phải qua ba giai đoạn cơ bản:
- N hân giông.
- Lên men.
- Thu nhận và tin h chế sản phẩm.
N hân giốn g
Người ta cấy bào tử vào môi trường có thành phần như sau:
Cao ngô 2%; tinh bột 1,5%; pH môi trường 6,8 - 7,0
Môi trường được phân phôi vào các bình tam giác, lắc với tốc độ 220 -
250 vòng/phút. Thời gian nhân giông 24 - 40 giờ.
Giống được nhân vào những thùng lên men tương ứng với các cấp độ
CÕNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT KHÁNG SINH 185

lên men. Lượng giốhg trong các cấp độ lên men có thể ỉên đến 30%.
Quá trìn h lên m en
Lên men tetraxyclin cũng qua hai pha rõ rệt.
Pha thứ nhất, số’ lượng các chất dinh dưỡng giảm đi nhanh chóng, sinh
khối tạo th à n h râ't khác nhau. Chỉ cần 24 - 48 giờ tổng lượng sinh khôi đã
đạt được mức độ tối đa. Trong giai đoạn này, 60 - 80% các chất dinh dưỡng
được tiêu thụ.
Pha thứ hai, các quá trình hâ'p thụ chất giảm, sự tăng sinh khôi giảm.
Giống Str.aureofacieus đồng hóa glucose và giống Str.rimosus đồng hóa
mantose để tạo ra tetraxyclin. Lượng tetraxyclin trong pha này đạt được
cao nhâ't.

Thời gian lên men (giở)

1- hoạt lực; 2- khối lượng khuẩn ty; 3' hydratcacbon; 4- N-NH3

Hình 5.9: Thay đổi hóa sinh của S tr. Aureofaciens trong quá trình lên men
Trong công nghệ sản xuâ't tetraxyclin, người ta thường sử dụng môi
trường gồm tinh bột khoai tây, bột mì và bột ngô (bắp).
• Thời gian lên men: 110 - 130 giờ, trong đó giai đoạn tạo th àn h sinh
khôi cao n h ất sau 70 - 90 giờ; giai đoạn tạo kháng sinh cao n h ất sau 110 -
120 giờ.
• PH tối ưu trong lên men là 6,8 - 7,0.
• Trong quá trình lên men, người ta cho thêm 0,2 - 0,3% axit lactic
làm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. Trong quá trìn h lên men,
người ta thường sử dụng các chất béo để phá bọt. Lượng chất béo dùng để
phá bọt không được quá 3 %, nếu cao quá, khả năng tổng hợp kháng sinh sẽ
giảm.
Để sản xuất clotetraxyclin, người ta thường dùng một trong những môi
186 CHƯƠNG 5

trường sau:
• Môi trường I:
Cao ngô (bắp) 0,5%; Amon n itrat 0,5%; Tinh bột khoai tây 2,0%
N atri clorua 0 ,2 %; Canxi cacbonat 0,5%; Bột ngô 5%
Amon n itra t 0,7%; Benzyl thioxyanat 0,0001%; Coban clorua 0,0001%
• Môi trường 2:
Saccharose 2%; Cao ngỏ 0,24%; Bột đậu tương 2 %
(NH4)2S 0 4 0,5%; CaCO-j 0,4%; NaCl 0,5%; Rỉ đường 0,2
Với giống S tr. Riniosus, thời gian lên men để tạo ra oxytetraxyclin
thường dài hơn và cũng xảy ra hai pha rấ t rồ ràng. Oxytetraxyclin được tạo
ra ngay từ giờ thứ 24, đến 60 - 70 giờ lên men chúng ngưng lại và đạt được
tối đa ở giờ thứ 116 - 120. Sinh khối đạt được cao n h ất ở giờ thứ 70.
Phai Pha II

II
5 -c 60 •o
'cn
>N C
ỗ ầ
5.0 C
2500 200 1500 tíì
0
C 0
•ffl
2000 160 1200 40 -C

1500 120 900 30

1000 80 600 Ị-2,0

500 40 300 - 1,0

16 24 48 72 96 116
Thời gian lên men
16 giờ 24 giở 48 giờ 72 giờ
f
'

w it
*r
Ầ

Trạng thải khuẩn ty

1 - Oxytetraxyclin; 2 - Sinh khối; 3 - Hydratcacbon; 4 -N -N H3
5- Photpho vò cơ, 6- pH; 7- Tốc độ tích tụ kháng sinh
Hình 5.10: Biến đổi hỏa sinh trong thời gian lèn men oxytetraxyclỉn bằng
Str. Rimosus L S T -ĨỈ8 trên môi trường tổng hợp (theo Zaiseva và Orlova, Ĩ959)
Đối với Str. Rimosus, người ta thường dùng môi trường có th àn h phần
như sau để tiến hành lên men: tinh bột, amon sulfat, cao ngô, CaC03,
pH = 6,8 - 7,0; ìên men trong diều kiện thổi khí liên tục trong 6 - 7 ngày.
Thu nhận và tinh chê nhóm kháng sinh này giống như các loại kháng sinh khác.
 Chương

CÔNG NGHỆ ENZYM

6.1 KHÁI NIỆM VỀ ENZYM

Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất
nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần. C hất cho thêm
vào này được gọi là chất xúc tác.
Chất xúc tác hóa học có hai đặc điểm quan trọng
1- Làm tăng phản ứng hóa học.
2- Bản thân chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng.
Sau này các nhà khoa học thấy rằng các chất xúc t á c h ó a h ọ c c h ỉ làm
tăng tốc độ phản ứng, chứ không tham gia làm thay đổi chiều hướng phản
ứng, trạng thái phản ứng hay năng lượng sứ dụng trong phản ứng. Trong
các phản ứng sinh học (các phản ứng xảy ra trong cơ thể sinh vật) cũng có
chất làm tăng các phản ứng, chất đó được gọi là enzym.
Chữ “enzym” được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là chất trong
nấu men.
Enzym được các cơ thể sinh vật sinh tổng hợp nên và th am gia các
phản ứng hóa học trong cơ thể. Enzym là một chất hữu cơ, trong khi đó các
chất xúc tác hóa học thường là chất vô cơ. Sau này, các nhà khoa học xác
định chúng là protein.
Như vậy enzym là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản
ứng hóa học trong và ngoài cơ thể.
Điểm rất đặc biệt của enzym là chủng hoạt động trong điều kiện nhiệt
độ ôn hòa giống như nhiệt độ ôn hòa của cơ th ể sinh vật. Trong khi đó, các
ch ất h óa h ọc cần p h ải có n h iệ t độ cần th iế t cho p h ản ứng. N h iệ t độ càn g
cao, tốc độ phản ứng xúc tác hóa học càng cao. Ưu điểm cơ bản của enzym
khi tham gia các phản ứng sinh hóa có th ể tóm tắ t như sau:
1- E n zy m có th ể th am gia h à n g lo ạ t các p h ản ứng tron g chuỗi phản
ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật
chất.
188 CHƯƠNG 6

2- Enzym có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng
chuyển hóa rấ t cao.
3- Enzym có thể tạo ra những phản ứng dây truyền. Khi đó sản phẩm
phản ứng đầu sè là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
4- Trong các phản ứng enzym, sự tiêu hao năng lượng thường râ't ít.
5 Enzym luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Sô" lượng
enzym được tổng hợp rấ t lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản
ứng xảy ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thế luôn luôn có sự
tham gia xúc tác bởi enzym.
6- Có nhiều enzym không bị m ất đi sau phản ứng. Ngày nay, các nhà
khoa học đả tìm ra trên 1.000 loại enzym khác nhau có trong tế bào sinh
vật, sô' lượng này là rấ t nhỏ so với số lượng có th ậ t trong mồi tế bào. Trong
hơn 1.000 loại enzym đã biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được
khoảng 200 loại.

6.2 CẤU TẠO CỦA ENZYM

Enzym là những protein có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000

dai ton.
Các enzym được cấu tạo từ L - axit amin. Các axit amin này liên kết
với nhau bởi liên kết peptit. Khi thủy phân protein - enzym, ta sẽ thu nhận
được các axit amin. Trong một sô' trường hợp, ngoài axit amin ra người ta
còn thu được những thành phần khác.
• N ếu một enzym, khi bị thủy phân, ta chỉ thu được các axit amin thì
emzym này được gọi là enzym đơn cấu tử hay còn gọi là enzym đơn giản.
- N ếu một enzym, khi bị thủy phân, ta thu được ngoài axit amin còn
các thành phần khác thì enzym này được gọi là enzym đa cấu tử hay còn
gọi là enzym phứt: tạp.
Các enzym phức tạp, ngoài protein ra còn có các thành phần khác như
ion k im lo ạ i, v ita m in , glu tation d ạn g khử, ... đa s ố em zym có trong cơ thể
thuộc enzym đa cấu tử. Trong thành phần enzym đa cấu tử người ta phân
b iệ t rõ cá c p h ầ n n h ư sau :

- Phần protein được gọi là feron hay apoenzym.

- P h ầ n k h ô n g p h ải p rotein gọi là n hóm n goại “agon ”.
Nhóm ngoại, khi được tách ra khỏi enzym, có thể tồn tại độc lập.
Trong khi tham gia xúc tác, không phải toàn bộ tấ t cả các phần trong
cấu trúc của enzym tham gia mà chỉ có một phần giới hạn của phân tử
CÔNG NGHỆ ENZYM 189

enzym tham gia phản ứng. Phần giới hạn tham gia phản ứng này được gọi
là trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động của enzym do một sô" axit
amin đảm trách. Như vậy, trong trường hợp cơ thể bị đột biến th ì không
phải bất kỳ đột biến nào cùng dẫn tới hiện tượng làm sai lệch các phản
ứng sinh hóa của tế bào, chỉ có những đột biến làm thay đổi axit amin hoặc
làm thay đổi thứ tự sắp xếp của các axit amin thì mới có ý nghĩa.
Trung tâm hoạt động của các enzym đơn cấu tử thường bao gồm một tổ
hợp các nhóm định chức của axit amin không tham gia vào trục chính của
sợi polypeptit. Các nhóm này có thể ở xa nhau trong mạch polypeptit
nhưng chúng lại gần nhau trong không gian. Khoảng cách này được xác
định sao cho chúng có th ể tương tác với nhau trong quá trình xúc tác. Cấu
trúc không gian của trung tâm hoạt dộng thường giông cấu trúc không gian
của cơ chất mà chúng tham gia xúc tác.
Trung tâm hoạt động của các enzym đa câu tử là nhóm ngoại và nhóm
định chức của axit amin nằm ở apoenzym. Khi enzym tương tác với cơ chất
các nhóm định chức của trung tâm ljoạt động sè thay đổi cấu trúc không
gian sao cho tương ứng với cấu trúc không gian của cơ chất.
ơ tế bào động vật tồn tại một loại enzym không có khả năng thain gia
phản ứng ngay, muốn có khả năng hoạt động chúng phải được hoạt hóa.
Trung tâm hoạt động của loại enzym này tồn tại ở dạng chưa được hoạt hóa
và được gọi là zymogen hay proenzyin, ví dụ như enzym pepxinogen,
tripxinogen, kimotripxinogen hay protrombin. Các enzym này có thể tự
hoạt hóa hoặc nhờ tác dụng của một enzym nào đó hoặc một yéu tố nào đó.
Khi đó một sô" iiên kết peptit trong phân tử zymogen bị mất, enzym sẽ dược
hoạt hóa. Trong một sô" trường hợp khác có sự sắp xếp lại các nhóm
trong phân tử enzym. Khi đó sẽ hình th àn h trung tâm hoạt động của
enzym ỏ trạng thái hoạt hóa.
ở những enzym dị lập thể hay enzym điều hòa còn có trung tâm dị lập
thể (enzym điều hòa). Các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất
khác. Các cơ chất tương tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa. Khi
trung tâm điều hòa này tương tác với chất điều hòa, chúng sẽ làm thay đổi
câu trúc không gian của trung tâm hoạt động, khi đó tốc độ phản ứng
enzym sẽ bị thay đổi. Trong trường hợp phản ứiig enzym được tâng !ên khi
chất điều hòa tương tác với trung tâm điều hòa thì chất điều hòa này được
gọi là chất điều hòa dương. Ngược lại, nếu phản ứng enzym giầm đi khi
chất điều hòa tương tác với trung tâm điều hòa thì chất điều hòa này được
gọi là chất điều hòa âm. Các chất điều hòa hoàn toàn không biến đổi khi
chúng tương tác với enzyra.
190 CHƯƠNG 6

Các nhóm chức năng của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt
động của enzym bao gồm:
- Nhóm sulfridril của xistein.
- N h ó m a m in ở đầu N hoặc nhóm £ - amin của lizin.
- Nhóm cacboxil của axit aspartic và axit glutamiz.
- Nhóm hydroxyl của serin, treonin, va trirozin.
Trung tâm hoạt động của các enzym một thành phần bao gồm từ 3 -ỉ- 7
nhóm chức năng trên. Các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động được
định hướng xác định sao đó để đảm bảo cho chúng cố khả năng tương tác
với nhau trong khi phản ứng.
Trung tâm hoạt động của enzym hai thành phần bao gồm một sô" nhóm
chức nảng của axit amin trong thành phần apoenzym và trong nhiều trường
hợp còn cần cả ion kim loại. Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt
động của enzym là những ion kim loại hóa trị 2 như Fe, Co, Mn, Zn, Cu ...
chúng có m ặt cá ớ trung tâm hoạt động của enzym một thành phần và
enzym hai thành phần. Các kim loại này có thể tham gia trực tiếp trong
các phản ứng xúc tác, chúng liên kết bền vđi phân tử enzym.Trong nhiều
trường hợp enzym bị m ất hoàn toàn hoạt tính khi bị loại bỏ kim loại ra
khỏi thành phần cúa enzym. Trong trường hợp này enzym này được gọi là
metaloenzym- Hoạt động của enzym này sẽ được phục hồi khi cho kim loại
vào.

6.3 ĐỘNG THÁI CỦA PHẢN ỨNG ENZYM

Fischer cho rằng hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong
trung tâm hoạt động cùa chúng. Trung tâm hoạt động của enzym có cấu
trúc không gian tương ứng với cơ chất mà chúng tham gia phản ứng. Sự
tương ứlig của cấu trúc không gian ở enzym và cấu trúc không gian của cơ
chất giống như chìa khóa và ổ khóa.
Sự tương ứng về cấu trúc không gian này không có sẵn mà chúng được
hình th à n h trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất.
CÕNG NGHỆ ENZYM 191

S- cơ chất; E- Enzym

Hình 6.1: S ự tương ứng cấu trúc không gian của cơ chất
và trung tâm hoạt động enzym
Theo Koslanđ, trong phân tử enzym đã có sẵn nhừng nhóm định chức.
Những nhóm định chức này chưa dược sắp xếp ở dạng thích hợp cho hoạt động
xúc tác. Khi enzym tương tác với cơ chất, cấu hình không gian củạ enzym bắt
đầu thay dổi, từ đó có sự sắp xếp của các nhóm định chức trong không gian sao
cho sự tương tác giữa enzym và cơ chất được thuận lợi.

khi tương tác với cơ chất

192 CHƯƠNG 6

trong đó: A, B, c - là những nhóm chức trong trung tâm hoạt động
a - phức enzym và cơ chât
b - các chất có cấu trúc gần giông cơ chât có thể kết hợp với
enzym, nhung các nhóm chức A, B, c được định hướng không đúng, nên
không tạo được cấu hình không gian tương ứng, trung tâm sẽ không hoạt
động.
Sự kết hợp của cơ chất (S) vào trung tâm hoạt động của enzyra sẽ tạo
thành phức chất enzym - cơ chất (ES). Đây cũng là phương trình Michaeỉis
- Menten. Điều này đã được nhiều dẫn liệu thực nghiệm chứng minh. Phức
ES này rấ t kém bền vững. Chúng nhanh chóng chuyển hóa và giải phóng
sản phẩm (P) và enzym tự do. Khi đó enzym bị quay vòng và thực hiện
những phản ứng tiếp theo.
E+ s =Ị=k E - s
K-l
K +2
E - s — ►E + p
ở đây: E -enzym; „ s - cơ chất; p - sản phẩm
E - s - phức enzỵm, cơ chất; K + 1 - hằng sô phản ứng thuận
K + 2 - hằng số phản ứng phân ly; K - 1 - hằng sô' phản ứng nghịch.
Các loại liên kết chủ yếu tạo thành từ E và s trong phức ES là các
tương tác:
- Tương tác tĩnh điện
- Liên kết hydro
- Tương tác Vandecvan
Các tương tác uày đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng
rất. khác nhau khi có nước.
Tương tác tĩnh điện (còiì gọi là liên kết ion, liên kết muối, cầu muối,
cặp ion): Liên kết này được tạo thành giữa nhóm tích diện của cơ chất (S)
với nhóm tích điện trái dấu trong phân tử enzym (E).
Liên kết hydro: Liên kết này được tạo thành theo kiểu A - H ... B,
trong đó hydro kết hợp với A bằng liên kết cộng hóa trị, đồng thời tạo liên
kết yếu với B. Liên kết này được tạo thành khi khoảng cách giữa A và B là
3Ẳ .
I
Ví dụ: -O -H N- - N - H - O s
I
— 2.88Ẳ —► -«— 3,04Ẵ — ►
CỒNG NGHỆ ENZYM 193

* Tương tác Vandccvan: Tương tác này yếu hơn tương tác tình điện và
liên kêt hydro. Tương tác này thể hiện rấ t rõ khinhiều nguyên tử của cơ
chất có th ể đồng thời tiếp cận vđi nhiều nguyên tử của enzym. Nóchỉ xảy
ra khi có sự ăn khớp về câu trúc không gian giữa cơ chất và enzym.

6.4 CÁC YẾU TÔ' ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYM

1‘ Ánh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzym

Cơ chế tác động của enzym vàc cư chất qua ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: Enzym tương tác với cơ chất tạo thành phức enzym - cơ
chất ES.
Giai đoạn 2: Phức enzym - cơ chất sẽ được tách ra.
Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm
Như vậy ở giai đoạn đầu, nếu cơ
chất có nồng độ thấp thì tốc độ phản
ứng enzym sẽ phụ thuộc tuyến tính với
nồng độ cơ chất.
Vận tốc phản ứng được tính như sau:
Vận tốc phản ứng thuận:
V+1 = K +] [ES] [S]
Hình 6.3ỉ Ảnh hưởng của cơ chất
Vận tốc phản ứng nghịch:
đến tốc độ phản ứng của enzym
V_! = K_! [ES] [S]
Vận tốc phản ứng tạo ra sản phẩm:
v +2 = K+2[ES][S]
Trong trạng thái cân bằng sự phân ly ES sê cân bằng với sự tạo ra ES.
Khi đó: V+1 = v_i + V+2 ( 6 . 1)

thay các giá trị V vào ta có:

(K_! + K+2)[ES] = K+1[E][S] (6 .2 )

Nồng độ enzym ban đầu là E0 ta có:

[Eo] = [E] + [ES] (6.3)
thay phương trình (6.3) vào phương trình (6.2) ta có
K+1[Eọ][S]
ES (6.4)
K+1 + K+2 + K+1[S]
194 CHƯƠNG 6

[E o p ] k _ị + k +2
từ đó: [ES] = = K, (6.5)
K_! + K +2
+ [S]
K +1

ta sẽ có: [ES] = [E.][s] 66

( . )
Km + [S]
Vận tốc phản ứng enzym còn được tính theo phản ứng tạo ra sản
phẩm:
V = K+2[ES] (6.7)
Khi đó thay giá trị [ES] trong phương trình (6.6) ta sẽ có
K ,2[Eq][S] (6 . 8 )
V =
Km + [S]
Khi phức ES càng cao vận tốc phản ứng càng mạnh. Do đó vận tốc
phản ứng được cao nhất khi toàn bộ enzym kết hợp được với cơ chất.
VmM = K+2[E0] (6.9)
thay V vào phương trình (6.8) ta sẽ có
V -,-[S] ( 6 . 10 )
Km + [S]
Phương trình (6.10) được gọi là phương trình Michalis - Menten. Hằng
số Km đặc trưng cho ái lực enzym và cơ chất.
Trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ
tăng. Nhưng khi tốic độ phản ứng đạt cực đại, cho dù ta có tăng nồng độ cơ
châ't, tôc độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo.
2- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym
Trong các phản ứng hóa học, TỐC độ
phản ứng
nhiệt độ càng tăng, tốc độ phản
ứng xúc tác càng tăng.
Trong các phản ứng sinh học,
nhiệt dộ tăng, khả năng xúc tác của
enzym sẽ tàng. Nhưng khả nâng
táng của tốc độ phản ứng có một u N hiệt dỏ (aC )
giới hạn nhất định. Quá giới hạn H ìn h 6.4. Ả n h hưởng của n h iệ t độ
nhiệt độ đó, phản ứng enzym sẽ
đến tốc độ p h ả n ứng của enzym
giảm và giảm rất nhanh.
Hiện tượng đặc biệt này ở enzym có liên quan đến bản chất hóa học
của enzym. Các enzym là những protein thường không bền nhiệt. Trường
CÔNG NGHỆ ENZYM 195

hợp ta tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzym sẽ làm tăng
khả năng tạo cấu trúc không gian của enzym cho phù hợp với câu trúc
không gian của cơ chất. Khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, câutrúc không
gian của trung tâm hoạt động trong enzym không cònphùhợp với câu trúc
không gian củạ cơ chất nữa, khi đó hoạt tính enzym sẻ mât dần và đi đến
triệt tiêu. Vì vậy, trong kỹ thuật người ta thường dùng nhiệt độ như một
biện pháp làm tăng khả năng hoạt động, của enzym. Biệin pháp này thường
rất có ý nghĩa cả trong bảo quản và trong chế biến thực phẩm.
3- Ánh hưởng của pH đến hoạt tính enzym
Trong những thí nghiệm nghiên cứu về
ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyni, các
nhà khoa học cho thây hiện tượng: nếu tăng
hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định
nào đó, vận tốc phản ứng enzym sè tăng
dần và đạt đến điểm cực đại. Giá trị pH, mà
ở đó vận tốc enzym đạt được cực đại gọi là
pH tối ưu cho hoạt động của enzym. Vượt
quá giới hạn pH này hoạt động của enzym Hình 6.5: Ảnh hưởng của
sè giảm. pH đến hoạt tính enzyni
Mỗi một loại enzym có khoảng pH tối
ưu và điểm pH tối ưu. Dựa vào tính chất này, các nhà khoa học mới phân
ra loại enzym axit, enzym trung tính và enzym kiềm.
pH có ảnh hưởng rất lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức
trong trung tâm hoạt động của protein, trạng thái ion hóa của cơ chất và
phức chất ES.
Đặc tính này rấ t có ý nghĩa trong việc làm tăng phản ứng enzym, làm
giản hoặc triệ t tiêu phản ứng enzym. Đồng thời, nó còn có ý nghĩa rấ t lớn
trong các quá trình bảo quản và chế biến lương thực, thực phẩm cũng như
trong ứng dụng enzym vào sản xuất các chất tẩy rửa, trong công nghiệp
nhẹ và y học.
4' Ảnh hường cùa các chất kìm hăm đến hoạt tinh enzym
Hoạt tính của enzym có thể bị ảnh hưởng bởi những chất kìm hãm.
Những chất kìm hãm là những chất hóa học có khả năng làm giảm hoạt
tính hoặc làm ngưng hoạt tính của enzym. Các chất kìm hãm (.Inhibitor)
thường là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, và cả protein.
Các chất kìm hàm thường tham gia vào quá trình kiểm tra, điều hòa
196 CHƯƠNG 6

quá trìn h trao đổi chất trong cơ thể sống. Các chât kìm hãm được chia làm
hai loại:
- Nhóm các chất kìm hãm cạnh tranh.
- Nhóm các chất kìm hãm không cạnh tranh.
a) Nhóm các chất kìm hăm cạnh tranh: Các chất kìm hãm cạnh tranh
thường có cấu trúc không gian tương tự câu trúc không gian của cơ chát. Do
đó, chúng có khả năng kết hợp với enzym ở trung tâm hoạt động của
enzym. Chúng chóan vị trí của cơ chat trong trung tâm hoạt động của
enzym, kết quả là enzym không thế kết hợp được với cơ chất để tạo thành
phức ES.

Hình 6.6: Kìm hãm cạnh tranh

h) Nhóm các chất kìm hăm khỏng cạnh tranh: Các chât kìm hãm
không cạnh tranh tham gia kết hợp với enzym không phải ở trung tâm
hoạt động của enzym, mà là ờ một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của
enzym. Người ta còn gọi vị trí này là trung tâm kìm hãm của enzym.
Khi chât kìm hãm kêt hợp với enzym ở vùng ngoài trung tâm hoạt
động của enzym sẽ làm thay đổi câu trúc không gian của trung tâm hoạt
động của enzym. Như vậy, chúng sẽ làm giảm tốc độ phản ứng của enzym.
CÒNG NGHỆ ENZYM 197

Hình 6.7: Kìm hãm không cạnh tranh

T ro n g r ấ t n h ie u trư ờ n g hợp, s ả n p h ẩ m cuối của chuỗi phán ứ ng hav
cùa một phán ứng thường là chất kìm hãm không cạnh tranh.
Xgoài ra, còn có trường hợp chất kìm hãm không tác động vào enzym
mà tác động vào phức chât ES. Kết quả là phản ứng enzym sẽ bị giám.
5- Anh hưởng của các chất hoạt hỏa đến hoạt tính enzym
C á c c h á t h o ạ t h ó a {activator) là n h ữ n g c h ấ t l à m t ă n g k h ả n ă n g xúc t á c
cu,'» onzym. Cac chàt hoạt hóa có b á n c h ấ t hóa học khác nhau: các anion,
các chất hữu cơ có câu trúc hóa học khác nhau.
Khả năng làm táng hoạt tính en z y m của những chát này có một giới
hạn nhát định, vượt quá giới hạn này T ấ t có thể lại làm giám hoạt tính của
enzym .

6.5 VI SINH VẬT THAM GIA SINH TổNG HỢP ENZYM

Người ta thường khai thác enzym amilase, bromelin, papain từ thực

vật, pepsine, chimotripsine, tripsine, remin từ động vật. Đặc điếm rấ t dẻ
nhận thấy ớ giới thực vật hay giới động vật là mỗi loài chỉ có thế cho ta
một loại enzym nào đó, ví dụ như malt cho ta amylase, dứa (khóm, thơm)
cho ta bromelin, quả đu đủ cho ta papaift.
Riêng giới vi sinh vật cho ta tấ t cả những enzym đã được biết còn lại.
Vi sinh vật là giới sinh vật được xem như nhiều n hất và có khả nảng
chuyển hóa vật chất trong thiên nhiên mạnh nhât. Hiện nay người ta khai
thác enzym nhiều từ vi sinh vật và được ứng dụng rấ t nhiều trong đời sống,
s ả n xuất.
So với nguồn khai thác enzym từ động vật và thực vật, nguồn enzym
198 CHƯƠNG 6

từ vi sinh vật có những ưu điểm quan trọng sau:

1- Tỏ'c độ sinh sản của vi sinh vật rát mạnh. Do đó chỉ trong một thời
gian ngắn a có thể thu nhận được một khối lượng enzym râ t lớn.
2- Enzym từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao, có khả năng chuyển hóa
một khôi lượng vật chât rấ t lớn. Người ta đã làm thí nghiệm và cho biết
rằng, chúng có khả năng chuyến hóa một khòi lượng vật chât lớn hơn 30 -
40 lần khối lượng của tế bào vi sinh vật tạo ra chúng.
3- Nguyên liệu dùng để sản xuất enzym rẻ tiền và dễ kiếm.
4- Nuôi cây vi sinh vật không phụ thuộc vào thời tiết, điều kiện địa lý
như nuôi, trồng động vật và thực vật.
5- Hoàn toàn có thề sản xuất theo qui mô công nghiệp và hoàn toàn
kiêm soát được quá trình sản xuất.
6.5.1 Vi sinh vật tham gia tổng hợp am ylase
Các nhà khoa học cho biết enzym amylase được vi khuấn và nấm sợi
tổng hợp nhiều nhất, ơ các loài vi sinh vật khác khả năng này yếu hơn.
Các loại enzym amilase thường gặp khi nuỏi cây vi sinh vật gồm:
tt-amylase (- 1,4 g lu can - glucanhydrolase. Mã số 3.2.1.1)
ơ-amylase thủy phân liên kết 1,4 glucozit ờ giửa chuỗi mạch
polysaccharit. Chính vì th ế nhiều tài liệu gọi chúng là endoamylase.
Dưới tác đụng của enzym a-am ylase, tinh bột sè mất khá năng tạo
màu với iot và độ nhớt bị giảm rấ t nhanh. Loại (X - amylase thường bền
nhiệt hơn các loại amylase khác. Khi có mặt ion canxi, khả năng bền cấu
trúc của fx~amylase sè tăng lên. Chúng thường kém bền trong môi trường
axit.

Hình 6.8: Vị trí tác dụng của a-amylase trong phân tử tinh bột
Khi a-am ylase tác dụng vào tinh bột, sản phẩm tạo thành của phản
ứng này bao gồm: maltose; glucose; dextrin phân tử lượng thấp
CÔNG NGHỆ ENZYM 199

Trong đó chủ yếu là dextrin có phân tử lượng thâp. a-am ylase của nấm
sợi và cùa vi khuẩn có những điếm khác nhau được trình bày ở bảng 6.1.
Bảng 6.1: Đặc tính của a-amyỉase vi khuẩn và nấm sợi
a-amylase
STT Đặc tính
Nấm sợi Vi khuân
1 pH pH tối ƯU 4,5 - 4,7 pH tối ưu là 6,5 - 7
pH tối ƯU trong dung dịch đường Khả năng hoạt động ở khoảng
hóa là 5 - 5,5 pH 5 - 9
Nhiệt độ đường hóa có thể
2 Nhiệt độ Nhiệt độ tối ưu lả 50 - 52°c > 75°c thậm chi có thể hoạt
động ở 90 - 100°c

Ị3-amylase (mã số 3.2.1.2)

Tham gia thủy phân 1,4 glucozit ở đầu không khử, chủ yếu tạo th àn h
mantose và dextrin phân tử lớn. p-am ylase bị mất hoạt tính ở nhiệt độ
trên 70°c. Chúng bền với axit hơn a-am ylase.

Hình 6.9: Vị trí tác động cứa p~amylasc

Gỉucoamylase (mã sô 3.2.1.3)
Loại enzym này tham gia phân hủy tinh bột, glucogen, polysaccharit
đồng loại ở mối liên kết a-1,4 glucozit và a-1,6 glucozit.

Hình 6.10: Vị trí tác động của gỉucoamyỉase

Glucoamylase có ý nghĩa râ't lớn trong sản xuâ't rượu. Chúng chuyến
các dextrin có phân tử cao không lên men thành những hợp chất lên men.
Enzym amylase là một trong những enzym được nghiên cứu sớm nhâ't
và có nhiều công trình nghiên cứu được công bố nhất. Trong những công
200 CHƯƠNG 6

trìn h nghiên cứu về enzym amylase của vi sinh vật thì amylase từ nấm sợi
và từ vi khuẩn được nghiên cứu nhiều hơn cri.
Những kết quà thu nhận được khi nghiên cứu amylase của vi sinh vật
được tóm tắ t trong bảng 6.2.
Báng 6.2: Vi sinh vợt tỏng hợp amylase
Nhiệt độ tối Ưu
STT Vi sinh vật Enzym pH tôi Ưu
< C)

{/--amylase 4,5 - 6,2 40° c

1 Asp. aw am ori p-a m ylase 3.5 - 7.0 50° c
glucoam ytase 4,5 - 4,7 55 - 75°c

u -a m y la s e 4,7 - 6,0 65° c

2 Asp niger
glucoam ylase 3,8 50° c

u -a m y la s e 3.8 5(TC
3 Asp. usami
glucoam ylase 5,0 55°c
a -a m y la s e 5.5 - 5.9 50 - 5 7 °c

4 Asp. onyzae [i-a m yla se 4,8 30° c

glucoam ylase 4.8 5 0 °c

5 Bacillus am ilolique faciens (Jt-amylase 5,7 - 6,0 55 - 60°c

6 Bac. diastaticus li-a rn y ln s e 5,8 7 0 -c

7 Bac. subtilis (/-am yla se 4,6 - 5,1 37 °c

8 Endom yces sp gluco,'3inylase 4,8 5 5 -c

9 Phizopus delem ar giucoam ylase 5,5 4 5 °c

Ngoài ra còn râ t nhiều loài vi sinh Víật có khá năng sinh tổng hựp
amylase. Trên cơ sở nhừng giống vi sinh vật đã có, các nhà khoa học dùng
kỷ t h u ậ t g e n cổ đ i ể n h o ặ c k ỷ t h u ậ t g e n h i ệ n đ ạ i, t ạ o r a đư ợc rất. n h i ề u
giông có giá trị kinh tế.
Các giống được sử dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyni amylase
baơ gồm : Asp. onyzac; Asp. usami: Asp. cuvamori; Asp. batatae■ Rhizopits
deicmar; Rhizopus tonkincnsis; Rh. nevcus; Rh. japonic urn; Rh. topnincusis;
N eurospora crafisa; M u cor Sp.
Ngoài các nấm sợi ra, còn rất nhiều lơài nấm men cùng được sứ đụng
tr o n g s á n xu ất en z y m a m y l a s e n h ư Candida, Saccharomyccs, Endomycopsis.
Các giông vi khuấn được sử dụng trong sản xuất amylase bao gồm:
CÔNG NGHỆ ENZYM 201

Bacillus mesentericus, Bac. subtilis, Bac. polymyxa, Bac. macerans, cl.

acetobutylicum.

6.5.2 Vỉ sin h v ậ t th a m gia tổ n g hợp p ro te a se

Protease là loại enzym tham gia phân giải protein để tạo thành các
peptit ngắn và cuối cùng tạo thành các axit amin và NH3 .
Enzym protease đầu tiên được nghiên cứu không phải là các protease
của vi sinh vật mà là các protease của động vật (chủ yếu là protease trong
hệ tiêu hóa của động vật).
Năm 1836 Schwann đă quan sát khả năng phân giải protein của dịch
vị. Sau 30 năm (1857), Corvisart mới tách được enzym này. Đây được coi
như protease ở dạng chế phẩm đầu tiên trên th ế giới về enzym protease.
Các loại protease của thực vật được nghiên cứu chậm hưn các nghiên cứu
protease động vật. Mãi đến năm 1874, Besaner mới công bố kết quả nghiên
cứu protease từ đậu. Năm 1879, Wurtz nghiên cứu nhựa quá đu đủ và cho
thấy chúng có khả năng phân giải protein. Sau đó là hàng loạt những
nghiên cứu của W ilstaller, Gnassmann, Ambnos, 1926), về bromelin,
protease ở mô động vật.
Từ nhửng năm 1950 sau khi hoàn thiện những phương pháp tinh sạch
protein, người ta đã thu nhận được những chế phẩm protease tinh khiết
hơn. Củng từ đây, các nhà khoa học bắt đầu nhửng nghiên cứu protease cưa
vi sinh vật. Tuy nhiên, trước đó, vào năm 1918 - 1919, Wakman đã phát
hiện khả năng phân giải protein của xạ khuẩn. Từ đó đến nay đã có rất
nhiều nghiên cứu được công bố theo chiều hướng này.
Ngày nay các loại enzym protease từ vi sinh vật được sản xuât rât
nhiều và được sử dựng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, y học và
nông nghiệp. Ưu điểm lớn nhâ't của protease từ vi sinh vật là chúng rất
phong phú về chủng loại.
Năm 1960, Hartley chia protease ra bôn nhóm dựa trên thành phần
cấu tạo của trung tâm hoạt động trong enzym này.
202 CHƯƠNG 6

Báng 6.3: Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protcase
N hóm vi
STT Vi s in h v ậ t Đ ặ c tín h c ấ n lư u ý
s in h v â t
1 Bacillus subtilis Protease trung tính
2 Bac. Sphaericus Protease kiểm (subtilizin)
3 Bac. Circulans
4 Bac. Thermophilus
5 Bac. Thermoproteolítycus
c
6 '“‘CO Bac. Brevis
13
7 -C Protease kiém
Bac. licheniformis
8 Bac. mensentericus
>
9 Bac. megatherium Proíease trung tính
10 Bac. cereus Protease trung tính và protease axít
11 Clostridium períriugens
Cl. histoluticum
1 Colagenase
Cl. sporoqenes
12 Streptomyces griseus Các giống xạ khuẩn đã ơược sản xuất
13 '•ca Str. Rimosus thành chế phẩm mang tẻn pronase,
3
14 x: sư. Fradiae bao gồm 11 enzym có khả nàng phân
15 03- giải 70% protein thánh axit amin
X Str. Faecatis
16 Str. Rectus var proteolyticus
17 Aspergillus oryzae Chứa 3 loại protease
- Trung tính
- Axit
- Kiểm
18 Asp. sa toi Protease axit
19 Asp. Awamori Protease axit
20 Asp. niger Protease axit
21 Asp Shirousami Protease axit
22 Asp fumigatus 2 loại protease axit và protease kiềm
23 'ã Asp. candidus Protease axit có tác dụng làm đông tụ sữa
ư>
24 E Asp. ochraceus Protease axỉt
25 Asp. sojae Protease kiềm
26 Asp. flavus Protease kiếm, Protease trung tinh
27 Penicillium janthineHum Protease axit
28 Pen. chrysogenum Protease axit
29 Mucor pusilius Protease axit
30 Rhizopus chinensis í
31 Rhizopus delemar Protease axit có tác dụng làm đông
32 Rhtzopus niveus . tụ sữa. Ở Nhật người ta dùng thay
33 Rhizopus nodous I thế renỉn
34 Rhizopus peka
Proteasc nììỏm 1: nhóm này bao gồm các loại protease có xerin trong
t.rimg tám hoạt động (bao gồm các loại onzym tripsin; kimotripsin; elastase;
subtilizi; các enzym xúc tác làm đông máu; acrozin).
Protcuse nhóm 2: bao gồm các protease có nhóm SH trong trung tâm
hoạt động (bao gồm bromelin, papaiil, íìxin).
Proteasc nhóm 3: bao gồm các protease có kim loại trong trung tám
CÔNG NGHỆ ENZYM 203

hoạt động và trực tiếp tham gia các quá trình xúc tác (bao gồm các protease
trung tinh cũa Bacillus hoặc Colagenase).
Prutcasc nhỏm 4: bao gồm các protease có nhóm a-cacboxil trong
trung tâm hoạt động. Nhóm này gồm pepsin, renin, protease axit của vi
sinh vật.
Như vậy, tùy theo vùng hoạt động pH của enzym protease mà các
protease tồn tại ở dạng protease axit, protease trung tính và protease kiềm.
Khác với thực vật và động vật, vi sinh vật vừa rât giàu protease, vừa
có nhiều loại protease. Bảng 6.3 cho thấy khá nâng sinh tổng hợp protease
của nhiều loài vi sinh vật khác nhau,
Đôi với sinh lý của vi sinh vật, protease đóng vai trò rất quan trọng.
1- Protease ngoại bào cùa vi sinh vật tham gia các quá trình phân giãi
ngoại bào các protein để tạo ra các axit am in.

Các axit ami 11 này sẽ được đưa vào trong tê bào tham gia tống hợp
sinh khối hoặc cũng có thế bị phản giái đế giái phóng năng lượng và sán
phẩm bậc 2.
Sự phân giải protein còn có ý nghĩa loại trừ tác động độc hại của
protein, vì trong thiên nhiên tồn tại một sô loại protein khá độc đỏi với vi
sinh vật hoặc tham gia quá trình kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật.
2- Protease nội bào của vi sinh vật tham gia quá trình cải hiến
protein, enzym, tạo ra các quá trình cung câp năng lượng, vật liệu xây dựng
và sự tạo thành bào tử của vi sinh vật.
3- Protease nội bào có thể tham gia vào việc hoàn thiện các chuỗi
polypeptit đá được tổng hợp như: tách gốc, focmilmet hoặc một sô' gốc axit
amin khỏi đầu N cùa chuồi polypeptit đả được tồng hợp.
4- Protease nội bào tham gia phân hủy các protein nội bào không còn
204 CHƯƠNG 6

tác dụng trong quá trình sinh lý của vi sinh vật.

Ngoài ra chúng còn có thế tham gia vào một số quá trình tạo thành vỏ
tế bào cúa vi sinh vật.

Hình 6.12: Quá trình hoạt động protcasc nội bào

Đối với thực tiền sản xuât và đời sông, protease được ứng dụng rát
rộng rãi, từ công nghệ thực phẩm đến công nghệ làm sạch mỏi trường, từ
còng nghệ làm sạch da thú đến các loại tẩy rứa, từ công nghệ lẻn men
truyền thông (làm tương chao, nước mắm. nước chấm) đốn cống nghệ sán
xuất bia, phomai ...
6.5.3 Vi sin h v ậ t tổ n g hợp c e lỉu la se
Cellulase ià thành phần cơ báií của sinh khôi thực vạt. Trong thiên
nhiên, thực vật đóng vai trò chú yếu tổng hợp cellulase và vi sinh vật đóng
vai trò chuyền hóa các hợp chất cellulase, trả nó về chu trình chuyên hóa
trong thiên nhiên. Nhờ có vi sinh vật mà con đường chuyến hóa các hợp
chất ceflulase trong thiên nhiên trơ nên rất hài hòa. Nếu thiếu sự c h u y ể n
hóa cellulase nhờ vi sinh vật, các hợp chất cellulase sẽ không thê’ chuyển
hóa được và như vậy chu trình chuyển hóa của chúng trong thiên nhiên sẻ
bị ngưng trệ.
ơ thực vât, cellulose không bao giờ tồn tại đơn lẻ mà chúng bao giờ
cũng kêt hợp với hemicellulose hoặc với pectin thành pectinocalluỉose, hoặc
vởi lignin thành lignocellulose. Chính vì thế chúng thường tạo nén một hợp
c h a t rất bền. Mặt khác, cellulose lại tồn tại ở hai dạng: dạng kết tinh và
dạng vò định hình.
Nèu loại cày nào chứa nhiều collulose ớ dạng kết tinh thì gỗ rất chắc.
Nêu loại cây nào chứa nhiều cellulose ờ dạng vô định hình thì gồ yêu.
Cây lâu năm chức'1 nhiều cellulose ờ dạng kết tinh, cây hòa thào thì
CÒNG NGHỆ ENZYM 205

chứa nhiồu cellulose ờ dạng vỏ định hình. Vì cấu trúc của hợp chất
lignocellulơse và pectinocellulose chật chè như vậy nên chúng thường rất
khó bị phán huy.
Trong thiên nhiên ít gặp nhừng vi sinh vật cùng một lúc chứa đầy đủ
tất cá hệ Oilzvin tham gia phân hùy hoàn toàn lignocellulose hay
pectinoceHulose. Mỗi một vi sinh vật chỉ có thê sinh tổng hợp một vài ioại
enzyni trong phức hệ enzym này. Phức hệ enzym này được gọi chung là
citolase.
Enzym phàn hủy phức hệ lignocellulose và pectinocellulose thuộc nhóm
enzym bị điều hòa không chỉ bằng những tác dụng thông thường mà chúng
còn bị ức chế bởi sản phẩm cuối. Sản phầm cuối cùng của quá trình phân
giải này như một ức chế cạnh tranh. Do đó, cơ chế của quá trình phân giải
của chúng trở nên hết sức phức tạp. Chúng thuộc enzym kiềm dị hóa.
So với c á c e n z y m p r o t e a s e v à a m y l a s e , e u z y m c e llu lo s e được n g h i ê n
cứu muộn hơn. Tuy nhiên số lượng các công trình nghiên cứu về loại enzym
này iại rất nhiều. Cơ chế tác động tổng quát cúa enzym này được trình bày
như sơ đồ sau:
C ellulose Cellulase „ Cellobiose Glucose
Hemicellulose Hemtcellulase » Hỗn hợp các monosaccharit và axit
P e n to s a n Pentọsạn_asẹ_^ p e n to s e

Trong thực tế, cơ chế chuyển hóa của chúng phức tạp hơn rất nhiều.
Trong thiên nhiên, sự phân hủy cellulose xáy ra cá trong điều kiện
hiếu khí và yếm khí. Các vi sinh vật thường thay phiên nhau thủy phân
cellulose ở từng m ắt xích trong chuỗi chuyển hóa để cuôì cùng tạo ra những
sản phẩm có câu trúc đơn giản. Các chât này lại tiếp tục được chuyển hóa
vào chu trình chuyển hóa vật chất cacbcn.
Nkừng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cnzym celluỉase:
A ỉtcnaria tenuis , A spergillus fu m ig a tu s , A spergillus flavus, A spergillus
niger, A spergillus oryzae, Aspergillus sydouii , A spergillus terras,
Celluvibrio gilvus, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, F usarium
solani, Phizus sp., Trichodcrma Koningi, Trichoderma lignoruni,
Trichoderm a roseum , Trichodenna rccsei, A ctinom yces sp, P cnicillium sp.
Những vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzym hcmiceỉlulase:
Trichodcrma roseum, Trichodcrma rccsci, Aspergillus oryzctc,
A spergillus flavus, Aspergillus batatcci , C hactonium g lobosum , A spergillus
fumigatus, Penicillium sp. Fusanium roseum, Myrothccium vcrrucciric,
206 CHƯƠNG 6

stachybotys at ra, Ccphalothcciỉim, Phizopus sp.

Những vi sinh vật có khả nùng tổng hợp pcctinusc:
Penicilỉium glaucum, Pen. chrlichii, Asp. aivamori, Asp. fo etid US, Asp.
ter reus, Asp. saitoi, Asp. campestris, Asp. fniiscancs. Pen. chrysogcnum,
Pen. ccipanam, Sclcrotina Ubertiana, Sclcrotina sclcrotiorum, Rotrytis
cincrea, Trichodenna roseum, Conithyrium, Fusarium monifi forme,
Neurospora crassa, Pen. citrinum.
Hoạt tính của hệ ceỉlulase đạt cao nhất ở nhiệt độ nằm trong khoảng
40 -60°c , pH nằm trong khoảng 4 - 7 .

6.6 Cơ CHẾ SINH TỔNG Hộp ENZYM ở VI SINH VẬT

Trong tế bào của vi sinh vật cũng như trong các tế bào khác của động
vật và thực vật luôn luôn xảy ra quá trình tống hợp protein và enzym.
Quá trình tống hợp enzym xảy ra rất phức tạp ở ribosome. Ribosome ở
vi khuẩn thường có hai tiểu phần 50S và 30S. Ribosome là các hạt
ribonucleoproteit. H ạt này được tạo ra do sự kết hợp giữa protein có tính
kiềm với axit ribonucleic. Trọng lượng phân tử cùa các protein vào khoáng
2000 đến hàng chục ngàn dalton. Trọng lượng phân tử của RNA vào
khoảng 0,7 - 1,6.10° dalton. Trong tiếu phần 50S có hai vị trí:
-Vị trí A được gọi là “điểm nhận”, đây là nơi tiếp nhận axit amin
-VỊ trí p là “điểm cho’\ là nơi tạo chuỗi peptidil - RNA.
Trong quá trình tổng hợp enzym, nguyên liệu chính là các axit amin.
Các axit am in này có trong tế bào, được cung cấp bới các nguồn sau:
- Axit amin từ môi trường bên ngoài tế bào vào trong tế bào. Các axit
amin này có thề từ quá trình dị hóa ngoài tế bào, cũng có thể là các axit
amin tự do có sẵn trong môi trường.
- Axit amin được tổng hợp trong tế bào thông qua các quá trìn h đồng
hóa của tế bào.
- Axit amin được tạo ra do quá trình dị hóa trong tế bào.
Ngoài các axit amin được xem như là nguyên liệu chính cho quá trình
tổng hợp, quá trình sinh tổng hợp các enzym còn đòi hỏi rấ t nhiều loại
enzym khác nhau, trực tiếp tham gia các phản ứng trong chuỗi phản ứng
tạo ra enzym.
Toàn bộ quá trình tổng hợp enzym gồm bốn giai đoạn:
- Hoạt hóa các axit amin
- Giai đoạn khởi đầu
- Giai đoạn tạo liên kết pept.it (còn gọi là giai đoạn kéo dài)
- Giai đoạn kết thúc quá trình tổng hợp
CÔNG NGHỆ ENZYM 207

1‘ Giai đoạn hoạt hóa axit amin

Quá trìn h này dược thực hiSn trong tế bào châ't. Trong tế bào có ít
nhất 20 loại tRNA và 20 loại enzym tương ứng với 20 axit amin khác nhau.
Mỗi một axit amin được hoạt hóa bởi một loại enzym. Các enzym này có
chứa vitamin B12 hay có chứa một số nhóm SH trong trung tâm hoạt động.
Trong các enzym có ba trung tâm liên kết với axit amin, tRNA, và AMP.
Phản ứng xảy ra qua hai bước:
Bước 1: Axit amin sẽ kết hợp với ATP, enzym tạo ra một phức hợp rất bền
R - CH - COOH + ATP + E ---- > R - C H - C O - AMP - E + H4P20 7
I
nh2 nh2

Phửc hợp enzyme - aminoaxíi - AMP

Trong phức hợp E - aminoaxil - AMP nhóm -C O - của axit amin sẽ

kết hợp vào vị trí số 5 photphat của AMP nhờ liên kết anhydric,
Bưởc 2: Phức hợp E - aminoaxil - AMP sê kết hợp với tRNA, chuyển
gốc aminoaxil từ AMP đến tRNA và giải phóng enzym AMP.
R -C H -C O - A M P-E+tRN A Mg2< > aminoaxil- tRNA + AMP + E
NH2
Gốc axit amin sẽ kết hợp với nhóm OH ở vị trí 3’ của nucleotit cuối
cùng trong phân tử tRNA.
NHg

Hình 6,13: Phức hợp aminoaxil - tRNA

208 CHƯƠNG 6

Quá trìn h trên có sự tham gia của enzym: Aminoaxil - tRNA -

sintetase. Enzym này có tính đặc hiệu rấ t cao với axit amin và tRNA.
2- Giai đoạn bắt đầu quá trình tổng hợp
Giai đoạn này kéo dài qua ba bước
Bước 1: Phân tử mRNA sẽ kết hợp với điểm 30S của ribosome. Trong
đoạn mRNA kết hợp với ribosome có chứa mă tương ứng của focmil
metionin là AƯG.
Bước 2: Phức hợp này sẽ kết hợp với focmil metionin - tRNA (f.met -
tR N A ^ t) tạo thành phức hợp mở đầu. Như vậy phức hợp mở đầu sẽ là:
<tiểu phấn 30S - mRNA - f.met - tR N A ^iet)

Trong phức mở đầu này sẽ tạo thành liên kết hydro giừa bộ ba AƯG
và đối mã tương ứ ng của nó trong phân tử tRNA^et.
Bước 3: Phức mở đầu sẽ kết hợp với tiểu phần 50S của ribosome và sẽ
tạo thành ribosoine 70S, gọi là phức mơ đầu 70S.
H
I
0=0 Hưóng dịch chuyến
của ribosome
1
CH3- S - C H 2-C H 2- C H ^ ^

\ UAX /
{ AUG
. . . NKI —OH
Đầu 5' của ----------------------------------- Đầu 3 'của mRNA
Hình 6,14: Phức mở đầu 70S
Trong giai đoạn này tRNA đóng vai trò rấ t quan trọng. Mỗi một axit
amin cần một tRNA. Chức năng của tRNA như sau:
- Vận tải axit amin đã được hoạt hóa
- Giảiphóng axit amin đã được hoạt hóa k h ỏ i enzym tham gia hoạt
hóa
- Phân bố các axit amin này vào phân tử protein enzym mới sẽ được
tạo thành.
Trong giai đoạn này còn có các yếu tố bắt đầu (imitiatation factors).
CÔNG NGHỆ ENZYM 209

Các yếu tô' bắt đầu đó được ký hiệu là IF j, IF2 và IF3.

Các yếu tố bắt đầu này là những protein được hấp thụ trên bề mặt của
ribosome. Các yếu tố này sẽ tách ribosome 70S thành hai tiểu phần 50S và
30 s. Các tiểu phần này sẽ tham gia tiếp tục theo trình tự như trình bày ờ
trên.
* IFj có trọng lượng phân tử 8000 - 9000 dalton.
* IF2 có trọng lượng phân tử 75.000 dalton.
* IF3 có trọng lượng phân tử 21.000 - 29.000 dalton.
Vai trò của từỉig yếu tô" bắt đầu như sau:
- IF3 làm nhiệm vụ kết hợp tiểu phần 30S với mRNA
- IFj làm bền phức hợp rnRNA với tiểu phần 30S
- IF2 đảm bảo nầng lượng cho giai đoạn mở đẩu.

3- Giai đoạn kéo dài

Trong giai đoạn này, các axit amin lần lượt được ghép nôi với nhau bời
liên kết peptit vào đúng vị trí ìnà nó được mã hóa từ bộ ba nucieotit trong
DNA.
Quá trình lắp ráp các axit amin tạo thành polypept.it nhờ liên kết
peptit phải trải qua nhiều bưđc và có sự tham gia của nhiều yếu tô kéo dài
(elonghgation factor). Có tất cá 3 yếu tố.
* Yếu tô' G
* Yếu tố Ttl (chữ u trong tiếng Anh có nghĩa là không bền - unstable)
* Yếu tố Ts (chữ s trong tiếng Anh có nghĩa là bền - Stable)
* Yếu tố Tu thường không bền nhiệt còn yếu tố Ts lại bền nhiệt. Các
yếu tố này tham gia vào quá trình kết hợp aminoaxiỉ - tRNA mới và
ribosome.
Trước tiên, Tu sế kết hợp với GTP tạo thành phức hợp Tu - GTP. Sau
đó phức hợp này sẽ kết hợp với aminoaxit - tRNA có chứa đối mã tương ứng
với mã thứ 2 trong phân tử mRNA và tạo thàn h phức hợp bền (aminoaxiỉ -
tRNA -Tu - GTP). Phức hợp này sẽ chuyển aminoaxiỉ - tRNA đến ribosome
và giải phóng Tu - GTP.
* Sau đó Ts tác dộng vào quá trìhn giải phóng Tu . Tu lại tiếp tục
tham gia vào quá trình.
* Yếu tố G tham gia vào quá trình chuyển vị trí của peptỉdiỉ tRNA từ
vị trí A sang vị trí p của ribosome. Yếu tố G là một loại protein nằin trong
210 CHƯƠNG 6

tiểu phần 50S của ribosome. Trong ribosome, 7 - met -tUNAjnet ở vị trí A
phải được chuyền sang vị trí p của ribosome. Những vị tri A cho aminoaxil
- tRNA mới vào đó. Sau đó là quá trình liên kết gi ứa axit amin của hai
aminoaxil - tRNA đang ở vị trí A và vị trí p trong ribosome. Khi đó liên
kết peptit được tạo thành giữa nhóm cacboxyl của 7 - met và nhóm amin
của a x it a m in th ứ h a i. N h ờ đó liê n k ế t e ste r giữa 7 - m e t và tR N Ajnet sẽ bị

cắt đứt. Quá trình này do enzym peptidiltransferase xúc tác. Enzym này là
một thành phần trong tiếu phần 50S cua ribosome.
Khi hai axit amin được liên kết với nhau thành dipeptidil - tRNA, hợp
chất này sẽ lại được chuyến về vị trí p, giải phóng vị trí A cho việc kết hợp
với một aminoaxit - tRNA thứ 3. Quá trình chuyển dipeptidil - tRNA từ vị
trí A đến vị trí p rất cần yếu tô" G. Quá trình chuyển vị trí này đồng thời
xảy ra với quá trình đẩy tRNA^et ra khỏi vị trí p. Khi đó ribosome trượt
một bước dài trên mRNA khoảng 1 codon về phía đầu 3 của mRNA,
t.RNA^pt được tách ra khỏi ribosome.
ơ vị trí p có gắn dipeptidil - tRNA, ở vị trí A không có một chất nào
và sẵn sàng cho việc gắn aminoaxil - tRNA thứ 3 với sự tác động của yếu tố
kéo dài T, GTP.
H (1)
I NH
c =o
- CO-CH - R
NH
Vị trí A ư,u, ARN

mARN

NH NH
CHr-R.

Hình 6.15: Quá trình tạo polypeptit ở ribosome

CÔNG NGHỆ ENZYM 211

4- Giai đoạn kết thúc

Peptidil

(RF)
O.GTP

ribosom mã vô nghĩa UAA VỚI ribosom để trả lời với rtiã

được đưa vào ribosom chấm dứt I

Pbân tử enzim đã được

3 - Thủy phân liẻn kết giữa

peptidil và ARN giải phóng
chuồi polipeptit
Hình 6.16: Quá trình kết thúc tổng hợp enzym
Ribosome sẽ trư ợ t trên mRNA mỗi một bước trượt ứng với một bộ ba
nucleotit. Quá trình này sẽ xảy ra liên tục cho đến khi nào gặp được một
trong những bộ ba vô nghĩa uAA, uAG và uGA. Những bộ ba này hoàn toàn
không mã hóa cho một axit amin nào và như vậy quá trìn h tổng hợp enzym
sẽ được kết thúc.
Quá trình tống hợp được xem như kết thúc khi nào chuỗi polypeptit
tách ra khỏi ribosome.

6.7 Cơ CHẾ ĐIỂU HÒA SINH TỔNG HỢP ENZYM

Các tế bào của sinh vật đều tuân theo một qui luật trao đổi chất. Qui
luật đó là: trong quá trình trao đổi chất, tế bào luôn luôn tìm cho mình một
con đường kinh tế n h ất và hài hòa nhất.
Tham gia vào các quá trình trao đổi chất đó, enzym cũng không the át
ra khỏi qui luật trên. Hoạt tính của enzym hay sự tạo thành các enzym
cung phải tuân theo qui luật đó. Điều này được thực hiện bởi hai cơ chế:
- Điều hòa hoạt tính enzym.
212 CHƯƠNG 6

- Điều hòa sự tổng hợp enzym.

Điều hòa hoạt tính enzym chính là sự điều hòa bởi các chất kìm hảm,
các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym.
Điều hòa số lượng enzym được tổng hợp trong tế bào cóthể được thực
hiện theo nhiều cách khác nhau thồng qua điều hòa hoạt động của gen dưới
tác dụng của các phân tử thấp. Những phương thức điều hòa đó được thực
hiện như sau.
6.7.1 Đ iều hòa theo k iểu đóng, mở gen thực h iện (operator)
1- Trong quá trình sinh tổng hợp enzym xảy ra hiện tượng sản phẩm
cuối của p h ả n ứng gây ức c h ế h a y gây trấn á p (repression) là m cho tế bào
không có khả năng tạo ra enzym tham gia quá trình tạo ra sản phẩm này
nữa.
Ví dụ: Nếu ta đưa một axit amin nào đó vào trong môi trường nuôi cấy
vi sinh vật sẽ dẫn đến hiện tượng tế bào vi sinh vật không cần tổng hợp ra
axit amin này nữa. Từ đó tế bào không cần phải tiến hành quá trình sinh
tổng hợp ra enzym này. Quá trình tổng hợp này chỉ được phục hồi khi nào
cơ thể thiếu axit amin đó.
2- Trong trường hợp sản phẩm tạo ra không phải chỉ có một loạỉ duy
nhất mà là nhiều sản phẩm thì hiện tượng trân áp xảy ra rấ t phức tạp. Khi
đó mỗi sản phẩm của quá trình tổng hợp enzym. Trong thời gian gần đây,
các nhà khoa học lại cho rằng cơ chế trấ n áp trong trường hợp này do
aminoaxil - tRNA tạo ra.
3- Điều hòa cảm ứng: Điều hòa trấn áp là làm giảm hoạt tính cúng
như làm giảm quá trình sinh tổng hợp enzym. Ngược lại điều hòa cảm ứng
là làm tăng hoạt tính và sinh tổng hợp enzym.
Trong tế bào vi sinh vật tồn tại hai loại enzym. Một loại luôn luồn
được tổng hợp ra, không phụ thuộc vào chất mà chúng tham gia phản ứng.
Mội loại chỉ dược tạo ra với số lượng nhỏ nếu không có m ặt chất mà chúng
tham gia phản ứng. Khi ta cho chất tham gia phản ứng (gọi là cơ chất) vào
môi trường, sự tạo th àn h enzym sè tăng rấ t nhanh. Monod và Cohn (1952)
gọi loại enzym này là enzym cảm ứng; chất mà enzym này tham gia phản
ứng gọi là chất cảm ứng. Còn hiện tượng làm tăng quá trìn h sinh tổng hợp
này gọi là hiện tượng cảm ứng.
CÔNG NGHỆ ENZYM 213

Bảng 6.4: Sinh tổng hợp enzym cãm ứng ở một sỏ vi sinh vật
Tấng hoạt tỉnh của
STT Vi sinh vật Enzym càm ửng Cơ chất cam ung
enzym (%)
Tinh bột 100
1 Asp. oryzae 153 «-amy!ase
Mantose 200
Mantose 100
2 Asp. oryzae « -a m y la s e Isom antose 176
Pentose 176
NaNOg 2
3 Asp. níger Protease axit
Protein đậu nành 125
Pectin 100
4 Asp. niger Pectinase
Pectin + lactic 250
Protease Lông, móng 100
5 A ctinom yces fradiae
elastase Kiratinase Protein đậu tương 300

elastase elastin 0
Khô dấu đậu
0
6 Actinom yces albus phộng
colagenase
Cazein 100
Khô dầu đặu tương 150

Hiện tượng cám ứng thường thấy ở vi sinh vật vi khi ta cho chất cảm
ứng vào môi trường nuôi cây, các tê bào vi sinh vật sè trực tiếp bị ánh
hương và có nhừng phan ứng bằng các quá trình sinh hóa ngay lập tức và
xáy ra rát mành ìiệt.
Các nhà khoa học cũng cho thấy hiện tượng cảm ứng chỉ xảy ra đối với
nhừng enzym thủy phần. Các enzym cảm ứng dễ nhận biết nhâ't bao gồm:
protease, amylase, pectinase, penicilinase. p - galactosidase ... Khi người ta
cho các cơ chất tương ứng của các enzym này vào môi trường, sự tổng hợp
của các enzym tăng rất nhanh.
Cơ chế cảm ứng có tính chất dây truyền. Trong trường hợp quá trình
phản ứng bao gồm rất nhiều phản ứng khác nhau theo một dây truyền thì
chât cảm ứng ban đầu có ảnh hưởng tới toàn bộ hệ thông. Cơ chế này được
thực hiện như sau:
Đầu tiên, chât cảm ứng ban đầu sẽ tạo ra hiện tượng cảm ứng của
enzym đầu tiên, phán ứng của enzym đầu tiên sẽ tạo ra sản phẩm đầu tiên.
Sán phẩm đẩu tiên này lại là chất cảm ứng cho phản ứng tiếp theo và cứ
như vậy tạo ra cá một dây truyền cảm ứng và tổng hợp cảm ứng.
214 CHƯƠNG 6

Toàn bộ cơ chế tổng hợp cảm ứng enzym được giải thích bằng thuyết
operon của Monod và Jacob. Thuyết operon được trìn h bày theo H.6.17.
ADN
n u
Sao chép mã

mARN

Phiên mã

R - gen điểu hòa

p - gen prom otor
o - gen operator
s v s2. s3 - các gen cấu trúc
(1) repressor
(2) ỊZZ] corepressor (sàn phẩm cuối cùng của quá trình phản t'/ng - D)
(3) ^ * ARN - polimerazal A, B, c, D - cơ chất và sản phẩm trung gian
của quá trinh phản ứng do các enzym E,, E,, E3, E<J xúc tác

Hình 6.17: Sơ đồ minh họa cơ chế trấn áp sinh tổng hợp enzym bởi sản
phẩm cuối cùng
Phân tử DNA trong nhiễm sắc thể được chia ra nhiều loại gen khác
nhau. Trong đó có những gen quan trọng như sau:
a) Gcn cấu trúc (structure gene). Gen này đảm nhận tổng hợp protein,
enzym. Các gen cấu trúc được sắp xếp liền nhau trên DNA và có khả năng
điều khiển sự tổng hợp một loại protein hay enzym n h ất định.
b; Geri thực hiện {ọperator). Gen này sè gắn với chất ức chế. Nhờ tác
dụng ức chế, gen thực hiện làm việc như một rơle để điều khiển các gen cấu
trúc.
c) Gcn promotor, là vị trí gắn enzym RNA - polymease xúc tác việc
tổng hợp RNẨ. Gen này đứng trước gen operator nên chất ức chế gắn vào
gen operator, RNA - polymease sẽ bị ngăn chặn không di chuyển theo sợi
xoắn kép DNA được. Khi đó các gen câu trúc bi kìm chê và enzym khồng
được tạo thành. Gen promotor không phụ trách việc tổng hợp một e n z y m
n hất định nào mà nó chỉ là vị trí gắn RNA - polymease. Từ đó bắt đầu sự
sao chép để tRNA hình thành. Do đó, gen promotor còn được gọi ỉà gen
khới điếm.
CÒNG NGHỆ ENZYM 215
4r

d) Gen điều hòa (Regulator)

Gen này mã hóa cho một loại protein đặc biệt gọi là chất trấn áp
(represson). Chât trân áp có vai trò “đóng, mở” gen operator. Do đó gen
điều hòa có thế kiêm tra quá trình sao chép gen câu trúc thông qua chất
trấn áp này.
Trong phân tử của chất trân áp có chứa trung tâm liên kết đặc hiệu
với gen operator và với chất điều hòa. Trong trường hợp điều hòa tổng hợp
enzym theo cơ chế trấn áp, represson do gen điều hòa tống hợp nên còn ở
dạng không hoạt đ ộ n g (aporepresson), chưa có khả năng liên kết với
operator nên quá trình sao chép các gen câu trúc tiến hành bình thường.
Các enzym được tổng hợp xúc tác cho các phản ứng, dần đến sự tạo thành
sản phẩm cuối cùng. Sản phẩm cuối cùng sê kết hợp với aporepresson và
hoạt hóa chúng.
Aporepresson đá được hoạt hóa sẽ kết hợp với operator ngăn cản quá
trình sao chép các gen cấu trúc, làm ngưng việc tổng hợp mRNA tương ứng,
đó làm ngưng quá trình tống hợp enzym. Trong trường hợp này, sân phẩm
cuôi đóng vai trò như một corepressor.

R p o s, s2 s3 ADN

I mARN
N /\y N

E.r Ei| E3>

: Chất cảm ứng các ký hiệu khác giống như hình I - 22)

Hình 6.18ĩ Sơ đồ minh họa cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzym
216 CHƯƠNG 6

Trong trường hợp cảm ứng, represson được tống hợp đã ở trạng thái
hoạt động, chúng sẽ kết hợp với gen operator. Quá trình sao chép mà cùa
gen cáu trúc bị bao vây. Các enzym tương ứng không được tống hợp.
Sau khi kết hợp với chất cảm ứng, represson sè inât khả nãng hoạt
động và sẽ tách khỏi operator. Quá trình sao chép mả được bắt đầu. Hiện
nay người ta đã tách được một sô' represson và nghiên cứu rấ t kỹ bản chât
hóa học của chúng, Ví dụ, Riggs, Suzuki Bourgeois đã tách được Lac.
represson. Các tác giả cho biết trọng lượng phân tử của chúng từ 140.000 +
150-000. Chúng có cấu trúc bậc 4 bao gồm 4 tiều đơn vị giông nhau. Mỗi
tiếu đơn vị có trọng lượng phân tử 37.200 bao gồm 347 gốc axit amin.
6 .7 .2 Đ iể u h ò a tư ơ n g t á c g iữ a R N A - p o ly m e a s e v ớ i g e n o p e r a t o r
Quá trình tổng hợp euzym cảm ứng không chi chịu tác động bởi CƯ chê
cảm ứng mà còn chịu tác động bởi nhiều cơ chế khác, trong dó có tác động
của AMP vòng (AMPV), AMPV có tác dụng kích thích quá trình sao chép
mă của các operon phân giải.
Tác dụng kích thích của AMPV đổi với quá trìn h sao chép mã được
thực hiện nhờ một protein đặc biệt làm trung gian gọi là protein nhận
AMPV hay còn gọi là protein hoạt hóa gen phân giải, viết tá t là GAP.
{Catalcolite gcnc Activator Protein).
Khi AMPV kết hợp với CAP tạo thành phức hợp có tác dụng hoạt hóa
gen operator làm cho RNA - polymease dề dàng kết hợp với chúng để bắt
đầu sao chép mã. Như vậy, AMTV có tác dụng làm tăng quá trình sao chép.
Glucose và một số đường khác khi thêm vào môi trường nuỏi cấy vi
khuẩn sè làm giảm lượng AMPV trong tế bào, do đó làm giám quá trình
sinh tổng hợp nhiều enzym cảm ứng, ngay cá khi có chất cám ứng trong
môi trường.
Hiện tượng này gọi ià hiệu ứng glucose.

6.8 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT THU NHẬN ENZYM HÒA TAN

Phần lớn các loại enzym là protein hòa tan. Các enzym được sàn xuât
theo qui mô công nghiệp là những eazyin hòa tan. Khái niệm “enzym hòa
tan” cũng không hoàn toàn chính xác vì trong nhiều trường hợp enzym
hoàn toàn không hòa tan, ví dụ như khi enzym còn trong tế bào vi sinh vật
thì chúng ở trạng thái không hòa tan. Khái niệm này dùng đề phân biệt
loại enzym không hòa tan được tạo ra từ enzym loại hòa tan này.
CÔNG NGHỆ ENZYM ‘217

Trong công nghiệp sản xua't enzym, trên th ế giới đang tiến hành hai
phương pháp: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cây chìm.
6.8.1 Phương pháp nuôi cấy bề m ặt

i- ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt

Phương pháp nuôi cây bề m ặt là phương pháp nuôi cây vi sinh vật đã
được nghiên cứu và phát triển râ't mạnh mẽ trong những năm đầu của th ế
kỷ XX. Sau đó, phương pháp nuôi cây chìm được thay thè vào nhừng năm
50 - 60 của th ế ký trước. Phương pháp nuôi cấy bề m ặt là phương pháp tạo
điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, phương pháp
này lại được phục hồi rất mạnh từ nhừng năm 1970 đến nay.
• Nhừng ưu điềm cơ bản của phương pháp nuôi cây bề mặt là:
1- Nuôi càv bề mặt rất dẻ thực hiện. Qui trình công nghệ thường
không phức tạp. Thực chát của phương pháp nuôi cây bề mặt theo qui mô
công nghiệp được xuât phát từ các quá trình lên men truyền thống ở các
nước, ơ đó, người dân đã biết sử dụng khu hệ /i sinh vật tự nhiên. Người
ta chi cần náu (hoặc hảp> các nếuyên liệu, đế nguội và khi đó vi sinh vật
trong không khí sè rơi xuống khôi nguyên liệu, tự chúng phát triển tuân
theo qui luật cạnh tranh trong thiẻn nhiên. Những giông vi sinh vật nào có
khá năng trao (lối c h â t m ạ n h , có k h ả nã n g ph á t triể n m ạ n h sẽ lấn á t các
vi sinh vật khác. Và như vậy, người ta đã đột nền móng cho sự ra đời của
công nghẹ miỏi cấy bề lĩìặt được trình bày trong phần sau.
2- Lượng enzym được tạo thành từ nuôi cấy bề m ặt thường cao hơn rất
nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng giải
thích tại sao phương pháp nuôi cây bề mặt hiện nay phát triển mạnh trơ
lại.
3- Chế phâin onzyni thô (bao gồm thành phần môi trường, sinh khôi vi
sinh vật, enzym và nước) sau khi thu nhận rất dề sây khô và dễ bảo quản.
4- Nuôi cây bề m ặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó
việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tôn
kém.
5- Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rấ t dễ dàng xử lý.
Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào
bị nhiềm ta chì cần loại bò khu vực đó khỏi toàn bộ khôi nuôi cây. Những
khu vực khác sẻ hoàn toàn được an toàn.
* Phương pháp nuôi cấy bề m ặt cũng có những nhược điểm cần quan
tâm đế khắc phục và hoàn thiện dần phương pháp này.
218 CHƯƠNG 6

1- Nhược điếm thứ nhất dề nhận biết đó ià việc phải có diện tích rất
lớn khi thực hiện phương pháp này. Trong phương pháp này, vi sinh vật
phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lòng và mỏi trường bán rắn)
nên rất cần nhiều diện tích. Trong nhừng năm gần đây, người ta đà cải
tiến các thiết bị đề vi sinh vật có thề phát triển ở 4 m ặt (nơi tiếp xúc giữa
môi trường và không khí). Những thiết bị này được thiết kế như một hình
hộp dứng có kích thước trung bình như sau:
Chiều cao 1,2 - l,4m; chiểu ngang 0,8 - l,0m; chiều dày 10 - 12cm (0,1 - 0,2m).
Môi trường sau khi thanh trùng được trộn giống vi sinh vật và cho vào
những hộp này. Cả bốn phía m ặt ngoài của hộp phải có độ thoáng khí nhất
định, Iihờ đó giông vi sinh vật, n hất là nám sợi, sè phát triển rất mạnh ờ
bốn phía của hộp. Bằng cách cải tiến này, vi sinh vật phát triển rất mạnh
và ta đã tiết kiệm được ít nhất 1/2 diện tích nuôi cấy.
2- Phương pháp nuôi cấy bề m ặt khó cơ giới hóa, tự động hóa.
2- Kỳ th u ậ t nuôi cấy bề mặt
Kỳ thuật nuôi cây bể m ặt với môi trường bán răn
a) Nguyen liệu: N g u y ê n liệu sử dụng trong nuôi cấy bổ mặt thường là
ahửng nguyên liộu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô
manh (bap manh), đậu nành và các loại ngũ cốc khác. Trong các loại
nguyên liệu trên, cám gạơ, cám mì thường được sử dụng nhiều hơn cã. Hai
loại cám này cổ đầy đủ các chát dinh dường cần thiết cho vi sinh vật phát
triển. Mặt khác khi tạo mòi trường, chúng thường có tính chất vật lý rât
thích hợp (lò vừa đám bào khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng
không khí lưu chuyên trong khối nguyên liệu.
T r o n g nhiêu trường hựp, đ ê tạo k h ả năng thoáng k h í t ố t h ơ n , người ta
thường cho thêni trâu với ỉượng khoảng 20 - 25ck. Thực chất việc cho trấu
vào là làm tàng độ xôp cùa môi trường, tạo nèn những khoảng trống đê
k h ô n g k h í có t h ể lưu t h ô n g t r o n g l ò n g m ô i t r ư ờ n g . C h í n h V) t h ế ta th ấ y
ràng vi sinh vật không chí phát triển trên bề mặt môi trường mà còn phát
triên rât mạnh trên bề m ặt hạt môi trường. Hay nói cách khác, vi sinh vật
phát triển ở giữa pha rắn của môi trường và pha khí của môi trường. Trong
trường hợp này vi sinh vật có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi
trường nhưng nó vần hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trìn h nuôi cày bê
mặt.
Trong trường hợp ta nuôi cây vi sinh vật đế thu nhận enzym cellulase,
trâu không chỉ có ý nghĩa như một chất độn làm tăng khả năng thoáng khí
CÔNG NGHỆ ENZYM 219

mà chúng còn được sử dụng như một cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của
enzym cellulase. Cũng tương tự như vậy, khi nuôi cấy vi sinh vật để thu
nhận enzym pectinase, người ta thường cho vào cám bột cà rốt (bột cà rôt
chứa nhiều pectin) như châ't cám ứng để làm tăng quá trình sinh tổng hợp
enzym này. Khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận protease, người ta cho
thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành như những cơ chất cảm ứng cho sự
tổng hợp của protease.
Bảng 6.5: Thành phần dinh dường của cám
1 Năng lượng 350 - 426 KCal 7 Tro 6.0 - 6.5%
2 Nước 12% - 14% 8 Canxi 30 - 32 mg.%
3 Protein thò 10 - 12,2% 9 Photpho 4,5 - 4.6 mg.%
4 Lipit 20 - 22.7% 10 Sát 10 -1 4 mg.%
5 Gluxit tổng số 40,3 - 42% 11 Vitamin B1 0,96 • 1 mg.%
6 Cellulose 6,3 - 7%

b) Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Trong quá trình chuẩn bị môi trư ờ n g ,
điều quan trọng nhất là tạo được độ ấm thích hợp. iĐộ ẩm thích hợp cho
n h i ề u vi s i n h v ậ t k h i n u ô i c ây t r o n g m ô i t r ư ờ n g c á m l à 6 0 c/c w . Độ á m vư ợt
quá 60% w thường tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn phát triển, khi đổ dễ
xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ. Nêu độ ẩm < 60^ w (thường 45 - 50rr W)
thường gây hiện tượng tạo nhiều bào từ ở nấm sợi, và như vậy hoạt tính
enzym sẽ giám rất mạnh.
Trường hợp cần tạo giông trung gian, ta nên tạo độ ấm Iĩìỏi trường
khoảng 45 - 50% w . Trong suốt quá trình nuôi cây đề thu nhận enzyin, ta
cần duy trì độ ấm khoảng 50 - 60 c/cW và độ ẩm không khí 95 - 100'/ w.
Sau khi chuẩn bị xong môi trường, ta tiến hành thanh trùng môi
trường đề tiêu diệt các vi sinh vật nhiễm vào môi trường mà có thế ức chế
sự phát triển của giống vi sinh vật mà ta quan tâm. Người ta thường thanh
trùng bằng hơi nước nóng ở 1 - 1,5 at trong thời gian 45 - 60 phút. Đê
thuận lợi cho việc thanh trùng có hiệu quá cùng như tạo điều kiện thích
hợp cho nâm sợi phát triển, trước khi thanh trùng, người ta thường dùng
axit clohydric hay axit sulfuric đế điều chinh pH môi trường.
Sau khi thanh trùng, môi trường được làm nguội và người ta bắt đầu
nuôi cấy đế thu nhận enzym.
c) Kỹ thuật nuôi cấy: Môi trường được trải đều ra các khay với chiều
dày 2 - 3cm và tiến hành trộn giông vi sinh vật vào khôi môi trường sao
cho th ật đều.
Giống vi sinh vật thường được nuôi cấy riêng ở phòng thí nghiệm hay
220 CHƯƠNG 6

các phân xưởng nhân giống hoặc là giống thương phẩm có bán ở các nơi
cung cấp giống. Các loại giống này thường chứa nhiều bào tử. Khi cấy vào
môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào vi sinh vật và tạo
ra các loại enzym mà ta mong muôn. Tỷ lệ giông đưa vào nuôi cấy thường
vào khoảng 0,5 - 20% so với khối lượng của môi trường.
Sau khi đã trộn giông, các khay chứa môi trường sẽ được đưa vào
phòng nuôi cấy, đặt trê n những giá đỡ. Các giá đờ này được th iết kế sao
cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có
hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.
Nhiệt độ thích hợp cho tuyệt đại đa số nâin sợi ỉà 28 -32°c. Nhiệt độ
tháp quá hoặc cao quá đều không có lợi cho nấm sợi phát triển.
Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi
trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự-thay đổi pH ở một vùng nào đó ít
khi ảnh hưởng đến toàn bộ khôi môi trường.
Thời gian nuôi nârn sợi để thu nhận enzym vào khoảng 36 - 60 giờ.
Điều này còn phụ thuộc vào giông vi sinh vật và vào điều kiện môi trường
cũng như phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi
bằng phương pháp bề m ặt trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1. Giai đoạn này kéo đài 10 - 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu
nuôi cấy. ơ giai đoạn này có những thay đổi sau:
- Nhiệt độ tăng rất chậm.
- Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
- Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
- Khôi môi trường còn rời rạc.
- Enzym mới bắt đầu được hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt
đối không được đưa nhiệt độ cao quá 30° 0 vì thời kỳ đầu này giông rất
mần cảm với nhiệt.
Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14 - 18 giờ. Trong giai
đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:
- Toàn bộ bào tử đả phát triển thành sơi nấm và sơi nấm bắt đầu phát
triên rât mạnh. Các sợi nam này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp
trong các h ạt môi trường, trong lòng môi trường.
Trong giai đoạn này, ta có thể hoàn toàn nhin rõ các sợi nâm có màu
trắng xám bằng m ắt thường.
CÔNG NGHỆ ENZYM 221

* Môi trường được kết lại khá chặt.

* Độ ẩm môi trường giảm dần.
* N hiệt độ môỉ trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40 - 45° c.
* Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa m ạnh của
nám sợi.
* Các loại enzym được hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng
trội hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn.
* Lượng oxy trong không khí giảm và C 02 sẽ tăng dần, do đó trong
giai đoạn này cần phái được thông khí m ạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì
trong khoảng 29 -30°c là tốt nhát.
Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 - 20 giờ. Ở giai đoạn
này có một sô' thay đổi cơ bản như sau:
- Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh
dường sẽ chậm lại.
“N hiệt độ của khôi môi trưộng giảm, do đó làm giảm lượng không khí
môi trường xuống còn 20 - 25 thể tích không k h í / t h ể tích phòng nuôi cấy/1
giờ. Nhiệt độ nuôi duy trì ỏ 30°c. Trong giai đoạn này, bào tử được hình
thành nhiều do đó lượng enzym sê giảm. Chính vì th ế việc xác định thời
điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết.
Hoạt động Nhiệt Sinh dinh

H ìn h 6.19: Sự phát triển của nấm sợi trong nuôi cấy bề mặt
Có ba phương pháp nuôi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt.
222 CHƯƠNG 6

* Phương pháp nuôi trên khay

^ ~ __ __ ^ Môi trường
I/WVA/WN/VV'^'^^A/S/X/Wvyrif-- nùô\ CT

.yỉ/VƯX/VA/X/V^^^A/^X/VVvVV.

■t/l/l/xA/vxA/V'/^-'Vv/v'Nyvvwv, Khay

n /l/l/v A /N A A y v ^ ^ - ^ V v v /x /v v v x /v .
giá đỡ

Giá đỡ thường có chiều cao khoảng 1,8 - 2m

Khoảng cách giữa các giá đỡ là 0,2 0,25m
Khay có kích thước dài: 1,0 l,2m
rộng: 0,8 - l,0m
cao 5 + 7cm
Phía dưới đáy các khay có đục ỉỗ để không khí dề lưu thông.
* Phương pháp nuôi trong hộp

o
oo Ọọ 0 °0
o 9 o
oo ọ o 9 o Lỗ thoảng khí

oo o o 9 o
oo ọ oo 9So
oo ọ o 9 oo
oo ọọ s R o
oo ọ 0 9 °
oo o
oo
Thiêt kê và chế tạo ra các hộp bằng nhôm có kích thước như sau: chiều
cao 1 +l,2m, chiều rộng 0,6 -ỉ- 0,8m, chiều dày khoảng 5 + 7cm. Xung q u a n h
hộp có đục lồ vừả nhỏ sao cho môi trường không bị thoát ra ngoài. Những
CÔNG NGHỆ ENZYM 223

lổ này có tác dụng thông khí. Vi sinh vật sẽ phát triển đều ở tấ t cả các mặt
có tiếp xúc với không khí. Các hộp này sè được xếp đ'íng cách nhau một
khoảng là 20m. Hệ thống nuôi này đảm bảo sự thông khí dễ dàng và sự tỏa
nhiệt rất tốt.
* Phương pháp nuôi trong thùng quay

Trong hệ thông thùng quay bô trí một hệ thông thổi khí liên tục.
Không khí vô trùng dược cung cấp vào trong thùng quay hình tang trông có
chứa môi trường và vi sinh vật giông. Phương pháp nuôi này rấ t có hiệu
quả vì quá trình cung cấp oxy, giải nhiệt, giữ độ ẩm hoàn toàn có thề thiết
kê tự động. Thời gian nuôi giảm rấ t nhiều so với những phương pháp trên.
Kết thúc quá trình nuôi để thu nhận enzym theo phương pháp nuôi
trên bề m ặt trên mối trường bán rắn thường vào thời điểm nấm mốc bắt
đầu tạo bào tử.
d) Thu nhận sản phẩm: Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được
chê phẩm enzym. Chê phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài
thành phần enzym ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần
môi trường và nước có trong môi trường).
Tùy theo mục đích sử dụng, ta có thể dùng chế phẩm thô này ngay
không cần qua quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết
khác, ta phải tiến hành làm sạch enzym. Khi enzym được tách hết nước,
sinh khối vi sinh vật và thành phần môi trường và chúng ở d ạ n g tinh thể,
ta thu được chế phẩm enzym sạch. Chế phẩm enzym này còn gọi là chế
phẩm enzym tinh khiết.
Để đảm bảo cho chê phẩm enzym thô không m ất hoạt tính nhanh,
người ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp. Độ ẩm cần
đạt được s a u khi quá trình sấy kết thủc là < 10% w . Để đảm bảo hoạt tính
enzym không thay đổi, người ta thường sây enzym ở nhiệt độ 38 -ỉ-40oC. Ở
nhiệt độ này phần lớn enzym ít bị biến đổi. Còn nếu ta sấy ở nhiệt độ cao
quá 40°c, enzym rấ t dễ bị biến tính. Do đó, điều kiện nhiệt độ trong quá
trình sây phải được thực hiện tuyệt dối chính xác.
224 CHƯƠNG 6

Đề sản xuất enzym tinh khiết người ta tiến hành như sau:
Toàn bộ khối lượng chế phẩm enzym thỏ được đem đi nghiền nhỏ. Mục
đích của quá trình nghiền ỉà vừa phá vờ thành tế bào vừa làm nhỏ các
thành phần cùa chẽ phẩm thỏ. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzym
nội bào và cả enzym ngoại bào chưa thoát ra khỏi tê bào sẽ dễ dàng thoát
khỏi tế bào. Mặt khác, phần ỉớn enzym ngoại bào khi được tổng hợp và
thoát ra khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường đặc.
Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát khỏi các thành phần này dễ dàng hơn.
Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền để
làm tăng mức độ nghiền. Các chất trợ nghiền trong trường hợp này được
dùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ
không tham gia vào phẩn ứng và có khả nâng tăng mức độ ma sát. Trước
khi sử dụng, cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở
nhiệt độ > 100° c để loại nước và tiêu diệt vi sinh vật*
Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym. Các loại
enzym thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng
nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người
ta cho bốn đến năm phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bă
thu riêng dùng làm thực phấm gia súc.
Dịch thu nhận được vẫn ớ dạng chế phẩm enzym thô, vì trong đó còn
chứa nước, các chât hòa tan khác từ khôi mỏi trường nuói cây. Việc tiếp
theo ià làm sao táybh enzym ra khỏi những vật chất này.
Để làm được điều đó, nguời ta phái tiến hành kết tủa enzym nhờ
những tác nhân gây kết tủa. Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta
thường dùng cồn và sulfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dề tìm kiêm và
giá rẻ so với những tác nhân gây kết tủa khác.
Trước khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch
enzym thô và cả những tác nhân kết túa dể tránh làm m ất hoạt tính
enzym. Khi đố chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết
sức từ từ đề trán h hiện tượng biến tính.
Trong quá trình kết tủa ta dùng C2H5OH (cồn) hoặc sulfat amon với
liều lượng như sau: cứ một phần dung dịch enzym thô, người ta cho 2 đến
2,5 lần cồn hoặc sunfat amon.
Khi cho chất tạo kết tủa vào dung dịch enzym thô, người ta tiến hành
khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (nhiệt độ thường từ
4 - 7°c ). Theo thời gian, các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy,
người ta tiến hành gạn và lọc, thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm
> 70ữ/íW).
ở trạng thái này enzym rấ t đề bị biến tính vì còn nhiều nước. ĐỂ dễ
bảo quản, người ta tiến hành sấy kết tủa enzym này d nhiệt độ 40° c cho
đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5 - 8%w.
CÔNG NGHỆ ENZYM 225

Nguỵẻn liệu

Xử lý Giống vi
nguyên liệu sính vật

„ ,thanh
Hấp ± trùng
1 .Nhân
. Igióng
J..
Làm nguội

X
Trộn giống Giống cho
vi sinh vật san xuất

1 cấy
Nuôi

Thu nhận phế Chế phẩm enzym thỏ

phẩm enzym thô đem sử dụng

i
Chế phẩm enzym
thô đem tinh chế

II
Nghiền mịn

I .ly
Trích

I
Lọc ----------- Bã ------► Dùng trong chăn nuôi

I
Kếttủaenzym -------------- Cổn hoặc sulfat amon

l ỉ l .
Thu nhận kết tủa

I
Sấy kết tủa --------------------► Sử dụng chế phẩm enzym tinh sạch

„Tinh „chế jkết ltủa

”T “ _
Thu nhận chế phẩm enzym tinh khiết

Enzym tinh khiết

Sơ đổ 6.1
226 CHƯƠNG 6

Các chế phẩm tinh sạch này thường được sử dụng trong các phân tích,
trong y học và trong sản xuất thực phẩm sạch.
Toàn bộ quá trình sản xuất chế phẩm enzym bằng phương pháp nuôi
cấy bề m ặt được trình theo sơ đồ 6.1.
Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym ở dạng kết tủa vần hoàn
toàn chưa sạch về m ặt hóa học vì trong đó còn chứa một sô' enzym ngoài
những enzym ta quan tâm và còn chứa các protein lạ khác. Do đó, muôn
thư nhận được enzym có độ tinh khiết cao hơn ta lại phải tinh chế enzym
kết tủa bằng các quá trìn h lọc gen hoặc bằng những phương pháp hóa lý
khác.
Kỹ thuật n uôi cấy bề m ặt với m ôi trường lỏng
Trong nuôi cấy bề mặt, ngoài môi trường bán rắn như trình bày ở
trên, người ta còn sử dụng môi trường lỏng. Ớ môi trường lỏng, vi sinh vật
sẽ phát triển trên bề m ặt dịch lỏng nơi phân cắt pha lỏng và pha khí. Khi
đó các tế bào vi sinh vật sẽ tạo thành những váng phủ kín về m ặt dịch
lỏng. Chiều dày cũa váng này phụ thuộc rấ t nhiều vào giông vi sinh vật và
điều kiện nuôi cây.
Trong quá trình phát triển trên bề m ặt môi trường, các chât dinh
dường sẽ đi từ môi trường thẩm thấu vào tế bào, không khí sẽ từ pha khí
được tế bào sứ dụng và tiến hành các quá trình trao đổi chất. Enzym sẽ
được tống hợp trong tê bào và thoát khỏi tế bào vào trong dung dịch nuôi
cấy.
Như vậy trong quá trìn h nuôi cấy này sè xẩy ra hai quá trình khuyếch
tán ngược chiều. Quá trình hâ'p thụ chât dinh dường từ môi trường vào tế
bào và quá trình thoát enzym từ tế bào vào môi trường. Do đó việc thu
nhận chê phẩm enzym thô trong nuôi cấy bề m ặt ở môi trường lỏng là thu
nhận dung dịch nuôi cấy. Việc thu nhận dung dịch enzym thô rấ t đơn giản.
Người ta chỉ việc tách sinh khối bằng lọc, thậm chí chỉ cần tháo phần dịch
dưới sinh khối là tác được sinh khốỉ khỏi dung dịch.
Tuy nhiên phương pháp nuôi này tỏ ra không hiệu quả vì hoạt tính
enzym thu nhận được không cao bằng nuôi cây trên môi trường bán rắn.
Mặt khác, phương pháp này đòi hỏi diện tích m ặt bằng rấ t lớn, iớn hơn cả
phương pháp nuôi trên môi trường bán rắn. phương pháp này hiện nay ít
được sử dụng trên th ế giới và cả ở Việt Nam trong sản xuất enzym.
CÔNG NGHỆ ENZYM 227

6.8.2 Phương pháp nuôỉ cấy chìm

1- ưu và nhược điếm của phương pháp
Phương pháp nuôi cáy chìm đề thu nhận enzym là phương pháp ờ đó vi
sinh vật phát triển hắn trong lòng môi trường. Chính vì th ế trong nuỏi cấy
chìm người ta thường sứ dụng môi trường lỏng. Phương pháp này có nhừng
ưu điểm cơ bản sau:

Nguyên liệu

Nhân giống

ị
Giống cho
sản xuất

- Phương pháp nuôi cấy chìm th ư ờ n g cần ít diện tích. Quá trìn h nuôi
cấy thường được thực hiện trong các thiết bị lên men. Các thiết bị lên men
thường rất gọn.
- Phương pháp nuôi cấy chìm có thế tự động hóa và cơ giới hóa ờ mức
độ cao. Trong nuôi cấy chìm thường phải thiết lập hệ thống cánh khuấy và
hệ thống thổi khí. Kiểm soát quá trình thối khí bằng hệ thống tự động
hoàn toàn có thế thực hiện được với bất kỳ dung tích nào của th iết bị lên
men. Ngoài ra, ta còn có thể kiểm soát được nhiệt độ và điều hòa sự thay
đổi nhiệt độ bằng hệ thống điều khiến tự động.
- Phương pháp nuôi cấy chìm có thề thực hiện liên tục bằng hệ thống
nhiều th iết bị lên men nối tiếp nhau. Do đó, việc kiêm soát chảt lượng lên
men trở nên rấ t dề dàng.
Tuy nhiên, phương pháp lên men chìm củng có những nhược điểm cần
phải khắc phục:
** Hoạt , tín h enzym trong nuôi cấy chìm thường thâp hơn hoạt tính
enzym trong nuôi cấy bề mặt.
- Trong nuôi cấy chìm, sự nhiễm các vi sinh vật lạ nếu xểy ra sẽ gây
ra sự nhiễm toàn bộ hệ thông trong một thời gian rấ t ngắn. Dung dịch lên
men trong th iế t bị lên men luôn luôn trong trạng thái động nhờ hoạt dộng
228 CHƯƠNG 6

cùa cánh khuấy và hệ thống thối khí. Do dó, chỉ cần một điếm nào đó của
môi trường bị nhiễm ngay lập tức toàn bộ hệ thông bị nhiềm, khi đó ta rất
khó kiểm soát và giải quyết những hậu quả cỉo sự nhiồm vi sinh vật lạ gây
nên.
* Phương pháp nuôi cấy chìm thường đòi hòi chi phí rấ t lớn. Nhửng
chi phí này chủ yếu bao gồm chi phí c h o hệ thòng lên men, năng lượng cho
cánh khuấy, cho quá trình hoạt động cùa hệ thòng cung cap khí trong suôt
quá trình lên men.
2- Phương pháp tiến hành
a) Nguyên liệu: nguyên liệu sử dụng trong phương pháp nuôi cây chìm
đê chuẩn bị mòi trường cho nhiều loài vi sinh vật là rấ t khác nhau. Mỗi
một loài vi sinh vật có một loại môi trường riêng. Tuy nhiên, các loại môi
trường đều giống nhau ỏ một điểm là chúng chứa nhiều loại chất dinh
dường, có khả năng hòa tan cao và phải đầy đủ những thành phần dinh
dường cả dinh dưỡng cơ bản và dinh dưởng đặc hiệu. Trong nhiều trường
hợp, người ta sử dụng các loại bột như thành phần chính của môi trường.
Bên cạnh đó, người ta còn sử dụng các loại đường đè bố sung. Các loại
đường này chú yếu là cung câp năng lượng cho giai đoạn đầu của quá trinh
phát triển của vi sinh vật.
Điều không thế thiếu được trong m ô i trường của phương pháp nưôi cây
chìm là các loại muôi vi Jượng. Tuy nhiên các thành phần vi lượng cũng còn
phụ thuộc vào các loại vi sinh vật và loại enzym mà ta cần thu nhận.
Vi dụ: trong nuôi cấy aspergiilus, muôi M nS04 rấ t cần làm ức chế sinh
tổng hợp enzym amylase.
Để cung câ'p nguồn ni tơ cho môi trường nuôi cây chìm, người ta thường
đùng các loại nước chiết đậu, cao ngô hay dịch tự phân nấm men. Việc đưa
nhừng thành phần này vào làm môi trường cũng cần rấ t thận trọng, vì
rằng các axit amin có trong các thành phần này dường như chỉ có tác dụng
đối với sinh tổng hợp amylase, còn các loại enzym khác lại gây nên sự ức
chế.
b) Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy, môi
trường được th an h trùng bằng hơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 118 -125°c
trong khoảng thời gian là 45 - 60 phút.
Sau khi thanh trùng, môi trường được làm nguội đến nhiệt độ bình
thường (28 -30°C ) và tiếp giông vi sinh vật vào môi trường. Tỷ lệ giống
đưa vào khoảng 2 - 2,5%. Trong một số trường hợp có giông tốt ta chỉ cần
CÔNG NGHỆ ENZYM 229
---------------:--------------------------------------------------í--------------------------------------

cho lượng giông khoáng 0,5 - 0,6% là đủ.

Quá trình nuỏi cãy có thề thực hiện theo hai phương pháp: nuôi cây
theo chu kỳ hay nuôi cây liên tục.
Nuôi cấy theo chu kỷ, là p h ư ơ n g p h á p nuôi cây trong một thiết bị lên
men. Sau một chu kỷ nuôi từ 2 - 4 ngày, ỡ nhiệt độ 28 -32°c , người ta thu
nhận toàn bộ dịch nuôi cấy như một loại chế phẩm enzym thô. Sau khi kết
thúc quá trình nuôi cấy, người ta vệ sinh thiết bị, chuẩn bị môi trường mới
và lại tiến hành một mé nuôi cấv mới. Phương pháp này không đòi hòi kỹ
thuật cao. Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy từng mè này cũng có những nhược
điểm riêng. Vỉ dụ, thời gian ngừng giừa hai lần nuôi đé vệ sinh thiết l)ị
thường làm gián đoạn quá trình sán xuât, (io đó năng suất thường thấp.
Các mẻ tiến hành thường không cho chất lượng sán phãm giông nhau.
Nuôi cấy liên tục, là dè khác phục tình trạng trên. Quá trình nuôi oày
liên tục có thê được thực hiện trong một thiết bị, cũng có thế được thực
hiện trong nhiều thiẽl bị.
230 CHƯƠNG 6

Như vậy dòng môi trường vào với tốíc độ bàng tốc độ của lượng sản
phấm thu nhận hàng ngày. Phương pháp này có lợi là nếu chất lượng sản
phẩm cuối cùng ta thu nhận được chưa đáp ứng được yêu cầu đặt ra, ta có
hai cách khắc phục:
Cách thứ nhất: ta cho tốc độ môi trường vào và tốc độ sản phẩm ra
chậm lại, có nghĩa là làin sao cho thời gian lưu của dung dịch và tế bào vi
sinh vật trong th iết bị lên men láu hơn.
Cách thứ hai: ta tiến hành hoàn lưu dung dịch lên men hòa chung với
dòng môi trường để tái lên men. Như vậy, các th àn h phần môi trường sẽ có
cơ hội tham gia triệt để vào quá trình trao đổi chất, các loại enzym sè được
tạo ra nhiều hơn.
Không khí ra

Hình 6.21: Hệ thòng lên men li ôn tục nhiều thiết bị lẽn men
Nhược điếm lớn nhất của phương pháp nuôi cây liên tuc trong một
thiết bị lên men là tốc độ dòng chảy rấ t chậm. Đề khắc phục tình trạng
này, người ta lắp dặt một loạt thiết bị lên men nối tiếp nhau. Các th iết bị
lẻn men này có cùng tốc độ dòng môi trường vào và sản phẩm lên men ra.
Ưu điềm chính của hệ thông nuôi cây nhiều th iết bị lên men này là
làm tăng được tốc độ dòng mỏi trường vào và tốc độ sản phẩm ra.
Tuy nhiên, hệ thống này có nhược điểm khá lớn - đó là chi phí rấ t cao.
c) Kỹ thuật thu nhận và tinh chế cmym: Dung dịch sau nuôi cấy theo
phương pháp chìm được tách khỏi sinh khối và các thành phần không hòa
tan bằng phương pháp ly tâm. Dịch thu được thường chứa khoảng 2 - 3fr
chất khô hòa tan (trong thành phần chất khô hòa tan này bao gồm cả
CÔNG NGHỆ ENZYM 231

enzym). Hàm lượng này rấ t nhỏ, do đó ta cần phải cô đặc chúng cho đến
khi khôi lượng dịch giảm đi khoảng 5 - 10 lần ở điều kiện chân không
(nhiệt độ chỉ được duy trì trong suốt quá trình cô ỉà 30 -32°c. N joài
phương pháp cô chân không, ta có thể dùng nhựa trao đổi ion để hấp thụ
enzym. Sau đó là tiến hành phản hấp thụ và sẽ thu được enzym.
Sau khi thu được enzym ta tiến hành làm sạch enzym bằng những
phương pháp như trình bày phần trên.

6.9 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM KHÔNG HÒA TAN

6.9.1 Ư u đ iể m c ủ a e n z y m k h ô n g h ò a ta n
Các enzym thủy phân là những protein hòa tan. Các enzym này sau
khi tham gia phản ứng sẽ được giải phóng khỏi sản phẩm và tiếp tục tham
gia phản ứng. Như vậy, về cơ bản, enzym hòa tan có ý nghĩa rấ t lớn trong
quá trình chuyển hóa khối lượng cơ châ't lớn hơn rấ t nhiều so với trọng
lượng phân tử của chúng.
Tuv nhiên, các enzym hòa tan có những nhược điểm cơ bản sau:
- Trong quá trình tham gia phản ứng, các enzym hòa tan sẽ lẫn cùng
sản phẩm cuối. Việc tách chúng khỏi sản phẩm cuối là một điều hết sức
khó khăn. Đặc biệt trong sản xuất công nghiệp việc khắc phục tình trạng
này trớ nên hểt sức phức tạp. Ví dụ, trong sản xuất đường glucose nếu sản
phẩm cuối lẫn enzym thì glucose không thể được dùng trong dịch tiêm
truyền.
- Trong trường hợp tiên hành các biện pháp tách các enzym này ra
khói sản phẩm thì enzym sẽ không bảo toàn được hoạt tính ban đầu. Như
vậy việc tái sử dụng enzym sè gặp rấ t nhiều trở ngại, thậm chí không thể
sử dụng trong những trường hợp tiếp theo.
- Các enzym hòa tan thường kém bền nhiệt, pH hay hoạt tính của
nước.
Enzym không hòa tan hay CÒĨ1 gọi là enzym cố định (immobilized
cnzyms) là những enzym được gắn vào một chất mang bằng những kỹ thuật
khác nhau. Khi đó enzym sè không ở trạng thái hòa tan và chúng có những
ưu điểm cơ bản:
- Enzym không hòa tan có th ể được sử dụng nhiều lần và hoạt tính của
chúng ít thay đổi.
- Enzym không hòa tan sẽ không lẫn vào sản phẩm cuối và như vậy ta
không cần quá trình tách chúng khỏi sản phẩm cuối. Sản phẩm cuối sẽ là
232 CHƯƠNG 6

sản phẩm sạch.

- Sử dụng enzym không hòa tan sẽ có ý nghĩa kinh tế nhiều hơn
enzym hòa tan.
6 .9 .2 Đ ặ c đ ỉể m c ủ a e n z y m k h ô n g h ò a ta n
Khi nghiên cứu tạo ra enzym không hòa tan, các nhà khoa học đưa ra
một số’ đặc điểm của enzym không hòa tan như sau:
a) Hoạt tính riêng của enzym không hòa tan thường nhỏ hơn enzym
hòa tan cùng loại. Đặc điểm này của enzym không hòa tan là do những
nguyên nhân sau:
- Do đặc điếm điện tích của chất mang. Khi gắn enzym vào chât mang
có điện tích khác, cấu trúc không gian của enzym sẽ bị thay đổi. Từ đó hoạt
tính của enzym sẽ giảm. Mức độ giảm hoạt tính phụ thuộc vào mức độ thay
đổi cấu trúc không gian của enzym khi ta gắn chúng vào châ't mang.
- Do sự nhốt enzym vào một gel. Khi ta nhốt enzym vào một gel nào
đó, các gel n à y sè bao q u a n h p h â n t ử e n z y m , k h i đó cơ c h ấ t Tất k h ó tiếp
cận với enzym, và như vậy, phản ứng sẽ khó được thực hiện. Phản ứng chi
xảy ra khi cơ chât tiếp xúc được với enzym. Trong trường hợp này các gel
gần như một vật càn.
b) Enzym không hòa tan tuân theo định luật Michaclis - Menten
.(phán ứng enzym và cơ chất). Tuy nhiên phản ứng giữa cơ chất và enzym
không hòa tan có nhừng sai khác nhất định.
- Có thể xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất giữa enzym và chất
mang.

- Hiện tượng khuyếch tán cơ chất và các sản phẩm làm giảm hoạt tính
của enzym hay tốc độ phản ứng.
c) Enzym không hòa tan có tính bền nhiệt hơn enzyrn hòa tan.
d) Enzym không hòa tan thường có pH chuyển dịch sang miền kiềm
hay miền axit hơn enzym hòa tan cùng loại.
e) Enzym không hòa tan có khả năng bảo quản tốt hơn enzym hòa tan.
f) Enzym không hòa tan có thể thực hiện phản ứng nhiều lần. Đặc
điểm này rấ t có ý nghĩa trong phản ứng theo qui mô công nghiệp.
6 .9 .3 C á c p h ư ơ n g p h á p cô' đ ịn h e n z y m
Kỹ thuật cô định enzym không chỉ liên quan đến các enzym hòa tan
mà cả với những enzym không hòa tan (trong tế bào tồn tại hai dạng
enzym: enzym hòa tan và enzym không hòa tan).
CÔNG NGHỆ ENZYM 233

Đốì với enzym hòa tan. khi được gắn vào một ch ấ t mang sẽ tạo ra
những đặc điểm riêng như ta đã phân tích ở trẽn. Riêng các enzym có
trong tế bào ơ dạng không hòa tan, bằng kỷ thuật cô' định ta sẽ làm tăng
khả năng sử dụng của chúng. Vì thè trong vân đề cô định enzym, ta quan
tâm cả enzym hòa tan và enzym không hòa tan tự nhiên trong quá trìn h cố
định chúng.
Toàn bộ phương pháp cô" định enzym hòa tan và không hòa tan được
tóm tắ t theo sơ đồ sau:

Hình 6.22: Phân loại các phương pháp cố định enzym

7- Phương pháp nhốt enzym
Nhốt enzym trong khuôn gen
Phương pháp nhốt enzym dựa trên cơ sở tạo ra một màng bọc hay một
polyme, ở đó cơ chất có thể thẩm thấu vào trong các sản phẩm trao đối
chất (sản phẩm của phản ứng thoát ra ngoài, enzym không bị m ất đi trong
các phản ứng).
Cách tiến hành như sau: Enzym được trộn vào trong một monomer.
Sau đó tiến hành quá trình trùng hợp với sự có m ặt của một hay nhiều tác
nhân tạo ra phức càng cua. Enzym sẽ được bao bọc trong khoảng không của
gel. Người ta có thể sử dụng nhiều loại vật liệu nhốt enzym. Các vật liệu
này cũng đã được nghiên cứu rấ t kỹ, tương ứng với các gel khác nhau.
234 CHƯƠNG 6

Bảng 6.6: Phương pháp nhốt enzym trong khuôn gel

S TT N g u y ê n liệ u E nzym T à i liệ u th a m k h ả o
Acetyl choline síease Ngo and Laidler 1978
(EC. 3.1.1.7)
A lcohol dehydrogenase L e m ie re et al 1991
<E.C. 1.1.1 1)
C haym otripsin M a rtìne k etal 1977,
(E .c . 3.4.21.1) 1980, K uan 1980
A sparaginase M o ri et at 1976
11
(E .c . 3 .5 . . )
D.gluco dehydrogenase C h e n et al 1979
(E .c . 1.1.1.47)
Alcohol dehydrogenase C h e n et al 1979
(E .c . 1.1.1.1)
1 Poty acrylarm de p-D. gala closidase Danielson et al 1979
(E C. 3.2.1.23)
Phenol K jellen and N eufahr 1979 -
(2 -m onoxygenase) 1980
(E C . 1.14.13.7)
U rease (E C .3.5.1.5) S ada et al 1980
P-D fructofuranosidase A d a ch i et al 1980
(E C .3.2.1.26)
Penicitin amidase S zew czuk 1979
(E C .3.5.1.11)
C atalase (E C .1 .1 1.1.6) B uchhot et a! 1978
D -glucose oxydase B uchhol et al 1981
(E C .1 .1.3.4)
G luco am ylase M o riyam a et al 1980
(E C .3.2.1.3)
D -gluco oxydase H a ru la et al 1987
Is o -p ro p y l ac ry la m id e N -N -m e th yle n e (EC. 1.1.3.4)
2
b is a c ryla m ide PeniciNn G *acylase P rab hune et al 1991
ÍE C .3 .5.1.11)
A c ry la m id / g ly c id y lm e th a o ry la te A M P -diam inase K aru be et al 1977a
3
(EC 3.5.4 6)
p-D Fructofuranosidase F ukui et al 1978
E thyleneglycoư 2 hyd roxy eth ytm etha {E C .3.2.1.26)
4
cryia te D-giucose isomerase Fukui 1978
(E C .5.3.1.5)
a-am ylase K um a kura et al 1977, 1979
(E C .3 .2 .1 .1 )
G lucoam ylase K aetsu et al 1979
(E C .3 .2 .1 .3)
C ellulase K aetsu et al 1979
(E C .3 .2 .1 .4)
5 H y d ro x y e th y lm e th a c ry la te
a*D .gluco sidase K aetsu et al 1979
(E C .3.2 .1.2 0)
D .glucose oxidase K aetsu et al 1979
(E C .1.1.3.4)
Penicilin acylase B occu et al 1987
(E C .3.5.1.11)
N-vinyl pyrolìdome/ 2 D -glucose oxidase G u rse l ha sirci 1992
6
hydroxyethyl methacrylate (E C .1.1.3.4)
P oly {so d iu m 2 -a c ry la m id e 2 -m e th y l-1- C ataiase K o h ịiva et al 1991
7 propanesul phonate/ poty (2- (E C .1.11.1.6)
tn m e th y la m m o n io e ỉh y l m e thacryla te
CÔNG NGHỆ ENZYM 235

Tiếp theo (bảng 6.6)

U rethane prepolym e L(pase K oshtro and O zaki 1987
8
(E C .3.1.1.3)
P h o to cro ssltn ka b le prepolym e Lipase K onigi et al 1987
9
(EC. 3 1 .1 .3 )
S orb itoỉ E 090/ Lipase M a rcinow ski 1987
10
E p ichỉorohyd rin (EC 3.1.1.3)
11 P olyazind ines MisceHa neus W ood et al 1990
Urease (E C .3.5.1.5) G opinath an and
Balan 1989
12 P o lyvinyl alcohol
Inve rtase S u e h iro 1989
(EC 3.2.1.26)
1,3 p h enyíe ned ia m m e / D .glucose oxidase A lm e id a and
13
electro p o lym e iza tio n (EC 1.1 3.4) W inqard 1991
P hen ol electropo lym eizatio n D .glucose oxidase B artle tt e l a! 1992
14
(EC 1.1.3.4)
A xit phosphatare Braun et al 1991
(EC. 1.1.3.4)
A lkaline photphatase Braun et at 1991
15 T etram ethosy-s*iate
{E C .3 1.3.1)
T rypsin Braun et a! 1991
(E C .3-4.21,4)
C -S lyase Thom as and P arkir
{E C .4.4.1.4) 1991
Invertase U m eyam a et al 1987
{EC.3.2.1 26)
16 A lginate
Lipase Konishi et al 1989
(EC. 3.1.1.3)
|i-D -ga lactosida se Isushim a 1991
(E C .3 2 1 29)
Ax It photphatase K oenig and Ugi
{EC. 3.1.3.2) 1991
17 Algm ic axit/ Ugi reaction
Lactat dehydro gen ase Koenig and Ugi
(EC 1 1 1 27) 1991
A m yno acyiase Tosa et al 1979
(EC 3 5 1 1 4 )
A spartate am ynonialyase Tosa et al 1979
(EC 4 ,3 1 1)
18 K C artagee m an
Fum aM te hydratase Tosa et al 1979
(EC 4 2.1 2)
Lipase Kom shi et al 1988
(EC 4 2 1 2 )
Fibroin Lipase (EC 3 1 1 3) N akayam a et al
19
1986
ổ e ia tm Inựertãse S ugisaw a et al 1987
20
(EC 3 2 1 26)
H ardened ge la tin G lucose oxidase E lcin and A kbulut
21
(EC 1.1 3.4) 1992
G ela tin /o xid ize d po lysa ccharide |\-D ga lactosidase S chacht and N obel
22
(EC 3 2 1 23) 1989
M ircoem uìsion organogel Lipase Jen ta et al 1991
23
{EC 3 1 1.3)

Nhốt enzym trong hệ sợi

Việc nhốt enzym trong sợi nhàn tạo được Diiìelli thực hiện năm 1972
236 CHƯƠNG 6

và năm 1978. Enzym có thể được nhốt trong hệ sợi nhân tạo và thực hiện
tốt chức năng xúc tác nhiều lần.
Phương pháp này tiến bộ hơn phương pháp nhốt enzym trong gel. Sợi
có độ bền với axit, kiềm và tác dụng của các ion, các dung môi hừu cơ hòa
tan. Tính chất này phụ thuộc rấ t nhiều ở bản chất các polyme tạo ra sợi
mà ta sử dụng trong cô" định enzym.
Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại sợi làm chát cố định enzym,
trong đó phô biến nhất là Cellulose acetate.
Bảng 6.7: Phương pháp nhốt enzym trong các sợi nhân tạo
STT Loại sợi Enzym cố định Tải liệu tham khào
Amyloglucosidase D.Angiuro et al,
Cellulose
(EC.3.2.1.3) 1991
1
Acetyl cholinesterase Tusarova et al 1991
(EC. 3.1.1.7)
Amino acylase Bartoli et al 1978
(EC.3.5.1.14)
Fumarate hydratase Marconi 1975
(EC.4.2.1.2)
Glucoamylase Corno et al 1972
(EC.3.2.1.3)
D.gluco isomerase Giovenco et al. 1973
(EC.5.3.1.5)
Dihydropyrimidinase Snamprogetti, 1976
2 Cellulose acetate
{EC.3.5.2.2)
[5-D. Fructo Furanosidase Marconi et al, 1974
(EC.3.2 1.26)
Penicilin amidase Marconi et al, 19/3
(EC 3 5 1 11)
Tryptophan synthetase Marconi et al. 1974
{EC. 4.2.1.20)
Dipeptidyl peptidase Pardin et al. 1977
(EC.3.4.14.1/2)
Urate oxidase Kiỉano et al, 1980
Polyvinyl alcohol and (E C .1.7.3 3)
3
cellulose Urease Kitano et al, 198C
(EC.3.5.1 5)
Invertase Tsutsjmi etal, 1990
Polyvinyl alcohol (EC.3.2.1.26)
4
fibers Amynoacylase Tsutsumi et al, 1990
(EC.3.5.1.14)
Polysulphone/polyethy Glucoamylase Ishizuka eỉ al, 1991
5
leneimine (EC.3.2.1.3)
Lipase Rucka and
6 PVC
(EC.3.1.1.3) Turkiewier 1990
7 Lipase Kimura and
Polypropilene fibers
(EC.3.1.1.3) Takahashi. 19S1
CÔNG NGHỆ ENZYM 237

Tạo vi nang
Phương pháp nhốt enzym trong các V I nang có kích thước 1 - 100fim.
Trong trường hợp này cơ chất và các sản phấm phản ứng sẽ đi qua màng
một cách tự do. Phương pháp tạo vi nang được thực hiện vào 1960 và lần
đầu tiên được công bô' vào 1964 (chang, 1964). Từ đó đến nay có hàng loạt
enzym được cố định theo phương pháp này.
B ảng 6.8: Tạo vỉ nang để nhốt enzym
STT Nguyên liệu ỉạo VI nang Enzym Tài liệu tham khảo
Ị3-D. galactosidase Wadiak and
(EC.3.2.1.23) Carbonell, 1975
1 Nítro cellulose
Asparaginase Chang. 1973
(EC.3.5.1.1)
Alcohol dehydrogenase Campbell and
(EC.1.1.9.1) Chang, 1976
Malate dehydrogenase Campbell and
(EC.1.1.1.37) C h a n g .1976
Catalase Mogensen and
(EC.1.11.1.6) Vieth, 1973
2 Collodion
Piruvat Kinase Campell and
(EC.2 7.1.40) Chang, 1975
Hexokinase Campbell and
(EC.2.7.1.1) C h an g ,1975
Urease Mogensen and
(EC.3.5.1.5) vĩeth 1973
[5-D-galactosidase Ostergaard and
3 Nylon
(EC-3.2.1.23) Martiny 1973
Asparaginase Mori et al. 1973
{EC.3.5.1.1)
4 Polyurea
D-glucose oxidase Komoei et al, 1987
(EC.1.1.3.4)
Lactat dehydrogenase Stefuca et al, 1991
5 Polyelectrolyte complex
(EC.1.1.1.27)
Poly (2-hydroxyethyỉ) metha Urokinase Liu et al, 1991
6
cry late (EC. 3.4.21.31)
p-D-galactosidase Inushima, 1991
7 K'Carrageeman
(EC.3 2.1.23)
D-glucose oxidase Ozden and Hasirci 1990
8 Coated liposomes
(EC.1.1.3.4)
Alkaline protease Koishi and
9 Polyethylen glycol
(EC.3.4.21.14) Sekiguchgi 1980
Styrenebutadiene Lipase Omi and Iso 1989
10
ruber/polyvinyl alcohol (EC.3.1.1.3)
Triacylglycerol lipase Kitajema et al 1969
11 Ethyl cellulose (EC.3.1.1.3)
Catalase (EC. 1.11.1.6) Kitajema et at 1969
12 Polystyrene
Urease (EC.3.5.1.5) Kitaịema et al 1969
238 CHUƠNG6

2- Phương ph áp tạo liên kết với chất m ang

Những chất mang (carrier) là những chất dùng đế gắn enzym vào. Các
chất mang phải có những tính chất cơ bản sau:
- Chất mang phải bền với pH ax it hay pH k iề m .

7- Chất mang phải có khả năng gắn enzym.

- Chất mang không có khả năng tham gia phản ứng với cơ chất.
Phương pháp tạo liên kết vđi chất mang bao gồm:
- Phương pháp hâp thụ.
- T ạ o liê n k ế t ÌOĨ1.
- Tạo liên kết kim loại.
- Tạo liên kết đồng hóa trị.
Hiện nay người ta sử dụng rộng rái nhừng chất mang sau trong cô"
định enzym (bảng 6.9).
Bảng 6.9: Những chất mang dược sử dụng trong cô định enzym

STT P h ả n lo ạ i C hất m ang

Các chất mang hữu

Than hoạt tinh; Agar; Agarose; Albumin; Cellulose: Chitin
1 cơ nguồn gốc

tự nhiên Chitozan; Collagen; Dextran; Gelatin; Glucomannan; Sợi; Tinh bột

Các chất hữu cơ

2 Acrylamide; Acrylic; Maleic anhydride; Nyfon; Poly styrene
tổng hợp

Nhôm; Bentonite; Photpbat canxi; Photphat titanic; Ceramic

3 Các chất vô cơ
Caolin; Magie; Cát; tatinic
CÔNG NGHỆ ENZYM 239

Phương pháp hâ'p thụ

Bảng 6.10: Phương pháp hấp thụ trong cố định enzym
STT Chất mang Enzym Tài liệu tham khảo
Chát mang hữu cơ
Lipase
1 Cellulose hạỉ Kery etal, 1990
(EC.3.1.1.3)
Lipase
2 Photpholipit Akita và Umezawa, 1991
(EC.3.1.1.3)
Alkaline photsphatase
Dixon et al 1979
(EC.3.1.3.1)
3 Phenoxyacetyl cellulose Glyceraldehyde-3 photphat
dehychogemase Dixon et al 1979
(EC.1.2 1.12)
B-D-xylosidase
Ogumỉimein và Reilly 1980
(EC.3.2.1.27)
Triacyl glycerol lipase
4 Palmitoyl-cellulose Horiuti vá Imamura 1978
(EC. 3.1.1.3)
Aminocacylase
Tannia amỉnohexye Watanabe etai 1979
5 (EC.3.5.1.14)
cellulose
Narinqinase Ono alal 1978
Tannia-TEAE- Pulfulanase Ohba and Ueda
6
cellulose (EC.3 2.1.14) 1980
Photspho diestease
7 Concanava A-agarose Schiger et al 1980
(EC.3.1.4.1)
D-glulose oxidase
Mattiason 1978
(EC. 1.1.3.4)
Peroxidase
8 lecithirvagarose Mattiason 1978
(EC.1.11.1.7)
Catalase
Mattiason 1978
(EC.1 11.1.6)
Chlorophylase
9 Heptyl-agarose Sudina. 1979
(EC.3.1.1.14)
Guanylate cyclase
10 Hexyl-agarose Garbers, 1978
(EC.4.6.1.2)
Guanylate cyclate
11 Octyl-agarose Garbers, 1978
(EC.4.6.1.2)
Guanylate cyclase
12 Decyl-agarose Garbers. 1979
(EC.4.6.1.2)
Glucoamylase
13 Than hoạt tính Cho và Bailey 1979
(EC.3.2.1.3)
14 Chitin hay Chitosan Trypsin (EC.3.4.21.4) Goodman, 1982
15 Tannin-chitosan Chftinase (EC.3.2.1.14) Sakai, 1991
16 xương Invertase (EC.3.4.21.4) Safanik, 1987
Hạỉ cafe
17 Trypsin (EC.3.4.21.4) Safanik, 1987
Các chất mang nguổn vò cơ
D.glucose oxidase
18 zeolite Piffert 1980
(EC.1 1.3.4)
Invertase
19 Zeolite/ Al20 3 Straus, 1990
(EC.3.2.1.26)
Tripsin (EC.3.4.21.4) Buchholz. 1990
20 Silicagel Alcohol dehydrogenase
Mickel. 1979
ÍEC.1.1.1.1)
21 Bentonite Miscelaneous Kawa, 1989
240 CHƯƠNG 6

Bàng 6.11: Phương pháp tạo liên kết ion

STT 1 Chất mang 1 Enzym 1 Tài liệu tham khéo
Các Chất trao đổi anion
Glucoamylase
Maeda, 1979
(EC.3.2.1.3)
Photphodiestease
Aukati, 1978
(EC.3.1 4.1)
D. glucose ỉsomerase
Huitron, 1978
(EC.5.3.1.18)
Insulinase
1 DEAE - cellulose Guinaud, 1981
(EC.3.2.1.7)
Methanol oxidase
Baratti, 1978
(EC. 1.1.3.13)
Dextrausucrase
Kaboli, 1980
(EC.2.4.1.5)
Aminoacylase
Szwajcer, 1981
(EC.3.5 1.14)
D-glucose isomerase
2 TEAE - cellulose Huiton, Limon 1978
(EC.5.3.1.18)
D-glucose isomerase
Huiton, Limon 1978
(EC.5.3.1.18)
Phenol 2 monooxygenase
Kaboli, 1980
3 DEAE - sephadex (EC.2.4.1.5)
Dextrausucrase
Kaboli, 1980
(EC.2.4.1.5)
NAD. (p) H.oxidase Hakozaki, 1990
Lipase Yokomichi, 1989
4 DEAE-Sephadex-ASO
(EC. 3.1.1.3) Vang, 1991
Phenol 2 monooxygenase
5 DEAE-Bio-gelA Kjellen, 1979, 1980
(E C .1.14.13.7)
D-glucose oxydase
6 Amberlíte IRA Klei, 1978
(EC .1.1.3.4)
Amberlyst A21 Lipase
8 Loose, 1990
Các chất trao đổi cation (EC.3.1.1.3)
Penicilin amidase
Carley smith, 1980
(EC.3.5.1.11)
9 CMC
Axit photphotase
Vaidya, 1978
(EC.3.1.3.2)
Amyno acyl-t-RNA-
10 Cellulose photphaỉ Yamada, 1978
synthetase
P-D-Fructofuranosidase
11 CM-sephadex Woodward, 1978
(EC.3.2.1.26)
Dextrausucrase
12 S.P-sephadex Kaboli, 1980
(EC.2.4.1 5)
D-glucose oxydase
13 Amberlíte IRA93 Annesini, 1990
(EC .1.1.3.4)
14 Aminoacylase
Nylon/polyethyleneimine Obon, 1990
(EC.3.5.1.14)
CÔNG NGHỆ ENZYM 241

Người ta cho enzym hâp thụ trên nhừng chất mang có hoặc không có
diện tích theo cơ chế hấp thụ. Thông thường, người ta cho enzym hâp thụ
trên bề m ặt các chất có hoạt tính bề inặt mạnh như th an hoạt tính,
cellulose, agarose, chitin, poly acrylamit, nylon, polystirol, nhựa trao đổi
ion, silocagel, thủy tinh.
Khi tiến hành hâp thụ có thê xảy ra trường hợp:
- Trường hợp chất mang có nhiều lồ xôp, enzym sè đính vào bề mặt
các lỗ XÔỊ> và bề mặt toàn bộ chát mang.
- Trường hợp chết mang không có lồ xô'p, chúng sè bám vào toàn bộ bề
mặt chất mang.
- Trường hợp chất mang có tích đ iệ n , chúng sê tạo thành liê n kết ion.
Phương pháp tạc liên kết íon
Phương pháp này dựa trên cơ sở tạo ra ỉiên kết ion giữa enzym và chất
mang. Liên kết ion thường không bền bằng hấp thụ nhưtig lại bền hơn liên
kết đồng hóa trị. Enzym đẩu tiên được cố định theo phương pháp này là
enzym (EC. 1.11.1.6) do Mitz thực hiện vào năm 1956. Chât mang được ông
sử dụng là DEAE - Callulose và năm 1966 là năm đầu tỉên Tosa áp dụng
DEAE - Sephadex như một chát mang để cô" định aminoacrylase đế sản
xuất axit amin theo qui mô công nghiệp từ hỗn hợp N - acetyl “ DL amino
axit. Sau đó hàng loạt nhừng công trình nghiên cứu và ứng dụng theo
phương pháp này được công bố.
Tạo liên k ết kim loại
Phương pháp này dựa trên cơ sở làm tăng hoạt tính bề mặt chất mang
để chất mang dễ dàng giữ enzym trên bề m ặt của chúng.
Bảng 6.12: Phương pháp tạo liên kết kim loại
STT Chất mang Enzym Tài liệu tham khảo
Nuclease p.
1 Cellulose Rokugawa, 1979
(E C .3.1.23.30)
Pectinlyase
2 DEAE - cellulose Hanish, 1978
(E C .4.2.2.10)
Glucoamylase
3 Gelatin Kennedy, 1984
(E C .3.2.1.3)
Papain
4 Bông thủy tinh Kennedy, 1980
(E C .3.4.22.2)
D-glucose-dehydrogenase
5 Nylon Bisse, 1978
(EC. 1.1.1.47)
Glucoamylase
6 Nhôm Allon, 1979
<3.2.1.3)
Trypsin
7 silicagel Volkowa, 1979
(3.4.21.4)
---------------------------------------------
242 CHƯƠNG 6

Bảng 6.13: Phương pháp cổ định cnzym băng liên kết đồng hóa trị
số thứ tự Nhóm hoạt hóa của chất mang Nhóm hoạt hóa cùa enzym Phản ứng. liên kết
-N H ,
- < f _ 3 - Nfe’a
-S H
1 Liên kết diazo
Muối diazoni
- o “ oH

~ CO- 0
2 - CO^ -N H 2 Tạo amide
Axit anhydriđ
- nh2
- CH2CON3 -S H
3 Tạo amide
Acy! azide
- y - OH

-o -
4 - o - c = NH - nh2 Tạo amide
Imidocarbonate

- R “ NCS
5 -N H ? Tạo amide
Isothio cyanate

6 - o - NCS -N H 2 Tạo amide

Iso cyanate
ii
I

- CH2COCI
7 Tạo amide
Ỉ

Acyl chloride

8 - nh2 Tạo amide

Cyclic carbonate
R
NH

c - c o 2-
9 II •n h 2 Tạo amide
NH
I
R
0-acylisourea
c o 2- c = c h - c o - n h - c ?h 5

10 - nh2 Tạo amide

Q
SO i

11 C f - N 0 2
-nh2 Arylat hóa
N 02
5-fluoro-2,4 dinitroanilide

12 - nh2 Arylat hóa

c 5 -"a.
Nor
CÔNG NGHỆ ENZYM 243

Tiếp theo (bảng 6.13)

- 0 - CH - CH

X
?
'
13 V Alkyl hóa

1 1
3= *
ò
X = > NH > 0 > s

GO
Oxirane

- o - ch2 - c h 2- s o 2 - nh2
14 -CH"CH2 - SH Alkyl hóa
vínylsulphonyl - OH

• o
(I

-N H 2
15 - SH Arylat hóa
- OH

Ù
o
-CHO
16 -nh2 Tạo shift base
Aldehyde

- nh2
17 - NH = r1
Phản ứng ugi
R2 -CO?H

NH

18 - C - O C 2H5 - nh2 Phản ứng amidin

Este ìmido

— CN -N H 2
19 Phản ứng amidin
Cyanit

20 - SH Tạo thio disultit

- S - s O
N Cầu disulfit

Phản ứng enzym -

21 - SH
- <f ^ - HgCI mercury

- nh2 - nh2
22 Tạo amid
Amin - c o 2h

—conhnh2 - nh2
23 Tạo amid
Acyl hydrazo I - c o 2h
244 CHƯƠNG 6

P h ư ơ n g p h á p tạ o liê n k ế t đ ồn g h ó a trị
Phương pháp này dựa trên cơ sở tương tác đồng hóa trị giữa phân tử
enzym và vật châ't không tan trong nước. Phương pháp này được phát triển
rấ t m ạnh trong việc cô" định enzym.
6 .9 .4 T h i ế t b ị p h ả n ứ n g e n z y r o k h ô n g t a n

o o

Thiết bị phản ứng enzym

hòa tan có cánh khuấy

o Thiết bị phản ứng Thiết bị phản ứng

D tuẩn hoàn
tuần hoàn
có tấm ngăn không có tấm ngăn
Thiết bị phản ứng
enzym không hòa tan

Hình 6.23ỉ Một số kiểu thiết bị phản ứng

d=-

C O

T !^ ĩ t ị phản ứng liên tục có màng ngăn Thiết bị phản ứng tuần hoàn hai ngăn

ơ o
0 0

Thiết bị phản ứng cố định enzym liên tục Thiết bị phàn ứng liên tục có màng ngăn

Hình 6*24: Thiết bị phản ứng liên tục

CÔNG NGHỆ ENZYM 245

Hình 6.25: Thiết bị dòng chảy liên tục có màng ngăn

t i

t' 'I
Hình 6.26: Thiết bị dòng chảy liẽn tục có sợi ngăn cản

1 I I

I
Hình 6.27: Thiết bị dòng chảy liên tục có tấm ngăn
 246 CHƯƠNG 6

6.10. ỨNG DỤNG ENZYM

6 .1 0 .1 T ìn h h ìn h s ả n x u ấ t v à t i ê u t h ụ c á c l o ạ i e n z y m c ô n g n g h i ệ p
Theo thời gian, enzym cồng nghiệp ngày càng được ứng dụng vào
nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó, những enzym được ứng dạng nhiều
n hất là protease, carbohydrase, ligase, một sô" enzym đặc biệt khác.
Theo báo cáo của Frost và Sullivan trong tạp chí Chemistry in Britain,
1992 thì trong năm 1991, doanh sô' thu được từ việc bán e n z v m
carbohydrase là 62,6 triệu USD:
Protease: 140,85 triệu USD
Lipase: 31,31 triệu USD
Pectinase: 31,3 triệu USD
Các loại enzym khác: 31,31 triệu USD
Cùng theo báo cáo của tạp chí này, năm 1995 tổng doanh thu từ các
enzym tăng lên như sau:
Carbohydrase: 83,2 triệu USD
Protease: 187,2 triệu USD
Ligase: 41,6 triệu USD
Các loại enzym khác: 41,6 triệu USD
Và nhừng loại enzym đặc biệt là 20,8 tĩiệu USD
Lưu ý rằng sô liệu trình bày ở trên chỉ bao gồm những sô liệu thông
. kê được ở các nước châu Âu. Sô liệu ở các nước châu Á, châu Mỹ và châu
Phi hiện chưa có con sô chính xác.
Điểm thứ hai cần lưu ý là số liệu trên chỉ nói lên doanh thu từ bán các
loại enzym sán xuất theo qui mô công nghiệp. Có nghĩa là enzym chì thu từ
. nguồn enzym.
Khi xem xét khả nâng ứng dụng của các loại enzym công nghiệp,
Godfacy và Reichelt (1983) cho biết sô' lượng enzym Protease được sử dụng
nhiều nhất, chiếm 59%, trong đó:
trypsine: 3c/c\ rennet: 10%; protease axit: 3%; protease trung tính: 12%
protease kiềm: 31% trong đó 25% được sử dụng để sản xuất chất tẩy rửa.
Sau protease là enzym carbohydrase chiếm 28%, ligase 3% và các
enzym khác 10%.
Trong enzym carbohydrase bao gồm những enzym sau được ứng dụng nhiều:
pectinase: 3%; isomerase: 6%; cellulase: V7c\ ctr amylase: 13%; (5- amylase: 13cỉc
CÓNG NGHỆ ENZYM 247

Theo thời gian, sô liệu thu nhập trên có thẻ thay đối, song điều dề
nhận thây là tổng doanh thu hay khả năng buôn bán các enzym cồng
nghiệp ngày một tăng; khả năng ứng dụng của enzym protease vần cao
nhất, ké đến là các loại enzym carbohydrase. '
6 .1 0 .2 ứ n g d ụ n g e n z y m

l- Các hướng ứng dụng

Hiện nay có hai hướng ứng dụng enzym trong các ngành công nghiệp
nhẹ, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp và y tế.
a) Hướng thứ nhất: Sử dụng có định hướng các enzym có trong tê bào
sông của vi sinh vật. Theo hướng này, việc sử dụng enzym đồng nghĩa với
việc sừ (lụng tế bào vi sinh vật trong quá trình sản ximt. Trong trường hợp
nàv. ta có thế coi tẻ bào vi sinh vật như một chât mang enzym. Enzvm tồn
tại trong té bào vi sinh vật, thực hiện các phản ứng sinh hỏa trong và
ngoài tế bào vi sinh vật. Chất mang này có một tính chất rất đặc biệt là
c h ú n g k h ô n g CỈ11 g iữ CI.ZVI11. m à c ò n có k h á n ă n g t ạ o r a n h ữ n g e n z y m n à y .
Sự tạo thành enzym liên tục trong tế bào vi sinh vật, dám báo cho việc tồn
tại chúng liên tục trong điều kiện tự nhiên. Mặt khác, ta có thế coi tế bào
vi sinh vật như một nhà máy sán xuât các vật chât hữu cơ hoàn chinh. Khi
tló. enzym như những công cụ hữu hiệu đế thực hiện tất cả các cóng đoạn
san \uát với độ chính xác cao và theo một trậ t tự nhát định để tạo ra sự
hoạt dộng hết sức hài hòa cùa bộ máy sông này.
Tuy nhiên, cũng phải nhận thây rằng ứng dụng enzym theo kiểu này
có những đặc điểm rất riẻng biệt cần quan tâm đề điều khiến chúng sao
cho chúng hoạt dộng có hiệu quả.
* Ưng dụng e n z y m t r o n g tế bào sông của vi sinh vật chì có ý nghĩa khi
sản phấni cua sự tham gia phản ứng enzym là sản phẩm khỏng tinh khiết.
Đày là hồn hợp các sán phẩm được tạo thành trên cơ sở có sự tham gia của
hãng loạt enzym, vì trong tế bào vi sinh vật sông tồn tại hàng loạt các
enzym tham gia nhừng phan ứng sinh hóa khác nhau, sản phẩm của phản
ứng này là nguyên liệu hay cơ chất cho phản ứng kế tiếp. Như vậy, trong
quá trinh tiến hành phản ứng sẽ tạo ra p£ức hợp nhiều chất khác nhau, các
chất này luôn luôn ớ trạng thái động và sẵn sàng tham gia tiếp tục nhừng
phản ứng sinh hóa trong và ngoài cơ thể. Do đó, nếu ta quan tâm thu nhận
một loại sản phẩm nào đó có độ sạch tuyệt đôi thì không th ể sử dụng
enzym theo hướng này.
248 CHƯƠNG 6

* ư n g dụng enzym trong tế bào sông của vi sinh vật đặc b i ệ t có ý

nghĩa đối với nhừng quá trình lên men truyền thống (sản xuất rượu từ
nguồn tinh bột, sản xuất tương, chao, phomai, nước chấm, nước mắm, làm
dưa chua), các quá trình ủ (ủ phân hữu cơ, ủ thức ăn gia súc). Trong nhừng
quá trình này, sản phẩm cuối cùng thường là hỗn hợp nhiều chất, trong đó
có th ể tồn tại một hay hai châ't chiếm sô' lượng lớn, những chất này được
tạo th àn h trên cơ sở sô' lượng, hoạt tính enzym tham gia tạo ra chúng có
trong tế bào sống vượt trội hơn nhừng loại enzym khác. Tất cả các quá
trình này, nếu xảy ra trong những điều kiện không biến động nhiều, sè tạo
ra sự hài hòa giữa các sản phẩm trao đổi chất. Nhưng nếu có một biến động
nào đó trong quá trình phản ứng, lập tức có sự đảo lộn sự cân bằng này, và
như vậy sè làm chất lượng sản phẩm cuô'i cùng thay đối.
* ứ n g dụng enzym trong tế bào sống của vi sinh vật để sản xuất ra các
sản phẩm trao đổi chất có liên quan chặt chẽ đến phương pháp cô" định tẽ
bào, enfcym có trong tế bào, tế bào lại được cố định, như vậy về nội dung cơ
bản ta tạo ra một màng sinh học. Các chất dinh dưỡng đi qua màng lọc
sinh học và sản phẩm của quá trình chuyền hóa sẽ đi ra khỏi màng lọc
sinh học.
Phương pháp tạo tế bào cô định gần giống phương pháp tạo enzym cô
định. Sau khi tiến hành cố định tê bào vào những chất mang, các chất
mang đã cô định các tê bào trên đó sẽ được đưa vào troug lĩiột cột hay một
thiết bị phản ứng hình trụ.
Không khí ra

ọọọọọọọọọọọ
00000000000
00000000000 ^ Vi sinh vật chứa enzym
ọọọọọọọỏọoọ đã đư<?c cổ dmh trẽ " chấi man9

Hệ thông thổi khí

Dòng sản phẩm ra

Hình 6.28: Bình phản ứng hộ thông cô định tè bào điển hình
 CÔNG NGHỆ ENZYM 249

Như vậy, chất dinh dường hay cơ chất sè được đưa từ phần trên của
thiết bị và chảy qua các tế bào cố định trong hệ thống. Các chất này sẽ
tham gia các phản ứng enzym trong tế bào và sản phẩm thoát khỏi tế bào
xuống phần đáy của thiết bị. Người ta thu nhận các sản phẩm từ phía đáy
thiết bị này.
* Ưng dụng enzym trong tế bào vi sinh vật theo hướng thứ n h ất này
không chỉ có ý nghía trong công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men
truyền thông, các quá trình ủ, mà còn có ý nghĩa rấ t lớn trong xử lý nước
thải công nghiệp, nước thài sinh hoạt và nước thải bệnh viện.
b) Hưởng thứ 2: Hướng này sử dụng enzym này hoàn toàn không liên
quan gì đến tê bào sông của vi sính vật. ơ đây, các loại enzym được tách ra
khỏi tế bào, được tinh chế hoặc không tinh chế.
Nếu sứ dụng enzym theo hướng thứ nhất, người ta quan tâm đặc biệt
đến tê bào vi sinh vật phải là những tế bào sông, và chúng chỉ có tác dụng
tham gia chuyến hóa vật chất khi chúng có khả năng phát triển trên cơ
chất. Khi đó enzym mới định tổng hợp và tham gia phản ứng. Nếu tế bào
vi sinh vật phát triển kín hoặc không phát triển thì quá trình chuyển hóa
sẽ không xảy ra hoặc xáy ra rất chậm.
Nếu sứ dụng enzym theo hướng thứ hai, người ta không quan tâm đến
tế bào vi sinh vật đó sống hay chết. Khi đó, người ta đã có một khối lượng
9 sinh khôi vi sinh vật chứa nhiều enzym và có hoạt tính cao. Công việc ứng
dụng chí bao gồm việc tạo điều kiện thuận lợi cho enzym hoạt động, chứ
không phải tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triến.
Sinh khôi vi sinh vật chứa enzym trong trường hợp này được gọi là chế
phấm enzym thô (trong đó bao gồm enzym, sinh khôi vi sinh vật, nước và
thành phần môi trường). Nhiều trường hợp, người ta sử dụng chế phẩm
enzym thô này để tiến hành các quá trình thủy phân (ví dạ như trong sản
xuất rượu theo phương pháp Mycomant, hay trong sản xuất bia bằng
nguyên liệu thay thê' malt).
Nếu enzym được tách khỏi sinh khối, nước và thành phần m ô i trường,
ta có enzym hoàn toàn sạch. Chế phẩm enzym này gọi là chế phẩm enzym
tinh khiết. Các enzym tinh khiết thường được dùng để sản xuât những sản
phẩm sạch.
250 CHƯƠNG 6

Chế phẩm enzym tinh khiết có liên quan rất nhiều đến enzym cô định.
Do đó việc ứng dụng enzym cô định trong các quá trình sản xuất nằm trong
hướng ứng dụng thứ hai.
2- ứng dụng enzym công nghiệp
Các enzvni được sán xuãt theo qui mỏ công nghiệp được gọi chung là
enzym công nghiệp (industrial enzyms). Các enzym công nghiệp thường ìì\
những enzyni được sản xuất từ vi sinh vật. Do đó trong những phắn snu
này khi trình bày ứng dụng enzym vào nhửng lĩnh vực khác nhau, ta hiểu
như là ứng dụng enzym vi sinh vạt.
Ưng dụng enzym am ylase
Enzym amylase là nhóm enzym tham gia thúv phàn tinh bột. Cơ chè
chuyền hóa tinh bột bởi nhóm enzym này được tóm tiìt như sau.

Tinh bột —
I ’u l l n l . n i . t M ' >I 'l 'i t m v l n s r ■
--------------------------------►Dextrin

.nnvbtM ^ m altose

Dextrin
A m > I f i-'lllt n s l ' t a - r ,
— --------- —----------- ► glucose

Amylase chia ra làm hai nhóm: endoamylase và axoamvỉase.

Endoamylaac: « amylase (EC.3.2.1.1) tham gia phân cắt mối liên kêt
ơ-1,4 glucozit.
Các enzym th a m gia p h â n h ú y « - 1 . 6 g l u c o zi t b a o gồm i s o a m y l a s c
(E C .3 .2 .1.68 ) h a y p o llu la n a s e (E C .3.2.1.41).
Exoamyỉasc: bao gồm: p-amylase (EC.3.2.1.2) tham gia phân giải tinh
b ộ t đ ã d ị c h h ó a v à dextrin thành maltose, glucoamylase ( E C . 3 . 2. 1 . 3 ) , còn
gọi là ainylogluco-sidase tham gia phân hũy dextrin thành glucose.
a-amylrtse: Trong malt tồn tại cà cx-amyiase và Ịì-amyỉase, tt-amylase
còn tồn tại nhiều ở vi sinh vật. M ộ t số độc điểm quan trọng cúa « - a m y l a s e
có liên q u an đ ố n pH và nhiệt độ ta có thè tham kháo ở bảng 6.14.
CÔNG NGHỆ ENZYM 251

Bảng 6.14: Đặc điểm a-amylase

pH tối ưu và khoảng Nhỉệt độ tối Ưu
STT Enzym Nguốn
pH hoạt động (° C )

1 Pancreatic amylase Pancreas của lợn 5,5 - 8,5 (6,0 - 7.0) 40 - 45 (75)

Bacillus
2 ot-amylase vi khuẩn 4 ,5 -9 ,0 (6 ,5 -7 ,5 ) 70 - 85 (95)
subtilỉs

3 ơ-amylase vi khuẩn chịu nhiệt Bac. licheniformic 5,8 - 8,0 (7,0) 90 - 105 (120)

Aspergillus oryzae 4,0 - 7,0

o
in
Ũ5

co
4 ư-amylase nấm sợi

Aspergillus niger 5.0 - 6,0 80

Dịch malt 3,5 - 7,5 60 - 70

5 a-amylase malt
Bột malt (4,5 - 7,0) 85

a-amylase của vi khuẩn được chia làm hai ỉoại:

- Loại amylase chuẩn
- Loại amylase chịu nhiệt.
Loại cx-amylase chuẩn là những enzym được thu nhận từ Bac. subtiỉis
và Bac. amyloliquefaciens. Chúng hoạt động rấ t mạnh ở nhiệt độ 70 -85°c.
Loại a-amylase chịu nhiệt là loại enzym được thu nhận từ tíac.
licheniformic có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 90 -105°c. Tuy nhiên, nhiệt độ
này còn phụ thuộc vào pH và nồng độ ion canxi. Điều kiện tôi ưu cho
enzym chịu nhiệt hoạt động là:
Nồng độ tinh bột là 30cỉf. \ pH = 7,0; nhiệt: 103 -105°c
Nồng độ ion canxi: 70mg/l; thời gian thủy phân: 7 - 1 1 phút.
Nếu pH = 3,5 -ỉ- 4,5; chỉ cần nhiệt độ 80 -90°c trong thời gian
5 - 30 phút enzym sẽ mất hoạt tính. Ngoài ion canxi, nhiều trường hợp
cx-amylase của vi khuẩn được hoạt hóa bởi NaCl. Các kim ioại như đồng, sắt
ức chế hoạt tính của enzym.
Khi thủy phân tinh bột khoai tây, a-amylase chuẩn sẽ tạo thành
những sản phẩm có tỷ lượng như sau:
Gj (glucose): 5% G2 (maltose): 79c G3 (malfcotriose): 13c/c
252 CHƯƠNG 6

G4 (maltotetraose): 4% G5 (maltopentaose): 16%

G5 (maltohexaose): 22% Dextrin bậc cao 33%
Trong công nghiệp enzym, giá trị DE (dextrose equivalent) được biêu
thị cho khả năng phân giải tinh bột, Khi sử dụng a-amylase của vi khuẩn
DE = 20. Khi sử dụng a-amylase của nấm sợi, DE = 40.
a-amylase của nấm sợi: a -a m y la se của n â m sợi thường được sản xuât
từ Aspergillus niger hay Aspergillus oryzae. So với a-amylase của vi khuẩn,
a-amylase của nấm sợi kém bền nhiệt hơn. Khi cho a-amylase của nấm sợi
thủy phân tinh bột sẽ cho những sản phẩm có tỷ lượng như sau:
G j: 8% G3 : 32% G4 : 18% G5 : 9% G6 : 4c/c
Dextrin bậc cao 17%
Hai loại cc-amylase từ nguồn vi khuẩn và từ nguồn nấm sợi có nhiều
đặc tính hoàn toàn không giống nhau. Ta có thể tham khảo báng 6.15.
Bảng 6.15: Đặc tính a-amyíase của vi khuẩn và của nấm sợi
STT Đặc tính a-amylase của nâm sợi a-amylase cùa vi khuấn

1 pH tối ƯU 4.7 - 4 , 9 5.9 - 6,1

2 Nhiệt độ tối ưu 55 - 56° c 65 - 75°c

3 Khả năng chịu nhiệt < 7 0°c 90 - 105°c

4 Lượng canxi trong cấu trúc enzym ít nhiều

p-amyỉase: (EC.3.2.1.2): Enzym nay có trong bột, trong đậu nành,

khoai lang (khoai ngọt).
Enzym này tương tác với amylose trong thành phần tình bột đê tạo
thành maltose như là sản phẩm cuối của phản ứng.
pH tối ưu của enzym |3-amylase là 5,1 -ĩ- 5,5
N hiệt độ tối ưu của p-amylase là 55°c
P-amylase thường được sử dụng thay th ế malt trong sản xuất cồn và
sản xuất bia.
Isoamyỉase: Enzym này phân hủy liên kết a-1,6 glucozit trong tinh bột
để tạo thành dextrin.
Nêu enzym này được nhận từ nấm men và nấm sợi được gọi là
isoamylase (EC.3.2.1.68).
Nếu enzym này được nhận từ vi khuẩn (vi khuẩn Aerobacter aerogenes
hay Klebsiella aerogenes) thì được gọi là pullulanase (EC.3.2.1.41).
N hiệt độ tôi ưu cho những enzym này là 60° c.
CÔNG NGHỆ ENZYM 253

pH tôi ưu cho những enzym này là 4 - 5.

Gỉucoamyỉase (EC.3.2.1.3): Enzym này còn có tên gọi khác là
amyloglucosidase. Chúng thuộc nhóm exo-a-1,4 D-glucohydrolase. Chúng
tham gia phản ứng tạo ra glucose như là sản phẩm cuối cùng. Tùy theo
nguồn thu nhận loại enzym này mà chúng có những đặc tính dựa trên quan
hệ với pH và nhiệt độ khác nhau. Ta có thể tham khảo bảng 6.16.
Bảng 6.16: Đặc tính của glucoamylase
STT Nguổn enzym Khoảng pH Nhiệt độ tối ưu ( °c )
3,0 - 6,0 5 5 -6 0
1 Aspergillus
(4,5 - 5,0) (90 ° C )
2 , 0 - 7 ,0 5 5 -6 5
2 Aspergillus awamori
(3,0 - 5,0) (85)
3,0 - 6,0 5 5 -6 0
3 Rhizopus niveus
(3,0 - 5,5) (70 - 80)

Hiện nay, người ta sử dụng nhiều là glucoamylase ở dạng cố định

(enzym không hòa tan). Glucoamylase có khả năng tạo liên kết với nhiều
chất mang khác nhau.
Enzym amylase được ứng dụng rấ t nhiều trong nhiều lĩnh vực khác
nhau, nhất là trong công nghiệp chế biến thực phẩm.
Hiện nay, trên th ế giới đang sản xuất và thương mại hóa các chế
phẩm enzym amylase như bảng 6.17.
Bảng 6.17: Tên một số sản phẩm thương mại của chế phẩm Amylase
Số thứ tự Enrym Chế phẩm thướng mạ í Nơi sản xuất
Tenase Miỉes laboratories
optỉamyí Miles Kali chemic
1 a*amylase vi khuẩn
BAN Novo Nordisk
Rapodase Gist brocades
Termamyl Novo Nordisk
Taka - therm n Miles laboratories
2 a-amylase vi khuẩn chịu nhiệt
Taka - líte Miles laboratories
opti - therm Miles Kali chemic
Maxamyl Gist brocades
optiđex Mites Kali chemic
3 Amyloglucosidase AMG Novo Nodisk
spezym e Finn Bio chemical
Amygase Gist brocades
Dextomyze Novo Nodisk
4 Deluanching enzym
Promozyme Novo Nodisk
Biozyme Amano
MKC Miles Kali chemic
5 Enzym amylase nấm sợi
Clanase Miles laboratories
Funqamyl Novo Nodisk
 254 CHƯƠNG 6

a) ứng dụng amylase để sản xuất sỉrô và những sản phẩm có vị ngọt cao
Enzym amylase đóng vai trò quan trọng trong sản xuất sirô có hàm
lượng fructose cao. Quá trình sản xuất được thực hiện như sau:
H ạt bắp được ngâm và được xử lý bằng đioxit sulíurơ và vi khuẩn lactic
dế cho hạt trở nên mềm hơn. Sau đó h ạt được tách dầu, phôi, gluten bằng
một lực ly tâm mạnh. Sau đó người ta đưa enzym a-amylase vào tiến hành
thủy phân ở nhiệt độ 105 -1 1 5 °c , và pH = 5,5 - 6,5. Ngoài enzym amylase,
ở giai đoạn này người ta còn sử dụng cả enzym protease, cellưlase,
pectinase để thủy phán nhừng thành phần không phải là tinh bột.
Sau đó, người ta hạ nhiệt xuống 90 - 95°c và tiếp tục cho a-amylase.
t Toàn bộ thời gian tiến hành quá trình này khoảng 2 giờ. Sau đó, người ta
lại cho tiếp amyloglucosidase và tiến hành quá trình đường hóa ở nhiệt độ
55 - 65° c, pH = 4 - 4,5. Kết thúc quá trình đường hóa, người ta tiến hành
lọc và tiến hành trao đổi ion, xử lý bằng than hoạt tính để tách các thành
phần chứa nitơ, các cation, anion. Kết thúc quá trình này, người ta cho vào
đó isoamylase đế tiếp tục phản ứng ở nhiệt độ 55 - 6 0 ° c , pH = 7 - 8 . Đến
giai đoạn này ta thu được dung dịch sirô chứa 42% fructose.
Công việc tiếp theo là nâng cao hàm lượng fructose trong dung dịch
bằng trao đổi ion và cô đặc. Quá trình này được thực hiện như sau:

SOj Chát béo, gluten và phôi

Hạt b ắp— Ngâm — Tách Thủy phàn Thủy phân —

ĩ ỉ t
Vi khuẩn u - Amylase a - Am ylase

Glucose isomerase ,ac,ic (105-115°c (90 • 95°C)

ị pH = 5.5 - 6.5)

isomare hóa - — Trao đổi ion Lọc —— Đưởng hóa —---------

Thành phán P ro te in a n y lo g lu c o s id a s e
chứa nitơ, chất béo (55 . 65°c pH = 4 - 4 5)
c a tio n , a n io n

Siro chứa r Làm tăng Trao dổi ion Sirochứa

42% Fructose hám lượng Fructose và cô đặc 55% Fructose

H ìn h 6.29. Qui trình sản xuất sirô chứa nhiều fructose

Tóm tắ t toàn bộ điều kiện kỳ thuật trong qui trình công nghệ sản xuât
sirô fructose như bảng 6.18.
CÔNG NGHỆ ENZYM 255

Bảng 6.18: Một sô điều kiện kỹ thuật trong sản xuất sirô giàu fructosc
Ị Nống độ Nống độ
STT Các brtc Nổsg độ e»zym (%) DE Nhiệt độ PH \ n 7,
I Ca (mg/l) Mg'1' (mg/l)

Giai đoạn (í-amylase

1 2 -5 105 115 5.5 - 6.5 50 - 100
thủy phân 1 (0,01-0,02)

Giai đoạn u-amylase

2 15 - 20 90 95 5.5 - 6.5 50 - 100
thủy phàn 2 (0.1 - 0.2)

Amyloglucosidase
3 Đường hóa 98 - 99 55 -65 4 - 4.5 5 - 100
(0.1)

42%
4 Isomer hóa Glucose Isomerase 55 - 60 7-8 0
ù 25 - 100
Fructose

Nâng cao hàm 55,95%

5 •
lượng fructose Fructose

b) ứng dụng amylase trong sản xuất cồn từ nguồn tinh bột
Để sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu chứa tình bột, mỗi nước sử dụng
các loại nguyên liệu khác nhau. Ví dụ, ở Mỹ người ta sử dụng nguyên liệu
bột ngô (bắp) để sản xuất cồn, còn ở Brazin iại sử dụng khoai mì (sắn), các
nước khác sử dụng gạo hoặc tấm từ gạo.
Trong sản xuất cồn từ nguồn tinh bột người ta phái thực hiện hai giai
đoạn:
- Giai đoạn đường hóa.
- Giai đoạn rượu hóa.
Giai đoạn đường hóa, người ta bắt buộc phải sử dụng enzym amylase
(trong sản xuất, người ta không bao giờ sứ dụng phương pháp thủy phân
bằng axit hay bằng k iềm vì những nhược điểm rất lứĩi trong kỹ thuật)
Người N hật đã biết sử dụng enzym của nấm mốc trong quá trình
đường hóa để sản xuât rượu SAKE từ cách đây hơn 1700 năm.
Người Trung Quốc đã biết sử dụng các ioài nấm mốc để đường hóa
trong sản xuất rượu cách đây 4000 năm. Người Việt Nam cũng đã biết sản
xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm.
Riêng ở Mỹ, mải đến th ế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm
mốc Aspergillus sang mới biết sử dụng enzym này thay amylase của malt
để sản xuất cồn. Chính vì th ế mới xuất hiện phương pháp m i c o m a l t ( m ầ m
mốc) trong sản xuất cồn và rượu. Nhờ sự du nhập kỹ thuật này từ N hật mà
256 CHƯƠNG 6

người Mỹ tiết kiệm được một khôi lượng malt khổng lồ trong sản xuâ't rượu
(Trước đây người Mỹ vần sử dụng malt như nguồn enzym duy nhất đá’
đường h ó a bột bắp trong sản xuât cồn và sản xuát rượu.
Tại Việt Nam, từ lâu, nhân dân ta đã biết sản xuất rượu từ nguồn tinh
bột bằng bánh men thuốc bắc. Và vào năm 1895, Caimet, Colet, và Boidin
đá sử dụng nấm sợi Rhizopus vào sản xuât rượu. Phương pháp này nhanh
chóng được áp dụng tại Việt Nam và được gọi là phương pháp Amylo.
Phương pháp này được duy trì cho măi tới ngày nay ở nhà máy rượu Binh
Tây, TP. Hồ Chí Minh. Ở Hà Nộỉ, năm 1959 chúng ta đã thay phương pháp
Amylo bằng phương pháp Micomalt bằng cách sử dụng nârn sợi Aspergillus
thay Rhizopus. Việc thay đổi phương pháp sản xuất rượu chủ yếu dựa vào
nguồn nguyên liệu. Trong phương pháp Amylo, người ta sử dụng nguyên
liệu là gạo tấm. Khi hồ hóa, độ nhớt của dung dịch rấ t cao, vì th ế không
thích hợp cho Aspergillus phát triền, trong khi đó, nấm sợi Rhizopus lại
phát triển rấ t tốt trong nguyên liệu này và sinh tổng hợp nhiều enzym
amylase.
Giai đoạn rượu hóa, nhờ nấm men saccharomyces cerevisiae, cũng có
thể coi đây như là một quá trình áp dụng enzym. Quá trìn h rượu hóa là quá
trình h ết sức phức tạp, trải qua rấ t nhiều giai đoạn chuyên hóa từ đường
th àn h cồn nhờ sự tham gia của nhiều enzym khác nhau. Điểm khác với
enzym amylase là ở chỗ các enzym tham gia quá trình rượu hóa nằm trong
tê bào nấm men. Việc điều khiển các quá trình chuyển hóa bởi enzym trong
tê bào thực chất là quá trình điều khiển quá trìn h trao đổi chất của nấm
men trong môi trường chứa đường.
c) ứ ng dụng enzym amylase trong sản xuất bia
T ron g côn g n g h ệ sả n xu ất bia truyền th ố n g , các nước phương Tây chủ
yếu sử dụng en zy m a m y la se của m a lt đ ể th ủ y p h ân tin h b ột tron g m alt, sau
đó m ới đến g ia i đoạn rượu h ó a (giai đ oạn lê n m en ) bởi n âm men
S acch arom yces sp.
Cơ sd khoa học của việc sử dụng amylase của m alt ở chỗ, khi đại mạch
ch u yển từ tr ạ n g th á i h ạ t sa n g tr ạ n g th á i n ảy m ầm (m alt), en zym am ylase
sẽ được tổng hợp và khi đó enzym này sẽ thảy phân tinh bột có trong hạt
tạ o ra n ă n g lượng và v ậ t ch ấ t cho sự tạo th à n h m ầm . N h ư v ậ y v iệc đường
hóa tin h bột tro n g h ạ t n h ờ en zym của ch ính nó. N ếu x é t v ề sự cân bằng
v ậ t ch ấ t th ì th iê n n h iê n đã tạo ra được m ột tr ạ n g th á i ch u yển h ó a rấ t hữu
h iệu v à m a n g tín h k in h t ế cao: k h i đó h ạ t s ẽ chỉ tổ n g hợp ra lượng enzym
a m y la se vừa đủ đ ể th ủ y p h ân h ế t lượng tin h b ột có tron g h ạt.
CÕNG NGHỆ ENZYM 257

Từ đó ta sẽ tháy rằng, nếu ta thay th ế một phần malt bằng nguồn tinh
bột khác sẽ xảy ra hiện tượng thiếu e n z y m amylase cho quá trìn h thủy
phản lượng tinh bột này. Điều đó buộc ta phái cho thêm enzym từ ngoài
vào (không phải enzym axnylase của malt). N h ư vậy vai trò của enzym công
nghiệp chính ở phần thủy phân lượng tinh bột cho thêm này.
Trước năm 1950 các nước có truyền thống sản xuất bia chưa bao giờ
thay th ế malt bằng một loại tinh bột khác. Sau năm 1950, nhiều nước trên
th ế giới đã áp dụng việc thay thê này với tý lượng khoảng 40 - 50% từ
nguồn tinh bột phi malt.
Các lđại enzym được sử dụng cùng với nguyên liệu thay th ế thường
được sản xuất từ nấm sợi Aspergillus oryzae. Nâm sợi này, ngoài sự tổng
hợp amylase còn tổng hợp enzym protease. Enzym này có ý nghĩa rấ t lớn
trong việc làm trong bia. Do đó nguồn enzym từ vi sinh vật rấ t thuận lợi
trong việc sản xuất bia có thay th ế nguyên iiệu malt.
Ngoài ra, trong sản xuất bia, người ta còn sử dụng chế phẩm enzym
cellulase của trichoderma roseum. C h ế phấm cellulase có tác dụng phá vỡ
thành tế bào, tạo điều kiện đề các thành phần có trong tế bào hạt thoát ra
phía ngoài nhờ đó chất lượng bia được nâng cao hơn. Một loại enzym khác
cùng được sử dụng khá rộng rải đó là gluco amylase. Enzym này được sử
dụng đề loại trừ 0 2 có trong bia, giúp quá trình bảo quản bia kéo dài hơn
rất nhiều. Kết quả việc sử dụng enzym trong sản xuất bia cho thâ
thành có thể giâm từ 3 - 109c.
d } ưng dụng cứa enzym trong sán xuất bánh mì
Trong s*n xuất bánh mì, chất lượng bánh phụ thuộc rấ t nhiều vào chất
lượng bột mì (chất lượng gluten, các loại đường có trong bột mì) và hoạt
động của nấm men. Một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượn| bánh mì
là độ xốp của bánh. Độ xốp này phụ thuộc vào chất iượng gluten 'và khẩ
năng tạo ra C 0 2 trong quá trình lên men.
C 02 lại được tạo ra trên cơ sở chuyển hóa đường nhờ nấm men. Sự
chuyển hóa này có đường nhờ lượng đường có trong bột mì và nhờ hoạt
động sống của nấm men. Lượng đường có trong bột mì thường rấ t ít, không
đủ cho quá trình tạo lượng C 02 cần thiết đê làm nở bánh.
Để giải quyết tình hình này, người ta bổ sung lượng enzym amylase
cần thiết. Enzym amylase sẽ tiến hành thủy phản tinh bột và tạo thành
đường. Nhiều kết quả thực tế cho thây chỉ cần bổ sung 0,002 - 0,003% chế
phẩm en zym am y la se (k h oảng 20 - 30 gam c h ế phẩm n ấm sợi th ô) đủ làm
258 CHƯƠNG 6

cho b á n h nở tố t hơn và thơm hơn. E nzym am y la se của v i khu ẩn ít được sử

d ụ n g tro n g s ả n xuất b án h mì vì k h ả n ă n g chịu n h iệ t của ch ú ng khá cao.
Khi tiến hành nướng bánh, nhiệt độ đạt 80 -110°c enzym này vần tiếp tục
tiế n h à n h th ủ y p h ân là m cho b ánh k ém ch â t ỉượng hơn. V iệc sử dụng
en zy m a m y la se vào sả n xu ất b ánh m ì đã được áp dụng rất rộn g rài ở nhiều
nước. H ầu như tấ t cả các nước đều sử d ụng en zym từ n ấm sợi. E nzym từ
n ấ m sợi có ưu đ iểm là chịu n h iệ t k ém , n ên sau k h i k ế t thúc quá trìn h thủy
phân, rấ t dễ bị phá hủy ở nhiệt độ ban đầu khỉ nướng bánh. M ặt khác, pH
tô i ưu cho a m y la se của n ấm m ốc n ằm tro n g vù ng a x it, trù n g hợp với pH
h o ạ t đ ộn g tố i ưu của n ấm m en. K hi sử d ụng c h ế phầm a m y la se với tỷ lệ
trê n có th ể tạo thêm cho bột ìượng đường khoảng 2 - 4%, rú t ngắn quá
trìn h nhào bột, làm tăng th ể tích bánh khoảng 5 - 15%.
Ưu đ iểm quan trọn g khác của v iệc sử d ụ n g en zym tro n g sả n xuất bánh
m ì là ta h oàn toàn có th ể sử d ụng các lo ạ i b ột mì có châ't lượng trung bình
vào sả n xuất đ ể thu n h ậ n được b án h m ì có ch ấ t lượng tốt.
Đ iểm lưu ý quan trọ n g là tron g sả n xu ất b ánh m ì, người ta rất sợ
g lu ten bị p h á hủy. C h ín h vì th ế , nếu c h ế p hẩm en zym am y la se có chứa
thêm protease sẽ làm cho gluten dễ dàng bị phân giải. Khi đó C 0 2 rấ t khó
giữ được, b án h mì sẽ k ém xốp. Tuy n h iê n , tron g m ột sô" trường hợp, người
ta v ẫ n có th ể sử dụng p rotease vđi liều lượng rấ t nhỏ k h i gặp p hải bột mì
bị d ín h chặt.
e) ứ n g d ụ n g enzym am ylase trong sản xu ấ t tương và nước chấm
B ả n ch ấ t hóa sin h của quá trìn h sả n xuâ't tương và nưđc ch ấm là quá
tr ìn h p h ân g iả i p rotein v à tin h b ột là ch ín h . N goài ra còn có m ột loạt quá
trìn h tạo mùi, tạo màu khác. Quá trình thủy phân tinh bột là quá trình cổ
sự th a m g ia en zy m a m y la se của n ấm sợi. K ết quả của quá trìn h n ày là tạo
ra đường tro n g sả n phẩm .
S ả n xu ất tương là quá trìn h sả n xu ất th ủ côn g và sử dụng vi sin h vật
tự n h iê n . Sau này, n h iều n g h iên cứu có sử dụng vi sin h v ậ t th u ần khiết.
Việc sử dụng chế phẩm vi sinh v ật thuần k h iết đã nâng cao khả nâng thủy
phân của amyỉase, của n ấ m sợi lên rấ t nhiều. Mặt khác, quá trìn h sản xuất
b ằ n g c h ế p h ẩ m vi sin h v ậ t th u ần k h iế t đ ảm bảo tín h ổn đ ịn h của sản
p hẩm .
p ứ n g d ụ n g am ylase trong ch ế biến thực p h ẩ m g ia súc
T ron g c h ế b iế n thực p h ẩm gia súc, th à n h p h ần n gử cốc ch iếm m ột khối
lượng rấ t lớn. Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để táng
h iệu su ấ t sử d ụng n ă n g lượng từ nguồn tin h b ột, người ta thường cho thêm
CÔNG NGHỆ ENZYM 259

enzym amyiase vào. Enzym amylase sè tham gia phân giải tinh bột tạo
th àn h đường, giúp quá trình tiêu hóa tinh bột tốt hơn.
g) ứ ng dụng enzym amylase trong công nghiệp dệt
Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase của vi
khuẩn, để tẩy tinh bột. Trong vải tha thường chứa khoảng 5c/r tinh bột và
những tạp chất khác. Do đó, khi sử dụng chế phẩm enzym amylase của vi
khuẩn vải sẽ tốt hơn. Người ta thường sử dụng lượng chế phẩm amylase
khoảng 0,3 - 0,6 gA dung dịch và thời gian xử lý là 5 - 15 phút ở nhiệt độ
90° c.
Ngoài chế phẩm amylase từ vi khuẩn, hiện nay nhiều nước có sử dụng
amylase từ nám sợi. Cho đến nay có rấ t nhiều nước đã sử dụng enzym
trong công nghiệp dệt để tăng khả năng cạnh tranh các hàng vải, sợi. Các
nước sử dụng lượng enzym nhiều nhất trong linh vực này là Mỹ, N hật,
Pháp, Đan Mạch.
ứ n g dụng của enzym celỉulase
Cellulase là một phức hệ enzym gồm nhiều enzym tham gia nhừng
phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose, để cuôì cùng tạo ra đường
glucose. Theo Wood và Mc. Cral (19*79) hệ enzym phân hủy cellulose chủ
yếu gồm ba loại enzym:
- Exocellulase hay exobiohyđrolase (EC.3.2.1.91)
- Endocelluiase hay endoglucanase (EC.3.2.1.4)
- p-giucosidase hay cellbiase (EO.3.2.1.21)
1- Exocellulase hay exobiohydrolase. còn được gọi ỉà enzym hay
hoạt tính (C j- activity). Enzym này còn được gọi theo một tên khác là
1,4-P-D-glucan cellobiohydrolase. Chúng chuyển hóa cellobiose từ đầu không
khử của chuồi gỉucan và từ cellodextrin.
E nzym n ày được tổ n g hợp n hiều ở trichoderm a và asp ergillu s.
2- Endoglucanase hay endocellulase, hay hoạt tính cx (CX-activity),
chúng còn có một tên khác là 1,4-P-D glucan-4-glucomohydrolase.
3- p~gỉucosỉdare, hay callob iase, hay P-d glucoside glucohydrolase.
E n zym n à y th am gia thủy phân ceỉlob iose, cellod extrin tạo th à n h
glucose. C húng k h ôn g có k h ả n ăn g phần giả i cellu lose h ay ceỉlod extrỉn bậc
cao. H iệ n n a y cellu lase được ứng dụng rất n h iều trong những lĩn h vực sau:
a) ứ n g dụng trong xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose. Các châ't thải
hữu cơ chứa cellu lose ch iếm m ột k hôi lượng rất lớn trong tổ n g s ố ch ất th ải
hữu cơ h iệ n nay ở các đô th ị và các khu côn g n gh iệp tạ i các nước trôn th ế
260 CHƯƠNG 6

giới. Trong các chất thái hữu cơ có nguồn gòc thực vật. cellulose chiêm
khoang 50r(. Các chất hữu cơ chứa cellulose thường là những chât rảt khó
phân hủy trong điều kiện tự nhiên. Chúng chí bị enzym cellulase của vi
sinh vật tham gia phân hủv trong điều kiện ôn hòa.
Nêu đè các chất thái hửu cơ chứa cellulose tự phân hủy trong điều kiện
tự nhiên thì thời gian phân hủy rất lâu. Yêu tô quan trọng là sô lượng và
chat lượng các loài vi sinh vật tham gia phân hũy các hợp chất chứa
cellulose trong điều kiện tự nhiên thường không đồng đều. Những chât thải
hữu cơ nào chứa nhiều vi sinh vật có khá năng phân giải cellulose thì thời
gian cần cho quá trình phán giái này ngắn. Ngược lại nếu chất thái chứa ít
vi sinh vật có khá nãng phân giái cellulose thì thời gian phân giải sè rất
dài.
Thực tê cho thấy, thời gian cần thiết cho sự phân giải các chất thải
hừu cơ chứa cellulose trong điều kiện tự nhiên là trén 8 tháng ỏ điều kiện
khí hậu nhiệt đới. Vùng khí hậu ÔI1 đới và hàn đới, thời gian phân hủy kéo
dài hơn nhiều. Thời gian phân húy các chát thái này càng lâu, càng gây ra
hiện tượng ô nhiềm không khí, ô nhiễm nước và ò nhiễm dất. Mặt khác các
vật chất chứa trong các dạng chất thái này rát khó chuyên hóa vào mắt
xích trơng dây chuyền chuyền hóa vật chất trong thiên nhiên. Từ đó tạo ra
hiện tượng mất càn bằng sinh thái. Đẻ khác phục tình trạng này, các nhà
khoa học dã đưa vào khôi ủ chế phẩm vi sinh vật giàu celỉulase. Kết quả là
các hợp chât chứa lignocellulose và các hợp chất chứa pectinocellulose bị
phán húy trong thời gian dưới 1 tháng. Kết quả này rất có ý nghĩa trong
công nghệ bao vệ môi trường.
b) ưng dụng cnzym ccỉlulasc trong sán xuất các sản phẩm thực phâtn
Các sản phẩm thực phẩm dược sản xuất từ các nguyên liệu thực vật
chứa nhiều cellulose gây ra hiện tượng khó tiêu hóa ở người. Người và
những động vật không nhai lại thường thiếu vi sinh vật phân giải cellulose
trong đường tiêu hóa, do đó, việc chế biên thực phẩm (nhát là inột sô sản
phẩm đồ hộp) bằng chê phẩm cellulase có ý nghĩa làm tăng hiệu suát sử
dụng thức ăn.
Tuy nhiên, cũng phải nhận thây rằng, ờ các nước phương Tây, do khẩu
phần ăn quá dư thừa thịt cá, nên việc thêm cho các nguyên liệu thực vật
chứa cellulose râ t có lợi. Nguyên liệu này đóng vai trò như chât độn cho
quá trình tiêu hóa.
c) ứng dụng enzym ccllulase trong tế bào vi sinh vật như một loại
phản bón vi sinh vật
CÓNG NGHỆ ENZYM 2 ( il

Đà có nhiều nước sư dụng chẻ phàm vi sinh vạt có kha năng sinh tỏng
hợp celiulase mạnh như một loại phân hón vi sinh vật. Các chê pliấin này
là nhừng tê bào vi sinh vật sông. Khi được bón vào đãt trổng cò nhiêu chất
hừu cơ c h ứ a c el l u lo s e, c h ú n g sẽ p h â n h u y n h a n h các c h ấ t h ừ u cơ n a y t ạ o
thành mùn, giúp cho cây tróng phát triến nhanh.
d) ưỉiịị d ụ n g enzvrn celiuiasc (ỉc nàn xuát thực ph à m ÍỊKÍ súc
Đôi với động vật nhai lại như trâu, bò, ngựa, dô, việc ứng đụng onzvni
celỉulaso đê san xuất thực phám gia súc là không cán thiôt.
Dõi với n h ữ n g đ ộ n g vật k h ô n g n h ai lại, việc t húy p h â n t v ll ul as o sư !>ộ
t r o ng ch ố b i ê n t hực p h à m gia súc là (iiổu rấ t cần thiỏt.
Nhiều kêt qua nghỉén cứu cho thây việc cho thòm chó* pliấm ('11/vin
cellulíìse vào thực phâni gia súc làm tăng trọng gia sue nit rõ.
C’ ỉ^ììiỊ (Ịiiìiiị enzym cellulose front* kỹ thuật (ỉì truycìị
Te bao thực vật thường chứa lignocvllulose hoạc }H*i'tinociỉluỉos(\ (Vic
thành phắn khác cũng thuộc họ náy. trong đó có ca mamian va glucan.
('ác* hựp chat ỉignoccỉluỉost* hay pectinocellulosí' thường rát kho phá,
trong khi trong công nghệ tê bào lại cán thu nhận tê hào trail, ( ’hi khi ít*
ỈKH) thực vật chuyên sang Liạng thái tò báo trần tin qnn trình chu vòn gt-n
mơi thực hiện dẻ (làng (tè biio tran là tẽ bào ílưựr tacli khói vo Ci'llulost'i
('ác nhà (lì truyền cho biết phương pháp sư dụng enzym 1‘t‘Uuluse (ỉà
phá vớ tẽ hao thực vật <iê tạo rí 1 tẽ bao tran lã tót nhât. Tè bào tràn thực
vật (protoplast) C U I ' -Ị như tế bão trẩn cùa nãni men (spheroplast) (l(»u cỏ các
(ỉậc tinlì quan trọng như sau:
■■ T ẻ b à o t r ầ n dề d a n g n h ậ n các đ ơ n vị di t r u y ổ n lạ, t r o n g k h i các lẽ
b à o n g u y ê n t h è k h ò u g cỏ t í n h c h a t n à y í t r ừ tỏ b à o vi k h u ã n ) .
Tẽ bào trần có khá nàng tự tái tạo thanh ũ* hao khi til (lưa chung
vào trơng mỏi trườug dinh dường thích hợp.
: Tố bao trần có khá níìng phàn chia bình thường như các tố bào khác
và mang theo đó lĩhửng nhân tô di truyềi^mới.
Enzym cellulase thường không gây ánh hưưng xâu tới 11hừng tính chất
này cúa tế bào trần.
Ngoài tế bào thực vật, khi tiến hành tạo tè bào trần của nấm 111011,
người ta cũng sứ dụng enzyni cellulase. Thành tế bào nấm men chửa hai
chât là gỉucan và m a n n a n với số lượng 1ỚI1. hai t h à n h phần n à y thường rất
bồn. do đó các nhà khoa học lại phái nhờ sự can thiệp cùa enzyin oellulase
íiê phá vờ chúng. Kết quá việc sư dụng enzvni cellulaso giúp ta thu được te
262 CHƯƠNG 6

bào trầ n của nấm men giông như thu tê bào trầ n của thực vật.
ứ n g dụng enzym pectinase
Pectin là hợp chất polyme của axit galacturonic, ester methyl và một
sô' th àn h phần nhỏ khác chỉ tồn tại trong tế bào thực vật. Cacbohyđrat tồn
tại cùng pectin bao gồm: araban, arabinoxylan, gaclactan. Pectin chia ra
làm hai loại: loại tan trong nước và loại không tan trong nước. Loại không
tan trong nước còn được gọi là protopectin và chúng thường liên kết với
cellulose đê tạo thành pectinocellulose.
Tồn tại ba nhóm enzym pectinase phân giải pectin
- Pectin methyl esterase
- Depolyinease
- Exoenzym pectinase
Pectin methyl esterase (EC-3.1.1.11): Enzym này tham gia phán giải
pectin thành axit pectic và methanol. Enzym này còn có tên khác là
pectiestenase (PE). Hiệu suất thủy phân pectin của enzym này rất cao, có
thể đạt được 98%.
Pectinesterase của nấm sợi hoạt động m ạnh ơ pH 3 - 5 .
Cả hai loại pectinase này bị biến tính ở nhiệt độ 80°c.
Enzym pectin methyl esterase tham gia tác động vào COOCH3 theo cơ
chè sau.

Vị trí tác động cúa enzyme (PE)

COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3

COOH

Pcctin depoỉymease: Enzym này có trong tế bào thực vật. Tuy nhiên
hiện nay người ta sản xuất enzym này theo qui mô công nghiệp từ nâ'm sợi
và từ vi khuẩn. Chúng được phân ra làm 4 loại như sau:
1- Endo pectin transelim inase (EC.4.2.2.3). Viết tắ t là PTE - pectiliase
2- Endo pectin axit transelim inase (EC.4.2.2.1). Viết tá t PATE
CÔNG NGHỆ ENZYM 263

3- Enđo-poly galacturonase (EC.3.2.1.15). Viết tắ t PG

4- Endo-poly methyl galacturonase (PMG)
Các enzym này thường phân cắt liên kết glucozit trong cấu tạo của
pectin:

o- -o
COOH o OH
Enzym polygalacturonase tham gia tác động vào glucoside cuối cùng để
tạo ra những phân tử cấu thành.
COOH COOH COOH COOH

Vị trí tác động của PG

Tùy theo nguồn thu nhận enzym depolymease mà chúng có pH tôi ưu
khác nhau. Ta có thề tham khảo pH tôi ưu ciia các enzym này trong bảng
6.19.
Bảng 6.19: Giá trị pH tổi ưu của depolymeasc
số thử tự Nguổn enzym Loại enzym pH tối ưu

1 Aspergillus niga Endo - PMG 5,2

2 Flavobacterium pectinovorum Endo - PMG 7,4 - 8,2

3 Aspergillus niger E n d o -P G 4,7 - 4,8

4 Aspergillus sp. Endo - PG 3 ,7 -4 ,2

5 Coniothyrum diplodiela Endo PG 4,4

6 Aspergillus sojae Endo PTE 5,5

7 Bacterium polymyxa Endo PTE 8.9 - 9,1

5- Exoenzym là những enzym giải phóng axit galacturonic bắt đầu từ

điểm cuối của phân tử pectin. Enzym pectinase được ứng dụng chủ yếu để
phá vở thành tế bào của quả nhằm giải phóng các chất có trong tế bào của
quả ra ngoài.
Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầu
tiên vào năm 1930. Từ đó đến nay việc áp dụng enzym này đả trở nên rất
264 CHƯƠNG 6

phổ biến ở nhiều nước trên thê" giới.

Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp
ép. Nếu pectin còn nhiều sè theo vào nước quả và gây ra hiện tượng nước
quả bị đục, có độ keo cao và rấ t khó lọc trong.
Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90 - 95%. Nếu ta chỉ nghiền
sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60 - 70% là tôi đa. Khi ta
cho enzym pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15 * 30%. Nhiều trường hợp,
hiệu suât ép tăng đến 50c/c. Liều lượng chế phẩm enzym tinh khiết cho vào
là 0,03 - 0,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5 - 2%. Nhiệt độ duy trì cho quá
trìn h thủy phân là 43 -45°C: Thời gian thủy phân là 4 - 8 giờ. Dịch quả thu
được khi xử lý bằng pectiqase sề trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và
hiệu quả kinh tế rất rõ.
Quá trình ứng dụng đế sản xuất dịch quả như sơ đồ 6.2.
Quả

Rửa
j
Nghiền nát

Thu khối nghiền

* Gia ♦nhiệt ...

I Xử lý enzym

ỷ
Ép
♦

Thu dịch ép dạng sệt

I
Xử lý enzym Làm nóng nhanh

- Làm sảng I
- ổn định sạch
Siêu âm Ly tâm
- lọc
♦
Nưởc quả trong Nuớc quả trong Nưởc quả
. Sơ đồ 6.2: Công nghệ thu nhận dịch quả có ứng dụng enzym
ứ n g dụng enzyra protease
Enzym protease ià nhừng enzym tham gia phân giải liên k ết peptit
cùa phán tử protein. Ngoài cách phân loại thông thường ra, protease được
CÕNG NGHỆ ENZYM 265

phân loại theo cấu trúc trung tâm hoạt động cua các enzym. Theo cách
phân loại này, protease được chia làm 4 nhóm:
Nhóm 1: bao gồm các loại protease chứa nhóm mercapto trong trung
tâm hoạt động. Thuộc nhóm này gồm papain, bromelin, ficin, và một sô
protease của vi sinh vật.
Nhóm 2: Nhóm metalloprotease, bao gồm những protease có chứa ion
kim loại như kẽm, magie, cobalt trong trung tâm hoạt động.
Nhóm 3: bao gồm những protease chứa gốc histidin trong trung tám
hoạt động, ví dụ như trypsin, chymotripsin, và protease của vi khuấn.
Nhóm 4: là những protease axit, chứa gốc asparagyh hay glutamyl
trong trung tâm hoạt động, ví dụ như pepsin, các protease của Iiấm sợi.
a)Một sô enzym từ nguồn thực vật và động vật
P ancreatin protease: Trong hệ thống thương mại, tồn tại hỗn hợp
enzym:
- Trypsin (9002-07-7)
- Chymotrypsin (9004-07-3)
Các enzym này được thu nhận từ tuyến tụy cùa động vật bao gồm cá
peptidase, amylase và lipase. Chúng hoạt động mạnh ở pH = G - 8, nhiệt (lộ
40 - 45 C.
Pepsin (EC.3.4.4.1): Pepsin được thu Iihạn từ bao tử heo (lợn). Chúng
được phôi hợp với Rennin đế sản xuât phomai. Chúng hoạt động mạnh ơ
pH 2 - 4 , nhiệt độ ỉà 50°c.
Renin (EC.3.4.4.3): Renin thường được thu nhận tử bao tữ cùa cừu, dỏ,
và cả heo. Chúng là loại enzym rá t đặc biệt, được ứng dụng nhiều trong sán
xuất phomai.
Papain (EC.3.4.22.2): Là loại enzym của thực vật, papain thường được
khai thác từ quả đu đủ. Trong thành phần mù cùa quả đu dù, hai thành
phần protease chiếm khôi lượng lớn là papain và chymopapain. Chúng được
ứng dụng nhiều trong chế biến thịt, sản xuất bia, sản xuất bánh nướng và
trong y học.
pH tối ưu của papain là 7,5. Nhiệt độ tỏi ưu cho papain hoạt động là
55°c - 60° c.
Bromelin (EC.3.4.22.5): Bromelin là một loại protease được khai thác
từ cây dứa (khóm). Chúng có nhiều ở đọt dứa phần chồi trên quả. Tính chất
của bromelin gần giông papain nhưng có điểm khác là chúng kém bền hơn
papain.
266 CHƯƠNG 6

Ficin (EC.3.4.22.3): Loại enzym này được tìm thấy ở các quả của cây
sung. Chúng có tín h chất rấ t giốhg papain về mọi phương diện.
b) Enzym protease của vi sinh vật
Protease của vi sinh vật râ't phong phú. Chúng Tất khác nhau về mức
tôì ưu của pH, nh iệt độ, hoạt tính xúc tác, độ bền cũng như tác động của
chất kìm hám.
P r o te a s e c ủ a v i k h u ẩn : Vi khuẩn có khả n ă n g sin h tổ n g hợp h ai loại
enzym
* Protease kiềm
* Protease axit
Protease kiềm (EC.3.4.21.14): Loại protease này được sản xuất từ vi
khuẩn Bacillus subtilis.
Loại protease kiềm hoạt động mạnh ở khoảng pH 7 - 11. Trong
thương mại chúng còn có tên là enzym tẩy rửa (detergent enzym). Loại
enzym này được ứng dụng rấ t nhiều trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa.
Protease trung tính (EC.3.4.24.4): Enzym này thuộc nhóm metalloenzym.
Chúng hoạt động mạnh ở pH 6 - 9 . Chúng được khai thác từ Bacillus subtilis,
Bacillus thermoproteoỉyticus, và Streptomyces griseus. Trong thương mại,
chúng dược bán ở dạng bột Chúng được ứng dụng nhiều trong thuộc da, trong
sản xuất bia, và trong sản xuất protein đậm đặc.
Đặc điểm của protease kiềm và protease trung tính được tóm tắ t trong
bảng 6.20.
Bảng 6.20: Đặc điểm protease trung tính và protease kiềm của vi khuẩn
STT Tính chấỉ Protease kiêm Protease trung tính

1 Khoảng pH hoạt động 7,0 - 11.0 6 ,0 -9 ,0

2 pH Ổn định tối ưu 7,5 - 9,5 6 .0 - 8 .0

3 Chất kim hãm Các chất kim hãm trong đậu nành
Sodium dodecye sulfate
và trong khoai tây

4 Cơ chất đặc trưng Ester, amid, peptit khác nhau Một số esler và peptít

Protease của nấm sợi: Protease của nấm sợi có thể tồn tại ở cả ba
dạng protease theo quan hệ với pH:
- Protease axit
- Protease trung tính
- Protease kiềm
CÓNG NGHỆ ENZYM 267

Protease axit và protease trung tính của nấm sợi được ứng dụng nhiều
trong sản xuất bia, sản xuất bánh nướng. Protease kiềm dược sử dụng trong
công nghệ thuộc da.
Đặc tính cơ bản của protease nấm sợi dược trình bày trong bảng 6.21.
Bảng 6.21: Đặc điểm protcase nấm sợi
Khoảng pH phán hùy
STT Vi sinh vật Ổn định ỞpH Chất ức chế
Hemoglobin Cazein

1 Aspergillus saitoi 3,0 - 4,5 2 ,5 - 3 .0 2,0 - 5,0 NBS

2 Aspergillus oryzae 3 ,0 - 4 ,0 2,5 - 3,0 5.0

3 Aspergillus oryzae 5 ,5 - 7 ,5 7,0 EDTA

(Protease trung tính)

4 Aspergllus oryzae 6 .0 -9 .5 6 , 5 - 1 0 ,0 7 , 0 - 8 ,0 DIFD

(Protease kiềm)

5 Paccilomyces varoiti 3,5 - 5 . 5 3.0 3,0 - 5,0

6 Rhizopus cheminsis 5.0 2 ,9 - 3,3 3,8 - 6 ,5

7 Mucor pusillus 3 .5 - 4 ,5 5.6 3,0 - 6 , 0

Trên thương trường hiện nay tồn tại nhiều sản phẩm thương mại
protease khác nhau. Các sản phẩm thương mai có uy tín bao gồm nhừng
sản phâni được ghi trong bảng 6.22.
Bảng 6.22: Một sổ sản phấni protcasc thương mại
STT Loại enzym Tên thiiơng mại Ndi sàn xuất

1 Enzym nấm sợi Amano-A-Fungal Protease Amano Miles laboratories

2 Protease trung tỉnh NT. Proteolytic Neutrase Miles laboratories Novo - Nodisk

Cùng với enzvm amylase, enzym protease được ứng dụng rấ t rộng rãi
trong nhiều linh vực sân xuất, cũng như trong cuộc sống.
Các lính vực ứng dụng enzym protease được liệt ké trong bảng 6.23.
a) ứng dụng protease trong sản xuất các chát tẩy rửa
Từ nám 1913 enzyra đã được ứng dụng trong sản xuất các chất tẩy rửa
tại công ty hóa học OTTO ROHM của Đức.
Enzym trypsin và chimotrypsin hoạt động mạnh ở pH 7 - 9 được xử lý
cùng carbonate natri trưđc.
Enzym vi khuẩn đầu tiên được ứng dụng để sản xuất chất tẩy rửa là
protease Bio.40 từ năm 1959, tại nhà máy Gebruder Schuyder (Thụy Điển).
268 CHƯƠNG 6

Bảng 6.23: Các ứng dụng cua Proteasc

S TT L ĩn h vự c ú n g d ụ n g L o ạ t e n zym M ục đ íc h ứ ng d ụ n g

1 Chất tây lưa Protease kiếm Làm sach cac vết bân boi protease ơ quăn. áo. và mũng. mén ...
2 Còng nghiệp S íia Rerinm Đổng lu sừn trong san xuãt phomai
Protease nấm sợi Thay thể Renmn
Chymosm Thảnh phấn hoạt hóa lentìin
Protease San xtỉâl phomai
3 Công nghiệp da Trypsin Lam sach (1,1
Protease khác Làm sạch lóng thú
4 Công nghiêp bia Pap3ín Lãm trong và ỏn dinh bia
5 Công nghiệp bánh Protease Irung tinh Làm íăng chát luọng bnnh
6 Công Iighiệp chẻ biến thịt, ai papam Làm mém thịl. ca
7 Còng nghiệp thục phãm Protease các loại Làm tăng ch.il luonọ protein nguyên liêu protein rĩảu nanh gUỉten
8 San phám co vt ngọt ĩhetrnoly/ín Chuyên hoa tíorụỉ lõng hop aspartame
9 Trong y líỌC Trypsin Lám sạch mó chết
10 Insulin Chymopapain Lãm sạch mó chết
Car boxypetidase Chư/ẽn hoa msultn cua lon sang msulm nguói
Tiypsme i

0 66 68 70 72 74 76 /8 80 82 84 86 Nãrn
Hình 6.30: Tình hình ứng dụng enzym vào sơn xuất chát tà\ẫrửa ở
các nước châu Âu và châu M \
Hâng Novo Nodisk của Đan Mạch đã sản xuất theo qui mô còng nghiệp
protease kiềm từ bacillus licheniformis. Sau một thời gian dài việc ứng
dụng enzym trong sản xuất chất tẩy rứa chậm lại, thì từ nhừng năm 1968 -
1970 việc ứng dụng này lại phát triển rất. nhanh. Năm 1985, 70'/ các còng
ty sản xuất chất tẩy rửa ở châu Âu có ứng dụng enzym, trong khi ờ Mỹ chi
có 15r/t các công ty sán xuất chất tây rứa có ứng dụng enzym. Ta có thè
xem H.6.30.
CÔNG NGHỆ ENZYM 269

Khi cho enzym vào trong thành phần của chàt tẩy rứa, người ta
thường tạo hạt enzyin đỏ tránh hiện tượng biến tính nhiệt, pH và hoạt tính
cùa nước.
ơ châu Au. người ta sàn xuất chát tẩy rửa có thành phần trung bình
như bang 6.24.
Báng 6.24. Thùììĩì phủìì trung bình cúa chùt /ấy rửa ở các nước châu Âu
STT Thành phán C h â t tẩ y rửa b ộ t (%) C h ấ t tá y rửa lò n g (°o)
1 Các anion hoạt hóa 2 - 10 8 - 10
2 Các chất hoạt hóa khóng phải lon 0,5 - 6 18-20
3 Xà phỏng 1-5 7 - 12

cn
4 Sequstrant

ỏ
5 Ethyíenedia mínetetraacetic axit 20 - 30 1
6 Chát hoạt hóa
ỉ Triethanolanriine 7 - 13
8 Ethanol 4 -6
9 Propylene glycol 4 -6
10 Enzym 0.5 1
11 Chất mùi 0.2 0,4
12 Chất tạo trắng 0.4 - 0,8 0,2
13 Sulfat natri cho đủ 100%
14 _ Nước cho đủ 100%

Lượng sứ dụng trong khi tẩy ra không hoàn toàn giỏng nhau ớ các
nước. Ớ các nước châu Âu lượng sử dụng là 4 - lOg/lít.
b) Ưng dụng protcasc trong công nghiệp da
Việc sán xuất da dộng vật hiện nay hoàn toàn thủ cỏng. Enzym
protease có thế được ứng dụng vào trong một số công doạn của côag nghiệp
da, trong đó có hai công đoạn có thề sử dụng enzym:
- Công đoạn tách lông thú khỏi da.
- Cóng đoạn làm sạch da.
Lông thư là một loại tt-keratin. tt-keratin hoàn toàn không tan trong
nước và chứa rấ t nhiều nhóm cystin. Lông được gắn vào collagen cùa da.
Collagen chứa rát nhiều glycin, alanin, prolin, hydroxyproline. Khi ta cho
enzym protease vào, enzym sè tham gia phân hủy moncollagen cua da, nhờ
đó lông thú sẽ rời ra.
Trong công nghiệp da, người ta thường sử dụng enzym protease kiềm.
Cách tiến hành rấ t đơn giản: người ta ngâm da thú trong dung dịch có chứa
enzym ở nhiệt độ thường trong thời gian từ 10 - 20 giờ. Sau đó người ta
làm sạch lông thú một cách dể dàng.
270 CHƯƠNG 6

c) ứ ng dụng tổng hợp Aspartam

Aspartam là một chất ngọt có năng lượng rá t thâ'p, nhưng lại có độ
ngọt rấ t cao. A spartam là một dipeptide chứa L aspartic axit và methyl
ester của L - phenylalanin. Độ ngọt phụ thuộc vào hỗn hợp của hai loại axit
này; a-aspartam e có độ ngọt gấp 150 - 200 lần độ ngọt của đường
saccharose, nhưng (3-aspartam lại có vị đắng.

o 0
H,N CH — c — N — CH — CO CH,

H,N — CH c — N — C H — co— OCH,

[ì - aspartam (22899 - 61 - 8)
có vị đắng

Trong sản xuất aspartam , người ta có sử dụng en 2ym thermolysin

(EC.3.4.24.4). Đây là loại enzym thuộc nhóm metaỉlloprotease được sảa
xuất từ vi khuẩn Bacillus thermoproteolyticus.
Dưới tác dụng của enzym thermolyzin, phản ứng xảy ra như sau.
CÔNG NGHỆ ENZYM 271

o
Z-N H-C H-C-O H
I
CH,
I
c=o
I
OH

L. z. Aspartic axit D. z. Phenoylalanin — OCH3

o
II
z “ NH — CH — C — N — CH — c — OCH3 + H2N - CH - c - OCH3
I I I
ch2 H CH,
I
c =o

OH
L. z. Asp.l.Phe - OCH3 D.I.Phe — OCH.

-o

I. z. Asp.l.Phe — OCH3 D.I.Phe - OCH,

a - aspartame

ở đầy: z = benzyloxycarboxyl
Hỉện nay có hai công ty trên th ế giới sản xuất lượng aspartam lớn
n hất là Toyo Soda (Nhật) và DSM (Hà Lan).
d) S ả n xu ấ t in s u lin cho người từ in s u lin heo
Insulin của người và heo chỉ khác nhau 1 amino axit (threonỉn ha^
alanin). Trong công nghệ sản xuất insulin cho người từ insulin của heo
người ta có sử dụng hai loại enzym:
- Carboxypeptidase A.
- Trypsine.
Các enzym này tham gia quá trình chuyển hóa các amino axit sao cho
thành phần, số lượng và thứ tự sắp xếp cua chủng giông như insulin của
người.
e) ứ n g d ụ n g proteose trong c h ế biến th ịt
Trong chế biến thịt, ngưởi ta thường cho vào th ịt 0,002% chế phẩm
enzym tinh khiết và đem ướp lạnh, bằng cách này th ịt giữ được màu tự
nhiên lâu hơn cách bảo quản thôn** A^ương. Măt khác, th ịt được xử lý bằng
272 CHƯƠNG 6

enzym protease có hiệu suất hấp thụ cao hơn rấ t nhiều so với th ịt không xử
lý.
f) ứ ng dụng proteasc trong chế biến sữa
Trong chế biến các sản phẩm từ sữa, người ta sử dụng khá nhiều loại
enzym khác nhau. Các enzym đó có th ể liệt kê như bảng 6.25.
Bảng 6.25. Các loại cnzym dược ứng dụng trong chế biến
STT Loại enzym -''’Nguổn

I Renin

Chymosin (EC.3.4.4 3) CỪU non

Pepsin (EC.3.4.4.1) Cừu, heo, gà

Các ioại renin vi sinh vật Mucor miehei, Mucor pusillus, Enđothia parasitica,
Bacillus subtilis, Bacillus mensentericus, Bacillus
polymyxa, Bac. licheniformis, Bac. megaterium,
Rhizopus sp. Asp. megaterium, Rhizopus sp. Asp.
oryzae, Candida sp

»-ór• Các íoại protease khác

Papain (EC.3.4.22.2) Quả đu đủ

Ficin(EC.3 4.22.3) Quả sung

Trypsin (EC 3.4.4 4) Heo, bò

Chymotripsine {EC.3.4.4.5} Heo, bò

Bromelin Dứa

Trong chế biến sửa (đặc biệt trong chê biến phomai), người ta sứ dụng
một khôi lượng rấ t lớn enzym đông tụ sữa. Trước đây, các nước châu Âu
thường sử dụng các loại protease động vật, ngày nay, người ta sử dụng rát
nhiều loại protease khác nhau. Chính sự thay th ế các loại enzym từ vi sinh
vật làm giảm giá thành sản phẩm chế biến từ sữa.
 Chương

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CồN v ả

CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN
CHỨA CỒN
Cồn và các sán phâm lên men chứa cồn là IIhửng sán phàm được sân
xuất rộng rãi nhất trên thê giới. Công nghệ sán xuảt các san phám này ílốu
giông nhau ở một điếm là bắt đầu từ sán xuất thú còng, qua thời gian (lã
dược chuyển sang sản xuất theo qui mô cóng nghiệp.

7.1 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CỔN TỪ NGUYÊN LIỆU CHỨA TINH BỘT

Có thề khắng định ràng công nghệ sân xuât cồn là một trong số khóng
nhiều lắm các công nghệ được phát triẽn rát sớm. Còng nghệ sán xuât CỎI1
xuất h i ệ n từ 6000 - 8000 năm trước (’ông nguyên ờ nhiéu bộ tộc t r ê n thê
giới. Mãi đến thê ký XII - XIII người ta mới tiến hành sán xuất theo qui
mỏ công nghiệp. Lúc đầu. đế thực hiện quá trình đường hóa, người ta sứ
dụng malt như một nguồn enzvm duy nhất. Việc sứ dụng malt kéo dài cho
mãi đến đầu thê kỷ XIX mới được thay thế bàng chế phẩm enzym từ vi
sinh vật. Tuy nhiên, cũng cần phai nhạn thấy ràng, ớ các nước có nền nông
nghiệp tương đòi phát trièn và cá nhừng nước có nền nông nghiệp không
phát triển nhưng sông chù yếu bằng nông nghiệp, sán xuất cồn theo truvền
thống, người ta đã sử dụng vi sinh vật như một tác nhản ch uy 011 hóa từ
hàng ngàn năm trước.
Đầu th ế kỷ thứ XIX nhiều nhà khoa học phương Tây đả quail tám đến
công nghệ sản xuất rượu từ gạo và các nguồn tinh bột khác cua các nước
phương Đông. Từ đó họ đã biết thay chế phàm enzym từ vi sinh vật cho
nialt, nhờ đó g iá thành sản xuât cỏn và rượu đà giám rất nhiều.
Việt Nam ià một trong nhièu nước bắt đẩu sản xuất cồn theo qui mô
công nghiệp cũng từ th ế kỳ XIX.
274 CHƯƠNG 7

7.1 .1 N g u y ê n l i ệ u c h ứ a t in h b ộ t t r o n g s ả n x u ấ t c ồ n

1- Ngô (bắp)
Ở nhiều nước, ngô là loại lương thực quan trọng thứ hai sau lúa. Thành
phần của ngô như sau:
Phần vỏ 2 - 59r Phôi 10 -13% Nội nho 83 - 85%
Thành phần hóa học của ngô bao gồm ;
Nước 14% Lipit 4,6c/c Gluxit 67,9%
Protit 10 c/c Tro 1,3% Cellulose 2,2%
Ngô là ngũ côc rấ t thích hợp cho sản xuâ't cồn, rượu. Do đó nhiều nước
(trong đó có nước ta) sử dụng ngô như là nguyên iiệu chính cho sản xuất
cồn và rượu.
2- Sắn (khoai mì)
Sắn được trồng nhiều ở Thái Lan, Brazin, Việt Nam và Trung quốc.
Thành phần của củ sắn như sau:
Vỏ 3 - 5 c/c T h ị t củ 9 0 - 9 5 c/c Lỏi 0 ,5 - l c/c

Thành phần hóa học của củ sắn bao gồm

Nước 13 - 14f/í Protit 0,2 - 3c/c Lipit 0,4 - 0,5%
Gluxit 70 - 80c/c Tro 1,3 - 1,6%
Cellulose 1 - 2% HCN 0,007 - 0,24%
Trong th à n h phần hóa học của sắn, hàm lượng tinh bột rất cao nhưng
hàm lượng protit râ't thấp. Thành phần này có ảnh hưởng xấu cho sự phát
triển của nấm men. Do đó trong quá trình lên men, ta nên cungcấp thêm
muối vô cơ chứa nitơ hoặc các chất hữu cơ chứa nitơ.
3- Khoai lang (khoai ngọt)
Ớ các nước châu Á, người ta sử dụng khoai lang làm nguyên liệu đê
nấu rượu. Thành phần hóa học của khoai lang như sau:
Nước 68% Protit 1,6% Lipit 0,5%
Gluxit 28% Tro 1% Cellulose 0,9%
Khoai lang sử dụng trong sản xuâ't rượu thường không cho hiệu suất
cao và rượu không tốt.
4- Gạo
Gạo là loại lương thực cơ bản trong khẩu phần ăn của các nước châu A
cũng như lứa mì là thành phần cơ bẩn trong khẩu phần ăn của các nước
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÔN VÀ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN CHỬA CỒN 275

châu Âu. ư u điểm cơ bản của gạo là vừa chứa hàm lượng tinh bột cao, vừa
chứa protein thích hợp cho nấm men hoạt động, vừa tạo ra những hương vị
tốt trong sản phẩm.
Tuy nhiên, vì đây là loại lương thực rấ t quí nên ngày nay dùng gạo
làm nguyên liệu sản xuất cồn theo qui mô công nghiệp không được khuyến
khích, thay vào đó là những nguyên liệu như bắp, khoai mì. Ở các nước
châu Âu, người ta sử dụng khoai tây để sản xuât cồn và rượu.
7.1.2 Công nghệ tổn g quát
Bất*kỳ công nghệ sản xuất cồn hoặc rượu từ nguồn tinh bột nào cũng
phải qua nhừng giai đoạn sau:
- Xử lý nguyên liệu
- Đường hóa nguyên liệu đế tạo ra dung dịch lên men
- Lên men để chuyển đường thành cồn
- Tinh chế sản phẩm
1- Xử lý nguyên liệu
Nguyên liệu là những sản phẩm của sản xuât nông nghiệp. Trước khi
đưa vào sản xuất nguyên liệu phải được tiến hành phân loại, làm sạch, loại
bỏ những thành phần không thích hợp. Tùy theo nguyên liệu mà ta có
những biện pháp xử lý tương ứng.
2- Đường hỏa và chuẩn bị dung dịch cho quá trình lên men
Cồn chỉ tạo thành từ đường do nấm men Saccharomyces cerevisiac
chuyển hóa. Trong các dạng nguyên liệu chứa tinh bột thường chứa rấ t ít
đường. Lượng đường này hoàn toàn không đủ cho quá trình lên men và tạo
thành cồn.
Muôn thu nhận được lượng cồn cao phải tiến hành đường hóa tinh bột.
a) Ở các nước châu Âu và châu Mỹ, người ta thường đường hóa tinh bột
bằng chế phẩm enzym thu nhận được từ malt. Việc sử dụng m alt như một
nguồn enzym amylase có xuất xứ địa lý và phương thức sản xuất nông
nghiệp của họ. Các nưđc châu Âu nằm trong vùng địa lý rấ t thuận lọi cho
canh tác hóa đại mạch, khi đại mạch nảy mầm tạo ra rấ t nhiều enzym
amylase. Người ta đem phơi mầm đại mạch (mầm đại mạch được gọi là
malt) và đem nghiền mịn thành bột. Bột này giàu amylase. Người ta sử
dụng chúng để đường hổa. Khi tiến hành đường hóa tinh bột bằng bột malt,
người ta thường hòa bột nguyên liệu với nước, tiến hành hồ hóa và tiếp đó
làm nguội đến 60 - 65° c rồi cho bột malt vào. Người ta duy trì nhiệt độ
276 CHƯƠNG 7

này trong điều kiện khuấy liên tục. Quá trìn h thủy phân sẽ tạo ra đường
glucose. Dung dịch được tách ra khỏi bă (phần không thủy phân được) bằng
cách lọc ép hay ly tâm.
Phương pháp này được tóm tắ t như sau:

Bột malt Nấm men cổn tinh chế

.................................. í ................. ĩ .. .. 7
Tinh bộ t— ► Hổ hóa— ► Đường hóa — ►Lọc ép— ►Dịch— ► Lỗn men— ►Chưng cất— ►Tinh chế

Phương pháp này chỉ được thực hiện nhiều trước th ế kỷ XIX. Từ th ế kỷ
XIX cho đến nay, các nước cháu Ảu đã thay chế phẩm enzym từ bột malt
bằng cách chẽ phẩm enzym từ vi sinh vật. Tuy nhiên, việc sử dụng bột malt
như nguồn enzym vẫn dược sử dụng ở những vùng nông thôn trong sản
xuất rượu theo qui mô gia đình.
b) Người ta có thê sử dụng axit như t á c nhân thủy phân tin h bột, sau
đó trung hòa bằng cacbonat. Axit suifuric và axit chlohydric thường được sử
dụng để thủy phân tinh bột; Na2C 0 3 thường được sử dụng để trung hòa các
axit dư.
Phương pháp này thường đòi hỏi các th iế t bị chịu được axit hoặc phải
chịu điều kiện. Mặt khác, các axit thường rấ t độc hại và hay gây nguy hiểm
cho người sản xuất, chính vì thế, hiện nay ít được sử dụng.
c) Ở các nước châu Á, theo truyền thông, người ta hay dùng các loại
bánh men để sản xuất rượu, cồn từ nguồn tin h bột. Công nghệ sản xuất
rượu, cồn từ các loại men đã có từ hàng ngàn năm trước đây ở Trung Quốc,
Việt Nam và N hật Bản. Lúc đầu, người ta sản xuất hoàn toàn nhờ vào khu
hệ vi sinh vật tự nhiên được rơi vào khối ủ. Cách làm này thường không
cho kết quả ổn định. Do đó bằng kinh nghiệm, người ta chọn kho'i ủ nào tốt
n h ất để lại một phần để làm mẻ sau. Cách làm này có tố t hơn cách làm
trên nhưng khi thực hiện vẫn không thu được kết quả ổn định do không
bảo quản được. Sau đó, người ta tiến hành sản xuất bánh men. Lúc đầu
bánh men cũng được tạo ra từ những mẻ ủ tố t n h ất bằng cách tạo\hình
chúng, đem sây khô và bảo quản để dùng dần. Bằng cách này, người ta đã
hoàn toàn chủ động được quá trình sản xuất và đảm bảo được chất lượng
sản phẩm. Từ đó phương pháp sản xuất bánh men được p hát triển khá
hoàn thiện và tạo ra được nhiều loại bánh men khác nhau, tùy theo từng
dân tộc và tùy theo thị hiếu của người tiêu dùng. Chất lượng rượu, cồn phụ
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CỐN VÀ CẢC SẢN PHẨM LẺN MEN CHỬA CÔN 277

thuộc rấ t nhiều vào chất lượng cũng như chùng loại của bánh men, trong
các loại bánh men đều chứa các loài nâm sợi, vi khuẩn có khả năng đường
hóa tinh bột và đều chứa nấm men có thể chuyền hóa đường thành cồn.
Như vậy có th ể khẳng định được rằng bánh men dùng trong sản xuất rượu
từ nguyên liệu chứa tinh bột là chế phẩm vi sinh vật rấ t đặc biệt. Trong đó
có sự tồn tại hài hòa nhiều vi sinh vật khác nhau, tạo được th ế cân bằng
giữa các quá trình chuyển hóa. Phần công nghệ sản xuất bánh men, chúng
tôi đã trình bày ở tập 3 “Công nghệ lên men truyền thống’'.
d) Trong công nghiệp sản xuất cồn và sản xuất rượu từ nguyên liệu
tinh bột, người ta không thể sử dụng các nguồn enzym như phần trĩnh bày
trên vì tính chất kinh tế và tính ổn định của sản phẩm, vì bản chất sản
xuất công nghiệp và sản xuất hàng loạt là các sản phẩm phải có chât lượng
đồng đều và có kiểm soát, do đó trong sản xuất công nghiệp người ta đòi
hỏi quá trìn h tạo giống có chất lượng ổn định và có kiểm soát các loại
giông được tạo ra. Trong cồng nghệ vi sinh vật việc kiểm soát giông chỉ có
thế khi ta phân lập được chúng ở dạng thuần khiết (dạng không có sự
nhiễm bới các vi sinh vật khác).
Như vậy, muốn sản phẩm có chát lượng đồng nhất phải có giống thuần
khiết. Từ những bánh men thuốc bắc, thuôc nam cùa người châu Á, các nhà
khoa học Pháp đả phân lập ra được rất nhiều giống vi sinh vật có khả năng
đường hóa cao, trong đó nhửng giông điển hình bao gồm aspergillus sp.
Rhizopus Sp., Mucor. sp. Các giống vi sinh vật này lần lượt được ứng dụng
vào công nghệ sản xuất cồn thay cho bột malt. Trong thè ký XIX, người
Pháp đã ứng dụng thành công nấm Rhizepus và Mucor VÍ1 ) sản xuất lớn
theo qui mô công nghiệp tại các nước Đỏng Dương. Phương pháp sản xuất
cồn theo công nghệ của người Pháp được gọi là phương pháp amylose (xuất
phát từ tên một loài nấm sợi do người Pháp phân lập ra và ứng dụng thành
công trong sản xuất cồn ở Việt Nam - amylomyces rouxi).
Cũng trong thời gian này, người N hật đưa loài nấm sợi aspergilius
sang Mỹ. Nấm loại này nhanh chóng chiếm được sự chú ý của người Mỹ vì
họ đá nghiên cứu chúng rấ t kỹ. Sau đổ, người Mỷ đã sử dụng nấm sợi này
trong sản xuất cồn thay cho bột malt. Từ đó sản xuất cồn có thêm một
phương pháp mới: phương pháp mycomalt (mầm mốc).
Như vậy, cho đến nay ta có hái phương pháp đường hóa tinh bột trong
sản xuất cồn: phương pháp amylose và phương pháp mycomalt.
Ở phương pháp amyỉose, người ta thường sử dụng nấm sợi rhizopus và
mucor để đường hóa tinh bột. Ở phương pháp mycomalt người ta thường sử
278 CHƯƠNG 7

dụng aspergillus để đường hóa. Tuy nhửng nấm sợi này có nhừng đặc điểm
giông nhau (trong đò có sự giông nhau về quan hệ với oxy), nhưng giửa các
loài nấm sợi có những điểm khác nhau rất rõ.
Rhizopus và Mucor là nhừng loài nấm sợi phán nhánh và thuộc nhóm
n ấ m sợi có b à o t ử hở. C h ú n g p h á t t r i ể n được t r ê n Tất n h i ề u lo ại môi
trường. Đặc biệt là chúng có khả năng phát triển mạnh trong môi trường
cháo đặc (môi trường có độ nhớt cao). Chính vì th ế khi sử dụng tấm gạo để
sản xuất cồn và rượu, người ta thường sử dụng rhizopus và mucor chứ
khồng bao giờ sử dụng aspergillus. Aspergillus sp. là loài nấm rấ t phổ biến
trong thiên nhiên. Chúng được sử dụng nhiều trong lên men các sản phẩm
từ đậu nành. Điểm khác với Mucor hay Rhizopus là chúng không có khả
năng phát triển hoặc phát triển rấ t kém trong môi trường có độ nhớt cao
phi dịch hồ hóa từ tâm gạo. Chứng thuộc nấm sợi có bào tử khá kín. Một sô"
chủng nấm sợi được ứng dụng trong sản xuất cồn và rượu từ nguồn tinh bột
như:
Aspergillus nỉger: Nấm này có màu đen nên thường được gọi là nấm
sợi màu đen. Khi mới phát triển, sợi nấm màu trắng, sau đó sẫm lại nhưng
không hoàn toàn đen. Chỉ có bào tử của chúng là có màu đen tuyền. Từ một
sợi đầu tiên, chúng phân nhánh tạo ra 2 - 4 nhánh sợi nhỏ. Từ các nhánh
này sẽ phát triển thành nhừng đỉnh bào tử và từ đó sẽ phát triển thành
nhừng bào tử màu đen. Nấm sợi này có kh ả'n ăn g tạo ra rấ t nhiều enzym
khác nhau như: amylase, invertase, maltase, protease, pectinase,
• gluamyìase và cà cellulase.
Aspergillus oxyzac: Nârn sợi này thường có màu vàng khi già nên còn
được gọi là nâm sợi màu vàng. Khi mới phát triển, hệ sợi có màu trắng, sau
đó chuyển dần sang màu lục và khi già chuyển hẳn sang màu vàng. Chúng
phát triển trong khoảng nhiệt độ rấ t rộng (15 - 40 °c ), nhiệt độ tối ưu cho
chúng phát triển là 30 - 32 ° c . Khả năng sinh enzym của chúng rấ t mạnh,
trong đó chủ yếu là các loại enzym amylase, protease, catalase, maltase.
Aspergillus tlavus.
Loài nâm sợi này mới nhìn rấ t giông aspergillus oryzae, nhưng thực ra
chúng có kích thước nhỏ hơn. Màu của sợi nấm là xnàu lục. Chúng tạo ra
nhiều enzym khác nhau, trong dó enzym protese là mạnh nhất. Chế phẩm
enzym của chúng được ứng dụng trong sản xuất để làm ổn định chất lượng
bia. Chúng có khả năng sinh độc tô" azlatoxin nên khi sử dụng chúng phải
hết sức thận trọng.
A s p e r g illu s aw a m o ri và a sp e r g ỉlỉu s usam ỉ: H ai loài n ấ m sợi n à y gần
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CỎN VÀ CÁC SẢN PHẨM LẺN MEN CHỬA CỔN 279

giống nhau về hình thái. Đặc điểm quan trọng của hai nấm sợi này là
chúng tạo ra enzym protease không nhiều, nhưríg lại có khả năng sinh tổng
hợp dexninase, glueoamyiase rất mạnh.
3-Nuôi cấy nấm sợi tạo enzym trong sản xuất cồn và rượu từ nguồn tinh bột
Phần trên đã trình bày hai phương pháp sản xuất cồn và rượu: phương
pháp amylose và phương pháp micomalt. Hai phương pháp náy về cơ bản
không khác nhau nhiều.
- Cả hai phương pháp đều dùng nấm sợi cho quá trình đường hóa tinh bột.
- Cả hai phương pháp đều sử dụng nấm men Saccharomyces cererisiac
đế chuyến thành đường cồn. Tuy nhiên, hai phương pháp này cũng có điếm
khác nhau n h ất Jà cách sử dụng nấm sợicho quá trình đường hóa.
- Trong phương pháp amylose, nấm sợi được sử dụng để tiến hành
đường hóa là Mucor hoặc Rhizopus. Đặc điểm cơ bán của mốc này là người
ta chỉ nuôi chúng trong phòng thí nghiệm với dung tích khoáng 5 - 10 lit,
từ lượng nấm sợi này, người ta chuyển chúng sang thùng lẻn men hàng
chục tán. Dịch bột đã được hồ hóa và nấm sựi này phát triên trong đó.
Hình thức nuôi này giống như phương pháp lên men hiếu khí trong môi
trường lỏng, để tạo được lượng nâni sợi cần thiết cho quá trình đường hóa,
thời gian đầu, người ta tiến hành thổi khí liên tục. Nấm sợi là loài vi sinh
vật hiếu khí bắt buộc, trong quá trình thối khí nấm sợi sẽ tăng nhanh sinh
khối và sinh tổng hợp ra enzym, trong đó lượng enzym amylase là lớn
nhất. Sở dĩ có hiện tượng này là vì môi trường được sử dụng là tinh bột,
tinh bột là cơ chất để tổng hợp enzym cảm ứng amylase. Như vậy, nếu sản
xuất cồn và rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột theo phương pháp amylose,
người ta không cần phải thiết kế, xây dựng một phân xưởng sàn xuất nấm
sợi (hay chế phẩm enzym) riêng. Trong trường hợp này, ở giai đoạn này,
xảy ra 3 quá trình sinh học cơ bản:
- Quá trình tăng sinh khối nấm sợi.
- Quá trìn h sinh tổng hợp enzym.
- Quá trình đường hóa tinh bột.
Bằng kinh nghiệm thực tế, người ta cho nấm men saccharomyces
cerevisiae vào địch này và nấm men saccharomyces cerevisiae sẽ chuyển
hóa đường thành cồn. Như vậy xuất hiện thêm một quá trình sinh học nữa
xảy ra trong cùng một th iết bị, đó là quá trình rượu hóa bởi nấm men.
Các chủng nấm sợi thuộc Mucor và Rhizopus do người Pháp phân lập
từ bánh men thuốc bắc của Việt Nam và qui trình công nghệ sản xuất cồn
280 CHƯƠNG 7

từ tấm gạo do họ xây dựng đà được áp dụng tại nhiều nhà máy, trong đó cỏ
các nhà máy rượu ở Pnôni-pẽnh (Cãnìpuchia), Saigon, Hà Nội (Việt Nam).
Trong công nghệ sán xuàt cồn và rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột
bang phương pháp miconialt. người ta không sử dụng nảm sợi là Mucor hay
Rhizopus mà sử dụng các giỏng nấm sợi thuộc aspergillus sp. Các giống
(lược sử dụng nhiều trong phương pháp này là Asp. oryzae, Asp. niger, Asp.
usmi. Asp. awamori Asp, batatac.
Các giống nàm sợi này được J.Takam ine (người Nhật) phản lập từ sán ,
phấm lỏn men truyền thông của người N hật vào năm 1884. Sau đó, các
giông nấm sợi này được dưa sang Mỹ và 11Ó được ứng đụng rất nhanh, thay
thô' hoàn toàn amylase từ malt. Trong sản xuất cồn và rượu theo phương
pháp inicomalt, người ta không phát triển sinh khối nâ*m sợi ngay trong
dịch cháo như trong phương pháp amylose mà tiến hành dường hỏa bằng
chò phàm nấm sợi aspergillus sp. có chứa enzym, còn được gọi là chế phẩm
onzyni thô. Như vậy phương pháp này đòi hỏi phái có một phân xưỡng
riỏng san xuíú chè phẩm vi sinh vật.
Quá trình sán xuất chế phấm vi sinh vật theo phương phap nàv phái
(Ịun hò 11 giai (loạn:
- Chunn bị giông
Chuãu bị mòi trường
- Nuôi n à III sựi
- sư dụng ngay chẻ phàm hoặc sấy khô báo quán dùng dán.
Giống nấm sựi (lược nuòi cây trong môi trường thạch - niíìlt và dược
giứ ơ nhiệt độ 4 - 7"C . Mỗi tháng cấy truyền một lần. Mỗi tần cấy truyền
lại. người til thường cày vào 3 - 5 ống thạch - malt, trong đó một ống dùng
cho sán xuất, một ông dùug đẽ kiếni tra chất lượng và một ông dùng đề giữ
giống tiỏp.
Ông giỏng dùng cho sán xuất được tiến hành nhán giỏng theo từng
bưức sau:
- Chuán bị một bình cầu có dung ị ích 500ml.
* Cho vào đó 10 gam cám đã được làm ám đến độ ấm là 60 - 65r/c w.
- Thanh trùng bằng hơi nóng trong 1 giờ ớ 1 at.
- Làm nguội niôi trường đến nhiệt độ phòng.
- Trộn giôìig từ ông thạch nghiêng.
- Nuôi ở nhiệt độ ‘28 - 32 °c trong thời gian 3 ngày. Khi thấy nấm sợi
tạo nhiêu bào tứ là thời cliòni kôt thúc quá trình nhân giỏn£ câp 1-
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÔN VÀ CÁC SẢN PHẨM LẺN MEN CHỨA CÓN 281

Sau giai đoạn này, nấm sợi được chuyến sang nuôi trên các khay. Đế
thực hiện giai đoạn Iihân giống cấp 2 này ta thực hiện các bước như sau:
- ChuaII bị khay.
- Chuần bị mỏi trường cám (cám gạo hay cám mì có hàm lượng tinh
bột > 20rr) và trộn nước cho độ ẩm.
- Thanh trùng mỏi trường cám ờ 1 at trong 1 giờ.
- Làm nguội môi trường cám.
- Trộn giống vào môi tường cám. Tỷ lệ giống 0,2 - 0,4C
/Í.
- Chuyền chúng vào các khay, tài đều cám sao cho có độ dày 2 - 3cm.
- Đưa các khay vào phòng nuôi, nuôi ờ nhiệt độ 28 - 32 °c trong thời
gian 30 - 36 giờ-
Sau khi nám sợi đá nuôi đến thời gian tạo enzym cao nhát (thông
thường người ta kết thúc giai đoạn này nấin sợi mới bắt đầu tạo bào tứ),
người ta phai sấy chê phẩm ở nhiệt độ <45°c cho đêu khi dộ ấm là
10 - 12 °c đẽ hoạt tính enzym không giảm, đồng thời dề báo quản sau này.
Trong các loại nguyên iiệu dùng đế sán xuất chè phâm ainylase dùng
trong sán xuất cồn, rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột, người tiì còn sứ dụng
một số loại mòi trường có thành phần như sau:
Mỏi tnỉờììiị bột ngô:
Bột ngỏ váiìg 75cr Trâu nhò 25<i (NH4 ).,SOj 0,5'r
Mòi trường tùm gạo:
Tàm gạo té 8 0 'f Trấu nhó 20'(
Mỏi trường cám bối:
Cám bối 99,5'r íN H t ).2SOi 0,5',
Các loại mòi trường trên cũng được hấp thanh trùng giông môi trường
cám gạo và tiên hành nuôi cây nám sợi tưưng tự như trên.
Trong các loại môi trường dùng đế nuôi cấy nấm sợi, thực te cho thấy
mòi trường cám Iìii có tác dụng tôt Ằìhât dôi với sự phát triển và sự tổng
hựp enzvm cua nấm sựi aspergillus sp.
ơ một sò nhà máy, người ta không nuói cấy nấm sựi theo phương pháp
bề mặt Iihư trcn mà tiến hành nuôi chúng trong môi trường lỏng có thối
khi liên tục. Cách tiến hành theo phương pháp này như sau:
- Ohuán bị mòi trường với thành phần như sau:
Cáin 2 - 3(f Cao ngô 0,5c/c K N 03 0,5^
MgO 0,1 - 0,2^ CaCOj 0,2cc pH 5,6 - 5.8
282 CHƯƠNG 7

- Thanh trùng môi trường ở 1 at trong 1 giờ

- Chuẩn bị bình tam giác có dung tích 1000ml, cho vào đó 150ml môi
trường
- Chuyển giống từ ông nghiệm sang các bình tam giác
- Đ ặt các bình tam giác này trên máy lắc có số lầ n lắc là 200 - 220
iần/phút.
- Nuôi ở nhiệt độ 28 - 32° c trong thời gian 72 giờ.
Từ nhừng bình tam giác này người ta chuyển giống qua những thùng
lên men lớn hơn và có thổi khí liên tục. Khi nuôi nâ'm sợi trong thiết bị
lớn, người ta sử dụng môi trường có thành phần như sau:
Dịch lọc bã rượu 97,8%Bột gạo 1,5 - 2cr Cao ngô 0,5%
MgO hoặc CaCOg 0,2% pH 5,6 - 5,8

4-Quá trình đường hóa

- Trong công nghệ amylose, người ta tiến hành dường hóa và rượu hóa
trong cùng một th iết bị. v ề lý thuyết, thực hiện quá trìn h dường hóa xong
mới tiến hành quá trìn h rượu hóa. Trong thực tế, quá trìn h đường hóa và
rượu hóa xảy ra trong cùng một th iết bị, đo đó lượng đường được lạo thành
ngay lập tức sẽ được chuyền hóa thành rượu. Cứ như vậy, hai quá trình này
luôn luôn nối tiếp nhau tạo ra th ế đan xen hài hòa trong thiết bị. Phương
pháp này có ưu diem là không tôn th iết bị cho quá trìn h sản xuât nhưng có
khó khăn rấ t lớn là đòi hỏi trình độ kỹ thuật rá t cao. Nêu thực hiện không
cẩn thận sẽ rấ t dề gây nên hiện tượng nhiễm vi sinh vật lạ.
- Trong công nghệ micomalt, giai đoạn đuờng hóa và rượu hóa xảy ra ở
hai th iết bị hoàn toàn khác nhau. Người ta tiến hành quá trìn h đường hóa
xong mới tiến hành quá trình rượu hóa. Ưu điểm cùa phương pháp này
chính là tách hai quá trìn h riêng rẽ để dễ kiểm soát. Tuy nhiên, phương
pháp này lại đòi hỏi nhiều thiết bị và diện tích.
Trong quá trìn h đường hóa, lượng đường sẽ được tăng dần theo thời
gian. Nhưng lượng đường sè chỉ đạt đến raột mức độ n h ất định, sau đó thì
không có khả năng tâng tiếp. Các yếu tố ảnh hưởng nhiều đến quá trình
đường hóa bao gồm pH, nhiệt độ, lượng enzym bổ sung. Người ta thường
phải nghiền chế phẩm và cho nước vào để trích iy enzym từ chế phẩm thô.
Lượng nước cho vào để trích ly enzym thường gấp 3 - 5 lần chế phẩm.
Lượng chế phẩm enzym cho vào để tiến hành đường hóa là 10 - 15**, tùy
theo hoạt tính enzym có trong chế phẩm.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CỐN VÀ CÁC SẢN PHẨM LẺN MEN CHỬA CỔN 283

Sơ đồ 7.1: Các phản ứng sinh hóa trong quá trình lên men
284 CHƯƠNG 7

Quá trìn h đường hóa được tiến hành như sau: Dịch nấm được chuyên
qua thùng đường hóa. Khi khối cháo này đạt 1/3 dung tích th iết bị, người ta
cho nước làm nguội. Khi nhiệt độ xuống 60 - 65 ° c thì tiến hành đường
hóa và cho thêm Na2SiF6 với liều lượng 0,02 - 0,25 so với khỏi lượng để sát
trùng. N hiệt độ đóng vai trò râ't lớn đối với tốc độ thủy phân của enzym.
Enzym amylase thường có hai loại a-amylase và p-ainylase với số lượng
nhiều hơn các loại enzym khác. Hai loại enzym này có nhiệt độ tối ưu khác
nhau nên nếu có điều kiện cần điều chỉnh hai chế độ khác nhau để chúng
p h át huy tôì đa khả năng thủy phân (a-amylase hoạt động mạnh ở 75°c,
P-amylase hoạt động mạnh ở 60 - 65 ° c ).
Thời gian đường hóa có thê kéo dài hoặc rút ngắn tùy thuộc vào hoạt
tính của enzym. Thông thường thời gian tiến hành đường hóa là 2 - 2 giờ
30 phút. Có nhiều nơỉ, quá trình đường hóa chỉ diền ra trong 1 giờ.
Sau khi đường hóa xong, người ta xác đinh một số chỉ số để biết được
khả năng đường hóa. Người ta lây dịch đường và xác định các chỉ số về độ
khô, hàm lượng đường, độ axit . Quá trình đường hóa được coi là kết thúc
khi trong dịch đường đảm báo các chỉ số sau:
Độ khô > 16rí Độ đường > 80 g/e Độ axit 1,2 - 1,7 g/e
Khi kêt thúc quá trình dường hóa, người ta hạ nhanh khối dịch đường
hóa xuông nhiệt độ 35 - 36 ° c và cho giôìig nấm men vào để tiến hành lên
men.
5' Tiến hành lên men
Sau khi đường hóa xong, người ta tiến hành quá trình lẽn men. Quá
trìn h lẻn men được thực hiện theo những bước như sau:
- D ùng các ch ât tẩy rửa (Cl.,1, SOg 2 focm alin) k ế t hợp với n h iệ t để
làm vệ sinh th ậ t sạch thiết bị lên men.
ơ các nhà máy, người ta thường dùng focmalin nồng độ 0,02 - 0,05c/c so
với dung tích thùng lên men đế vệ sinh thùng lên men, cùng với hơi nóng
55 - 6 0 'C giữ trong thời gian 1 - 1,5 giờ. Sau đó đưa nhiệt của hơi nóng lên
95 - 100 ° c và giữ trong 45 phút. Sau đó phải làm nguội thùng lên men đên
nhiệt độ phòng, xả hết nước ngưng tụ trong thùng lên men.
- Tiêp đên, người ta cho dịch lên men và 10% giống nấm men
Saccharomyces cesevisiae vào. Ở giai đoạn đầu, người ta thường thổi khí để
làm tăng khá nãng phát triển của nấm men cho đủ số lượng cần thiết cho
quá trinh lên men.
- Khi lượng nâm men phát triển đủ số lượng cần th iế t cho quá trình
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÔN VÀ CÁC SẢN PHẨM LẼN MEN CHỬA CỎN 285

lên men, người ta không cung câ'p không khí nữa mà tiến hành lên men
yếm khí. Quá trình lên men, dược tiến hành ở nhiệt độ 32 - 34 °c . Trong
quá trìn h lên men luôn luôn phải kiếm tra pH và lượng đường để biết được
khả năng lên men.
* Kết thúc quá trình lên men, người ta kiểm tra lại các chỉ số cần
thiết. Các chỉ sô' sau đây cho biết quá trình lên men kết thúc:
Độ rượu: 7 - 9c/c Đường sót: 5g/e
Tinh bột sót: lOg/e Độ axit; 1,7 - 2,2 g/e
Thời gian lên men thường trong khoảng 4 - 5 ngày, sau đó tiến hành
quá trình chưng cất và tinh luyện.
Theo lý thuyết, cứ 100kg bột thu được 71,6 lít cồn. Nhưng trong thực tế
ta chỉ thu được 63 lít cồn, 0,5 - 1% lượng tinh bột không bị nấm chứa2 - 4
% lên men, 6% chuyển hóa thành các sản phẩm khác.

7.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BIA

Bia là một loại nước giải khát rấ t đặc biệt. Đặc biệt ỏ chỗ, nó vừa là
loại nước giải khát phổ biến n hất trong các loại nước giải khát có từ hàng
ngàn năm trước công nguyên, không có một quốc gia nào trên th ế giới
không sản xuất hoặc không tiêu thụ bia. Tuy nhiên, nghề sản xuất bia bắt
đầu không phải ở tấ t cả mọi châu lục mà nó bắt đầu từ những nơi sản xuâ't
ra nguyên liệu tạo ra nó. Dần dần, công nghệ này đã lan tỏa ra toàn th ế
giới, ở cả những nưđc mà điều kiện khí hậu không cho phép trồng đại mạch
và hoa houblon.
Sở dĩ b ia có sức lan tỏa m ạn h như v ậ y vì nó có nhữ n g ưu điểm rất
quan trọ n g k h ác h ẳn với những dạng nước giả i k h á t khác như sau:
Thứ nhất: bia như một loại nước giải khát. Tác dụng giải k hát và làm
m át của b ia p hần lổ n nhờ lượng k h í C 0 2 có trong bia. Tác dụng làm m át
cơ thể của C 02 lại phụ thuộc vào số lượng khí C 02 ở dạng liên kết chứ
k h ô n g p h ả i phụ thuộc vào d ạn g tự do (C 0 2 tồn tạ i trong b ia ở h ai dạng:
dạng liên kết và dạng tự do). Khi C 02 liên kết chuyển sang dạng C 0 2 tự
do cần p h ải được cung cấp n ãn g lượng, và như vậy m ột p h ần n ă n g lượng
của cơ th ể được sử dụng cho sự chuyển h óa này. Đ iều n ày xảy ra rất n h an h ,
do đó ta cảm th ấ y m á t k h i uống bia.
Thứ hai: b ia cung cấp n ă n g lượng. M ột lít bia cho ta 5 0 0 - 600k l. N ă n g
lượng n à y do C 2H 5OH và m ột s ố th à n h phẩm d in h dưỡng có tron g bia cung

cấp.
286 CHƯƠNG 7

Thứ ba: ngoài tác dụng làm m át có thê như đã trìn h bày ở trên, C02
còn có tác dụng như một chất làm tăng khả năng tiêu hóa của cơ thể. Mặt
khác khi ucfng bia sẽ làm tăng khả năng bài tiết nước tiểu, giúp quá trình
giải độc cơ thê nhanh hơn.
Tuy nhiên, vì trong bia chứa C2H5OH nên việc lạm dụng bia quá
nhiều sẽ đem lại nhiều hậu quả không tót. Đặc biệt nguy hiểm khi ta uống
những loại bia không đảm bảo chất lượng.
7.2.1 N guyên liệ u dùng trong sản xuất bia
1- Nước: Nước chiếm khoảng 80 - 90%trong bia. Như vậy, nếu tính về
khôi lượng, nước chiếm tỷ lệ rấ t lớn. Do đó, việc xử lý nước đê đảm bảo
chât lượng phải được đặt lên hàng đầu. C hất lượng nước dùng trong sản
xuất bia phải đảm bảo như nước dùng để uống. Cụ thể, nước dùng trong sản
xuât bia phải đảm bảo các chỉ tiêu sau:
- Không mùi; không vị; không màu.
- Độ cứng tạm thời vào khoảng 0,72mg đương lượng/1 lít.
- Độ cứng vĩnh cửu 0,26 - 0,72mg đương lượng/lít.
- Độ oxy hóa 2mg 02/lít.
- Tổng số vi sinh vật < 100 tế bào /ml.
- E. Coli không quá 3 tế bào/ 1 lít.
- pH ià 6,8 - 7,2.
- Trong nước không được chứa N aHC03 , NH 3 , H N 02. Riêng NO 3 không
vưựt quá 25 mg/1. c ần lưu ý rằng, nếu nước dùng trong sản xuất bia không đảm
bảo chất lượng như phần trình bày trên, sẽ gây ra tác động rất nguy hiểm:
Thứ nhất: nước là thành phần cơ bản trong quá trìn h lên men bia.
Nước chứa nhiều vi sinh vật, n hất là vi sinh vật gây bệnh, sẽ phát triển
mạng trong bia, lấn á t sự p hát triển của nấm men, làm quá trình lên men
gặp khó khăn. Kết quả là bia sè hư và không đảm bảo chất lượng.
Thứ hai: nước chứa nhiều chất hóa học, một m ặt kìm hãm hoạt động
amylase có trong m alt, m ặt khác kìm hãm quá trìn h rượu hóa.
Thứ ba: bia là một sản phấm lên men sử dụng ngay không qua chưng
cất, nếu nước không đảm bảo như chất iượng dùng cho nước uống sẽ gây
ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe.
2- Malt: M alt ià mầm đại mạch. Trong quá trình chuyển từ trạng thái
tĩn h sang trạng th ái nẩy mầm, h ạ t đại mạch sẽ có sự biến đổi to lớn về
chất: khi đó các loại enzym sẽ được tạo thành, trong đó amylase là loại
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÓN VÀ CÁC SẢN PHAM l ẻ n men chử a CÓN 287

enzym được tạo thành nhanh nhâ't và nhiều nhát, kẽ đến là enzym
protease. Để sản xuất bia, thóc đại mạch được ngâm và cho nảy mầm trong
nhừng điều kiện được kiểm soát chặt chẽ về nhiệt độ, độ ẩm, nhờ đó, chát
lượng m alt mới thực sự được ổn định và đảm bảo.
Hiện nay có hai loại malt: malt vàng và malt đen. Ngoài ra còn có một
số m alt đặc biệt để sản xuất những loại bia đặc biệt.
Các loại m alt sau được sử dụng nhiều trong công nghệ sản xuất bia:
a) Malt caramen: loại malt này được sản xuất từ đại mạch tốt, có chất lượng
đặc biệt và được sảy với chế dộ riêng. Loại malt này được dùng để sản xuất bia
đen, bia có vị caramen có độ sánh cao và có mùi thơm mạnh, nhiều bọt.
b) Malt cà phê: M alt này được sấy ở nhiệt độ cao, có màu vàng đậm
như màu càphê rang.
c) M alt mela (còn gọi là malt melanoid): loại malt này có hàm lượng
protein cao và chứa nhiều melanoiđ. Người ta thường sây loại inalt này đến
nhiệt độ cao.
Màu của bia phụ thuộc rất nhiều vào chẽ độ sây malt. Do đó trong sản
xuất bia, người ta quan tâm rấ t nhiều ở chế độ sấy malt. Chê độ sây tiêu
biểu như sau:
• Trong 12 giờ đầu sấy ở 45° c .
- Sau đó nâng nhiệt và giữ ở khoảng 50 - 55 °c trong 4 giờ.
- N âng nhiệt và giừ ở nhiệt độ 60° c trong 2 giờ.
- Nâng nhiệt lên 80°c và giữ trong 2 giờ.
- Hạ nhiệt xuống 75°c và giữ trong 2 giờ.
Sau khi sấy, độ ẩm cuối cùng của m alt nằm trong khoảng 3 - 4%. Sau
khi sấy, người ta thường chà sát để tách mầm rề. Mầm rễ thường gây đắng
rất khó chịu cho bia và rất dề bị mọt. Đối với malt dùng cho sản xuất bia
màu thầm , người ta thường sấy ở nhiệt độ 105° c
M alt là nguyên liệu rấ t quan trọng, nó đóng vai trò chính quyết định
đến chất ỉượng bia thành phẩm:
* M alt cung cấp toàn bộ lượng gluxit (chủ yếu là tinh bột) đề chuyển
hóa thành đường. Từ lượng đường này sẽ chuyển hóa th àn h cồn và các
thành phẩm khác của bia. Chính vì thế, nhiều nước không sản xuất được
malt b ắt buộc phải nhập m alt từ nước ngoài. Trong nhiều trường hợp, nhiều
nhà máy sử dụng các loại ngũ cấo khác để thay th ế một phần m alt (có thể
dùng tới 50% ngõ cốc thay malt), tuy nhiên chất lượng bia thường không
bằng khi sử dụng 100% m alt trong sản xuất.
288 CHƯƠNG 7

* Malt cung câp các loại enzym nmvlase. Thông thường lượng e n z y m
dược tổng hợp trong quá trình thóc dại mạch náy main dii thuy phàn hèt
lượng tinh bột có trong malt. Trong trường hợp thav malt bang một lượng
ngũ côc thì sẽ thiếu một iượng aniykuso nil ất định. Vì thê. khi ta sứ dụng
ngũ cốc thay th ế malt bắt buộc ta phai cho thêm amylase không phái của
m alt đế thùv phân lượng tinh bột cho thỏm này. Người ta thường dùng
enzym từ vi sính vật để thủy phán lượng tinh bột cho thêm này.
* Malt chứa một lượng khá lớn protein. Trong quá trình nay mam,
ngoài amylase ra còn có sự tống hợp protCíiso. Trong quá trình nău bột
nialt các enzym này thủy phân protein, và các sán phẩm thuy phàn proU*in
tạo ra nhửng pluíc chất giữ C 09 rất tốt., vị bia (lặc trúng hơn.
ơ một sỏ cơ sở sán xuất bia thú công, HííLíòi ta có sứ (lụn# c;k' ỉoại
đ ư ờ n g t h a y cho dị ch đ ư ờ ng hóa từ nmlt. Đường t h ư ừ n g (lược đừu<í t r o n g Síiu
xuất thu công là hỗn hợp ciia đường m;mtose, cỉextriu và glucose. Bằn <4 cách
thay the như th ế này, người ta cũng san xuất ra hill với chất. l ư ợ n g kháo
nhau, tuy nhiên chất lượng không thố bang bia (lược -an xuàt từ malt.
3- IĨOCĨ houblon
H o a h o u b ỉ o n c ũ n g l à một. loại n g u y ê n liộu (lặc 1Mộ 1 (lược s ữ đ ụ n " t ron í?
sán xuất bia. Cây houblon là một loại cày leo. thuội* họ .S^IÍ clíiii. Chúng chỉ
phát triển ớ các nước Ò11 đới. Hoa houhlon ĩiH) CỈH) hi;i co vị rất liậc biệt.
Cho đến nay, người ta vần chưa tìm ra một loại nguy ôn liệu mữi nào có thế
thay th ế được hoa houblon trong sán xuất bia.
Thành phần hóa học của hoa hinbỉon như sau:
* Độ ẩm 8 - 14rf
* Cellulose 12 - 16'r
:: Hợp châ't chứa ni tơ 15 - 24r<
* Tanin 2 - 5C
Ả
* pectin 9 - 11%
* Nhựa và chất đắng
to
1
0

* Đường 2 - 4%
* E ster
co
Ó

*—t
1

* Các chất hữu cơ bền vững 12 - 20%

* Trồ 6 - 10V
Trong thành phần hóa học của hoa houblon, có hai thành phần quan
trọng nhất, đó ỉà axit đắng hamulong và nhựa dắng, trong đó axit đắng
CÔNG NGHỆ SẢN XUÀT CỒN VÀ 'CÁC SẢN PHẨM LẼN MEN CHỬA CÔN 289

chiêm 9 - 119r, còn nhựa đắng chiêm 7 - 8r/r. Nhựa đắng thường (lược tạo ra
từ axit đắng.
Axit đắng có công thức hóa học là C21H30O5. Chúng có 3 đồng phân
quan trọng là cohưmlong, ađhumulong và lupulong, axit đắng là thành phần
chính tạo ra vị đắng của bia. Ngoài khá năng tạo ra vị đáng cho bia, axit
đắng có mức độ hoạt động bề mặt rấ t mạnh mẽ, có khá năng tạo bọt và giừ
bọt rấ t tốt. Các chất, đắng cùa hoa houblon thường chứa trong hạt Iupulin.
Hạt lupulin có mày vàng ánh giông như phấn hoa.
Ngoài axit đáng và nhựa đắng ra, trong hoa houblon có chứa nhiều
tinh dầu. Đa sô tinh dầu của hoa houblon (lề bị bay hơi khi ta uống bia. Sô
còn ìại sẽ tạo ra sự bão hòa về mùi cho bia.
T a l l i n có t r o n g t h á n h p h ầ n c u a h o a h o u b l o n c ũ n g có ý n g h ĩ a n h ấ t đ ị n h
t r o n g s ả n x u ấ t b i a, t a n i n t h a m gi a q u á t r ì n h k ế t t ủ a p r o t e i n l à m t ă n g t í n h
ổn định của bia.
7.2.2 Nâm m en d ù n g tro n g sán x u â t bia
Nấm men được dùng trong sán xuất bia thuộc saccỉiaroììiyccs. Nám
men này có kích thước 6 - 9JLI111, chúng sinh sán bàng cách náv chổi và
t h u ộ c loại h i ế u k h í k h ô n g b a t buộc. T r o n g d i ề u k i ệ n có oxy c h ú n g t i ế n
hành quá trình tăng sinh khối là chính. Trong điều kiộn không có oxy
chúng tham gia quá trình !õn men đê tạo ra C.,H5OH . các sàn phám lên
m e n k h á c v à CO-> là c h í n h .

Trong sản xuât bia, nsỊười ta sử dụng cá nấm men nối (saccharomyces
và c e r e v i s i n e ) , v à n ấ m m e n c h ì m (saccharomyccs carshcrgcỉisis). N g o à i r a
một chủng nấm men chìm khác đang (lược s ử d ụ n g rất rộng rái là
saccỉiaromycec uvaniĩim. Cá nấm men nổi và nấm men chìm đều có những
đặc điểm cơ bán giống nhau, tuy nhiên giừn chúng cũng có những dặc điểm
riêng. Những đặc điểm riêng này ta có thế tham khảo ở báng 7.1.
Khả năng kết lắng của nấm men phụ thuộc vào cấu tạo thành tế bào
nấm men. Nếu trong tế bào nấm men chứa ít thành phẩn hydratcacbon,
mangan, chứa nhiều axit amin tê bào nâm men càng dễ kôt lắng.
Ngoài yếu tô' cơ bản trên, kết lắng của tế bào nấm men còn phụ thuộc vào
thành phần môi trường nhiệt độ, trị số tích điện của tế bào và pH của môi
trường. Trong quá trình lên men, các giống nấm men thường kết lắng theo hai
dạng: dạng bông và dạng bụi. Dạng kết lắng bồng thường tiến hành quá trình
lèn men nhanh, còn dạng kết lắng bụi thường lên men chậm hơn.
290 CHƯƠNG 7

. Bảng 7.1: Đặc điểm của nấm men nổi và nấm men chìm
Đặc dlểm nấm men nổi Đặc điếm nấm men chỉm

(Saccharomyces cerevisiaọ) (Saccharomyces carbergensis)

- Trong quá trình lên men, tế bào nấm men lơ - Trong quá trình lên men, tế bào nấm men

lửng trong dịch lên men, tập trung nhiều ở thường tạo thành chùm, sau đổ lẳng xuống

vùng bổ mặt. đáy thiệt bị lôn men

- Thờỉ gian lên men ngắn, nhiệt độ lên men - Thờĩ gian lôn men dài, nhiệt độ lẽn men thấp
cao < 1 2 -1 8 °C ) ( 6 - 7 C)

- Khổng thuận tiện cho quá trinh lọc. Khó thu - Thuận tiện cho quá trình lọc và làm trong. Dễ

hổi nấm men sau khi lẽn men kết thúc để tái dàng thu nhận nấm men sau lén men để tái

sử dụng sử dụng

* Thường dùng để sản xuất loại bia den và bia - Thường dùng đế sản xuất loại bia vàng và

có nồng độ cổn cảo. bia có độ cổn thấp

.
7 2.3 Công nghệ sản x u ấ t bỉa
B ỉa được sả n xu ất th e o h a i phương p háp lê n m en cơ bản:
* Phương pháp sản xụất truyền thống.
* Phương pháp sản xuất hiện đại.
T h eo phương p h áp lê n m en truyền th ố n g , quá tr ìn h sả n xu ất b ắt buộc
p h ả i quạ n h ữ n g g ia r đ o ạ n chủ yếu sau:
* Đ ường h ó a tin h b ột th à n h đường n h ờ en zym a m y la se của m a lt hoặc
a m y la se của v i s in h v ậ t (n ếu sử dụng nguồn tin h bột th a y t h ế m aỉt).
* Lên men chính.
* Lên men phụ, tạo sản phẩm.
T h eo phương pháp lê n m en h iệ n đ ại, các quá trĩn h cũng tương tự như
tr ên . Tuy n h iê n , có đ iều k h á c cơ b ản là người ta tiế n h à n h quá trìn h lên
m en c h ín h v à quá tr ìn h lê n m e n phụ tro n g m ột th iế t bị. Đ iều k h iể n quá
tr ìn h lê n m en n à y b ằ n g h ệ th ố n g là m ỉạ n h cục bộ. Đ ằn g h ệ th ố n g lạnh
được lắ p d ặ t tro n g th iế t bị lê n m en , người ta điều k h iể n quá tr in h lê n m en
chính, phụ xen kẽ và cuối cùng toàn bộ hệ thống được lên men phụ. Phương
pháp lên men hiện đại có hai ưu điểm cơ bản:
* Tốn ít th iết bị lên men
* T hời g ia n lê n m en n h an h .
H iệ n nay, k h ô n g p hải tấ t cả các n h à m áy đều áp d ụng phương pháp
lể n .m en h iệ n đại. Phương pháp lê n m en truyền th ô n g vẫn đượó áp dụng
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CON VÀ CÁC SẢN PHẨM LÈN MEN CHỬA CÔN 291

trong sản xuât và vần được phát triển rất mạnh ở nhiều nước trên th ế giới.
Toàn bộ qui trìn h được trình bày trong H.7.1.

Lọc trong I \ o ự fNập"chaTcÕ2Ị

\ n/m/ __J ___[xửly
[ìỉã meỉTị ............ỵ • • ■ [

/ Dia 1[ươ»/
/B
.Hơi nước) Kiểm tra
1
[p)— Rửa, khử trùng Ch lết chai’ }onl Chiết thùng

»|Thanh trùng]

I Nưóc+hời nước
Dàn nhân, vô thùng, kẻt >1Xuất xưòng I

H ì n h 7 .1 : Qui trình công nghệ sản xuất bia

292 CHƯƠNG 7

1- Nhãn giống nấm men cho sản xuất

a) Người ta tiến hành nhân giông nấm moil dùng cho sản xuảt bia theo
các bước sau:
* Giống nấm men trong ống nghiệm được cấy truyền sang bình tam
giác có 300 ml nước malt. Nuôi chúng ở nhiệt độ 18 - 25°c trong thời gian
16 - 20 giờ.
* Chuyến lượng nấm men này sang bình dung tích 3 - 5 lít (chứa 2 - 3
lít dịch malt). Nuôi ở nhiệt độ 18 - 25°c trong thời gian 16 - 20 giờ. Trong
giai đoạn này, ta có thề cho vào dung dịch nuôi một ít dịch chiết hoa
houbloa đề nấm men quen dần với điều kiện sán xuất.
* Chuyên toàn bộ lượng nấm men giông này sang thùng lẻn men có
dung tích 200 - 400 lít (trong đó có 100 - 200 lít dịch malt). Trong giai đoạn
này, ta nuôi chúng ớ nhiệt độ thâp (khoảng 12 - 14°C) để cho chúng quen
dần với nhiệt độ trong sản xuất.
* Nhứng giai đoạn tiếp theo, dung tích nhân giông thường nhiều hơn
từ 10 - 15 lần. Ta tính toán sao cho quá trình nhân giốug theo nhửng cấp
nhân giông đii lượng giông cho quá trình lên men.
b) Trong nhiều nhà máy, người ta sử dụng nấm men sau khi đã lên
men đê tái sứ dụng trong những lần lên men tiếp theo. Muôn sử dụng được
nấm men dã qua lên men phải tiến hành quá trìn h xử lý. Các bước xứ lý
nám men được thực hiện như sau:
Cặn nấm men (hay sinh khôi nấm men) sau khi lên men xong được
thu nhậu và chuyền chúng vào một thùng hình trụ. Cho nước lạnh vào,
khuây nhẹ rồi đế yên cho đến khi toàn bộ sinh khôi nấm men lắng hêt. Ta
bỏ phần trên, phần dưới của sinh khỏi, chỉ nhận phần giữa vì phần dưới
cùng thường bao gồm nhiều tế bào nấm men đã gia, còn phẩn trên cùng
chứa nhiều tê bào có kích thước rát nhỏ. Phần giữa chứa nhiều tê bào nâm
men trưởng thành. Lớp sinh khôi này dùng để tiến hành lên men là tốt
Iihât. Sinh khôi nấm men được rửa nước đã khử trùng và làm lạnh ở l°c
nhiều lần.
Trước khi sử dụng, ta nên dùng dung dịch malt có hàm lượng đường 7 -
8% vào đê tế bào nấm mei> phục hồi khả năng phát triển và khả năng lên
men.
Trong trường hợp nấm men bị nhiễm nhiều vi sinh vật hoặc tạp chât,
ta tiến hành xử lý như sau:
Dùng H2S 0 4 nồng độ Qy4r/Ỉ hay H3P 0 4 nồng độ 0,6% cho vào sinh
 CÕNG NGHỆ SẢN XUẮ T CỎN VÀ CÁC SÁN PHẨM lẻn m en chửa côn

k hỏ i n à m m o n . k h a v n h ẹ s.ỉtỉ đó I igưng k h u â y đ ế loại c ặ n b â n . D ị c h sill}}

k h ỏ i í lược t r u n g h o a b a n g KOỈ I (ứi p H 4, 8 H- 5 , 2 ! D ù n g n ư ớ c vỏ t r ù n g đ ã đò
Lì nh ừ 1"C riía n h i ổ u l ã n và s ứ d ụ n g s i n h k h ố i n à y n h ư p h ư ơ n g p h á p t r ẽ n .

2- DườtìíỊ hóa
Dê c h o q u a r r ì n h d ư ờ n g h o a dược t i ê n l i à n h tcVt, n i a l t , c á c iiỉỊim-n liộu
t h a y t h ò ỉiKilt p h a i dược n g h i ề n n h o . N g h i ề n c à n g n h ỏ , d i ộ n t í c h t i ò p xúc
"iữii cơ c h a t và c n z y m c à n g cao. N h ư v ậ y p h ả n ứ n g x á v r a c à n g m ạ n h . S a u
khi n ^ u v ẽ n li('U (lược n g h i ê n n h ò , (Ịuá t r ì n h d ư ờ n g h ó a được t lìực h i ộ n l á n
lượt nhu' Siiu:
T r ộ n nước và ngu Ví‘11 liẹu thíiv t h ê m a l t ( nốu t r o n g cõniỊ Hiíhệ có s ứ
(lụng n m i v ô n liộu i h a v t h ô inalt >. Tý lệ n g u v ê n liệu / n ước là 1 / ỉ - 1/3.
T r ội ì l íộ t ma lt với nước thíM) tv lộ bộ t m a l t / n ư ớ c l à 1/5 -ỉ- 1/4,.
Lưu y. t n m i ( tníờn.ií ỉ11 >■p p h a i s ứ (lụng bột g ạ o h a y loại bột khi ic t h a y
t h ê n i a h , liai luiộc r':\xi l)ií s u n g t - n / y m cho dủ (lỏ tỉ ui y p h à n h è t lượuíí t ị tì lì
hột này.

Sítu khi ! I'ụn ntíoc. b «>t m a l t v à n g u y ê n l iệ u t h a y t h ò . người t a tiõii

h à n h IKIU. Qu;i i r i n h n â u ht qu;í t rì 1 1 I1 d i ề u c h i n h n h i ệ t (lộ s a o c h o c h ú n g
t h í c h h ợ p c h o hoạt (lỘHK cun tiíỉiií loại e n z v m có t r o n g m a l t h a v t r o n g c h é
p h â m vi si 1 1 I1 vạt Hì á t a (lưíi vào. C á c q u á t r ì n h t h ú y p h à n t r o n g ' k hi n à u .
(Ịiiá I r i n h thuv p h à n t i n h bột va p r o t e i n là c h í n h , t r o n g đó n g ư ời t a q i m n
t; ìm nliiou (ỉôn q u à t r ì n h t h u y p h à n t i n h bột , m ặ c dù q u á t r ì n h t h u y phTin
p r o t e i n đ ó n g va i trì) khon.u n h o t r o n g việc h ì n h t h à n h k h ố i l ư ợ n g bia.
T r o n g bột malt t o n ’ till loại e n z y n i r ấ t q u a n t r ọ n g : P r o t o a s e , </.-
amylíisi*, | J-ainyỉus<\ Nị ĩ umì tí i rõ 11 một. sỏ e n z y m k h á c c h i ế m s ố l ư ợ n g k h ô n g
n h i ề u và ít có t ; ú ‘ tiling tlõn cỉiíìt lưựníí bia. C h í n h vì t h ế , vi ệc ítiều k h i ể n
n h i ệ t (lộ đố ba loại en/Ạ 111 này p h á t huy được k h ả n ă n g xúc ĩ á c cứa m i n h là
c ỏ n ^ việc q u a n tr ọ ni Ị nhiit troiiíỊ q uá t r ì n h n â u bia.
T h ự c t ố nghi('*n cứu ya s a n x u ấ t cho t h â y n h i ệ t độ t h í c h h ợ p c ho t ừ n g
loại 1 *1 1 / vni cô t r o n g m a l t n h ư sau: ^
: P r o t o a s o h o ạ t (lộng m ạ n h ớ 17 - 5 2 ° c
:: ( í - a m v l a s e h o ạ t (lộng m ạ n h ớ 70 - 7 5 ° c
:: ị i - a n i v l a s í 1 lioiit (lộní* m ạ n lì ớ GO - 6 5 ° c
T r o n g t n r ờ lìịí hííp ílùỉi” bột t h a y t h ế m a l t , d ù n g e n z y m đ ế n g h i ề n vi
k h u â n , n h i ẹ t <!<) c a n C‘h n h o ạ t (lỏng cứa e n z y m n à y s è ca o h ơ n r ấ t n h i ề u .
M ạ t k h á c , liêu (iìnm lmt i h n y tin'* m a l t ng ười t a v ẩ n p h ả i c ho b ộ t m a l t vào
k hi h òn t nil mfoc vnj lưon<í k h o n n g W'f su với lượngbột để t r á n h hiộn tượng
294 CHƯƠNG 7

tạo khối keo khó khuấy trộn và chill không đều. Giai đoạn cho một ít malt
vào này được gọi ià dịch hóa (làin loãng khôi bột khi gia nhiệt). Người ta
điều khiển nh iệt độ trong quá trình này như sau:
* N âng nh iệt lên 48 - 52 ° c , giữ trong khoảng 15 phút.
* N âng tiếp đến 70 ° c giừ trong khoảng 10 phút.
* N âng tiếp đến 100 ° c để bột chín hoàn toàn.
Đến giai đoạn này ta kết thúc quá trình dịch hóa, tiếp theo là giai
đoạn đường hóa. Quá trình này nhiệt độ được điều khiến như sau:
* Hạ nhiệt xuống 75°c và cho toàn bộ dung dịch bột malt đă hòa tan
vào nước ấm ơ 48 - 52 °c và nâng nhiệt lên 63 - 68 ° c , giừ nhiệt độ này
trong 30 - 40 phút.
* Nãng tiếp nhiệt đến 72 - 75 °c và giừ trong 30 - 40 phút.
Kiểm tra quá trình đường hóa bàng cách dùng dung dịch cốt nhỏ vào
(lung dịch đường hóa, nếu không đổi màu là quá trình dường hóa kết thúc.
Sau khi đường hóa kết thúc, tiến hành lọc bằng các máy lọc khung
ban. Bã được rửa bang nước nóng 70 " 7 5 'C . Sau khi lọc, người ta phân
nước dường theo hàm lượng đường ra làm hai loại đế sán xuất bi^ có chất
lượng khác nhau.
* Nước đường có hàm lượng đường 8 - 9c/( đê sản xuất bia chai
* Nước đửờng có hàm lượng đường 10 - \2 rf đê sán xuât bia lon.
Trong trường hợp nước dường không du lượng đường theo qui định của
sán xuât, người ta có thể bồ sung dường cho đủ.
Nước đường này sẽ được đem đun với hoa houbion nhằm trích ly từ hoa
houbỉon các axit đắng, tinh dầu, nhựa đắng, các thành phần hòa tan khác.
Sau khi nấu với hoa houblon, agười ta lọc đề bỏ bã hoa houblon, đề
láng để loại bỏ những thành phần không tan. Phần dịch trong rè được làm
lạnh nhanh đến 10 - 15 °c và chuyển qua thùng lên mon.
Trường hợp dùng cao houblon thì không cần phải làin phức tạp như
trinh bày trên mà chi cần hòa tan cao houblon vào dung địch đường ở nhiệt
dộ cao. Sau khi hòa tan hết cao houblon, ta hạ nhiệt và chuyểnhướng
chúng qua thùng lên men.
Toàn bộ quá trình nấu đường hóa dược trìxih bày ở H.7.2. Ở đây cần lưu ý
đến việc dám bảo vệ sinh thiết bị và thao tác tuyệt đối vô trùng, nếu trong quá
trình thực hiện, đo phạm phải sai sót nhỏ để có sự hiện diện của các vi sinh vật,
thì quá trình lên men sè bị nhiễm, toàn bộ khối lên men sè bị loại bỏ.
CÔNG NGHỆ SẦN XUẤT CỔN VÀ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN CHỬA CỒN 295

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Thởi 9ia" <9iở)

Hình 7.2: Quá trình đường hóa
3-Quả trình lên men
Quá trìn h lên men sẽ được tiến hành qua hai giai đoạn*.
* Giai đoạn lên men chính.
- Giai đoạn lên men phụ.
a) Giai đoạn ỉên men chính
Sau khi dịch đường được làm lạnh và đưa vào th iết bị lên men, người
ta cho giống nấm men được nuôi riêng ở phân xưởng lên men vào dịch
đường này,
Giống nấm men cho vào quá trình lên men thường vào khoảng
10 - 15%.
N hiệt độ cho quá trình lên men chính vào khoảng 8 - 13 ° c (thường
duy trì ở nhiệt độ 8 - 9 °C ) Trong giai đoạn lên men xảy ra quá trìn h
chuyển hóa đường thành C 02 và C2H5OH là chính.
Thời gian lên men chính thường nằm trong khoảng 6 - 1 0 ngày. Quá
trình này xảy ra qua 4 giai đoạn.
* G ia i đoạn đầu: Giai đoạn này k éo dài 1 - 5 n gày. Ở giai đoạn này
xuất hiện những hiện tượng sau:
* Xuất hiện rấ t nhiều bọt trắng và mịn trên bề m ặt diện tích lên men.
* Nấm men nẩy chồi và phát triển rấ t mạnh.
296 CHƯƠNG 7

* Hàm lượng chất hòa tan có trong dung dịch nước đường (dịch lên
men) giảm trung bình 0,2 - 0,5%/ngày.
* Giai đoạn thứ hai:
Giai đoạn này kéo dài 2 - 3 ngày, ơ giai đoạn này xuất hiện những
hiện tượng sau:
Xuãt hiện rấ t nhiều bọt trắng, tạo ra một lớp khá dày trên bề mặt
dịch lên men.
* Lượng cồn tạo ra nhiều:
* Hcàni lượng chất khô có trong dịch lên men giảm rấ t nhanh. Tốc độ
giám hàm lượng chất khô khoảng 0,5 - l,5 C/í/ngày
Đây lả giai đoạn lên men mạnh nhất trong quá trìn h lên men. Lượng
cồn, CO., sẽ được tạo ra nhiều nhất ở giai đoạn này.
pH giam từ 5,5 - 6 xuống còn 4,2 - 4,5 do sự hình thành một số axit
hửu cư trong quá trình lèn men.
Giai đoạn tỉiứ ba
-■ G i a i đ o ạ n n à y k é o d à i k h o á n g 3 - 4 n g à y , ơ g i a i đ o ạ n n à y l ớ p b ọt
trôn bổ mạt (lịch lên men sẽ.xẹp xuống dần. Trên bề m ặt phủ một lđp bọt
chuyên sang màu nâu vàng .
H à m l ư ự n g c h ấ t k h ô t r o n g dị ch l ê n m e n g i á m d ầ n với t ố c độ k h o ả n g
0,2 - 0 , 5 r r/ngàv.
Tẽ bào nám men sè tạo thành khối lớn, nhỏ khác nhau và lắng
xuống dưới đáy thùng lên men.
* Dịch lèn men trong dần
Khi tiến hành lên men. nấm men sử dụng đường cho quá trình tăng
sinh khòi (giai đoạn đầu) và quá trình chuyển thành cồn cùng các axit hữu
Ctì và các hợp chất khác.
Khi sử dụng đường, nấm men sê sử dụng glucose trước, sau đó đến
fructose và cuối cùng là maltose
b) Giai đoạn lên m en phụ
Giai doạn lên men phụ được thực hiện ở nhiệt độ rấ t thấp. Người ta
thường tiến hành quá trình lên men phụ ở nhiệt độ khoảng 1 - 3 ° c , trong
thiết bị kín, áp suát. 0,2 - 0,4kg/cm2
Thời gian tièn hành lên men phụ không co' định; Uó phụ thuộc vào
điều kiện nhà máy và đặc biệt phụ thuộc vào chất lương của từng loai bia
mà nhà máy sán xu^t. Giai đoạn lên men phụ nhằm ba mục tiêu cơ bản:
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÓN VÀ CÁC SẢN PHAM l ẻ n m e n c h ử a c ô n 297

* Bào hòa C 02 .
* Tạo hương vị cho bia, ổn định chất lượng bia
Làm trong bia.
Khi mới chuyền dịch lên men từ quá trình lên men chính sang những
t h ù n g l ê n m e n p h ụ , l ư ợ n g CO., t r o n g d ị c h b i a 1 1 0 1 1 n à y t h ư ờ n g l à 0 ,2 %. S a u
khi lên men phụ, lượng COọ sè tăng lên > 0,3CC.
Mức độ bão hòa C 0 9 trong bia phụ thuộc vào ba yếu tô': nhiệt độ, áp
suất và thời gian.
-* N hiệt độ. Nhiệt dộ càng thấp, khả năng hòa tan C 02 cồng cao. Ở
giai đoạn lên men chính, mức độ hòa tan CO., thấp vì lên men ở nhiệt độ
cao. ơ giai đoạn lên meal phụ, mức độ hòa tan C 02 đạt cao nhất vì trong
giai đoạn này, người ta thường duy trì nhiệt độ lên men ờ 1 - 4 ° c .
> Á p su ất . Á p s u â t c à n g cao, k h d n ă n g h ò a t a n CO., c à n g cao. T r o n g
quá trình lên men, C 09 sẽ được tạo ra và có xu hướng thoát khỏi (lung dịch
lên men theo chiềư từ clưđi lên. Do đó việc tạo ra một lực đẩy CO., ngược
lại v ào t r o n g d u n g (lịch l ê n m e n s è t ạ o đ i ề u k i ệ n đế’ COọ n ằ m t r o n g d u l l "

địch lên men và hòa tail trong đó. Ap suât tạo ra trong thiết bị lên men
kín ụèn duy t rì ở 0,2 - 0,4 kg/cm2.
* Thai gian lèn men. Thời gian lén men (nhất là lên men phụ) càng
dài khá năng hòa tan C 0 2 vào dung dịch bia càng lớn
* Đối với bia hơi, t.hời gian lên men phụ khoảng 1 1 -1 4 ngày.
* Đối với bia chai, thời gian lên men phụ khoáng 15 + 21 ngày.
Thời gian này thường *không cỏ' định đốì với tấ t cả các loại bia hoặc
đối với tấ t cá các nhà máy mà tùy theo loại bia hoặc từng nhà máy, mà
người ta quyết định thời gian lén men phụ dài, ngắn khác nhau.
Quá trình lắng trong bia là một quá trinh hết sức phức tạp. Trước tiên,
nhừng hạt có kích thước nhỏ, không có khả năng hòa tan trong nước, gặp
nhiệt độ thấp sè lắng xuống đáy thiẻt bị.
Ở nhiệt (tộ thấp, xáy ra hiện tượng đông tụ nhựa houblon, các protein,
tan ill. Tế bào nấm men sẽ lắng xuống theo từng đám khi chúng liên kết với
nhau. Như vậy, ở giai đoạn làm trong bia, quá trìn h lắng không chi là do
nấm men mà còn do rấ t nhiều vật chất không tan khác. Trong quá trình
lên men phụ, cần lưu ý một sô' điểm quan trọng có ảnh hương rấ t xấu đến
chất lượng bia.
* Trong khi tiến hành lên men chính, hàm lượng diacetyl sè tăng
298 CHƯƠNG 7

nhanh. Ngược lại, trong giai đoạn lên men phụ hàm lửợng này không
những không được tạo th àn h mà còn giảm. Có hai diacetyl giảm đến 50%
trong giai đoạn lên men phụ.
* Trong quá trìn h lên men phụ, tuyệt đốì không cho oxy xâm nhập vào
thùng lên men. Nếu hàm lượng oxy có trong dịch lên men bia lmg/1 thì đã
ở mức bắt đầu gây ra những quá trinh oxy hóa có hại cho vị của bia. Nếu
trong dịch lên men bia hàm lượng sắt hoặc đồng ở mức 0,1 - 0,2 mg/1 sè
làm tăng quá trìn h oxy hóa. Do đó việc kiểm soát và vệ sinh th iế t bị lên
men thường xuyên là điều rấ t cần thiết.
* Trong quá trìn h lên men phụ, xảy ra hiện tượng tự phân của nấm
men. Nếu quá trình này xảy ra ít thì hoàn toàn có lợi cho chát lượng bia.
Nhưng nếu quá trìn h này xảy ra quá mạnh sẽ gây ra hiện tượng bia bị hư
hỏng rấ t nhanh vì sẽ hình thành rấ t nhiều mùi khó chịu.
Vì quá trình tự phân là quá trình phân hủy protein của protease của
chính nấm men Saccharomyces cerevisiac. Kết thúc quá trìn h lên men phụ,
các iihà khoa học cho thấy trong bia có khoảng 100 chât sinh hương và tạo
vị, trong đó có:
* 36 loại ruợu khác nhau
* 45 loại ester
* 28 loại axit
Sô' còn lại là những chất hoàn toàn khác, đóng góp vào việc tạo ra
hương vị cho bia. Ngoài ra, hàm lượng CO.? có trong bia phải > 0,3%

4- S ử d ụ n g các c h ế p h ẩ m cnzym tro n g sản x u ấ t bia

Từ năm 1950 đến nay, nhiều nhà máy sản xuất bia trên th ế giới đá sử
dụng nguồn enzym từ vi sinh vật. đố thủy phân tinh bột và các chất khác từ
các nguồn phi malt. Những enzym tư vi sinh vật được dùng trong sản xuất
bia gồm:
a) a-amylase từ vi khuẩn, nâ'm sợi. Những enzym được sản xuất từ vi
khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn những enzym thu nhận từ nấm sợi. Các
enzym a-amylase này thường được dùng để thủy phân tinh bột.
b) Protease cùng được thu nhận từ vi khuẩn và từ nấm sợi. Chúng được
dùng để thủy phân protein có trong nguyên liệu tạo ra những hợp chất hoặc
những chất có trọng lượng phân tử Iihỏ, giúp cho nấm men phát triển
nhanh hơn ở thời kỳ đầu đồng thời làm tăng giá trị của bia, tăng khả năng
tạo ra C 09 và giữ COa trong bia.
 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÔN VÀ CÁC SẢN PHẨM LẼN MEN CHỬA CỒN
Bàng 7.2: Một sổ chê phẩm enzym từ vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trẽn
Số thứ
Tên chế phẩm
1 Termamye 120L.
2 Cellulaso 1,5L
3 Cereflo
I - Nhiệt độ hoạt động là 50 - 70°c
I -*pH hoạt động là 6,5 - /,5
i ■
4 Fungamyl 800L
5 Neutrase
ỉ xuất từ Aspergillus niqer
6 Finzym 200L
7 Maturex L.
299
th ế giới
Đặc tỉnh của chế phẩm
- Loại enzym chịu nhiệt độ cao (95 - 105 °C)
- Liều lượng sử dụng: 0,05 - 0,1%
- Hoạt động ổn định trong dung địch enzym có 50 -
70ppm Ca2+
- Thường dùng thay thế malt lot
- Chế phẩm ơạng lỏng
- Chế phẩm thu nhận từ Tridroderma reesei
- Nhiệt độ hoạt động là 50 - 60°c
- pH hoạt động là 4,5 * 6
- Phản hủy cellulose thành glucose, cellubiose
- Liều lượng sử dụng: 0,2 - 1kg/ tấn nguyên liệu thay thế
* Đây ià enzym [ì-glucanase được thu nhận tử Bacillus
subtilis
- Cắt liên kết 3-1,3 và 3-1,4 glucan
- Dùng trong giai đoạn dịch hóa để làm giảm độ nhớt của
dich
- Chế phẩm enzym này được sản xuất tử nấm sợi
Aspergillus Oryzac
- Enzym nảy cắt liên kết cx-1,4 - glucozit trong amylo và
amylopectin dể tạo thành maltose
- Nhiệt độ tối Ưu: 55 - 60°c
- pH tối ưu: 4 - 5
- Liểu lượnq sử dụng: 0,02 - 0,05%
- Đày là chế phẩm protease được thu nhận từ Bacillus
subtilis
- Chủng thuộc enzym protease trung tính, trong phân tử
của chúng cỏ chứa Zn2+
• Khi có mặt Ca2* hoạt tinh rất ổn định ị
- Nhiêt đô tỏi ưu: 45 - 55°c
- pH tối ưu: 5,5 + 7,5
- Liều lươnq sử dụnq 0,06 + 0,1%
- Enzym này thuộc nhóm enzym p-glucanaset được sản
- Nhiẽt tối ưu: 60°c
- pH tối ưu là 4 - 5.5
- Liéu lượnq sử dung ỉà 0,5 - 1kg/100hl
• Maturex là enzym chuyển hóa a-acetolectat, được thu
nhận từ Enterobacter acrogener và Bacillus lich
eniformis, Bacillus brevis
- Thường sử dụng ở giai đoạn đầu của quá trình lên men
với liều lượnq 0,02 ppm
300 CHƯƠNG 7

c) Citase được dùng đề thúy phân cellulose tạo điều kiện tốt cho lẻn
men và quá trình lọc sau này.
Việc sử dụng enzym từ vi sinh vật vào trong sản xuất bia có những ưu
điểm như sau:
a) Giúp người sản xuất bia có thể sử dụng tinh bột phi malt thay thẻ
m alt trong công thức sản xuât bia theo phương pháp truyền thông, nhờ đó
giảm được giá thành sản xuất bia mà giá trị của bia khỏng khác nhiều so
với sử dụng 100% malt.
b) Làm tăng chất hòa tan trong dung dịch lẻn men, nhờ đó quá trình
lên men đạt hiệu suất cao hơn,f
c) Ta có thế sử dụng malt có chất lượng thấp (Nếu malt có chât lượng
thấp thì amylase sẽ có hoạt. tính thấp). Như vậy đã giái quyết được phần
nguyên liệu không đủ tiêu chuẩn cho sản xuât thành nguyên ỉiệu đũ chất
lượng cho sản xuât.
d) Giám độ nhớt trong dịch, giúp quá trìn h lọc tốt hơn.
e) Rút ngắn được thời gian nâu, thời gian lên men phụ.
Hiện nay, các chê phẩm enzym sử dụng trong sán xuất bia dược san
xuât với sô lượng rất lớn theo qui mô còng nghiệp. Các chè phám thương
mại được bán rộng rãi ơ nhiều nước, trong đó có ờ Việt Nam. Những chê
phấin đó được trình bày trong bảng 7-2.

7.3 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VANG.

Rượu vang là loại rượu được sản xuất từ nho, xuất phát từ các nước
châu Au. Ngày nay, từ rượu vang được hiểu theo nghĩa rộng hưn: tất cácác
loại rượu được sản xuất từ nguồn nguyên liệu là trái cây tieuđưực gọi là
rượu vang (wine).
7.3.1 N guyên liệu trong sản xuất rượu vang.
Nguyên liệu sử dụng trong sản xuất rượu vang đỏ là: 11hưng loại trái
cây có chứa nhiều đường, vitamin, axit hữu cơ. các châ't khoáng, protein.
1- Nho
Nho là một ìoại trái cây dùng làm nguyên liệu truyến thống đẻ shn
xuất rượu vang. Trước đây, nho chí được trồng nhiồu ỡ các nước châu Àu.
Hiện nay, nho được trồng ở rấ t nhiều nước khác nhau trên thê giới.
Nho thường phát triền ờ nơi có khí hậu khô ráo, nhiều nắng và trên
vùng đất ít chua.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÓN VÀ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN CHỬA CÔN 301

ơ Việt Nam, nho được trồng ở một sô" tỉnh miền Trung. Nảng suất
trồng ở đây chưa cao và chất lượng trái nho chưa phù hợp đê sản xuất rượu
vang.
Nho có thành phần hóa học trung bình như sau:
* Đường: 10 - 30c/c (bao gồm giucose, ítructose và saccharose)
* Các axit hữu cơ: 0,5 -1,7% (bao gồm axit malic và factoric)
* P r o t e i n : 0, 1 - 0 , 9 c/c
* Pectin: 0.1 - 0,3c'c
* Chat khoáng: 0,1 - 0,5rí
* Chứa nhiều vitamin c , Bj .B.j , p p và các chất thơm khác.

2 Dứa
Dứa là một ỉoại trái cây được trồng trong vùng nhiệt đới. Trái dứa
chứa nhiều đường, cellulose, protein, các vitamin và các chât khoáng.
Dứa là một trong nhiều loại trái cây có khả năng nhât của vùng nhiệt
đới đế sán xuât rượu vang. Tuy nhiên, sản xuât rượu vang từ dứa có một
nhược điểm rấ t lớn ià các hợp chất thơm có trong dứa thường râ t không
bén nhiệt và axit, do đó, sán phẩm lén men cuôi cùng từ nguyên liệu ià dứa
thường bị m ất mùi dứa.
3 Mơ
Mơ có nhiều loại và dược trồng nhiều ở vùng nhiệt đới. Mơ được xem
như một vị thuõc trong kho tàng thuốc Bắc cố truyền. Ưu điểm lớn nhất khi
chọn mơ làm nguồn nguyên liệu sản xuất rượu vang là các chất thơm có
trong mơ khã bền, do đó, sản phấm lên men thường giữ được mùi mơ Tuy
nhién, mơ là loại trái cây rấ t khó ép lấy nước và nước mơ thường chứa ít
đường.
4 Chuối
Chuối là một loại cây phát triển nhiều ở vùng nhiệt đới. Chuối có
nhiều loại, về nguyên tắc, các loại chuôi đều có thế sử dụng để sản xuât
rượu vang. Các hợp chải thơm có trong chuối được giữ suốt quá trình lên
men và có nhiều trong rượu vang. Tuy nhiên, chuôi là loại trái cây có thịt
quả dẻo nên rấ t khó ép lấy dịch mà ta chỉ có thể trích ìy bằng nồng độ
đường cao hoặc lên men cả miêng chuôi nhỏ.
5 Đảu
Nghề trồng dâu có từ láu đời ờ nước ta. Tuy nhiên, ngườỉ Việt Nam chi
302 CHƯƠNG 7

có thói quen trồng dâu nuôi tằm mà không trồng dâu để lấy trái, nếu có qui
hoạch tốt, ta thu hái trái dâu và sử dụng nó như một loại nguyên liệu rất
quý cho quá trìn h sản xuất rượu vang. Trái dâu chứa hàm lượng đường khá
cao (>10%), màu của trái dâu có đặc điểm rấ t riêng để tạo ra vang đỏ. Tuy
nhỉên, trá i dâu cùng có nhược điểm là khó bảo quản và hiện nay thu hái để
có đủ nguyên liệu cho sản xuâ't là điều hết sức khó khăn.
7.3.2 Hệ vỉ sỉnh vật trong sản xuất rượu vang
Hiện nay trên th ế giới người ta sản xuất rượư vang theo hai phương
pháp:
- Phương pháp lên men bằng hệ vi sinh vật tự nhiên.
- Phương pháp lên men bằng vi sinh vật thuần khiết.
2-Lẽn men rượu vang bằng vi sinh vật tự nhièn
ơ những nước có nghề sản xuất rượu vang truyền thống, người ta
thường sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên có ở quả (trái) nho. Việc sử dụng vi
sinh vật tự nhiên để sản xuất rượu vang có ưu điểm là:
- Không cần giống vi sinh vật thuần khiết, do đó khổng đòi hỏi kỷ
th uật cao, không cần đầu tư nhiều cho quá trìn h sản xuá't.
- Sản phẩm khá đặc biệt vì quá trình tích lũy hương cho sản phẩm
không chỉ lấy từ nguồn trá i cây mà còn được tạo ra bỏi vi sinh vật tự nhiên
có ở trá i nhò và theo vào quá trìn h lên men.
Tuy nhiên, việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên cũng có rất uhiều nhược
điểm:
- C hất lượng sản phẩm thường không ổn định vì không kiểm soát được
chất lượng giống vi sinh v ật ban đầu khi đưa lên men. Ở những nước,
n h ữ n g cơ sở s ả n xu ất rượu v a n g h ay ở những g ia đ ìn h có truyền th ố n g sản
xuất rượu vang nổi tiếng họ vẫn dừng vi sinh vật tự nhiên để tiến hành lên
men. Tuy nhiên, chất lượng sản phẩm của họ phụ thuộc phần lớn-vào kinh
nghiệm rấ t tuyệt vời khi lựa chọn nguyên liệu, phối trộn nguyên liệu.
Có nhiều nơi, người ta không bao giờ rửa nho trước khi làm n á t để tận
dụng tối đa lượng vi sinh yật có ở trá i nho. Họ dùng gần như 100% lượng
nho không rửa này để lên men.
Có nhiều nơi, họ chĩ lấy 1/2 hoặc 1/3 lượng nho dùng làm nguyên liệu
sản xuất như một chất mang vi sinh vật tự nhiên vào lên men. Còn 1/2 hay
2/3 khối lượng nho kia người ta rửa rấ t sạch và đem làm n á t cùng khối
lượng trên.
CÕNG NGHỆ SẦN XUẤT CÔN VÀ CẤC SẢN PHẨM LẼN MEN CHỨA CÔN 303

V iệc là m n à y ch ỉ có h iệu quả tố t và đảm bảo an toàn vệ s in h thực

phẩm k h i người ta trồ n g n h o k h ôn g dùng quá n hiều hoặc k h ô n g d ù n g thuốc
trừ sâu, p h â n h ó a học. Trường hợp ngược lạ i th ì k h ôn g n ên áp d ụ n g phương
pháp n à y v ì s ẽ rấ t nguy h iể m cho quá trìn h lê n m en cũng như cho sức k h ỏ e
của người tỉêu dùng.
N h ữ n g n g h iê n cứu của các n h à khoa học cho th â y , tro n g khu h ệ vi s in h
vật tự nhiên dùng trong sản xuất theo phương pháp này có 76 - 90% ỉà nấm
sợi, 9 - 22% là nấm men, số còn lại là xạ khuẩn và vi khuẩn.
D ịch nước n h o có pH th ấp (pH: 2,7 -I- 3,8 ) thường k h ô n g th ích hợp cho
vi khuẩn p h ổ t tr iể n . Đ ây là điều rấ t th u ận lợi cho v iệc sử dụng h ệ vi sin h
v ậ t tự n h iê n tro n g sả n xuất.

2« Vi sinh vật thuần khiết trong sản xuất rượu vang

C ông đoạn quan trọ n g n h ấ t tron g sả n xu ất rượu v an g là quá tr ìn h lê n
m en. Người ta ch ia quá trìn h lê n m en n à y ra là m h ai gia i đoạn: g ia i đ oạn
lên m en ch ín h và g ia i đoạn lên m en phụ. Cả h a i gia i đoạn lê n m en n ày, vi
sin h v ậ t đ ổn g v a i trò quan trọng, n h ấ t ỉà n ấm m en. N ấ m m en th a m g ia
chủ yếu vào quá trìn h chuyển h ó a đường th à n h cồn. N h ư v ậ y , yêu cầu của
quá trình lên men trước tiên là phải tạo được cồn từ đường, k ế đó là tạo
hương và lắ n g trong.
S ản p h ẩ m rượu v a n g ỉà sả n p h ẩm ỉê n m en k h ô n g qua chung cá t, do đó
yêu cầu về độ tro n g rấ t quan trọng, v ề lý th u yết, vi s in h v ậ t sử d ụ n g trong
quá trìn h lê n m en rượu v an g g iô n g như tron g quá tr ìn h lê n m en b ia. Tuy
n h iê n , v iệc ứng dụng các vi sin h v ậ t tron g sả n xu ất rượu van g, n g o à i các
tín h ch ấ t g iô n g n h ư tro n g sả n xu ất bia (bao gồm lê n m en cồn, k h ả n ă n g
lắ n g líh a n h , chịu n h iệ t độ th ấp ), còn p hải có k h ả n ă n g tạo hượng. Vì t j ế ,
tro n g s ầ n xu ất rượu van g, người ta thường sử d ụng các ch ủ ng n á m m en
th u ần k h iế t n h ư sau:
a) Saccharomyces vini: Trước đây nấm men này cổ rấ t nhiều tên khác
nhau như: sacch arom yces ellip so id eu s, saccharom yces m eyer. N ấ m m en
sa cch arom yces v in i có k h ả n ă n g k ê t ỉ ắn g rất n han h . K ích thước của ch ú ng
vào khoảng (3 + 8) X (5 - 12) um. Chứng sinh sản theo cách nảy chồi và
rạp bào tử.
b) Saccharomyces uvarum: Chúng có h ìn h th ái rấ t g iố n g các loài nấm
m en có k h ả n ă n g lên m en cồn k h á c, n him g k h ả n ă n g tạo bào tử của ch ú n g
cao hơn rất n hiều các loài n ấm m en k h ác (n h ấ t là k h i ta nuôi ch ú n g tron g
môi trường thạch - malt). Trong quá trình lên men, chúng có khả năng tạo
304 CHƯƠNG 7

được lượng cồn rấ t cno (có thế đạt được lượng cồn trong dịch lẽn men
12 - 13% V).
c) Saccharomyccs ovifonnis: Nấm men này có khả năng lên men dịch
đ ư ờ n g đ ể t ạ o t h à n h l ư ự n g c ồn r ấ t c a o (có t h ể l ê n đ ế n 18% V). H ì n h t h á i củ a
nấm men này giống saccharomyces villi. Đặc điểm quan trọng của nâm
111011 n à y l à có k h á n ă n g l ê n m e n được rất. n h i ề u l o ạ i đ ư ờ n g k h á c n h a u n h ư
g l u c o s e , m a n o s e , s a c c h a r o s e , m a l t o s e v à 1/3 n a f i n o s e . C h ú n g k h ô n g có k h ả
n ă n g ỉ è n m e n g a l a c t o s e . C á c n ấ m m e n đ ược s ử d ụ n g t r o n g s ả n x u ấ t rượu
vang thường thích hợp lên men ở nhiệt độ 18 -25°c
7 .3 .3 Q u á t r ìn h l ê n m e n r ư ợ u v a n g
Q u á t r ì n h s á n x u â t r ư ợu v a n g l à qui t r ì n h s á n x u ấ t t r u y ề n t h ố n g của
các nước phương Tây. Qui trình này được thực hiện qua nhừng giai đoạn
sau:
- Cxiai đ o ạ n c h u á n bị d ị c h l ê n m e n .
- G i a i (loạn l ê n m e n c h í n h .
- Giai đ o ạ n lòn m e n phụ.
- O n (lịnh s ả n x u â t .
II) (ỉiai (ỉoạn cỉìiỉàn hị dung dịch lên ìììcn: Trong cnc loại nguyên liệu
t h ư ờ n g (lược sứ đ ụ n g (lể s a n x u á t rượu Viìiig, n h o là n g u y ê n liệu lý t ưởng
n h á t , vì t r o n g n h o h à m l ư ợ n g đ ư ờ n g r ấ t cno, chim b á o (lủ đ ế n q u á t r ì n h
c hu v ố n h ó a t h à n h c ồn t h e o n h ư m o n g m u ô n .
T u y n h i ỏ n , c á c l oạ i t r á i c ã y k h á c có l ư ợ n g đ ư ờ n g k h ô n g ca o và h à m
l ư ự n g a x i t r á t cao. Đ ỏ i với c á c l oạ i q u à k h ô u g p h ả i là n h o , n g ư ời t a c ầ n
p h á i (liều c h i n h l ư ợ n g đ ư ờ n g s a o c h o t ổ n g l ư ợ n g đ ư ờ n g t r o n g d u u g d ị c h p h ả i
đạt 16 - lS 'rS là tôt nhát.. Ngoài ra chúng ta phái điều chính cả pH, sao
cho pH đạt được 3,5 - 3,8 là tốt nhất.
Đố thu được dung dịch từ nho, theo công nghệ truyền thống, người ta
t h ư ờ n g l à m n á t c h ứ k h ô n g n g h i ề n , c ò n t r o n g c ô n g n g h ệ t h e o qui m ô c ông
nghiệp, người ta thường chà trong các máy chà có tốc dộ quav rấ t chậm chứ
k h ô n g n g h i ề n n á t . S ở dĩ, n g ư ờ i t a p h ả i l à m n h ư v ậ y đ ể t r á n h h ạ t n h o bị
bế, n ế u h ạ t n h o bị bể, c á c c h ấ t đ ộc có t r o n g h ạ t n h o sỏ t h o á t r a n g o à i , h ò a
tan trong rượu vang, như vậy người tiêu dùng uòug loại rượu này sẽ bị
n g ộ độc.
CÒNG NGHỆ SẢN XUÀT CÔN VÀ CÁC SẢN PHẨM LẼN MEN CHỬA CÔN 305

Mặc dù trái nho có hàm lượng đường khá cao, nhưng troag sản xuất
người ta vẫn phái điều chỉnh lượng đường trong dung dịch lên men đè tấ t
cả những dịch lên men sản xuất một loại rượu phải có cùng một lượng
đường trong dịch lên men như nhau. Sau khi làm nát nguyên liệu, người ta
không tiến hành đun sôi dung dịch lẽn men. Đê tiêu diệt vi sinh vật người
ta thường dùng S 0 2 . Lượng S 0 2 trong dịch lên men không được quá nhiều
vì sẽ gây ức chế sự phát triển và hoạt động chuyền hóa đường th à n h rượu
của nấm men; lượng S 0 9 được đưa vào dịch trái cây khoảng 30 - 120mg/l.
Song song, người ta thường cho vào hỗn hợp nho làm n át này enzym
pectinase hoặc cellulase (xem chương “Công nghệ sản xuất enzym”) để phá
vở thành tế bào của thịt trái nho, giúp quá trình thoát khỏi tế bào toàn bộ
các chất có trong tế bào.
Đối với nhừiig loại trái cáy khác, người ta có ba cách đề thu nhận dịch
trái cây dùng cho quá trình lên men.
Cách thứ nhất: Dùng máy ép ép trái cây, thu lấy địch trái cây. Cách
làm này thường không triệt đế vì hiệu suất thu nhận dịch trái cây phụ
thuộc rất nhiều ơ máy ép và tính chất hóa học, vật lý của loại trái cây.
Cách thứ hai: Nghiền nát trái cây, sau đó tiến hành giông như dịch
thu được từ trái nho.
Cách thứ ba: Người ta dùng đường để trích ly các thành phần có trong
trái cây ra ngoài. Trong trường hợp này, dịch trích ly sẽ chứn rất nhiều
đường (đường đưa vào để tạo áp suất thẩm thấu), nguừi ta dùng nước đê
pha loảng dịch đường đến mức độ đường cần thiêt cho quá trình lên men.
b) Giai đoạn lên men chính
Trong quá trình sử dụng hệ nấm men tự nhiên có ở trái cây (đặc biệt
là trái nho), người ta tiến hành lên men dịch trái cây trong những điều
kiện lên men theo kinh nghiệm truyền thống.
Trong qui trình công nghiệp, người ta thường sử dụng nấm ,m en giống
thuần chủng. Tỷ lệ giống cho vào quá trình lên men thường là 2 - 3% so với
khối lượng dịch trái cây. Nấm men này được nhân giống ở phân xưởng
riêng; ở một số trường hợp khác, người ta sử dụng một phần dung dịch
đang lên men của ĩĩiẻ này để lên men mẻ tiêp theo. Cách làm này có ưu
điểm là: giống nấm men trong quá trình lên men đã quen với điều kiện sản
xuất. Tuy nhiên, việc làm này không phải được tiến hành mãi mà chỉ có
th ể sử dụng 5 - 7 lầ n , sau đó, người ta lại phải làm lạ i từ đầu.
Khi nhân giống nấm men trong quá trình lên men liên tục, cần lưu ý
tạo điều kiện cho nấm men quen dần với điều kiện lên men có S 0 2 bằng
cách thổi S 0 2 vào dịch nhân giông với liều lượng từ thấp đến cao. Làm
cách này, nấm men sè chịu được S 0 2 trong dịch lên men, trong khi các vi
sinh vật khác không chịu dược S 0 2 sẽ bị tiêù diệt, quá trìn h Lên men sẽ
xảy ra thuận lợi.
306 CHƯƠNG 7

Khi lên men trong giai đoạn lên men chính, người ta thường duy trì
nhiệt độ lên men ớ 20 - 22°c . Thời gian lên men chính thường nằm trong
khoảng 10 - 20 ngày.
Trong trường hợp tiến hành lên men ở nhiệt độ cao (khoảng
25 - 28°C). thời gian lên men được rút lại trong khoảng 6 - 7 ngày.
Trong công nghệ sản xuất rượu vang, người ta khòng khi nào dùng
chât màu nhân tạo đề tạo màu cho rượu. Màu của rượu vang hoàn toàn là
màu tự nhiên cua trái cây dùng đê sản xuất rượu vang. Việc tạo ra rượu
vang có nhiều màu khác nhau là cả một nghệ thuật cua những người sán
xuất rượu vang. Ví dụ, muôn sản xuât rượu vang có màu đỏ sậm, người ta
phải dùng loại nho có vỏ chứa nhiều sắc tô đỏ thẫm. Khi lên men, người ta
tiến hành lẽn men cả vỏ nho. Khi cồn được tạo thành, các chất màu sẽ hòa
tan trong cồn và như vậy rượu vang có màu đỏ thầm. Trường hợp cần sản
xuảt rượu vang có màu đỏ sáng hơn, người ta tiên hành lên men dịch chiêt
hoặc dịch ép, chứ không lên men cả vỏ nho, cũng có thề pha trộn giữa loại
vang trắng với vang đỏ thầm.
Kết thúc quá trình lên men ở giai đoạn lên men chính, thường đạt
khoảng 8 - 10% cồn.
c) Giai đoạn lẽn men phụ
Mục đích của lên men phụ là làm ôn định chất lượng rượu, làm sáng
trong rượu và làm tăng hương cho rượu.
Lẻn men phụ thường được tiến hành ư nhiệt độ Lhấp hơn nhiệt độ tiên
hành lên men trong giai đoạn lên men chính. Người ta thường tiến hành
lên men phụ ờ nhiệt độ 15 “ 18°c . Trong quá trình lên men phụ, sự tạo
thành cồn chậm lại rất nhiều, thay vào đó ỉà một loạt các quá trình chuyên
hóa phụ đế tạo thành các chất thơm. Quá trình iắng, làm trong rượu cung
xảy ra rấ t nhanh, các quá trình này giông như các quá trình xảy ra trong
ién men phụ ở bia;
Trường hợp sau khi lẻn men, lượng cồn được tạo thành quá thấp sẽ
xảy ra hiện tượng chua rượu do quá trình lên men axetic, người ta phải bổ
sung thêm cồn để triệt tiêu quá trình lên men axit axetic và tăng thêm
lượng cồn vào rượu đảm bảo chât lượng rượu đồng đều. cồ n được sử dụng để
điều chỉnh lượng cồn có trong rượu phải là cồn thực phẩm.
Sau khi điều chỉnh lượng cồn có trong rượu xong, người ta chuyển toàn
bộ vào phòng lạnh dưới 10° c . Ở nhiệt độ này tấ t cả các thành phần không
tan sẽ được lắng xuống đáy và người ta gạn cặn lắng ra. Rượu sau khi đả
được làm trong sẽ được tiếp tục tàng trữ. Thời gian tàng trữ ở điều kiện
lạnh càng lảu, chất lượng rượu càng tốt.
 Chương

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

AXIT HỮU Cơ
Ngày nay, axit hữu cơ (axit axetic, axit lactic và một sô" loại axit hữu cơ
khác) không chỉ được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm mà còn được
ứng dụng nhiều trong cồng nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ
và cả trong y học.
Nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều, trong khi đó việc sản
xuất axit hữu cơ bằng công nghệ lên men không đủ đáp ứng những nhu cầu
trên.
Công nghệ sản xuâ't các axit hữu cơ đã có từ lâu. Các công nghệ sản
xuất ban đầu chủ yếu mang tính chất thủ công. Mãi đến đầu th ế kỷ XIX và
đầu th ế kỷ XX, công nghệ thủ công mới được thay th ế bằng công nghệ sản
xuất theo qui mô công nghiệp.
Trong số các loại axit hữu cơ đang được sản xuất theo phương pháp
này hay phương pháp khác, có hai loại axit hữu cơ (axit lactic và axit
axetic) được sản xuất nhiều nhâ't và được ứng dụng rộng rãi nhất.

8.1 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT AXETIC

8.1.1 A x it a x e t ỉc
Công thức hóa học của axit axetic là CH 3 COOH
Khôi lượng phân tử của axit axetic là 60,05
Axit axetic hoàn toàn tan trong nước, cồn, eter, benzen,axeton, và
trong cloroform. Chung hoàn toàn không ta n trong cs2
Axit axetic rấ t bền với các chất oxy hóa như axit chromic,
permanganate. Chúng có khả năng hòa tan cellulose, các hợp chất tương tự
cellulose. Chúng có khả năng phân hủy da, gây bỏng da, ăn mòn nhiều kim
loại.
308 CHƯƠNG 8

8.1.2 C ác p h ư ơ n g p h á p s ả n x u ấ t a x it a x etỉc
Axit axetic là một loại axit hừu cơ được ứng dụng rất rộng rãi và từ rất
lâu. Do đó, loài người đã phát minh ra nhiều phương pháp khác nhau đế
sản xuất axit axetic. Nhừng phương pháp sản xuất axit axetic bao gồm:
* Phương pháp hóa gồ
* Phương pháp hóa học
* Phương pháp sinh học
* Phương pháp kết hợp
2- Phương pháp hóa gồ
Cùng với sự phát triển của ngành khai thác và chế biến gỗ, loài người
đã biết cách sản xuất axit axetic từ dạng nguyên liệu này.
Bằng cách chưng cất gồ đã lên men, người ta thu được một hỗn hợp
nhiều chất khác nhau, trong đó có axit axetic với hàm lượng rấ t lớn. Hiện
nay phương pháp này không còn sử dụng.
2- Phương pháp hóa học
Phương pháp này dựa trên quá trìn h oxy hóa axetaldehyt th àn h axit
axetic, có xúc tác của mangan rồi sau đó chưng cất phân đoạn ở nhiệt độ
50-80°C
Phản ứng oxy hóa xảy ra như sau:

CH 3COOH

Hiện nay, người ta tổng hợp axit axetic từ methanol và c o bằng phản
ứng carbonyl hóa.
CHgOH + CO - » CH 3COOH

3- Phựơng pháp hỗn hợp

Trước tiên, người ta tiến hành quá trình oxy hóa hydrat cacbon có
mạch cacbon ngắn như propan hay butan để tạo thành axit acetal dehyd,
formaldehyde methanol và aceton.
Sau đó acetaldehyd được oxy hóa để tạo thành axit axetic.
Phương pháp hồn hợp được sử dụng nhỉều hơn cả là phương pháp thủy
phản bột gỗ bằng axit (phương pháp hóa học)
Sau đó người ta trung hòa khôi thủy phân này và tiến hành lên men
đế thu nhận được dung dịch chứa axit axetic.
 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT HỮU c ơ 309

4- Phưcmg pháp sình học: Hiện nay, người ta sản xuất nxit axetic chù
yêu b ằ n g p h ư ơ n g p h á p l ẽ n m e n . So với n h ữ n g p h ư ơ n g p h á p k h á c , p h ư ơ n g
p h á p l ê n m e n có n h i ề u ưu d i ê m .

a) Nguyên liệu đề sản xuất axit axetic bằng phương pháp lên men rất
dề kiếm. Có thê sử đụng nguyên liệu chứa đường (nước ép trái cây, nước
trái dừa, nước ép mía, có thề sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột và có
the sứ dụng cồn công nghiệp.
* Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột, phai qua ba giai đoạn
chuyên hóa.
- Giai đoạn chuyển tinh bột thành đường.
- Giai đoạn chuyên đường thành cồn.
- G i a i đ o ạ n e h u v ế n c ồn t h à n h a x i t a xe t i c .
N ê u s á n x u à t rừ a g u v ẻ n liệu c h ứ a đ ư ờ n g t hì q u a h a i giai đoạn:
- Gi ni đ o ạ n c h u y ể n đ ư ờ n g t h à n h cồn.
- Giai đ o ạ n c h u y ể n cồn t h à n h a x i t a xe t ic .
Nếu sail x u â t t ừ n g u y ê n ỉiệu đ à c h ứ a c ồn t hì t a chi c ầ n t ạ o (liều k i ệ n
t h u ậ n lợi đ ố vi k h u â n n x e t i c c h u y ê n c ồn t h à n h a x i t axoti c.
b) Q u á t r ì n h c h u y ể n h ó a ( h a y q u á t ỉ i u l ì l ẽ n 1 1 1 0 1 1 dược t h ự c h i ệ n ơ (lieu
kiện rất ÒI1 hòa, không cần nh iệ t độ cao, áp suất cao hay máy móc-, thiế t bị
phức tạp.
c) C ô n g n g h ẹ s á n x u ấ t a x i t a x e t i c h o à n t o a n khũiiỊí g ã y u l i h i e m môi
trườn ạ.
Vi s i n h v ậ t l c n m e n a x i t a x e t i c
CY> r ấ t n h i ỏ u loài vi s i n h v ậ t có k h á n ă n g lò;i 1 1 1 0 1 1 ill- t ạ o ra a xi t
a x et i c . T ấ t cả c ác vi k h u ẩ n có k h ả n ă n g l ê n m o n t ạ o r a iixit n x o t i c (lược <íọi
chung là vi k h u n n axoti-c. C á c ỉoài vi s i n h v ậ t a x e t i c khoiiK t-hi co k h a n â n g
l ê n m e n c ồ n tỉế t ạ o t h n n h axit, a x e t i c , m à c òn có k h á năiìK c h u w n h ó a (lược
rượu p r o p i o n i c t h à n h a x i t p r o p i o n i c v à c h u y ể n h ó a rơựti b u t y r i c t h à n h a x i t
butyric.
C á c l oà i vi s i n h v ậ t a x e t i c k h ô n g t h ể oxy h ó a clưực rượu b ậ c cao và
rượu m o t y l i c .
C á c loài vi s i n h v ậ t a x e t i c l à n h ữ n g loài h i ê u k h í m ạ n h . T r o n g (lieu
k i ệ n m ô i t r ư ờ n g đ ầ y dù và l ư ợ n g oxy đ ược c u n g c á p l i ê n tục. c h ú n g có t h ố
t ă n g s i n h k h ố i s a u 12 giờ g ấ p 17 t r i ệ u l ầ n so vứi s i n h k h u i b a n đ ấ u.
310 CHƯƠNG 8

Trong số 20 loài hiện đã được nghiên cứu kỹ, cho thấy khả năng có thể
á p d ụ n g v à o t h ự c t ế s ả n x u ấ t , c á c g i ố n g vi k h u ẩ n s a u đ â y được x e m n h ư có
n h i ề u ưu đ i ể m h ơ n cả.
a) Acetibacter aceti: Vi khuẩn này có hình dạng giống như vi khuẩn
h ì n h q u e k h á c , n h ư n g k í c h t h ư ớ c r ấ t n g ắ n . C h ú n g k h ô n g t h ế t ạ o được bà o
t ử v à các t ế b à o t h ư ờ n g t ạ o t h à n h h ì n h c h u ỗ i có k í c h t h ư ớ c r ấ t d à i . K h i
n h u ộ m i ot t ế b à o c h u y ể n t h à n h m à u v à n g . C h ú n g c h ị u đ ư ợ c n ồ n g đ ộ rượu
1 1% V v à t r o n g đ i ề u k i ệ n m ô i t r ư ờ n g t h u ậ n lợi, c h ú n g có k h ả n ă n g t ạ o r a
được 6c/c axit axctic. N hiệt, độ thích hợp n h ất đê acetobacter phát triển ỉà
34° c
b) Acetobacter pasteurianum: Hình thái acctobacter pasteurỉanum
giông acetobactcr ciceti, nhưng khi ta Iihuộm chúng với iot, tế bào sẽ cho
màu xanh.

Khả năng chịu nồng độ cồn của chúng thấp hơn của acctobactcr accti.
T r o n g đ i ề u k i ệ n m ô i t r ư ờ n g p h á t t r i ể n t h u ậ n lợi, c h ú n g có k h á n ă n g t ạ o
được 5 - 6c/f axit axetic.
c) Acctobacter orỉcancusc: Hinff thái vi khuẩn này giống hai vi khuân
t r ê n , n h ư n g l ại có k í c h t h ư ớ c n h ỏ h ơ n n h i ề u . Đ ặ c b i ệ t h a i đ ầ u c ú a t ế b ào
thường nhỏ lại. Nhiều trường hợp người ta lẫn lộn vi khuân này với vi
k h u ẩ n kỵ khí Clostridium . T r o n g dịch nước cây, ch ú n g th ư ờ n g tạo ra một
v á n g r â t m ỏ n g t r ê n bề m ậ t . V á n g vi k h u ẩ n t h ư ờ n g r ấ t c h ắ c ; k h i n h u ộ m với
iot, t ế b à o s ẽ c h u y ế n s a n g m à u v à n g . Vi k h u ẩ n n à y c h ị u đ ự n g được l ư ợn g
c ồ n đ ế n 1 2 % v , v à t r o n g đ i ề u k i ệ n l ê n m e n t h í c h h ợ p , c h ú n g có t h ê t ạ o r a
đ ư ợc 9 , 5 % a x i t a x e t i c .

d) Acetobacter xylinum: Vi khuẩn này khi phát triển trong môi trường
thuận lợi có thể tạo ra 4,5% axit axetic và tạo ra một màng rấ t dày trên bề
m ặt môi trường.
Ở nhiều nước như Trung Quốc, Triều Tiên và N hật Bản, người ta
thường sử dụng vi khuẩn này cùng với nấm men đế sản xuất ra loại nước
uống rấ t đặc biệt.
e) Acetobacter Schiitzenbachii: Vi khuẩn này thuộc vi khuẩn hình que,
n h ư n g k íc h thước của c h ú n g dài h ơ n các g iông đ ã t r ì n h b à y ở tr ê n . C h ú n g
không tạo bào tử, không có khả năng chuyển động và thuộc vi khuẩn gram

Khi phát triển ở môi trường lỏng, chúng tạo ra lớp màng dày nhưng
không chắc.' ơ các nước trên th ế giới, người ta thường sử dụng chúng để
CÓNG NGHỆ SAN XUẢ 7 AXIT HỦU c ơ 311

san xuất đ â m th eo phương p h á p chìm.

T r o n g (iit ‘ 11 k i ệ n mò i t r ư ờ n g t h u ậ n ỉợi, c h ú n g co k h á n ă n g t ạ o được 11 -
12 (f a xi t a x ot ic .
/) Acctobuctưr curvuìn
Vồ cơ b á n vi kluKin 11 ãV g i ố n g A c e t o b a c t e r s c h i i t z e u b a c h i i
T r o n g m ỏ i trườiiỊí lẽn m o n t h u ậ n lợi, vi k h u â n n à v có t h ê t ạ o ra (tược*
10 - l l r ; a xi t Mxetic. Vi k h u â n A c e t o b a c t e r ciirvuni t ạ o v á n g r ấ t c h ắ c t r ê n
bè m ậ t m ò i t r ư ờ n g . Xliit'1 (lộ lon m e n tỏi ưu c ù a vi k h u â n n à y là 3 5 - 3 7 ° c .

g) Acctohactcr sulh' Yvcỉans

Vi k h u â n Ac ot oba ct iT s u b o x vc l an s được sử d ụ n g I ihiều t r o n g c ô n g 11 tỊÌiộ
s á n x u ấ t v i t a m i n c. ( ‘luíniỊ có k h ả n a n g c h ị u d ự n g được n ồ n g độ cổII n í t
cao. N ê u t r o n <4 mói tníYíng. t a c ho t h è m mộ t lư ợn g n h ó các c h ấ t đ i n h (l ường
CỈUÌ t h i ế t , ví (lụ n h ư ííỉtirusr*. vi k h u â n n à y có t h ố c h u y ế n h ó a h o à n t o a n c ỏn
t h à n h a x i t a x e ti c . Lươni; íixit axet.ic t ạ o dược t ừ q u á t r ì n h ' l ê n m u u có t h ò
l ê n (lèn 1 3 f r .
N h i ệ t (lộ t hit’ll h o p I*h<) vi k h u a 11 n à y tiôii h à n h 1Ỏ11 1 1 1 0 1 1 l a 2 8- - ;H )' C .
Thời g i a n lỏn I1HM1 xay ni rất n h a n h , chi c ắ n 4 8 giờ, lơựng a xi t a xe ti c co
t h ố đ ạ t đ ược đ ó n \[V(.
T r o n g q u á t r i n h lòn m e n c nn p h á i t h ô n g k i n l i ê n t ục vi vi k h u à n Iìi\y
cán lượng OXV rất nhiỏu cho quá tr ì n h chuyên hóa cồn t h à n h axit axetic và
c ho q u á t r ì n h p h á t t r i ò n .
C á c p h ư ơ n g p h á p l ên m en
a) Bàn chất sinh hòn nia íờìì men a.xit axetic
L ê n m o n íixit a x e t i c là q u á t r ì n h oxy h ó a c ồn t h à n h a x i t a x e t i c , n h ờ vi
k h u á n a x e t i c , trong, đi ỏu k i ệ n h i è u k h í .
Phương trình tốiiií quát cua quá trình lên men là
C 2H r>O H + G 2 - klu1^ C H 3C 0 0 H + H 20 + 1 1 7 k c a l

P h a n ứ n g n à y x á v r a t r o n g t ế b à o c ủ a vi k h u á n . M u ô n p h á n ứ n g dược
xáy ra C,H.-OH và Q., pliải được thẩm tkấu vào trong tế bào. Khi đó các
enzyni oxy h ó a có t r o n g tê b ào củ a vi k h u ấ n t h a i n gia oxy h ó a rượu tạ o
thành CH;iCOOH. CHịCOOH được tạo thành sẻ thoát ra khôi tè bào và
t a n t r o n g d u n g d ị c h môi t r ư ờ n g .
 CHƯƠNG 8

ỉíìtìh 8.1a: Qud trình oxy hóa rượu thành ơxit (Ỉxcỉic
TroiiỊí tỏ h à o c u a vi k h u â n , q u á t r ì n h oxy h ó a x à y r a r à t p h ứ c t ạ p . Quá
t r ì n h n a y xnv r a q u a bíi giai đ oạ n. Các giai đ o ạ n đó dược t o m t at n h ư sau:
c , H ^ 0 H + 0 , - > C H ; J C H 0 + H 20

Acetaldehyd
CHoCl 1 0 + H . , 0 -> C ỉ l Ặ l h O ĩ ỉ ụ

H ydrate acetnldehvci
Cí 1,011(011)., + 0., - Cỉ Ị . C O O I I t i U )

Phương (rìn h lò ng quát:

(.ui-O H + o., -> c n ;ỉc:o o ii + H .í)
N^oìii klìíi n.-iiìỊí oxv hỏn cồn t ì in nh axit axe ti c. CMC vi kluiíin nxet ic còn
co k h a nans ' t h a m gia c h u y ê n h ó a một loạt cãc loui n íũu kh;tc Hiiinh c;íc
axit iươn,^ ứn<í và cãe c h ấ t khác .
c' Ỉ11 1 \ í ‘11 lì o; I rượu p r o p y l i c — iixit p r o p i o n i c
C h u v ô n h o n hutỉiiỉol —> a x i t luitylic
C h u y ê n Ĩ1 1 >n g l y x e r i u —> ( l i ox y ox e to n
C h u y ê n hóii s ob ic —> s o r b o s o
Chuyôn hóa arnbino axit a ra b a n ic
C h u y ê n hóa glucose a x i t glurostMÚc’
: Chuyên hóa axit lactic axit glucosonic
Diều ỉlì' lì lưu V là, trong môi trường lón m<Mi krt rượu. vi khniu axetic
sẽ tham Ịíia quá trình oxy hóa axil nxotic thành n>., và ỉ LO (Ít' nhận
nan" lượng dùng cho quá trình sinh trưong va phát \ní'i\ cu.ị nmi!)
CH ịCOOH +20., — CO.. ..211,0
C h i n h vì t h ê , s a u k h i l è n m o n . b ao giò’ niỊƯỜi t;i cuni í ill* lại mọt lượnịí
c ỏ n k h o á n g 0. 3 - 0 , 5 r r (lê vi k h u à n có t h è s ư (hull' roi) m à k huii í í SIÍ (lụng
axi t a x o t i c n h ư m ộ t n g u ồ n n ã n g lượng.
 CÔNG NGHỆ SẢN XUA T AXIT H ữu c ơ

bi Các phươiìiị phu Ị) (ừtì men

B àn c h ã t qu á t r i n h lèn m e n là lên I1UM1 hiôu k hí . VI t hô p h á i t ạ o đieu
kiẹn tôi (la (lô vi k h u â n xúc được vứi oxv và rỏu.
Đố giíii cjuycvt tỏt v ậ n (iổ này. người t a đ;t (lua ra 1 p h ương p h á p khi ít'
nhiiu:
- P h ư ơ n g p h á p lèn m en c h ậ m
- Phươi ìíỊ Ị)h;íp lòn m e n n h a n h
- ĩ ’h ư ơ n g p h a Ị) lẽn m e n c hì m
- PhươM^ pháp kèt hợj)
P h ư ơ n g p h á p l ên mon c h ạ m
P h ư ơ n g p h í i p tiàv (lược niíơì/i Ph í ip í hực h i ệ n t ừ n i t l â u va được coi n h ư
là ph ư ơn g p h á p truyiMi ihôn<í cua n^uVíi ỈMiMỊ) P hươn g p h á p a à y được thực
hi (>11 lì h ư s au:
X^ười t a (lóiiíí các í hùní ; lõu 1111*11 Itimií I'M cộ (lung tích k h o á n g ‘2 5 0 -
•>00 lit l ù m " gò sổi h ì n h t.’imj t r ù n u 'L;iuiii4 (’;!(' ‘ lùing s à n xuât bia va rượu
v ; m » ).
X^uvòn.ỉiỌu (lùiiíí cỉi* s;in xu.it ;i\it ;i\ctK* la míó‘c nho.
Oiinn^ vi khuàn iỉXtHỈc cìinVc <ú (lun,Lĩ cho quá trình sán xuất là
A<vtol >;j et(»r o r l r . ỉ i i r i ỉ s r

\ “ u'oi í 1\ t h ư ờ n g c ho v ào i l ù m g gò ì:'ì ihv t íc h l ư ợ n g đ â m và s a u (ỉó c ho

Viio thun. " (lunsí ‘iit’h IIŨOY rị) n h o SMO c ho tí)àn bộ k h ỏ i l ư ợ ng đ ạ t 1/2 t h è
ỈICỈI t hù nt í lòn m r h í h o ạ c - -ì thí* tích thìniií lon m en )
h à n h q u a ni l) ]) \õn m e n (>■ n h i ệ t độ t h ư ờ n g . T r o n g t h ờ i g i a n l ê u
IÌHMK t r ẽ n 1M* Iì»;ií (ỈỊclỉ 1*0 mọt lớp v a n g t r á n g . Lá p v á n g n à y là vi k h u ẩ n b
ax ct i c. C^Uíi t r ì n h iiMi 11 HM1 kốt t h ú c sail vài t u ầ n , k h i h à m l ư ợ n g c ổn t r o n g
(lun^ tiịch l è n m e n cùn lại k h o a n g 0/2 - 0 , 3 r fV. H à m l ư ợ n g a x i t a x e t i c s ả n
xuĩít th(»o phươiiíỊ p h á p n à v s a u k h i l ê n m e n l à 5 - Qf/t. H à m l ư ợ n g a x e t i c
n ay rất thiíp, r á t co k h a Iiítng l)ị oxy h ó a ti ếp, l à m g i ả m độ axit. Do dó,
(lâm s a n x uà t x o n g p h á i (tược i h í i n h t r ù n g v à t i ê u t h ụ n g a y .
P h ư ơ n g p h i i p i õn ÌÌÌVÌÌ t h ậ m chi s a n x u ấ t a x i t a x e t i c d ù n g tron<í c ô n g
nghộ t h ực p h à m : ưu đ i ế m cua phương pỉiáp n à y là dề t h ực h i ệ n , s á n p h ẩ m
n m q u á t r ì n h l ê n m o n lit đ à m co h a m í ưựng a x i t a x e t i c t h ấ p , có m ù i t h ơ m
íiạc t r ư n g r ấ t t h í c h h ợ p c h o c õ n g nghi; t h ự c p h à m .
T u v n h i ê u , p h ư ơ n g p h á p n à y b ội ‘ 16 m ộ t l o ạ t n h ư ợ c đ i ế m
- T h ờ i ặ i a u l òn m o n t h ư ờ n g r á t d ài
314 CHƯƠNG 8

- H à m lượng a x i t axetic trong d u n g dịch t h ấ p

- Năng suât tháp, thiết bị nhiều
* Phương pháp lên men nhanh
P h ư ơ n g p h á p d o n g ư ời Đức t h ự c h i ệ n t h e o qui m ô c ô n g n g h i ệ p (lã kỉnic
p h ụ c được n h ữ n g n h ư ợ c đ i ế m c ù a p h ư ơ n g p h á p l è n m e n c h ậ m cứa 11 "Ười
Pháp thực hiện.
T h e o p h ư ơ n g p h á p n à y , q u á t r ì n h được t h ự c h i ệ n n h ư sau:
N g ư ờ i t a t h i ế t k ế n h ữ n g t h ù n g l è n m o n r ấ t l ớ n. h ì n h t r ụ , t h ư ờ n g cỏ
k í c h t h ư ớ c n h ư s au:
Chiều cao thùng 2,5 - 6 m
Đường kính đáy cùa thùng 1,2 - 3m.
T ỷ lệ đ ư ờ n g k í n h đ á v so với c h i ề u ca o k h o a n g 1/2 là t h í c h h ợ p nhât.
T r o n g t h ù n g đ ư ợc c h â t đ ầ y p h o i b à o h a v lõi n g ô ( bắp) . P h o i b à o h a v lõi ngô
đư ợc x e m n h ư c h ấ t m a n g , g i ữ vi s i n h v ậ t t r o n g q u á t r ì n h l ôu m o n , n h ờ đổ
m à vi s i n h v ậ t k h ô n g đi t h e o v à o s á n p h â m cuôi c ù n g. N g o à i ra, ơ đ á v thiỏt
bị, n g ư ờ i t a c h o l á p m ộ t h ệ t h ô n g p h â n p h ô i ; k h ô n g k h i đ ư a t ừ dưới lòn.
Mô i t r ư ờ n g đ ư ợ c đ ư a v à o t ừ t r ê n xuòng.- T o à n bộ t h i ỏ t bị dược t h i ế t kẽ theo
H.8.1b:
môi truớng vao khởng khí ra

Hình s .ỉb
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT H ữu c ơ 315

Quá trình vận hành thiết bị được thực hiện như sau: Đầu tiên, người ta
dùng axit axetic có nồng độ 3 - 5c/c chảy qua lứp phoi bào hav lồi bắp để vừa
có mục đích thanh trùng vừa có tác dụng axit hóa vật liệu chất mang đê vi
sinh vật giông dề thích nghi trong quá trình lẽn men. Sau đó, dùng nước vô
trùng rửa qua và nạp giông vi khuẩn axetic vào. Vi khuẩn axetic sè bám
vào phoi bào hay lõi bắp. Tiếp đó người ta cho dòng môi trường từ trẽn
xuống qua hệ thông phân phối như một vòi hoa sen trong buồng tắm. Môi
trường sẽ được phân phôi đều khắp vật liộu phoi bào hay lỏi bắp. Cùng lúc,
người ta thổi khí từ dưới lên. Môi trường dùng trong lên men thường có
thành phần như sau:
Rượu khan 100 lít
Glucose 500g
Supephotphat 5g
Sulfatamon 25g
Carbonate kali 0,9*
: môi trường sau:
Rượu khan 100 lít
Glucose 700g
Diphotphat amon 125g
Diphotphat kali 50g
Sulphatmagie 20 g
Môi trường được đưa từ trẽn xuống, chay qua lớp chất mang có chứa
các tế bào vi khuẩn, cồn sẽ thẩm thâu vào tế bào vi khưẩn, không khí được
đưa từ dưới đáy thiết bị lên trên, thẩm thấu vào trong tế bào vi khuân. Vi
khuẩn tiến hành quá trình oxy hóa rượu thành CHgCOOH sẽ thẩm thấu
qua màng tế bào ra ngoài và theo dung dịch xuống đáy th iết bị lên men.
Người ta thu nhận sản phẩm từ đáy thiêt bị lên men.
Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 24- 37°c . Thời gian lên
men kéo dài 8 - 10 ngày. Trong trường hợp dịch lên men cuối cùng chứa
lưựng axit axetic thấp, người ta tiến hành tái lên men bằng cách bơm
chúng ngược lại từ trên xuông.
Phương pháp này có một sô ưu điêin sau:
- Thời gian lên men nhanh
- Thiết bị đơn giản và không cần nhiều thiết bị cho quátrìn h lên men.
- Hàm lượng axit axetic cao (thường đạt từ 10 - 11%)
 CHƯƠNG 8

Tuy nhiỏn. vì thối khí từ (lưới lên nên xáy ra quá trình làm mất
C. ,I Ir>O H h o ậ c C H ị C O O H

Một sò' p h ư ơ n g p h á p l ê n m e n n h a n h k h á c
H i ệ n n n y x uã ỉ l ì i ẹ n rất. n h i ề u p h ư o u g p h á p l ê n m e n n h a n h k h á c nhau,
t r o n g (ló u h ừ n g p h ư ơ n g p h á p SỈIU d ư ợc á p d ụ n g n í t r ộ n g r ã i :
+ Phương pháp nhún": Người ta thiòt kỏ thùng lẻn men hình trụ, bên
tron"- lắp nhieu ịịk) chứa dáy clìât niani* <mạl cưa, lỏi bấp, than cúi hay các
v ậ t l i ệ u c e l l u l o s e có k h a n à n g g i ữ vi k h u â n t r ỏ u đó). C á c giỏ a n y có thề
nâng lên hoặc hạ xuỏng được.
Người la chuân bị mỏi trường và (lõ mỏi trường vào thùng lên men. Vi
sinh vật sẽ dược làm bám dính vãn các vật liộu chins' trong giỏ. Giỏ chứa
vật iiỌu co vi sinh vật sò (lược liluiiiii XUÓIISỊ đung địch lỏn men rồi lạỉ nhâc
c l u i n g lòn k h o i d u n g (lie’ll. K h i cliìôc gio c h ứ a c h ; ú m a n g có vi s i n h vật
t h á m điiy mỏi r r ư ờ n g v à (lược n h a c lòn k h ò u g kill. q u á t r ì n h oxy h ó a rượu
(lược xây ra. Thao tác này được lạp (li. lập lại nhiều lần sẽ co tác dụng oxy
hóa ỉìõt lượng cũn có t ronịỊ (ỈUIII' dịch.

Iỉỉnh 8.2: Thùng lẽn men tỉìco phiỉíĩììg pháp nhúng

Ưu (liốin của phương pháp này là dề thực hiện, thiết bị đơn gian, lẻ11
men nhanh. Nhưng phương pháp này có nhược điểm là năng suất thâp, rất
dề bị nhiềm vi sinh vật lạ.
+ Phương pháp hình trống quay: Người ta th iết kế th iết bị lỏn men có
hình trự nằm ngang nằm bèn trong một thùng chứa dung dịch lên men hở
náp. Thiết, bị hình trụ này đưựe bọc một lớp vật liệu có khả năng thâm
nước và có khá năng giữ vi sinh vật. Một nửa th iết bị này nằm trong lòng
(lung dịch lẽn men, một nửa nằm trên dung địch lên men và dược tiếp xúc
vói không kỉií. Khi vận hành, một nửa thiết bị luôn luôn được tiếp xúc vdi
không khí. Người ta thiêt kè hệ thòng quay này với vận tốc rất chậm đề đữ
thời gian cho quá trình oxy hóa cồn thành axit axetic.
CÕNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT HỮU c ơ 317

Phương pl íp này có ưu điểm là đơn giản, dỗ vận hành, nhưng nhược

điếm lớn nhất là thời gian lên men thường kéo dài và hiệu suất oxy hóa
không cao.
• Phương pháp lỏn men chìm.
Người ta thiết kê hệ thông lên men axetic được gọi là acetator. Người
ta cho dung (lịch lòn men vào thiết bị và tiến hành thổi khí rấ t mạnh. Khi
đó trong dung dịch lên men sè tạo ra thê huyền phù và dung dịch lên men.
Hai thể này luôn luôn được trộn lẫn nhau và như vậy, quá trình oxy hóa
xảy ra rất mãnh liệt. Phương pháp này có líu điểm là hiệu suất chuyển hóa
có khi đạt được 98 - 99%.

Hình 8.4: Thiết bị lẽn men với hệ thống cung cấp khí mạnh
318 CHƯƠNG 8

Phương pháp kết hợp.

Người ta thiết kế hệ thống iên men bao gồm hai phần: phần tiên là
lớp đệm hay lớp chất mang chứa vi sinh vật (giống phương pháp nhanh),
lớp giữa chi ỉà một thùng chứa dung dịch sau khi lên men ở phần trên chảy
xuống. Dưới cùng là hệ thòng thôi khí mạnh; khí sè được thổi qua phần
dung dịch này rồi chuyên ngược lên phẩn trên (giống th iết bị lên men
chìm).
khòng khí ra

Phương pháp kẻt hợp có rất nhiều ưu điềm, trong đó ưu điểm lớn nhât
là hiệu suàt ìên men rất cao, nồng độ axit axetic thu nhận được thường
nằm trong khoang 10 - 12 c/c.
8 .1 .3 P h ư ơ n g p h á p n â n g c a o n ồ n g đ ộ a x it a x e t ic t r o n g d ịc h l ê n m e n
Sau khi lén men, hàm lượng axit axetic có trong dịch lên men thường
không cao. Hàm lượng này nằm trong khoảng 5 - 10 % Axit axetic có trong
dịch len men thường lẩn với các chất khác, do đó, dịch sau lên men chỉ có
thỏ’ s ử dụng đè’ chế biến thực phẩm. Trong nhiều ngành cần sử dụng axit
axetic, người ta yêu cắu hàm lượng axit axet.ic trong dưng dịch phải cao và
có độ tinh khiết. Chính vì thế việc nâng cao hàm lượng axit axetic trong
dung dịch lẽn men và làm sạch axit axetic là việc làm rất cần thiết.
Trong thực tế sán xuất axit axetic, người ta thường sử dụng những
CÔNG NGHỆ SÀN XUẤT AXIT HỮU c ơ 319

phương pháp sau để nâng cao hàm lượng và tinh chế axit axetic.
1- Phư ơng p h á p chưng cất

Người ta sử dụng phương pháp chưng cất thông thường đế nhận axit
axetic có hàm lượng cao hơn. Phương pháp này rát đơn giản và dề thực
hiện. Tuy nhiên, phương pháp này thường tiêu hao nhiều năng lượng và
hàm ỉượng axit axetic thường khòng cao.
2- Phương pháp chưng cất bằng muối
Người ta sử dụng một cấu tử có khả năng phàn ly mạnh làm thay đổi
t r ạ n g t h á i c â n b ằ n g l ỏ n g - hơi. T r o n g c h ư n g c â t có s ự t h a m g i a c ử a m uô i
CaCl2 hoặc CHyCOONa , hiệu suât thu nhận axit axetic thường rát cao.
Phương pháp này có ưu điểm:
- Tôn ít năng lượng
- Sản phẩm đạt độ tinh khiết cao
Tuy nhiên, phương pháp này cùng có những nhược điểm:
- Phái hoàn nguyên cấu tử phân ly nên tốn thiết bị và năng lượng cho
quá trình này.
- Gây ăn mòn thiêt bị
3- Phương pháp chưng cất - trích ly
Phương pháp này được thực hiện trèn cơ sở những câu tử phân ly có độ
bay hơi nho hơn cấu tử đã có trong hỗn hợp. Câu tử phân iy này sẻ kết hợp
với một cấu tử có trong dung dịch tạo ra một hỗn hợp khó bay hơi và thoát
ra ỡ dưới đáy tháp chưng cất.
Cấu tử phân ly cần có tính chất hòa tan chọn lọc và không được hòa
tan cấu tử cần tách. Đặc điểm của phương pháp này như sau:
- Sử dụng một cấu tử trung gian để làm thay đổi dộ bay hơi tương dối
của các cấu tử trong hồn hợp.
- Người ta thường thu hồi cấu tử phân ly để sử dụng lại.
- Các cấu tử phân ly có tính chọn lọc cao, nên trong quá trìn h chưng
cât cần chọn đúng chất phân ly.
4- Phương ph áp chưng cất chăn không
Phương pháp này rấ t phức tạp. Tuy nhiên, phương pháp này có ưu
điểm là thu nhận được sản phẩm có chát lượng cao.
320 CHƯƠNG 8

7.1.4 Một sô' ứng dụng quan trọng của axit axetic
Axit axetìc là một loại axit hữu cơ được ứng dụng rộng răi trong đời
sống và trong sán xuất công nghiệp. Nhừng ứng dụng quan trọng nhất của
axít axetic bao gồm:
1- ứng dụng trong chế biến mù cao su
Trong sản xuất mú cao su, người ta rất sợ hiện tượng đòng đặc cùa mủ
trước khi đưa đi chê biến. Đế chống đông inủ cao su, người ta thường dùng
NH 3 3%. Lượng NH 3 được sử dụng tùy theo loại mủ đem sơ chế.
* Mủ đổ xông khói, người ta sử dụng lượng NHg là 0,6 - lg/ỉ mủ
* Mủ đánh đông không pha loãng, người ta thường sử dụng lượng
NH 3 là 0,3 - 0,6g/l.
Khi đổ mủ vào xô hoặc thùng chứa, người ta thường dùng N1I;< đê
chông đông. Theo đó, mủ được pha loãng với nước đẽn độ cao su thồ (DRC)
khoảng 14%, pH = 4,7. Tuy nhiên, tùy theo hệ thống máy cán,người ta có
th ể thay đổi pH hoặc độ cao su thô cho thích hợp. Ví dụ:
* DRC từ 25 - 30% để chế biến cao su tờ xông hơi (IRC)
* DRC khoảng 25%, pH = 5 - 5,2 đề chế biến cao su SVR
Sau khi pha loãng và khuấy trộn mủ với NH 3 , người ta cho thêm vào
dung dịch axit axetic 2,59c với lượng là 3,5 - lOkg/tấn dung dịch mủ cao su;
khi cho axit vào người ta khuấy liên tục.
Nhu cầu về axit axetic trong chế biến mủ cao su là hết sức lớn. Hiện
nay, nướC'ta vẫn phải nhập axit axetic từ bẻn ngoài.
2- ứng dụng axit axetic trong công nghệ thực phẩm
V ớ i h à m lư ợ n g a x it a x e tic từ 5 - 10%, ng ư ời ta gọ i d u n g d ịc h n à y là
dầu ăn. Dầu ăn được sử dụng trong công nghệ thực phẩm để chế biến đồ
hộp rau, quả, gia vi trong các bữa ăn gia đình* Lượng dầu ăn được sử dụng
trong công nghệ thực phẩm rấ t lớn, do đó, việc sản xuất dầu ăn không chỉ
mang tính chất thủ công mà đã trở thành một ngành sản xuất theo qui mô
công nghiệp ở nhiều nước trên th ế giới.
3- ứng dụng trong công nghiệp khác
Axit axetic còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp
như công nghiệp sản xuất chất màu, dung môi hừu cơ, tổng hợp chất dẻo tơ
sợi. Những ngành sản xuất này đòi hỏi lượng axit axetic nhiều và có chất
lư ợ n g c a o h ơ n d u n g d ịc h a x it a x e tic d ù n g t r o n g c ô n g n g h ệ th ự c p h ẩ m v à
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT HỮU c ơ 321

trong công nghệ chế biến mủ cao su.

7 .1 .5 M ộ t s ố n g u y ê n n h â n là m g iả m c h ấ t lư ợ n g l ê n m e n a x i t a x e t ỉc
Quá trình lên men axit axetic là một quá trình rấ t nhạy cảm với các
yếu tố hóa học, lý học và nhất là các yếu tô sinh học.
1- Dấm bị dục và giảm độ chua
Trong sản xuất dấm, thường xảy ra hai quá trình oxy hóa:
* Quá trìn h oxy hóa C9H5OH thành CHgCOOH
* Quá trìn h oxy hóa CH3COOH thành C 0 2 và H20
Quá trình oxy hóa C9H 5OH thành CH3COOH là quá trình có lợi cho
sản xuất* Quá trình oxy hóa CH3COOH thành C 0 2 và H20 là quá trìnta
có hại cho sản xuất. Trong quá trình oxy hóa này có thế xảy ra hai hưđhg:
oxy hóa hóa học và oxy hóa sinh học. Oxy hóa sinh học chuyển CH 3COOH
thành C 0 2 và H20 xảy ra do nấm men Comdida mycoderma, Acetobacter
xylinum, Acetobacter aceti gây ra. Các giông vi sinh vật này có khả năng
tạo màng nhầy làm cho dấm đục và tạo cặn.
Người ta khắc phục tình trạng này bằng cách cho lên men lại và trước
khi lẻn men phải vệ sinh thiết bị lên men th ật sạch hoặc thanh trùng
Pasteur ở nhiệt độ 60 - 70°c, hoặc cho thêm vào dấm K 2S 20 5 với liều
lượng 5 - 15gam/100 lít dấm kết hợp với thanh trùng Pasteur đê tăng độ
bền cúa rìâni.
2 « Hiện tượng lươn đấm
Lươn dâ'm có tên khoa học là Angiullula aceti. Chúng thuộc loại động
vật như giun tròn, rấ t nhỏ, có màu hồng. Con đực ở tuổi trưởng thành có
kích thước lmm, con cái ở tuổi trưởng thành có kích thước 1 - 2 mm.
Nếu nồng độ dấm < 6 %, lươn dấm rấ t dề phát triển. Nồng độ dấm cao
khoảng > 9 %, chúng bị ức chế và không thể phát triển được.
Lươn dấm thường sử dụng vi khuẩn axetic như nguồn dinh dưỡng. Tuy
nhiên, chúng cũng có khả năng sử dụng C2H5O H , CH3COOH, đường, các
chất hữu cơ chứa nitơ để phát triển. Chúng thường không gây độc cho người
mà chỉ gây đục dấm và làm giảm hiệu suất lên men.
Để phòng ngừa lươn dấm phát triển, người ta thường cho vào dấm
thành phẩm X - 2% NaCl (muối ăn). Sau 1 - 2 ngày lươn dấm chết, người ;a
đem lọc hoặc đưa nhiệt độ lên đến 40 - 50°c , sau đó lọc dấm để loại bỏ
lươn dâm.
322 CHƯƠNG 8

3- Bọ dấm
Trong sản xuất dấm, người ta thường thấy hai loại bọ dấm.
Loại to, màu trắng, có kích thước 0,8 - l,5mm
Loại nhỏ, màu nâu, có kích thước 0,3 - 0,4mm.
Người ta thường dùng dầu khoáng bôi vào những nơi hay có bọ dâm.
Trong trường hợp có nhiều bọ dấm ở thiết bị lên men, người ta phải dùng
hơi .nóng để tiêu diệt chúng.
4- Ruồi dấm: ở những cơ sở sản xuất dấm, ngườita thường thấy có rất
nhiều ruồi dấm. Ruồi dấm thường có màu nâu đỏ, có kích thước khoảng 2,5
- 3mm. Ruồi dấm thường phát triển ở phần trên, phần dưới cửa th iế t bị lên
men. Chúng làm giảm axit axetic, sinh ra những â'u trùng ăn vi khuẩn
lactic và thường là vật trung gian lây nhiềm các vi sinh vật gây hại dấm.
Do đó cần phải hạn chế sự xuất hiện ruồi dấm bằng cách che kín cửa, đậy*
kín các phần hở của th iế t bị lên men và vệ sinh đâ't khu sản xuất.

8.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT LACTIC

8.2.1 A x ỉt l a c t i c
Công thức hóa học của axit lactic là CH 3CHOHCOOH. Khối lượng
phân tử của axit lactic là 98,08, nhiệt độ sôi là 122°c , điểm tan 17°c . Axit
lactic là chất hữu cơ không màu, mùi nhẹ, tan trong nước và trong cồn.
Axit lactic còn có tên gọi khác là 1- hydroxỹềthanoi cacboxylic hay axit. 2-
hydroxypropanoic. Trong cấu tạo phân tử của chúng có một cacbon bất đối xứng
nên chúng có h ai đồng p h ân quang học: D -axit lactic và L-axit lactic. H ai đồng
phân quang học này có tính chất hóa lý giống phau, chỉ KHác nhảu khả năng
làm quay m ặt phẳn g p h ân cực ánh sán g, m ột sa n g phải và m ột sa n g trái. Do
đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau.

COOH

H -C -O H - HO - c - H

CH3 ch3

L- axit lactic D- axit lactic

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT HỮU c ơ 323

Loại L- axit lactic ở dạng tinh thề. Chúng có khá nàng tan trong nước,
tan trong cồn etylic, tan trong eter, không tan trong CHCI3 . Nhiệt độ nóng
chảy 28° c , góc quay cực ở 15° c ỉà 2.67°
Loại D-axit lactic là dạng tinh thể, tan trong nước, tail trong cồn.
N hiệt độ nóng cháy là 28°c , nhiệt độ sôi 103°c , góc quay cực ớ 15°c là
-2.26°.
Nêu D-axit lactic và L- axit lactic có trong một hỗa hợp theo tỷ lệ
50/50 người ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Hỗn hợp này được ký hiệu là DI
axit lactic. Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỷ lệ
lý tướng này mà chỉ có được hỗn hợp này khi tiến hành tống hợp hữu cơ.
DL-axit lactic là dịch lỏng dạng sino, có khả năng tan trong nước, trong
cồn, không tan trong CHCI3 nhiệt nóng chảy của chúng là 16.8 ° c , nhiệt
độ sôi là 122 ° c .
8.2 .2 V i s i n h v ậ t th a m g ia lê n m e n l a c t ic
Đặc điềm chung của vi khuẩn lactic như sau:
* Vi khuẩn lactic thuộc họ lactobaciỉliaccac
* Vi khuẩn iactic thuộc vi khuẩn gram (+ )
* Vi khuẩn lactic không di động
* Vi khuẩn lactic không tạo bào tử (tuy nhiên, hiện nay người ta tìm
thây một sô' giống trong họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử).
* Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tùy tiện
* Vi khuẩn lactic không chứa cytochrom và enzyin catalase
* Vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzym peroxydase râ't
mạnh. Chúng phân giải H 20 2 để tạo ra H 20 và oxy để phát triển.
/* Theo khóa phân loai của Bengay, ho Lactobacteriaceac chia ra làm hai ho
' Họ: Streptococcae
Họ: Lactobacileae
Họ Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc. Họ
Lactobacileae chỉ có một loài là Lactobacillus.
Vi khuẩn lactic cỏ nhiều trong thiên nhiên. Chúng tồn tại nhiều ở cỏ,
n h ất là cỏ khô. Chúng tồn tại trong cơ thể người và động vật. ở người và
động vật, chúng có trong đường ruột, trong miệng. Ở đường ruột có nhiều vi
khuẩn lactic thuộc pifidobacteria, Enterococcus và Lactobacillus, trong đó vi
khuẩn Lactobacillus chiếm sô' lượng nhiều nhất.
Có một số loài trong họ vi khuẩn lactic như Streptococcus có khả năng
324 CHƯƠNG 8

gây bệnh.
Khi nghiên cứu về khá năng le n jn e n lactic từ các nguyên liệu chứa
đường, người ta thấy có hai nhóm vi khuẩn lactic chuyến hóa đường hoàn
toàn khác nhau:
* Vi khuẩn lactic dị hình
* Vi khuân lactic đồng hình
1- Vi khuẩn lactic dị hình
Khi tiến hành lên men các dung dịch đường, các vi khuẩn lactic dị
hình thường tạo ra lượng axit lactic không lớn lắm. Ngoài axit lactic, chúng
còn tạo ra hàng loạt các sán phẩm khác như axit axetic, axit propionic,
ethanol C 0 9 .
Một sô giỏng vi khuẩn lactic dị hình được nghiên cứu kỹ như sau:
a) Lactobacillus past cur ianus
Đặc điẻm chung cũa vi khuẩn này như sau:
* Thuộc loại trực chuẩn, gram (+ )
* Kích thước: rộng 0,5 - l|im dài 7,0 - 35,um.
* Trong thièn nhiên chúng tồn tại riêng lê. khòng di động.
Có khá năng lõn men được arabinose. glucose, fructose, galactose
maltose, saccharose, rafinose, trehalose, mannitol, dextrin.
* Trong quá trình lên men tạo ra một loạt sán phấiĩi như COọ,
alcohol, axit lactic, axit axetic, axit formic.
* Nhiệt độ thịch hợp là 29 - 33°c
* pH thích hợp 8,0
h) Lactobacillus brevis
Đặc điểm chung của vi khuấn này như sau:
: Thuộc loại trực khuẩn gram (+)
* Kích thước rộng 0,7 - l , 0 nm, dài 2,0 - 4,0|im
* Trong thiên nhiên chúng liên kết với nhau thành chuỗi, không di
động.
* Trong quá trình phát triển, chủng có thể sử dụng lactat canxi như
nguồn cung câp cacbon
* Chúng có khả năng lên men các loại đường như arbinose, xylose,
gìucoso, fructose, galoctose, maltose.
* N hiệt độ phát triển tôì đa là 30°c
CÔNG NGHỆ SẢN XUÃT AXIT HỮU c ơ

* Vi khuẩn này có nhiều trong sữa, trong keíìa, trong dưa chua.
c) Lactobacillus lycopessici
Đặc điềm chung của vi khuẩn này như sau:
: Thuộc ỉoại trực khuấn, gram (+ )
• Trong thiên nhiên, chúng tồn tại từng đôi một
: Chúng có khả năng tạo bào tứ.
Trong quá trình lẻn men đường, chúng lạo lii cồn, nxii lactic, axit
axetic và C 0 9
d) Streptococcus cumorÌH
Đặc điốm chung cua vi khuẩn này như sau:
; T h u ộ c Joài cắ u k h u â n , t r o n g t h i ê n n h i ê n c h ú n g t ồ n t ạ i t h à n h từììíĩ
c h uố i r ã t đ à i .
Thuộc gram (+ )
Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triến là 30"c
Chúng không phát triển được ở nồng độ NaOl ¥ '
Khi lẽn 1110II đường tạo ra axit axetic, diacetyl. CO.J
Chúng có k)m năng tạo ra nhừng chât kháng klìiiàn.
C) Sírcptoỉucỉtras lactic
Dặc (iiếiiì chung cua vi khuân này như sau:
Thuộc chuồi rầu khuân, gram í + i.
Nhiột (lộ pliát ĩriên từ 10 - 4 5 'c
( ’ỏ kha n;mg chịu được nồng độ NaOl Ví
Khi lên men đường glucose, maltose, líictose, xylose, anibinose,
s n c c h a r o s e . t r e h a l o s e , n i o n n i t o l , s a l i c i n . t ạ o r a axit l ac ti c, C()_» a xi t ax«»tic\

diacetyl
Chung khỏng cỏ kha náng lên men đưựt* raffinose. insulin. glycerol,
sorbitol
f) Streptococcus fedcalls
Chúng tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, gram ( + )
Nhiệt độ sinh trướng 10 - 45°c
Có khá năng chịu được nồng độ NaCl 5c'r
Có khả năng lẻn men đường glucose, maltose, lactose, trehak>se và
Siiirin; m a n r i t o l . rorbit ol .
Tất cá các vi khuán lactic dị hình thường thiếu hai loại enzym quan trọng:
326 CHƯƠNG 8

- Enzym aldolase
- Enzym triosophophatizomerase.
Do đó trolly giai đoạn đầu của quá trình lên men, chúng thường được
tiến hành theo con đường pentose - photphat. Quá trình chuyển hóa được
trìn h bày như sau:
Glucose

ATP

— ADP

Glucose - 6 - photphat
NAD'
C NAD~H2

6 - phosphogluconic axìt
NAO‘
C N A D -H 2

Ribose - 5 - photphat

Xylulose - 5 - photphat

I
Piriiì/at Acetaldehyde
Ị
1
Axit lactic Etanot
I
2-Vi kfiuan lactic đồn% hình
Vi khuẩn lactic đồng hình là những vi khuẩn trong tế bào của chúng có
chứa enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase. Khi tiến hành lên
men các loại đường chúng tạo ra chủ yếu là axit lactic.
Một số giông vi khuẩn lactic điển hình được nghiên cứu kỷ như sau:
a) Lactobacillus axitophilus
Đặc điểm chung của vi khuân này được tóm tắ t như sau:
- Chúng thuộc trực khuẩn, có kích thước: rộng 0,6 - 0 ,9 nm, dài
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT Hữu c ơ 327

1,5 - 6 ,0 n m .
* Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ. Đôi khi chúng tạo th àn h
những chuỗi ngắn. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram (+) và có khả năng
chuyển động.
* Chúng có khả năng lên men một loạt đường như glucose, fructose,
galactose, mannose, maltose, lactose, saccharose để tạo ra axit lactic.
* Chúng hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, arabinose,
rahamnose, glycerol, mannitol, sorbitol, đulcitol, inositol
* Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả hai dạng đồng phân quang
học của axit lactic.
* N hiệt độ phát triển tỏì ưu là 45° c - 50°c .
b) Lactobacillus bulgaricus xí
* Thuộc loài trực khuẩn có kích thước rấ t dài, liên kết vói nhau tạo
thành chuồi, gram (+)
* Chúng khỏng có khả năng di chuyển
* Có khả năng lên men được các loại đường glucose, lactose, galactose
* Không lên men được xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol,
dextrin, inulin
* Chúng không có khả năng tạo ra in itrit từ nitrate
* N hiệt độ phát triển 45-50°C
c) Lactobacillus bifdus
* Trực khuẩn rấ t nhỏ, kích thước trung bình khoảng 4nm.
* Không có khả năng đi động, thuộc gram (+)
* N hiệt độ phát triển tốt n h ất của vi khuẩn này là 37°c
* Chúng có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose,
galactose, saccharose, inulin, dextrin
d) Lactobacillus casei
* Trực khuẩn nhỏ, có kích thước rấ t ngắn. Chúng có th ể tạo thành
chuồi, không chuyển động, gram (+)
* Chúng có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose,
mannose, galactose, maltose, lactose, salicin.
* Trong quá trình lên men chúng tạo ra D-axit lactic
* N hiệt độ phát triển tôi ưu là 38-40°C
328 CHƯƠNG 8

e) Lactobacillus causaciccus
* Trực khuẩn ngắn, không có khả năng chuyển động, gram (+)
* Chúng có khả năng lên ĩnen các loại đường glucose, fructose,
mannose, galactose, maltose, lactose, mannitol.
* N hiệt độ phát triển tối ưu 48 - 50 c .
f) Lactobacillus delbruckii
* Trực khuẩn dài, kích thước 0,5 - 0 ,8^im, 2,0 - 9,0fim, không di động,
gram (+ )
* Chúng có khả năng lên men được các loại đường glucose, maltose,
fructose, galactose và dexrin
* Chúng không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose,
lactose, raffinose, trehalose, inulin, mannital.
g) Lactobacillus lcichmannii
* Trực khuẩn gram {+). Kích thước tế bào 0,6 - 2 nm.
* Trong tự nhiên chúng có khả năng tạo thành chuồi ngắn.
* Chủng có khả năng lên men glucose, fructose, maltose, saccharose,
trohalose. ^
* Chúng không có khả năng lên men lactose, galactose, raffinose,
arabinose, rhamnose, dextrin, inulin.
: Trong quá trình lên men, chúng tạo ra L-axit lactic.
: Chúng không có khả năng tạo nitrit từ nitrate
Nhiệt độ phát triển tốì ưu là 36°c
h) Lactobacillus helvetỉccus
* Trực khuẩn có kích thước 0,7 - 0,9|jni; 2,0 - 6,0|jm.
* Trong thiên nhièn chúng có thế tồn tại riêng từng tế báo, cũng có
thê tạo thành chuỗi tế bào.
* Nhiệt độ phát triền 40 - 42° c
* Chúng có khả năng lên men được glucose, fructose, galactose,
mannose, maltose, lactose.
* Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuât sữa chua và phomai
cứng.
i) Lactobacillus thermophillus
* Trực khuẩn, gram (+). kích thước tế bào 0,5 - không có khả
năng di động.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT HỮU c ơ 329

* N hiệt độ phát triển tồi ưu là 30° c , chịu được 65 - 75° c

* Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuấtsữa chua, phomai.
j) Lactobacillus pỉantanrum
* Trực khuẩn, gram (+ ), kích thước tẽ bào 0,7 - l,0ụm; 3,0 - 8,0pm.
* N hiệt độ phát triền tối ưu là 30° c
* Có khả n ă n g chịu n ồ n g độ NaCl 5,5%.
* Vi khuẩn này được dùng nhiều trong chẽ biến sữa.
Tất cả các vi khuẩn lactic đồng hình tiến hành quá trình lên men
lactic theo cơ chế chung như sau:
Giucose

ATP
1C Ann
Glucose - 6 - photphat

I
Fructose - 6 - photphat

ATP
IC ADP

Fructose - 1 , 6 - photphat

I Aldolase

Triose - 3 - photphat

ADP
1C ATP

3 - phosphoglicerinic axit

I
2 - phosphoglicerinic axit

I
Phosphonol piruvi axit

I c "ADPp
▼
Piruvat
NAD - H2
NAD~

Axit lactic
330 CHƯƠNG 8

8.2.3 C ông n gh ệ sản xu ât axỉt lactic

H iện nay, người ta sản xuất axit lactic theo hai phương pháp:
* Phương pháp sản xuất truyền thông.
* Phương pháp sản xuâ't hiện đại.
i- Công nghệ truyền thống sản xuất axit lactic
Theo phương pháp truyền thống, công nghệ sản xuất axit lactic phải
qua ba giai đoạn chính:
* Chuẩn bị môi trường lên men.
* Điều khiển quá trìn h lên men.
* Tạo lactat canxi và thu nhận axit iactic.
a) Chuẩn bị môi trường lên men
Người ta thường sản xuất axit lactic từ nguồn m ật rỉ vì rẻ và dễ kiếm
(cả m ật rỉ từ củ cải và m ật ri từ đường mía).
Trước tiên, m ật rỉ cần phải được xử lý để tẩy màu và tách các chất keo
có trong m ật rỉ. Để xử lý màu, người ta thường dùng th an hoạt tính. Trước
tiên, m ật ri cần phải được làm loãng theo tỉ lệ 1:3, sau đó cho chảy qua cột
than hoạt tính. Than hoạt tính sẽ hâp phụ các chất màu, khi đó dung dịch
m ật ri sẽ sáng màu hơn.
Sau đó, người ta lại làm loãng m ật rỉ đến nồng độ chât khô 15% và
dùng H 2S 0 4 5% theo khối lượng dịch để axit hóa môi trường. H 2S 0 4 có ý
nghĩa rấ t quan trọng trong quá trìn h xử lý m ật rỉ: H 2S 0 4 như một chất
điều hòa pH, H 2S 0 4 như một chất phá vỡ hệ keo và H 2S 0 4 như một chất
chuyển hóa đường saccharose th àn h đường nghịch đảo giúp quá trình lên
men sau này tố t hơn. Trong giai đoạn này, người ta đun dung dịch đến 90 -
95° c tr o n g 6 giờ.
Tiếp tục người ta pha loãng dung dịch đường xuống còn 5 -1 0 % đường
và điều chỉnh pH ngược lại đên 6,3 - 6,5. Người ta làm nguội dung dịch
đường xuốhg 50° c và bơm chúng vào thùng lên men để tiến hành quá
trin h lên men.
b) Giai đoạn lên men
Vi khuẩn lactic đã được nuôi cấy riêng ở phân xưdng nhân giống. Khi
lượng giống đảm bảo về số lượng tế bào (khoảng X.106 tế bào/lml), người ta
chuyển giống vào thùng lên men với tỷ lệ giông là 2,5 - 3%. Trong sản xuất
lactic, người ta thường sử dụng các loài vi khuẩn lactic đồng hình, trong đó
vi khuẩn Lactobacillus đelbruckii được sử dụng nhiều hơn cả.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXỈT HỮU c ơ 331

Đôi với vi khuẩn này, người ta thường duy trì nhiệt độ trong suốt quá
trình lên men là 50° c , pH duy trì ở 5 - 6 , thời gian lên men 7 - 10 ngày.
Tuy nhiên, những điều kiện lên men trên có th ể thay đổi tùy theo giông vi
khuẩn lactic mà ta sử dụng trong sản xuất.
Trong quá trình lên men, người ta thường sử dụng vôi mịn để trung
hòa lượng axit đươc tạo thành nhằm trán h hiện tượng axit hóa dung dịch
lên men và tạo ra lactat canxi. Hàng ngày, người ta thường cho vôi mịn vào
3 - 4 lần một ngày. Sô" lượng CaC0 3 cho vào tùy thuộc vào lượng axit lactic
được tạo thành. Số lượng này cho vào dịch lên men đủ để trung hòa lượng
axit lactic, duy trì pH trong dịch lên men ở mức độ 5 - 6 .
Trong quá trình ỉên men, người ta tiến hành khuấy trộn liên tục môi
trường. Nhiều trường hợp, người ta tiến hành thổi khí, khi thổi khí lượng
axit lactic tạo ra cao hơn nhiều so với không thổi khí.
c) Giai đoạn tạo lactat canxi và thu nhận axit lactic
Sau khi lên men xong, dung dịch lên men được đun nóng đến 80 -
90°c . Người ta dùng CaC0 3 điều chỉnh pH củíỉ dịch lên men đến 10 - 1 1 .
Giữ yen pH này trong thời gian 3 - 5 giờ. Trong thời gian này, các chất
lắng và sinh khối vi khuẩn sẽ lắng xuống đáy. Người ta loại chất lắng này.
Sau đó dịch trong được lọc bằng máy lọc khung bản ở nhiệt độ 7 0 -8 0 °C .
Sau khi lọc xong, toàn bộ dịch lên men được chuyển qua th iết bị tạo
kết tủa iactat canxi. Quá trình tạo kết tủa lactat canxi phải m ất từ 10 - 16
giờ.
Kết thúc quá trình kết tủa, người ta cũng đem lọc bằng máy lọc khung
bàn.
Người ta để riêng kết tủa và dịch lọc. Dịch lọc được đem đi cô đặc lại
và tiến hành kết tủa lại một lần nữa để thu hồi toàn bộ lượng axit lactic có
trong dịch lên men. Phần kết tủa này được trộn chung với phần trước và
đem sang th iế t bị thu nhận axit lactic.
Để thu nhận axit lactic, người ta cho H 2S 0 4 vào phần tủa. Khi đó
phản ứng sẽ xảy ra và tạo th àn h CaS0 4 kết tủa và dung dịch chứa axit
lactic (C3H 60 3) theo phương trình sau:
Ca(C3H50 3)+H2S 0 4 ^ C a S 0 4 ị+2C 3H60 3
Dung dịch axit lactic được đem đi khử màu bằng than hoạt tính và
đem cô đặc chân không dể thu nhận axit lactic tinh khiết.
 CHUO NG8

2- Công nghệ hiện (lại sán xtiâỉ fixit lactic

XỈÌU C.'IU M\it lactic n"i\v c à n g t ấ n " , do đó n hi ồ u í'('n\g Tv s i n h học tron
ĩ h ố ưiới (ỉa co Ịíỉins' t ì m ra nhưii.^ công n g h ệ mới n h a m n â n g cao hi ệu snãt
và n á n g s uã t s;m Mi.it (inn*' thời Ịíiỉim giá t h à n h s a n p h à m . Đã xunt lì ít *a
111ột s ố cônií nỊíhộ moi S*UI xuât a xi t Inctic CÍÌC côn g n g h ệ n à v dựa vào
nlùínií t h à n h tựu cua \;jt lý hoc và h oa học.
P h ư ơ n g p h á p t h â m l í c h cliộn v à t r a o đ ổ i i o n
P h ư ơ n g p hí i p n à y khai* Vũi p h ư ơ n g p h á p t r u y ề n t h ò n s í ờ h a i nội chilli*:
T h a v (ỉòi ìíiônỊí v;i n 1 1 M tniừiiíỊ l ê n m e n .
: T h a y đòi phư<ínjí p h a p t h u n h ặ n a xi t l act ic.
(í) G i ỏ n g r u m ũ i ỉ n ỉ ơ n i ị ỉ r n ỈỈÌCIÌ

Mỏi t ní ờnsĩ it’ll mt>n ĩ J*í JIÌ Lĩ ph ư ơn g p h á p n à y bao <íổin:

Oimg (lịch ch ứ a (iưún^: 10 - 1 (H) (lường tronsf lOOOmỉ
V ’t c l a u l).íị) t h o

1 - 1' ' míóc chi<**t Uip

X g ư ừ i t n c o n ỉ ><> SUI1.U k h a I i l ì i õ u l o ạ i k h o á n " vi l ư ợ n ự v ; i o III ‘>i t n í õ n ì í
11' 11 nu*n.
I)i(>u k i ệ n 1f ‘ 1 1 nn>ỉi:
N h i ệ t (lọ l*'n !1H'I 1 10 - ”>()"(’

Di ổu c l u n h pí Ị i n n i í í siiòt qu;í t r ì n h l òn m on la - 5,7 b a n g N í i O H

( i i õ n g ( ỉ ùnn i r m i t í tịiia t r m h U*I1 IMt111 là g i ò n " Ị , a r t ohi ici ll us axiU)| )l ìi lns

Luón.n í^iỏng (‘ho V.IO (lò lt*n m en 1:1 5 ’! su vứi (lun<ĩ (lịch li*n men.
ỉ>) Phương Ị>ỈIifỊ} thu ahạu ((XI ỉ lactic
S au khi k ‘11 iỉumi . n^uời l a tiling X;iCO;j (lưa p H filing dị ch lôn nu*n (líMi
plí - f>.f) và tlníc lì ì ẹ 11 ciic đ i r u ki ện cho việc t ạ o í h à n h l a c t i t o;mxi n!ui'
pÌHíóní' pli.'ij) t n i v v n thônií-
T o h n bọ (Itniịí (lịch, ca p h á n l a c t nt và s i n h k h ố i dược chia v à o t h i o t bị
t h; uì ì t í c h U‘ỉ(H‘tr<) ( linlysi s) (lô t h u u h ậ u ỉ a c t n t Cítnxi ()■ :ỉ;m >í Innií và
s i n h k h o i vi s i n h v ậ t . S i n h k h ỏ i vi s i n h vật có k h a n ; m g ỈỎ11 mo n se (lược
I'huyon ngược lại đô ỈCMÌ 11UM1 Ìiie kè íióp. Ln ct at call Vỉ (lược cỏ (lạc* c ha n
k h ô n # và (lược c h u y ê n s a n g m;ív t h á m tích cliộn t.rirh ly ( w a t e r s p l i t t i n g
e lí T i r o . l i n l v s i s ) <Ị<> th u n h ạ n a x it l a c t ic t i n h k h i ô t D tiu g (iịch n x it ií ỉc t ic Si*
(iưực tỉ Ưa Ijua cọí t r a o đỏi ion dò t á c h c á c c a t i o n Na và c á c c a t i o n kh á c’
(cột t r a o đổi ion t h ứ n h ấ t co n h a n hi ệu A n i b e r ỉ í t e Ỉ 1M 2 0 p ku s n i a h ã n g
Rohm nnđ Hass). () cột tr;io (lối ion thứ hai (cụt nãy có n h n n hi(‘ii
CÒNG NGHỆ SẢN XUẮT AXIT HỮU c ơ 333

A m b e r l í t e I R - 9 4 c ũ n g ciia h ã n g t r ẽ n ) s ẽ t á c h các a n i o n S O 4 và n h ừ n g hợp

chất chứa nitơ.

A x i t l a c t i c s a u k h i q u a h a i c ột lọc n à y có độ t i n h k h i ế t đ ạ t 99**.

3- Phương pháp thu nhận axit lactic ở pH > pKa

Đ ầ u t i ê n , ng ười t a c ho d u n g d ị c h l ê n m e n t i ế p xúc với c h ấ t h ấ p t h ụ
a la m in 336 (tric a p ry ly la m in h ò a t a n trong m eth y l isobutylketone).
T i ế p đ ế n , c h â t h ấ p t h ụ s ẽ t i ế p xúc với a m o n i a c v à t r i a l k y ỉ a m i n p h á n
t ứ t h ấ p l à t r i i n e t h v l a n i i n ( TMA). T M A s ẻ t ạ o t h à n h t r i i n e t h y l a r n o n i u m
( T M A m ) , s a u đó T M A v à hơi nưức sẽ được t á i sử (lụng, c òn a x i t l a c t i c sè
được t h u n h ậ n t h e o p h ư ơ n g t r ì n h sau:
CH 3CHOHCOOHN<CH 3 >3 -> CH;ỉCHOHCOOH + N(CH;i I;i + H .O

4- Phương pháp tách pha

Axi t l a c t i c được c h u y ể n t h à n h l a c t a t c a n x i ớ d u n g d ị c h l ê n m e n . D u n g
d ị c h n à y đ ược c h u y ể n q u a t h i ế t bi lọc. P h ầ n s i n h k h ô i dược t á i s ứ d ụ n g .
Phần lactat hòa tan được cô đặc đên khoảng 40 - 70r/f khối lượng bail đầu.
(Người ta điều chỉnh pH bang NaC0 3 đến pH = 6,0 - 6,5 đô tạo ra lactat
natri).
L a c t a t n a t r i được đ ư a v à o t h i ế t bị c h ứ a t r i a l k y l a m i n và k h í CO., ơ á p

s u ấ t 7 5 p S i . L ú c n à y d u n g d ị c h S0 t ạ o t h à n h h a i p h a :
- Pha hữu cơ gồm chất hấp thụ axit lactic.
- Pha hòa tan gồm muôi carbonate natri và axit carbonic.
N g ư ờ i t a t h u h ồ i a x i t l a c t i c t ừ p h a h ữ u cơ b ằ n g p h ư ơ n g p h á p c h ư n g cất
chân không với áp suất 2 - lOOminHg, ở nhiệt độ 80 - 240° c .
8 .2.4 ứ n g d ụ n g vi k h u ẩ n lactic và a x it lactic
Axit lactic ngày càng được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm,
trong y học và trong nông nghiệp. Những hướng ứng dụng cơ bản gồm:
1- ứng dụng axit lactic trong công nghệ thực phẩm
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có rất nhiều trong thiên nhiên, vì
th ế chúng tham gia vào tấ t cả hoạt động sống của con người trong đó đặc
biệt quan trọng là chế biến thực phẩm.
a) ứng dụng để sản xuất dưa chua
Quá trìn h muối chua rau, quả chính là quá trình hoạt động sống của vi
khuẩn lactic và vi khuẩn axetic. Trong quá trình phát triển của chủng,
trong rau quả, khi lên men sẽ tạo ra axit lactic và axit axetic cùng một. số
334 CHUƠNG8

loại axit hữu cơ khác. Các axit hữu cơ này làm giảm pH của dịch, chống lại
hiện tượng gây thôi rau, quá. Mặt khác, nhờ có lượng axit hữu cơ được tạo
th àn h sẽ làm tăng hương vị của khối ủ chua rau, quả. Chính vì thế, người
ta cho rằng muôi chua rau, quả là quá trình vừa mang ý nghĩa chê biến vừa
mang ý nghĩa bảo quản.
b) ứng dụng để làm chua quả
Trước đây, người ta thường sử dụng axit axetic để Xìgâm chua quả. Sau
này, người ta sử dụng axit lactic đề ngâm chua quả. Phương pháp thay thê
này tỏ ra rấ t hiệu quả vì chúng ít ỉàm thay đổi màu tự nhiẽn của quá và
vẫn đảm bảo chất lượng quả ngâm chua.
c) ứ ng dụng trong sản xuất tương
Sản xuất tương theo phương pháp của người miền Bắc (Việt Nam) có
giai đoạn ngả nưđc đậu sau khi rang. Quá trìn h ngả nước đậu xáy ra nhiều
phản ứng sinh hóa khác nhau, trong đó có quá trìn h lên men iactic tạo pH
thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hương vị cho sản phấm.
d) ứ ng dụng trong sản xuất đậu phụ
Trong sản xuất đậu phụ có giai đoạn kết tủa protein của đậu. Phươug
pháp truyền thống thường làm là dùng nước chua (chứa vi khuấn lactic) đề
tạo kêt tủa (nhờ pH giảm đến điếm đẳng điện của protein đậu nành).
e) ứ ng dụng đ ể sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa
Trong sản xuât các loại sữa chua đều có sử dụng quá trìn h lên men
lactic. Nhờ có quá trìn h chuyến hóa đường th àn h axit lactic mà cazein được
kết tủa và tạo cho sản phẩm hương vị đặc trưng.
í) ứng dụng đ ể ủ thức ăn gia sức
Về nguyên tắc, ủ các loại cỏ và lá cây làm thực phẩm gia súc cũng
giống như công nghệ sản xuất dưa chua. Quá trìn h lên men lactic xảy ra
làm tă n g g iá tr ị d in h dưỡng và k h ả n ă n g bảo quản cỏ, lá cây cho gia súc.

2' ứng dụng trong y họe

Quá tr ìn h lê n m en la ctic và ax it lactic được ứng d ụ n g rộn g rãi trong y
học.
a) ứ ng dụng vi khuẩn lactic đ ể chữa bệnh đường ruột
Thực ra v iệ c ứng d ụng n à y đã được V iệt N a m ứng d ụ n g từ lâu. Khi
người ta bị tiê u ch ả y , th ầ y thuốc k h u yên h à n g n g à y u ống 1 * 2 ch én (bát)
nước dưa chua. Phương p h áp n à y tỏ ra rất h iệ u n g h iệ m tro n g đ iều k iện
n g à n h được chưa p h á t tr iể n .
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIĨ HỮU c ơ 335

Dựa vào hiệu quả sử dụng vi khuẩn lactic trong việc chữa trị tiêu chảy,
Pháp đã sản xuất và đưa ra thị trường từ hàng chục năm nay một sản
p hẩm m a n g tê n là B iolactyl. S ản phẩm n ày chuyên trị tiêu ch ảy b ằng
n h iều vi k h u ẩn lactic.
b) ứng dụng axit lactic theo phép chữa vi lượng đồng cân (homeopathy)
T ron g quá trìn h vận động của cơ th ể, m ô cơ h o ạ t động m ạn h v à tron g
một thời gian dài sẽ gây ra hiện tượng mệt mỏi. Hiện tượng mệt mỏi này
xuất h iệ n do các p h ản ứng sin h h óa xảy ra trong mô cơ, tạ o ra ax it lactic.
Các th ầ y thuốc đã tạo ra m ột vị thuốc bao gồm a x it lactic k ế t hợp với
cây k im sa có k h ả n ă n g giúp cơ th ể k h ôn g còn m ệt m ỏi và có k h ả n ă n g làm
việc và hoạt động liên tục trong thời gian dài.
c) ứng dụng axit lactic trong phẫu thuật chỉnh hình
T rong p hẫu th u ật chỉnh h ìn h , người ta thường sử dụng loại v ậ t liệu có
tên là purasorb.
Purasorb là m ộ t hợp ch ất cao p h ân tử được sả n xu ất từ axifc lactic.
Thành phần của purasorb bao gồm: lactides, glycolide, f olylactides,
p o ly g ly co lid e, la ctid e/glycolid e copolym e. Purasorb được sử dụng như những
đ ịn h ghim , gắn p hần xương lạ i với nhau; k h i xương đ ịn h h ìn h , purasorb sẽ
tự tiêu hủy.
d) ứ ng dụng axit lactiẹ trong nha khoa
Trong nha khoa có hai chế phẩm được sử dụng nhiều đó là Puramex và
puracal.
Puram ex bao gồm các th à n h p h ần sau: A m ulinium lactat, F e-la cta t,
M g-lactat, M n la ctat, Z nlactat còn Puracal chỉ có la c ta t canxi. Các ch ê
p h ẩm n à y thư ờng là m răn g khoẻ hơn.
e) ứ ng dụng để sản xuất vật liệu sinh học (Bỉomateriais)
Các n h à kỊíoa h ọc đ ang n g h iên cứu tạo ra nhữ n g v ậ t liệu sin h học
d ùng tron g y học b ằử g các copolym e của a x it lactic. Các copolym e n à y có
tín h n ă n g r ấ t g iố n g nhữ n g bộ k hu n g xương động vật. H ướng n à y đ an g được
n g h iê n cứu v à người ta h y vọn g tron g tương la i nó s ẽ được ứng dụng nhiều .
f) ứng dụng trong sản xuất các loại sửa và bột giàu canxi
Người ta thư ờng bổ sung la c ta t can xi vào th à n h p h ần sữa bột d in h
dưỡng, b án h n g ọ t, b án h nướng đ ể tă n g lượng can xi cho cơ th ể.
 CHƯƠNG 8

3- Một s ố ứng dụng khác của axit lactic

a) Chất dẻo trong tương lai
C á c p h ò n g t h í n g h i ệ m đ a n g n g h i ê n cứu loại c h â t d e o m ớ i t h a y t h ế cho
c h ã t d ẻ o cũ k h ó p h à n h u y. C h ấ t d ẻ o m ới n à y l à m ộ t loại p o l y m e d ư ợc gọi là
p ol y a x i t l a c t i c ( P L A ) . Đó l à s á n p h ẩ m dược t ạ o r a t ừ p h ả n ứ n g t r ù n g hợp
a x i t l a ct i c . N g ư ờ i t a h y v ọ n g t r o n g t ư ơ n g lai n ó s ẽ t h a y c h ấ t d ẻ o được s á n
xuất từ đầu mỏ vì tính chất dẻ phân húy của aó có ý nghĩa rất lớn trong
bao vệ môi trường.
b) Ưng dạng trong mỹ phấm
C á c loại l a c t a t k i m loại được s ử d ụ n g t r o n g t h à n h p h ầ n c ủ a m ộ t s ố ’ mỹ
p h à m c h ă m s óc d a n h ư p u n o s a i v à cùn h ã n g 1 1 1 V p h à m P l ' n a c . M v p h ấ i n n à y
có t á c ( l ụ n g c h ố n g l ạ i c á c vi s i n h v ạ t có t r ò n bề m ặ t d a , l à m ấ m và Làm
Sỉhig (ln.

8.3 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXỈT XỈTRỈC

Axit xitric có công thức hóa học ià: C( í í sO~
T r o n g t h i ê n n h i ê u , a x i t x i t r i c có n h i ề u t r o n g t h ự c v ậ t t h u ộ c h ọ c h a n h ,
(\IJ11. C h í n h vì t h ê có n h i ề u nơi x á y (lựng qui t r ì n h công n g h ệ c hi ế t , r út từ
c á c loại n g u y ê n l i ệ u t h i ê n n h i ê n n à y .
A x i t x i t r i c đ ư ợ c ứ n g d ụ n g r ấ t n h i ề u troiiíí c ó n g n g h ẹ s a i l x u ấ t nước giáí
k h á t , b á n h k ẹ o , t r o n g c ô n g n g h i ệ p s á n x u ấ t s ơ n v à c h ấ t đèo.

8.3.1 Vi sin h v ậ t sử d ụ n g tro n g công n g h ệ sả n x u ấ t a x it x itric

Axit xitric được tống hợp chú yếu từ các loài nấm sợi. Kình như các
ỉoài n á m m e n v à c á c l o à i vi k h u á n k h ô n g có k h á n ă n g Iiày. C á c loài n ấ m
sợi có khá nàng sinh tổng hợp axit xitric bao gồm: Citroììiyresgỉadcr,
ritromyccs pfcfferianiis, CitmmyvcH Conidỉnphone, Pcnicillium ỉute um ,
Peììicìllium glauciun , Aspergillus íìigcr, Aspergillus Orvznc, Aspergillus
bntutac, Aspergillus awamari Aspergillus wclchii.
Trong các giống vi nấm kề trcn, Aspergillusniger là nấm sợi được ứng
(l ụn g v à o s ả n x u â t a x i t x i t r i c n h i ề u n h â t , flap ứ n g đưực 3 y ê u c ầ u cơ b á n về
gỉỏng dùng trong sản xuất axit xitric là:
* Có khả năng tạo axit xitric rất mạnh
C ó k h á n à n g c h ị u đ ược mô i t r ư ờ n g nxit k h i l ư ợ n g a x i t x i t r i c t ă n g cao
; It t ạ o r a n h ữ n g a x i t hữu cơ k h á c n h ư a x i t oxalic, a x i t gluconic, axi t
fumnric.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT HỮU c ơ 337

8 .3 .2 C ơ c h ế s i n h t ổ n g h ợ p a x it x ỉt r ỉc

Cơ chê sinh tổng hợp axit xitric vần CÒI1 nhiều vấn đề chưa được làm
sáng tỏ. Tuy nhiên, các nhà khoa học củng đà thống nhất một cơ chê dơn
giản nhất cua cơ chê tạo axit xitric từ đường
2CgH 1:,0 6 + 3 0 2 —>2CưH 80 7 + 4H20

8 .3 .3 C ô n g n g h ệ s ả n x u ấ t a x ỉt x it r ic
Hiện nay vẫn tồn tại hai phương pháp sản xuất axit xitric từ nấm sợi
Aspergillus niger: phương pháp lên men bề mặt và phương phíip lèn men
chìm.
1-Phư<mg pháp lởn men bề mặt
Phương pháp lén men bề mặt được ứng dựng nhiều vào nhừng năm đầu
cũa thè kỷ XX, theo đó các ví sinh vật phát triển hẳn trén bề mật môi
trường nằm giữa pha rail và pha khí hoặc nằm giừa pha lỏng và pha khí.
Như vậy, phương pháp lên men bề mặt có thề sử đụng hai loại mói
trường: mỏi ĩ rường bán rắn, còn gọi là môi trường xốp, và môi trường lõng.
a) Lên men bồ mặt vái mòi trường bản rắn
Phương pháp này rất dồ thực hiện. Tuy nhiên, trong sản xuàt axit
xitric, phương pháp này cho cỉến nay rất ít được áp dựng vì năng suất thu
nhận axil xitric không cao và khá phức tạp ở khâu chiết, tách axit xitric.
Trước đây. đề sán xuất axit xitric người ta thường sử dụng môi trường
cám mì, cám gạo có trộn khoáng 15 - 25rc trâu đế tăng độ xôp cùa mòi
trường. Ngoài ra, trong nhiều cơ sở sản xuất axit xitric, người ta còn sử
dụng các mỏi trường khác từ sắn (khoai mì), bột bắp, khoai tây, thậm chí
cả bột khoai lang (khoai ngọt) làm môi trường.
Toàn bộ nguyên liệu làm môi trường phải được nghiền nhỏ đến kích
thước vừa phái (không nên nghiền mịn quá sẽ dề tạo ra hiện tượng dính,
bết lại, không khí khó lưu thông trong lòng môi trường. Sau khi nghiền và
phôi trộn những thành phần khác cần thiết xong, nguyên liệu được làm ẩm
đến độ ẩm khoảng 60% - 65% và đem hấp thanh trùng bằng hơi nóng. Môi
trường đã thanh trùng xong được làm nguội và chuẩn bị cho quá trình nuôi
cấy.
Trước đó ta phải chuẩn bị nấm sợi giống. Quá trình này còn được gọi
là giai đoạn thu nhận bào tử giông.
Có hai phương pháp thu nhận bào tử giông đùng cho sản xuất.
Phương pháp thứ nhất
338 CHƯƠNG 8

Chuẩn bị 3 - 4 bình tam giác dung tích 150ml, cho vào đó khoáng 50
gam cám để có độ ầm 60rc. Hấp thanh trùng và đê nguội.
Từ ông giống Aspergillus nỉgcr gốc, ta chuyển toàn bỏ khuẩn lạc bằng
cách cho vào mỗi ống nghiệm 10 ml nước vô trùng, khuây đều cho bào tử
giỏng trong ỏng nghiệm hòa trộn trong nước. Bằng phương pháp vô trùng
(thực hiện trong những tủ nuôi cấy vô trùng) chuyển toàn bộ sang các bình
tam giác dã chuẩn bị môi trường sán. Lắc đều cho môi trường trộn đều bào
tử. Nuôi chúng trong những tủ ấm có nhiệt độ 30 - 37°c , trong thời gian 3
ngày. Khi thây trong bình tam giác toàn là bào tử màu đen là kết thúc giai
đoạn nuôi cấy này.
Tiếp đó, chuẩn bị sẩn môi trường như trên, đem thanh trùng môi
trường và chuyến chúng vào các khay báng nhôm hoặc bằng inox. Tãi đều
môi trường sau khi cho 10 % giông từ các bình tam giác đả nụôi ở trên vào.
Chiổu dày khôi môi trường sau khi trộn giống thường là 3 - 5cm. Đề khay
vào trong phòng có nhiệt độ ôn định là 32uc . Nuôi trong thời gian 3 - 4
ngày khi bào tử màu đen xuất hiện kill bề mặt môi trường, đem sây ở nhiệt
độ < 40° c ta thu được bào tử giông sẵn sàng cho sản xuất đại trà.
Phương ph á p t h ứ 2.
Thay vì ngay từ đáu, người ta nuòi Aspergillus nigcr có thành phần
trên môi trường bán rắn trong các bình tam giác, người ta nuôi chúng trong
mòi trường lỏng.
Môi trường lỏng đề thu nhận bào tứ nấm sợi Asp. niger như sau:
- Dung dịch nước m alt có nồng độ chất khô 3 - 57í
- NH 4C1 0,25g
- KH 2P 0 4 l,25g
- M gS0 4 0,25g
- F eS 0 4 0,0125g
Môi trường chuẩn bị xong được phân phôi vào bình có dung tích
2 - 3 lít với chiều cao của dung dịch trong các bình là 1 cm, đom hấp thanh
trừng ỏ la t trong 30 phút. Làm nguội và chuyến vào đây giống từ các ông
nghiệm giống gôc. Tiến hành nuôi giống ở nhiệt độ 32° c trong thời gian 4
ngày hoặc lâu hơn cho đến khi trên bề m ặt xuâ't hiện váng nâni sợi, lức đầu
là màu trắng, sau đó là màu đen chứa toàn bào tử. Người ta thu bào tử này,
đem sấy ở nhiệt độ < 40° c và dùng nó như bào tử giông cấp 1.
Để sản xuất bào tử giông cấp 2, 3, người ta thực hiện như quá trình
nuôi nấm sợi trên khay đã trình bày ở phần trên.
Mục đích của quá trình nhân giông là thu nhận bào tử cho sản xuất
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT HỮU c ơ 339

sau này, nên trong quá trìn h nuôi, thu được càng nhiều bào tử càng tốt.
Tiến hành quá trìn h sản xuất theo phương pháp lên men bề m ặt được
thực hiện như sau:
Người ta chuẩn bị cám và trộn cám với nước theo tỷ lệ 1:1 (theo kinh
nghiệm, tỷ lệ trộn này đảm bảo độ ẩm đạt 55 - 65%). Hấp th an h trùng ở
la t trong thời gian 30 phút và tãi chúng ra các khay sau khi làm nguội và
trộn bào tử giông với tỷ lệ 0,3% - 0,5%. Chiều dày của khôi cám + bào tử
giông là 3 - 5cm. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ ổn định là 30 - 32° c trong
thời gian 4 - 5 ngày. Thời gian lên men kết thúc khi thấy bào tử nấm sợi
mới bắị đầu xuất hiện nhiều nhưng chưa hoàn toàn chuyển sang màu đen.
Phương pháp nuôi cấy bề m ặt để thu nhận axit axetic trên môi trường
bán rắn đã từ lâu không còn áp dụng ở các nước châu Âu. Tuy nhiên ở
nhiều nước phương pháp này vẫn được sử dụng và người ta đă thay cám
bằng bột khoai mì. Nhiều thông báo cho thấy cứ 3 - 4kg bột khoai mì người
ta thu được lk g axit xitric.
Khôi môi trường sau khi nuôi cấy được gọi là canh trường nấm sợi hay
là chế phẩm axit xitric thô. Người ta lập tức đem xử lý ngay hoặc sấy khô
để trích ly và xử lý dần theo kế hoạch.
b) Lên men theo phương pháp bề mặt trên môi trường lỏng.
Trong phương pháp nuôi cấy này, người ta sử dụng một trong những
công thức môi trường sau đây:
Môi trường 1:
- Saccharose: 150g 15%
- MgS04 0,25g -> 0,025%
- n h 4n o 3 0,5g 0,05%
- k h 2p o 4 0,15g 0,015%
- Nước 1 .000 ml —» nước vừa đủ 100 %
Môi trường 2: (môi trường Curie)
- Saccharose 12 - 15%
- MgS04 0,15%
- n h 4n o 3 0,2 %
-KH 2P 0 4 ỒJL%
-p H 3 - 3,6
Môi trường 3: (môi trường Deolger)
Saccharose 14%
MgS04 0,023%
n h 4n o 3 0,223
k 2h p o 4 0 ,1%
Ễ 22
340 CHƯƠNG 8

Mô ỉ trường 4
Saccharose 10 %
n h 4n o 3 0,25%
KH 2P 0 4 0 ,01 %
M gS047H20 0,03%
ZnS047H20 0,0008%
pH = 5 , 5 - 6
Người ta thay đường bằng m ật ri. M ật ri được xử lý trước khi dùng làm
môi trường. Xử lý m ật rỉ gồm 3 vấn đề cần giải quyết:
* Xử lý màu
* Xử lý hệ keo có trong m ật rỉ
* Xử lý sắt nếu m ật rỉ chứa nhiều sắt.
Xử lý màu và xử lý hệ keo có trong m ật rỉ đã được trìn h bày ở chương
7 “Sản xuất cồn và các sản phẩm lên men chứa cồn”. Còn trường hợp mật
rỉ chứa nhiều sắt người ta xử lý như sau: cho vào m ật rỉ sau khi đá pha
loãng K 4ỊFe(CN)6Ị
4Fe+++ +3[Fe(CN)6] ^ F e 4 [Fe(CN )6]3
Môi trường phải được lọc kỹ và được th an h trùng, làm nguội, phân
phôi vào các khay, nuôi à nhiệt độ 28 - 32° c trong thời gian 48 - 72 giờ.
Khi đó trên lớp môi trường lỏng sẽ tạo thàn h một lớp váng dày của khuẩn
lạc nấm Aspergillus niger. Axit xitric sẽ được thẩm thấu qua màng tế bào,
hòa tan vào môi trường. Kềt thúc quá trình lên men, người ta lấy phần địch
lên men, bổ sung môi trường mới và tiếp tục lên men mẻ mới.
2- Lẽn men theo phương pháp chìm
Trong công nghệ sản xuất axit xitric theo phương pháp chìm, người ta
sử dụng môi trường giống như môi trường lỏng dùng trong phương pháp lên
men bề xnặt.
Quá trìn h được thực hiện trong các th iết bị lên men có cánh khuấy và
có hệ thông thổi khí liên tục. Người ta tiến hành quá trìn h lên men ở
28 - 32ớc trong thời gian là 6 - 7 ngày.
Trong quá trìn h lên men, người ta thường phải sử dụng CaC0 3 để điều
chỉnh pH vì axit xitric được tạo thành sẽ làm giảm pH xuống 1 - 1,5. Việc
điều chỉnh này còn có ý nghĩa là người ta chuyển axit xitric th àn h xitrat
canxi lắng xuống.
Kết thúc quá trình lên men, người ta sử dụng H 2S 0 4 để tách axit xitric ra
Tiến hành cô đặc và kết tinh axit xitric giống như trưỉmg hợp sản xuất axit lactic.
 Chương

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT AMIN

Khi nghiên cứu quá trình tổng hợp protein, các nhà khoa học cho thấy
trong protein tồn tại khoảng 20 axit amin khác nhau.
Trong sô' 20 loại axit amin có 8 loại axit amin (lyzin, methionin,
treonin, tryptophan, phenylalanin, isoloxin, lơxin và valin) cơ thể người và
động vật không có khả năng tổng hợp. Những axit amin này được gọi
chung là những axit am in không thav thế. Các axit amin có trong thành
phần protein thường có một sô" đặc điểm chính sau:
* Axit amin thường chứa nhóm - N H 2 và -COOH (nhóm amin và
nhóm cacboxil). Các axit arain có cấu trúc đặc trưng sau:
NH 2
R -C -C O O H
„
Nhóm NH 2 thường liên kết với nguyên tử cacbon ở gần nhớin COOH.
Trong trường hợp axit amin có hai nhóm NH 2 thì nhóm NH 2 thường liên
kết với nguyên tử cacbon cuối cùng. Ví dụ:
CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH - COOH
nh2 nh2
L'Lyzin

* Trong cấu trúc của axit amin, ít nhất có một nguyên tử cacbon bâ't
đối, do đó axit amin tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học: dạng D và
dạng L. Cơ th ể động vật và thực vật chỉ có th ể đồng hóa được axit amin
dạng L.
* Đa số axit amin tồn tại ở thể rắn và là dạng tinh thể trong điều kiện
bình thường. Chúng bị phá hủy ơ nhiệt độ cao (200 -3 0 0 °c ).
* Đa sô' các axit, amin đều cho màu tím xanh khi tương tác với
ninhydrin.
* Các axit amin là thành phần cấu tạo nên protein, enzym, các
vitamin, chât kích thích sinh trương, hocmon và kháng sinh, kháng thể.
342 CHƯƠNG 9

Trong tế bào sinh vật luôn luôn xảy ra quá trìn h tổng hợp ra các chất kể
trên. Các nhà khoa học cũng cho thấy rằng các axit amin tham gia quá
trìn h tổng hợp đều được lấy từ 3 nguồn:
* Nguồn dinh dưỡng từ bên ngoài.
* Nguồn được tạo ra do quá trìn h phân hủy các hợp chất chứa axit
amin có trong tế bào để đổi mới vật chất trong tế bào.
* Nguồn được tổng hợp trong tế bào.
Quá trình tổng hợp các axit amin trong tế bào đóng vai trò rấ t quan
trọng. Nhờ có quá trình này, tế bào mới đảm bảo việc tổng hợp vật chất
chứa axit amin mới hài hòa và đáp ứng đúng các nhu cầu sinh lý của cơ
thể.
Tuy nhiên, cùng phải nhận thấy rằng, quá trình tổng hợp các axit
amin tuân theo một qui luật là tiết kiệm và hợp lý, có nghĩa là, tế bào
không tổng hợp quá dư thừa axit amin so với nhu cầu của tế bào. Như vậy,
vân đề tổng hợp thừa các axit amin là một ngoại lệ của tế bào, khi đó tế
bào sẽ m ất khả năng kiểm soát quá trình tổng hợp. Lượng axit amin thừa
này lại đáp ứng yêu cầu của ngành công nghiệp sản xuất axit amin.

9.1 NHỮNG PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT AXIT AMIN

Axit amin được ứng dụng rấ t rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và
trong y học. Vì nhu cầu về axit amin của hai ngành này rấ t lớn nên các
.nhà khoa học đã đưa ra rấ t nhiều phương pháp khác nhau để sản xuất axit
amin. Các phương pháp cơ bản n h ất bao gồm:
a) Phương pháp thủy phân
Người ta dùng axit hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều
protein. Các phương pháp này hiện nay vần đang được sử dụng rộng rãi.
Tuy nhiên, các phương pháp này có nhược điểm là:
* Cần th iế t bị chịu axit hay chịu kiềm.
* Trong trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều axit
amin dạng D.
* Trong trường hợp sử dụng axit để thủy phân sẽ tạo ra ô nhiễm môi
trường không khí do lượng axit dư bay hơi trong quá trình thủy phân.
* Giá thành thường cao.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT AMIN 343

b) Phương pháp tổng hợp hóa học

Đây cùng là phương pháp được áp dụng nlỹều vào trong thực tế. Tuy
nhiên, phương pháp này lại cho ra nhừng axit amin raxemic (hồn hợp axit
amin dạng D và dạng L). Việc tách hai loại axit anìin nảy ra rấ t tốn kém.
c) Phương pháp kết họp
Người ta kết hợp phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. B a n g
con đường hóa học, người ta thu nhạn hợp chát dạng L-Keto và các tiền
c h á t c u a axit. a m i n , S a u đó ng ười t a s ứ d ụ n g vi s i n h v ậ t (iê c h u y ê n h ó a
nhừng chát này thành axit amin.
d) Phương p h á p tống hợp axit ciỉìũn bàtig CỎIÌỊỊ nghệ vì siììỉì rật
Nhờ khá năng sinh tổng .hợp thừa một sô ioại axit aniin cùa một sỏ
ỉ oà i vi s i n h v ậ t , n g ư ời t a t i ế n h à n h n u ôi c à y vi s i n h v ậ t (lồ t h u n h ậ n các
axit amin. Phương pháp nàv có rât nhiều ưu điểm. Những ưu (liốni (ló như
sau:
:: P h ư ơ n g p h á p n à v c h o p h é p t a t h u n h ậ n a x i t a i n i n d ạ n g L.
■ N g u y ô n li ệu đ é s á n x u ấ t rẻ, d ễ k i ế m .
' T ố c đ ộ t r a o đ ố i c h â t , tốc độ s i n h s á n v à p h á t t r i ể n m ạ n h cù a vi s i n h
vật cho phép ta được năng suât cao.
G iá t h à n h s á n p h n m t h ấ p hơn giá t h à n h sa n p h á m từ n h ừ n g phương
pháp khác.

9.2 SẢN XUẤT AX1T AMIN BẰNG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT
Trong quá trình sinh trưởng, phát triển, vi sinh vật tiến hành các quá
trình tổng hợp axit amin trong tế bào vi sinh vật. Sau đó các axit anùn
cĩưực giái phóng khỏi tế bào và ra môi trường. Người ta biết (lược đặc điếm
tổng hợp này ở tế bào vi sinh vật và từ đó thiết lập qui trình công nghệ
sản xuất axit amin theo qui mỏ công nghiệp.

Axit amin thoát

Chất dinh dưỡng
vảo mòi trường

Môi trường T ế bào Môi trưởng

Hình 9.1: Quá trình tổng hợp và thu nhận axit amin
344 CHƯƠNG 9

Như vậv, việc sán xuất axit amin bằng công nghệ vi sinh là một quá
trìn h thu nhận các axit ainin tự do từ quá trình sinh tông hợp của tế bào vi
sinh vật. Đây là điểm khác cơ bán của phương pháp này vđi phương pháp
thúy phân. Do đó, việc điều khiển quá trình sân xuât chính là điều khiển
quá trìn h sống cũa tế bào. Đây là vân dề rất phức tạp gồm hàng loạt các
công việc điều khiến có liên quan đến tê bào sông nên đòi hỏi sự hiếu biết
rát sâu về sinh lý vi sinh vật và các kỹ thuật hóa lý. Mặt khác, mỗi một
loại axit amin đòi hói một công nghệ riêng; chúng hoàn toàn không giõng
nhau trong khi vận hành sán xuất.
9 .2 .ỉ C ô n g n g h ệ s ả n x u ấ t a x i t g lu t a m ic
Axit glutamic có công thức cấu tạo như sau:
NH2
HOOC - CH 2 - CH 2 - CH - COOH
Phân tử lượng cùa axit gìutainic ỉà 147,13. Nhiệt độ nóng cháy ỈM
247 - 2 ‘19'C. Axit glutamic tan hoàn toàn trong nước. Chúng không tail
trong cồn. eter. và một sô' dung mỏi.
Axit glutamic được ứng dụng nhiều trong y học và trong công ngliộ
thực phàm. Trơng y học, axit glutamic được coi như chất bò nãơ, chửa các
bệnh thần kinh phàn icập, bệnh chạm phát triến trí nào. Trong còng nghệ
thực phàm, muôi giutamat natri cùa axit alutamic được coi như một chât
(ỉieu vị lý tướng.
ỉ- Các phưctng pháp sản xuất axit glutamic
Trước dày, vào những năm đầu của th ế kỷ XIX, người ta sử dụng
phương pháp thúy phản protein đe thu nhận axit glutamic. Nguyên liệu
thường được dùng trong sán xuất axit glutamic là bột mì. Khi thủy phán
bàng axit, người ta thu đượe hồn hợp các axit amin, trong đó có chứn nhiều
iìxit glutamic. Bằng phương pháp hóa lý, người ta tách axit glutamic ra
khói hỗn hợp này.
Phương pháp hóa học được ứng dụng rất rộng rãi trong một thời gian
dài ờ các nước châu Ảu. Sau này, các nhà khoa học cho thấy cò nhiều vi
sinh vật có khả nàng tổng hợp axit glutamic, và mài đến năm 1957, N hật
là nước đầu tiên trên th ế giới sản xuất axit glutamic theo qui mô cóng
nghiệp. Từ đó đến nay, sán xuất axit glutamic bằng phương pháp lên men
được phát triến rộng rãi trong nhiều nước trên th ế giới. Phương pháp lên
men đã giái quyẽt được hàng loạt I i h ừ n g nhược điếm của phương pháp hóíỉ
học, do đó giá thành đã giám đi rất nhiều. Chính vì thế phương pháp lên
CÒNG NGHỆ SAN XU ÀT AXIT AMIN 345

men dĩi thay thê hoàn toàn phương pháp hóa học.
2- Sún xuất uxit glutam ic bằng phương pháp ỉcn men
(!) Vi sinh rật tham gia ỉ ổng hợp cuxỉt gỉ litamìc
(Y k- n h à k h o a h ọc đ ã t ì m r a r á t n h i ề u vi k h u ẩ n có k h a n ă n g s i n h t ổ n g
liỢị) ỉixit glutamic, trong đó đáng chú ý nhất ỉà các chúng vi k h u ẩ n sau:
;; C á c c h i i t i i * Ỉ h ỉ i ỏ c B c i c i ỉ ỉ u s :

B d c ilh is c ịr c u ỉu n s
Bdci ỊI Í/.S' ììiCỊịatìi cri // ìtì
B a c illu s mcựaỉìi critnnccrcuỉt
B a c illu s gịgtuì tci/s
B a v iỉỉu s ỉ c n i us
(Ytc cỉỉiiỉiLị th u ộ c Micrococcus:
XlicmvtwvuH lịlutumicỉta
Mirrnvot-rus raric/n s.
('</<■ c h i/ ỉ ì i ỉ t h u ộ c ỉìrcrì b a c t c r i u m :
ỊỉrcriỈHit-tcrium (Itỉtilìogcncs
Brrỉ ih itc ỉc n iim u h n iic u m
Ịĩrcrihucttrriunì kuicastíki
ỉỉr r r ih í/c ỉe r iu m ỉ(frt(tfcrììĩcntutn
B r c rib a c ỉe riỉỉm sarchorolyíiritỉtì
ỉ ỉ r c n b a c te r iu m Ịla v u m
B r c v ib a c tc r i Uììì ì ft ì ì na ri ỉpỉt i ỉ ỉ li IU
B n r ih a c fe r iu m n ts c u m 7
B rcv iỉm c tcriỉu tì soya
B r c c ib a c tc r iu m d iv a r ic a tu m
B r c v ib a c te r iu m v ita r u m c n
: Các giổniỉ thuộc Coryncbactcriuni:
- Coryncbucterium ỉ ilium
- Corynchactcrium calỉunac
- Corvnebacterium glutamicum
b) Sinh tỏng hợp thừa CLX it glutamic ở vi khuẩn
Trong sán xuất ítxit glutamic hiện nay, người ta sử dụng chú yếu các
cluing loại vi sinh vật sau:
> C orvnebactenuiỉì lịlỉituìtìisunì
346 CHƯƠNG 9

* Brevibacterium flavum
* Brcvibactcrium dỉvaricatum
Trong quá trìn h sinh tổng hợp axit glutamic, người ta thấy có nhiều
điểm rấ t dặc biệt không giống con đường khử amin thông thường. Nhửng
điểm quan trọng đó như sau:
* Vi khuẩn thiếu enzym a-xetoglutaradehyđrogenase.
* Quá trình amin hóa hoặc khử amin íx-xetoglutarat nhờ hoạt tính cao
của e n z y m glutamatdehyđrogenase đặc hiệu với N A D -H 2 : Loại enzyin này
nhận NAD-H., từ một phản ứng cún Izohydrat dehydrogenase cũag tham
gia chuyến hóa với NAD-P. Trong quá trình oxy hóa-khử, NAD-P, cần
th iết cho sự loại hvdro của izoxitrat, sẽ được tái tạo.
Người ta tìm thây enzvm photphoenol-piruvat-cabocvlase và
n i a l a s i n t e t a s e t r o n g t ế b à o vi k h u ấ n . C á c e n z y j n n à y t h a m g i a v à o c á c quá
trình cacboxyi hóa pivuvat và photphoenol-piruvat.
: Trong trường hợp thiêu biotin, tính thấm của màng té bào sẽ thav
(lôi dưới tác động của peniciliu và axit béo. o dây có hai trường hợp xảv ra.
Thứ nhất. Tính thân') của màng tê bno không bị thay đối sò dẫn đến
hạn chẽ sự thoát axit amin ra ngoài môi trường thòng qua màng tế bào.
Khi đó sự tổng hợp thừa xáv ra trong tế bào và axit amin sẻ tồn đọng lại
trong tế bào. Trong trường hợp này, các axit glutamic sẽ ức chế enzym
gỉutamat - d e h y d r o g e n a s e , sự tạo t h à n h axit glutam ic t r o n g n h ử n g phán
ứng tiếp theo sẽ giảm nhanh chóng.

Thứ hoi. Nếu màng bán thấm của tế bào bị thay đổi, axit glutamic sẽ
được thoát ra ngoài qua màng bán thâm , khi đó lượng axit glutamic trong
tê bào ít sẻ không có khả năng ức chế các enzym tổng hợp ra chúng. Như
vậy, enzym luôn luôn hoạt động và axit ainin sẽ được tạo ra dư thừa so với
nhu cầu của tế bào.
Sự thay đổi màng bán thẫm có liên quan rá t nhiều với sự tạo thành
axit béo ở màng. Sự tạo th àn h axit béo lại lệ thuộc rất nhiều ở hàm lượng
biotin có trong môi trường. Do đó việc nghiên cứu nồng độ biotin thích hợp
ỉà điều rấ t quan trọng.
Nguyên nhân khác có liên quan đến sự tạo thành axit glutamic thừa là
sự biên đổi di truyền. Những biến đổi gen trong câu trúc AND có tính quyêt
định đên sự tạo thành axit glutamic thừa. Bằng phương pháp gây đột biến
hay biến đổi gen, người ta tạo ra nhừng chủng vi khuẩn sinh tổng hợp axit
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT AMIN 347

glutamic râ t cao và có khả năng tích lũy trong môi trường đến 120 g/1.

Hình 9.2: Sinh tổng hợp thửa axit glutamic

c) Các phương pháp lên men

Hiện nay trên th ế giới, người ta sán xuất axit glutamic theo hai
phương pháp:
Phương pháp thứ nhất: Phương pháp này được gọi là phương pháp lên
men hai giai đoạn.
Trước năm 1964 xuất hiện rất nhiều công trình nghiên cứu về khả
năng chuyển hóa axit a-xetoglutanic thành axit glutamic nhờ enzym
am inotransferase. Từ những nghiên cứu này, các nhà khoa học tiến hành
thủy phân protein để thu nhận L hoặc DL aspartic. Sau này các nhà khoa
học đã tìm ra các vi khuẩn Flavobacterium, Achromobacter, Micrococcus,
Sarratia có khả năng tổng hợp am inotransferase rấ t cao và người ta không
chỉ dùng aspartic làm chất chuyển duy nhất mà sử dụng một loạt các axit
amin như iơxin, glyxin, prolin, serin, treonin. Phương pháp này đòi hỏi
phải thu được các tt-xatoglutaric, sau đó dùng vi khuẩn Bacterium
xatoglutarium (hoặc một vi khuẩn nào có chứa am inotransferase) chuyển
348 CHƯƠNG 9

chủng th àn h axit glutamic.

Một hướng nghiên cứu thành công khác của các nhà khoa học trên thế
giới là dừng axit xitric thay cho cc-xetoglutaric đê tạo ra axit glutamic.
Trong trường hợp này điều bắt buộc là phải bố sung muôi anion vào môi
trường nuòi cây.
Phương pháp thứ 2: Phương pháp này còn được gọi là phưưng pháp lên
men trực tiếp đường và các thành phan khác của môi trường íĩô tạo ra axit
glutamic.
Nguyên liệu dùng cho ỉêu men là các loại dung dịch dường giucose,
saccharose hay dịch thủy phán tinh hột, cellulore. Trong dung dịch, (tường
thường chiẻm khoáng 8 - 25c/c. Trong quá trìn h lêu men, người ta có thế sử
d ụ n g n ồ n g độ đ ư ờ n g cao n g a y t ừ b a n đau. N h ư n g p h ư ơ n g p h á p SỪ d ụ n g
đường làm nhiều lẳn trong suốt, thời gian lòn men thường cho hiệu suất cao
hơn lượng đường cần thiết cho quá trình lèn men còn tùy thuộc vào giống
vi khuẩn mà ta đưa vào sản xuàt. Những sô liệu cụ thề chỉ có th ể có được
b a n g n h ữ n g t h ực n g h i ệ m n g h i ê n cứu v à t h ự c t è Síin xuất .
Trong các ỉoại nguyên liệu dùng đẽ sán xuất axit glutamic, thường được
sứ đụng nhiều nhíít là m ật rỉ vì mật ri có những ưu điẻin rất thuận lợi cho
sản xuất axit glutamic như sau:
• Mật rỉ là nguyên liệu rẻ tiền và rat dẻ kiếm.
- Trong mật ri có chứa đủ lượng dường cần thiết cho quá trinh lên
men.
- MíẬt rí có hàm lượng biotin rât cao. Hàm lượng biotin thích hợp cho
len men axit glutamic là 2 - 5 g/lít môi trườn". Lưu ý rang nếu hàm lượng
biotin quá cao, sự tạo thành alnnin. axit lactic, aspartic sẽ rấ t nhiều, anh
hưởng đến hiệu suất axit glutamic.
Trong trường hợp dùng các dung địch chứa đường khác để tiến hành
lên men ta phái cung cấp thêm hàm lượng biotin. Người ta thường sử dựng
nguồn biotin từ cao ngô. Điều lưu ý nừa là biotin có ánh hưởng tốt đến sự
tạo thành axit gỉutamic, nhưng 11Ó lại ánh hường xấu đến khả năng bán
thâm cúa màng té bào. Do đó, trong quá trình lén men người ta phải sử
dụng một sô chàt ức chê tao th àn h các lipogìuco protein ơ màng tế bào. Các
chát úc chỏ thường được sử dụng trong sân xua't axit glutamic là Tvveen 60,
với liêu lượng sứ (lụng là hoặc (iinudin 0 ,01 %, muôi canxi của benzin
penicilin 5 UI/mJ.
Nguồn nitơ được sứ dụng nhiều n hát là urea. Người ta thường cho hàưi
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT AMIN 349

lượng urea khoảng 0,5 - 2%. Thông thường trong sản xuất, lượng urea được
cho vào làm nhiều lần. pH trong quá trình lên men duy trì ở mức 6,8 - 7,8
là tố t nhất.
Ngoài nguồn urea ra, người ta còn sử dụng nhiều (NH 4 )2S 0 4 hoặc
(NH 4 )C1 với liều lượng là 0,5%. Trong nhiều trường hợp người ta sử dụng
cả NH4OH hoặc khí amoniac thổi vào dung dịch lên men để cung cấp
nguồn ni tơ cho vi khuẩn hoạt động. Các hợp chất khoáng thường được sứ
dụng trong quá trìn h sản xuất bao gồm:
KH 2P 0 4 0,1 - 0 ,2 %
M gS0 4.7H20 0,03 - 0,3%

M nS0 4.4H20 0 ,001 %

Dùng C a C 0 3 để giữ pH 6,8 - 7,8
N hiệt độ cho quá trìn h lên men nẻn duy trì ở 30 - 32° c.
Thời gian lên men khoảng 2 - 3 ngày tùy theo khả năng p hát triển và
tổng hợp axit glutamic của từng chủng vi sinh vật.
Oxy phải được cung cấp thường xuyên. Lượng oxy cần cung cấp theo
liều lượng 40 - 90 mg 0 2/ l lít môi trường/phút.
Trong sản xu ất axit glutamic người ta thường tiến hành quá trìn h lên
men theo chu kỳ vì yèu cầu tuyệt đôi vô trùng của sản xuât.
d) Làm sạch axit glutamic
Trong quá trình Lên men, axit glutamic được thoát từ tế bào vào môi
trường nuôi cây. Vi vậy việc thu nhận axit glutamic chủ yếulà từ môi
trường sau khi lên men.
Dung dịch lên men, sau khi kết thúc quá trình lên men, thường chứa
từ 60 - 120g/l axit glutamic. Dung dịch này, ngoài lượng axit glutamic, còn
chứa rấ t nhiều axit am in khác, cung như các thành phần môi trường chưa
lên men hết. Do đó việc tách axit glutamic và tinh chế chúng là điều phải
làm trong quá trìn h sản xuất.
Hiện nay có nhiều phương pháp kết tinh axit glutamic từ dung dịch
nuôi cấy. Các phương pháp đó như sau:
* Phương pháp điểm đẳng điện.
* Phương pháp tạo hydrochloxit của axit glutamic.
* Phương p háp d ùng dung m ôi hữu cơ.
* Phương pháp trao đổi ion.
* Phương p háp ch u yển a x it glu tam ic th à n h các m uối k im loại.
350 CHƯƠNG 9

* Phương pháp điện thẩm tích.

Trong các phương pháp nêu trên, có hai phương pháp được ứng dụng
trong sản xuất hơn cả. Đó là phương pháp tạo hydrochlorit của axit
glutamic và phương pháp điểm đẳng điện.
Trong những nàm 70 của th ế kỷ XX, phương pháp thường tạo
hydrochlorit của axit glutamic được sử dụng để tách axit glutamic rấ t rộng
rãi. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là sử dụng nhiều th iết bị
chịu axit và chịu kiềm, gây ô nhiễm môi trường rấ t nặng nề, đặc biệt là giá
th àn h sản phẩm thường rấ t cao, do vậy hiện nay trên th ế giới rấ t ít nhà
máy sản xuât theo phương pháp này mà phương pháp điểm đẳng điện được
áp dụng nhiều. Phương pháp điểm đẳng điện được thực hiện như sau:
- Dịch sau lên men được cô đặc ở nhiệt độ 50 - 60° c để làm tăng hàm
lượng axit glutamic có trong dịch lên men và để trá n h chi phí cho nhừng
công đoạn sau.
- Dung dịch sau khi cô đặc đến 1/3 - 1/2 dung tích ban đầu, sau đó được
đem đi tẩy màu bằng than hoạt tính.
- Dung dịch sau khi đã tẩy màu được điều chỉnh pH đến 3,2 để kết
tinh axit glutamic bằng HC1.
- Tiến h à n h kết tinh axit glutamic trong điều kiện lạnh.
- Sau khi axit glutamic dã được kết tinh, người ta tiến hành ly tâm để
thu tinh thể axit glutamic. Nước qua ly tâm dùng làm phân bón hay dùng
làm thực phẩm gia súc.
Trong rấ t nhiều trường hợp (nhất là khi sản xuất sử dụng m ật ri làm
nguyên liệu), tinh thể không được sạch mà còn nhiều chât màu bám vào.
Nếu gạp trường hợp này, ta nên hòa axit glutamic lại và đem tẩy màu rồi
kết tinh lại lần nừa. Khi đó ta sẽ thu được tinh th ể axit glutamic sạch.
Phương pháp này dề thực hiện, song hiệu suất thu nhận axit glutamic
chỉ đạt khoảng 60%.
e) Sản xuất bột ngọt (glutamat natri)
Người ta sản xuất bột ngọt (glutamat natri) từ axit glutamic. Phương
pháp này thực hiện rấ t đơn giản như sau:
* Người ta dùng axit glutamic tin h th ể vừa nhận được sau khi tin h chế
như phần trình bày trên, hòa vào nước.
* Dung dịch chứa axit glutamic được tẩy màu một lần nữa. Trước đó,
CỒNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT AMIN 351

người ta điều chinh pH bằng NaCOg hoặc NaOH đến 6,8 - 7,0. Tiếp đó là
công đoạn khử sắt.
* Toàn bộ dung dịch axit glutamic đã khử sắt và tay màu được cô đặc ơ
điều kiện c h â n không 600 mm thùy ngân cho đến khi đạt được 30,2 -
30.5°Bé. Tiếp đó, người ta cho tinh thẻ glutamat natri vào làm mầm và cô
đặc tiếp đến 31 - 31,8 Bé. Trong thời gian này glutamat natri sẽ tạo thành
tinh thề và người ta tiến hành ly tâm để thu nhận tinh thể. Hiệu suất thu
nhận gỉutam at n atri theo phương pháp này đạt 75 - 80c/c, độ tinh sạch của
glutamat n atri là 98%.
9 .2 .2 C ô n g n g h ệ s ả n x u ấ t ly z in
Lyzin là một axit amin có chứa hai nhóm (-NH.;) và mộtnhóm
(-COOH). Chúng có công thức hóa học như sau:
CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CH - COOH
nh2 nh2
Lyzin là một loại axit amin rấ t cần cho hoạt động sông của người và
động vật (chúng thuộc loại axit amin không thay thế).
Cơ thể người và động vật thiếu lyzin cơ thể sẽ không hoạt động bình
thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm
lớn, trí tuệ phát triển kém. Chính vì th ế lyzin là một loại axit amin thường
được đưa thêm vào khẩu phần ăn của trẻ em và của gia súc.
1-Vi sinh vật tham gia tổng hợp lyzin
Trong thiên nhiên, có nhiếu vi sinh vật có khả năng sinh tống hợp
lyzin, nhưng số chửng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp thừa lyzin có
thể sứ dụng để sản xuất theo qui mô công nghiệp không nhiều. Trong sản
xuất công nghiệp, người ta thường dùng nhừng chủng vi khuẩn đột biến đế
sản xuất ly zin. Các chúng vi khuẩn được sứ dụng nhiều trong cồng nghiệp
bao gồm:
Micrococcus gỉutamicum
Breưỉbacterium flavum
Brevibacterium lactofermentum
Corynebacterium acetophiỉum
T ất cả các chủng vi khuẩn trên đều cần homoserin để phát triển và
sinh tổng hợp lyzin.
Khi cho homoserin vào tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra methionin và
treonin. Do đó ta có th ể cho treonin và methionin thay homoserin vào môi
352 CHƯƠNG 9

trường lên m e n cũng đảm bảo quá trình lên men xáy ra mạnh.
Trong quá trìn h tổng hợp, lyzin được tạo th àn h ảnh hương rấ t lớn đến
enzvm aspactokinase, không ức chê enzyin dehydrogenatsyntetase.
Trong sản xuất, người ta thường sử dụng cao ngô như là nguồn trionin
và methionin. Ngoài ra, người ta CÒI1 sử dụng nước chiết cá, nước chiết nấm
men, nước chiết đậu nành, dịch thủy phân cazein như nhừng nguồn nitơ
hữu cơ hừu hiệu.
2 - Cơ chế sinh tổng hợp lyzin
Điểm quan trọng trong cơ chẻ sinh tổng hợp lyzin của vi khuẩn là
lyzin được tổng hợp cùng với met-hỉonin, treonin đều xuất phát từ một chát
chung, đó là chât Aspactat - p - semialđehyđ. Quá trình tổng hợp xảy ra
theo sơ đồ sau:
Glucose

ị ------- Con đường EMP

Piruvat __

Ị @
Oxalaxetat

ị
Aspactat

[;
\\ - Aspartyl - photphat

ị
Aspactat - ị3 - sinialdehyd

Từ sơ đồ trên cho ta một nhận xét cần quan tâm : muôn vi khuẩn tạo
ra nhiều lyzin th ì sự chuyến hóa phải theo nhánh (3 ). Ở đây, các chủng đột
biên m ât enzym homoserin dehydrogenase, do đó sẽ không tạo ra treonin.
M ặt khác, enzym dihydropicolinatsyntetase không mẫn cảm dị lập th ể nên
sự ức chế không còn. Kết quả là lyzin sẽ được tổng hợp thừa.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT AXIT AMIN 353

3- Công nghệ sản xuất lyzin

Môi trường
a) Nguồn hydratcacbon
Các giông vi khuấn tham gia tống hợp lyzin đều có khá năng đồng hóa
glucose, fructose, maltose, saccharose. Chúng không có khá năng đồng hóa
lactose, rafmose, pentose.
Trong quá trình lẻn men, người ta thường chuẩn bị môi trường có nồng
độ đường khoảng 10 - 12c/c. Trong thực tế sản xuất, người ta thường sử dụng
dung dịch đường từ quá trình thủy phân bột ngô, bột sắn. Ngoài ra người ta
còn sử dụng cả m ật rỉ.
b) Nguồn nỉtơ
Nguồn nitơ thường được sử dụng trong sản xuất là urea, các loại muối
amon hoặc nước amoniac.
c) Nguồn muối khoáng
Muối khoáng được sứ clụng nhiều nhât là các dạng muôi photpho. Nồng
độ photpho thích hợp là 0,008 - 0,02 mg/1.
Ngoài muôi photpho ra, trong sản xuất, người ta phái bổ sung thêm
MgS0 4.7H90 với hàm lượng 0,03 - 0,5c/c.
Đ iểu k iện lên men
* Nhiệt độ trong quá trình lên men duy trì ờ 28 - 30° c.
' pH trong quá trình lên men duy trì df 7,0 - 7,6.
* Quá trình lên men phái được thực hiện trong các thiêt bị lên men có
cánh khuấy và thổi khí liên tục.
Trong suốt quá trình lẽn men xảy ra hai pha rát rõ rệt:
* Pha tạo thành sinh khôi
* Pha tạo thành lyzin
Sự tạo thành sinh khối ở pha đầu tiên, thường xảy ra rất m ạnh trong
thời gian từ 12 - 18 giờ sau khi bắt đầu nuôi cấy. Sau đó tốc độ tạo thành
sinh khỏi sẽ chậm lại.
Trong thời gian tốc độ tạo thành sinh khôi bắt đầu giảm, hàm lượng
lyzin được tổng hợp bắt đầu tăng dần. Pha tạo lyzin kéo dài khoảng 40 giờ
đến 60 giờ.
Năng suất lyzin sau khi lên men đạt từ 50 - 60 g/1.
Thu nhận và làm sạch lyzin
Sau khi lên men, nồng độ chất khò trong dịch lên men vào khoảng
10 - 13%. Dịch sau khi lên men rấ t dễ bị hỏng do quá trình tự phân củs vi
khuẩn và do quá trình dễ bị nhiễm bởi các vi sinh vật khác. Do đó, người
ta thường giải quyết theo hai cách sau:
* Đem dịch sau lên men đi thu nhận và tinh chê lyzin ngay
354 CHƯƠNG 9

* Dùng HC1 axit hóa dung dịch lên men (đưa pH dung dịch lên men
đến 5 là vừa). Đồng thời, người ta bố sung m etabisulíĩt n atri với liều lượng
0,4% so với dịch lên men đê bảo quản dung dịch lên men.
Quá trình thu nhận Iyzin tiếp tục được thực hiện như sau:
Dung dịch lên men được bơm vào nồi cô chân không, tiến hành cô cho
đến khi nồng độ chất khồ trong dịch đạt tới 35 - 40%. Ta thu được chế
phẩm thô đầu tiên. Chế phẩm này có chứa khoảng 15 - 20% lyzin ở dạng
monochlohydrat, 15 - 17% protein, 4% axit amin, 10 - 13% betain, 20 - 25%
tro và các thành phần dinh dưởng khác. Ta có thể sử dụng ngay chế phẩm
này cho chăn nuôi gia súc.
Dạng chế phẩm này chỉ có thế’ bảo quản để sử dụng dần trong thời
gian khoảng 4 tháng. Do đó, muốn bảo quản lâu hơn, người ta phải tạo ra
những sản phẩm có độ ẩm thấp.
Cách làm dễ nhất là dùng một loại chất độn nào đó trộn vào đung dịch
đã cô đặc trên, sau đó đem sây khô để được dạng bột hoặc ép th àn h viên
sau đó mới sây, ta sè được sản phẩm dạng viên. Các châ't độn thường được
sử dụng là bột xương, bột ngũ cốc.
Một cách khác .được nhiều nhà máy hiện đại đang thực hiện là đưa
dịch đả cô đặc đem sấy phun. Cách làm này cho ta sản phẩm có hàm lượng
lyzin rấ t cao và độ ẩm giảm râ't nhanh. Độ ẩm cuối cùng của loại sản phẩm
này khoảng 5 -6 % .
Để thu nhận được lyzin tinh khiết ở dạng kết tinh người ta thực hiện
các bước như sau:
Dịch lên men được tiến hành ly tâm để loại bỏ sinh khối và các thành
phần không tan. DỊ ch sau ly tâm sẽ được đưa qua hệ thống trao đổi ion
cationit. Sau đó cột được rửa nhiều lần cho h ết màu và tiến hành quá trình
nhẩ hấp phụ bằng 0,5 - 5% dung dịch amoniac.
Đun nóng dung dịch chứa lyzin để đuổi amoniac. Sau đó dùng HC1 hạ
pH của dung dịch xuống đến 4,9 - 5. Tiến hành cô chân không để nồng độ
chất khô trong dung dịch đ ạt được 30 - 50%.
Dưới tác dụng HC1 (dùng trong khi hạ pH dung dịch), lyzin sẽ chuyển
sang dạng monochlohydrat lyzin.
Tiến hành làm lạnh toàn bộ đến nhiệt độ 10 - 12°c . Khi đó thấy xuất
hiện những tinh thể có màu vàng nhạt. Người ta tiến hành ly tâm để thu
nhận tin h thể. Dịch sau ly tâm sẽ tái k ết tinh để thu nhận triệ t để lyzin có
trong dịch lên men.
Muôn tinh th ể sạch hơn, người ta hòa tan tinh thể trong cồn và lại kết
tinh lại. Làm đi làm lại nhiều lần như vậy ta sẽ có tinh th ể sạch. Lyzin
tinh khiêt có độ sạch 97%, độ ẩm 0,5%, tro 0,3% được dùng trong thực
phẩm và trong y học.
 Chương 10
CÔNG NGHỆ SẢN XUAT v i t a m i n
Vitamin là một chất hữu cơ khồng cung cấp năng lượng cho tế bào
trong quá trìn h phát triền của tế bào. Tuy nhiên, vai trò của vitamin đốì
với tế bào lại rấ t lớn: vitamin thúc đẩy các quá trìn h trao đổi chất và là
thành phần không thề thiếu được trong cấu tạo của nhiều loại enzym. Do
đó, việc nghiên cứu, sản xuất vitamin trở nên rấ t cần thiết. Sau chiến
tranh th ế giới lần thứ hai, vitamin được sản xuất râ't nhiều và từ đó đến
nay vitamin được sử dụng chủ yếu ồ ba lĩnh vực:
* Y học
* Thực phẩm cho người
* Thức ăn gia súc
Các nhà khoa học đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau trong
công nghệ sản xuất vitamin. Các phương pháp đó bao gồm:
* Chiết rú t từ nguồn nguyên liệu thực vật và độiig vật
* Tổng hợp hóa học
* Tổng hợp sinh học
Cả ba phương pháp đều có những ưu và nhưựr điểm riêng. Mổi phương
pháp cho ra những vitamin riêng. Do đó. để san xuât các vitamin từ các
nguồn nguyên liệu và phương pháp khác nhau, người ta thường nhắm vào
hiệu quả của phương pháp, trong đò giá thành đÓQịí vai trò quan trọng cho
việc quyết định phương pháp sản xuát.
Công nghệ sản xuất vitamin theo phưưng }>háp sinh học chỉ tập trang
vào một sô' vitam in đặc trưng và cổ hiệu quả nhất. Cúc vitamin được sản
xuất nhiều bằng phương pháp sinh học bao lỊồni vitamin B ^. vitamin B2 ,
h ỗn hợp v ita m in D 2 và v ita m iu nhói ti B.

Ngoài ra, các nhà khoa học còn đưa ra phương pháp két hợp hí'>a học
và sinh h ọc để sản xuất vitamin c .

10.1 CỐNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12

Năm 1955 là năin đánh dùu sự hiểu biết về cấu tạo hóạ hoc oỉa

m
356 CHƯƠNG 10

vitam in B12. Vitamin B12 có ý nghĩa rấ t quan trọng trong quá trìn h trao
đối chất: nếu thiếu hoặc không đủ vitamin B 12 trong cơ thế con người và
động vật sẽ gây ra hiện tượng rối loạn trao đổi chất nydratcacbon và axit
béo.
Vitamin B I2 tham gia vào việc sinh tổng hợp enzym metyl malomye-
CoA-mutase và rấ t nhiều enzym quan trọng khác. Các enzym này tham gia
vào các phản ứng chuyển metyl và quá trìn h tổng hợp methionin, colin,
timin.
Ngoài ra, vitam in B 12 tham gia vào việc đảm bảo hoạt động của các cơ
quan tạo ra máu và làm tăng cường các phản ứng bảo vệ cơ thể. Thiếu
vitamin sê dẫn tới sự thóai hóa mỡ ở gan.
Cùng với methionin, vitamin B12 tham gia vào quá trìn h trao đổi
nhóm metyl. Vitamin B 12 giúp cơ thế tổng hợp m ethionin từ homosistein.

10.1.1 Cấu tạo hóa học và tính ch ât của Bt2

5, 6 - dimetylbenzylmidazot

HX c ' c\
H3C - c v c -N
CH

I
CH -CH3
1
CH, =
NHpCO . CH
CH2 CH? I CH3 (
CH, . CHpCONH
CH; CH c ' \ỵ
^CH c Q N ^CHCH2.CONH2
CH Z- Ị C - CH
CH xc'ó© .CH,
\ C -N cI \n n - C
CH,
/ ^ 11 \ \ /
NH2CO . ch 2 . ch 2 - CH BC CH A c
\ W \ / \ ...........
ỵO C CH CH.CONH2
nh 2c o . ch 2 ch 3 c h 3 c h 2- ch 2. conh 2

Hình 10.1: Cấu trúc vitamin B12

* Vitamin B 12 có công thức hóa học là C63H 90N 14O14PCc
* Vitamin B12 thường ở dạng kết tinh, có kích thước rấ t nhỏ, màu sẫm
đỏ, không có mùi và vị.
* Vitamin B 12 hòa tan trong nước, trong các dung dịch trung tính,
trong cồn.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẴT VITAMIN 357
\
* Vitamin B12 không hòa tan trong eter, acetol, benzen, clorofoc.
* Vitamin Bị* bền nhiệt khi chúng ở dạng xiamit
* Vitamin B12, khi tiếp xúc với kim loại nặng, rấ t dễ m ất hoạt tính.
Chúng không bền trong pH kiềm.
Vitamin B 12 có trong gan và ở các bộ phận khác của động vật, nhưng
lại không thấy chúng có m ặt ở các tổ chức thực vật bậc cao.
Cấu trúc hóa học của vitamin B 12 như hình sau.
10.1.2 Vỉ sỉnh v ậ t tham gia sỉn h tổng hợp vitam in Đ12
COOH
COOH COOH OOH
V H2 \
Ộh 2 CH2 ĩ° 2
<pooi>H <pH
Òh 2
ĩ CH
Ò0 -S .C 0A \ ộh 2
1 I I
Xucxinyl-CoA 1—► c1= o — 0=0 — C ộ
ĩ H ,0 tl
C
I
+ Ị CH-NHL òh- nh2 CH
1
c h 2- n h 2 //
COOH /
CH: H
I
COOH NH-
Glyxin Axit í<-Amino Axit ò-Amino-levulic Pocphobilinnogen
Ịl-ketoodipic . ^Kêthợp4vòng
— pyrol với sự
loại amin
Hệ tbỏng vòng corin
— Gân coban
S -+— Axit hóa nhóm cacbonxyl và gắn nhóm
1 Amino 2-Propanol (từ Treonin)
------ 3' Photphoribofuronoza

/_ Thay thế 5'Dexoxyodemozyl va vị trí Co

/- Thay thế 5 .6-Dimetyl-Ben 2ylmídazol
Xù lý khi có mật CN

H?N-OC~H?C -C H ?hLC
1 / CH3
1 1 r' LJ -uw-nn2
h ,n- o c h ?c 7 — c h 2- c h 2- c o - n h 2
H ,c

H N - O C - H ^ C - H jC

H ,c C H 3IC H 3 c h 2- c h 3- c o - n h 2
ch 3

HC-CH , J Ỵ V

\ /° N ^^C H ,

HQ -CH ' Vitamin B12(Xyanocobanlamin)

Hình 10.2: Quá trình sinh tổng hợp B12 từ xucxỉnyỉ và gỉyxỉn
358 CHƯƠNG 10

Quá trìn h sinh tổng hợp vitamin B12 là một quá trìn h rấ t phức tạp,
trải qua rấ t nhiều giai đoạn khác nhau nhờ sự tham gia của rấ t nhiều loại
enzym khác nhau.
Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 bắt đầu bằng sự tạo th àn h các
porphinin, sau đó là gắn nucleotat và các thành phần khác vào.
Porphinin của vitamin B12 khác với porphinin của xitocrom, clorofin ở
chỗ nó chứa rấ t nhiều nhóm - CH2 CH2COOH và CHg
Côban trong cấu tạo vitamin B12được gắn vào bằng ba hóa trị thông
thường và ba hóa trị phụ. Côban tạo màu đỏ cho vitamin Br?
Sự tạo th àn h porphirin bắt đầu từ xucxinat (đây là sản phẩm trung
gian của chu trìn h Krebs). Dẫn xuất của axit xucxinic ià xucxinyì-CoA sẽ
kết hợp với glyxin và tạo thành chu trình xucxinat-glyxin. Từ đó porphirin
được tạo th àn h trên cơ sở axit-a-amino-p-xetoadipic sinh ra được khử
cacboxyl th àn h monopyrol porphobilinogen
Tham gia quá trình sinh tổng hợp vitamin B]2 có rấ t nhiều vi sinh
vật khác nhau.
a) Vi khuẩn Propionibacterium
Trong các giống vi khuẩn tham gia tổng hợp vitamin Br2 có giống
Propionibacterium sherm anii là giống có nhiều ưu điểm n h ât và có thê đưa
vào sản xuất công nghiệp. Vi khuẩn này có một số đặc điểm quan trọng
được tóm tắ t như sau:
* Là trực khuẩn, có kích thước nhỏ
* Trong thiên nhiên chúng thường xếp th àn h từng đôi hoặc từng chuỗi
ngắn.
* Chúng thuộc loại hiếu khí tùy tiện
* Chúng có khả năng lên men axit lactic, glycerol, glucose, fructose,
m anit, lactose,
* Khoảng pH hoạt động 4,5 - 7,5; pH tối ưu cho việc sinh tổng hợp B12
là 5,8 - 7,5.
* Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B 12 là 28 - 30° c
* Các chất dinh dưỡng cho sự phát triển bao gồm muối amon, nước
amoniac, C0C12 hoặc C0(N 03)2 ; các kim loại như Fe, Cu* Zn, Mn thường
làm giảm quá trình sinh tổng hợp B 12
* Các vitam in làm tăng hiệu suất tổng hợp B12 bao gồm tiam in, biotin,
axit nicotinic, axit tolic
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN 359

b) Xạ khuẩn Actinomyces
Trong các giống thuộc actinomyces có giống Actinomyces olivacens có
khả năng tổng hợp vitamin B12 cao hơn cả và chúng được sử đụng để sản
xuất vitam in B 12 theo qui mô công nghiệp. Một sô' đặc điểm quan trọng của
giông xạ khuẩn này được tóm tắ t như sau:
* Xạ khuẩn Act. Olivacens thuộc loại hiếu khí
* Chúng phát triển mạnh và sinh nhiều vitamin B12 trong môi trường
chứa glucose, tinh bột, m ật rỉ, bã rượu. Trong thành phần môi trường này
cần cho thêm các muôi amon, muôi coban và CaC0 3
* Sinh tổng hợp vitamin B 12 chỉ xảy ra mạnh sau 24 giờ nuôi cây.
* Trong quá trình lên men, xạ khuẩn tạo ra hai pha rấ t rõ rệt:
- Pha tạo thành sinh khôi
- Pha tạo th àn h vitamin B12
Thường pha tạo thành vitamin B 12 chỉ mạnh khi kết thúc quá trìn h
tăng sinh khốỉ.
* pH ban đầu môi trường nên điều chỉnh vào khoảng 7. ơ pha thứ
nhất pH sẽ giảm xuống khoảng 6,5 và bước sang pha thứ 2 pH sẻ tăng dần
lên 8,2 - 8,7
* Thổi khí có ảnh hưởng rấ t lđn đến sự tổng hợp vitamin Bl2, do đó
trong quá trìn h lên men bắt buộc phải thổi khí mạnh.
* N hiệt độ cho sự phát triển và sinh tổng hợp vitamin B 12 là
28-30°C
* Thời gian lên men là 60 - 120 giỏ (trung bình là 60 - 96 giờ)
c) Vi khuẩn sinh metan
Trong thiên nhiên có rấ t nhiều vi sinh vật tham gia lần lượt nhiều
phản ứng tạo ra khí metan. Khí metan là loại khí có th ể đôt được, đồng
thời nó là loại khí tạo ra hiện tượng hiệu ứng nhà kính lớn nhất. Cùng với
sự tạo thành khí metan, vi sinh vật còn tổng hợp được sô' lượng vitam in
B^2 lơn. /
Đặc điểm chung của vi khuẩn sinh khí metan được tóm tắ t như sau:
* Chúng thuộc vi khuẩn gram (-)
* Chủng không chuyển động
* Chúng không tạo bào tử
* Chúng thuộc loại kỵ khí b ắt buộc
 360 CHƯƠNG 10

10.1.3 C ông n g h ệ sả n x u ấ t
2« Giữ giống
Hiện nay người ta sản xuất vitamin theo qui mô công nghiệp
thường sử dụng chủng Prop. shennanii. Chung này thường được giữ giông
trong môi trường thạch nghiêng với glucose, KHoPOj. (N H t ).>SO.j. Trong
môi trường, người ta cho thêm cao ngó hoặc nước chiết trái cnv, nuôi vi
k h u ấ n ó’ đ i ề u k i ệ n n h i ệ t độ 2 8 - 3 2 ° c t r o n g t h ờ i g i a n 7 - 8 n g à v , v à s a u đó
bào quản lạnh, cấy truyền định kỳ mỗi tháng 1 lần.
2- Nhân giống cho sản xuất
Nhân giống cho sán xuất thường được thực hiện trong điều kiện kỵ khí
bắt buộc.
Môi trường cho nhân giống có lưựng dường ít hơn mỏi trường lên men,
còn các thành phán khác của môi trườag giỏng như môi trường lên men.
T r o n g môi t rư ờ n g , n g o à i t h à n h p h á n đ ường ra, người t a CÒ1Ì cho t h è m
c ác m u ố i a m o n . HƯỚC a m o n i a c , CoClo h o ặ c C o ( N O ;ị).)

Nhân giống là quá trình tăng dưng tích. (ìịch clìứa sinh khôi qua nhiều
cồp. Mồi cấp nhàn giống thường tăng (lung khối từ 10 - 15 lần. Cứ làm như
vậy cho đến khi toàn bộ dung tích đú đố tiến hành qua trình lén men.
Lưu ý là trong trường hợp không (lùng chung vi khuán Prop.
' Sherm anii đế san xuất vitamin B]9 , ta dùng xạ khuán hoặc các vi khuẩn
sinh m etan thi phai thay đối thành phần môi trường và (tiều kiện nuôi cấy.
Ví dụ, xạ chuán phái nuôi trong diều kiệỉi kỵ khí bắt buộc, còn vi khuẩn
sinh inetan lại nuôi trong điều kiện vốm khí bắt buộc.
3- Quá trình lên men
Đỏi với vi khuần Propĩonìbactcrium shcrmanii, quá trình lên men được
thực hiện ơ pH ban đầu của môi trường là 6,8 - 7. Trong quá trình lên men
phái điều chỉnh pH bằng NH4OH
Đôi với xạ khuẩn, pH ban đầu là 7. Trong quá trìn h lên men ít khi
người ta điều chinh pH. Lượng vitamin Bp bắt đầu (lược tổng hợp mạnh ở
pha thứ hai. Khi đó pH sẽ tăng dần đến vùng kiềm yêu. Đối với các vi
khuấn sinh m ethan thường sữ^dụng inôi trường là các loại phế liệu trong
sán xuất cồn, bia, thậm chí cả bùn thối, việc điều chinh pH không cần đật
ra nhiều.
N hiệt độ lên men cho các vi khuẩn tống hợp B l0 thường nằm trong
khoáng 2 8 - 32° c .
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN 361

Thời gian lèn men thường là 5 - 7 ngày. Đối với xạ khuẩn thời gian
thường ngắn hơn các vi khuẩn. Dịch sau khi nuôi sè được iy tâm ớ máy ly
tâm cao tốc với tốc độ 10.000 vòng/phút. Sinh khối thu được đem sây khô
làm chê phầm thỏ cho gia súc, hoặc đem sinh khối chiết rút và tin h chế thu
nhận vitamin B 12 ■
Hiện nay trên thị trường có bán nhiều chế phẩm vitamin B Ị9 cùng
kháng sinh tetracycline, clotetracyclin được mang tên thương mại là
BIOVIT, hocặc chê phám vitamin B 12 với tetram ixin được gọi tên thương
mại là TERAVIT hay OTC. Các chế phẩm Br> này được sứ dụng rộng rãi
trong chăn nuôi.

10.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RIBOFLAVIN (VITAMIN B2)

Lần đầu tiên vitamin B., được Kulm chiết tách từ trứng vào năm 1933.
Lúc đầu ông đặt tẻn là ovoflavin. Sau đó các nhà khoa học Booher,
Ellinger, Koschara tách được riboflavin từ cazein. Vitamin B.2 CÒ11 có một
sô tên khác như iactoílavin. Tên này hiện nay không dùng nửa.
Công thức hóa học cũa riboflavin là C 17H.j0N 4Og.
Trong câu trúc hóa học ciia riboflavin, người ta thây có ba nhãn
izoaloxazine và 1 đường ribose. Câu trúc cúa riboflavin như sau:
CH2OH
HO - CH

HO - CH
HO - CH

H , 2
c r Nr N

H3C“Cf l l T =0
u N c =0
Riboflavin có phàn tử lượng là 376, tinh thể nhỏ. hình kim, màu vàng;
điềm nóng chảy của riboflavin là 292°c. Riboflavin có vị đắng, có khả
năng tan trong nước và các loại dung môi.
Riboflavin ổn định ơ nhiệt độ thường, do đó râ t dề bảo quản.
Riboflavin tham gia vào th àn h phần của enzym flavinase
10.2.1 Vi s in h v ậ t th a m g ia s i n h t ổ n g h ợ p r ib o f la v in
Cà nấm sợi, vi khuẩn và nấm men đều tham gia tổng hợp riboflavin
362 CHƯƠNG 10

như Mycobacterium Sp. Clostridium sp. Mycocandida sp. Candida sp.

Ashbya Sp. Eremothecium sp, trong đó đáng chú ý n h ất là giông
Enemothecium ashbypii và Ashbya gossypii
1- E. ashbypii
* E. ashbypii tạo khuẩn ty phân nhánh, kích thưđc của khuẩn ty
2-*-4x60“ 80fim .
Khi còn non, khuẩn ty có màu trắng, về già khuẩn ty chuyến sang màu
vàng, khi chết màu vàng được thoát vào môi trường.
* E. ashbypii có khả năng đồng hóa glucose, saccharose, levulose,
manose.
* E. ashbypii có thế đồng hóa nguồn nitơ hữu co' và nguồn nitơ vô cơ,
trong đó nguồn nitơ từ cazlin và globulin có ý nghĩa rấ t lớn cho sự phát
triển của chúng. Các nhà khoa học tháy rằng gỉyxìn có ảnh hưởng rất lớn
đến sinh lý của chúng. Do đó, trong sản xuất người ta thường bố sung
glyxin vào trong môi trường lên men.
* E. ashbypii phát triển mạnh và tổng hợp nhiều vitamin B, nếu bổ
sung các chất kích thích sinh trưởng như tiainin, biotin, inozit.
Trong trường hợp môi trường thiếu nguồn cacbon từ hydratcacbon,
chúng có thể đồng hóa lipit để phát triển. Người ta thường bố suug
0,6 - 1 ,2 c/c dầu ngô trong quá trình lên men, Việc làm này tạo hiộu quả tổng
hợp vitamin rấ t rõ.
2- Ashbya gossypiỉ
- Ashbya gossypii cũng thuộc loại nấm tạo khuẩn ty phân nhánh giống
E. ashbypii.
- Ashbya gossypii có khả năng tạo bào tử. Sô' lượng bào tử khoang
4 - 32. Bào tử hình thoi, một đầu rấ t dài. Bào tử của chúng trông giống vi
khuấn Clostridium.
1 0 .2 .2 C ơ c h ê s i n h t ổ n g h ợ p v i t a m i n B 2
Sinh tổng hợp vitam in B 2 được bắt đầu từ chất guaninucleotid (Có thế
là GTP). Cơ chế này vẫn còn nhiều vấn đề chưa th ậ t sáng tỏ, ví dụ như quá
trìn h điều hòa, quá trìn h tổng hợp riboflavin...
Quá trình sinh tổng hợp riboflavin có sự tham gia của 4 loại enzym
quan trọng:
* GHT - cyclohydrơlase II
* Ảminohydrolasc
* Lumcizin syntctasc
* Riboflavin syntetạse
Quá trình này có thể biểu diễn theo H.10.3.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN 363

Guanoziotriphotphat (GTP)

OH

N r 2,5-Diamino-hydroxy-
h 2n /
^ n x nh 4-ribozylamino pyrimidin-
® - o - ch2 5-monophotphat

JTP
OH OH
\O H

2,5-Diamino-hydroxy-
h 2n ^
1 1C
n^ nh 4-ribo2ylamino-pyrimidin

2,6 dihydroxy-
5-amino-
pyrimidin

3 6,7-Dimetyl-
8-ribityl-
Ngưng tụ hai phân tủ Lumaxìn lumazin
vdi sự giải phỏng Pyrimidin

1- GHT-xyclohydrolaza II
o
HN^ CH;
2- Aminohydrolaza
NT- n a A ch.
3- lumazinsyntetaza Riboflavin
ch2
4- riboflavin syntetaza
(CHOH)3
(theo W.Fitche, 1978)
c h 2oh

H ìn h 10.3: Sinh tổng hợp riboflavin

1 0 .3 .3 C ô n g n g h ệ l ê n m e n
* Môi trường dùng trong sản xuất riboflavin có thành phần như sau:
364 CHƯƠNG 10

Saccharose 5%
Dịch thủy phân protein 3%
Phôi lúa mì 1%
Cao th ịt 0,3%
KH 2P 0 4 0,3%
NaCl 0,25%
pH ban đầu 6
* Giống được nhân ở một phân xưởng riêng. Lượng giống ban đầu đưa
vào là 1 - 1,5%
* N hiệt độ lên men là 28 - 30° c
* Điều kiện thối khí liên tục
* Thời gian lên men 7 ngày
Nếu bổ sung thêm chất béo, năng suất thu nhận riboflavin sẽ rấ t cao.
* Trong sản xuất riboflavin, người ta thường áp dụng phương pháp lên
men chìm.
Riboflavin được tổng hợp trong tê bào nâ'm và được thoát ra ngoài môi
trường nuôi cấy. Tuy nhiên không phải toàn bộ riboflavin thoát được ra môi
trường, trong tế bào còn khá nhiều riboflavin ...
Tỷ lệ riboflavin nội bào và ngoại bào phụ thuộc rấ t nhiều ở khả nàng
sinh trưởng của giông mà ta đưa vào sản xuất.
Sự thay đổi pH trong quá trình lên men khá phức tạp: hai ngày đầu pH
giảm rõ rệt, sau ngày thứ hai pH tăng nhanh cùng sự tạo thành riboflavin.
Khi tiến hành thổi khí sẽ tạo ra nhiều bọt. Người ta thường dùng 0,2'r dầu
đậu nành đế phá bọt. Năng suất lên men thường đạt từ 800 - 1700yml riboflavin.
Toàn bộ qui trìn h sản xuâ't ta có thế xem H.10.4.

Hình 10.4: Sơ đồ công nghệ sán xuất riboflavin

Dịch làm men được tiên hành cô chân khồng và sây th àn h phẩm bằng
th iết bị sấy hình trông. Sản phẩm sau sấy có độ ẩm < 8 %, đem đóng gói và
sừ dụng làm thực phẩm gia súc.
 Chương 11
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHAT
KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG
Có hai nhóm chất kích thích sinh trưởng do vi sinh vật tống hợp ra là
Auxin và Gebereỉia. Những chât này gộp chung lại là Phitohocmon.
Auxin là chát kích thích có nhiều ơ thực vật. Trong quá trình phát
triển, auxin kích thích quá trình phân chia tế bào, kích thích quá trình tạo
mô bào mới. Auxin còn được một sô' vi sinh vật tổng hợp.
Giberelin Ịà chất kích thích sinh trường dược tổng hợp bởi vi sinh vạt
và cá ở thực vật bậc cao. Tuy nhiên, việc sản xuất chất kích thích sinh
trương chủ yếu là từ vi sinh vật.

11.1 CẤU TẠO, TÍNH CHẤT CỦA GIBERELIN

11.1.1 Vài dò n g lịch sử

ở những nơi có truyền thông trồng lúa nước, thường thấy một bệnh rấ t
lạ: cây lúa nước phát triển mạnh, nhưng không được tạo hạt hoặc khá năng
tạo ra hạt rấ t kém. Thân lúa cao và chuyến màu rấ t nhanh.
Năm 1912, các nhà khoa học đà quan sát thây hiệa tượng lạ này và họ
bắt đầu quan tâm tìm hiểu, nhưng chưa đưa ra được kêt luận gì.
Mãi đến năm 1920 Kurosawa mới đưa ra một dự đoán: nấm sợi
Fusarium Sp. gây ra bệnh trên ở cây lúa. Năm 1926, ồng đà trích ỉy được
hỗn hợp chát từ nấm sợi này và nhiễm vào các cây lúa khác, thấy có hiện
tượng bệnh tương tự. Khi nghiên cứu tính chất của dịch chiết này, ông cho
rằng chúng râ't bền trong ánh sáng và có khả năng hấp thụ trên than hoạt
tính. Từ đó các nhà khoa học N hật Bản nghiên cứu rấ t kỹ dịch chiết này và
tách được chất đó ra, đặt tẽn cho chất này là giberelin. Như vậy, các nhà
khoa học N hật Bản là những người đầu tiên tìm ra giberelin và nghiên cứu
khá đầy đủ về giberelin.
Năm 1938 Yabuta và Summiki đã tách và kết tinh được giberelin ổ
hai dạng khác nhau và đặt tên cho chúng là giberelin A và geberelin B.
366 CHƯƠNG 11

Các nhà khoa học này cho thấy: chúng không chứa nitơ trong cấu tạo phân
tử, hòa tan rấ t kém trong nước. Ngược lại, chúng hòa tan rấ t tốt trong các
dung mồi hữu cơ.
Mãi đến 1950, các nhà khoa học Mỹ mới thực sự quan tâm đến những
công trìn h nghiên cứu của các nhà khoa học của Nhật. Cùng với các nhà
khoa học người Anh, họ tiến hành các nghiên cứu ảnh hưởng của giberelin
đến sinh lý cây trồng.
Sau đó, người Mỹ đ ặt k ế hoạch sản xuất giberelin theo qui mô công
nghiệp với khả năng tổng hợp ban đầu ià 20g/l giberelin. Họ đã p h át hiện
ra một loại giberelin mới và đặt tên là giberelin X ị .
Từ những nghiên cứu ban đầu đó, từ năm 1950 của th ế kỷ trước đến
nay, người ta đã tách được hơn 30 loại giberelin khác nhau.
Trong số những giberelin trên có hai loại giberelin có ý nghía lớn đến
sinh lý cây trồng đó là giberelin A3 (hay giberelin X)

11.1.2 Cấu tạo và tính ch ất g ỉb ereỉin

Đến nay người ta đã tìm thấy trên 30 loại giberelin khác nhau. Trong
đó:
* Fusarium moniforme tổng hợp các giberelin
A‘2 » A10 - A15, A24 và A25
* Thực v ậ t bậc cao tổng hợp ra các giberelin
-^5 > ^ 6 > Ag , A 16 —A 2 3 , A26 “ A 3 2
* Fusarium moniforme và thực vật bậc cao đều có khả n ă n g tổ n g hợp
giberelin

Ngày nay, người ta đă biết được toàn bộ cấu trúc của 38 loại giberelin
và người ta quan tâm đặc biệt đến loại giberelin A3 .
Công thức câu tạo của giberelin A3 như sau:

H — OH

CH2
CH3 COOH
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẤT KÍCH THÍCH 367

Giberelin Ag là chất ở dạng kết tinh màu trắng, không bay hơi, có
nhóm cacboxyi, hydrocyl (nhóm phân cực), metyl, metylen (nhóm không
phân cực).
Giberelen A 3 hòa tan trong các dung môi như metanol, etanol,
butanol, propanol, hòa tail trong axitol, cyclophitanol, cyclohexanol và hòa
tan trong các este.
Giberelin A3 hòa tan kém trong nước, butylaxetat, clorofoc etesulfuric.
Tuy nhiên muôi của chúng lại hòa tan hoàn toàn trong nước.
* Cơ chế tổng hợp giberelin
Tuy có cấu tạo hóa học khác nhau, nhưng tấ t cả các giberelin đều có
chung cách tổng hợp. Quá trình tổng hợp giberelin đều trả i qua 3 giai đoạn.
Giai đoạn đầu tiên
Giai đoạn đầu tạo ra tecpen gồm 4 vòng, chất này được gọi ià cauren
từ axetat.
Giai đoạn thứ hai
Từ cauren sẽ được chuyển th àn h c20 gọi là giban.
Giai đoạn thứ ba
Giai đoạn chuyển giberelin 20 sang giberelin 19. Thực ra quá trình xảy ra
rất phức tạp. Toàn bộ quá trình tổng hợp này đi theo sơ đồ sau:

Axetat
T.
Mevoỉonolacton
T
Farnezylpino photphat

Geranylgeranỳl pinophotphat

Lapdadrenolpino photphat
I
Pimaradien
7
Cauren
X ,
Caurenol

r.
Cau renal

! ,
Axit cạurenic
ị
Axit oxy caurenic

7 C Z
Gibanaldehyt
c20- giberelin Ai4
c 19-giberelm
368 CHƯƠNG 11

11.3 VI SINH VẬT TỔNG HỢP GIBERELIN

Gibcrelin được hai chủng nấm sợi Fusarium là Fusarium moniforme và
Fiisariuni oxy sporuni tống hợp, trong đó chủng Fusarium moniforme được
sử dụng trong sản xuất gìbcrclin nhiều hơn. Đặc điểm ciìa chủng này như
sau:
* Chúng thuộc nấm bất toàn
* Chúng sinh sản bằng bào tử.
Chúng có khả năng tạo kháng sinh.
* Chúng có khả năng tạo ra chất ức chế thực vật (axitfusaric)
* Chúng rấ t dễ phát triển trong những môitrường tổng hợp không cần
đến chất kích thích sinh trương
pH tỏi ưu cho chúng phát triển là 5,0 - 5,4
* Nhiệt độ tối Ưu cho chúng phát triển là 26 - 28°c
Phương pháp báo quản giông tốt nhất là cây chúng vàokê hoặc gạo.
Nếu báo quan trong ống thạch nghiêng cấy truyền, chúng thường giảm khả
năng sinh tổng hợp rấ t mạnh.
* Chúng đồng hóa rất tô't các loại đường như glucose, saccharose, tinh
bột, glyxeril, dầu thực vật.
* Các nguồn dinh dưỡng nitơ thích hợp cho chúng phát triển là các
Iiìuõi nmon, các loại nitrat, củng như các Iiguồn hữu cơ chứa uitơ.

11.4 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT GIBERELIN

11.4.1 M ô i tr ư ờ n g

Môi trường dùng trong sản xuất giberelin thường được sử dụng là môi
trường Rolen - Tom. Môi trường này có thàn h phần như sau:
Saccharose: 40 - 60 g/1
T actarat ainon: 7 g /l
k h 2p o 4 2 g/l
M gS0 4.7H20 0,2 g/1
k 2s o 4 0,2 g/1
pH điều chỉnh tới 5,5
Trong khi lẻn men, người ta thường bố sung 0 ,5 % cao ngô và hỗn hợp
vi lượng sẽ làm tăng khả năng sinh tổng hợp giberelin.
Môi trường Rolen - Tom được dùng khi tiến hành lèn men theo phương
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẤT KÍCH THÍCH 369

pháp chìm.
Môi trường cám có bố sung một ít vi lượng được dùng lên men theo
phương pháp bề mặt.
11 .4 .2 P h ư ơ n g p h á p l ê n m e n

2* Phương pháp lên men bể mặt

Người ta thường sử dụng môi trường cám và bố' sung 0,5 cao ngó,
0 ,01 % hỗn hợp vi lượng để sản xuất giberelin theo phương pháp bề mặt.
Theo phương pháp này, các loại nguyên liệu dùng làm môi trường được
ghi ở trên được phôi trộn và điều chỉnh độ ẩm đến 55 - 60%, phân phôi vào
các bình tam giác có dung tích 1000 - 2000 ml. Lượng môi trường cho vào
đây khoảng 80 - 100 gam.
Môi trường được hấp thanh trùng ờ la t trong 30 phút. Làm nguội môi
trường, sau đó trộn giông với tỷ lệ 0,3 - 0,57f. Nuôi ở nhiệt độ 28°c trong
3 - 4 ngày. Khi nấm Fusarium tạo nhiều bào tử, chúng được chuyền ra nuôi
ở trong các khay với môi trường tương tự.
Kết thúc quá trình nuôi, người ta thu nhận chế phẩm giberelin thỏ này
và đem sử dụng ngay bằng cách trích ly chúng bằng dung môi và thu nhận
được dung dịch có chứa giberelin.
2- Phương pháp lên men bề sâu
Trong phương pháp này, người ta sử dụng môi trường Rolen - Tom.
Môi trường được thanh trùng và được tiến hành quá trình lên men trong
các th iết bị lên men có cánh khuấy và hệ thống thôi khí.
Quá trìn h lên men thực hiện với những điều kiện kỷ thuật được tóm
tắ t như sau:
* N h iệ t độ lên m en 26 - 2 8 ° c
* pH duy trì ở 5,0 - 5,5
* Điều kiện khuấy trộn và thổi khí liên tục
* Thời gian lên men 160 - 190 giờ
Trong suốt quá trìn h lên men luôn luôn kiểm tra pH, vì pH thay đổi
rấ t nhanh ở giai đoạn đầu. Quá trình lên men giberelin là quá trình hai
pha rá t rõ rệt.
Pha đầu là pha tạo ra hệ sợi hay pha tăng sinh khối. Pha này thường
kéo dài 45 - 90 giờ đầu ciia quá trình lên men. Ở pha này, thấy lượng :hất
dinh dường giảm rấ t nhanh, pH đột nhiên tăng ỉên sau đó lại trở ỉại trạng
thái gần pH ban đầu. Cuối pha này giberelin thường đưực tạo ra rấ t Ít.
370 CHƯƠNG 11

Pha thứ hai, hệ sợi gần như không tăng, pH tăng nhanh. Trong pha
này, giberelin được tạo ra rấ t nhiều. Trong nhiều cơ sở sản xuât, người ta
thường bo sung nguồn cacbon trong pha này. Người ta cho thấy rằng không
nên cho đường vào giai đoạn đầu nhiều, nên bổ sung mồi ngày 1 - 2 lần với
mức 1 - 4c/c là tốt nhất.
Ở đây cũng cần lưu ý một điểm rấ t quan trọng là các chủng Fusarium
khác nhau thường có đặc điểm sinh lý rá t khác nhau, do đó trong quá trình
điều khiển lên men không bao giờ áp dụng điều kiện giông nhau, n hất là
yếu tô' thời gian.

11.5 LÀM SẠCH GIBERELIN

Làm sạch giberelin là quá trình thu nhận chúng ở dạng tinh khiết.
Dung dịch sau lên men (hay dung dịch chiết từ canh tường nuôi cây bề
mặt), được ly tâm để tách sinh khôi và những th àn h phần có kích thước
lớn, không tan, khỏi dung dịch. Dung dịch sau ly tâm đem đi làm sạch để
thu nhận giberelin.
Hiện nay có ba phương pháp làm sạch giberelin từ dịch nuôi cây:
* Phương pháp hâ'p thụ bằng than hoạt tính hay nhựa trao đổi ion.
* Phương pháp chiết bằng dung môi
* Phương pháp kết tủa từ dung dịch
Theo phương pháp hấp thụ bằng than hoạt tính thì dưng dịch sau ly
tâm đuợc điều chỉiih pH đến 3 - 3,5 đế than hoạt tính dễ dàng hấp thụ
giherelin. Sau đó người ta dùng axeton hoặc cồn để tiến hành quá trình
phản hấp thụ. Người ta thường dùng axeton 70% để phán hấp thụ cho hiệu
suất cao nhất. Dưng dịch giberelin thu nhận được từ quá trìn h phản hấp
thụ được đem đi lọc, cô đặc và chiết xuất bằng axetat etyl. Tiên hành cô
đặc tiếp dịch này sẽ thu được giberelin ồ dạng tinh thể. Theo phương pháp
chiết giberelin bằng dung môi, người ta thường dùng metylizobutylxeton,
butand và etylaxetat đế thu nhận giberelin. Phương pháp này khá đắt vì
phải sử dụng nhiều dung môi.
Theo phương pháp kết tủa, người ta thường dùng các ion sắt
(F e ++Fe+^+) trong môi trường axit (pH = 3 - 3,5) để kết tủa giberelin. Các
muôi sắ t có hiệu quả cao cho quá trìn h kết tủa là FeCl2, FeCl3 . Sản phẩm
cùa quá trình này là phức hợp sắt clorua với giberelin. Ta có th ể sử dụng
phức hợp này ngay hoặc dùng nó để tinh chế thu nhận giberelin sạch hơn.
 TÀ I LIỆU THAM KHẢO

Aiba s, Hemphrey A.E. and Millis N.F., Biochemical Engineering,

Second Edition. Academic Press, NewYork, 1973.
Beckwith. J., Gene Function in Prokaryote, Coldspring Harborlab, 1983.
Berlin J. and Saes F., Advances in biochemical engineering
Ị biotechnology. Vol. 3 Verlay, Heidelberg, 1985.
Lê Hgọc Tú, Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học Kỳ thuật,
Hà Nội, 1977.
Lương Đức Phẩm, Hồ xưởng vi sinh vật tổng hợp, Nhà xuất bản Khoa
học-Kỹ thuật, Hà Nội, 1978.
Monique L. G, Biotechnoỉogie, Principles et m ethods, Doin editeurs,
Paris, 1992.
Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ sinh học, N hà xuất bản Đại học Quốc
gia Tp.HCM, 2000.
René. Scriban, Biotechnologie, Tocdoc. Paris, 1993.
 CÔNG NGHỆ VI SINH TẬP 2
VI SINH VẬT HỌC CÔNG NGHIỆP
Nỵuyễn Đức Lượng

NHÀ XUẤT BẢN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP H ồ CHÍ MINH
03 Công trường Quốc tê, Q. 3, TP HCM
ĐT: 823 9170 - 823 9171 - Fax: 823 9172
Emaỉỉ: VNUHP^Fmail.vnn.vn
’fr -k 'ẩr

Chịu trách nhiệm xuất bản

NGUYỄN QUANG ĐlỂN

Biên tập

PHẠM THỊ ANH TÚ

Sửa bản in

TRẦN VĂN THẮNG

Trình bùv bìa

TRƯƠNG NGỌC TUẤN

.'í 500 cuôn, khổ 16 X 24. Giây phép xuất bản sò: 15/410/XB-QLXB
ti-> Cục Xuàt hán câp ntỉày 26/4/2ÍXX). Giây trích imang số: 267/KHXB
rỉ: ày 2 i /10/2002. In tại Xưởng in Dại học Bách khoa - Đại học Quôc gia
TI'. HCM. Nộp lưu chiểu thánii 11 nã ri 2(X)2.