VILNIAUS UNIVERSITETAS

VITA KIRILIAUSKAITĖ

BIOTECHNOLOGINĖS PASKIRTIES LIPAZIŲ TAIKYMO

IŠPLĖSTINIS TYRIMAS

Daktaro disertacija
Fiziniai mokslai, biochemija (04 P)

Vilnius, 2015 metai

Disertacija rengta 2010 – 2014 metais Vilniaus universiteto Gamtos mokslų fakulteto
Biochemijos ir molekulinės biologijos katedroje.

Moksliniai vadovai:

Prof. habil. dr. Benediktas Juodka (Vilniaus universitetas, fiziniai mokslai, biochemija –
04 P). Nuo 2010 10 01 iki 2012 12 27;
Dr. Vida Bendikienė (Vilniaus universitetas, fiziniai mokslai, biochemija – 04 P). Nuo
2012 12 28 iki 2014 09 30.

2
TURINYS
Santrumpų sąrašas............................................................................................................................4
Įvadas................................................................................................................................................5
1 Literatūros apžvalga....................................................................................................................8
1.1 Bendra lipazių charakteristika: šaltiniai, struktūra, stabilumas, komercinės lipazės..............8
1.2 Katalizinės lipazių savybės...................................................................................................20
1.3 Lipazių savitumas..................................................................................................................27
1.4 Netradicinės lipazių katalizuojamos reakcijos......................................................................32
1.5 Lipazių biotechnologinio pritaikymo galimybės..................................................................37
1.6 Biodyzelinas..........................................................................................................................41
1.7 Lipolizinio aktyvumo nustatymo metodai............................................................................64
2 Medžiagos ir metodai................................................................................................................66
2.1 Medžiagos.............................................................................................................................66
2.2 Baltymų kiekio nustatymas...................................................................................................68
2.3 Lipolizinio aktyvumo nustatymas.........................................................................................68
2.4 Kiekybinis laisvų riebalų rūgščių nustatymas titrimetrija.....................................................69
2.5 Plonasluoksnė chromatografija ir densitometrija..................................................................69
2.6 Biodyzelino sintezė ..............................................................................................................70
2.7 Oleino rūgšties ir trimetilolpropano esterių – biotepalų - sintezė ........................................72
2.8 β-Citronelolio esterių sintezė................................................................................................72
2.9 Vieną ar daugiau hidroksi- ir/ar karboksigrupių turinčių rūgščių esterinimas......................73
2.10 Muilo gamybos atliekų utilizavimo tyrimas.......................................................................73
3 Rezultatai ir jų aptarimas...........................................................................................................75
3.1 Biodyzelino sintezė: rapsų aliejaus transesterinimas............................................................77
3.1.1 Lipoprime 50T katalizuojamo rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu optimalių
sąlygų nustatymas....................................................................................................................78
3.1.2 Lipolase 100L katalizuojamas rapsų aliejaus transesterinimas metanoliu bei metil-
ir butilacetatais.........................................................................................................................88
3.1.3 Ektoino įtaka rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu eigai.........................................91
3.1.4 Naujų organinių tirpiklių - glikolio eterių - įtaka rapsų aliejaus transesterinimo
metanoliu eigai.........................................................................................................................97
3.2 Biotepalų sintezė: reakcijos, kai vienas iš substratų yra trimetilolpropanas ......................103
3.3 Įvairių biotechnologijai svarbių esterių sintezė...................................................................111
3.3.1 Skirtingų aliejų transesterinimas β-citroneloliu............................................................111
3.3.2 Vieną ar daugiau hidroksi- ir/ar karboksigrupių turinčių rūgščių esterinimas.............118
3.4 Lipazių tinkamumo riebalinių atliekų (pamuilių) utilizavimui tyrimas..............................124
3.4.1 Pamuilių cheminės sudėties analizė..............................................................................125
3.4.2 Pamuilių, kaip potencialios biodyzelino žaliavos, transesterinant bei esterinant jas
atitinkamais alkoholiais, panaudojimo tyrimas......................................................................126
Išvados..........................................................................................................................................133
Publikacijos disertacijos tema......................................................................................................134
Padėka...........................................................................................................................................136
Literatūra......................................................................................................................................137

3
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
AA – alyvuogių aliejus
BE – butilo esteriai
CALB – Candida antarctica lipazė B
DA – dagių aliejus
DAG – diacilglicerolis (-iai)
DO – dioleilglicerolis (dioleinas)
FSP – fazių sąlyčio paviršius
JA – judrų aliejus
KA – kokosų aliejus
KS – kakavos sviestas
LE – 3,7-dimetil-1,6-oktadien-3-olio
(linalolio) esteris
LSA – linų sėmenų aliejus
MAG – monoacilglicerolis (-iai)
ME – metilo esteriai
MetOH – metilo alkoholis (metanolis)
MO – oleino rūgšties metilo esteris
(metiloleatas)
OA – cis-9-oktadeceno (oleilo) alkoholis
OR – cis-9-oktadeceno (C18:1, oleino)
rūgštis
PAM – paviršiaus aktyvios medžiagos
p-NPB – butano rūgšties p-nitrofenilo
esteris (p-nitrofenilbutiratas)
p-NPP – palmitino rūgšties p-nitrofenilo
esteris (p-nitrofenilpalmitatas)
4
RA – rapsų aliejus
RiA – ricinų aliejus
RLA – ryžių luobelių aliejus
RR – riebalų rūgštis (-ys)
SA – saulėgrąžų aliejus
TAG – triacilglicerolis (-iai)
TLC – plonasluoksnė chromatografija
(thin-layer chromatography)
TMP – 2-(hidroksimetil)-2-etilpropan-
1,3-diolis (2-etil-2-hidroksimetil-1,3-
propandiolis, trimetilolpropanas)
TMP-DO – cis-9-oktadeceno rūgšties ir
2-(hidroksimetil)-2-etilpropan-1,3-diolio
diesteris (trimetilolpropano dioleinas)
TMP-MO – cis-9-oktadeceno rūgšties ir
2-(hidroksimetil)-2-etilpropan-1,3-diolio
monoesteris (trimetilolpropano
monooleinas)
TMP-TO – cis-9-oktadeceno rūgšties ir
2-(hidroksimetil)-2-etilpropan-1,3-diolio
triesteris (trimetilolpropano trioleinas)
TO – trioleilglicerolis (trioleinas)
UB – universalus buferis
VSA – vynuogių sėklų aliejus
ĮVADAS
Įvairių kasdien naudojamų produktų, tokių kaip popierius, tekstilė, maistas,
pašarai, kuras, cheminės ir vaistinės medžiagos, gamybos metu ne tik sunaudojamas
didelis kiekis žaliavų bei energijos, bet ir susidaro daug skirtingos kilmės atliekų,
darančių neigiamą įtaką aplinkai ir gyvenimo kokybei. Pasaulinės žmonių populiacijos
augimas bei ekonomikos vystymasis skatina vartojimo augimą ir tuo pačiu didina
įprastomis cheminėmis technologijomis besinaudojančios pramonės daromą žalą
aplinkai. Todėl įvairioms pramonės šakoms ieškoma alternatyvių technologijų, leisiančių
patenkinti augančius visuomenės poreikius, sunaudojant mažesnį kiekį žaliavų ir kaip
įmanoma labiau sumažinant aplinkos taršos problemas.
Pramoninė biotechnologija yra šiuo metu vienas sparčiausiai augančių, didžiulį
potencialą turinčių pramonės sektorių ne tik Europoje, bet ir visame pasaulyje,
naudojantis skirtingus biotechnologinius metodus, gaminant įvairius produktus.
Pagrindinis tikslas yra laipsniškas naftos pakeitimas atsinaujinančiomis augalinės kilmės
žaliavomis, mat pramoninių biotechnologijų plėtrą skatina ne tik įvairios ekologinės
problemos - didėjanti aplinkos tarša, šiltnamio efektas, - bet ir naftos išteklių ribotumas.
Vienas pagrindinių biotechnologinės gamybos įrankių – fermentai – biologiniai
katalizatoriai, - kurių pritaikymo galimybės, atrodo, bent jau kol kas neturi ribų. Lipazės
(triacilglicerolacilhidrolazės, EC 3.1.1.3.) dėl savo įvairiapusiškumo yra vieni labiausiai
tyrinėjamų ir įvairių junginių sintezei naudojamų hidrolizinių fermentų, jau seniai
neapleidžiančių savo pozicijų biokatalizatorių pasaulio populiarumo aukštumose. Lipazių
fiziologinė funkcija susijusi su lipidų apykaita, tačiau, priklausomai nuo reakcijos sąlygų,
jos gali katalizuoti ir įvairias biotechnologijai svarbias reakcijas: esterių sintezę,
aminolizę, epoksidaciją, laktonizaciją, polimerizaciją ir kt.
Seniai žinoma, kad, palyginus su įprasta tradicine chemine katalize, fermentinei
sintezei būdingi esminiai pranašumai: švelnios vykdomų reakcijų sąlygos, aukšto lygio
substratinis savitumas, šalutinių reakcijų nebuvimas, ekologiškumas, netoksiškumas,
neretai gaunami ir aukštesnės kokybės produktai. Tokių bioprocesų taikymas, gaminant
įvairius kasdieniam naudojimui tinkamus bioproduktus, galėtų užtikrinti tvarų
ekonomikos vystymąsi – dėl didėjančios žmonių populiacijos augančių vartojimo
poreikių patenkinimą, nedarant žalos aplinkai.

5
 Kita vertus, siekiant gauti optimalias pageidaujamų produktų išeigas, neretai
reikia naudoti didelius fermentų kiekius, tačiau paprastai po keleto reakcijų ciklų
nustatomas biokatalizatoriaus aktyvumo sumažėjimas. Be to, dažnai susiduriama ir su
fermentų slopinimo reakcijos mišinio komponentais problemomis, patys fermentiniai
procesai trunka santykinai ilgai, o visa tai yra ekonomiškai nepalanku. Todėl, norint
sumažinti tokios gamybos kaštus, būtina ne tik optimalių sąlygų paieška, bet ir tinkamo
fermento parinkimas, kiekvieno biokatalizatoriaus savitumo ir aktyvumo įvertinimas
skirtingų substratų, reakcijų tipo bei sąlygų atžvilgiu individualiai. Todėl disertacinio
darbo metu ir buvo tiriamas pasirinktų iki šiol mažai tyrinėtų lipazių savitumas bei
aktyvumas, katalizuojant skirtingomis sąlygomis vykdomas biotechnologijai svarbias
reakcijas, susidarant produktams, be kurių mūsų kasdienybė šiuo metu neįsivaizduojama
– biodyzelinui, biotepalams, įvairios paskirties esteriams.

Šio darbo tikslas buvo ištirti komercinių lipolizinių fermentų taikymo, sintetinant
įvairius biotechnologijai svarbius esterius, galimybes.

Šiam tikslui įgyvendinti buvo iškelti uždaviniai:

1. Įvertinti įvairių reakcijos sąlygų įtaką komercinių lipazių katalizuojamos

biodyzelino sintezės produktyvumui.
2. Ištirti komercinių lipolizinių fermentų gebą katalizuoti sudėtingų esterių –
biotepalų - sintezę, kai vienas iš substratų yra trimetilolpropanas.
3. Atrinkti naujus lipazių katalizuojamoms vertingų esterių sintezės reakcijoms
tinkamus substratus bei įvertinti įvairių sąlygų įtaką susidarančių produktų
išeigoms.
4. Ištirti muilo gamybos riebalinių atliekų – pamuilių – utilizavimo galimybes, jas
fermentiškai esterinant/transesterinant.

6
Mokslinis naujumas

Nors fermentinė biodyzelino gamyba nėra nauja tyrimų sritis, tačiau, kadangi,
kaip žinoma, skirtingų fermentų katalizuojamų reakcijų optimalios sąlygos gali drastiškai
skirtis, kiekvienas naujas fermentas turi būti ištirtas atskirai, tad šiame darbe pirmą kartą
taip išsamiai tirta komercinio preparato Lipoprime 50T katalizuojama rapsų aliejaus
transesterinimo metanoliu reakcija. Be to, įvertinta ir neseniai lipazių katalizuojamoms
reakcijoms pradėto naudoti priedo – ektoino – bei naujų perspektyvių tirpiklių – glikolio
eterių - įtaka įvairių šiuo atžvilgiu netirtų komercinių lipazių preparatų aktyvumui.
Biotepalų sintezės reakcijos, kai vienas iš substratų yra trimetilolpropanas,
paprastai vykdomos sumažinto slėgio sąlygomis, naudojant ypač didelius fermento
kiekius. Tuo tarpu šiame darbe atlikti tyrimai, siekiant optimizuoti procesą bei pritaikyti
jį pramoninei biotepalų gamybai, nenaudojant jokios sudėtingos įrangos bei sumažinus
reikalingą fermento kiekį.
Iki šiol nebuvo atlikta darbe vykdyta įvairių aliejų atranka, transesterinant juos
terpenoliais - β-citroneloliu bei geranioliu - susidarant vertingiems biotechnologijoje
naudojamiems esteriams. Tyrimų metu fermentiniu būdu gautas glutaro rūgšties ir β-
citronelolio diesteris, kurio detalių sintezės tyrimų literatūroje neaptikta, o visi galimi
sudėtingi cheminiai procesai patentuojami. Be to, įvertinus β-citronelolio ir oleilo
alkoholio įtaką atrinktų organinių rūgščių esterinimo eigai, pirmą kartą nustatyta, kad šių
reakcijų metu gaunamas skirtingas produktų skaičius, kuris kinta ir naudojant skirtingus
komercinius lipolizinius fermentus.
Darbo metu atlikti ir nauji riebalinių atliekų panaudojimo tyrimai: Lietuvos
įmonėje (AB“Naujoji Ringuva“) susidarančių muilo gamybos atliekų – pamuilių -
fermentinio esterinimo/transesterinimo, susidarant įvairiems RR esteriams, kaip
efektyvaus pamuilių utilizavimo būdo, įvertinimas.

7
1 LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Bendra lipazių charakteristika: šaltiniai, struktūra, stabilumas,
komercinės lipazės
Aplinkos apsaugos įstatymai, konkurencingumas ir augantis socialinis
atsakingumas skatina įvairias pramonės sritis ieškoti tradiciniams cheminiams metodams
alternatyvių, aplinkai saugesnių, ekonomiškesnių bei tvaresnių procesų. Todėl vis
daugiau dėmesio sulaukia įvairūs, taip vadinami, žalieji cheminiai vyksmai [1], iš kurių
labai svarbi yra biokatalizė [2], pasižyminti ypatingu savitumu, atrankumu bei švelniomis
reakcijų sąlygomis [3].
Fermentai – biologinėse sistemose vykstančių reakcijų katalizatoriai,
sumažinantys tų reakcijų eigai reikalingą aktyvacijos energijos kiekį ir taip didinantys
reakcijų greitį, bet nekeičiantys jų pusiausvyros. Reakcijų metu patys fermentai nei
sunaudojami, nei pagaminami [4]. Atsižvelgiant į katalizuojamos cheminės reakcijos
prigimtį, fermentai skirstomi į šešias klases: oksidoreduktazių, transferazių, hidrolazių,
liazių, izomerazių ir ligazių [5].
Vienai gausiausių klasių – hidrolazėms - priskiriami įvairius junginius
hidrolizuojantys biokatalizatoriai, sudarantys 75 % pasaulinio komercinių fermentų
gamybos kiekio [6]. Esterazių - fermentų, hidrolizuojančių esterines jungtis tarp
alkoholio ir karboksirūgšties, grupei priskiriamos ir lipazės, kurios pagal tarptautinę
klasifikacijos sistemą vadinamos glicerolio esterių hidrolazėmis arba
triacilglicerolacilhidrolazėmis (EC 3.1.1.3.). Lipazės yra vieni labiausiai tyrinėjamų ir
įvairių junginių sintezei naudojamų hidrolizinių fermentų [7, 8], kurių fiziologinė
funkcija susijusi su lipidų apykaita [9], tačiau, priklausomai nuo reakcijos sąlygų, lipazės
gali katalizuoti ne tik lipidų hidrolizės, bet ir įvairių esterių sintezės, aminolizės,
peroksidacijos, epoksidacijos, laktonizacijos, polimerizacijos ir kt. reakcijas [10-13].
Lipazėmis ypatingai domimasi dėl jų pritaikymo galimybės biotechnologijoje,
nes, kontroliuojant įvairius šių fermentų katalizuojamų procesų parametrus, galima gauti
didelę produktų išeigą. Lipoliziniams fermentams būdingas platus substratinis savitumas
[14], didelis enantioatrankumas [15], stabilumas organiniuose tirpikliuose, o jų veikimui
nereikalingi kofaktoriai. Dėl šių savybių lipazės naudojamos įvairių substratų hidrolizei
arba sintezei. Teigiama, kad iš visų žinomų fermentų, būtent lipazėms būdinga didžiausia

8
skirtingų substratų bei katalizuojamų reakcijų įvairovė. Lipoliziniai fermentai yra plačiai
taikomi maisto, farmacijos, odos, kosmetikos, tekstilės, popieriaus ir detergentų
pramonėse, sintetinat medikamentus, vertingas chemines medžiagas, maisto
sudedamąsias dalis [16-18], biotepalus [19], biodyzeliną [20-24] ir kt.

1.1.1 Šaltiniai

Nors lipazės plačiai paplitusios gamtoje ir yra sintetinamos daugelio

mikroorganizmų bei aukštesniųjų eukariotų, bet gausiausiai šie fermentai visgi randami
mikrobiologinėje floroje: bakterijose, grybuose, mielėse [25]. Lipazes sintetinančių
mikroorganizmų galima aptikti įvairioje aliejingoje/riebalingoje aplinkoje: pramoninėse
atliekose, aliejų gaminančiose įmonėse, pieninėse, riebalais užterštoje dirvoje, aliejinių
augalų sėklose, pūvančiame maiste [26, 27], taip pat komposto dėžėse ir net karštosiose
versmėse [28]. Būtent iš mikroorganizmų išskirtos lipazės yra komerciniu atžvilgiu
patraukliausi fermentai, kuriems teikiama pirmenybė biotechnologijoje dėl jų katalizinių
aktyvumų įvairovės, ypatingo stabilumo, esant aukštoms temperatūroms bei organiniams
tirpikliams, atrankumo, plataus substratinio savitumo, greitesnio, saugesnio ir pigesnio
išgavimo būdo, lengvesnių genetinių manipuliacijų [6, 29, 30].
Bakterinės lipazės pirmą kartą aptiktos 1901 m., sintetinamos tokių
mikroorganizmų kaip Bacillus prodigiosus, B. pyocyaneus, ir B. fluorescens. Šiuo metu
jie yra vieni geriausiai ištirtų lipazių producentų, dabar atitinkamai vadinamų Serratia
marcescens, Pseudomonas aeruginosa ir P. fluorescens. Lipazės skiriasi savo
lokalizacija: gali būti viduląstelinės arba sekretuojamos, visgi dažniausiai jos yra
sekretuojami (užląsteliniai) fermentai, išskiriami tiek gramteigiamų (Staphylococcus,
Bacillus, Streptomyces), tiek gramneigiamų (Pseudomonas, Chrommobacterium)
bakterijų. Lipazių sintezei įtakos turi įvairūs mitybiniai ir fiziologiniai veiksniai: terpės
pH (daugeliu atveju lipazės efektyviausiai sintetinamos, kai pH > 7,0), temperatūra bei
ištirpusio deguonies koncentracija, anglies ir azoto šaltiniai, lipidai, neorganinės druskos
ir augimo fazė, tačiau svarbiausias veiksnys yra anglies šaltinis [31]. Lipazės paprastai
yra indukuojami fermentai, sintetinami esant aliejui (triacilgliceroliams (TAG)), riebalų
rūgštims (RR), hidrolizuojamiems esteriams, detergentams, tulžies druskoms ar
gliceroliui. Kita vertus, jų gamybą gali skatinti ir kitokios prigimties anglies šaltiniai:

9
cukrai, polioliai, kazaminorūgštys [32]. Nustatyta, kad nejoninių detergentų naudojimas
taip pat skatina užląstelininių lipazių gamybą dviem mechanizmais: dėl į substratus
panašios savo cheminės prigimties jie gali veikti kaip sintezės induktoriai arba tiesiog
kaip lipazių sekreciją stimuliuojančios paviršiaus aktyvios medžiagos (PAM) [33].
Lipazės į kultūrinę terpę paprastai sekretuojamos, bakterijoms pasiekus
eksponentinio augimo fazės pabaigą. Galimá kiekvienos lipolizinių fermentų sintezės ir
sekrecijos stadijos reguliacija, pradedant lipazės struktūrinių genų transkripcija,
atitinkamų mRNR transliacija ir baigiant baltymo sekrecija per vidinę ir išorinę
membranas [34].
Lipoliziniai fermentai taip pat aptinkami žinduolių (žmogaus, kiaulės, šuns)
kasoje bei aukštesniuosiuose augaluose, tačiau iš augalų išskirtos lipazės komerciškai
nenaudojamos dėl mažo jų aktyvumo, o gyvūninės kilmės lipazės negali būti taikomos
vegetariškų maisto produktų gamyboje, be to, gali turėti likusių gyvūnų hormonų ar
virusų [5]. Pastaruoju metu didesnio dėmesio sulaukia iš žuvų išskirtos lipazės [35].

1.1.2 Struktūra

Pirmoji rentgeno kristalografinės analizės būdu nustatyta struktūra buvo lipazės,

išskirtos iš Rhizomucor miehei [36]. Vėliau nustatytos ir kitų pagrindinių lipazių
struktūros, įskaitant Bacillus thermocatenulatus, Candida antarctica, Pseudomonas
cepacia (struktūra pavaizduota 1.1 paveiksle), Bacillus subtilis [37-41] ir kt.
Trimatę lipazių struktūrą sudaro trys domenai: substrato paviršių atpažįstantis
kontaktinis domenas, vieną substrato molekulę atskiriantis ir užtikrinantis jos sąveiką su
kataliziniu centru hidrofobinis domenas bei katalizinę triadą, sudarytą iš Ser, His ir
Asp/Glu liekanų, turintis funkcinis domenas [42]. Visos lipazės, kurių erdvinė struktūra
yra žinoma, priklauso α/β struktūrinio tipo hidrolazių šeimai. Tokiems fermentams
būdinga iš lygiagrečių β klosčių sudaryta šerdis, kurią supa α spiralės [43-45].

10
 A
kilpa
stogelis

1.1 pav. Burkholderia cepacia (dabar Pseudomonas cepacia) lipazės tretinė (A) ir antrinė (B)
struktūros [41]. A: stogelio sritis - 118-159 aminorūgštys (α4-kilpa-α5), katalizinė triada (S87,
D264, H286) pavaizduota raudonais apskritimais. B: α spiralės ir β klostės pažymėtos
stačiakampiais ir rodyklėmis, atitinkamai.

Lipazių aktyvusis centras yra sudarytas iš serino proteazėms būdingos katalizinės

triados – Ser, His ir Asp/Glu aminorūgščių [36, 46]. Nors lipazių ir proteazių aktyvieji
centrai yra chemiškai panašūs, tačiau dėl skirtingos Ser hidroksigrupės orientacijos jų
struktūra skiriasi, ir todėl lipazių katalizinei triadai būdinga invertuota stereochemija
(reakcijos metu lipazių katalizinė triada atakuojamos jungties atžvilgiu išsidėsto
priešingai negu serino proteazių triada) [36, 46, 47]. Lipazių aktyviojo centro

11
nukleofilinė Ser liekana yra plaukų segtuko struktūros linkyje, tarp β klostės ir α spiralės
ypatingai konservatyviame pentapeptide (Gly-X-Ser-X-Gly); taip suformuojamas
būdingas β-linkis-α motyvas, vadinamas nukleofiline alkūne [44, 45]. Yra ir išimčių,
pavyzdžiui, žinoma, kad Candida antarctica lipazė B (CALB) tokios konservatyvios
pentapeptido sekos neturi [48].
Atsižvelgiant į aktyvaus centro geometriją, lipazės skirstomos į tris pogrupius: i)
lipazės, kurioms būdingas hidrofobinis siauro plyšio formos netoli baltymo paviršiaus
išsidėstęs aktyvusis centras (Rhizomucor ir Rhizopus lipazės); ii) lipazės, kurioms
būdingas piltuvo formos aktyvusis centras (C. antarctica, Pseudomonas ir žinduolių
kasos lipazės) ir iii) lipazės, kurioms būdingas tunelio formos aktyvusis centras (Candida
rugosa lipazė) [49].

1.1.2.1 Stogelis
Daugumos fermentų aktyvusis centras lokalizuotas molekulės paviršiuje, todėl
laisvai prieinamas substratui ir tirpikliui, tačiau lipazių atveju yra kitaip. Daugelio lipazių
ypatybė yra ta, kad jų aktyvusis centras yra uždengtas „stogeliu“ (toliau – stogeliu)
vadinama struktūra, sudaryta iš amfifilinės α spiralės peptidinės sekos [50]. Skirtingoms
lipazėms būdingas įvairus stogelio dydis, pvz., Geobacillus thermocatenulatus lipazės
stogelis yra kompleksinė struktūra, kurią sudaro didelė dalis fermento aminorūgščių,
formuojančių dvigubo stogelio struktūrą [51], tuo tarpu CALB būdingas labai mažas ir
paprastas stogelis, kuris visiškai neizoliuoja fermento aktyvaus centro net ir esant uždarai
jo būsenai [48]. Vienas mažiausių nustatytų stogelių (sudarytas tik iš penkių
aminorūgščių) būdingas iš jūrų kiaulytės išskirtai lipazei [52]. Todėl ir CALB, ir iš jūros
kiaulytės išskirtai lipazei nebūdinga toliau tekste aptarta lipazių aktyvacija fazių sąlyčio
paviršiumi (FSP), susijusi su stogelio poslinkiais bei atitinkamais fermento struktūros
konformaciniais pokyčiais [50, 53]. Kita vertus, yra turinčių stogelį lipazių, kurioms
aktyvacija FSP būdinga tik kai kurių substratų atžvilgiu, pvz., lipazėms, išskirtoms iš
Pseudomonas glumae [54], P. aeruginosa [55], nutrijos kasos [56] ir Staphylococcus
hyicus [57].
Kadangi lipazių katalizuojama reakcija vyksta dviejų fazių (vandens-lipidų)
sąlyčio riboje, buvo pastebėta, kad fermentui adsorbuojantis ant FSP, vyksta su stogelio

12
poslinkiais susiję fermento struktūros konformaciniai pokyčiai (1.2 pav.), nulemiantys
oksianijono plyšio orientaciją bei fermento hidrofobiškumo padidėjimą, - struktūros
ypatybes, reikalingas sąveikaujant su hidrofobiniais substratais [25, 58-60].

1.2 pav. Thermomyces lanuginosus lipazės dviejų konformacinių formų trimatės struktūros [16].

Lipazių struktūra gali būti dviejų konformacinių formų: uždarosios (neaktyvios)

ir atvirosios (aktyvios) (1.2 pav.). Uždaroji forma dominuoja vandeninėje terpėje, todėl,
nesant FSP, lipolizinis aktyvumas yra minimalus. Šios būsenos fermento aktyvusis
centras yra laisvas, nes nuo tirpiklio jį skiria stogelis. Stogelio ir likusios molekulės
dalies sąveika yra komplementari, išskyrus arti Ser liekanos esančią sritį, kur po stogeliu
susidaro ertmė, kurioje yra nedidelis kiekis vandens. Uždaros formos lipazių išorinis
paviršius yra hidrofilinis [61]. Pasislinkus stogeliui, aktyvusis centras tampa prieinamas
substratui, susidaro atviroji fermento forma. Įvykus šiems konformaciniams pokyčiams,
išorėje susiformuoja didelis hidrofobinis paviršius [25]. Hidrofobiškiausias paviršius
susidaro prie aktyvaus centro Ser liekanos, kuri lieka siauro įdubimo, susidarančio
pasislinkus stogeliui, dugne [48, 51, 54, 61].
Įvairių lipazių konformaciniai struktūros pokyčiai skiriasi, pvz., R. miehei lipazės
atveju įvyksta santykinai paprastas, tik vienos spiralės vyrio tipo, poslinkis [58], tačiau
kitoms lipazėms gali būti būdingi gerokai didesni pokyčiai, apimantys keletą kilpų,
drastiškai keičiančių savo antrines struktūras (1.3 pav.) [62-64].

13
1.3 pav. Lipazių uždaroji (mėlyna spalva) ir atviroji (geltona spalva) stogelio konformacijos [65].
Skrandžio lipazės atveju uždaroji ir atviroji stogelio konformacijos gautos, tiriant žmogaus ir
šuns skrandžio lipazes, atitinkamai. Homologiškų bakterinių lipazių, išskirtų iš Pseudomonas sp.,
uždaroji ir atviroji formos gautos, tiriant P. glumae ir P. Cepacia lipazes, atitinkamai.
Homologinių grybinių lipazių, išskirtų iš Geotrichum ir Candida sp., uždaroji ir atviroji
konformacijos gautos tiriant G. candidum ir C. rugosa lipazes, atitinkamai. Aktyvaus centro Ser
liekana pažymėta raudonai.

1.1.3 Stabilumas organiniuose tirpikliuose bei termostabilumas

Ankstyvaisiais biokatalizės tyrimų metais buvo tikima, kad fermentai aktyvūs tik
vandeninėje aplinkoje, tačiau vėliau atskleisti tokių fermentų kaip lipazės veikimo
ypatumai ir organiniuose tirpikliuose [66]. Nustatyta, kad organinių tirpiklių naudojimas
gali išspręsti prasto substratų bei produktų tirpumo reakcijos mišinyje, žemo atrankumo
ir sudėtingo produktų gryninimo problemas, būdingas vandeninėje aplinkoje
vykstančioms reakcijoms [67]. Taip pat nustatyta, kad nepoliniai tirpikliai yra tinkamesni
už polinius. Kitaip nei nepoliniai, poliniai tirpikliai patraukia vandenį iš fermento
aktyvaus centro, taip sumažindami jo katalizinį aktyvumą [68]. Įprastai lipazių
katalizuojamai esterių sintezei naudojami nepoliniai tirpikliai: n-heksanas, heptanas,
cikloheksanas, izooktanas ir toluenas. Naudojamos ir dvifazės sistemos, pavyzdžiui,
vanduo ir organinis tirpiklis ar du skirtingi organiniai tirpikliai [69].

14
 Lipazių katalizuojamų riebalų transesterinimo alkoholiais reakcijų atveju prastas
vieno iš substratų - trumpos grandinės alkoholių - tirpumas aliejuose gali sukelti lipazių
inaktyvaciją. Vienas šios problemos sprendimo būdų - organinių tirpiklių pridėjimas į
reakcijos mišinį. Taip padidinamas lipazės stabilumas bei substratų tirpumas,
sumažinama reakcijos mišinio klampa. Kita vertus, ne visos lipazės yra stabilios
organiniuose tirpikliuose, ir todėl jų aktyvumas tokiose sistemose gali būti ribotas [70].
Lipazių paviršiaus savybės, tokios kaip hidrofobiškumas ir krūvio pasiskirstymas,
yra pagrindiniai veiksniai, nulemiantys lipazių stabilumą organiniuose tirpikliuose [71].
Neseniai nustatyta, kad kilpos, esančios Bacillus subtilis lipazės paviršiuje, nulemia
atsparumą tokiems organiniams tirpikliams kaip dimetilsulfoksidas [72]. Siekiant
užtikrinti lipazių stabilumą organiniuose tirpikliuose, neretai naudojami „kieti“ fermentų
preparatai (liofilizuoti arba imobilizuoti – adsorbuoti inertiško nešiklio), suspenduoti
organiniame tirpiklyje. Biologinė lipazės kilmė, reakcijos tipas (hidrolizė ar sintezė),
substratai – visa tai lemia, koks tirpiklis konkrečiu atveju yra tinkamiausias [73, 74].
Termostabilumo dėka įvairūs bioprocesai gali būti vykdomi, esant aukštesnėms
temperatūroms, taip pasiekiami didesni difuzijos greičiai, geresnis hidrofobinių substratų
tirpumas vandenyje, mažesnė substratų klampa, padidėjęs reagentų tirpumas
(transesterinimo reakcijų atveju padidėja alkoholių tirpumas aliejuose), todėl reakcijos
vyksta greičiau ir gaunamos didesnės produktų išeigos [6]. Kadangi, pakėlus temperatūrą
10oC, reakcijos greitis apytiksliai padvigubėja, daugelis pramoninių fermentų
katalizuojamų procesų įprastai vykdomi esant aukštesnei nei 50oC temperatūrai, tad
temperatūrinis stabilumas yra viena labiausiai pageidaujamų lipazių (kaip ir kitų
fermentų) savybių [75, 76]. Tokiomis savybėmis pasižymi ne tik iš termofilinių ir
hipertermofilinių mikroorganizmų išskirtos lipazės, bet ir iš daugelio kitų šaltinių,
įskaitant P. fluorescens [77], Bacillus sp. [78], B. coagulans ir B. cereus [79].
Lipazių termostabilumas yra neabejotinai susijęs su jų struktūra, ir pagrindiniai jį
nulemiantys veiksniai yra aminorūgščių sudėtis, didesnis druskų tiltelių ir hidrofobinių
sąveikų skaičius, mažesnis baltymo vidinių ertmių dydis, paviršiaus pokyčiai [80]. Labai
didelę įtaką gali turėti ir mutacijos fermento molekulės stogelio srityje [81, 82]. Be to,
termostabilumas priklauso ir nuo įvairių aplinkos veiksnių: pH, metalų jonų ir kt., tačiau
gali būti padidintas imobilizuojant fermentą ir taip pakeičiant jo terminės inaktyvacijos

15
mechanizmą [83] arba keičiant vykdomos reakcijos sąlygas, pvz., parenkant tam tikrus
tirpiklius (joninius skysčius) ir pan.

1.1.3.1 Lipazių imobilizacija – stabilumo didinimo būdas

Viena pagrindinių lipazių naudojimo pramonėje problemų yra santykinai aukšta
fermentų kaina [6]. Ši problema buvo dalinai išspręsta, kai fermentai pradėti imobilizuoti
ant įvairių nešiklių - taip atsirado galimybė juos naudoti keletą kartų, veiksmingiau
kontroliuoti katalizės eigą, produktų kokybę bei išeigą, lengviau atskirti ir gryninti
reakcijų produktus, padidinti fermentų termo- ir cheminį stabilumą [5, 22, 83-86].
Imobilizacijos sėkmė priklauso nuo trijų parametrų: fermento, nešiklio bei
imobilizacijos metodo. Prijungimas prie netirpaus nešiklio stabilizuoja fermento
konformaciją, dažnai padidina termostabilumą ir aktyvumą bevandenėje aplinkoje,
pakeičia temperatūrinį ir pH optimumus bei kitas savybes. Literatūroje aprašyta daug
lipazių imobilizacijos metodų [87], įskaitant adsorbciją ar nusodinimą ant hidrofobinių
medžiagų [88, 89], joninį ir kovalentinį prijungimą prie funkcinių grupių [90, 91],
sulaikymą polimeriniuose geliuose [92], mikroinkapsuliaciją lipidinėse pūslelėse [9],
hidrofobines sąveikas [93] ir kt. Dažniausiai naudojamas adsorbcijos metodas, nes tai yra
paprasta, lengva, santykinai pigi, švelniomis sąlygomis vykdoma procedūra [94, 95].
Plačiai tiriami įvairūs nešikliai - neorganiniai ir organiniai, monomeriniai ir
polimeriniai, natūralūs ir sintetiniai, hidrofobiniai ir hidrofiliniai, pavyzdžiui, nailonas
[96], Amberlite MB-1, diatomitas [97], baltasis asbestas [98] ir daugybė kitų. Nešiklio
pasirinkimas priklauso nuo keleto veiksnių: atsparumo, cheminio patvarumo ir
mechaninio tvirtumo (ilgaamžiškumo), lipazės ir reakcijos sistemos tipo, regeneracijos
lengvumo, kainos ir kt. [22]. Pvz., neorganiniams nešikliams būdingas didesnis cheminis
atsparumas nei organiniams, tačiau pastarieji yra gerokai pigesni, jų taikymas yra
įvairesnis, o savybės yra lengvai modifikuojamos [5].
Literatūroje aprašyta daug lipazių imobilizavimo ant hidrofobinių nešiklių atvejų,
kai siekiama padidinti jų aktyvumą, stabilumą, pagerinti katalizines savybes
(imobilizuojant atviros konformacijos fermentą) [99-104]. Pvz., po adsorbcijos ant
hidrofobinio nešiklio nustatyta Alcaligenes sp. lipazės hiperaktyvacija: imobilizuotai
lipazei buvo būdingas 135 % aktyvumas, palyginus su tirpiu fermentu [104]. Tai susiję

16
su lipazių aktyvacijos FSP fenomenu: fermento aktyvųjį centrą supančios hidrofobinės
aminorūgščių liekanos sąveikauja su hidrofobiniu nešikliu, ir stogelis, dengiantis
fermento aktyvųjį centrą, pasislenka. Tokiu būdu hidrofobinės sąveikos dėka lipazė
tvirtai adsorbuojasi atviroje aktyvioje konformacijoje, ir taip padidinamas jos katalizinis
aktyvumas [105]. Nustatyta, kad tokio pobūdžio aktyvacijos fenomenas gali būti
sukeliamas ne tik hidrofobinių nešiklių, bet ir hidrofobinių baltymų (hidrofobinų) [106]
ar net kitų atviros formos lipazių molekulių [107, 108].
Pastaruoju metu vis daugiau dėmesio sulaukia imobilizacijos ant įvairių
nanomedžiagų metodai, nes tokioms medžiagoms būdingas ypatingai didelis paviršiaus
ploto ir tūrio santykis, o patys metodai nėra sudėtingi. Šiuo metu naudojami nešikliai:
nanodalelės [109], anglies nanovamzdeliai [110], nanoskaidulos, iš kurių gali būti
lengvai nupinamos membranos [111, 112] ir kt.

1.1.4 Komercinės lipazės

1.1.4.1 Thermomyces lanuginosus lipazė
Pirmoji komercinė lipazė pradėta gaminti dar 1988 m. Novo Nordisk (dabar
Novozymes) pristatė genetiškai modifikuoto (su perkelta T. lanuginosus lipazės seka)
Aspergillus oryzae mikroorganizmo sintetinamą, detergentų pramonei skirtą lipazę
komerciniu pavadinimu Lipolase [16, 18]. Optimalios šios lipazės veikimo sąlygos: pH
10 - 11,5, 40oC temperatūra. Fermentas pasižymi stabilumu proteolizininių fermentų
turinčiuose plovimo tirpaluose, atsparumu įvairioms paviršiaus aktyvioms medžiagoms
bei plačiu substratiniu savitumu. Vėliau Novozymes pradėjo gaminti ir kitus šio
fermento komercinius preparatus: skystos formos LipolaseUltra, Lipex, LipoPrime,
Lipozyme TL 100L ir imobilizuotus Lipozyme TL IM, Lipolase 100T ir Lipex
100T. Nors iš pradžių komerciniai preparatai daugiausia buvo skirti detergentų
priedams bei maisto pramonei, vėliau pradėti taikyti ir daugelyje kitų pramonės sričių,
pradedant biodyzelino gamyba bei baigiant vertingų junginių sinteze (paprastai enantio-
ar regioatrankių procesų metu) [16].
Thermomyces lanuginosus (anksčiau vadinta Humicola lanuginosus) lipazė yra
grybinės kilmės bazofilinis, pakankamai termostabilus (išlaiko aktyvumą, esant 55 -
60oC), 1,3-savitas fermentas, sudarytas iš vienos polipeptidinės grandinės, susidedančios

17
iš 269 aminorūgščių, jo molekulinė masė – 31,7 kDa, o izoelektrinis taškas 4,4 [113].
Nustačius lipazės tretinę struktūrą, paaiškėjo, kad tai yra 35Å x 45Å x 50Å dydžio sferos
formos baltymas, sudarytas iš aštuonių centrinių lygiagrečių β klosčių, kurias jungia
penkios α spiralės. 1.2 paveiksle pavaizduotos uždaroji ir atviroji trimatės fermento
formos. Lipazės aktyvųjį centrą dengiantis stogelis yra mobili α spiralė, kurią sudaro
aminorūgštys – 86 - 93 [114]. Aktyvusis fermento centras sudarytas iš įprastos Ser-His-
Asp katalizinės triados. Nustatyta, kas viena iš keturių lipazės Trp liekanų - Trp89 -
lokalizuota fermento stogelio srityje, taip pat turi įtakos efektyviai substratų hidrolizei
[115].
Yra nustatyta, kad lipazės savo atviros formos aktyvių centrų sritimis paprastai
yra linkusios sudaryti bimolekulinius agregatus [116]. T. lanuginosus lipazei ši savybė
būdinga netgi labiau nei kitoms, todėl kitos imobilizuotos lipazės gali būti naudojamos
jos gryninimui ar netgi imobilizacijai [107, 108]. Tiriant lipazę, į šią jos savybę būtina
atsižvelgti, nes monomerinės ir dimerinės formos gali pasižymėti skirtingu aktyvumu,
stabilumu bei atrankumu [116].
Kaip minėta, T. lanuginosus lipazė naudojama daugelyje pramonės sričių, ir nors
nėra tokia populiari kaip iš mielių Candida genties išskirtos lipazės, bet kai kuriais
atvejais pasižymi netgi geresnėmis savybėmis, ir, be abejo, ypatingo dėmesio susilaukia
dėl didelio stabilumo [16].

1.1.4.2 Kitos lipazės

Rhizomucor miehei lipazė - komercinis imobilizuoto preparato pavadinimas -
Lipozyme RM IM, skysto – Palatase 20000L. Kaip minėta anksčiau, pirmoji nustatyta
trimatė lipazių struktūra buvo būtent šio fermento [36]. Šiai lipazei būdingas hidrofobinis
siauro plyšio formos netoli baltymo paviršiaus išsidėstęs aktyvusis centras [49]. Stogelio
struktūros konformaciniai pokyčiai, esant atvirai ir uždarai fermento formai, pateikti 1.3
pav. Tai - 1,3-savita lipazė. Nors dauguma lipazių savitos nuo vidutinės (C4) iki ilgos
(C16) grandinės sočių RR esteriams, R. miehei lipazė gali efektyviai hidrolizuoti iki 22
anglies atomų turinčių RR esterius [117]. Šios lipazės transesterinimo reakcijų substratais
gali būti ne tik alifatiniai, bet ir turintys įvairias kitas funkcines grupes alkoholiai, pvz.,
cikloheksilmetanolis, metoksipropandiolis [118].

18
 Candida rugosa lipazė - mielių sintetinama lipazė (komercinis pavadinimas
Resinase), sudaryta iš 534 aminorūgščių [119], būdingas tunelio formos aktyvusis
centras [49], kurį dengia α spiralinė struktūra – stogelis (aminorūgštys 65 - 94) [119].
Stogelio struktūros konformaciniai pokyčiai, esant atvirai ir uždarai fermento formai,
pateikti 1.3 pav. C. rugosa lipazėms būdingas savitumas trumpos grandinės RR [120,
121]. Kai kurios šių fermentinių preparatų katalizinės savybės pateiktos 1.1 lentelėje.

1.1 lentelė. Gamintojo pateikiamos trilaurino hidrolizės metu nustatytos Resinase preparatų
savybės
Preparato pavadinimas Aktyvumas, Savybės
KLU/g
Resinase A2X 100 Stabili, esant 40 - 75oC temperatūrai
Optimali veikimo temperatūra 50 - 75oC
Stabili, esant pH 4,5 - 8,5
Optimalus pH 6,0 - 6,5
Resinase HT 50 Stabili, esant 45 - 90°C temperatūrai
Optimali veikimo temperatūra 70 - 85°C
Stabili, esant pH 4,5 - 8,5
Optimalus pH 6,0 - 6,5

Candida antarctica B lipazė - komercinis imobilizuoto preparato pavadinimas -

Novozym 435. Tai - viena populiariausių, daugiausiai tyrinėjamų ir plačiausiai
organinėje sintezėje [122] bei biodyzelino gamyboje [123, 124] naudojamų lipazių. Dėl
ypatingo susidomėjimo šiuo fermentu buvo optimizuota jo gamyba: gauti, charakterizuoti
ir išgryninti du izofermentai (vadinami atitinkamai A ir B lipazėmis), o, siekiant gauti
praktiniam taikymui pakankamus biokatalizatorių kiekius, jie buvo klonuoti į Aspergillus
oryzae mikroorganizmą, kur buvo padidinta jų raiška [125].
Tai – globulinis baltymas, sudarytas iš 317 aminorūgščių, o jo molekulinė masė
yra 33,273 kDa [48]. Nors daugumos lipazių aktyviojo centro nukleofilinė Ser liekana
yra plaukų segtuko struktūros linkyje, tarp β klostės ir α spiralės ypatingai
konservatyviame pentapeptide (Gly-X-Ser-X-Gly), tačiau CALB yra išimtis ir, kaip
žinoma, tokios konservatyvios pentapeptido sekos neturi [48]. Šiam fermentui būdingas
piltuvo formos aktyvusis centras [49] bei labai mažas ir paprastas stogelis, kuris visiškai
neizoliuoja aktyvaus centro net ir esant uždarai jo būsenai [48], todėl šiuo atveju
daugeliui lipazių būdinga su stogelio poslinkiais susijusi aktyvacija fazių sąlyčio
paviršiumi nėra galima [50, 53].

19
 CALB yra termostabili, 1,3-savita lipazė, katalizuojanti reakcijas tik ties
pirminėmis glicerolio hidroksigrupėmis [50], nors kai kuriuose kituose šaltiniuose
nurodoma, kad šis lipolizinis fermentas yra nesavitas arba savitas tik esant tam tikroms
sąlygoms [126-129]. Nors išskirtinės imobilizuotos Novozym 435 lipazės savybės leidžia
ją naudoti įvairiose pramonės srityse [68, 130], yra duomenų, kad šis preparatas tinka ne
visada: esant tam tikromis sąlygomis, iš jo gali atsiplauti paties fermento molekulės bei
kiti sudėtyje esantys junginiai, kurie gali dalyvauti šalutinėse reakcijose kaip lipazės
substratai, susidarant nepageidaujamiems produktams [68, 131, 132].

1.2 Katalizinės lipazių savybės

1.2.1 Lipazių katalizuojamos reakcijos

Lipazės apibūdinamos kaip fermentai, gebantys hidrolizuoti TAG esterinę jungtį,

susidarant laisvoms RR ir gliceroliui. Bevandenėje ar turinčioje mažai vandens aplinkoje
lipazės gali vykdyti ir priešingą hidrolizei reakciją - esterių sintezę, kurios metu tarp
alkoholio ir karboksirūgšties molekulių suformuojama esterinė jungtis [7, 25]. Šie du
procesai sudaro transesterinimo reakcijų pagrindą.
Transesterinimo reakcijos skirstomos į interesterinimą (dvi TAG/esterių
molekulės pasikeičia acilinėmis liekanomis), acidolizę (jų metu pasikeičiama acilinėmis
liekanomis tarp TAG/esterio bei RR) ir alkoholizę (pasikeičiama acilo liekanomis tarp
TAG/esterio ir alkoholio) [7, 133]. Tarp šių reakcijų vis dažniau minima aminolizė, kai
nukleofilo vaidmenį atlieka ne alkoholis, o aminas (1.4 pav.). Be to, lipazės gali
katalizuoti ir kitas reakcijas: peroksidaciją, epoksidaciją, laktonizaciją, polimerizaciją,
angliavandenių acilinimą ir kt. [134]. Netradicinės lipazių katalizuojamos reakcijos
aptartos 1.4 skyriuje. Kadangi klasikinė alkoholizė daugelyje literatūros šaltinių yra
vadinama tiesiog transesterinimo reakcija, taip ji bus vadinama ir šiame darbe.

20
(i) Hidrolizė (vandeninė aplinka)

R1COOR2 + H2O ↔ R1COOH + R2OH

(ii) Sintezė (organinė aplinka)

(A) Esterinimas:

R1COOH + R2OH ↔ R1COOR2 + H2O

(B) Transesterinimas:

(1) Acidolizė

R1COOR2 + R3COOH ↔ R3COOR2 + R1COOH

(2) Alkoholizė

R1COOR2 + R3OH ↔ R1COOR3 + R2OH

(3) Interesterinimas

R1COOR2 + R3COOR4 ↔ R1COOR4 + R3COOR2

(4) Aminolizė

R1COOR2 + R3NH2 ↔ R1CONHR3 + R2OH

1.4 pav. Pagrindinės lipazių katalizuojamos reakcijos.

Esterių hidrolizės bei sintezės reakcijos yra grįžtamos ir joms būdinga tam tikra
pusiausvyra, kurios poslinkis į vieną ar kitą pusę paprastai priklauso nuo vandens kiekio
reakcijos mišinyje. Todėl, pvz., vykdant esterių sintezę, sistemoje turi būti užtikrinamas
minimalus vandens kiekis. Tai realizuojama naudojant liofilizuotus arba imobilizuotus
fermentų preparatus ir/arba reakciją vykdant molekuliniais sietais išdžiovintuose
organiniuose tirpikliuose. Keičiant vandens kiekį, keičiasi ir fermento substratinis
savitumas, stabilumas bei kitos savybės [135].
Nustatyta, kad minimalus vandens kiekis yra būtinas fermento aktyvumui, nes
palaiko reikiamą baltymo molekulės judrumą, todėl labai svarbu įvertinti naudojamo
organinio tirpiklio hidrofobiškumą bei kitas savybes, nuo kurių priklauso vandens kiekis
ne tik visame reakcijos mišinio tūryje, bet ir fermento mikroaplinkoje [135]. Bendrą
vandens kiekį sudaro vanduo, ištirpęs organiniame tirpiklyje, sudarantis lipazės ir kitų

21
sistemos komponentų hidratacinį sluoksnį bei vandens kiekis, esantis išorinėje aplinkoje
(ne reakcijos sistemoje) [136].

1.2.2 Lipolizė: mechanizmas ir pagrindiniai kinetikos principai

Kaip minėta, lipazės yra hidrolazės, skaldančios acilgliceroliuose esančius

esterinius ryšius, atpalaiduodamos laisvas RR bei glicerolį. Pagrindiniai tokių reakcijų
substratai - vandenyje netirpūs bekrūviai lipidai (ilgagrandžiai TAG). Įsotinimo taškas,
kuriame TAG vandeninėje terpėje pradeda formuoti emulsijas, vadinamas maksimalia
monomerų koncentracija. Viršijus šią koncentraciją taške, vadinamame kritine micelių
koncentracija, formuojasi micelės. Tarp įvairių substratų fizikocheminių formų
egzistuoja tam tikra dinaminė pusiausvyra, tačiau, kadangi daugelis substratų pasižymi
ribotu tirpumu arba apskritai netirpsta vandenyje, paprastai dominuoja nemonomerinės
formos [11, 137].
Kadangi fermentas yra hidrofilinis, o substratai – hidrofobiniai, lipolizės reakcija
vyksta lipidų ir vandens fazių sąlyčio paviršiuje (FSP). Substrato molekulių
koncentracija FSP tiesiogiai apsprendžia lipolizės greitį, todėl labai svarbu palaikyti šio
paviršiaus kokybę. Kad ir kaip bebūtų keista, žinios apie šio paviršiaus sudėties įtaką
lipolizės reakcijai iki šiol yra gana skurdžios, ir vienintelis plačiai naudojamas terminas
yra FSP kokybė. Atlikti sisteminiai biofizikiniai tyrimai atskleidė tam tikrus FSP
mikroaplinkos poveikio lipazių veiklai ypatumus. Nustatyta, kad lipazių aktyvumas, kaip
FSP sudėties funkcija, labiau susijęs su substrato pasiekiamumu nei paties fermento
denatūracija ar inaktyvacija, kaip buvo dažnai spėjama. Aiškiai įrodyta, kad TAG
lipolizės greitis labai priklauso nuo specifinės emulsijos lašelio srities, kurioje ji vyksta
[138, 139].
Lipazių katalizuojamos hidrolizės mechanizmas paprastai analizuojamas arba
koncentruojantis į substrato, arba į fermento modelį. Substrato modelis akcentuoja
pagerėjusį substratų pasiekiamumą ir tinkamą orientaciją FSP. Kita vertus, fermento
modelis analizuoja konformacinius lipazės pokyčius adsorbuojantis ant FSP [11].

22
1.2.2.1 Lipolizės mechanizmas
Lipazių pagrindinė katalizinė reakcija, t.y., TAG skaldymas, vyksta aktyviajame
centre, kurį, kaip minėta, sudaro aminorūgščių triada Ser-Asp(Glu)-His, atsakinga už SN2
tipo reakcijos mechanizmą. Lipazių katalizuojamos reakcijos mechanizmas priskiriamas
Ping-Pong Bi-Bi tipui, t.y., vyksta bisubstratinė reakcija, dalyvaujant TAG ir vandens
molekulei. Susidaro du produktai, kai antrojo substrato prijungimas vyksta atsipalaidavus
pirmajam produktui. Be to, reakcija prasideda po lipazės adsorbcijos FSP, taigi visas
katalizės procesas vyksta dviem etapais [140].
Katalizės mechanizmas bendras visoms lipazėms. Reakcijos metu susidaro
tetraedrinis tarpinis junginys, kuris vėliau virsta acilintu fermento kompleksu, o
paskutinėje stadijoje lipazė regeneruojama hidrolizės metu. 1.5 paveiksle pateikta
lipolizės reakcijos stadijų schema.

1.5 pav. Lipolizės reakcijos stadijos [25]. Susidaro tetraedrinis tarpinis junginys, kuris vėliau
virsta acilintu fermento kompleksu, o paskutinės stadijos metu lipazė regeneruojama hidrolizės
metu.

Katalizinę triadą sudarančių aminorūgščių funkcija: pirmiausia nukleofilinis Ser

deguonies atomas atakuoja substrato sudėtyje esantį karbonilinį esterinio ryšio anglies
atomą, susidarant tetraedriniam tarpininkui, kuris yra šios reakcijos pereinamoji būsena.
Būtent Ser liekana tiesiogiai dalyvauja kataliziniame procese. His sudaro vandenilinį ryšį
su Ser hidroksigrupe, taip padidindamas Ser nukleofiliškumą. His imidazolo žiedas
protonizuojasi, susidaręs teigiamas krūvis stabilizuojamas Asp arba Glu neigiamos

23
karboksigrupės [25]. Pereinamoji būsena stabilizuojama, susidarant vandeniliniams
ryšiams tarp aktyviojo centro aminorūgščių liekanų ir substrato oksianijono. Tetraedrinis
tarpininkas suyra, atsipalaiduojant alkoholio molekulei bei susidarant tarpiniam
acilfermento kompleksui. Laisva RR atpalaiduojama ir lipazė regeneruojama hidrolizės
metu, veikiant nukleofilui (vandens molekulei arba monoacilgliceroliui (MAG)) [11].

1.2.2 Pagrindiniai kinetikos principai

Viena unikalių lipazių savybių yra aktyvacijos FSP fenomenas. Dar ankstyvųjų
tyrimų metu buvo parodyta, kad, kol substratas vandeniniame tirpale yra monomerinės
formos, lipazė pasižymi minimaliu aktyvumu, tačiau, kai substrato koncentracija yra
pakankamai didelė, kad viršytų tirpumo ribą ir suformuotų emulsijas bei miceles,
stebimas staigus hidrolizinio lipazės aktyvumo išaugimas (1.6 pav.) [141, 142]. Šie
eksperimentai įrodo, kad lipazės aktyvumas priklauso ne nuo substrato molinės
koncentracijos, bet nuo FSP egzistavimo, ir jis yra kontroliuojamas FSP esančios
substratų koncentracijos [50, 143].
Esterazės, priešingai, - aktyvios tik vandenyje tirpių substratų atžvilgiu. Jų
aktyvumas yra substrato koncentracijos funkcija, aprašoma Michaelio-Menten kinetiniu
modeliu, kai maksimalus reakcijos greitis pasiekiamas gerokai greičiau nei tirpalas
įsotinamas substratu, todėl fizikocheminės būsenos pasikeitimas (substrato emulsijos
susidarymas) reakcijos greičio nebekeičia [144]. 1.6 paveiksle parodyti lipazėms ir
esterazėms būdingų kinetinių kreivių skirtumai.
Tirpus Agreguotas
substratas substratas
Aktyvumas

Aktyvumas

Esterazė Lipazė

Substrato koncentracija Substrato koncentracija

1.6 pav. Lipazių ir esterazių kinetinės kreivės [17]. Substrato koncentracija išreikšta santykiniais
vienetais, kur 1 (C*) atitinka kritinę micelių koncentraciją. Aktyvumas – savitas fermento
aktyvumas, išreikštas santykiniais vienetais.

24
 Šis FSP sukelto lipolizinio aktyvumo išaugimo fenomenas daugelį metų ne tik
žavėjo, bet ir glumino enzimologus, nes lipolizė negalėjo būti tiriama įprastais metodais
ar apibrėžta klasikiniu Michaelio-Menten modeliu, galiojančiu tik homogeninėje fazėje
vykstančiai biokatalizei. Lipolizė vyksta iš bent dviejų skirtingų fazių sudarytoje
aplinkoje. Substratai, produktai ir fermentai pasiskirsto tarp tūrio ir paviršiaus fazių. Be
to, šis pasiskirstymas nėra fiksuotas ir kinta lipolizės reakcijos metu [145].
Dėl to buvo pasiūlyti įvairūs kinetiniai modeliai, aprašantys fermentinės lipolizės
mechanizmą FSP. Vienas paprasčiausių yra Verger-de Haas sukurtas modelis, aprašantis
lipolizinių fermentų katalizės kinetiką [146, 147]. Tai - paprasčiausias Michaelis-
Menten-Henri kinetinio modelio pritaikymas trumpos ir vidutinės grandinės ilgio lipidų
hidrolizei FSP, susidarant tirpiems produktams (1.7 pav.). Jis sudarytas iš dviejų stadijų:
grįžtamos fizinės vandenyje tirpaus fermento (E) adsorbcijos ant FSP, fermentui
pereinant į energetiškai palankesnę būseną (E*), po to sekančios jo aktyvacijos (atsidaro
stogelis, dengiantis aktyvųjį centrą) [61, 148] bei substrato (S) surišimo, t.y., fermento ir
substrato (E*S) komplekso susidarymo. Antroji stadija gali būti apibūdinta sąlyčio
paviršiniu Michaelio-Menten modeliu, substrato koncentracijas išreiškiant ne mol/tūrio
vienetui, bet mol/paviršiaus ploto vienetui. Susidarius E*S kompleksui, vyksta
tolimesnės dvimatės katalizės stadijos, susidarę produktai (P*) atsipalaiduoja ir ištirpsta
vandeninėje fazėje, regeneruojamas E* formos fermentas, kuris lieka adsorbuotas ant
FSP ir atsipalaiduoja tik po keleto katalizinių ciklų [147].

Fazių sąlyčio paviršius

Vanduo

1.7 pav. Kinetinis lipolizinių fermentų katalizės modelis [149].

Remiantis šiuo modeliu, buvo atlikta daug kinetinių vidutinio grandinės ilgio
sintetinių lipidų hidrolizės, susidarant vandenyje tirpiems produktams, tyrimų. Nustatyta,

25
kad išvestos lygtys visiškai atitinka eksperimentinius rezultatus Tačiau natūralūs
lipolizinių fermentų substratai yra ilgos grandinės lipidai, kurių hidrolizės metu susidaro
vandenyje netirpūs produktai. Apskritai, kinetiniai modeliai turi atsižvelgti į susidariusių
vandenyje netirpių produktų susikaupimą ant FSP, kas keičia, taip vadinamą, FSP
kokybę. 1.8 paveiksle pavaizduotas kinetinis lipazės veikimo modelis, atsižvelgiantis į
galimą vieno iš produktų įtaką fermento, substrato ir kito produkto pasiekiamumui fazių
sąlyčio paviršiuje. Siekiant pašalinti ant FSP susikaupusius lipolizės produktus,
naudojami įvairūs vandenyje tirpūs akceptoriai (β-ciklodekstrinas ir kt.) [150].

1.8 pav. Kinetinis lipazės veikimo modelis, kai susidaręs produktas P1 veikia fermento (E),
substrato (S) ir kito produkto (P2) pasiekiamumą/prieinamumą fazių sąlyčio paviršiuje [151].

Taigi lipazės gali būti apibrėžtos kaip karboksiesterazės, veikiančios emulsintus

substratus. Ši savybė lengvai paaiškinama lipazių erdvinės struktūros ypatybėmis. Kaip
minėta, fermento aktyvųjį centrą dengia į stogelį panaši polipeptidinė grandinė, kuri
neleidžia substrato molekulėms patekti į vidų. Aktyvacija sąlyčio paviršiuje struktūriniu
požiūriu susijusi su stogelio poslinkio sąlygojamomis dviejomis konformacinėmis lipazių
formomis. Esant vienai iš jų (atvirajai), stogelis savo hidrofobiniu paviršiumi sąveikauja
su substratu (lipidine faze), ši sąveika yra labai svarbi lipolizės eigai, nes sustiprina
hidrofobinę sąveiką tarp fermento bei substrato lipidinio paviršiaus. Nesant substrato,
stogelis uždengia aktyvų centrą, įvyksta savotiška fermento struktūrinė inaktyvacija
(uždaroji forma) [58, 148].

26
1.3 Lipazių savitumas

Skiriami trys lipazių savitumo substratų atžvilgiu tipai: regiosavitumas (pozicinis

savitumas), stereosavitumas bei savitumas konkretiems substratams [134].

1.3.1 Regiosavitumas (pozicinis savitumas)

Atsižvelgiant į lipazių gebą hidrolizuoti TAG, jos gali būti suskirstytos į tris
pagrindines grupes [32, 117, 152]:
1. Nesavitos lipazės katalizuoja TAG hidrolizę, atskeldamos RR ties bet kuriuo
glicerolio molekulės C atomu [117, 152-154]. Jos katalizuoja visišką TAG hidrolizę
iki glicerolio ir laisvų RR (1.9 pav.). DAG ir MAG reakcijos metu susidaro kaip
tarpiniai junginiai [152, 154], kurie hidrolizuojami greičiau nei TAG, tad reakcijos
mišinyje jie nesikaupia [154]. Nesavitos lipazės sintetinamos tokių mikroorganizmų
kaip Burkholderia glumae (Pseudomonas glumae), B. cepacia (P. cepacia),
Chromobacterium viscosum ir Pseudomonas fluorescens [134].

Nesavita
lipazė

TAG Glicerolis

1.9 pav. Bendra nesavitų lipazių katalizuojamų reakcijų schema [134].

2. 1,3-Savitos lipazės katalizuoja reakcijas tik ties pirminėmis glicerolio

hidroksigrupėmis [117, 152-154]. Taigi jos vykdo savitą TAG hidrolizę, pasirinktinai
atskeldamos RR ties glicerolio molekulės C1 ir C3 atomais (sn-1,3 savita lipazė),
susidarant laisvoms RR, DAG ir/ar MAG (1.10 pav.). 1,3-Savitos lipazės
sintetinamos tokių mikroorganizmų kaip Bacillus thermocatenulatus, Aspergillus
niger, CALB, Mucor javanicus, Rhizomucor miehei (Mucor miehei), Rhizopus
delemar, R. oryzae, R. niveus, T. lanuginosus, Yarrowia lipolytica. 1,3-Savitumas
būdingas ir iš rapsų (Brassica napus) bei kiaulės ir žmogaus kasos išskirtoms
lipazėms [134].

27
 1,2-DAG

1,3-savita
lipazė

2,3-DAG
TAG

2-MAG

1.10 pav. Bendra 1,3-savitų lipazių katalizuojamų reakcijų schema [134].

3. Savitos tam tikroms RR lipazės efektyviausiai katalizuoja reakciją, esant tam tikro
ilgio ir nesotumo laipsnio RR [7, 117, 133, 155]. Pavyzdžiui, Geotrichum candidum
lipazė yra savita RR su dvigubu ryšiu tarp C9 ir C10 [156-158].

1.3.1.1 Acilgrupės migracija acilgliceroliuose - tai savaiminis acilgrupės judėjimas nuo

vienos hidroksigrupės prie gretimos [159-161]. 1,3-Savitos lipazės katalizuojamos TAG
hidrolizės reakcijos metu susidaro 2-MAG ir 1,2- ar 2,3-DAG. Šių junginių viduje vyksta
lėta acilgrupės migracija, susidarant 1,3-DAG ar 1-MAG, kurie tuomet yra
hidrolizuojami 1,3-savitos lipazės iki laisvų RR ir glicerolio (1.11 pav.). Dėl to ilgesnės
reakcijos trukmės dėka galima gauti visišką TAG hidrolizę iki laisvų RR ir glicerolio
[155, 157]. Pavyzdžiui, Holmberg ir Osterberg tyrė 1,3-savitos lipazės katalizuojamą
TAG hidrolizės reakciją iki 2-MAG, gauta išeiga siekė ne 100 %, kaip buvo galima
tikėtis, o 80 %. Didesnės išeigos nebuvo galima gauti dėl acilgrupės migracijos
fenomeno, dėl kurio galiausiai įvyksta visiška hidrolizė iki glicerolio ir laisvų RR [162].
Literatūroje aprašomi atvejai, kai, naudojant 1,3-savitas lipazes, gauta biodyzelino išeiga
siekė daugiau nei 90 % (teoriškai biodyzelino išeiga, naudojant tokias lipazes, turėtų būti
tik 66 %), ir tai yra taip pat paaiškinama acilgrupės migracijos fenomenu [163-166].

28
 1,2-DAG

2-MAG
TAG
2,3-DAG Acilmigracija

Acilmigracija

1-MAG Glicerolis
1,3-DAG

1.11 pav. Visi galimi produktai, įskaitant tuos, kurie susidaro dėka acilgrupės migracijos,
susidarę 1,3-savitų lipazių katalizuojamų triacilglicerolių hidrolizės reakcijų metu [134].

1.3.1.2 Veiksniai, turintys įtakos acilo migracijai

Nustatyta, kad medžiaga, ant kurios imobilizuotas fermentas, gali turėti įtakos
acilgrupės migracijai, jeigu jai būdingas rūgštinis ar bazinis paviršius [160]. Pvz., 1,3-
savitos T. lanuginosus lipazės katalizuojamo sojų aliejaus transesterinimo metu, kai į
reakcijos mišinį buvo pridėta silikagelio, biodyzelino išeiga išaugo ir siekė daugiau nei
90 % [167]; trietilamino (silpnos organinės bazės) pridėjimas į reakcijos mišinį taip pat
padidino biodyzelino išeigą kukurūzų aliejaus transesterinimo metu [166].
Teigiama, kad tirpiklio poliškumas taip pat turi įtakos acilgrupės migracijai.
Pavyzdžiui, 1,2-DAG greičiau izomerizuojasi nepoliniuose nei poliniuose tirpikliuose
[168], monooleinas stabilus dipoliniuose hidrofobiniuose tirpikliuose (cikloheksanone), o
tuo tarpu nepoliniuose hidrofobiniuose (n-heksane) ir poliniuose hidrofiliniuose
(etanolyje, metanolyje) aplinka palankesnė acilgrupės migracijai [160]. Ištyrus įvairių
tirpiklių ir jų savybių įtaką acilgrupės migracijos kinetikai 1,2-DAG ir 2-MAG, nustatyta,
kad bendru atveju mažėjant tirpiklio poliškumui, didėja acilgrupės migracijos greičio
konstantos [164]. Vandens kiekis reakcijos sistemoje taip pat veikia acilgrupės
migracijos greitį. Nustatyta, kad jis mažėja, didėjant vandens aktyvumui reakcijos
mišinyje [160, 165, 168].

29
 Acilgrupės migracijai įtakos turi ir reakcijos temperatūra bei pH. Nustatyta
tiesioginė reakcijos temperatūros ir acilgrupės migracijos greičio priklausomybė,
nepriklausomai nuo reakcijoms vykdyti naudojamo tirpiklio [160, 161, 165, 169].
Imobilizuotų CALB ir R. miehei lipazių katalizuojamos triacetino hidrolizės reakcijos
metu, kai pH 7, vyksta savaiminė acilgrupės migracija, susidarant 1,2- ir 1,3- diacetino
mišiniui, tuo tarpu, kai pH yra 5,5, acilgrupės migracija slopinama, ir gaunamas tik
vienas produktas - 1,2-diacetinas [170].

1.3.2 Stereosavitumas

Stereosavitumas (kitaip dar vadinamas stereoatrankumu) yra apibrėžiamas kaip

lipazės geba vieną nuo kitos atskirti TAG molekulėse esančias sn-1 ir sn-3 padėtis.
Lipazėms gali būti būdingas nedidelis stereoatrankumas arba jos gali būti labai
stereoatrankios. To paties fermento stereoatrankumas gali skirtis priklausomai nuo
substrato struktūros [171]. Kasos, Rhizopus arrhizus ir Pseudomonas fluorescens
lipazėms nebūdingas stereosavitumas kuriai nors pirminių pozicijų TAG ar
alkildiacilglicerolio molekulėse [172]. Žinduolių (žmogaus) skrandžio lipazei būdingas
ribotas atrankumas sn-3 pozicijai sintetinių TAG molekulėse [173]. Pseudomonas sp. ir
P. aeruginosa lipazėms būdingas sn-1 savitumas, kai substratas trioktanoinas, tuo tarpu
CALB būdingas labai didelio laipsnio sn-3 atrankumas. Visoms kitoms bakterinėms
lipazėms būdingas vidutinis ar žemas sn-1(3) stereosavitumas trioktanoino atžvilgiu.
Nustatyta, kad lipazių stereoatrankumas kinta kintant substratui, pvz., G. candidum M ir
A bei CALB lipazėms būdingas sn-3 savitumas trioktanoino atžvilgiu ir sn-1 savitumas,
kai substratas yra trioleinas [174].

1.3.3 Savitumas konkretiems substratams

Lipazėms būdingas labai skirtingo laipsnio savitumas skirtingų substratų

atžvilgiu. Jos gali katalizuoti reakcijas, dalyvaujant įvairiems substratams, bet,
priklausomai nuo jų molekulių struktūros, reakcijų greičiai labai skiriasi. Beveik visoms
lipazėms būdingas tam tikro laipsnio savitumas karboksirūgštims [157, 158]. Lipazės
pasižymi savitumu ne tik RR (tipas ir grandinės ilgis) bet ir alkoholio atžvilgiu [157].

30
Lipazių savitumą tam tikroms RR ar alkoholiams nulemia du pagrindiniai veiksniai:
steriniai efektai ir hidrofobinės sąveikos [175, 176].
Kai kurios lipazės teikia pirmenybę tam tikroms RR ar jų grupėms, pavyzdžiui,
Aspergillus flavus lipazė pasižymi didesniu savitumu trikaprinui nei trioleinui [177];
lipazės, išskirtos iš C. rugosa ir R. miehei, pasižymi didesniu savitumu oleino rūgščiai,
palyginus su elaidino rūgštimi (oleino rūgšties trans izomeras), o C. antarctica lipazė
priešingai - pirmenybę teikia elaidino, o ne oileino rūgščiai [178]. Lipazėms būdingas ir
savitumas RR grandinės ilgio atžvilgiu. Dauguma lipazių savitos nuo vidutinės (C4) iki
ilgos (C16) grandinės sočių RR esteriams, tačiau ir čia yra keletas išimčių, pavyzdžiui,
Penicillium roquefortii lipazė (pagerina sūrių skonį) gali hidrolizuoti trumpos grandinės,
bet ne vidutinės ar ilgos grandinės RR esterius [121], tuo tarpu R .miehei lipazė gali
efektyviai hidrolizuoti iki 22 anglies atomų turinčių RR esterius [117]. Kiaulių kasos ir
C. rugosa lipazėms būdingas savitumas trumpos grandinės RR [120, 121].
Lipazių aktyvumas skirtingų alkoholių klasių atžvilgiu yra išsidėstęs tokia tvarka:
pirminiai > antriniai > tretiniai alkoholiai [179]. Tretiniai alkoholiai ir jų esteriai yra
prasti lipazių susbtratai [180, 181], tačiau ir čia esama išimčių, pavyzdžiui, Burkholderia
sp. YY62 lipazė efektyviai hidrolizuoja tret-butilo esterius ir pasižymi didesniu savitumu
tret-butiloktanoatui, palyginus su tret-butilpalmitatu ar stearatu [182], kai kurios kitos
lipazės (C. rugosa [181], C. antarctica lipazė A [117]) taip pat pasižymi tam tikru, tačiau
pakankamai ribotu aktyvumu tokių substratų atžvilgiu.
Lipazių substratais gali būti ne tik alifatiniai, bet ir alicikliniai, bicikliniai ir
aromatiniai esteriai [50, 183, 184], tioesteriai bei aktyvuoti aminai [185]. Pvz., R. miehei
lipazės substratais gali būti įvairiausi alkoholiai, turintys įvairias kitas funkcines grupes,
pvz., cikloheksilmetanolis, metoksipropandiolis [118].
Toks platus lipazių substratinis savitumas gali būti paaiškintas substratų surišimo
vietos anatominiais (aktyvaus centro geometriniais) skirtumais. Nustatyta, kad lipazės,
turinčios į tunelį panašias substrato prijungimo vietas, yra savitos ilgos grandinės RR,
palyginus su stambiais/griozdiškais substratais, tuo tarpu lipazėms, kurių substrato
prijungimo vieta yra piltuvo formos, būdingas priešingas savitumas [49].

31
1.4 Netradicinės lipazių katalizuojamos reakcijos
1.4.1 Fermentų neišrankumas (enzyme promiscuity)

Neišrankumas - fermentų gebėjimas katalizuoti alternatyvias reakcijas, kurios

skiriasi nuo jų natūralių fiziologinių funkcijų [186-188]. Nors enzimologijoje šis
terminas yra santykinai naujas, tačiau dėl plataus šio reiškinio paplitimo šiuo metu jis jau
yra tapęs gana įprastu [187, 189]. Fermentų aktyvumas, katalizuojant netradicines
reakcijas, paprastai yra gerokai mažesnis už tą, kuris būdingas, katalizuojant natūralias
reakcijas (atliekant pirmines funkcijas), bet yra duomenų, kad antro laipsnio greičio
konstantos (kcat/KM) visgi pasiekia 105 M-1s-1, o greitis padidėja ((kcat/KM)/k2) iki 1018,
kas būdinga ir tradicinėms fermentų katalizuojamoms reakcijoms [190].
Fermentų neišrankumas gali būti suskirstytas į tris pagrindines klases [186]:
1) Neišrankumas reakcijų sąlygoms – fermento geba katalizuoti reakcijas, esant
nenatūralioms sąlygoms: bevandenei aplinkai, aukštai temperatūrai ar
ekstremaliam pH.
2) Neišrankumas substratui – būdingas fermentams, pasižymintiems plačiu
substratiniu savitumu. Tai - fermento geba katalizuoti panašias chemines
reakcijas, naudojant skirtingus substratus.
3) Katalizinis neišrankumas – tai fermento aktyvaus centro geba katalizuoti
chemiškai skirtingus cheminius virsmus. Tokie cheminiai virsmai gali skirtis
susidarančio ar suardomo ryšio tipu ir/ar kataliziniu mechanizmu [191, 192]. Hult
ir Berglund (2007) šią fermentų savybę suskirstė į du tipus: atsitiktinis (būdingas
laukinio tipo fermentams) ir indukuotas (naujas fermentinis aktyvumas, sukeltas
mutacijų) fermento katalizinis neišrankumas [186]. Manoma, kad konformacinė
fermentų įvairovė ir lankstumas yra vieni svarbiausių veiksnių, užtikrinančių
katalizinį neišrankumą [193]. Nustatyta, kad ypatingai svarbus yra aktyvaus
centro kilpų mobilumas, pavyzdžiui, fermento izopropilmalato izomerazės (EC
4.2.1.33) aktyvaus centro kilpos lankstumas leidžia atpažinti dviejų skirtingų
substratų (izopropilmalato ir homocitrato) skirtingus fragmentus (hidrofobinius ir
hidrofilinius) [194].

32
1.4.2 Netradicinių lipazių katalizuojamų reakcijų pavyzdžiai

Dėl savo potencialo katalizuoti daugybę netradicinių reakcijų lipazės katalizinio

neišrankumo klausimu tyrinėjamos labiausiai [195, 196]. Yra žinoma daug lipazių
katalizuojamų netradicinių reakcijų: anglis-anglis, heteroatomas-anglis, heteroatomas-
heteroatomas ryšių susidarymas bei įvairūs oksidaciniai procesai [186, 188, 195].

1.4.2.1 Anglis-anglis (C-C) ryšio susidarymo reakcijos - vienos svarbiausių reakcijų

organinėje sintezėje, svarbios medikamentų, vertingų cheminių junginių bei natūralių
produktų sintezei. Aldolazių katalizuojamos C-C ryšio susidarymo reakcijos žinomos jau
seniai, neseniai nustatyta, kad ir lipazės gali katalizuoti šias reakcijas [186, 197, 198].
Pvz., CALB katalizuoja aldolinio prijungimo C-C ryšio susidarymo reakciją, dalyvaujant
heksanoliui ir propanoliui [197]. Reakcija nėra enantioatranki, bet distereoatrankiai
skiriasi nuo savaiminės reakcijos. Buvo pasiūlytas ir šios reakcijos mechanizmas,
teigiantis, kad aktyviajame centre esantis His, patraukdamas protonus nuo aldehido,
veikia kaip bazė, tuo tarpu nukleofilinis Ser iš viso nevaidina jokio vaidmens. Ser
pakeitus Ala, mutantas pasižymėjo keturis kartus didesniu specifiniu aktyvumu nei
laukinio tipo fermentas.
2008 m. paskelbta pirmoji lipazės katalizuojama asimetrinio aldolinio prijungimo
reakcija: kiaulės kasos lipazės katalizuojama reakcija tarp acetono ir skirtingų aromatinių
aldehidų [199]. Nustatyta ir CALB geba katalizuoti aldolinę prijungimo reakciją tarp
triciklinio ketono ir in situ gauto acetaldehido (susidariusio reakcijos mišinyje dėl
vinilacetato hidrolizės). Produkto išeiga po 4 val. siekė 94 %, o nesant fermento ta pati
produkto išeiga pasiekta per keturias dienas [200].
Literatūroje aprašytas CALB gebos katalizuoti Michaelio prijungimo reakciją tarp
1,3-dikarbonilinio junginio ir α/β nesotaus aldehido ar ketono atvejis [198]. Lipazės gali
katalizuoti ne tik Michaelio tipo prijungimo, bet ir Markovnikovo ir anti-Markovnikovo
prijungimo reakcijas, susidarant anglis-heteroatomas ir heteroatomas-heteroatomas
ryšiams [201].

33
1.4.2.2 Oksidaciniai procesai
Perhidrolizė. Lipazės katalizuoja vidutinės grandinės ilgio karboksirūgščių
perhidrolizę, naudojant skystą vandenilio peroksidą kaip perhidrolizinį agentą, susidarant
peroksikarboksirūgštims [202]. Perhidrolizės reakcijos metu susidariusios peroksirūgštys
buvo panaudotos kaip in situ susidaręs oksidantas alkenų epoksidacijai, tad lipazių
katalizuojama perhidrolizės reakcija yra chemofermentinio būdo gauti epoksidus iš
alkenų pagrindas (1.12 pav.).

Lipazė

R, R1 = Alkil, R2, R3, R4 = H, Alkil

1.12 pav. Lipazių katalizuojama karboksirūgščių perhidrolizės reakcija, naudojant skystą

vandenilio peroksidą kaip perhidrolizinį agentą, susidarant peroksikarboksirūgštims, kurios po to
panaudojamos kaip in situ susidaręs oksidantas alkenų epoksidacijai [202].

Tiesioginė alkenų epoksidacija. Nustatyta, kad CALB Ser105Ala mutantas

(paprastai katalizėje dalyvaujanti Ser liekana pakeista Ala) geba katalizuoti tiesioginę
α/β nesočių junginių (but-2-enalio ir 3-fenilprop-2-enalio) epoksidaciją vandenilio
peroksidu ir vandeninėje, ir organinėje terpėje. Autoriai šiai reakcijai pasiūlė dviejų
stadijų mechanizmą (1.13 pav.).

1.13 pav. Candida antarctica lipazės B Ser105Ala mutanto katalizuojamos tiesioginės α,β-
nesotaus aldehido epoksidacijos vandenilio peroksidu reakcijos mechanizmas [203].

Pirmoji stadija: aktyvaus centro His liekana prisijungia vieną vandenilio atomą iš
vandenilio peroksido, susidarant naujam ryšiui tarp aldehido β-anglies ir peroksido

34
deguonies atomo. Antros stadijos metu susidaro C-O ryšys tarp aldehido α-anglies ir
peroksido deguonies, susidarant epoksidui ir vienai vandens molekulei [203].

1.4.2.3 Heterociklų sintezė

Literatūroje aprašoma 2-alkilbenzimidazolų sintezė fermentinio
acilinimo/ciklizacijos domino reakcijų metu tarp 1,2-arilendiamino ir RR esterių [204].
Neseniai nustatyta, kad lipazės gali katalizuoti ir dihidrofurano darinių susidarymo
reakcijas (1.14 pav.) [205].

c d
b

1.14 pav. Lipazių katalizuojama dihidrofurano darinių susidarymo reakcija [205]. Reaguojant
nitrostirenui (a) ir acetilacetonui (b), susidaro ne tik įprastas Michaelio tipo prijungimo reakcijos
produktas 3-(2-nitro-1-feniletil)pentan-2,4-dionas (c), bet ir 1-(5-(hidroksiimino)-2-metil-4-fenil-
4,5-dihidrofuran-3-il)etanonas (d).

1.4.2.4 Hantzsch tipo reakcijos

Lipazės geba katalizuoti Hantzsch tipo reakciją, dalyvaujant aldehidui, 1,3-
dikarboniliniams junginiams bei acetamidui, susidarant 1,4-dihidropiridinams. Nustatyta,
kad CALB katalizuoja 4-nitrobenzaldehido (1.15 (a) pav.), acetilacetono (1.15 (b) pav.)
ir acetamido (1.15 (c) pav.) reakciją, susidarant produktui - 1,4-dihidropiridinui (1.15 (d)
pav.), kurio išeiga po 72 val. siekia 90 % [206].

a b c

1.15 pav. C. antarctica lipazės B katalizuojama Hantzsch tipo reakcija, dalyvaujant 4-

nitrobenzaldehidui (a), acetilacetonui (b) ir acetamidui (c), susidarant 1,4-dihidropiridinui (d)
[206].

35
1.4.3 Neišrankumas reakcijų sąlygoms

Lipazės pasižymi dideliu stabilumu organiniuose tirpikliuose. Kaip minėta, esant

nedideliam vandens kiekiui aplinkoje (organiniame tirpiklyje), lipazės gali katalizuoti
priešingą hidrolizei reakciją – sintezę [12, 13, 17, 53, 184, 207]. Kitos sąlygos, kurioms
esant vyksta sintezės reakcijos: aukšta temperatūra (termofilų fermentai) [208],
ekstremalus pH (acidofilų ir alkalofilų fermentai) [209, 210], didelės druskų
koncentracijos (halofilų fermentai), dujinė fazė [211], sistemos be tirpiklių [212, 213],
joniniai skysčiai [214, 215], kieta fazė [216].
Įvairių reakcijos terpių, naudotų lipazių katalizuojamoms reakcijoms, privalumai
ir trūkumai gana plačiai aprašyti literatūroje. Dvifazė sistema, sudaryta iš hidrofobinių
tirpiklių ir vandeninių buferių, turi tam tikros svarbos lipazėms, mat dauguma šių
fermentų aktyvuojasi fazių sąlyčio paviršiuje [217-219]. Tweddell su kolegomis (1998)
tyrė Rhizopus nivea ir Mucor miehei lipazių esterinimo ir interesterinimo aktyvumus trijų
skirtingų tipų organinėse sistemose ir nustatė, kad dvifazės sistemos buvo tinkamesnės
esterinimo nei interesterinimo reakcijoms [220]. Vandens-organinio tirpiklio dvifazės
sistemos buvo sėkmingai pritaikytos labai didelio lipofiliškumo substratų, tokių kaip
steroidai [217], taukai [221] ir alkenai [222], transformacijoms vykdyti.
Nustatyta, kad organiniai tirpikliai daro įtaką lipazių katalizuojamų reakcijų
atrankumui [223-225]. Pvz., P. cepacia lipazės katalizuojamo 1,4-dibutiriloksi-2-
oktilbenzeno transesterinimo butanoliu metu hidrofobiniuose tirpikliuose susidaro 4-
butiriloksi-2-oktilfenolis, o hidrofiliniuose – 4-butiriloksi-3-oktilfenolis [224]. Tirpikliai
gali turėti įtakos ir lipazių prochiraliniam atrankumui (pagrindinio ir minorinio/šalutinio
enantiomero susikaupimo greičio santykiui). Ištyrus Pseudomonas lipazės katalizuojamą
prochiralinio diesterio 2-(1-naftoilamino)trimetilendibutirato hidrolizę iki jo monoesterių
įvairiuose hidratuotuose tirpikliuose, nustatyta, kad pro-S atrankumas varijavo nuo 3 kai
kuriuose tirpikliuose iki daugiau nei 30 – kituose [225]. Tirpikliai gali nulemti ir
enantioatrankumo inversiją: AH lipazės (Pseudomonas sp.) katalizuojamos kai kurių
prochiralinių 1,4-dihidropiridino darinių hidrolizės metu izopropilo eteryje susidaro
ee~90 % (S)-enantiomero, o cikloheksane susidaro apie ee~90 % (R)-enantiomero [223].

36
1.5 Lipazių biotechnologinio pritaikymo galimybės

Kaip minėta, lipazės yra labai svarbi biotechnologijai fermentų grupė, turinti
didžiules pritaikymo galimybes maisto, detergentų, farmacijos, tekstilės, kosmetikos ir
kitose pramonės srityse. Lipoliziniai fermentai veikia esant švelnioms reakcijų sąlygoms
(tai sumažina vykdomų procesų ekonomines sąnaudas bei reagentų ar produktų
degradacijos galimybę), yra labai stabilūs organiniuose tirpikliuose, katalizuoja daug
biotechnologijai svarbių reakcijų, pasižymi ypatingai plačiu substratiniu savitumu bei
regio- ir / ar stereoatrankumu, todėl nesusidaro nepageidaujami šalutiniai produktai,
nereikia papildomų priemonių reakcijos metu susidariusiems junginiams atskirti [226].

1.5.1 Įvairių vertingų esterių sintezė

Didžiąją lipazių taikymo biotechnologijoje dalį sudaro įvairių vertingų esterių

sintezė. Kvapiųjų esterių sintezė yra viena plačiausių lipazių katalizuojamų esterinimo ir
transesterinimo reakcijų taikymo sričių [1, 2, 7, 8]. Skonį ir kvapą suteikiančios
sudedamosios dalys yra specialūs priedai, naudojami maisto, gėrimų, farmacijos ir
asmens higienos (priežiūros) pramonės srityse.
Dauguma skonio ir kvapo junginių gali būti gauti iš natūralių šaltinių, tačiau jų
išskyrimas yra gana sudėtingas procesas. Tokių junginių ekstrakcijos kaina yra tokia, kad
procesas tampa komerciškai per brangus. Esteriai gali būti gaminami ir naudojant
cheminius katalizatorius, bet tokių reakcijų metu neretai susidaro šalutiniai
nepageidaujami produktai, o lipazių katalizuojamų reakcijų pagalba gauti produktai gali
būti traktuojami kaip natūralūs, kas yra ypatingai svarbu sintetinant maisto priedus [227].
Tipiniai šios grupės esteriai: butillauratas (abrikosų ir persikų kvapas), etilbutiratas
(ananasų kvapas), izoamilacetatas (bananų kvapas), izoamilizovaleratas (obuolių kvapas)
ir kt. (daugiau esterių pavyzdžių pateikta 1.16 pav.) [228-230].

37
 Izoamilacetatas Izoamilbutiratas Izoamilizovaleratas

Izoamilpropionatas Butilizobutiratas Izoamiloktanoatas

3-Tioheksilacetatas Butilkapratas (-) Mentilacetatas

Terpinilacetatas Cinamilacetatas (R)-1-Fenetilacetatas

Etilvaleratas Geranilacetatas Butiltiglatas

Eugenolbenzoatas Geraniltiglatas

1.16 pav. Fermentinės sintezės būdu gautų vertingų esterių pavyzdžiai [69].

Ilgos grandinės RR ir ilgos grandinės alkoholių esteriai vadinami vaškais.

Fermentinė katalizė ypatingai dažnai naudojama asmens higienos/priežiūros produktų
sudedamųjų dalių gamybai. Odą minkštinantys esteriai yra iš įvairios kilmės aliejų ir
riebalų gautos cheminės medžiagos, plačiai naudojamos kosmetikos produktuose dėl
savo minkštinančių ir drėkinančių savybių [231].

38
 Acetatai yra vieni populiariausių esterių, plačiai naudojamų maisto ir kvapų
pramonėse [232]. Literatūroje plačiai aprašytos iš įvairių mikrobinių šaltinių išskirtų
laisvų ir imobilziuotų lipazių katalizuojamos įvairių acetatų sintezės reakcijos [230, 233-
235]. Kita svarbi esterių klasė - terpenų esteriai - RR junginiai, pasižymintys įvairiomis
skonio ir kvapo savybėmis, labai plačiai naudojami maisto, gėrimų, farmacijos ir
kosmetikos pramonėse. Kai kurie tokių esterių pasižymi antibakterinėmis ir
antioksidacinėmis savybėmis bei geba slopinti nepageidaujamą kūno kvapą. Literatūroje
aprašoma tokių terpenolių kaip β-citronelolio, geraniolio ir terpenilo esterių, naudojant
įvairias lipazes, sintezė [236-239].

1.5.2 Maisto pramonė

Lipazės naudojamos įvairių maisto produktų kokybės ir skonio gerinimui.

Pavyzdžiui, krakmolas yra viena pagrindinių duonos sudedamųjų dalių. Ilgainiui duonoje
esantis krakmolas kristalizuojasi, taip suteikdamas nemalonų skonį bei kietumą.
Amilazės ir lipazės pridėjimas duonos gamybos metu slopina krakmolo kristalizacijos
procesus ir taip ilgina duonos galiojimo laiką [240].
Riebalai ir aliejai yra svarbi maisto sudedamoji dalis. Maistinė TAG vertė
priklauso nuo RR ilgio, nesotumo laipsnio bei padėties glicerolio molekulėje. Lipazių
katalizuojamų transesterinimo reakcijų pagalba iš struktūriniu atžvilgiu mažiau vertingų
riebalų galima gauti gerokai vertingesnius produktus. Šiuo metu toks riebalų ir aliejų
modifikavimas yra viena pagrindinių lipazių taikymo maisto apdorojimo pramonėje
sričių. Įvairūs prastos sudėties pigūs aliejai gali būti modifikuojami iki maistingų ir
pramonėje svarbių TAG: kakavos sviesto pakaitalo, žmogaus pieno riebalų pakaitalų,
mažai kaloringų TAG, polinesočiosiomis RR ir oleino rūgštimi prisotintų aliejų [241].

1.5.3 Farmacijos pramonė

Biokatalizė įgauna vis daugiau svarbos ir farmacijos pramonėje. Būtent čia,

gaminant įvairius vaistus, realizuojama lipazių geba sintetinti ne raceminius mišinius, o
grynus enantiomerus. Chirališkumas yra pagrindinis daugelio vaistų veiksmingumo
veiksnys, dėl to vaistams naudojama optiškai gryna medžiaga, o ne raceminis mišinys,

39
mat daugeliu atvejų pageidaujamu terapiniu poveikiu pasižymi tik viena konkrečios
medžiagos enantiomerinė forma, o kita gali būti netgi toksiška [242]. Lipazės katalizuoja
reakcijas, kurių metu gaminami tokie vaistai kaip nikkomycin-B, naproxen, ibuprofen,
suprofen ir ketoprofen [243].
Lipazės gali būti naudojamos ir tiesiogiai - virškinimo sutrikimams bei su jais
susijusioms odos alerginėms reakcijoms gydyti. Šiuo atveju naudojamos ypatingu
stabilumu bei aktyvumu, esant įvairiam pH, pasižyminčios lipazės [7, 25, 133].

1.5.4 Biojutikliai

Lipazės kaip biojutikliai naudojamos maisto technologijoje, klinikinėje

diagnostikoje, farmacijoje, pesticidų kiekio įvertinimo technologijose. Vienas lipazių
kaip biojutiklių panaudojimo būdų klinikinėje diagnostikoje – TAG kiekio kraujo serume
nustatymas (paprastai siekiant kontroliuoti lipidų kiekį kraujyje tais atvejais, kai
pacientams būdingi širdies ir kraujagyslių sutrikimai) [244, 245]. Nors biojutikliai gali
būti cheminės, biologinės ar elektroninės kilmės, tačiau biologiniai neretai yra ir pigesni,
ir greitesni [5].

1.5.5 Detergentai

Detergentų gamyba - komerciniu atžvilgiu svarbiausia hidrolizinių lipazių

savybių taikymo sritis. Dažniausiai lipazės naudojamos kaip sudėtinė buitinės ir
pramoninės paskirties plovikliuose naudojamų detergentų dalis. 1988 m. NovoNordisk
pristatė pirmąją detergentų pramonei skirtą komercinę lipazę - Lipolase [18].
Fermentų naudojimas mažina energijos sąnaudas (procesai vykdomi esant
žemesnėms temperatūroms) bei kenksmingų PAM, įeinančių į detergentų sudėtį, kiekį
[246]. Lipazės yra bioskalios, todėl neturi neigiamos įtakos nuotekų vandenims ir
vandens telkinių gyvajam pasauliui.
Detergentams naudojamoms lipazėms keliami reikalavimai: mažas substratinis
savitumas (galimybė hidrolizuoti įvairios sudėties ir kilmės riebalus), ypatingas
stabilumas (pH 10 - 11, 30 - 60ºC temperatūra) bei atsparumas cheminei denatūracijai ir
proteolizinei degradacijai (dėl PAM ir proteazių priedų) [18].

40
1.5.6 Tekstilės, odos, kailių ir popieriaus pramonės

Lipazės tekstilės pramonėje naudojamos, siekiant pagerinti audinių dažymo

kokybę, suteikti tvirtumo, atsparumo bei minkštumo. Fermentais modifikuoti įvairūs
sintetiniai pluoštai naudojami siūlų, audinių, tekstilės, kilimėlių ir kt. gamyboje [247].
Naudojant lipazes, galimas gerokai ekologiškesnis odos ar kailio nuriebalinimo
procesas [7, 25, 245, 248]. Šiuo atveju naudojamos įvairios ir rūgštinėje, ir šarminėje
terpėje stabilios lipazės. Lipazių pagalba gaunami kokybiškesni produktai (švaresni,
pasižymintys tolygesne spalva, geresne bendra išvaizda). Lipazės taip pat pagerina
vandeniui atsparios odos produktų kokybę [247]. Šalinant plaukus nuo odos įprastais
tradiciniais metodais, naudojami kalkių ir natrio sulfidų mišiniai – agresyvios ir aplinką
teršiančios medžiagos. Šio proceso metu cheminius reagentus galima pakeisti fermentais
- lipazėmis bei proteazėmis, kurios veiksmingai atpalaiduoja plaukus, kurie vėliau
pašalinami tiesiog juos nufiltruojant. Taip gaunami geresnės kokybės gaminiai.
Popieriaus pramonėje lipazės naudojamos popieriaus valymui, masės
minkštinimo proceso pagreitinimui, baltumo padidinimui, taip sumažinamas naudojamų
agresyvių cheminių medžiagų bei teršalų kiekis, taupomos energijos ir laiko sąnaudos
[249].

1.5.7 Atliekų apdorojimas

Lipazės naudojamos ir valant užterštą, nuotekų vandenį, perdirbant poliesterių

atliekas į naudingus produktus, kaip prevencinė priemonė nuo įrenginių užsikimšimo
riebalinėmis atliekomis bei naikinant įvairias kitas atliekas. Išsiliejusiai naftai ir ja
užterštiems paplūdimiams valyti taip pat naudojamos lipazės [245, 250].

1.6 Biodyzelinas

Nesustojamas populiacijos bei energijos suvartojimo augimas, senkantys

iškastinio kuro ištekliai, vis didesnę grėsmę keliantys dėl vidaus degimo variklių
išmetamųjų dujų emisijų spartėjantys pasaulinio atšilimo reiškiniai yra pagrindinės
priežastys, skatinančios ieškoti alternatyvaus energijos šaltinio, kuris užtikrintų tvarų

41
žmonijos vystymąsi, energetinį saugumą bei pasaulinės ekonomikos augimą [135, 251-
253]. Nuo 1971 iki 2001 m. pasaulinis energijos suvartojimas padvigubėjo, ir manoma,
kad iki 2030 m. energijos poreikis išaugs dar 53 %. Pavyzdžiui, spėjama, kad iki
minėtųjų 2030 m. JAV naftos sunaudojimas išaugs nuo 84,4 iki 116 mln. barelių per
dieną [254]. Remiantis dabartiniu vartojimo greičiu, apskaičiuota, kad iškastinio kuro
turėtų užtekti ne ilgiau nei ateinantiems 50 metų [255].
Viena alternatyvų - iš biomasės gaunamas biokuras: bioetanolis, biometanolis,
biodyzelinas ir biovandenilis [256]. Kadangi biodyzelinui (RR alkilo esterių mišiniui)
būdingos fizikinės ir kitos savybės yra artimos iš naftos gautam dyzelinui, kas leidžia jam
efektyviai veikti tradiciniuose varikliuose be jokių didesnių papildomų modifikacijų,
būtent jis iš visų biokuro rūšių šiuo metu sulaukia didžiausio dėmesio [256-259].
Biokuro naudojimo dyzeliniuose varikliuose idėja pirmą kartą pristatyta
pasaulinėjė parodoje Paryžiuje 1900 m., kai dyzelinio variklio išradėjas Rudolf Christian
Karl Diesel (1858 - 1913) kaip kurą panaudojo žemės riešutų aliejų. Biokuras ar
augaliniai aliejai buvo naudojami vidaus degimo varikliuose 1920 - 1930 m. bei antrojo
pasaulinio karo metu visame pasaulyje. Vokietija, Argentina, Japonija, Belgija, Italija,
Prancūzija, Jungtinė Karalystė, Portugalija ir Kinija bandė ir naudojo įvarių rūšių
biokurą, tačiau dėl tuo metu ypatingai gausių naftos išteklių bei gerokai mažesnės
iškastinio kuro kainos alternatyvaus kuro idėja didesnio dėmesio nesulaukė, tad degalų
augalinių aliejų pagrindu kūrimas bei tolimesni tyrimai nebuvo vykdomi.
Atsinaujinantys energijos šaltiniai bei tokio tipo kuras didesnio dėmesio sulaukė
palyginti neseniai (augalinių aliejų, kaip kuro, tyrimai JAV prasidėjo 1978 m., o Pietų
Afrikoje – 1981 m.), kai buvo suvokta, kad būtina sumažinti šiltnamio efektą sukeliančių
dujų emisiją, o iškastinio kuro ištekliai labai greitai senka, ir todėl turi būti rasti
ekologiški atsinaujinantys pakaitalai [257, 260, 261]. 1982 m. Vokietijoje ir Austrijoje iš
rapsų aliejaus gauti metilo esteriai, o 1985 m. Austrijoje pastatytas pirmasis mažas
bandomasis fabrikas. Komercinė metilo esterių gamyba pirmiausia prasidėjo Europoje
1990 m. Nuo tada biodyzelinas lėtai plito Europos, ypač Vokietijos ir Prancūzijos,
rinkose, dažniausiai naudojamas ne grynas, bet maišomas su tradiciniu dyzelinu.
Komerciškai šie mišiniai vadinami BXX, kur XX yra skaičius, nurodantis procentinę
biodyzelino tūrio dalį dyzelino ir biodyzelino mišinyje. Šiuo metu rinkoje yra keturios

42
pagrindinės biodyzelino koncentracijos: grynas (B100), mišinys (B20 - B30), priedas
(B5) ir tepalingumo priedas (B2). 2003 m. Europoje pagaminta daugiau nei 2,7 mln. tonų
biodyzelino, o tikslas – iki 2020 m. pasiekti 20 % visos dyzelinio kuro rinkos [259, 262].

1.6.1 Biodyzelino privalumai

Šiuo metu biodyzelinas yra laikomas vienu idealiausių atsinaujinančių energijos

šaltinių. Lyginant su įprastu kuru, gaunamu iš naftos, biodyzelinas pasižymi keletu
reikšmingų privalumų: gaunamas iš įvairių atsinaujinančių biologinių šaltinių (augaliniai,
dumblių aliejai, gyvūninės kilmės riebalai, riebalinės atliekos ar šių žaliavų mišiniai),
mažiau toksiškas, greitai suyra gamtoje, jo struktūroje esantis deguonies kiekis (11 - 15
%) užtikrina spartesnį sudegimo vidaus degimo varikliuose procesą ir mažesnį į aplinką
išskiriamų teršalų kiekį: jį naudojant į aplinką išskiriama mažiau sieros oksido (100 %),
anglies monoksido (44 %), smulkiųjų dalelių (particulars) (40 %), nesudegusių
angliavandenilių (68 %) ir policiklinių aromatinių angliavandenilių (80 - 90 %) [263-
268]. Biodyzelinas vadinamas CO2 neutraliu kuru, mat jam degant išsiskyręs anglies
dioksidas yra sunaudojamas jo žaliavos augimo metu, ir taip nedidinamas šiltnamio
efektas [257, 263]. Kadangi augaliniuose aliejuose sieros koncentracija artima nuliui,
naudojant biodyzeliną sumažinama sieros rūgšties daroma žala aplinkai [269, 270]. Be
to, biodyzelino sudėtyje nėra ir sunkiųjų metalų (švino, vanadžio ir kadmio).
Ypatingai svarbi biodyzelino savybė – bioskalumas (skyla keturis kartus greičiau
nei įprastas kuras, gaunamas iš naftos), tad atsitiktinio išsiliejimo metu aplinkai
padaroma gerokai mažesnė žala palyginus su atitinkamais naftos išsiliejimo avarijų
padariniais [259, 262]. Kaip jau minėta, RR metilo esteriai (biodyzelinas) yra netoksiški
ir lengvai biodegraduojantys vandeninėje aplinkoje. Nustatyta, kad per 21 d. laikotarpį
biologiškai suskaidoma 98 % iš rapsų aliejaus gautų metilo esterių, o gryno iš naftos
gauto dyzelino suskaidymo efektyvumas per tą patį laikotarpį siekia tik 60 %. Tad iš
rapsų aliejaus gauti metilo esteriai visiškai atitinka pagrindinius tarptautinius
biodegradacijos standartus (biokuro skaidymo efektyvumas turi siekti daugiau nei 90 %
per 21 d. laikotarpį) [271].
Biodyzelinui būdinga santykinai aukšta pliūpsnio temperatūra (150oC), (iš naftos
gauto tradicinio dyzelino atveju temperatūra nesiekia nė 64oC), tad jis yra nedegus,

43
nesprogus, mažiau lakus (neprodukuoja sprogių garų), o tai garantuoja didesnį jo
pervežimo bei laikymo saugumą [135]. Šis kuras pasižymi ir geromis tepalinėmis
savybėmis, kurių dėka sumažinamas variklio susidėvėjimo greitis [272].

1.6.2 Biodyzelino gamyba

Grynas augalinis aliejus pasižymi žemu oksidaciniu stabilumu ir po to

vykstančiomis polimerizacijos reakcijomis, mažu lakumu, dėl ko degimo metu susidaro
santykinai didelis pelenų kiekis, bei gana didele klampa (11 - 17 kartų didesnė už
dyzelinio kuro), dėl ko yra netinkamas klasikiniams vidaus degimo varikliams [3], ir dėl
to turi būti chemiškai modifikuojamas į monoalkilo esterius.
Pagrindiniai šiuo metu egzistuojantys metodai, siekiant gauti biodyzeliną, yra
mikroemulsinimas [273], maišymas su naftos produktais [274, 275], terminis
krekingas/pirolizė [276, 277] bei transesterinimas [278, 279]. Klampos mažinimas ir
cetano skaičiaus didinimas mikroemulsinimo ir terminio krekingo metodais pasirodė
nepakankamai veiksmingas, o aliejų maišymas su naftos produktais (dyzelinu), nors ir
dažnai taikomas, visgi nepakankamai sumažina iškastinio kuro sąnaudas, be to, nėra iki
galo ištirtas tokio kuro ilgalaikis poveikis varikliui [269].
TAG transesterinimo ir laisvų RR esterinimo reakcijos pasirodė esąs
reikšmingiausias ir palankiausias būdas, gaminant aukštesnės kokybės biodyzeliną [263,
280, 281]. Šių reakcijų metu bet kokios kilmės žaliava, turinti laisvų RR ir/ar TAG, tokia
kaip augaliniai aliejai, riebalinės atliekos, gyvūninės kilmės riebalai ir kt. paverčiama
biodyzelinu. Reakcijos metu vienas molis TAG reaguoja su trimis moliais alkoholio,
susidarant trims moliams alkilo esterių bei vienam moliui glicerolio (1.17 pav.) [282,
283]. Tai yra trijų grįžtamų reakcijų seka, kurių metu TAG paverčiamas DAG, DAG –
MAG, ir tada MAG – gliceroliu [284].

Katalizatorius

Triacilglicerolis Alkoholis Esteriai Glicerolis

1.17 pav. Triacilglicerolių transesterinimo alkoholiais reakcijos schema [282].

44
 Transesterinimo reakcijos efektyvumą bei galutinių produktų išeigos dydį
nulemia keletas veiksnių: reakcijos temperatūra, laisvų RR ir vandens kiekis žaliavoje,
katalizatoriaus tipas bei kiekis, reakcijos trukmė, substratų molinis santykis, alkoholio
tipas bei tiekimo į reakcijos mišinį pobūdis, ko-tirpiklių naudojimas bei maišymo
intensyvumas [254]. Transesterinimo reakcija yra grįžtama, ir alkoholio
(acilakceptoriaus) perteklius pastumia pusiausvyrą į produkto susidarymo pusę.
Egzistuoja du transesterinimo metodai: su katalizatoriumi ir be jo
(superkritinėmis sąlygomis) [285, 286]. Katalizatorius gali būti cheminės (rūgštinis,
bazinis) arba fermentinės kilmės. Šiuolaikiniai tyrimai koncentruojasi į šarminę ir
fermentinę katalizę, nes, veikiant rūgštiniams katalizatoriams, procesas yra ilgas, reikia
didesnio alkoholio kiekio, aukštesnės temperatūros, didesnio slėgio, o tai ekonomiškai
nepalanku [287, 288].
Nors šiuo metu vis dar vyrauja cheminiai metodai, jie turi keletą akivaizdžių
trūkumų: didelės energijos sąnaudos, brangi įranga, sudėtingi procesai, aplinkos tarša
[289]. Daugumos šių trūkumų galima išvengti taikant biotechnologinę (fermentinę)
gamybą. Fermentinio proceso metu riebalų transesterinimo reakcijas katalizuoja lipazės
[282, 290-292]. Nors šio proceso ekonominės sąnaudos pramoniniu mastu yra gana
didelės, o biologiniams katalizatoriams būdinga palyginti lengva inaktyvacija, tačiau
įvairių acilakceptorių, tirpiklių ir pigiausių daugkartiniam naudojimui tinkamų fermentų
paieška, fermentų modifikacijų bei imobilizacijos taikymas teikia vilčių sukurti
konkurencingą rinkai patrauklų biodyzelino gamybos metodą [24, 254, 287, 293].
Kaip minėta anksčiau, transesterinimo reakcijas galima vykdyti ir be įprasto
katalizatoriaus. Tokių reakcijų metu naudojamas superkritinis metanolis, kuris, esant
superkritinėms sąlygoms (pvz., 350oC, 43 Mpa), pats veikia kaip rūgštinis katalizatorius
[294]. Tokia reakcija trunka nepalyginamai trumpiau (mažiau nei 4 minutes) [258, 295,
296], gali būti naudojama cheminei katalizei netinkama žaliava (turinti didesnį laisvų RR
ir vandens kiekį), tačiau procesas labai brangus ir sunkiai įgyvendinamas didelio masto
gamybos pramonėje dėl būtinų ekstremalių reakcijos sąlygų, o didelio metanolio kiekio
naudojimas (metanolio ir aliejaus molinis santykis gali siekti 42:1) yra pavojingas
aplinkai. Visa tai trukdo proceso komercializavimui [297]. Siekiant sušvelninti proceso

45
sąlygas, naudojami įvairūs ko-tirpikliai, pridedamas nedidelis kiekis katalizatoriaus
[293].

1.6.3 Biodyzelino kokybę nulemiantys veiksniai

Biodyzelino kokybę gana smarkiai nulemia RR sudėtis bei transesterinimo

reakcijoms naudojamo alkoholio tipas. Kuo ilgesnė RR grandinė, tuo geresnės bus tokios
biodyzelino savybės kaip šiluminė talpa [298] ir cetano skaičius, kuris nusako gebą
detonuoti (t.y., užsiliepsnoti nuo suspaudimo) [299]. Žiemos metu aliejai, turintys didelį
kiekį sočių RR, gali užkišti kuro tiekimo linijas dėl sukietėjimo [259, 262, 300, 301].
Biodyzelinas, gaminamas iš aliejų, turinčių didelį oleino rūgšties kiekį, pasižymi
savybėmis, artimiausiomis įprastam dyzeliniam kurui [3, 302]. Visais metodais gauti
galutiniai biodyzelino sintezės produktai turi atitikti visuotinai apibrėžtus griežtus
reikalavimus (Europinis standartas EN 14214, JAV – ASTM D 6751-02) [303].

1.6.4 Žaliava
1.6.4.1 Aliejus
Kaip žinoma, svarbiausia priežastis, stabdanti biodyzelino komercializacijos
procesą, yra dideli gamybos kaštai, kurių 70 - 80 % sudaro žaliavos (maistinių aliejų)
kaina [252, 304]. Nors biodyzelino gamybai maistinis aliejus yra labai plačiai
naudojamas, ir tai šiuo metu vis dar yra pagrindinė žaliava, vis dėlto maisto stygius
besivystančiose šalyse bei natūralios bioįvairovės sutrikdymo grėsmė dėl didelių
maistinės aliejingos žaliavos plantacijų skatina ieškoti alternatyvių nemaistinės kilmės
riebalų šaltinių (dumbliai, nemaistiniai aliejai, riebalinės atliekos ir kt.) [305-309]. Būtent
fermentinė katalizė suteikia galimybę panaudoti tokią alternatyvią žaliavą, nes jai nėra
būdingi saviti chemine katalize pagrįsti technologijos trūkumai: būtinas ypatingai mažas
laisvų RR bei vandens kiekis žaliavoje, norint išvengi potencialaus muilų susidarymo
proceso metu [254, 293].
Žaliavos pasirinkimas paprastai priklauso nuo geografinės vietovės padėties ir
klimato sąlygų [302] bei ekonomikos [310], pvz., JAV – sojų, Europoje – rapsų ir
saulėgrąžų, o tropinio klimato šalyse – palmių bei kokosų aliejai yra įprasta biodyzelino
gamybos žaliava [311, 312]. Pasaulyje augalinių aliejų gamyba nuolat auga [313].

46
Pirmaujantis pagal išgavimo mastus maistinis aliejus gaunamas iš palmių - jo gamyba
išaugo nuo 17,1 mln. tonų 1997 m. iki 38,2 mln. tonų 2006 m. [314]. Šiam aliejui
būdingas didžiausias iš 1 ha išgaunamas produkto kiekis (apie 5000 kg), palyginus su
kitais aliejais, kurių didžiausias išgaunamas iš 1 ha žaliavos kiekis siekia 2250 kg
(kokosų aliejaus atveju), tad ekonominiu atžvilgiu naudingiausia naudoti palmių aliejų
[251]. Pagrindinė palmių aliejaus gamintoja yra Malaizija (Indonezija yra antroji šalis
pagal palmių aliejaus eksporto mastą pasaulyje) [314, 315].
Kadangi, kaip minėta anksčiau, didžiąją biodyzelino kainos dalį sudaro tradicinių
augalinės kilmės žaliavų kaina, didelių kaštų problemą bandoma spręsti, ieškant
tinkamiausių nemaistinės žaliavos šaltinių, mat įvairių aliejų naudojimui biodyzelino
gamyboje nėra jokių techninių apribojimų. Vieni tokių aliejų - ricinų ir braivėlių
(Jatropha curcas) [251]. Biodyzelino gamyba iš šių aliejų yra konkurencinga gamybai iš
maistinių aliejų tiek proceso, tiek ir kokybės atžvilgiu [316]. Palyginus su kita aliejinga
žaliava, Jatropha curcas kultūroms būdingas papildomas privalumas – atsparumas
sausrai (gali augti apleistose, nederlingose kitiems augalams netinkamose žemėse) [317].
Šiuo metu ypatingai didelis susidomėjimas biodyzelino gamyba iš dumblių aliejų
[318, 319]. Demirbas (2010) teigia, kad tai yra vienintelė žaliava, galinti visiškai
patenkinti transporto sektoriaus kuro poreikį pasauliniu mastu. Teigiama, kad artimiausiu
metu būtent šis aliejus taps pagrindine ir svarbiausia biodyzelino gamybos žaliava [320].
Dumbliai yra mikroskopiniai autotrofiniai ir heterotrofiniai organizmai [321,
322], sparčiai besidauginantys ir augantys tiek sintetinėse (druskų tirpalai), tiek ir
natūraliose (vandenvalos ir gyvulininkystės bei paukštininkystės fermų nuotekos) terpėse
[323]. Palyginus su augalais, dumblių augimas yra labai spartus procesas [324, 325],
pavyzdžiui, Chlorella per 24 val. suformuoja dvi naujas generacijas, t.y., iš vienos
ląstelės susidaro keturios. Kai kurios dumblių rūšys sukaupia ypatingai daug lipidų [326],
kurie savo sudėtimi yra analogiški iš įprastų augalinių kultūrų (rapsų, saulėgrąžų, palmių
ir kt.) gaunamiems aliejams [327, 328]. Be to, dumblių aliejaus kiekis hektarui žemės yra
gerokai didesnis palyginus su tradicinėmis aliejingomis kultūromis (l.2 lentelė).
Plačiausiai lipidų išskyrimui iš dumblių yra naudojami spaudimo, ekstrakcijos
tirpikliais, ardymo ultragarsu ir kt. metodai, o išskirtų lipidų išeigos gerokai viršija iš
tradicinių aliejingų augalų išskirtų aliejų išeigas [327-329]. Po lipidų išskyrimo likusi

47
dumblių biomasė gali būti paversta kitomis biodegalų rūšimis – biometanu, bioetanoliu ir
biovandeniliu. Visgi, siekiant komercializuoti šį procesą, susidurta su dumblių ląstelių
ardymo bei aliejų ir kitų bioproduktų išskyrimo iš jų problema. Literatūroje iki šiol nėra
aprašyta nė vieno visapusiškai efektyvaus metodo.

1.2 lentelė. Iš kai kurių šaltinių išgaunamo aliejaus bei kai kurių mikrodumblių sukaupiamų
lipidų kiekio palyginimas [285]
Šaltinis Išgaunamo aliejaus kiekis Lipidų kiekis
(L/ha) (% sausos biomasės)
Kukurūzai 172
Soja 446
Rapsai 1190
Braivėlis 1892
Riešutinė kokospalmė 2689
Palmė 5950
a
Mikrodumbliai 136900
b
Mikrodumbliai 58700
-Botryococcus braunii 25 - 75
-Chlorella sp. 28 - 32
-Crypthecodinium cohnii 20
-Cylindrotheca sp. 16 - 37
-Dunaliella primolecta 23
-Isochrysis sp. 25 - 33
-Monallanthus salina > 20
-Nannochloris sp. 20 - 35
-Nannochloropsis sp. 31 - 68
-Neochloris oleoabundans 35 - 54
-Nitzschia sp. 45 - 47
-Phaeodactylum tricornutum 20 - 30
-Schizochytrium sp. 50 - 77
-Tetraselmis sueica 15 - 23
a
kai lipidai sudaro 70 % sausos biomasės
b
kai lipidai sudaro 30 % sausos biomasės

Riebalinių atliekų naudojimas vietoj grynų aliejų galėtų veiksmingai (60 - 90 %)

sumažinti biodyzelino kainą bei dirbamos žemės plotus, skirtus biodyzelino gamybai
reikalingoms kultūroms auginti, tačiau prieš tokių atliekų taikymą gamyboje, būtina

48
atlikti gryninimo procedūras, kas vėlgi nėra ekonomiškai palanku [254], tuo labiau, kad
nustatyta, jog tokios žaliavos naudojimo metu išsiskiria dioksinai [330]. Be to, būtina
sukurti efektyvią tokių atliekų surinkimo infrastruktūrą.
Atliekų aliejus savo sudėtimi gana skiriasi nuo įprastai naudojamų šviežių aliejų.
Esant aukštesnei temperatūrai ir didesniam vandens kiekiui, vyksta TAG hidrolizė, todėl
vandens kiekis riebalinėse atliekose siekia apie 2000 ppm, o laisvų RR gali būti iki 15 %
ar daugiau [331]. Tad šiuo atveju šarminė katalizė negali būti taikoma dėl galimo muilų
susidarymo [332, 333]. Kita vertus, lipazės gali esterinti visas atliekų aliejuose esančias
laisvas RR [334]. Pavyzdžiui, palyginus Novozym 435 katalizuojamas reakcijas, kai kaip
žaliava naudotas atliekų bei grynas aliejus, nustatyta, kad reakcijos abiem atvejais vyksta
panašiai, produktyvumas beveik toks pat. Nors didesnis vandens kiekis atliekose ir
sumažino metanolizės greitį, tačiau reakcijos pusiausvyrai įtakos neturėjo [335]. Tai
patvirtina lipazių pritaikymo galimybę, perdirbant riebalines atliekas [334].
Biodyzelino gamybai gali būti naudojami ir gyvulinės kilmės riebalai [336] bei
aliejai, gauti iš genetiškai modifikuotų augalų, produkuojančių daugiau aliejų,
pasižyminčių papildomomis teigiamomis savybėmis (atsparumu sausrai ar ligoms) ir pan.
[20, 337, 338]. Tačiau šiuo atveju turi būti ypatingai atsižvelgta į atsargumo priemones,
siekiant užtikrinti tokių genetiškai modifikuotų kultūrų biosaugumą [337].

1.6.4.2 Acilakceptoriai
Įvairių riebalų transesterinimo reakcijų metu kaip acilakceptoriai dažniausiai
naudojami trumpagrandžiai alkoholiai, ypač metanolis (daugelyje šalių tai pigiausias
alkoholis) ir kiek rečiau etanolis. Dažniau pasirenkamas metanolis, nes jis yra pigesnis,
reaktingesnis, o RR metilo esteriai yra lakesni bei mažiau klampūs, palyginus su
atitinkamais etilo esteriais. Kita vertus, etanolis yra mažiau toksiškas, be to, gali būti
lengvai gaunamas fermentacijos būdu iš atsinaujinančių šaltinių (biomasės), o didžioji
metanolio dalis yra gaunama iš iškastinio kuro [339]. Naudojami ir kiti alkoholiai, tačiau
jie yra brangesni, todėl bendros ekonominės proceso sąnaudos būna didesnės [286].

49
1.6.5 Cheminė katalizė

Pramoninis biodyzelino gamybos procesas paprastai vyksta kaitinant augalinį

aliejų, esant alkoholio (dažniausiai metanolio) pertekliui bei neorganiniam katalizatoriui.
Kaip katalizatoriai dažniausiai naudojami šarmai (metalų alkoksidai ir hidroksidai), nes
tai yra santykinai pigūs ir lengvai gaunami katalizatoriai, be to, šarminė katalizė vyksta
apie 4000 kartų greičiau nei rūgštinė [313, 340]. Hidroksidai naudojami dažniau nei
alkoksidai, nes jie yra pigesni, tačiau ne tokie aktyvūs kaip atitinkami alkoksidai.
Šarminis katalizatorius, pvz., kalio hidroksidas, reaguoja su metanoliu, susidarant kalio
metoksidui, kuris ir reaguoja su TAG. Reakcijos produktai – esterių mišinys bei keletas
šalutinių produktų, kurių pagrindinis yra glicerolis. Tokio proceso pagrindinis trūkumas
yra tas, kad katalizatorius atsiskiria kartu su glicerolio sluoksniu ir nebegali būti toliau
naudojamas [341]. Dalinės TAG alkoholizės metu susidaro DAG ir/ar MAG, kurie turi
būti atskirti ir grąžinti į reaktorių. Reakcijos mišinyje taip pat randamos laisvos RR,
vanduo bei nesureagavęs katalizatorius.
Nors šarminės katalizės metu per gana trumpą laiką gaunamos didelės produkto
išeigos, šis procesas turi keletą reikšmingų trūkumų: žaliava turi būti pakankamai gryna
(laisvų RR turi būti mažiau nei 1 %, o vandens < 0,5 %) [342]. Kai biodyzelino gamybai
naudojamas aliejus savo sudėtyje turi daug laisvų RR ir vandens, tradiciniai šarminiai
katalizatoriai netinka, nes proceso metu laisvos RR reaguoja su šarminiu katalizatoriumi,
ir susidaro muilai. Taip sunaudojamas katalizatorius, sumažėja pageidaujamo galutinio
produkto – alkilo esterių – išeiga, sudėtingėja glicerolio atskyrimas nuo alkilo esterių,
padidėja klampa, susidaro geliai, emulsija, - visa tai sudaro daug problemų vėliau
gryninant ir išgaunant alkilo esterius [283, 343, 344]. Po reakcijos junginių atskyrimo
stadijos metu dėl poliškumo muilai ištirpsta glicerolio fazėje, taip pagerindami metilo
esterių tirpumą glicerolyje, ir sumažindami galutinę esterių išeigą [272].
Be to, po reakcijos, siekiant pašalinti muilus ir glicerolį, galutinis produktas 2 - 3
kartus plaunamas dideliu kiekiu vandens, taip susidaro apie 0,2 t. šarminių nuotekų
vienai tonai biodyzelino, kurios po to turi būti atitinkamai neutralizuojamos,
apdorojamos. Be to, susidaręs glicerolis paprastai būna užterštas katalizatoriaus

50
priemaišomis, ir tai sumažina jo komercinę vertę. [289, 342]. Tradicinės šarminės
biodyzelino gamybos schema pateikta 1.18 paveiksle.
Kaip alternatyva naudojami rūgštiniai homogeniniai katalizatoriai (pvz., sieros
rūgštis), kurie tinkami žemos kokybės žaliavai (turinčiai didelį laisvų RR bei vandens
kiekį) [346]. Šiuo atveju nesusidaro muilai, tuo pačiu metu vyksta ir laisvų RR
esterinimas, ir TAG transesterinimas, tačiau esterinimo reakcija trunka ilgai, reikia
aukštesnės temperatūros ir didelės rūgšties koncentracijos, kas daro neigiamą įtaką
aliejui, be to išlieka ir gryninimo problemos [135, 347, 348], o rūgštinis katalizatorius
gali sukelti dar ir įrangos koroziją [346].
Alkoholis
perdirbimui
Aliejus/riebalai
Neapdorotas
Neapdorotų Neutralizacija/ Distiliacija/
biodyzelinas Džiovinimas
biodyzelino gamybos plovimas garinimas
Alkoholis Transesterinimo
produktų atskyrimas vandeniu
reakcija

Šarmas Neapdororas glicerolis, Nuotekos

priemaišos, nešvarumai Galutinis
Mineralinė rūgštis
(H3PO4) produktas
(biodyzelinas)

Mineralinė rūgštis (H2SO4) Glicerolio Grynas glicerolis

gryninimas

Laisvos riebalų rūgštys

1.18 pav. Tradicinė šarminė biodyzelino gamyba [345].

Kaip minėta, didžiausios cheminės katalizės problemos yra ilga reakcijos trukmė
(rūgštinių katalizatorių atveju) ir metilo esterių nuo glicerolio atskyrimas (muilo
susidarymas šarminių katalizatorių atveju). Šias problemas bandoma spręsti naudojant
rūgštinę ir šarminę katalizę apjungiantį dviejų stadijų procesą. Pirmos stadijos metu
vyksta rūgštinė katalizė - esterinamos laisvos RR iki mažesnio nei 1 % kiekio. Antros
stadijos metu vyksta šarminė katalizė – riebalų transesterinimo reakcija [349, 350].
Literatūroje aprašomi atvejai, kai dviejų stadijų procesas reakcijos produktų išeigas
padidino 30 %, palyginus su vienos stadijos procesais, ir biodyzelino išeiga siekė 98 %
[351, 352]. Daugeliu tyrimų nustatyta, kad dviejų stadijų procesas yra veiksmingesnis,
tačiau ir šiuo atveju susiduriama su tam tikromis problemomis, kurių didžiausia – po
kiekvienos stadijos būtinas katalizatoriaus pašalinimas iš reakcijos mišinio. Ši problema
gali būti sprendžiama neutralizuojant pirmos stadijos rūgštinį katalizatorių, tačiau tuomet
antros stadijos metu turi būti naudojamas gerokai didesnis šarminio katalizatoriaus

51
kiekis, kas padidina proceso kaštus, be to katalizatorių likučiai vėliau gali būti
kenksmingi varikliams [254].
Įranga, kurioje vykdomi cheminės katalizės procesai, turi būti atspari šiems
agresyviems agentams, be to, reikia aukštų saugumo standartų. Tai daro šį procesą
ekonomiškai nepalankų ir per daug sudėtingą [135].

1.6.6 Fermentinė katalizė

Nors finansiniu požiūriu cheminis būdas pranašesnis už fermentinį, tačiau

ypatingai daug energijos, vandens išteklių ir laiko sąnaudų reikalaujantis produkto
gryninimas, pašalinant iš mišinio glicerolį, vandenį ir netinkamus produktus, skatina
ieškoti optimalių katalizės sąlygų, užtikrinančių ekologiškesnį ir ekonomiškesnį proceso
vyksmą. Tiesioginis RR esterinimas ar TAG transesterinimas alkoholiais lipazių pagalba
yra kur kas patrauklesnis būdas nei klasikinė pramoninė cheminė konversija, nes taip
galima išvengti daugelio anksčiau minėtų problemų [300, 353, 354].
Imobilizuotų lipazių taikymas yra perspektyviausias išvardintų problemų
sprendimo būdas: reakcijos gali vykti be tirpiklio - terpėse, sudarytose tik iš reaguojančių
medžiagų mišinio, susidarant išimtinai tik RR esteriams bei gliceroliui, o galimybė
pakartotinai naudoti imobilizuotą fermentą sumažina proceso kaštus [347, 353, 355,
356]. Susidarę produktai lengvai atskiriami ir yra ypatingai aukštos kokybės (fementinės
biodyzelino gamybos schema pateikta 1.19 paveiksle). Be to, lipazių katalizuojamų
procesų veiksmingumui užtikrinti pakanka švelnių reakcijų sąlygų: santykinai žemos
temperatūros, atmosferos slėgio, nereikia naudoti agresyvių reagentų. Tačiau ir čia
susiduriama su tam tikromis problemomis, kurių viena pagrindinių – lipazių slopinimas
reakcijos mišinio komponentais [357]. Be to, neapdorotame aliejuje paprastai aptinkamas
sąlyginai didelis fosfolipidų kiekis. Žaliavoje esantys fosfolipidai padengia lipazių
paviršių, taip slopindami jų aktyvumą, todėl prieš biodyzelino gamybos procesą būtinas
fosfolipidų pašalinimas. Šiam tikslui įgyvendinti taikomi patys įvairiausi metodai:
hidratacija, filtracija membranomis, superkritinė ekstrakcija ir kt. [358, 359].

52
 Aliejus/riebalai
Viršutinis
Produktų sluoksnis Galutinis
Transesterinimo atskyrimas/gryninimas produktas
Alkoholis
reakcija (biodyzelinas)

Fermentai Apatinis sluoksnis

Glicerolio
gryninimas Grynas glicerolis

1.19 pav. Fermentinė biodyzelino gamyba [345].

Lipazių katalizuojamos transesterinimo reakcijos plačiai vykdomos įvairiuose

organiniuose tirpikliuose bei sistemose be tirpiklių. Nors katalizinis transesterinimo
mechanizmas (ping-pong bi-bi) yra gerai išaiškintas [360] ir reakcijos sistema paprastai
sudaryta tik iš penkių skirtingų junginių (fermento, dviejų substratų: alkoholio ir esterio,
likutinio vandens ir organinio tirpiklio), reakcijos kinetika, esant skirtingoms sąlygoms,
vis dar gali nustebinti. Kinetikos sudėtingumas kyla iš to, kad visi junginiai sąveikauja, ir
todėl dažnai sunku įžiūrėti atskirus efektus/poveikius, identifikuoti jų molekulinius
mechanizmus ir prognozuoti sistemos elgesį [361].

1.6.6.1 Lipazėms keliami reikalavimai

Pagrindiniai reikalavimai, keliami lipazėms, norint jas panaudoti biodyzelino
gamyboje:
• didelė galutinio produkto išeiga (pageidaujamas nestereosavitumas, kad visi tri-,
di- ir monoacilgliceroliai galėtų būti paversti RR esteriais);
• nedidelis fermento slopinimas reakcijos mišinio komponentais (alkoholiu bei
reakcijos metu susidarančiu gliceroliu);
• greitas procesas;
• galimybė pakartotinai naudoti fermentą (imobilizacija);
• atsparumas temperatūros ir naudojamo organinio tirpiklio poveikiui;
• lengvas ir pigus lipolizinio fermento gavimas.
Burkholderia cepacia (Pseudomonas cepacia) yra viena dažniausiai naudojamų
bakterinių lipazių transesterinimo reakcijoms katalizuoti. Imobilizuota lipazė pakankamai
efektyviai katalizuoja biodyzelino sintezę tiek organiniuose tirpikliuose, tiek sistemose
be tirpiklio [362, 363]. Dažnai naudojama ir iš Pseudomonas fluorescens išskirta lipazė

53
[364, 365]. CALB yra plačiausiai taikoma iš mielių išskiriama lipazė [366]. Plačiai
naudojamos ir iš Candida sp. 99-125 [86] bei C. rugosa [367] išskirtos lipazės.
Dažniausiai transesterinimo reakcijoms naudojamų grybinės kilmės lipolizinių fermentų
pavyzdžiai: T. lanuginosus [368], R. oryzae [369], Penicillium expansum [215],
Geotrichum sp. [370] ir kitos lipazės. Literatūroje aprašyti ir iš kiaulės kasos išskirtos II
tipo lipazės gebos katalizuoti transesterinimo reakcijas tyrimai, tačiau didžiausia gauta
esterių išeiga nesiekia nė 19 % [371].
Šiuo metu egzistuoja pačios įvairiausios lipazių efektyvumo didinimo bei savybių
gerinimo strategijos, pradedant baltymų inžinerijos metodais ir baigiant imobilizacija bei
chemine modifikacija. [252]. Literatūroje aprašytas sėkmingas netgi visos R. oryzae
ląstelės kaip biokatalizatoriaus panaudojimas, ir ištirta ląstelės membranos sudėtyje
esančių RR įtaka biodyzelino gamybai [372]. Palyginus imobilizuotus fermentus su visos
ląstelės katalizatoriais, pastarieji pasižymi unikalia savybe – jie veikia kaip nedirbtinai
imobilizuoti fermentai. Tokiu būdu ši technologija tampa ekonomiškene bei paprastesne
alternatyva tradiciniams dirbtinio imobilizavimo metodams [252].

1.6.6.2 Fermento slopinimo reakcijos komponentais problemos sprendimo būdai

Gaminant biodyzeliną fermentinės katalizės būdu, viena aktualiausių problemų –
fermento slopinimas vienu iš reakcijos substratų - trumpos grandinės alkoholiu
(metanoliu) - ir reakcijos metu susidarančiu gliceroliu. Kadangi metanolis yra
augaliniuose aliejuose netirpus junginys, sistemoje susidaro nauja skysta fazė, nulemianti
fermento inaktyvaciją ir dėl to sumažėjusią galutinio produkto išeigą [23, 373]. Nors
molekulinis slopinimo metanoliu mechanizmas nėra iki galo išaiškintas, manoma, kad,
aliejuose susidarantys metanolio lašeliai, esant didelėms jo koncentracijoms, inaktyvuoja
lipazes, jas denatūruodami [354, 373].
Slopinantis metanolio poveikis yra didelis reakcijos pradžioje, bet proceso eigoje
poveikis mažėja, nes mažėja metanolio koncentracija, o jo tirpumas produktuose (RR
esteriuose) yra geresnis nei substratuose (TAG) [373]. Kita vertus, reakcijos metu
susidarantis hidrofilinis šalutinis produktas glicerolis taip pat netirpus aliejuose, tad jis
lengvai adsorbuojasi ant imobilizuotų lipazių paviršiaus, taip neigiamai veikdamas jų

54
aktyvumą bei stabilumą [335, 374, 375]. Tad slopinimo dėl katalizatoriaus pasidengimo
glicerolio molekulėmis reakcijos pradžioje nėra, bet proceso eigos metu jis auga [375].
Literatūroje siūlomi keli būdai šiai problemai spręsti: nuolatinis mažų metanolio
porcijų tiekimas į reakcijos mišinį, kitų acilakceptorių ir/ar įvairių tirpiklių parinkimas,
fermento apdorojimas prieš reakciją ir kt. [373, 376]. Skirtingų lipazių jautrumas
metanoliui skiriasi, tad taip pat svarbu parinkti ir tinkamą lipazę. Pavyzdžiui, nustatyta,
kad viena populiariausių daugeliui organinių tirpiklių atspari CALB (Novozym 435) yra
slopinama didelių metanolio koncentracijų [354, 373, 377], o labiausiai metanoliui
atsparus fermentas – lipazė, išskirta iš Pseudomonas cepacia.
Tokių hidrofobinių tirpiklių kaip n-heksanas ar petrolio eteris naudojimas
reakcijų mišiniuose [378] problemos neišsprendžia dėl prasto metanolio bei glicerolio
tirpumo juose [379]. Literatūroje aprašomas gana veiksmingos trioleino metanolizės
metodas, kai 1,4-dioksanas naudojamas kaip metanolį tirpinantis ko-tirpiklis, tačiau, kad
jo naudojimas pasiteisintų, reikia labai didelės šio tirpiklio dalies (90 %) [364]. Nors
tirpiklių naudojimas fermentinėje biodyzelino gamyboje yra vertinamas gana nepalankiai
dėl atsirandančios papildomos proceso stadijos (tirpiklio šalinimo iš reakcijos mišinio),
tačiau tirpiklio šalinimas yra įprasta praktika cheminėje biodyzelino gamyboje, todėl,
pramoniniu mastu, po fermentinės reakcijos tirpikliai gali būti regeneruojami kartu su
nesureagavusiu metanoliu [375].
Nustatyta, kad daugeliu atvejų hidrofilinio tret-butanolio naudojimas vietoj
tradicinių tirpiklių gali padidinti produkto išeigą [375, 380, 381]. Manoma, kad tai susiję
su tuo, jog tiek metanolis, tiek glicerolis yra tirpūs šiame tirpiklyje, dėl ko ir sumažėja jų
slopinantis poveikis [354, 375, 379-381]. tret-Butanolis yra tretinis alkoholis, tad jis
daugeliu atvejų nėra lipazių substratas [382], be to, tai - santykinai pigus, netoksiškas
tirpiklis [375]. Tokioje sistemoje dėl neigiamo metanolio ir glicerolio poveikio
neutralizavimo išauga lipazės veikimo stabilumas: aktyvumas nekinta net po 200-kartinio
jos panaudojimo [383]. Nors patvirtinta, kad tret-butanolis padidina metanolio tirpumą,
taip panaikindamas jo slopinantį poveikį lipazėms, molekulinis veikimo modelis liko
neišspręstas. Türkan ir Kalay (2008) nustatė, kad tret-butanolis keičia lipazių
katalizuojamų reakcijų mechanizmą, kaip tikėtina, sukeldamas konformacinius fermento
struktūros pokyčius, kas taip pat pašalina ir metanolio slopinantį poveikį [384]. Lipazės

55
turi panašią molekulės architektūrą, tačiau jų aktyvaus centro struktūros gali būti gana
skirtingos, kas nulemia kitokį substratinį savitumą ir netgi reakcijos mechanizmą [61,
385]. Nustatyta, kad organiniai tirpikliai gali keisti fermento aktyvumą, greitį
nulemiančią stadiją ir savitumą paprasčiausiai keisdami fizikochemines reakcijos terpės
savybes, tokias kaip poliškumas ir hidrofobiškumas [386, 387].
tret-Butanolio naudojimo privalumai: dideli reakcijų greičiai, didelės išeigos,
nereikia tokių didelių fermento kiekių kaip kitose sistemose, aukštas darbinis fermento
stabilumas net ir esant 50oC temperatūrai. Proceso pabaigoje žema tret-butanolio virimo
temperatūra leidžia jį kartu su metanoliu lengvai pašalinti iš reakcijos mišinio [375].
Siekiant padidinti lipazių stabilumą, aktyvumą ir atsparumą slopinančiam
metanolio poveikiui, fermentas prieš reakciją gali būti veikiamas įvairiais reagentais,
tokiais kaip substratai ar jų analogai, organiniai tirpikliai, druskos ar kraun eteriai.
Nustatyta, kad fermento veikimas 1 mM CaCl2 ir MgCl2 padidina jo aktyvumą,
toleranciją metanoliui bei veikimo stabilumą [388]. Literatūroje aprašomi ir atvejai, kai
metanolizė vyko greičiau, kai prieš reakciją C. antarctica lipazė buvo 30 min. inkubuota
metilo oleate ir po to 12 val. sojų aliejuje [389].
Nustatyta, kad biodyzelino žaliavoje esančios laisvos RR mažina neigiamą
metanolio poveikį lipazei [390]. Tai susiję su reagentų hidrofobiškumu (logPreagentai): kuo
mažesnė │logPreagentai - logPsąlyčio paviršius│vertė, tuo didesnė lipazės tolerancija metanolio
atžvilgiu (P - medžiagos pasiskirstymo tarp 1-oktanolio ir vandens koeficientas) [383,
391].
Dažnai be tret-butanolio biodyzelino sintezė apskritai nevyksta dėl galimo lipazės
slopinimo metanoliu, todėl vietoj metanolio naudojamas etanolis [335, 354, 356, 375,
378, 392]. Kita vertus, vietoj įprastų alkoholių kaip acilakceptoriai buvo pasiūlyti
atitinkami jų acetatai [393]. Nustatyta, kad metilacetatas neturi jokio neigiamo poveikio
fermento aktyvumui, ir beveik jokio aktyvumo netekimo nepastebėta lipazę pakartotinai
naudojant 100 kartų. Be to, taip išvengiama ir neigiamo glicerolio poveikio, nes vietoj jo
susidaro lipazėms jokio šalutinio poveikio neturintis triacetinas (1.20 pav.), ir negana to,
jo pritaikymas/panaudojimas įvairiapusiškesnis, platesnė rinka nei glicerolio [393, 394].
Tačiau tokie acilakceptoriai yra brangesni už įprastus alkoholius, reakcijos vyksta lėčiau,
o produktų išeigos yra gerokai mažesnės [86].

56
 Lipazė

Triacilglicerolis Metilacetatas Esteriai Triacetinas

1.20 pav. Lipazių katalizuojamos triacilglicerolių transesterinimo metilacetatu reakcijos schema

[393].

Literatūroje aprašomi ir kitokie fermento slopinimo metanoliu problemos

sprendimo būdai. Vienas įdomesnių - vietoj grynų aliejų naudojami tų aliejų ir ricinų
aliejaus mišiniai [395]. Ricinų aliejus gaunamas iš paprastųjų ricinmedžių (Ricinus
communis) sėklų, savo sudėtyje sukaupiančių iki 40 - 60 % aliejaus [396]. Pagrindinė
ricinų aliejaus riebalų rūgštis yra ricinolio (12-hidroksioleino) (1.21 pav.), turinti dvigubą
ryšį ties C9 ir hidroksigrupę ties C12, pastarosios buvimas ir nulemia ricinų aliejaus
tirpumą metanolyje bei transesterinimo reakcijos produkte - metilo esteriuose [395].
Kadangi būtent metanolio netirpumas augaliniuose aliejuose nulemia fermento
inaktyvaciją, manoma, kad ricinų aliejaus pridėjimas į reakcijos mišinį turėtų padidinti
fermentinės aliejų metanolizės efektyvumą. Be to, ricinų aliejus reakcijos metu veikia ne
tik kaip reakcijos efektyvumo didintojas, bet ir kaip substratas [397].

1.21 pav. Ricinolio rūgšties struktūrinė formulė [395].

Iš gryno ricinų aliejaus gautas biodyzelinas netinkamas dėl didelės jo klampos

[398], kita vertus, palyginus su biodyzelinu, gautu iš kitų augalinių aliejų, biodyzelinui iš
ricinų aliejaus būdingas didelis cetano skaičius bei žema ribinė šalto filtravimo
temperatūra (cold filter plugging point). Tad šios abi biodyzelino, gauto iš kitų augalinių
aliejų, savybės gali būti pagerintos, pridedant maždaug 20 % iš ricinų aliejaus gauto
biodyzelino [399, 400].

57
1.6.6.3 Vandens kiekio įtaka transesterinimo reakcijai
Viena vertus, vandens perteklius reakcijos mišinyje gali pastumti reakcijos
pusiausvyrą į riebalų hidrolizės pusę, susidarant laisvoms RR, kita vertus, įvairių
lipolizinių fermentų tyrimais nustatyta, kad nesant vandens, fermentai pasižymi mažu
aktyvumu, ir tai patvirtina, kad minimalus vandens kiekis reikalingas fermentui įgauti ir
palaikyti kataliziškai aktyvią konformaciją, nes lipazės aktyvumas bendru atveju
priklauso nuo fazių sąlyčio ribos, kuri susidaro tarp aliejaus ir vandens [135, 252, 373,
390, 401, 402]. Minimalus vandens kiekis, būtinas aktyviai fermento konformacijai
palaikyti, skirtingiems fermentams skiriasi ir priklauso nuo konkrečios lipazės prigimties,
todėl optimalus vandens kiekis reakcijos mišinyje turi būti nustatomas kiekvienai lipazei
bei reakcijai individualiai.
Nors vanduo organiniuose tirpikliuose yra reikalingas fermentui, jis taip pat
dalyvauja ir daugelyje fermento inaktyvavimo procesų [403]. Per didelis vandens kiekis
sukelia fermento molekulių agregaciją, o tai lemia fermento aktyvumo sumažėjimą. Be
to, imobilizuotų fermentų atveju vanduo gali užpildyti matricos, kurioje imobilizuota
lipazė, poras ir taip neleisti hidrofobiniams substratams pasiekti fermentą. [362-364, 404,
405]. Atlikus tyrimus su skirtingais tirpiklais, besiskiriančiais logP verte, nustatyta, jog
skirtinguose tirpikliuose lipazei palaikyti maksimalų aktyvumą reikia skirtingo kiekio
vandens. Bendru atveju, kuo hidrofobiškesnis tirpiklis, tuo daugiau vandens reikia.
Stebima koreliacija tarp didžiausio vandens kiekio ir tirpiklio logP vertės [135].
Žaliavoje esančių laisvų RR esterinimo reakcijos metu susidarančio vandens
šalinimui iš reakcijos mišinio taikomi įvairūs metodai, tokie kaip dehidratuojančių
agentų, molekulinių sietų, specializuotų membranų ir ceolitų naudojimas [406, 407].

1.6.6.4 Fermento kiekio įtaka reakcijos eigai

Didinant fermento koncentraciją reakcijos mišinyje, proceso efektyvumas auga
iki tam tikros ribos, kurią pasiekus, tolimesnis fermento kiekio didinimas nebeturi jokios
įtakos proceso eigai [378, 382, 408]. Taip gali būti dėl to, kad, esant dideliam lipazės
kiekiui, aktyvusis centras substratams neprieinamas dėl fermento molekulių tarpusavio
agregacijos, susidarant imobilizuotų lipazių aglomeratams [409, 410].

58
1.6.6.5 Skirtingu savitumu pasižyminčių lipazių mišinių naudojimas
Šiuo metu žinoma nemažai imobilizuotų komercinių lipazių, gebančių efektyviai
katalizuoti biodyzelino sintezę [362, 363], tačiau vienų lipazių atveju reikia gana didelio
jų kiekio, kitais atvejais - ilgesnės reakcijos trukmės, kas nulemia didesnius gamybos
kaštus. Novozym 435 yra gana dažnai biodyzelino sintezei naudojama nesavita
komercinė lipazė (gali atskelti visas acilgrupes, esančias TAG molekulėje ties sn-1, 2 ir 3
padėtimis), tačiau dėl didelės šio fermento kainos (2270 $/kg), pramoninis pritaikymas
yra gana ribotas. Kita vertus, kita komercinė lipazė Lipozyme TL IM yra 1,3-savita, t.y.,
gali skelti acilgrupes tik ties sn-1 ir 3 pozicijomis, be to, pasižymi mažesniu
transesterinimo aktyvumu nei Novozym 435. Tačiau tai gerokai pigesnis fermentas - jo
kaina sudaro 1/16 Novozym 435 kainos. Tyrimų metu parodyta, kad kartu naudojant
Lipozyme TL IM ir Novozym 435 fermentus, stebimas teigiamas sinergetinis efektas. Ši
kombinacija sėkmingai pritaikyta biodyzelino sintezei [411]. Tokia strategija gali labai
sumažinti bendrą katalizatoriaus kainą ir padidinti produktų išeigą [261].
Kaip minėta anksčiau, transesterinimo reakcija gali būti suskirstyta į tris stadijas:
TAG pavertimas DAG, DAG – MAG, ir galiausiai MAG – gliceroliu. Greičiausia
Novozym 435 fermento katalizuojamos transesterinimo reakcijos stadija yra MAG
pavertimas gliceroliu, o lėčiausia – DAG pavertimas MAG, tai ir yra bendrą proceso
greitį nulemianti stadija. Kita vertus, Lipozyme TL IM atveju greitį nulemianti stadija yra
TAG pavertimas DAG. Tokiu būdu Novozym 435 ir Lipozyme TL IM kombinacija gali
pašalinti iš proceso greitį nulemiančią stadiją, taip pagreitinant reakciją ir atitinkamai
padidinant produkto išeigą.

1.6.6.6 Temperatūros įtaka

Temperatūra yra dar vienas svarbus fermentų katalizuojamų procesų parametras.
Optimali proceso temperatūra priklauso nuo lipazės šaltinio ir imobilizacijos būdo [412].
Pvz., optimali įvairių lipazių katalizuojamos biodyzelino sintezės transesterinant aliejų
skirtingais alkoholiais reakcijos n-heksane temperatūra svyruoja tarp 30 ir 55oC. Taigi
transesterinimo reakcijos efektyvumas didėja augant reakcijos temperatūrai gana
siaurame temperatūriniame intervale. Tolimesnis temperatūros augimas paprastai neturi
jokio arba pasižymi neigiamu efektu, mat, esant auktesnėms temperatūroms, fermentas

59
destabilizuojamas. Todėl optimali transeterinimo reakcijos temperatūra yra
biokatalizatoriaus veikimo stabilumo bei reakcijos greičio sąveikos rezultatas [163, 364].

1.6.6.7 Priedų įtaka

Siekiant padidinti biodyzelino išeigą fermentinio transesterinimo metu, neretai
naudojami įvairūs priedai. Pvz., nustatyta, kad ciklinės aminorūgšties, ektoino (1,4,5,6-
tetrahidro-2-metil-4-pirimidino karboksirūgšties, 1.22 pav.), naudojimas gali padidinti
biodyzelino išeigą 20,9 %, palyginus su išeiga, gauta be priedo [413].

1.22 pav. Cheminė ektoino (1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidino karboksirūgšties)

struktūra [413].

Ektoinas yra priskiriamas osmoprotektoriams (osmolitams) – nedidelėms

molekulėms, pasižyminčioms osmolitiniu poveikiu (padeda ląstelėms išgyventi
ekstremalaus osmosinio streso sąlygomis). Šis junginys paprastai kaupiasi halofilinėse
bei halotolerantinėse bakterijose, esant labai didelei druskų koncentracijai aplinkoje, ir jo
funkcija yra susijusi su osmosinių slėgių pusiausvyros tarp ląstelės vidaus bei išorės
užtikrinimu bei palaikymu. Jis stabilizuoja baltymus, nukleorūgštis, membranas bei
ląsteles, nedarydamas jokio neigiamo poveikio įprastai vykstančioms fermentinėms
reakcijoms ar molekulių sąveikai, todėl gali būti plačiai naudojamas biologinių
makromolekulių bei ląstelių apsaugai bei stabilizacijai.
Nustatyta, kad teigiamas ektoino poveikis fermentinės biodyzelino sintezės metu
yra susijęs su lipazės giminingumo metanoliui sumažinimu, ir atitinkamai,
triacilgliceroliams – padidinimu. Tai yra vienas iš potencialių lipazių slopinimo
metanoliu TAG transesterinimo reakcijų metu problemos sprendimo būdų [413].

1.6.6.8 Tirpiklių įtaka

Jau pirmųjų fermentų katalizinio aktyvumo organiniuose tirpikliuose sisteminių
tyrimų metu buvo pastebėta, kad fermentų katalizinis aktyvumas ir substratinis savitumas
priklauso ne tik nuo substratų struktūros ir koncentracijos, bet ir nuo pasirinkto organinio

60
tirpiklio bei vandens kiekio reakcijos mišinyje [414, 415]. Tad tinkamo tirpiklio ar jų
derinio parinkimas yra puiki strategija, siekiant pagerinti biokatalizatorių veikimą.
Šiuo metu žinomi keturi būdai, kuriais organiniai tirpikliai gali veikti fermentų
katalizuojamą reakciją: (i) fermento aktyvaus centro struktūros bei dinamikos keitimas,
(ii) organinio tirpiklio molekulių konkurencingas jungimasis prie fermento aktyvaus
centro, (iii) prie fermento prisijungusių/esančių vandens molekulių pašalinimas bei (iv)
hidrofobinių substratų tirpumo pagerinimas [361].
Tirpiklio poveikis fermentų struktūrai bei dinamikai ištirtas gana išsamiai. Buvo
pasiūlyta, kad organinių tirpiklių poveikis fermentui pirmiausia susijęs su sąveika tarp
organinio tirpiklio bei fermento surištų vandens molekulių, ir kad mažas vandens kiekis
yra reikalingas efektyviam fermento konformaciniam lankstumui [416]. Nustatyta
koreliacija tarp fermento vidinio mobilumo ir enantioatrankumo [417], o organiniai
tirpikliai gali keisti fermentų lankstumą, taigi tai gali būti antras mechanizmas, kuriuo
tirpikliai keičia fermentų katalizinį aktyvumą ir enantioatrankumą. Trečias mechanizmas
siūlo, kad tirpiklio molekulės gali blokuoti substrato surišimo sritį, t.y., gali vykti
konkurencinis slopinimas organinio tirpiklio molekulėmis. Siekiant padidinti lipazių
katalizuojamos transesterinimo reakcijos efektyvumą, naudojami įvairūs organiniai
tirpikliai, mat jie gali padidinti bendrą tiek hidrofilinių (alkoholių), tiek hidrofobinių
(TAG) substratų tirpumą sistemoje, ir taip užtikrinti reakcijos mišinio homogeniškumą
[418]. Be to, kaip minėta anksčiau, organiniai tirpikliai gali prisidėti prie fermento
apsaugos nuo alkoholio pertekliaus reakcijos mišinyje sukeltos inaktyvacijos. Tirpiklių
naudojimas sumažina reakcijos mišinio klampą, taip sumažindamas masių pernašos
apribojimus ir padidindamas reakcijos greitį. Be to, nepoliniai tirpikliai neleidžia vandens
molekulėms pasitraukti nuo fermento, taip palaikydami fermentą stabilizuojantį vietinį
vandens aktyvumą [419].
Zaks ir Klibanov (1988) buvo pirmieji paskelbę, kad fermentai hidrofobiniuose
tirpikliuose išlaiko savo aktyvumą. Jie nustatė, kad poliškumas ir maišymasis su
vandeniu nėra kritiniai veiksniai/ būtini parametrai [416]. Vėliau Laane su kolegomis
(2009) paskelbė, kad tirpiklio logP yra pagrindinis organinių tirpiklų hidrofobiškumo
parametras, darantis įtaką fermentų katalizuojamoms reakcijoms [420]. Fermento
aktyvumas, stabilumas ir net enantioatrankumas neretai koreliuoja su tirpiklio

61
hidrofobiškumu. Didesni fermentų aktyvumai buvo pastebėti, kai logP vertė yra didesnė
už 2 [421]. Be to, didesnis fermentų stabilumas stebimas labiau hidrofobiniuose
tirpikliuose. Kita vertus, jokios produktų išeigos koreliacijos su tirpiklių poliškumu,
tirpumo savybėmis ar dielektrinėmis konstantomis nerasta [21], tačiau vandens
pridėjimas į polinius tirpiklius sumažina reakcijos efektyvumą, o į nepolinius –
priešingai, - padidina [422].

1.6.6.9 Superkritinių ir joninių skysčių naudojimas

Superkritinių skysčių (medžiagos būsena, pasiekiama slegiant dujas, esant aukštai
temperatūrai) naudojimas padidina difuzijos greičius, kas nulemia didesnius reakcijų
greičius. Vienas tokių skysčių naudojimo privalumų – lengvas tirpiklio savybių keitimas
(tiesiog keičiant reakcijos slėgį ir/ar temperatūrą) [423]. Daugelio dujų, tokių kaip CO2,
etanas, propanas ir butanas kritinė temperatūra yra temperatūrų intervale, kuriame
fermentai išlaiko savo didžiausią stabilumą ir aktyvumą [423, 424]. Tarp skirtingų
superkritinių skysčių superkritinis CO2 yra tinkamiausias dėl netoksiškumo, nedegumo,
pigumo, lengvo gavimo, pasižymėjimo švelniomis kritinėmis savybėmis (31,1oC ir 7,38
MPa) [425]. Be to, pasižymi unikaliomis transportavimo savybėmis, kurios gali
pagreitinti ribotą masių pernašą fermentų katalizuojamose reakcijose [423, 424].
Kitas naujų tirpiklių tipas - joniniai skysčiai, sukuriantys aukštam fermento
kataliziniam aktyvumui palankią aplinką [426]. Joniniai skysčiai – tai organinės tik iš
jonų sudarytos druskų tipo medžiagos, pasižyminčios įspūdingomis savybėmis: žema
lydimosi temperatūra, nedideliu garų slėgiu, nedegumu, puikiu cheminiu ir terminiu
stabilumu, netoksiškumu bei geromis tirpinimo savybėmis. Fizikinės ir cheminės joninių
skysčių savybės gali būti keičiamos, keičiant juos sudarančius katijonus ir anijonus, ir
tokiu būdu joniniai skysčiai gali būti pritaikyti atitinkamiems kataliziniams procesams.
Fermentai tokioje aplinkoje pasižymi išaugusiu atrankumu ir stabilumu, palyginus su
klasikiniais organiniais tirpikliais, ir tai gali būti alternatyvi aplinka procesams, sunkiai
vykstantiems įprastuose organiniuose tirpikliuose ar vandenyje [427].
Sunkiausia dalis, naudojant joninius skysčius, yra produktų atskyrimas nuo
reakcijos mišinio. Vandens kiekis vaidina labai svarbią rolę, nesvarbu ar reakcijai
naudojamas organinis tirpiklis ar joninis skystis [428]. Galimi trys naudojimo variantai:

62
kaip ko-tirpiklis vandeninėje fazėje, kaip grynas tirpiklis, kaip dvifazė sistema kartu su
kitais tirpikliais. Gali būti naudojami ir mažesni nei įprasti joninių skysčių ar organinių
tirpiklių kiekiai, kurie tik padengia lipazės paviršių, taip padidindami fermento aktyvumą
ir stabilumą [429]. Pramonėje netaikoma dėl aukštos tokių junginių kainos. Tinkami tik
ypatingai vertingiems junginiams sintetinti. Vienas pirmųjų sintezės joniniuose
skysčiuose pavyzdžių – CALB katalizuojama oktanamido sintezė (1.23 pav).
Karboksirūgščių fermentinė aminolizė yra sudėtingesnė nei esterių, kadangi reaguojantys
junginiai yra linkę sudaryti nereaktyvias druskas, tačiau joniniuose skysčiuose procesas
vyksta, susidarant didelėms produkto išeigoms [430].

1.23 pav. CALB katalizuojama oktanamido sintezės joniniuose skysčiuose reakcija [430].

1.6.6.10 Ultragarso ir mikrobangų įtaka

Įprastu būdu maišomos transesterinimo reakcijos vyksta santykinai lėtai, o
glicerolio fazės šalinimas yra gana ilgai trunkantis procesas. Ultragarso ir mikrobangų
naudojimas transesterinimo metu ne tik padidina reakcijos greitį, bet ir išsprendžia
anksčiau minėtas problemas [431-434]. Didesnis reakcijų greitis aiškinamas masių
pernašos pagerinimu bei papildomo energijos kiekio įvedimu į sistemą [432].
Reakcijos mišinio kaitinimas mikrobangomis – vis labiau populiarėjanti strategija
tiek cheminėje, tiek fermentinėje katalizėje [435]. Tokiu būdu dažnai įmanoma ne tik
sumažinti reakcijos trukmę, bet ir padidinti produktų išeigas. Kintantis elektrinis laukas,
sąveikaudamas su molekulių dipoliais bei krūvį turinčiais jonais, greitina tų molekulių ar
jonų sukimąsi, ir taip molekulinės trinties dėka generuojama šiluma [436]. Nustatyta, kad
biodyzelino gamybos procesas yra gerokai greitesnis veikiant mikrobangomis nei šildant
reakcijos mišinį įprastais metodais [437]. Atrodytų, kad mikrobangomis veikiama
transesterinimo reakcija yra gana perspektyvi biodyzelino gamybos technologija, visgi
didžiausias apribojimas yra mikrobangų skvarba, kuri tesiekia kelis cm, priklausomai nuo
absorbuojančių medžiagų dieletrinių savybių, be to, norint šią technologiją pritaikyti
didelio masto gamybai, kyla ir įvairūs saugumo klausimai [436].

63
1.7 Lipolizinio aktyvumo nustatymo metodai

Lipolizinis aktyvumas nustatomas naudojant gryną fermento preparatą arba

kultūrinę terpę. Nėra vieno universalaus lipolizinio aktyvumo nustatymo metodo, taikomi
įvairūs metodai [438], iš kurių laboratoriniams tyrimams dažniausiai naudojami trys:
titrimetrinis, spektrofotometrinis bei fluorimetrinis. Lipazių katalizuojamų reakcijų
greitis gali būti išmatuojamas, nustatant substrato sunaudojimo, laisvų RR susidarymo
arba emulsijos skaidrėjimo greičius [439].
Titrimetriniu metodu nustatomas TAG ar kito lipazės substrato hidrolizės metu
atsipalaidavusių laisvų RR kiekis. Kokybiniam reakcijos produkto aptikimui naudojami
spalvoti indikatoriai (fenolftaleinas, timolftaleinas ir kt.). Kiekybiniam laisvų RR
įvertinimui taikomas gana pigus ir patogus pH-statinis metodas, kurio esmė – pastovaus
pH palaikymas reakcijos metu, naudojant žinomos koncentracijos NaOH ar kito šarmo
tirpalą. Kadangi, kaip minėta anksčiau, lipolizės reakcijos greitis priklauso nuo FSP
kokybės, lipolizinis aktyvumas nustatomas naudojant intensyviai maišomus emulsintus
natūralius arba sintetinius substratus. Substratų koncentracija išreiškiama tūrio ar svorio
procentais arba moliais paviršiaus ploto vienetui [133].
Spektrofotometrinė analizė paprastai atliekama po reakcijos sustabdymo
organiniais tirpikliais ar jų mišiniais arba reakcijos metu, matuojant optinio tankio, esant
tam tikram bangos ilgiui (pastarasis parenkamas, atsižvelgiant į reakcijos metu
susidarančius produktus), pokytį per laiko vienetą. Prastas lipazių substratų tirpumas
vandenyje bei emulsijų ir micelių formavimasis turi įtakos šviesos absorbcijai. Ši
problema sprendžiama, naudojant labai praskiestus substratų tirpalus, pridedant įvairių
organinių tirpiklių, paviršiaus aktyvių medžiagų ir pan. Taikomi spektrofotometrinės
analizės variantai: tiesioginis (reakcijos metu susidaro spalvotas junginys, pvz., p-
nitrofenolis) ir netiesioginis (reakcijos metu susidarę produktai sąveikauja su kitais
junginiais, susidarant optiškai aktyviems dariniams, arba tokiais junginiais paverčiami
kitų fermentinių reakcijų metu) [440].
Fluorimetrinės analizės metodu lipolizinis aktyvumas nustatomas matuojant
fluorescencijos pokyčius, sąlygojamus RR fluoresceino esterių hidrolizės metu
susidarančio fluoresceino ar įvairių kitų fluorescuojančių medžiagų, susidarančių jomis

64
pažymėtų įvairių lipidų arba jų analogų (pirenas, dansilas, kumarinas ir kt.) hidrolizės
metu. Šiuo atveju fluorescuojančią žymę turi lipazių substratai. Be to, galima sekti žymę
turinčios RR, prijungtos prie savito surišančio baltymo, pakeitimą RR, atsipalaiduojančia
lipolizės reakcijos metu. Panašiai kaip ir spektrofotometriniu, šiuo metodu galima
nustatyti jau susidariusį produktą arba sekti jo susidarymą reakcijos metu.
Kiti metodai:
• Kontroliuojamo įtempimo sąlyčio paviršiaus sudarymo metodas. Lipazių
katalizuojamos reakcijos vyksta vandens ir lipidų FSP, todėl šio paviršiaus
įtempimas yra ne mažiau svarbus parametras negu pH ar temperatūra. Į vandeninę
fazę įnešta lipazė adsorbuojasi ant substrato plėvelės ir jį hidrolizuoja. Substrato
monosluoksnio hidrolizės metu, mažėja pastarojo tankis bei paviršiaus įtempimas,
kuris tam tikrais laiko intervalais atnaujinamas, naudojant mobilų paviršiaus
barjerą. Vykstant reakcijai, galima kontroliuoti įvairius substrato monosluoksnio
parametrus: paviršiaus įtempimą, potencialą ar radioaktyvumą [25].
• Radiometrinis ir chemiliuminescensinis metodai, nepaisant jų jautrumo, dėl
didelių ekonominių sąnaudų ir sunkumų sintetinant žymėtus substratus nėra
plačiai paplitę [438].
• Turbidimetrinės analizės metu matuojamas reakcijos mišinio drumstumo
mažėjimas, esant 340 nm ilgio bangai.
• Chromatografiniai metodai. Plonasluoksnės (TLC), dujų (GC), dujų-skysčių
(GLC), aukšto slėgio skysčių tiesioginės arba atvirkštinės fazės (HPLC)
chromatografiniai metodai naudojami lipolizės reakcijos produktų
frakcionavimui, kurie po to gali būti analizuojami masių spektrometrijos būdu.
• Konduktometrinės analizės metu, naudojant gryną fermentą ar kultūrinę terpę,
matuojamas elektros laidumas.
• Branduolio magnetinio rezonanso spektroskopiniais (BMR) metodais tiriamas
lipazių aktyvumas difuzinėse makroemulsijose arba analizuojami reakcijos
produktai (poziciniai izomerai).
• Infraraudonųjų spindulių (IR) spektroskopiniu metodu tiriama TAG hidrolizė
atvirkštinėse micelėse bei analizuojami reakcijos produktai [25].

65
2 MEDŽIAGOS IR METODAI
2.1 Medžiagos
2.1.1 Fermentai
Komerciniai „NovoNordisk“ (Lipoprime 50T) bei „Novozymes“ lipolizinių
fermentų preparatai gauti iš UAB „Biopolis“, Vilnius, dovana (2.1 lentelė).

2.1 lentelė. Pagal standartinį metodą (2.3.1 skyrelis) laboratorijoje išmatuoti tyrimams naudotų
lipolizinių fermentų hidroliziniai aktyvumai p-nitrofenilbutirato atžvilgiu
Kieti U/gpreparato Skysti U/mlpreparato
Lipex 100T 130 Lecitase Ultra 15
Lipoclean 2000T 2938 Lipex 100L 77
Lipolase 100T 568 Lipolase 100L 51
Lipopan 50BG 968 Lipozyme TL100L 17
Lipopan FBG 4670 Palatase 20000L 10
Lipoprime 50T 27841 Resinase A2X 86
Lipozyme RMIM 28 Resinase HT 43
Lipozyme TLIM 11008
Novozym 435 144
Novozym 435FG 238

2.1.2 Aliejai
Dauguma tyrimams naudotų aliejų yra komerciniai maisto produktai. Judrų
aliejus buvo gautas iš Aleksandro Stulginskio Universiteto (ASU), ricinų aliejus įsigytas
medicininiais preparatais prekiaujančioje vietoje, o kokosų aliejus pirktas „Sigma“.

2.2 lentelė. Tyrimams naudoti aliejai

Aliejus Paskirtis Gamintojas Šalis
Alyvuogių (AA) Maisto produktas „Corporation Oliveira“ Ispanija
Dagių (DA) Maisto produktas „Gloria“ Vokietija
Judrų (JA) Reagentas ASU Lietuva
Kakavos sviestas (KS) Maisto produktas AB „Pergalė“ Gana
Kokosų (KA) Reagentas „Sigma“ Vokietija
Linų sėmenų (LSA) Maisto produktas „Anira“ Vokietija
Rapsų (RA) Maisto produktas „Obelių“ Lietuva
Ricinų (RiA) Farmacijos produktas AB „Bakteriniai preparatai“ Lietuva
Ryžių luobelių (RLA) Maisto produktas „Rizi“ Tailandas
Saulėgrąžų (SA) Maisto produktas „Obelių“ Ukraina
Vynuogių sėklų (VSA) Maisto produktas „Anira“ Ispanija

2.1.3. Alkoholiai
„Lachema“ (Čekija): metanolis, etanolis, 2-propanolis, 1-butanolis, 1-pentanolis,
1-heksanolis. „Roth“ (Vokietija): tret-butanolis, tret-amilo alkoholis, terpenoliai -
geraniolis ir linalolis. „Merck“ (Vokietija): β-citronelolis. „Sigma-Aldrich“ (Vokietija):

66
trimetilolpropanas (TMP) bei aromatiniai alkoholiai – hidrochinonas, katecholis,
pirogalolis bei rezorcinolis. „Fluka“(Vokietija): 2-butanolis ir oleilo alkoholis (OA).
„Reachim“ (Rusija): izoamilo alkoholis.

2.1.4 Kiti reagentai

„Fluka“ (Vokietija): ektoinas, oleino rūgštis (OR). „Sigma“: trimetilolpropano
trioleatas (TMP-TO), oleino rūgšties metilo esteris (MO), trioleinas (TO), dioleinas (DO,
1,3–dioleino (85 %) ir 1,2–dioleino (15 %) mišinys), 1-monooleinas), p-nitrofenilo
esteriai - p-nitrofenilbutiratas (p-NPB) ir p-nitrofenilpalmitatas (p-NPP), Bredfordo
reagentas, jaučio serumo albuminas, metalinis jodas ir natrio dezoksicholatas. „Acros
Organics“ (Belgija): glutaro ir sieros rūgštys. „Reachem Slovakia“ (Slovakija): oksalo
rūgštis. „Roth“ (Vokietija): acto rūgštis, benzenas, diizopropilo eteris, izooktanas, n-
heptanas, n-oktanas, tret-butilmetilo eteris, tetrahidrofuranas, ftalo ir galo rūgštys,
etilacetatas, linalilesteris, agaras, geležies ir aliuminio sulfatai, mangano chloridas, natrio
molibdatas, natrio nitratas, mėlynasis silikagelis su indikatoriumi (2 - 4 mm.) ir
molekuliniai sietai (3 ir 4Å). „Sigma-Aldrich“ (Vokietija): acetonas, acetonitrilas, 2-
butanonas, chloroformas, cikloheksanas, dietilo eteris, dimetilformamidas,
dimetilsulfoksidas, dioksanas, n-heksanas, petrolio eteris, piridinas, n-pentanas,
skruzdžių rūgštis, toluenas, butilacetatas, citrinų rūgštis. „Chempol“ (Lenkija):
gumarabik. „Lachema“ (Čekija): natrio hidroksidas ir ortofosforo rūgštis. „Reachim“
(Rusija): boro rūgštis, fenolftaleinas, cinko sulfatas ir monokalio fosfatas. „Chempur“
(Lenkija): kalcio ir natrio chloridas, kalio fosfatas, magnio sulfatas bei etilendiamino
tetraacto rūgštis (EDTA). „Alfa Aesar“ (A Johnson Matthey Company, Vokietija):
glikolio eteriai - dietilenglikolio dietilo eteris, dietilenglikolio dibutilo eteris,
etilenglikolio dietilo eteris ir tetraetilenglikolio dimetilo eteris.
Silikageliu dengtos chromatografinės stiklo plokštelės (G-25, sluoksnio storis
0,25 mm.) pirktos „Merck“ (Vokietija).
Universalus buferis (UB) – Britono-Robinsono (Britton-Robinson) buferis -
ruošiamas iš acto, boro ir ortofosforo rūgščių santykiu 1:1:1, skiedžiant iki reikiamos
koncentracijos bei pH privedant iki 8,0.

67
2.1.5 Mikrodumbliai
Dumblių padermės gautos iš Čekijos Trebono miesto Botanikos instituto
(www.butbn.cas.cz). Chlorella vulgaris CCALA 896, ALGEUS 1942/SAG 211-11p,
išskirta Švedijoje iš Lundo miesto municipaliniame parke esančio tvenkinio, o
Scenedesmus dimorphus CCALA 443, KOMAREK 1962/36, išskirta Čekijoje iš Stary
Hospodar žuvų tvenkinio, esančio netoli Trebono miesto.

2.2 Baltymų kiekio nustatymas

Baltymų kiekis buvo nustatomas klasikiniu Bredfordo metodu [441] pagal
standartinę kalibracinę kreivę, gautą, naudojant jaučio serumo albuminą.

2.3 Lipolizinio aktyvumo nustatymas

2.3.1 Tirpios lipazės hidrolizinio aktyvumo p-NPB atžvilgiu nustatymas

Hidrolizinis aktyvumas buvo nustatomas spektrofotometriniu metodu

termostatuojamoje kiuvetėje, palaikant 30oC temperatūrą, 0,1 M UB, pH 8,0 buferyje
kaip substratą naudojant 10 mM p-NPB tirpalą 2-propanolyje, matuojant optinio tankio
pokytį, esant 410 nm bangos ilgiui. Galutinė substrato koncentracija matavimo kiuvetėje
esančiame reakcijos mišinyje buvo 0,1 mM. Savaiminė substrato hidrolizė buvo tiriama
analogiškomis sąlygomis, tik be fermento [75]. Lipazės hidrolizinio aktyvumo vienetas
(U) atitinka tokį fermento kiekį, kuris katalizuoja 1 µmol produkto – riebalų rūgščių -
susidarymą per 1 minutę. Reakcijos schema pateikta 2.1 paveiksle.

Lipazė

2.1 pav. Lipazės katalizuojama p-nitrofenilbutirato hidrolizės reakcija, susidarant butano rūgščiai
ir spalvotam junginiui - p-nitrofenoliui [442].

2.3.2 Imobilizuotų lipazių hidrolizinio aktyvumo p-NPB atžvilgiu nustatymas

Hidrolizinis aktyvumas buvo nustatomas spektrofotometriniu metodu

termostatuojamoje kiuvetėje, palaikant 30oC temperatūrą, kaip substratą naudojant 10
mM p-NPB tirpalą 2-propanolyje. Reakcijos mišinys, kurį sudarė 20 mg sauso

68
imobilizuoto fermento preparato, 2,5 - 7,5 ml UB, pH 8,0 bei 25 - 75 µl substrato, buvo
inkubuojamas, esant 30oC temperatūrai, 1 - 3 min. (priklausomai nuo fermento
aktyvumo). Po to reakcijos tirpalas buvo nufiltruojamas nuo imobilizuoto fermento ir
matuojamas jo optinis tankis, esant 410 nm bangos ilgiui.

2.3.3 Tirpios lipazės hidrolizinio aktyvumo p-NPP atžvilgiu nustatymas

Substrato tirpalas buvo ruošiamas dviem etapais. Pirmiausia 20 mg p-NPP buvo

ištirpinta 6 ml 2-propanolio, tuomet 100 mg gumarabiko ir 207 mg natrio dezoksicholato
ištirpinta 90 ml buferio. Į 19 ml buferio su ištirpintais reagentais intensyviai maišant
buvo sulašintas 1 ml paruošto p-NPP tirpalo (substrato tirpalo tūris priklauso nuo
mėginių skaičiaus, tačiau išlaikomas tirpalų santykis 19:1). Taip paruošta substrato
emulsija tinkama naudoti 2 val. Reakcijos mišinį sudarė 1,8 ml substrato emulsijos ir 0,2
ml fermento (kontrolės atveju – buferio). Galutinė substrato koncentracija – 0,4 mM.
Reakcijos sąlygos: pH 8,0, 40oC temperatūra, A400nm, reakcijos trukmė - 3 - 5 min.

2.4 Kiekybinis laisvų riebalų rūgščių nustatymas titrimetrija

Liekamasis (esterinimo reakcijos metu) arba išsiskyrusių (transesterinimo
reakcijų metu) laisvų RR kiekis buvo nustatomas reakcijos mišinį titruojant 50 ± 5 mM
NaOH tirpalu metanolyje, esant 22°C temperatūrai. Tiksli NaOH koncentracija tirpale
buvo nustatyta, titruojant iš fiksanalo paruoštu 0,1 N HCl tirpalu. Kaip indikatorius
naudotas fenolftaleino tirpalas etanolyje. Kiekvienas matavimas kartotas 3 - 4 kartus.

2.5 Plonasluoksnė chromatografija ir densitometrija

Tam tikrais laiko tarpais iš kiekvieno reakcijos mišinio buvo imami mėginiai (po
50 µl), reakcija sustabdoma, pripilant po 50 µl (jei buvo tiriama reakcijos sistema
nenaudojant tirpiklių – 350 µl) dietilo eterio ir užšaldant. Lipazių katalizuojamų reakcijų
metu susidariusių produktų bei nesureagavusių pradinių medžiagų analizė buvo
atliekama klasikiniu plonasluoksnės chromatografijos metodu ant skirtingo dydžio (5x10
cm ir 10x10 cm) silikageliu dengtų (sluoksnio storis - 0,25 mm) chromatografinių
plokštelių.

69
 Chromatografinėje plokštelėje 1,0 cm nuotoliu nuo krašto buvo pažymima starto
linija, ant kurios, priklausomai nuo tiriamų mėginių skaičiaus ir naudojamos plokštelės
dydžio, 0,8 – 1,0 cm nuotoliu vienas nuo kito 5 µl Hamiltono mikrošvirkštu užnešami
tiriamų medžiagų mėginiai (po 2 - 8 µl). Po kiekvieno mėginio užnešimo mikrošvirkštas
praplautas 2-propanoliu bei n-heksanu. Išdžiovinta plokštelė buvo merkiama į
chromatografijos indą su atitinkama eliucijos (organinių tirpiklių) sistema taip, kad inde
esantis tirpiklių mišinys neapsemtų pažymėtos starto linijos. Eliucijos sistemai pasiekus
numatytą aukštį, plokštelė buvo išimama ir, pažymėjus fronto liniją, 10 - 15 min.
džiovinama traukos spintoje.
Siekiant nustatyti nesočiuosius junginius, išdžiuvusios plokštelės buvo
ryškinamos jodo garų kameroje, o sočiųjų junginių atveju - apanglinamos sieros rūgštimi
(plokštelės nupurškiamos metanolio, sieros rūgšties ir acto rūgšties anhidrido mišiniu
(tūrių santykis 20:2:2) ir kaitinamos 15- 20 min., esant 120oC temperatūrai).
Kiekybinė TLC metodu atskirtų reakcijų mišinius sudarančių produktų analizė
buvo atliekama densitometrijos principais, naudojant UVItec Cambridge Fire-reader
TLC duomenų dokumentavimo sistemą bei UVItec Fire-reader 15.10 vaizdo apdorojimo
programą. Kiekvienos dėmės sugertis buvo apskaičiuota pagal jos plotą bei intensyvumą
kiekviename chromatogramos elemente, atmetus foninę sugertį. Pagal gautus duomenis
(3 - 4 matavimų vidurkis) apskaičiuota kiekvieno susidariusio produkto bei likusio
nesureagavusio substrato procentinė dalis visame reakcijos mišinyje.
TLC analizei tinkamų eliucijos sistemų – tirpiklių mišinių atranka buvo
atlikta, naudojant tiriamų aliejų (RA, JA, SA, AA, RiA, KS, LSA bei RLA) kontrolinius
mišinius, sudarytus iš 0,4 g aliejaus n-heksane (bendras tūris 4,5 ml) ir eterio (tūrio
santykiu 1:1). TLC analizė buvo atliekama kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

2.6 Biodyzelino sintezė

2.6.1 Rapsų aliejaus transesterinimas metanoliu

Reakcijos mišinys, kurį sudarė aliejus ir alkoholis (molinis reagentų santykis 1:2
– 1:16) n-heksane, tret-butanolyje arba įvairių santykinių tūrio dalių n-heksano ir tret-
butanolio mišinyje (vandens dalis reakcijos mišinyje - 0 – 40 %) bei lipazės preparatas

70
(galutinė koncentracija reakcijos mišinyje 11 – 110 mg/ml; naudojant keletą lipazių
preparatų, koncentracija buvo perskaičiuota į aktyvumo vienetus), 1 - 168 val. inkubuotas
30o – 50oC, maišant magnetine maišykle. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos
koncentracijos aliejaus, alkoholio, distiliuoto vandens bei tirpiklio mišiniai, inkubuoti
tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta fermentinė reakcija. Mėginių analizė atlikta,
taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje. Laisvų RR kiekis reakcijų mišiniuose
nustatytas titrimetriniu metodu, kaip aprašyta 2.4 skyriuje.

2.6.2 Rapsų aliejaus transesterinimas skirtingais acilakceptoriais

Reakcijos mišinys, kurį sudarė rapsų aliejus ir metanolis, metil- ar butilacetatas

(molinis substratų santykis 1:4) n-heksane, tret-butanolyje arba reakcijos sistemoje be
tirpiklio bei lipazės preparatas (galutinė koncentracija reakcijos mišinyje 44 mg/ml), 30
min. - 24 val. maišomas magnetine maišykle kambario temperatūros sąlygomis (25oC).
Maišymo poveikio įvertinimui analogiškos reakcijos vykdytos ir be maišymo. Kaip
kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos aliejaus, alkoholio bei tirpiklio mišiniai,
laikyti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta fermentinė reakcija. Mėginių analizė
atlikta, taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

2.6.3 Ektoino įtaka biodyzelino sintezės reakcijai

Reakcijos mišinys, kurį sudarė rapsų aliejus ir metanolis (molinis reagentų

santykis 1:6) n-heksane, tret-butanolyje arba reakcijos sistemoje be tirpiklio, lipazės
preparatas (galutinė koncentracija reakcijos mišinyje 44 mg/ml) bei reakcijos priedas –
ektoinas (galutinė koncentracija mišinyje – 1,1 mM), 1 - 24 val. inkubuotas 40oC,
maišant magnetine maišykle. Palyginimui kaip kontrolės analogiškos reakcijos vykdytos
ir be priedo. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos aliejaus, alkoholio bei
tirpiklio mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta fermentinė
reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

71
2.6.4 Tirpiklių įtaka biodyzelino sintezės reakcijai

Reakcijos mišinys, kurį sudarė rapsų aliejus ir metanolis (molinis reagentų

santykis 1:6) skirtinguose tirpikliuose (tret-butanolyje, n-heksane, dietilenglikolio
dibutilo eteryje, etilenglikolio dietilo eteryje, dietilenglikolio dietilo eteryje bei
tetraetilenglikolio dimetilo eteryje) bei lipazės preparatas (galutinė koncentracija
reakcijos mišinyje 44 mg/ml), 3 - 24 val. inkubuotas 40oC, maišant magnetine maišykle.
Reakcijos mišinys buvo džiovinamas molekuliniais sietais (3 – 4 Å) bei mėlynuoju
silikageliu su drėgmės indikatoriumi. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos
reagentų mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta fermentinė
reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

2.7 Oleino rūgšties ir trimetilolpropano esterių – biotepalų - sintezė

Lipazių katalizuojamos metiloleato transesterinimo ir oleino rūgšties esterinimo
trimetilolpropanu reakcijos buvo tiriamos trimis metodais. Pirmasis buvo pasirinktas,
atsižvelgus į E. Uosukainen’o ir bendraautorių metodiką [19]: reakcijos mišinys,
sudarytas iš MO arba OR ir TMP (molinis reagentų santykis 3,5:1 ir 4,5:1) vandenyje (15
% w/w) bei lipazės preparatas (40 % w/w), 1 - 120 val. inkubuotas, esant 37 ir 47oC
temperatūroms, maišant magnetine maišykle. Antrasis metodas – šiek tiek modifikuotas
pirmojo variantas: vietoj vandens buvo naudotas tret-butanolis, o reakcijos mišinys
inkubuotas, esant 60oC temperatūrai. Trečiojo metodo esmė – bet kokių papildomų
tirpiklių atsisakymas, naudojamo fermento kiekio sumažinimas iki 15 % (w/w) bei
fermentinių preparatų mišinių taikymas. Kaip kontrolės naudoti atitinkamų koncentracijų
reagentų mišiniai be fermento, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta
fermentinė reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1
skyrelyje.

2.8 β-Citronelolio esterių sintezė

Reakcijos mišinys, kurį sudarė aliejus ir alkoholis (molinis reagentų santykis 1:4)
įvairiuose organiniuose tirpikliuose bei lipazės preparatas (galutinė koncentracija
reakcijos mišinyje 44 mg/ml), 3 - 24 val. inkubuotas, esant 30oC temperatūrai, maišant
magnetine maišykle. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos aliejaus,

72
alkoholio bei tirpiklio mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta
fermentinė reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1
skyrelyje. Laisvų RR kiekis reakcijų mišiniuose nustatytas titrimetriniu metodu, kaip
aprašyta 2.4 skyriuje.

2.9 Vieną ar daugiau hidroksi- ir/ar karboksigrupių turinčių rūgščių

esterinimas

Reakcijos mišinys, sudarytas iš karboksirūgšties ir alkoholio (molinis reagentų

santykis - 1:1; jei naudojama dikarboksirūgštis, tuomet rūgšties ir alkoholio molinis
santykis - 1:2, atitinkamai) n-heksane bei lipazės preparato (galutinė koncentracija
reakcijos mišinyje 21 mg/ml), inkubuotas 1 – 144 val., esant 40o – 60oC temperatūrai
maišant magnetine maišykle. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos grynos
karboksirūgšties, alkoholio bei n-heksano mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis,
kokiomis vykdyta ir fermentinė reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą,
kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

2.10 Muilo gamybos atliekų utilizavimo tyrimas

2.10.1 Muilo gamybos atliekų transesterinimo ir esterinimo reakcijos

I dalis. Pamuilių mišinys ekstrahuotas skirtingais tirpikliais – potencialiais lipazių

substratais (metilacetatas, butilacetatas, izopropanolis, izobutanolis, izoamilo alkoholis,
metanolis, etanolis, 1-butanolis, 1-pentanolis, 1-heksanolis) – tūrio santykiu 1:1.
Reakcijos mišinys, sudarytas iš 0,87 ml pamuilių, 1,65 ml tirpiklio (vanduo, tret-
butanolis arba n-heksanas) bei 100 mg fermento, buvo inkubuotas 30 min. – 5 val., esant
30oC temperatūrai, maišant magnetine maišykle. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos
koncentracijos pamuilių bei tirpiklių mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis,
kokiomis vykdyta ir fermentinė reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą,
kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.
II dalis. Pamuilės ekstrahuotos įprastais lipazių katalizuojamoms reakcijoms
naudojamais tirpikliais: vandeniu, tret-butanoliu, toluenu, n-heksanu bei n-heptanu.
Reakcijos mišinys, kurį sudarė 0,87 ml pamuilių, 1,65 ml atitinkamo tirpiklio (vanduo,
tret-butanolis, toluenas, n-heksanas, heptanas), 65 - 195 µl metanolio bei 100 mg

73
fermento, buvo inkubuotas 30 min. – 48 val., esant 30oC temperatūrai, maišant
magnetine maišykle. Kaip kontrolės naudoti atitinkamos koncentracijos pamuilių bei
tirpiklių mišiniai, inkubuoti tokiomis pat sąlygomis, kokiomis vykdyta ir fermentinė
reakcija. Mėginių analizė atlikta, taikant TLC metodą, kaip aprašyta 2.5.1 skyrelyje.

2.10.2 Chlorella vulgaris ir Scenedesmus dimorphus dumblių padermių auginimas

Dumblių padermės augintos ir palaikytos standartiniais mikrobiologiniais

metodais [443] mėgintuvėliuose ant agarizuotos sintetinės Bristol terpės kambario
temperatūroje pastovaus apšviestumo vietoje. Padermių augimo eiga buvo tikrinta
kasdien, o persėjmas vykdytas sterilioje aplinkoje kas mėnesį. Biomasės priauginimui
pirmiausia buvo atgaivinamos skystoje terpėje esančios padermės. Sėjimo lazdele
padermės buvo užsėjamos į mėgintuvėlius su 50 ml autoklavuotos (120°C, 1 MPa, 30
min.) modifikuotos sintetinės Bristol terpės. Auginama 30 dienų, po to 15 ml (10 %
sėjamos terpės tūrio) atsigavusios padermės buvo persėjama į 250 ml tūrio kolbą su 150
ml minėtos terpės. Toks tūris pasirinktas dėl to, kad mėginiai nebuvo aeruojami. Steriliai
užsėjus, kolbos buvo užkemšamos vatos ir marlės kamščiais. Padermės skystoje terpėje
persėjamos kas 10 - 20 dienų. Auginama termostate, esant 25°C temperatūrai, 12:12 (12
val. šviesos ir 12 val. tamsos) šviesos periodo sąlygomis.
Pamuilių įtaka dumblių padermių augimui tirta pasirinktų padermių dumblius
auginant įvairiai skiestose „Ringuvos“ muilo gamybos atliekose (toliau – pamuilėse) bei
palyginimui - skirtingos sudėties sintetinėse terpėse (TAMIA, M8, Bristol ir Basal terpių
sudėtys pateiktos 2.3 lentelėje). Kiekviena padermė auginta dviejose 250 ml tūrio
kolbose, kuriose buvo 150 ml neautoklavuotos terpės. Kolbos laikytos termostate,
palaikant 25°C temperatūrą, 12:12 (12 val. šviesos ir 12 val. tamsos) šviesos periodo
sąlygomis 14 dienų.
2.3 lentelė. Cheminių elementų koncentracija sintetinėse terpėse, mg/l.
Cheminiai elementai
Terpė
Na K Mg Ca Fe Mn Cu Zn
Tamia 1280 2900 1900 - - - - -
Bristol be peptono 78 81,3 19,5 9,5 - - - -
M8 700 337 102 14 8,6 0,2 0,04 0,052
Basal 20 8,75 8,2 0,72 - - - -

74
3 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Darbo metu buvo tirtos įvairios lipazių katalizuojamos esterinimo bei

transesterinimo reakcijos. Kadangi reakcijų sąlygų įtaka procesų eigai daugiausia buvo
tiriama pigiu ir patogiu klasikinės plonasluoksnės chromatografijos metodu,
eksperimentų pradžioje jis ir buvo pritaikytas tiriamų reakcijų metu susidarančių
konkrečių produktų analizei. Tinkamos eliucijos sistemos (mobilios fazės, organinių
tirpiklių mišinio) parinkimas ne tik užtikrina efektyvų ir patikimą kokybinį reakcijos
mišinį sudarančių junginių atskyrimą bei nustatymą, bet ir leidžia įvertinti reakcijos metu
susidarančių produktų bei sunaudojamų pradinių medžiagų kiekybinius pokyčius, taikant
densitometrijos principus, naudojant atitinkamą įrangą bei kompiuterines programas
(mūsų atveju - UVItec Cambridge Fire-reader TLC duomenų dokumentavimo sistemą ir
UVItec Fire-reader 15.10 vaizdo apdorojimo programą).
TLC analizei tinkamiausių eliucijos sistemų atranka (3.1 pav.) atlikta kaip
kontroles naudojant įvairius aliejus - RA, JA, SA, AA, RiA, KS, LSA ir RLA, - kurių
cheminės sudėties kiekybiniai skirtumai pateikti 3.1 lentelėje, bei kitus grynus cheminius
junginius, kaip galimus fermentų katalizuojamų reakcijų produktus (oleino rūgšties
metilo esterį, trimetilolpropano trioleatą, trioleiną, oleino rūgštį, dioleiną, monooleiną);
pastarųjų išsidėstymas chromatogramose pateiktas 3.2 paveiksle.

3.1 lentelė. Pagrindinių riebalų rūgščių kiekis (%) tirtuose aliejuose [302, 304, 310-313]
Riebalų Miristo Palmitino Stearino Oleino Linolo Linoleno Ricinolio
rūgštys C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 12-hidroksioleino
C18:1
Aliejai
Rapsų 0,1 5,1 4,5 57,9 24,7 7,9 -
Judrų 3-8 2-6 11 - 25 15 - 24 30 - 40 -
Saulėgrąžų 6,5 4,5 21 68 - -
Alyvuogių 9 - 10 2-3 73 - 84 10 - 12 pėdsakai -
Ricinų 6-2 5-1 1 - 0,5 85 - 95
Kakavos 4 57 36 1 2 -
sviestas
Linų sėmenų 4-7 2-4 25 - 40 35 - 40 25 - 60 -
Ryžių 15,0 1,9 42,5 39,1 1,1 -
luobelių

Iš visų tyrimams pasirinktų aliejų įdomiausias - RiA, nes jo sudėtyje yra net 85 -
95 % ricinolio rūgšties, turinčios hidroksigrupę ties C12 (pastarosios buvimas nulemia
įprastiems aliejams nebūdingą RiA tirpumą įvairiuose hidrofiliniuose junginiuose) [395].

75
Visų tirtų aliejų, išskyrus KS, sudėtyje vyrauja nesočiosios 18 anglies atomų turinčios
RR. Oleino rūgšties (C18:1) daugiausiai aptinkama AA, kiek mažiau – RA, o RLA bei
LSA atveju - ir OR (C18:1), ir linolo rūgšties (C18:2) kiekiai praktiškai vienodi.
Pastarosios rūgšties didžiausias kiekis randamas SA (apie 68 %). Polinesočiosios
linoleno rūgšties (C18:3) daugelyje aliejų neaptinkama arba nustatomi tik pėdsakai,
išskyrus JA bei LSA, kuriame ši RR gali sudaryti net iki 60 % bendro visų RR kiekio.
Nesočioji 18 anglies atomų turinti stearino RR vyrauja kakavos svieste, o palmitino
rūgšties (C16:0) daugiausiai aptinkama RLA bei AA sudėtyje.

Chloroformas : acetonas : acto r.: Chloroformas : acetonas: Heksanas: eteris:

96:4:1 96:4 90:10

1234 5 678 9 1 23 45 67 89 1 2 34 5 67 8 9

Petrolio eteris:eteris:acto r.:

90:10:1 75:25:1 85:15:2 80:20:2 70:30:2

1234 5 678 9 1 23 45 67 89 1 2 34 5 67 8 12 34 5678 9 12 34 5 6789

3.1 pav. TLC analizei tinkamų eliucijos sistemų atranka. 1 – RA; 2 – JA; 3 – SA; 4 – AA; 5 – RiA; 6 – KS;
7 – LSA; 8 – RLA; 9 – kontrolių mišinys (monooleinas, DO, TO).

1 2 3 4 5 6
3.2 pav. Grynų cheminių junginių, kaip galimų lipazių katalizuojamų reakcijų substratų bei
produktų, chromatografinis vaizdas. 1- MO; 2 – TMP-TO; 3 – TO; 4 - OR; 5 – 1,3- ir 1,2-DO
mišinys; 6 – monooleinas. Eliucijos sistema: petrolio eteris : eteris : acto rūgštis = 85:15:2.

Įvairių organinių tirpiklių mišinių atrankos metu nustatyta, kad mūsų tiriamų
reakcijų metu susidarančių produktų bei nesureagavusių pradinių medžiagų atskyrimui
TLC analizės metodu tinkamiausios eliucijos sistemos, sudarytos iš petrolio eterio, eterio

76
bei acto rūgšties (3.1 pav.), lyginant su kitais mokslinėje literatūroje plačiai aprašytais bei
įvairių tyrimų metu dažnai naudojamais organinių tirpiklių mišiniais [444-446]. Keičiant
šio mišinio sudedamųjų dalių santykinį kiekį, eksperimentams parinkta efektyviausia
kokybinio ir kiekybinio produktų bei nesureagavusių pradinių junginių atskyrimo
atžvilgiu eliucijos sistema - kai petrolio eterio, eterio ir acto rūgšties santykis mišinyje
yra 85:15:2 (3.1 pav.).

3.1 Biodyzelino sintezė: rapsų aliejaus transesterinimas

Žmonių populiacijos bei vartojimo augimas, senkantys iškastinio kuro ištekliai,

dėl vidaus degimo variklių išmetamųjų dujų emisijų spartėjantys pasaulinio atšilimo
reiškiniai skatina ieškoti alternatyvaus energijos šaltinio [135, 251-253]. Šiuo metu
biodyzelinas yra laikomas vienu idealiausių atsinaujinančių energijos šaltinių, nes jis yra
bioskali bei aplinkai saugesnė alternatyva tradiciniam dyzeliniam kurui. Be to, kadangi
biodyzelino fizikinės ir kitos savybės yra artimos iš naftos gautam dyzelinui, tai leidžia
jam efektyviai veikti tradiciniuose varikliuose be papildomų modifikacijų [256, 257].
Kaip minėta, biodyzelinas gali būti gaunamas cheminiais arba fermentiniais
būdais - TAG transesterinimo ir/ar laisvų RR esterinimo trumpagrandžiais alkoholiais
reakcijų metu. Šiuo metu vis dar vyraujantiems cheminiams metodams būdingi tam tikri
trūkumai: didelės energijos sąnaudos, brangi įranga, sudėtingi procesai bei aplinkos tarša
[289]. Daugumos šių trūkumų galima išvengti taikant biotechnologinę gamybą, kai
riebalų transesterinimo reakcijas katalizuoja lipazės [282, 290-292]. Nors tokių procesų
ekonominės sąnaudos kol kas dar yra gana didelės, o biologiniams katalizatoriams
būdinga palyginti lengva inaktyvacija, tačiau įvairių tirpiklių, žaliavos, acilakceptorių,
pigiausių daugkartiniam naudojimui tinkamų fermentų paieška bei fermentų modifikacijų
ir imobilizacijos taikymas teikia vilčių sukurti konkurencingus biodyzelino gamybos
metodus [24, 254, 287, 293]. Tad darbo metu buvo tiriama lipazių katalizuojama
biodyzelino sintezės reakcija – įvertinta rapsų aliejaus transesterinimo skirtingais
acilakceptoriais efektyvumo priklausomybė nuo įvairių reakcijos eigą nulemiančių
veiksnių: vandens bei fermento kiekio, molinio substratų santykio, tirpiklio, temperatūros
ir acilakceptoriaus bei fermento prigimties.

77
3.1.1 Lipoprime 50T katalizuojamo rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu
optimalių sąlygų nustatymas

Kaip žinoma, vykdant lipazių katalizuojamas aliejų transesterinimo metanoliu

reakcijas, viena aktualiausių problemų – fermento slopinimas vienu iš reakcijos substratų
- metanoliu. Nors molekulinis šio slopinimo mechanizmas nėra iki galo išaiškintas,
manoma, kad dėl trumpagrandžio alkoholio netirpumo augaliniuose aliejuose sistemoje
susidaro nauja skysta fazė - metanolio lašeliai, kurie, esant didelėms jo koncentracijoms,
inaktyvuoja lipazes, jas denatūruodami [23, 354, 373]. Be to, reakcijos metu susidarantis
hidrofilinis šalutinis produktas – glicerolis - taip pat netirpus aliejuose, tad lengvai
adsorbuojasi ant imobilizuotų lipazių paviršiaus, taip neigiamai veikdamas jų aktyvumą
bei stabilumą [335, 375]. Teigiama, kad tokių hidrofobinių tirpiklių kaip n-heksanas
naudojimas reakcijų mišiniuose [378] problemos neišsprendžia dėl prasto metanolio bei
glicerolio tirpumo juose [379]. Todėl mūsų tyrimų metu reakcijos vykdytos ne tik n-
heksane, kuris buvo pasirinktas kaip klasikinis lipazių katalizuojamoms reakcijoms tirti
naudojamas hidrofobinis tirpiklis, bet ir hidrofiliniame tret-butanolyje (tretiniai
alkoholiai paprastai nėra lipazių substratai), kuriame tirpūs visi reakcijos mišinį
sudarantys junginiai. Dėl to manoma, kad jo naudojimas vietoj tradicinių tirpiklių gali
gerokai padidinti produktų išeigas [129, 375, 381, 383, 384].
Darbų pradžioje buvo siekiama įvertinti tirpiklio prigimties įtaką komercinės
Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo transesterinimo efektyvumui. Lipoprime 50T buvo
pasirinktas kaip komercinis lipoliziniu aktyvumu pasižymintis preparatas, kurio įvairios
katalizuojamos reakcijos iki šiol nebuvo detaliai ištirtos. RA ir metanolio molinis
santykis pasirinktas, atsižvelgus į literatūroje rastus duomenis (daugeliu atvejų riebalų
transesterinimo alkoholiais reakcijoms optimaliausias RA ir metanolio molinis santykis
yra 1:4) [129, 313, 383], o temperatūra parinkta, remiantis ankstesnių eksperimentų metu
gautais rezultatais (nepublikuoti duomenys). RA transesterinimo metanoliu tret-
butanolyje bei n-heksane eigos priklausomybės nuo reakcijos trukmės tyrimų duomenys
pateikti 3.3 paveiksle.

78
 tret-Butanolis n-Heksanas

Santykinis medžiagų kiekis

120

reakcijos mišinyje, %
100
ME
80 RA
60 RR
40 DAG
MAG
20
0
K 1 3 5 24 48 120 1 3 5 24 48 120
Reakcijos trukmė, val.

3.3 pav. Lipoprime 50T katalizuojamų RA transesterinimo metanoliu tret-butanolyje ir n-

heksane, esant 30oC temperatūrai, reakcijų metu susidariusių produktų kiekio priklausomybė nuo
reakcijos trukmės. Kontrolė: K – RA.

Nustatyta, kad Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo RA transesterinimo

metanoliu tret-butanolyje metu lygiagrečiai su esterių sinteze vyksta ir ypatingai efektyvi
RA hidrolizė: aliejus suskaldomas per netirtą reakcijos laiką tarp 5 ir 24 val., ir
akivaizdu, kad tolimesnis laisvų RR kiekybinis augimas reakcijos mišinyje vyksta tik dėl
MAG ir DAG hidrolizės, kurių kiekiai 24 - 120 val. laikotarpiu sumažėja apie 50 %. Šios
reakcijos metu po 24 val. susidaro apie 32 % metilo esterių, ir ilginant reakcijos trukmę,
šis kiekis nebekinta. Tuo tarpu n-heksane ir po 120 val. reakcijos mišinyje dar lieka apie
19 % nesuskaldyto RA, tačiau čia esterių išeiga yra didesnė ir siekia apie 45 % (3.3 pav.).
Taigi galima daryti preliminarias išvadas, kad hidrofilinis tret-butanolis galėtų
būti puikus tirpiklis įvairioms hidrolizės reakcijoms vykdyti, o jo naudojimo sintezei
(esterinimui ar transesterinimui) galimybė turėtų būti detaliau ištirta, mat tret-butanolyje
gautos esterių išeigos neprilygo n-heksane vykdytų reakcijų metu susidarančių produktų
kiekiams.
Lipazių katalizuojamo aliejų transesterinimo įvairiais alkoholiais metu
acilakceptoriaus (alkoholio) kiekis reakcijos mišinyje vaidina labai svarbų vaidmenį.
Pradinių tyrimų metu RA ir metanolio molinis santykis (1:4) buvo pasirinktas,
atsižvelgus į literatūroje rastus duomenis, tačiau lipazės yra itin įvairialypiai fermentai,
kuriems būdingos optimalios katalizuojamų reakcijų sąlygos gali labai skirtis,
priklausomai nuo fermento prigimties ir įvairių aplinkos parametrų (tirpiklio, substratų,
temperatūros ir kt.). Todėl, siekiant optimizuoti Lipoprime 50T katalizuojamą reakciją
tret-butanolyje, pirmiausia buvo ištirta pradinio metanolio kiekio įtaka reakcijos eigai,

79
keičiant RA ir metanolio molinį santykį (1:2; 1:4; 1:6; 1:8) bei reakcijos temperatūrą
(30oC, 40oC ir 50oC). Tyrimų rezultatai pateikti 3.4 paveiksle.
A
30oC 40oC 50oC
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
ME
80 RA
60 RR
40 DAG
MAG
20
0
K 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4
Reakcijos trukmė, val.

B
120
Santykinis medžiagų kiekis
reakcijos mišinyje, %

100
ME
80
RA
60 RR

40 DAG
MAG
20

0
K 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4
Reakcijos trukmė, val.

C
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
ME
80 RA
60 RR
40 DAG
MAG
20
0
K 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4
Reakcijos trukmė, val.

D
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
ME
80 RA
60 RR
40 DAG
MAG
20
0
K 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4
Reakcijos trukmė, val.

3.4 pav. Lipoprime 50T katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu (molinis RA ir metanolio

santykis A – 1:2, B – 1:4, C – 1:6, D - 1:8) eigos priklausomybės nuo reakcijos trukmės
chromatografinis vaizdas bei kiekybinis TLC duomenų įvertinimas, esant atitinkamoms
temperatūroms. K – RA (kontrolė).

Nustatyta, kad tirtos reakcijos metu visas RA suskaldomas per apytikriai 1,5 val.,
kai temperatūra yra 40oC, o RA ir metanolio molinis santykis yra nuo 1: 6 iki 1 : 8. Esant
šioms reakcijos sąlygoms po 4 val. susidaro ir didžiausias esterių kiekis, siekiantis 40 %
(3.4 (C, D) pav.).

80
 Kaip žinoma, hidrofiliniai tirpikliai yra linkę iš aktyvaus centro patraukti jame
esančias vandens molekules, reikalingas fermento aktyvumui palaikyti ir efektyviai
katalizei vykti, todėl fermentiniams procesams palankesni hidrofobiniai tirpikliai. Kita
vertus, didelis hidrofobiškumas gali sąlygoti baltymo konformacijos nepaslankumą, todėl
neretai naudojamas ne vienas tirpiklis, o dviejų skirtingos prigimties tirpiklių mišinys
[68]. Kaip minėta anksčiau, nors tret-butanolyje RA hidrolizė yra ypatingai greitas ir
efektyvus procesas, tačiau pageidaujamų produktų (metilo esterių) susidaro gerokai
mažiau, palyginus su n-heksane vykstančiomis reakcijomis. Tad, siekiant gauti didesnes
esterių išeigas, analogiškos reakcijos vykdytos ir n-heksane bei n-heksano ir tret-
butanolio mišinyje tūrio santykiu 1:1, esant skirtingai reakcijų temperatūrai bei moliniam
substratų santykiui. Kadangi n-heksane vykdomos reakcijos yra ilgiau trunkantys
procesai, jos buvo tiriamos pasirinkus atitinkamą reakcijos trukmę – 48 val. Gauti
rezultatai pateikti 3.5 paveiksle.
A
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100
ME
80
mišinyje, %

RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
K 1(30) 2(30) 3(30) 4(30) 1(40) 2(40) 3(40) 4(40) 1(50) 2(50) 3(50) 4(50)

B
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100
ME
80
mišinyje, %

RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
K 1(30) 2(30) 3(30) 4(30) 1(40) 2(40) 3(40) 4(40) 1(50) 2(50) 3(50) 4(50)

3.5 pav. Lipoprime 50T katalizuojamos RA transesterinimo metanoliu n-heksane (A) ir n-

heksano bei tret-butanolio mišinyje (1:1) (B), esant skirtingiems RA ir MetOH moliniams
santykiams, reakcijos metu po 48 val. susidariusių produktų santykinis kiekis reakcijų
mišiniuose. K – RA (kontrolė); 1 – RA:MetOH (1:2); 2 – RA:MetOH (1:4); 3 – RA:MetOH
(1:6); 4 – RA:MetOH (1:8).(30), (40), (50) - reakcijos temperatūra, oC.

Reakcijos eiga n-heksane ir n-heksano bei tret-butanolio (1:1) mišinyje skyrėsi

gana smarkiai (3.5 pav.). Tirpiklių mišinyje, kaip ir tret-butanolyje, labai efektyviai

81
katalizuojama RA hidrolizės reakcija, tačiau esterių išeiga išlieka mažesnė (didžiausia
siekia 27 %), palyginus su išeiga, gauta, kai naudotas grynas n-heksanas (38 %).
Nustatyta, kad optimalus molinis substratų santykis praktiškai visais tirtais atvejais yra
toks pats – 1:6, tačiau optimali temperatūra skiriasi: kaip ir gryname tret-butanolyje, taip
ir n-heksane ji yra 40oC, o šių tirpiklių mišinyje – 30oC. Palyginus santykinį kitų
reakcijos mišinį sudarančių produktų bei substratų kiekį, akivaizdu, kad optimaliomis
sąlygomis daugiau nesuskaldyto RA lieka n-heksane - apie 36 %, kai tuo tarpu tirpiklių
mišinyje RA kiekis nesiekia nė 15 %. Visų kitų medžiagų nustatyta daugiau, kai
reakcijos tirpikliu naudojamas n-heksano ir tret-butanolio mišinys: MAG - mišinyje - 9
%, o n-heksane – 1 %; DAG - mišinyje - 16 %, o n-heksane – 13 % bei laisvų RR -
mišinyje - 33 - %, o n-heksane – 12 %.
Taigi esterių sintezės atžvilgiu reakcija produktyvesnė n-heksane, o aliejų
hidrolizė efektyvesnė tirpiklių mišinyje, tačiau pastaroji reakcija neprilygsta
atitinkamiems procesams, vykstantiems gryname tret-butanolyje, todėl tokio tirpiklių
mišinio naudojimas nėra efektyvus reakcijos produktyvumo didinimo būdas.
Kadangi reakcijos n-heksane ir tirpiklių mišinyje taip smarkiai skiriasi, buvo
atlikti analogiški eksperimentai, reakcijas vykdant tirpiklių mišiniuose, labiau
besiskiriančiuose sudėties tūrio dalimis. Bandyta įžvelgti reakcijos pusiausvyros
pasislinkimo į hidrolizės ar sintezės pusę tendencijas, esant optimaliai 40oC temperatūrai.
Įvairių tirpiklių mišinių sudėties įtakos proceso produktyvumui tyrimų rezultatai pateikti
3.6 paveiksle.
A
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100
ME
80
mišinyje, %

RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
K 1 2 3 4 5 6 7 8 9

82
 B

Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100
ME
80

mišinyje, %
RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
K 1 2 3 4 5 6 7 8 9

C
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100
ME
80
mišinyje, %

RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
K 1 2 3 4 5 6 7 8 9

3.6 pav. Lipoprime 50T katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu skirtinguose tirpikliuose

metu susidariusių produktų po 24 (A), 48 (B) ir 168 val. (C) santykinis kiekis reakcijų
mišiniuose. K – RA (kontrolė). Tirpikliai: 1 – n-heksanas; 9 – tret-butanolis; n-heksano ir tret-
butanolio mišiniai tūrio santykiu atitinkamai: 2 – 4:1; 3 – 3:1; 4 2:1; 5 - 1:1; 6 - 1:2; 7 - 1:3; 8 -
1:4. Reakcijos sąlygos: 40oC temperatūra, RA ir MetOH molinis santykis 1:6.

Kaip ir buvo galima tikėtis, nustatyta tiesioginė reakcijos metu išsiskiriančių

laisvų RR kiekio priklausomybė nuo tret-butanolio tūrio dalies tirpiklių mišinyje. n-
Heksane procesai gerokai lėtesni, ir reakcijos pradžioje RR metilo esterių išeigos
neprilygsta gautoms reakcijų, vykstančių tirpikliuose, kur tret-butanolio kiekiai
mišiniuose yra didesni, metu, tačiau po 168 val. esterių išeigos tampa beveik vienodos.
tret-Butanolyje ir mišinyje, kuriame vyrauja didesnė šio tirpiklio dalis, jau po 24 val.
nebelieka RA (3.6 (A) pav. 8 ir 9 stulpeliai). Nors yra sulėtėjęs metilo esterių sintezės
procesas, bet stebimas laisvų RR kiekio didėjimas akivaizdžiai dėl MAG ir DAG
hidrolizės: jau po 48 val. kai kuriais atvejais DAG apskritai nelieka (3.6 (B) pav. 8 ir 9
stulpeliai). Tuo tarpu n-heksane ir mišiniuose, kur vyrauja šis tirpiklis arba tūrio santykis

83
yra 1:1, net ir po 168 val. aptinkami visi reakcijos mišinio komponentai: ir nesuskaldytas
RA, ir laisvos RR bei MAG ir DAG (3.6 (C) pav. 1 - 5 stulpeliai).
RA hidrolizė. Nors tret-butanolis dažniausiai naudojamas aliejų transesterinimo
metanoliu reakcijų metu, siekiant sumažinti neigiamą metanolio poveikį lipazių
aktyvumui, tačiau buvo pabandyta išsiaiškinti, ar jo privalumai išlieka ir vykdant
hidrolizės reakcijas. Mat yra žinoma, kad reakcijų metu susidaręs glicerolis pasižymi
panašiomis slopinančiomis savybėmis kaip ir metanolis, o šį poveikį, kaip nurodoma
literatūriniuose šaltiniuose [135, 375, 381], dėl anksčiau minėtų savybių galėtų pašalinti
būtent tret-butanolio naudojimas, tad, siekiant patvirtinti šias hipotezes, RA hidrolizės
reakcijos n-heksane palygintos su analogiškais procesais tret-butanolyje (3.7 pav.).
n-Heksanas tret-Butanolis
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
80 RA
RR
60
DAG
40 MAG
20
0
K 1 3 24 48 1 3 24 48
Reakcijos trukmė, val.

3.7 pav. Lipoprime 50T katalizuojamos RA hidrolizės n-heksane ir tret-butanolyje eigos

priklausomybė nuo reakcijos trukmės. Reakcijos sąlygos: 40oC temperatūra, RA ir MetOH
molinis santykis 1:6. K – RA (kontrolė).

Lipoprime 50T katalizuojama RA hidrolizė visu tirtu laikotarpiu (1 - 48 val.)

efektyvesnė tret-butanolyje, nes tomis pačiomis sąlygomis n-heksane vykstančios
reakcijos metu po 48 val. lieka apie 62 % nesuskaldyto RA, o tret-butanolio aplinkoje jau
po 3 val. ir RA kiekis sumažėja iki 40 %, o po 24 val. nebelieka visai (3.7 pav.). Be to,
kadangi tret-butanolis yra netoksiškas ir santykinai pigus, palyginus su n-heksanu, jis
gali tapti puikia alternatyva tradiciniams hidrofobiniams organiniams tirpikliams. tret-
Butanolis keičia lipazių katalizuojamų reakcijų mechanizmą, kaip tikėtina, sukeldamas
konformacinius fermento struktūros pokyčius [384], tačiau, nors bendrai lipazėms
būdinga panaši molekulės architektūra, jų aktyvaus centro struktūros gali būti gana
skirtingos, kas nulemia ir skirtingą jų substratinį savitumą ir netgi katalizuojamos
reakcijos mechanizmą [61, 385]. Todėl ir tret-butanolio poveikis skirtingiems

84
fermentams gali būti kitoks. Be to, yra lipazių, kurių substratais gali būti ir tretiniai
alkoholiai (bei jų esteriai) [181, 182], todėl prieš naudojant tret-butanolį kaip tirpiklį,
būtina įvertinti ir konkrečios lipazės savitumą bei aktyvumą tokių alkoholių atžvilgiu.
Nors vandens perteklius gali pastumti organiniuose tirpikliuose vykstančios
reakcijos pusiausvyrą į hidrolizės pusę arba sukelti fermento molekulių agregaciją, kas
lemia fermento aktyvumo sumažėjimą, tačiau įvairių lipolizinių fermentų tyrimais
nustatyta, kad pašalinus vandenį, fermentams būdingas mažas aktyvumas. Minimalus
vandens kiekis yra būtinas fermentui įgauti ir palaikyti kataliziškai aktyvią konformaciją,
nes lipazės aktyvumas bendru atveju priklauso nuo tarp aliejaus ir vandens susidarančios
fazių sąlyčio ribos [135, 252, 373, 390, 401, 402]. Minimalus vandens kiekis, reikalingas
aktyviai lipazės konformacijai palaikyti, skirtingiems fermentams skiriasi ir priklauso
nuo konkretaus lipolizinio fermento prigimties bei vykdomų reakcijų sąlygų, todėl
optimalus vandens kiekis reakcijos mišinyje turi būti nustatomas kiekvienai lipazei bei
reakcijai individualiai [373, 390, 401, 402]. Kadangi ankstesnių tyrimų metu buvo
naudota pagal standartinę metodiką parinkta vandens koncentracija (9 tūrio %, toliau
tekste - %), siekiant nustatyti optimalias tiriamos reakcijos sąlygas, buvo įvertinta
vandens kiekio įtaka anksčiau tirtuose tirpikliuose vykdytų reakcijų eigai (3.8 pav.).
A
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
ME
80 RA
60 RR
40 DAG
MAG
20
0
K 0 4 9 13 18
Vandens kiekis reakcijos mišinyje, %

B
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
ME
80 RA
60 RR
40 DAG
MAG
20
0
K 0 4 9 13 18 22 26 30 36 40
Vandens kiekis reakcijos mišinyje, %

85
 C

Santykinis medžiagų kiekis

120

reakcijos mišinyje, %
100
ME
80 RA
60 RR
40 DAG
MAG
20
0
K 0 4 9 13 18 22 26 30 35 40
Vandens kiekis reakcijos mišinyje, %

3.8 pav. Lipoprime 50T katalizuojamos RA transesterinimo metanoliu reakcijos po 24 val., esant
40oC temperatūrai, kai RA:MetOH molinis santykis 1:6, eigos priklausomybė nuo vandens
koncentracijos reakcijos mišinyje: tret-butanolyje (A), n-heksane (B) bei tret-butanolio ir n-
heksano mišinyje (1:1) (C). K - RA (kontrolė).

Nustatyta, kad skirtinguose tirpikliuose bei jų mišinyje kiekybiniai vandens

pokyčiai daro skirtingą įtaką procesų eigai. Tirtomis sąlygomis tret-butanolyje optimali
yra anksčiau naudota vandens koncentracija (9 %) (3.8 (A) pav.: suskaldomas visas RA,
ME kiekis siekia 39 %), o n-heksane ji yra gerokai didesnė – 26 %: nors ir
nesuskaldomas visas RA, tačiau ME kiekis sudaro 68 % (3.8 (B) pav.). Tai patvirtina
literatūroje nurodomą fermento optimalaus aktyvumo palaikymui reikalingą vandens
kiekio priklausomybę nuo tirpiklio hidrofobiškumo - skirtinguose tirpikliuose lipazei
palaikyti maksimalų aktyvumą reikia skirtingo kiekio vandens: kuo tirpiklis
hidrofobiškesnis, tuo didesnė vandens dalis reikalinga reakcijos mišinyje [135, 447].
Įdomiausias iš tirtų yra reakcijų, vykdytų tirpiklių mišiniuose, atvejis: čia
optimalios vandens koncentracijos yra trys: 4, 35 ir 40 % (3.8 (C) pav.: susidariusio ME
kiekis yra panašus - 40, 44 ir 43 %, atitinkamai). Nors visas RA suskaldomas, kai
vandens koncentracija reakcijos mišinyje siekia ir 4, ir 35 bei 40 %, visgi įdomiausi
pastarieji du atvejai, nes reakcijos mišinį praktiškai sudaro tik laisvos RR ir jų metilo
esteriai: suskaldomas visas RA, MAG bei DAG ir nusistovi pusiausvyra, kuri, ilginant
reakcijos trukmę, nekinta.
Kadangi, esant optimaliam vandens kiekiui, n-heksane gauta santykinai didelė
RR metilo esterių išeiga (68 %), buvo nutarta dar kartą įvertinti molinio substratų
santykio įtaką proceso produktyvumui, didinant metanolio kiekį reakcijos mišinyje (3.9
pav.).

86
 120

Santykinis medžiagų kiekis

reakcijos mišinyje, %
100
ME
80 RA
60 RR

40 DAG
MAG
20

0
K 2 4 6 8 10 12 14 16
Metanolio molinė dalis rapsų aliejaus atžvilgiu

3.9 pav. Lipoprime 50T katalizuojamos RA transesterinimo metanoliu n-heksane, esant 40oC
temperatūrai bei 26 % vandens, reakcijos po 24 val. efektyvumo priklausomybė nuo molinio
substratų santykio. K – RA (kontrolė).

Paaiškėjo, kad šiuo atveju optimaliausias RA ir metanolio molinis santykis yra

1:12 – 1:16 reikšmių intervale: per 24 val. suskaldomas visas RA bei MAG, o ME išeiga
siekia apie 75 %. Literatūroje aptinkama duomenų, kad kitų Lietuvoje vykdomų tyrimų
metu lipazių katalizuojamoms riebalų transesterinimo reakcijoms tirti naudojamas,
niekur kitur publikacijose neaptiktas, aliejaus ir metanolio molinis santykis, siekiantis
1:400 [448], o butanolio atveju ir – 1:500 [449], tačiau, kaip žinoma, net ir 1:42 santykis,
kuris neretai būna naudojamas, kai reakcija vykdoma be katalizatoriaus superkritinėmis
sąlygomis, yra ne tik ekonomiškai nepalankus, bet ir pavojingas aplinkai [297].
Taigi nustačius optimalias temperatūros, tirpiklio, vandens koncentracijos ir
molinio substratų santykio reikšmes, galiausiai atlikti ir fermento kiekio įtakos reakcijos
produktyvumui tyrimai. Rezultatai pateikti 3.10 paveiksle.
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
ME
80 RA
60 RR
40 DAG
MAG
20
0
K 11 22 44 66 88 110
Fermento koncentracija reakcijos mišinyje, mg/ml

3.10 pav. Lipoprime 50T katalizuojamos RA transesterinimo metanoliu n-heksane, esant 40oC
temperatūrai, RA:MetOH moliniam santykiui 1:16 bei 26 % vandens, reakcijos eigos
priklausomybė nuo fermento kiekio. K – RA (kontrolė).

87
 Paaiškėjo, kad, esant 66 mg/ml fermento koncentracijai, reakcijos mišinį sudaro
mažiausias laisvų RR kiekis, o ME išeiga siekia beveik 85 %, ir tai yra didžiausias šių
tyrimų metu gautas ME kiekis (3.10 pav.).

3.1.2 Lipolase 100L katalizuojamas rapsų aliejaus transesterinimas metanoliu bei

metil- ir butilacetatais

Kadangi Lipoprime 50T preparato komercinė gamyba buvo nutraukta, ir mes

negalėjome tęsti darbų, tolimesniems tyrimams buvo pasirinktas kitas iš Thermomyces
lanuginosus išskirtos lipazės komercinis preparatas - Lipolase. Pirmiausia palyginimui
buvo pakartotos RA transesterinimo metanoliu reakcijos tret-butanolyje, naudojant
skystą (Lipolase 100L) ir imobilizuotą (Lipolase 100T) lipazių preparatus (3.11 pav.).

Skystas Imobilizuotas
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
ME
80 RA
60 RR
40 DAG
MAG
20
0
K 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2
Reakcijos trukmė, val.

3.11 pav. Lipolase 100L (skysto) ir Lipolase 100T (imobilizuoto) preparatų katalizuojamo RA
transesterinimo metanoliu tret-butanolyje esant 30oC eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės.
K - RA (kontrolė).

Akivaizdu, kad imobilizuotas preparatas savo aktyvumu neprilygo skystam, kurio

katalizuojamos reakcijos metu per 15 minučių suskaldomas beveik visas RA (3.11 pav.).
Be to, taip Lipolase 100L savo hidroliziniu aktyvumu pranoko anksčiau tirtą Lipoprime
50T, kurio katalizuojamos reakcijos metu visas RA suskaldomas tarp 5 ir 24 val. (3.3
pav.). Todėl tolimesniems tyrimams pasirinktas tik Lipolase 100L lipazės preparatas.
Yra žinoma, kad, norint padidinti gaunamų esterių išeigą bei išvengti slopinamo
metanolio poveikio, vietoj alkoholių kaip acilakceptoriai biodyzelino gamybos procese
gali būti naudojami atitinkami jų ir acto rūgšties esteriai - acetatai [393]. Įrodyta, kad
metilacetatas neturi jokio neigiamo poveikio fermento aktyvumui. Be to, taip išvengiama
ir neigiamo glicerolio poveikio, nes vietoj jo susidaro lipazėms jokio efekto neturintis

88
triacetinas, ir negana to, jo, kaip šalutinio reakcijos produkto, vėlesnis panaudojimas yra
įvairiapusiškesnis nei glicerolio, susidarančio, kai reakcijoms kaip acilakceptoriai
naudojami alkoholiai [393, 394].
Tad tyrimų metu buvo palygintos Lipolase 100L katalizuojamos RA
transesterinimo reakcijos, kai kaip acilakceptoriai naudoti ir metanolis, ir metil- bei
butilacetatai. Šis eksperimentas išsiskyrė tuo, kad, siekiant įvertinti maksimalų proceso
ekonomiškumo potencialą, reakcijos buvo vykdytos, nepalaikant įprastai efektyviam jų
vyksmui reikalingos aukštesnės temperatūros. Tad reakcijų sąlygos buvo: 25oC
temperatūra, palyginti du anksčiau tirti tirpikliai (n-heksanas ir tret-butanolis) bei
reakcijos sistemos be tirpiklio, RA ir acilakceptoriaus (metanolio (A), metil- (B) ir
butilacetato (C)) molinis santykis 1:4, reakcijos trukmė – nuo 30 min. iki 24 val. (3.12
pav.).
A

Be tirpiklio tret-Butanolis n-Heksanas

120
Santykinis medžiagų kiekis
reakcijos mišinyje, %

100
ME
80
RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
0,5 1 5 24 0,5 1 5 24 0,5 1 5 24
Reakcijos trukmė, val.

B
Be tirpiklio tret-Butanolis n-Heksanas
120
Santykinis medžiagų kiekis
reakcijos mišinyje, %

100
ME
80
RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
0,5 1 5 24 0,5 1 5 24 0,5 1 5 24
Reakcijos trukmė, val.

89
 C
Be tirpiklio tret-Butanolis n-Heksanas
120

Santykinis medžiagų kiekis

reakcijos mišinyje, %
100
BE
80
RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
0,5 1 5 24 0,5 1 5 24 0,5 1 5 24
Reakcijos trukmė, val.

3.12 pav. Lipolase 100L katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu (A), metilacetatu (B) ir
butilacetatu (C) metu susidarančių produktų kiekio priklausomybė nuo reakcijos trukmės bei
tirpiklio prigimties.

Paaiškėjo, kad tirtomis sąlygomis RA transesterinimas įprastu alkoholiu –

metanoliu - vyksta nepalyginamai efektyviau nei atitinkamos reakcijos su acetatais. Šiuo
atveju reakcija efektyviausiai vyko be tirpiklio: per 24 val. suskaldomas visas RA, esterių
išeiga siekia 56 % (tret-butanolyje – 30 %, o n-heksane – 42 %), o MAG sudaro apie 2
%, DAG – apie 11 %, laisvos RR – apie 31 % (3.12 (A) pav.).
Įdomu tai, kad esterių sintezė apskritai nevyko (stebimas tik lėtas hidrolizės
procesas) n-heksane, kai kaip acilakceptorius buvo naudotas metilacetatas (3.12 (B)
pav.), ir sistemoje be tirpiklio, kai naudotas butilacetatas (3.12 (C) pav.). Abiejų acetatų
atveju tret-butanolyje nedidelis esterių susidarymas (apie 5 %) stebimas tik po 24 val.,
tačiau šiame tirpiklyje, kaip ir ankstesnių tyrimų metu, stebima efektyvi hidrolizė:
metilacetato atveju suskaldomas visas RA, butilacetato atveju lieka apie 2 %, o laisvų RR
kiekiai sudaro 54 ir 52 %, atitinkamai. Nors transesterinimas metilacetatu reakcijų
sistemose be tirpiklio vyko neefektyviai, tačiau, palyginus su butilacetatu, čia stebima
gana efektyvi hidrolizė: po 24 val. lieka apie 52 % RA, tačiau santykinai daug ir DAG –
23 % (daugiau nei laisvų RR, kurios sudaro 18 %) (3.12 (B) pav.).
Kadangi Lipolase 100L katalizuojamas RA transesterinimas metanoliu vyko
efektyviausiai, įvertinta ir reakcijos mišinio maišymo įtaka bendram proceso
efektyvumui: analogiškos reakcijos buvo vykdytos su ir be maišymo (3.13 pav.).

90
 120 Be tirpiklio tret-Butanolis n-Heksanas

Santykinis medžiagų kiekis

reakcijos mišinyje, %
100
ME
80
RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
0,5 1 5 24 0,5 1 5 24 0,5 1 5 24
Reakcijos trukmė, val.

3.13 pav. Lipolase 100L katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu be maišymo metu

susidarančių produktų kiekio priklausomybė nuo reakcijos trukmės bei tirpiklio prigimties.

Gauti rezultatai nustebino: paaiškėjo, kad maišymas neturi didesnės įtakos

tiriamos reakcjos efektyvumui. Dėl mišinio nehomogeniškumo ir skirtingų fazių
susidarymo didžiausias neigiamas nemaišymo poveikis pasireiškė reakcijoms,
vykdytoms n-heksane - šiuo atveju esterių išeiga po 24 val. sumažėjo nuo 42 % (reakcija
su maišymu) iki 32 % (reakcija be maišymo). Tuo tarpu reakcijų, vykdytų tret-
butanolyje, atveju praktiškai nepastebėta jokio efektyvumo skirtumo. Tai gali būti
paaiškinta tuo, kad šiame tirpiklyje puikiai tirpsta visi reakcijos mišinį sudarantys
komponentai, todėl reakcijos sistemos homogeniškumas yra užtikrinamas ir be maišymo.
Sistemose be tirpiklio didžiausia gauta esterių išeiga sumažėjo nuo 56 % (maišant) iki 52
% (nemaišant). Toks nedidelis pokytis, palyginus su n-heksane vykusiais procesais, gali
būti paaiškintas substratų koncentracijos reakcijų mišiniuose skirtumais.
Nors šių reakcijų tyrimo metu negautos optimalios esterių išeigos, visgi rezultatai
leidžia daryti tam tikras išvadas: metil- bei butilacetatų naudojimas vietoj metanolio
tirtomis sąlygomis nėra efektyvus reakcijos produktyvumo didinimo sprendimo būdas; ir,
nors literatūroje neaptikta duomenų, kur būtų abejojama reakcijų maišymo svarba lipazių
katalizuojamų vyksmų metu, visgi paaiškėjo, kad kai kuriais atvejais maišymo būtinybę
gali nulemti tik naudojamo tirpiklio prigimtis.

3.1.3 Ektoino įtaka rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu eigai

Vis dažniau literatūroje pasirodo duomenų, kad, siekiant padidinti fermentinės

transesterinimo reakcijos produktyvumą, naudojami įvairūs priedai. Pavyzdžiui,

91
nustatyta, kad tam tikras ciklinės aminorūgšties - ektoino (1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-
pirimidino karboksirūgšties, 1.22 pav.) - kiekis reakcijos mišinyje gali padidinti
biodyzelino išeigą 20,9 %, palyginus su išeiga, gauta be šio priedo. Šis junginys plačiai
naudojamas biologinių makromolekulių bei ląstelių apsaugai bei stabilizacijai, o
teigiamas jo poveikis fermentinės biodyzelino sintezės metu, kaip manoma, yra susijęs su
lipazės giminingumo metanoliui sumažinimu, ir atitinkamai - triacilgliceroliams –
padidinimu. Tad tai galėtų būti vienas iš potencialių lipazių slopinimo metanoliu TAG
transesterinimo reakcijų metu problemos sprendimo būdų [413].
Ektoino įtakos RA transesterinimo metanoliu reakcijos tyrimams buvo pasirinkti
šeši skysti (Lipolase 100L, Lipex 100L, Lipozyme TL100L, Resinase A2X, Palatase
20000L, Lecitase Ultra) bei septyni imobilizuoti (Lipoprime 50T, Lipolase 100T, Lipex
100T, Lipozyme TL IM, Lipozyme RM IM, Novozym 435, Lipoclean 2000T)
komerciniai lipoliziniu aktyvumu pasižyminčių fermentų preparatai. Reakcijos
temperatūra (40oC) bei molinis substratų santykis (RA:MetOH = 1:6) buvo pasirinkti,
atsižvelgus į ankstesnių tyrimų metu gautus rezultatus. Nors ankstesnių mūsų tyrimų
metu nustatytas optimalus RA ir metanolio molinis santykis reakcijoms, vykdytoms n-
heksane siekė 1:12 - 1:16 (3.9 pav.), tačiau šiuo atveju pasirinkome santykį, artimesnį
plačiai literatūroje aprašytoms standartinėms sąlygoms (1:4) - 1:6 (optimalų tret-
butanolyje vykstantiems procesams) dėl to, kad, kaip žinoma, didesnis metanolio kiekis
reakcijos mišinyje slopina daugelio lipazių aktyvumą. Tuo tarpu šių tyrimų tikslas buvo
palyginti ektoino įtaką įvairių komercinių lipazių preparatų katalizuojamų reakcijų
produktyvumui, kai vykdomų procesų sąlygos nėra ekstremalios ar kritinės naudojamų
fermentų optimalaus veikimo atžvilgiu.
Pirmiausia buvo ištirta skystų komercinių lipolizinių fermentų katalizuojama RA
transesterinimo reakcija n-heksane: palygintas fermentų katalizinis aktyvumas sistemose
su ektoinu ir be jo, esant skirtingai reakcijos trukmei (3.14 pav.).

92
 A

Santykinis medžiagų kiekis reakcijos mišinyje, %

120

100
ME
80
RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

as ra
L
0L

a
0L

X
0L

2X
0L
0L

0L

ltr
00

00
A2

lt
10

10

10
10
10

00
A

U
1

00
TL

e
TL

20

e
x
e

x
se

P a nas
as

Pa e 2

as
pe

pe
as

e
e
la

se
in

cit

cit
Li

Li
l

m
m

s
i
po
po

es
es

ta

ta
E/

Le

Le
zy
zy
Li
Li

la

la
R
R
po

E/
po
E/

E/
Li
Li

E/
E/

B
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos mišinyje, %

120

100
ME
80
RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
0L
0L

ita ltra

a
2X
pe 0L

Pa ina 2X

20 L
0L
se L

0L

T L

lt r
0

00
0

es L10
ym L10
10

10

ym 10

00
po 10

ta e A
A

U
at 200
/R ase

se
x
E/ lase

as
po ipe

e
la

se

e
in

cit
Li

as
L

ec
po

es
/

Le
E

oz
Li

/L
Li

la
R

al

E
ip

/P
Li

/L

E
E

3.14 pav. Ektoino įtaka įvairių lipazių katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu n- heksane
po 3 (A) ir 24 val. (B) efektyvumui. Reakcijų su ektoinu mišiniai pažymėti „E/“.

Tyrimų metu nustatytas slopinantis ektoino poveikis, kuris didžiausias Lecitase

Ultra katalizuojamos reakcijos atveju: po 3 val. reakcijos be ektoino metu susidariusių
esterių kiekis siekia 12 %, su priedu – tik 3 % (3.14 (A) pav.), o po 24 val. gautos esterių
išeigos siekia 23 ir 6 %, atitinkamai (3.14 (B) pav.). Visų kitų tirtų fermentų atveju,
naudojant priedą, po 3 val. gautų esterių išeigos sumažėja 2 - 6 % (3.14 (B) pav.).
Didžiausias nustatytas neigiamas ektoino poveikis reakcijų produktyvumui stebimas po
24 val.: Lipolase 100L - ME išeiga sumažėja nuo 72 iki 49 %, Lipozyme TL100L - nuo
70 iki 48 % ir Resinase A2X - nuo 57 iki 40 %. Palatase 20000L ir Lipex 100L pasirodė
esantys atspariausi potencialiam neigiamam ektoino poveikiui fermentai: jų

93
katalizuojamų reakcijų metu net ir po 24 val. naudojamo priedo poveikis buvo nedidelis -
produktų išeigos sumažėjo 1 - 4 % (3.14 (B) pav.).
Siekiant detaliau įvertinti ektoino poveikį lipazių kataliziniam aktyvumui,
analogiškos reakcijos vykdytos ir kitame tirpiklyje – tret-butanolyje. Tyrimų rezultatai
pateikti 3.15 paveiksle.
A
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100
ME
80
mišinyje, %

RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
0L

as ltra
L

a
2X
pe 0L

Pa ina 2X
L

L
se L

po e T 0L

ltr
m 100

se 00
0

Li /Lip 100

00
0
0

E/ zym x 10
po 10

E/ tas e A
es e A

U
es L1
1

Le 200
ta 00
L

Le se

e
x
e

s
s

2
e
E/ las

E / i na

a
e
la

Pa e

cit

cit
Li
po

zy
E
Li

la
Li

la
R
R
po

E/
Li

B
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100
ME
80
RA
mišinyje, %

60 RR
DAG
40
MAG
20

0
as tra
E / nas 0L

a
L

X
po pex L
pe 0L

Pa ina 2X
se L

0L

0L

ltr
m 100
00
0

A2

00
es L10

l
10
10
po 10

00
es e A

Le e U

U
E/ x 1

Le 00
TL

se

20

e
E/ lase

E / t as
2
la

e
Li m e

Pa e
se

cit
Li

Li

ci
E/ tas
i
po

ta
zy
y
Li
Li

la

la
R
R
po
Li
E/

3.15 pav. Ektoino įtaka įvairių lipazių katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu tret-
butanolyje po 3 (A) ir 24 val. (B) efektyvumui. Reakcijų su ektoinu mišiniai pažymėti „E/“.

tret-Butanolyje po 3 val. nedidelis neigiamas ektoino poveikis nustatytas tik

Lipex 100L lipazės atveju: esterių išeiga sumažėja 3 %, palyginus su reakcija, kai priedas
nebuvo naudotas, o nesuskaldyto RA lieka 6 % daugiau (3.15 (A) pav.). Po 24 val.
reakcijų su priedu ir be jo produktyvumas tampa vienodas visais atvejais, išskyrus

94
Lecitase Ultra, kurios katalizuojama reakcija, priešingai nei anksčiau tirtų vyksmų n-
heksane metu, su ektoinu vyksta produktyviau: nors esterių išeiga padidėja tik 3 %,
tačiau suskaldomas visas RA, kai tuo tarpu reakcijos be priedo atveju po 24 val. vis dar
lieka apie 12 % RA (3.15 (B) pav.).
Nors, kaip minėta, po 24 val. akivaizdesnės ektoino įtakos lipazių (išskyrus
Lecitase Ultra) katalizuojamiems procesams, nepastebėta, tačiau reakcijų pradžioje (po 3
val.) šioks toks teigiamas ektoino poveikis nustatytas ir kai kurių kitų lipolizinių
fermentų atveju: esterių išeiga padidėja apie 2 %, kai reakcijas katalizuoja Lipolase
100L, Resinase A2X bei Lipozyme TL100L, pastarosios lipazės atveju per 3 val.
suskaldomas visas RA, kai buvo naudotas ektoinas, ir lieka apie 5 % RA, kai priedo
reakcijos mišinyje nebuvo (3.15 (A) pav.).
Pakartojus eksperimentus reakcijas vykdant sistemose be tirpiklio, vėl, kaip ir n-
heksane, daugeliu atveju nustatytas neigiamas ektoino poveikis (3.16 pav.), tik čia jis
pastebimas jau reakcijos pradžioje, o Lecitase Ultra lipazės katalizuojamo proceso metu
nustatyta, nors ir nedidelė, bet visgi teigiama ektoino įtaka bendram proceso
produktyvumui.
A
120

100
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

ME
80
RA
60 RR
DAG
mišinyje, %

40
MAG
20

0
as tra
E / nas 0L

a
TL L

20 X
Li /Lip 00L
pe 0L

Pa ina 2X
po e T L
se L

ltr
0
00
0

se 0 0
A2

00

l
10
E / zym 1 0
0
po 10

es e A

Le e U

U
1

L1
1

Le 00
0
se

e
x
ex
E / l a se

E / t as
2
e
la

Pa e

cit
Li

ci
E/ tas
i
po

es

ta
zy
E
Li
Li

la

la
R
R
po
Li

95
 B

Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100
ME
80

mišinyje, %
RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

se L

t a ltra
0L

a
X
L

0L
Pa ina 2X

E/ itas 0L
L

T L

00

ltr
Li 100

00
Li /Lip 100
ol 100

/P ase A2
ym L10

as 00

0
A

U
es L1

Le 200
E zym x 1

se

at 20

Le e
se
e

x
/L se

T
as

pe

E i na
e
e
la

ci
c
po

es
ip

t
oz

la
Li

/R
R
po

al
ip
E

/L

E
3.16 pav. Ektoino įtaka įvairių lipazių katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu reakcijos
sistemoje be tirpiklio po 3 (A) ir 24 val. (B) efektyvumui. Reakcijų su ektoinu mišiniai pažymėti
„E/“.

Reakcijų sistemose be tirpiklio, didžiausias neigiamas priedo poveikis stebimas

Lipolase 100L ir Lipex 100L atvejais. Po 24 val. mažiausia neigiama ektoino įtaka
nustatyta Resinase A2X ir Palatase 20000L lipazių katalizuojamų reakcijų metu (3.16 (B)
pav.).
Analogiški eksperimentai buvo atlikti ir su anksčiau minėtais septyniais
imobilizuotais komerciniais lipolizinių fermentų preparatais, tačiau šiuo atveju reakcijų
su ektoinu ir be jo eiga nesiskyrė, todėl pateiktas tik reakcijų be tirpiklio po 24 val.
mišinius sudarančių medžiagų santykinių kiekių palyginimas (3.17 pav.).
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100
ME
80
mišinyje, %

RA
60 RR
DAG
40
MAG
20

0
M

E / ozy I M
e M

5
5
po e R IM
e 0T
pe 0T

Li m e T
se T
0T

0T

T
E/ las 0T

3
Li voz 43
00

m MI

00
0

E / cl e m 4
0

TL
po e 5

cl 20 0
M
Li 10

E / zy T L
po 10
5

E/ x 1

po x 1

20
o m
N eR
po e
e
m

y
m

n
an
Li ym
E/ pri

m
p
la

ea
pr

E/ zy
Li

ov
zy
po

z
po

N
po
Li

po
Li

po
Li

Li

Li

Li

Li

3.17 pav. Ektoino įtaka įvairių imobilizuotų lipazių katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu
reakcijos sistemoje be tirpiklio po 24 val. efektyvumui. Reakcijų su ektoinu mišiniai pažymėti
„E/“.

96
 Įdomu tai, kad visas RA suskaldomas tik Lipozyme TL IM (čia gaunama ir
didžiausia esterių išeiga, siekianti 65 %) ir labai mažai tyrinėto Lipoclean 2000T
preparato atveju. Daugiausia nesuskaldyto RA (apie 25 %) lieka Lipoprime 50T, Lipex
100T ir Novozym 435 katalizuojamų reakcijų metu.
Taigi ektoino, kaip priedo, padidinančio lipazių katalizuojamos transesterinimo
reakcijos produktyvumą, naudojimas tirtomis sąlygomis nepasiteisino. Kadangi ektoino
kiekis (1,1 mM) tyrimams buvo pasirinktas, atsižvelgus į literatūroje rastus duomenis,
tikėtina, kad mūsų atveju tai nebuvo optimali šio priedo koncentracija, mat yra nustatyta,
kad per didelė ektoino koncentracija gali slopinti fermentų aktyvumą [413]. Be to, galima
daryti preliminarias išvadas, kad hidrofilinėje aplinkoje (tret-butanolyje) ektoinui labiau
būdingas teigiamas poveikis, o hidrofobinėje (n-heksane, mišiniuose be tirpiklio) –
neigiamas.

3.1.4 Naujų organinių tirpiklių - glikolio eterių - įtaka rapsų aliejaus

transesterinimo metanoliu eigai

Glikolio eteriai (GLYMES) – jokių kitų funkcinių grupių neturintys sotūs

polieteriai. Kitaip nei glikoliai (pavyzdžiui, polietilenglikolis), glikolio eteriai neturi
laisvų hidroksigrupių, todėl yra chemiškai inertiški. Daugelis šių junginių puikiai maišosi
ir su kitais organiniais tirpikliais, ir su vandeniu, todėl juose puikiai tirpsta įvairūs
reakcijų substratai (tiek hidrofobiniai, tiek hidrofiliniai), susidarant homogeniniams
reakcijų mišiniams. Be to, jiems būdingas mažas klampumas, didelis cheminis ir terminis
stabilumas, nedidelis toksiškumas bei bioskalumas. Teigiama, kad glikolio eterių
naudojimas gali padidinti lipazės stabilumą, mat sumažėja neigiamas reakcijos substratų
poveikis: manoma, kad, naudojant šiuos tirpiklius, lipazių stabilumas, esant didelėms
metanolio koncentracijoms, smarkiai išauga dėl tarp metanolio ir glikolio dieterių
deguonies atomų susidarančių vandenilinių ryšių [450].
Atsižvelgus į literatūrinius duomenis, tyrimams buvo pasirinkti keturi lipazių
katalizuojamoms aliejų transesterinimo reakcijoms tinkamiausi glikolio eteriai (3.2
lentelė: 2, 4 – 6 eilutės) [450].

97
3.2 lentelė. Tyrimams naudoti organiniai tirpikliai
Tirpiklis logP
1 n-Heksanas +3,50
2
2 Dietilenglikolio dibutilo eteris +2,24
4
3 tret-Butanolis +0,83
4 Etilenglikolio dietilo eteris +0,75
5
5 Dietilenglikolio dietilo eteris +0,27
6
6 Tetraetilenglikolio dimetilo eteris -1,26

Kadangi, kaip minėta, šių tyrimų metu Lipoprime 50T lipazės komercinė gamyba
jau buvo nutraukta, pasirinkti kiti komerciniai preparatai: šeši skysti (Lipolase 100L,
Lipozyme TL100L, Lipex 100L, Resinase A2X, Palatase 20000L, Lecitase Ultra) bei du
imobilizuoti (Novozym 435 ir Lipoclean 2000T). Reakcijos temperatūra (40oC) bei
molinis substratų santykis (RA:MetOH = 1:6) buvo pasirinkti, atsižvelgus į ankstesnių
tyrimų metu gautus rezultatus. Skirtingų tirpiklių įtakos šių fermentų katalizuojamų RA
transesterinimo metanoliu reakcijų efektyvumui tyrimų rezultatai pateikti 3.18 paveiksle.
A
Santykinis esterių kiekis reakcijos

50
45
40 tret-Butanolis
35
mišinyje, %

n-Heksanas
30
Dietilenglikolio dietilo eteris
25
Tetraetilenglikolio dimetilo eteris
20
15 Etilenglikolio dietilo eteris
10 Dietilenglikolio dibutilo eteris
5
0
Lipolase Lipozyme Lipex Resinase Palatase Lecitase Novozym Lipoclean
100L TL100L 100L A2X 20000L Ultra 435 2000T

B
Santykinis esterių kiekis reakcijos

90
80
70 tret-Butanolis
60 n-Heksanas
mišinyje, %

50 Dietilenglikolio dietilo eteris

40 Tetraetilenglikolio dimetilo eteris
30 Etilenglikolio dietilo eteris
20 Dietilenglikolio dibutilo eteris
10
0
Lipolase Lipozyme Lipex Resinase Palatase Lecitase Novozym Lipoclean
100L TL100L 100L A2X 20000L Ultra 435 2000T

3.18 pav. Įvairių komercinių lipazių katalizuojamų RA transesterinimo metanoliu skirtinguose

tirpikliuose reakcijų efektyvumo po 3 (A) ir 24 val. (B) palyginimas.

98
 Iš gautų duomenų nustatyta, kad po 3 val. reakcijos efektyviausiai vyksta tret-
butanolyje visų tirtų lipazių atveju, išskyrus Lipex 100L, kurios katalizuojamas
transesterinimas produktyviausiai vyksta n-heksane. Didžiausios esterių išeigos,
siekiančios beveik 45 %, gautos Lipolase 100L ir Resinase A2X lipazių katalizuojamų
reakcijų metu (3.18 (A) pav.), bet po 24 val. situacija gana smarkiai pasikeitė - didžiausi
esterių kiekiai (apie 80 %) gauti n-heksane Lipozyme TL100L, Lipex 100L, Resinase
A2X ir Lipoclean 2000T katalizuojamo transesterinimo metu. Lipolase 100L atveju
gauta esterių išeiga mažesnė, palyginus su anksčiau minėtais fermentais, tačiau šios
lipazės katalizuojama reakcija taip pat efektyviausiai vyksta n-heksane. Palatase 20000L,
Lecitase Ultra, ir Novozym 435 katalizuojamas RA transesterinimas ir po 24 val.
efektyviausiai vyksta tret-butanolyje (3.18 (B) pav.).
Produktų išeigos, gautos reakcijas vykdant glikolio eteriuose, daugeliu atveju
neprilygo tradiciniams dažniausiai naudotiems tirpikliams – n-heksanui bei tret-
butanoliui. Po 3 val. didžiausios esterių išeigos (22 - 24 %) gautos dietilenglikolio dietilo
eteryje Lipolase 100L, Lipozyme TL100L ir Resinase A2X atveju. Įdomu tai, kad šių
fermentų katalizuojamos reakcijos apskritai nevyko etilenglikolio dietilo eteryje: esterių
nesusidarė nei po 3, nei po 24 val., tuo tarpu Lipoclean 2000T atveju esteriai nesusidarė
po 3 val, tačiau po 24 val. gauta išeiga siekė apie 10 %, ir šis kiekis netgi lenkia Lecitase
Ultra bei Novozym 435 katalizuojamų reakcijų metu susidariusių esterių išeigas,
nepaisant to, kad pastarųjų atveju, esterių aptinkama jau po 3 val. Dietilenglikolio
dibutilo eteryje nevyksta tik Novozym 435 katalizuojama reakcija, Lipoclean 2000T
atveju vėl stebima ta pati tendencija: po 3 val. esterių nesusidaro, tačiau po 24 val. jų
susidaro apie 30 %, ir tai yra viena didžiausių gautų išeigų šiame tirpiklyje (3.18 pav.).
Visais atvejais fermentai mažiausiu kataliziniu aktyvumu pasižymėjo
etilenglikolio dietilo eteryje, išskyrus Palatase 20000L, kurios katalizuojamos reakcijos
vyko labai neefektyviai, tačiau panašiai visuose glikolio eteriuose. Reakcijos
produktyviausiai vyko dietilenglikolio dietilo eteryje bei tertaetilenglikolio dimetilo
eteryje, išskyrus Lipex 100L lipazę, kurios katalizuojamas transesterinimas
dietilenglikolio dibutilo eteryje vyko panašiu efektyvumu.
Kadangi buvo palyginti aštuoni skirtingi komerciniai lipazių preparatai, iš kurių
šeši buvo skysti ir du imobilizuoti, siekiant sukurti identiškas reakcijų sąlygas,

99
imobilizuotų fermentų atveju į reakcijos mišinį atitinkamai buvo pridedamas papildomas
kiekis vandens. Žinant, kad vanduo turi didelės reikšmės reakcijų eigai, ir atsižvelgus į
literatūrinius duomenis, kad Novozym 435 lipazė puikiai veikia ir bevandenėje aplinkoje,
eksperimentai tęsti tik su imobilizuotais fermentais, nepridedant papildomo kiekio
vandens. Tyrimų rezultatai palyginti su anksčiau gautais duomenimis (3.19 pav.).
A
Santykinis esterių kiekis reakcijos

50
45
40
35 Novozym 435
mišinyje, %

30 Novozym 435 be vandens

25
20 Lipoclean 2000T
15 Lipoclean 2000T be vandens
10
5
0
tret-Butanolis n-Heksanas Dietilenglikolio Tetraetilenglikolio Etilenglikolio Dietilenglikolio
dietilo eteris dimetilo eteris dietilo eteris dibutilo eteris

B
Santykinis esterių kiekis reakcijos

90
80
70
60 Novozym 435
mišinyje, %

50 Novozym 435 be vandens

40 Lipoclean 2000T
30 Lipoclean 2000T be vandens
20
10
0
tret-Butanolis n-Heksanas Dietilenglikolio Tetraetilenglikolio Etilenglikolio dietilo Dietilenglikolio
dietilo eteris dimetilo eteris eteris dibutilo eteris

3.19 pav. Bevandenės aplinkos įtaka Novozym 435 ir Lipoclean 2000T lipazių katalizuojamų RA
transesterinimo metanoliu reakcijų skirtinguose tirpikliuose efektyvumui po 3 (A) ir 24 val. (B).

Nustatyta, kad bevandenėje aplinkoje vyksta Novozym 435 katalizuojama

reakcija dietilenglikolio dibutilo eteryje (susidaro kiek daugiau nei 20 % esterių), kuri
apskritai nevyksta, kai reakcijos mišinyje yra papildomas kiekis vandens. Be to, visais
atvejais stebimas smarkus esterių išeigų augimas. Po 3 val. didžiausia esterių išeiga (45
%), gauta, kai reakcijos tirpikliu naudojamas tret-butanolis bei tetraetilenglikolio
dimetilo eteris, po 24 val. kiek daugiau nei 50 % esterių išeiga nustatyta, kai tirpikliu
naudotas tret-butanolis, nors reakcijos ir kituose tirpikliuose, išskyrus dietilenglikolio
dibutilo eterį, vyko gana panašiu produktyvumu - išeigos viršija 40 %.
Tuo tarpu Lipoclean 2000T situacija daugeliu atvejų priešinga - vandens
pašalinimas iš reakcijos mišinio labai smarkiai sumažino fermento katalizinį aktyvumą
visuose tirpikliuose, išskyrus etilenglikolio dietilo eterį, kuriame jau po 3 val. susidaro
nedidelis esterių kiekis, apskritai nesusidaręs reakcijų mišiniuose su vandeniu net ir po

100
24 val. Įdomu, kad po 24 val. n-heksane esterių išeiga siekia beveik 80 %, kai reakcijos
mišinyje yra vandens, tuo tarpu bevandenėje aplinkoje šis kiekis nesiekia nė 5 %.
Kadangi bevandenė aplinka pradiniame reakcijos mišinyje pasižymėjo teigiamu
efektu Novozym 435 katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu metu, siekiant
optimizuoti reakcijos sąlygas, buvo bandoma papildomai pašalinti vandenį ir iš reakcijos
mišinio molekulinių sietų bei mėlynojo silikagelio su drėgmės indikatoriumi pagalba.
Tyrimų duomenys pateikti 3.20 paveiksle.
A
Santykinis esterių kiekis reakcijos

60

50
40 Vanduo
mišinyje, %

Be vandens
30
Be vandens + molekuliniai sietai
20 Be vandens + silikagelis
10

0
tret-Butanolis n-Heksanas Dietilenglikolio Tetraetilenglikolio Etilenglikolio Dietilenglikolio
dietilo eteris dimetilo eteris dietilo eteris dibutilo eteris

B
Santykinis esterių kiekis reakcijos

70
60
50 Vanduo
mišinyje, %

40 Be vandens
30 Be vandens + molekuliniai sietai
20 Be vandens + silikagelis

10
0
tret-Butanolis n-Heksanas Dietilenglikolio Tetraetilenglikolio Etilenglikolio Dietilenglikolio
dietilo eteris dimetilo eteris dietilo eteris dibutilo eteris

3.20 pav. Vandens ir jo šalinimo iš reakcijos mišinio būdo įtaka Novozym 435 lipazės
katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu skirtinguose tirpikliuose po 3 (A) ir 24 val. (B)
efektyvumui.

Nustatyta, kad molekulinių sietų pridėjimas į reakcijos mišinį, padidina reakcijos

efektyvumą visais atvejais, išskyrus reakciją po 24 val. n-heksane. Ypatingai didelis
poveikis matomas dietilenglikolio dibutilo eteryje (didžiausias esterių išeigų skirtumas).
Mėlynojo silikagelio poveikis reakcijai priešingas – katalizinis fermento aktyvumas
sumažėjo visais atvejais. Tai gali būti susiję su mechaniniu imobilizuoto fermento
molekulių pažeidimu silikagelio grūdeliais reakcijos mišinių maišymo magnetine
maišykle metu. Taigi molekulinių sietų naudojimas gali būti efektyvus vandens šalinimo
iš reakcijos mišinio būdas, siekiant gauti didžiausias pageidaujamo produkto išeigas.

101
Glikolio eteriuose molekulinių sietų pagalba po 24 val. didžiausią metilo esterių išeigą
pavyko padidinti iki 60 %.

Skyriaus apibendrinimas:
Ištyrus dviejų skirtingų organinių tirpiklių – n-heksano ir tret-butanolio – įtaką
Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu eigai, nustatyta, kad
tret-butanolis yra tinkamesnis aliejų hidrolizei, o n-heksanas – transesterinimui vykdyti.
Reakcijoms naudojant įvairius n-heksano ir tret-butanolio mišinius, pastebima tiesioginė
išsiskiriančių laisvų RR kiekio priklausomybė nuo tret-butanolio tūrio dalies tirpiklių
mišinyje, tačiau tokių mišinių naudojimas nėra efektyvus produktų išeigos didinimo
būdas - neprilygsta atitinkamiems procesams, vykstantiems grynuose tirpikliuose. Be to,
vandens kiekio pokyčiai daro skirtingą įtaką reakcijų efektyvumui – kuo tirpiklis
hidrofobiškesnis, tuo daugiau vandens reikia maksimaliam proceso efektyvumui pasiekti:
optimali vandens koncentracija tret-butanolyje yra 9 %, o n-heksane - 26 %.
Ištyrus optimalias abiejuose tirpikliuose vykdomų procesų sąlygas, nustatyta, kad
jiems būdinga ta pati optimali temperatūra - 40oC. tret-Butanolyje visas aliejus
suskaldomas per 1,5 val., o didžiausia esterių išeiga (40 %) gaunama per 4 val., kai
molinis RA ir metanolio santykis yra 1:6 – 1:8, vanduo sudaro 9 %, o fermentinio
preparato kiekis – 44 mg/ml. Tyrimų metu didžiausia gauta esterių išeiga siekia 85 %, kai
reakcija vykdyta 24 val. n-heksane, esant 26 % vandens, 66 mg/ml fermentinio preparato
bei RA ir metanolio moliniam santykiui 1:12 – 1:16.
Palyginus Lipolase 100L lipazės katalizuojamo RA transesterinimo metanoliu bei
metil- ir butilacetatais, efektyvumą, paaiškėjo, kad acetatų naudojimas vietoj metanolio
tirtomis sąlygomis nėra efektyvus reakcijos produktyvumo didinimo būdas. Ektoino, kaip
priedo, padidinančio aliejų transesterinimo metanoliu produktyvumą, naudojimas
tirtomis sąlygomis taip pat nepasiteisino. Kadangi ektoino kiekis (1,1 mM) tyrimams
buvo pasirinktas, atsižvelgus į literatūroje rastus duomenis, tikėtina, kad mūsų atveju tai
nebuvo optimali šio priedo koncentracija. Reakcijos naujuose organiniuose tirpikliuose -
glikolio eteriuose - daugeliu atveju neprilygo procesams, vykstantiems tradiciniuose
tirpikliuose – n-heksane bei tret-butanolyje, tačiau reakcijos produktyvumas gali būti
gerokai padidintas, naudojant džiovinimo agentus - molekulinius sietus.

102
3.2 Biotepalų sintezė: reakcijos, kai vienas iš substratų yra
trimetilolpropanas

Šiuo metu didžiąją tepalų dalį (85 - 90 %) sudaro iškastinio kuro produktai,
mažiau nei 15 % - sintetinė alyva, kuriai būdinga aukšta kokybė, geresnės tepamosios
savybės, didesnis termo- ir labai geras oksidacinis stabilumas bei mažesnis lakumas.
Nors augaliniai riebalai (aliejai) gali būti įvardijami kaip iš atsinaujinančių šaltinių
išgaunami bioskalūs esterių tipo tepalai, visgi prieš naudojimą turi būti pakeistos tam
tikros jų savybės: neatitinkantis reikalavimų oksidacinis stabilumas, blogos tepamosios
savybės, esant žemai temperatūrai ir kt. Dėl to tiesioginis aliejų, kaip biotepalų,
naudojimas pramonėje yra ribotas ir sudaro apie 1 % visų pasaulinės rinkos tepalų [451].
Tačiau tokios sandaros junginiai kaip 2-etil-2-hidroksimetil-1,3-propandiolis
(trimetilolpropanas, TMP) – triolis, kitaip nei įprastai TAG sudėtyje esantis glicerolis,
ties β–anglimi neturi vandenilio atomo, o tai, kaip manoma, nulemia TMP esterių
ypatingai aukšto lygio oksidacinį bei termostabilumą. Taip pat žinoma, kad tokie esteriai
pasižymi ir geromis tepamosiomis (lubrikantinėmis) savybėmis bei kitomis
technologiškai patraukliomis charakteristikomis [19].
Cheminiu būdu TMP esteriai gali būti gaunami šiuo trioliu transesterinant,
pavyzdžiui, iš palmių aliejaus gautus metilo esterius [451], tačiau galimi ne tik
cheminiai, bet ir alternatyvūs – fermentiniai - metodai, panaudojant riebalų virsmų
reakcijas katalizuojančius fermentus – lipazes [19]. Reakcijos schema pateikta 3.21
paveiksle.

Lipazė

Trimetilolpropanas Riebalų rūgštis Trimetilolpropano triesteris Vanduo

3.21 pav. Trimetilolpropano esterinimo riebalų rūgštimis reakcijos schema [19].

Žinant minėtas TMP junginio cheminės sandaros lemiamas ypatybes, buvo tirtos
komercinių lipazių katalizuojamos MO transesterinimo ir OR esterinimo TMP reakcijos.
Tyrimų pradžioje, pasirinkus vieną komercinį Lipoprime 50T lipazės preparatą,
vykdomų reakcijų sąlygos buvo parinktos, atsižvelgus į E. Uosukainen ir bendraautorių

103
metodiką (Uosukainen et al., 1998): molinis MO arba OR ir TMP santykis buvo 3,5:1 ir
4,5:1, temperatūra – 37oC bei 47oC, vandens kiekis reakcijos mišinyje sudarė 15 %
(w/w), o lipazės preparatas - 40 % (w/w). Nors minėtoje metodikoje slėgio sumažinimas
(2 – 16 kPa) buvo apibūdintas kaip vienas esminių veiksnių, nulemiančių dideles
reakcijos metu susidarančių produktų išeigas, mes siekėme įvertini proceso efektyvumą,
esant normaliam atmosferos slėgiui, taip išvengiant sudėtingos įrangos naudojimo vėliau
taikant sukurtus metodus didesnio masto gamybai. Tyrimų rezultatai pateikti 3.22 – 3.24
paveiksluose.
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100
MO
80
mišinyje, %

TMP-TO
60 OR
TMP-DO
40
TMP-MO
20

0
1 2 3 4 5 6 7 8

Reakcijų sąlygos
Reakcija 1 2 3 4 5 6 7 8
TMP ir MO molinis santykis 1:3,5 1:3,5 1:3,5 1:3,5 1:4,5 1:4,5 1:4,5 1:4,5
Temperatūra, oC 37 37 47 47 37 37 47 47
Trukmė, val. 48 72 48 72 48 72 48 72

3.22 pav. Molinio substratų santykio, reakcijos trukmės ir temperatūros įtaka Lipoprime 50T
lipazės katalizuojamo MO transesterinimo TMP efektyvumui.

Įvertinus molinio substratų santykio įtaką Lipoprime 50T lipazės katalizuojamos

MO transesterinimo TMP reakcijos efektyvumui, esant 37oC ir 47oC temperatūroms,
nustatyta, kad, TMP-TO išeigos didesnės, kai TMP ir MO molinis santykis yra 1 : 3,5,
kas lėmė jo pasirinkimą tolimesniems tyrimams. Be to, esant šiam santykiui, pakėlus
reakcijos temperatūrą nuo 37oC iki 47oC, triesterių išeiga išauga nuo 14 iki 31 % (3.22
pav.), todėl, siekiant optimizuoti proceso sąlygas, tyrimai tęsti, esant 60oC temperatūrai.
MO transesterinimo (3.23 pav.) bei OR esterinimo (3.24 pav.) TMP reakcijos vykdytos
ne tik vandenyje (3.23 (B) ir 3.24 (B) pav.), bet ir tret-butanolyje (3.23 (A) ir 3.24 (A)
pav.).

104
 A

Santykinis medžiagų kiekis

120

reakcijos mišinyje, %
100
MO
80 TMP-TO
60 OR
40 TMP-DO
TMP-MO
20
0
1 3 5 24 48 72 120
Reakcijos trukmė, val.

B
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
MO
80 TMP-TO
60 OR
40 TMP-DO
TMP-MO
20
0
1 3 5 24 48 72 120
Reakcijos trukmė, val.

3.23 pav. Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo MO transesterinimo TMP, esant 60oC
temperatūrai, tret-butanolyje (A) ir vandenyje (B) eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės.

A
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
80 TMP-TO
OR
60
TMP-DO
40 TMP-MO
20
0
1 3 5 24 48 72 120
Reakcijos trukmė, val.

B
Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
80 TMP-TO
OR
60
TMP-DO
40 TMP-MO
20
0
1 3 5 24 48 72 120
Reakcijos trukmė, val.

3.24 pav. Lipoprime 50T lipazės katalizuojamo OR esterinimo TMP, esant 60oC temperatūrai,
tret-butanolyje (A) ir vandenyje (B) eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės.

105
 Išanalizavus gautus duomenis, nustatyta, kad, esant 60oC temperatūrai, tiek OR
esterinimo, tiek MO transesterinimo reakcijos efektyviau vyksta vandenyje nei tret-
butanolyje, ypač dideli susidariusių produktų kiekių skirtumai stebimi MO
transesterinimo reakcijos metu: po 120 val. tret-butanolyje TMP-TO išeiga tesiekia vos 7
%, o vandenyje – 31 %. Be to, vandenyje esterinimo reakcija dvigubai efektyvesnė nei
transesterinimo: TMP-TO išeigos sudaro 62 ir 31 %, atitinkamai. Didžiausios triesterių
išeigos gautos OR esterinimo TMP vandenyje metu po 72 val., ir reakcijos trukmės
ilginimas tos išeigos nekeitė (3.24 (B) pav.).
Tyrimų metu buvo keistos įvairios reakcijų sąlygos, bet viskas vykdyta tik su
vienu fermentu – Lipoprime 50T, tad, norint dar labiau optimizuoti procesą, buvo
siekiama įvertinti, kokios įtakos tirtų reakcijų metu susidarančių produktų kokybinei ir
kiekybinei išraiškai turėtų kitų fermentinių preparatų naudojimas. Todėl be anksčiau tirto
Lipoprime 50T pasirinkti dar 9 komerciniai lipolizinių fermentų preparatai bei palygintas
jų katalizinis aktyvumas po 72 val. nuo reakcijos pradžios. Be to, siekiant sukurti
ekonomiškesnį procesą, buvo sumažintas reakcijoms naudojamų fermentų kiekis - nuo
literatūroje aprašytų 40 % (w/w) iki mūsų parinktų 15 % (w/w) (3.25 pav.).
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120
100
TMP-TO
80
OR
60
mišinyje, %

TMP-DO
40
TMP-MO
20
0
IM
p a BG

im FG
Li n 5 M
0T

T
Li Li p F BG
Li ean 0 0T
po ase 35

oz e R T
N zym 100

50
I
4

zy 2 00

ym M
po 0
po TL

po 435
1
Li zy m

e
n
x
e

e
pa
m

pr
o
l
ov
po

cl
po
N

po
Li

Li
ov
Li

3.25 pav. Įvairių komercinių lipazių katalizuojamos OR esterinimo TMP, esant 60oC
temperatūrai, reakcijos metu po 72 val. susidariusių produktų santykinis kiekis reakcijų
mišiniuose.

Paaiškėjo, kad fermento kiekio sumažinimas turi itin didelę įtaką būtent
Lipoprime 50T lipazės katalizuojamos reakcijos efektyvumui: TMP-TO išeiga sumažėja
nuo 62 iki 10 %. Be to, tirtomis sąlygomis TMP-TO apskritai nesusidaro, kai reakcijoms
naudoti tokie fermentiniai preparatai kaip Lipolase 100T, Lipozyme TL IM, Lipopan
50BG, Lipopan FBG bei Lipex 100T fermentai. Didžiausia gauta TMP-TO išeiga siekia

106
beveik 52 % tik tuo atveju, kai reakcija buvo katalizuojama Lipozyme RM IM lipazės
(3.25 pav.).
Kadangi, kaip nustatyta ir žinoma, lipazių katalizuojamiems procesams labai
didelę įtaką turi vandens kiekis reakcijų sistemose, siekiant optimizuoti sąlygas, tyrimai
tęsti pradedant nuo bevandenių reakcijų mišinių. Duomenys pateikti 3.26 paveiksle.
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos A
120
100
TMP-TO
80
OR
60
mišinyje, %

TMP-DO
40
TMP-MO
20
0
0T

T
5

ea 0 0T

BG

ov e R T
IM

pr FG
G

IM
43

50
0
B
00

10

M
po TL

50

5
1

e
m

po n 2

43
n

im
po e x
e
zy

n
e

pa
s

pa
m
a

ym
p
vo

m
po
l

Li
zy
po

po
cl

zy
No

oz
Li
po
Li

Li
Li
Li
Li

Li

N
B
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120
100
TMP-TO
80
OR
60
mišinyje, %

TMP-DO
40
TMP-MO
20
0
T

T
0T
5

IM

0T
G

pr FG
IM
00

50
43

po 0 B

FB
10

10
L

oz RM
0

e
ym

5
T
po n 2

43
n

im
po se

po e x
n
e

pa
oz

e
pa
m
ea
a

ym
p

m
l

Li
ov

zy
po

po
po
cl

zy
Li
N

Li

Li
Li

ov
Li
Li

Li

C
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120
100
TMP-TO
80
OR
60
mišinyje, %

TMP-DO
40
TMP-MO
20
0
T

T
0T
5

IM

0T
G

pr FG
IM
00

50
43

po 0 B

FB
10

10
L

oz RM
0

e
ym

5
T
po n 2

43
n

im
po se

po e x
n
e

pa
oz

e
pa
m
ea
a

ym
p

m
l

Li
ov

zy
po

po
po
cl

zy
Li
N

Li

Li
Li

ov
Li
Li

Li

3.26 pav. Įvairių komercinių lipazių katalizuojamos OR esterinimo TMP, esant 60oC
temperatūrai, reakcijos metu po 24 (A), 48 (B) ir 72 val. (C) susidariusių produktų santykinis
kiekis reakcijų mišiniuose.

107
 Taigi akivaizdu, kad vandens pašalinimas iš reakcijos mišinio nekeitė ir anksčiau
gautos didžiausios TMP-TO išeigos - Lipozyme RM IM atveju susidarė tie patys 52 %
TMP-TO. Bevandenėje aplinkoje, kaip ir vandens turinčiuose reakcijų mišiniuose,
Lipopan FBG ir Lipopan 50BG atveju TMP-TO apskritai nesusidaro. Vandens
pašalinimas iš reakcijos mišinio turėjo neigiamą efektą tik vienam fermentui – Lipoclean
2000T - TMP-TO išeiga sumažėjo nuo 35 iki 8 %. Visais kitais tirtais atvejais stebimas
teigiamas bevandenės aplinkos poveikis: TMP-TO susidaro ir tada, kai reakcija
katalizuojama fermentų, kurių atveju vandens turinčioje sistemoje triesteriai nesusidarė
apskritai (Lipolase 100T, Lipozyme TL IM ir Lipex 100T); Novozym 435 ir Novozym
435 FG katalizuojamų reakcijų metu triesterių kiekis padidėja 5 ir 10 %, atitinkamai,
susidarant 45 ir 45 % TMP-TO.
Kadangi TMP-TO esteriai gali būti gauti ne tik esterinimo, bet ir transesterinimo
metu, analogiškomis sąlygomis buvo vykdomas būtent MO transesterinimas TMP.
Nustatyta, kad visų tirtų komercinių preparatų atveju gautų produktų išeigos neprilygo
OR esterinimo reakcijoms (3.27 pav.)
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120
100 MO
80 TMP-TO
60 OR
mišinyje, %

40 TMP-DO
20 TMP-MO
0
IM
G

im G
IM
0T

T
po pex G
po ase 35
Li ea n 0 0T

oz e R T
N zym 10 0

50
F
0B

B
4

zy 2 00

ym M
po TL

po 435
1

Li n 5
Li zym

e
n
e

pa
pa
m

pr
o

po
l

i
ov
po

L
cl
po
N

Li

Li
ov
Li

Li

3.27 pav. Įvairių komercinių lipazių katalizuojamos MO transesterinimo TMP, esant 60oC
temperatūrai, reakcijos metu po 96 val. susidariusių produktų santykinis kiekis reakcijų
mišiniuose.

Kadangi OR esterinimo TMP bevandenėje aplinkoje reakcijų metu buvo gautos

didžiausios TMP-TO išeigos, kai reakcijoms naudoti Lipozyme RM IM ir Novozym 435
fermentai, buvo detaliau įvertinta šių reakcijų eigos optimizavimo galimybė (3.28 pav.).

108
 Novozym 435 Lipozyme RM IM

Santykinis medžiagų kiekis

120

reakcijos mišinyje, %
100
80 TMP-TO
OR
60
TMP-DO
40 TMP-MO
20
0
3 24 48 72 96 3 24 48 72 96
Reakcijos trukmė, val.

3.28 pav. Novozym 435 ir Lipozyme RM IM lipazių katalizuojamo OR esterinimo TMP, esant
60oC temperatūrai, eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės.

Taigi priešingai nei vandenyje vykstančių reakcijų atveju, bevandenėje aplinkoje

reakcijos trukmės ilginimas po 72 val. didina reakcijų efektyvumą, nes po 96 val.
nustatytos didžiausios triesterių išeigos - 59 ir 62 % (bendra TMP tri-, di- ir monoesterių
išeiga sudaro 83 ir 85 %), kai reakcijoms naudoti Novozym 435 ir Lipozyme RM IM
fermentai, atitinkamai (3.28 pav.). Kadangi Novozym 435 lipazės atveju TMP-TO
susidarymas pastebėtas tik po 24 val., buvo ištirta pradinė reakcijų eiga 1 - 6 val.
Pasirodo, kad Novozym 435 lipazės katalizuojamos reakcijos metu nedidelis TMP-TO
kiekis susidaro po 6 valandų, o Lipozyme RM IM – jau po 2 val. (3.29 pav.).

Novozym 435 Lipozyme RM IM

Santykinis medžiagų kiekis

120
reakcijos mišinyje, %

100
80 TMP-TO
OR
60
TMP-DO
40 TMP-MO
20
0
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Reakcijos trukmė, val.

3.29 pav. Novozym 435 ir Lipozyme RM IM lipazių katalizuojamo OR esterinimo TMP, esant
60oC temperatūrai, eigos priklausomybė nuo reakcijos trukmės.

Abiejų fermentų katalizuojamo OR esterinimo TMP eiga reakcijos pradžioje

nevienoda (3.29 pav.), tačiau po 96 val. jų efektyvumas tampa praktiškai identiškas (3.28
pav.). Žinoma, kad Lipozyme RM IM yra 1,3-savita, o Novozym 435 – nesavita lipazė,

109
todėl, siekiant gauti didesnes TMP-TO išeigas, analogiškoms reakcijoms buvo pasirinkti
abiejų fermentų mišiniai bei tiriama jų kiekio įtaka reakcijos produktyvumui (3.30 pav.).

Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120

100

80 TMP-TO

mišinyje, %
OR
60
TMP-DO
40 TMP-MO

20

0
I II III IV V VI VII

3.30 pav. Novozym 435 (I) ir Lipozyme RM IM (VII) lipazių bei jų mišinių (II - VI)
katalizuojamo OR esterinimo TMP, esant 60oC temperatūrai, metu po 9 val. susidariusių
produktų santykinis kiekis reakcijų mišiniuose. Novozym 435 ir Lipozyme RM IM santykis
mišiniuose: II – 4:1; III – 3:2; IV – 1:1; V – 2:3; VI – 1:4.

Fermentų mišinio naudojimas nepasiteisino: didinant Lipozyme RM IM lipazės

dalį mišinyje, TMP-TO kiekis auga, bet didžiausia išeiga išlieka, kai naudojamas grynas
Lipozyme RM IM fermentas (3.30 pav., VII stulpelis).

Skyriaus apibendrinimas:
Palyginus Lipoprime 50T katalizuojamų OR esterinimo bei MO transesterinimo
trimetilolpropanu reakcijas, nustatyta, kad OR esterinimas yra efektyvesnis TMP-TO
gavimo būdas nei MO transesterinimas. Be to, abiejų tirtų reakcijų produktyvumo
atžvilgiu vanduo yra tinkamesnis tirpiklis nei tret-butanolis. Įvertinus kai kurių reakcijų
sąlygų įtaką proceso efektyvumui, nustatyta, kad reakcija efektyviau vyksta, kai
reaguojančių medžiagų (TMP ir OR ar MO) santykis yra mažesnis - 1:3,5, o temperatūra
aukščiausia iš visų tirtų – 60oC.
Didžiausia gauta TMP-TO esterių išeiga siekia 62 %, o bendra TMP tri-, di- ir
monoesterių išeiga sudaro 83 bei 85 % Lipoprime 50T lipazės katalizuojamos reakcijos
metu po 72 val. bei Lipozyme RM IM – po 96 val., atitinkamai. Nors Lipozyme RM IM
katalizuojama reakcija yra ilgiau trunkantis procesas, tačiau tik jis potencialiai gali būti
taikomas didelio masto TMP-TO gamybai, nes vyksta bevandenėje aplinkoje, o fermento
kiekis sudaro tik 15 % (w/w), kai tuo tarpu Lipoprime 50T - net 40 % (w/w).
Kadangi analogiškos literatūroje aprašytos reakcijos paprastai vykdomos
sumažinto slėgio (2 – 16 kPa) sąlygomis, naudojant labai didelius fermento kiekius (40

110
% (w/w)), jos negali būti pritaikytos didelio masto gamybai ne tik dėl sudėtingos įrangos,
bet ir dėl labai didelių ekonominių sąnaudų. Tuo tarpu mūsų pakankamai palankiomis
sąlygomis gautos apie 62 % siekiančios TMP-TO išeigos ir 83 % bendra TMP tri-, di- ir
monoesterių išeiga, nenaudojant jokios sudėtingos įrangos bei sumažinus reikalingus
fermento kiekius, leidžia daryti išvadas, kad ateityje procesas gali būti dar labiau
optimizuotas ir pritaikytas pramoninei biotepalų gamybai.

3.3 Įvairių biotechnologijai svarbių esterių sintezė

Kaip minėta, lipazės yra labai svarbi fermentų grupė, turinti didžiules pritaikymo
galimybes maisto, detergentų, farmacijos, tekstilės, kosmetikos ir kitose pramonės srityse
ir didžiąją jų taikymo biotechnologijoje dalį sudaro įvairių vertingų esterių sintezė. Šie
junginiai gali būti gaminami ir naudojant cheminius katalizatorius, bet tokių reakcijų
metu neretai susidaro šalutiniai nepageidaujami produktai, o lipazių katalizuojamų
reakcijų pagalba gaunami gryni produktai, kurie gali būti traktuojami kaip natūralūs, kas
yra ypatingai svarbu sintetinant įvairius maisto priedus [227]. Be to, šie fermentai veikia
esant švelnioms reakcijų sąlygoms (tai sumažina vykdomų procesų ekonomines sąnaudas
bei reagentų ar produktų degradacijos galimybę), yra stabilūs daugelyje organinių
tirpiklių, pasižymi ypatingai plačiu substratiniu savitumu bei regio- ir / ar
stereoatrankumu, todėl, priešingai nei cheminės katalizės metu, čia nesusidaro
nepageidaujami šalutiniai produktai, nereikia papildomų priemonių reakcijos metu
susidariusiems junginiams atskirti [226].

3.3.1 Skirtingų aliejų transesterinimas β-citroneloliu

Terpenų esteriai - RR junginiai, pasižymintys įvairiomis skonio ir kvapo

savybėmis, labai plačiai naudojami maisto, gėrimų, farmacijos ir kosmetikos pramonėse.
Nustatyta, kad kai kuriems tokio tipo esteriams būdingas ir biologinis aktyvumas -
antioksidacinės ir/ar antibakterinės savybės [239].
Kadangi darbų metu buvo siekiama įvertinti lipazių gebą katalizuoti įvairius
biotechnologijai svarbius junginius, buvo atlikta naujų potencialių lipazių substratų
paieška. Atranka vykdyta, pasirinkus standartinę mūsų daugiausiai tirtą RA
transesterinimo reakciją kaip acilakceptorius naudojant įvairius iki šiol mūsų netirtus di-

111
ir trihidroksilius aromatinius alkoholius (buvo siekiama įvertinti lipazių savitumą šių
junginių atžvilgiu, mat lipolizinių fermentų substratais gali būti ne tik alifatiniai, bet ir
alicikliniai, bicikliniai ir aromatiniai junginiai [50, 183, 184]) bei terpenolius (pasirinkti
dėl anksčiau minėtų terpenų esterių savybių). Tyrimams naudotų alkoholių struktūrinės
formulės pavaizduotos 3.31 paveiksle. Šiems eksperimentams pasirinkti du jau anksčiau
mūsų naudoti komerciniai lipazių preparatai – Lipolase 100L ir Lipex 100L.
Aliejų transesterinimo reakcijoms tinkamų acilakceptorių - potencialių lipazių
substratų - atrankos chromatografinis vaizdas pateiktas 3.31 paveiksle. Kadangi abiejų
tirtų fermentų katalizuojamos reakcijos vyko praktiškai identiškai, 3.31 pav. pateiktas tik
vieno fermento - Lipolase 100L - katalizuojamų reakcijų chromatografinis vaizdas.

Pirogalolis
K 1 2 3 4 5 6 7

β-Citronelolis Linalolis

3.31 pav. Lipolase 100L lipazės katalizuojamos RA transesterinimo įvairiais alkoholiais (1 - 7)

reakcijos chromatografinis vaizdas bei reakcijoms naudotų alkoholių struktūrinės formulės.
Reakcijos sąlygos: 30oC, 24 val., tirpiklis - n-heksanas.

Paaiškėjo, kad tirtomis sąlygomis vyksta tik RA transesterinimo dviem

terpenoliais - β-citroneloliu bei geranioliu - reakcija (3.31 pav. 5 ir 6 takeliai). Linalolio
atveju esterių sintezė nevyko, nes tretiniai alkoholiai paprastai yra prasti lipazių
substratai (3.31 pav. 7 takelis). Rezorcinolio, katecholio bei pirogalolio atveju ne tik
nevyko sintezės procesas, bet ir buvo slopinama aliejaus hidrolizė (3.31 pav. 1, 3, 4
takeliai), kuri vyko kai reakcijoms buvo naudoti hidrochinonas bei linalolis (3.31 pav. 2
ir 7 takeliai). Kadangi abiejų terpenolių atveju reakcija vyko panašiai, tolimesniems
tyrimams buvo pasirinktas tik vienas jų – β-citronelolis.

112
 Pirmiausia buvo palygintas Lipolase 100L ir Lipex 100L lipazių katalizuojamų
vienuolikos skirtingų aliejų transesterinimo β-citroneloliu reakcijų tret-butanolyje bei n-
heksane efektyvumas (3.32 pav.). Be anksčiau naudotų aštuonių (3.1 lentelė) buvo
pasirinkti dar trys – kokosų (KA), vynuogių sėklų (VSA) bei dagių (DA, Carthamus
Tinctorius) – aliejai (3.3 lentelė).

3.3 lentelė. Riebalų rūgščių kiekis (%) tirtuose aliejuose [452]

Riebalų Kaprilo Kaprino Lauro Miristo Palmitino Stearino Oleino Linolo Linoleno
rūgštys C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
Aliejai
Kokosų 7,0 5,4 48,9 20,2 8,4 2,5 6,2 1,4 -
Dagių - - - 0,3 11,9 2,3 29,2 55,9 0,4
Vynuogių - - - - 7,2 4,8 19,4 68,1 0,1
sėklų

A
30
Santykinis esterių kiekis reakcijos

25

20
mišinyje, %

Lipolase 100L, tret-butanolis

Lipolase 100L, n-heksanas
15
Lipex 100L, tret-butanolis
10 Lipex 100L, n-heksanas

0
RA JA SA AA RiA KS LSA RLA KA VSA DA

B
80
Santykinis esterių kiekis reakcijos

70

60
Lipolase 100L, tret-butanolis
mišinyje, %

50
Lipolase 100L, n-heksanas
40
Lipex 100L, tret-butanolis
30 Lipex 100L, n-heksanas
20

10
0
RA JA SA AA RiA KS LSA RLA KA VSA DA

3.32 pav. Lipolase 100L ir Lipex 100L lipazių katalizuojamo įvairių aliejų transesterinimo β-
citroneloliu n-heksane bei tret-butanolyje metu po 3 (A) ir 24 val. (B) susidariusių esterių
santykinis kiekis reakcijų mišiniuose.

113
 Lipex 100L katalizuojama reakcija tret-butanolyje vyko ypatingai neefektyviai,
ir, nors reakcijos pradžioje po 3 val. Lipolase 100L atveju reakcija vyko gana
produktyviai abiejuose tirpikliuose, tačiau jau po 24 val. nustatytas smarkus susidariusių
esterių kiekio išaugimas n-heksane, palyginus su atitinkamomis reakcijomis tret-
butanolyje. Iš visų tirtų aliejų prasčiausiai transesterintas RiA, o efektyviausiai – KA
(Lipolase 100L katalizuojamos reakcijos n-heksane metu po 24 val. susidariusių esterių
išeiga siekia 72 %, o Lipex 100L – 46 %). Todėl KA ir buvo pasirinktas tolimesniems
tyrimams - proceso sąlygų ir parametrų optimizavimui.
KA iš kitų aliejų išsiskiria tuo, kad daugiau nei 90 % jo sudėtyje esančių RR yra
sočiosios, iš kurių apie 49 % sudaro lauro rūgštis (C12:0), kuriai, kaip žinoma, yra
būdingos antivirusinės bei antibakterinės savybės (3.3 lentelė). Kakavos svieste taip pat
daug sočių RR, tačiau jų daugumą sudaro ilgesnės anglies grandinės RR - palmitino
(C16:0) bei stearino (C18:0) (3.1 lentelė). Tad galima teigti, kad tiriami fermentai yra
labiau saviti sočioms trumpesnės anglies grandinės RR. Kita vertus, yra nustatyta, kad
KA tirpumas alkoholiuose yra didesnis, palyginus su kitais įprastais aliejais ar riebalais.
Todėl negalima atmesti prielaidos, kad ne tik lipazių savitumas, bet ir reaguojančių
medžiagų tirpumo skirtumai gali sąlygoti tokį skirtingą reakcijos produktyvumą.
Kaip žinia, lipazių savitumas pasireiškia ne tik RR, bet ir naudojamų alkoholių
atžvilgiu, ir ši savybė, priklausomai nuo reakcijų sąlygų, gali kisti. Todėl buvo palyginta
Lipolase 100L lipazės katalizuojamo KA transesterinimo β-citroneloliu eigos
priklausomybė nuo reakcijos trukmės dviejuose tirtuose tirpikliuose – n-heksane bei tret-
butanolyje. Tyrimo rezultatai pateikti 3.33 paveiksle.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

3.33 pav. Lipolase 100L lipazės katalizuojamo KA transesterinimo β-citroneloliu n-heksane (4 -

6) ir tret-butanolyje (7 - 9) eigos priklausomybės nuo reakcijos trukmės chromatografinis
vaizdas. 4 – po 1 val.; 5 – po 3 val.; 6 – po 24 val.; 7 – po 1 val.; 8 – po 3 val.; 9 – po 24 val.
Kontrolės: 1 – KA; 2 – β-citronelolis; 3 – KA ir β-citronelolio mišinys.

114
 Kaip ir anksčiau vykdytų įvairių reakcijų metu, taip ir šiuo atveju tret-butanolyje
vyksta tik efektyvi aliejaus hidrolizė, o susidariusių esterių kiekis – minimalus (3.33 pav.
7 - 9 takeliai). Nors n-heksane pradinis aliejaus hidrolizės procesas yra lėtesnis, tačiau čia
po 24 val. susidaro gerokai didesnis esterių kiekis, siekiantis 72 % (3.33 pav. 6 takelis),
kai tuo tarpu tret-butanolyje jis sudaro tik apie 19 % (3.33 pav. 9 takelis).
Kadangi pradiniai tyrimai buvo vykdomi tik su dviem komerciniais fermentais –
Lipolase 100L ir Lipex 100L - buvo įvertintas ir kitų anksčiau tirtų lipolizinių fermentų –
Lipex 100T, Lipolase 100T, Lipoclean 2000T, Lipopan 50BG, Lipoprime 50T,
Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM, Novozym 435, Lecitase Ultra, Lipozyme TL100L,
Palatase 20000L, Resinase A2X - efektyvumas, katalizuojant KA transesterinimo β-
citroneloliu n-heksane reakciją, bei atrinkti aktyviausi (3.34 pav.).
Santykinis esterių kiekis reakcijos mišinyje, %

80
70
60
50
3 val.
40
24 val.
30
20
10
0
oz LIM
m IM

as 35

L
la 00T

G
T
0T

po lase L

X
m 0T

0L
pr BG

L
ltr

00
0
ea 00

00

A2
po 0B

RM

10
po 200

es 000
U
T
po n F
1

at TL1
1

1
m
5

po me

e
e

e
x

Li ex
po se

y
e

as
2
n
pa
pe

n
pa

e
zy

in
cit
Li

Li
zy

m
ov

as
po

po
po
cl

Le

zy
Li

N
Li

Li

Li

R
Li

al
Li
Li

P
Li

3.34 pav. Įvairių lipolizinių fermentų katalizuojamo KA transesterinimo β-citroneloliu n-heksane

metu susidariusių esterių santykinis kiekis reakcijų mišiniuose.

Mažiausia esterių išeiga, nesiekianti nė 30 %, susidarė, kai reakciją katalizavo

Lipopan FBG. Lipolase 100L kaip ir Lipozyme TL100L bei Resinase A2X, pasirodė
esantys efektyviausi fermentai, katalizuojantys tiriamą β-citronelolio esterių sintezės
reakciją: po 24 val. susidariusių esterių kiekis viršija 70 %. Lyginant fermentų aktyvumą
reakcijos pradžioje (po 3 val.), nustatyta, kad didžiausios esterių išeigos, siekiančios 57 ir
62 %, susidaro, naudojant Lipozyme RM IM bei Lipozyme TL IM lipazes, atitinkamai.
Šis kiekis reakcijos laikotarpiu tarp 3 ir 24 val. kinta mažai ir nepasiekia didžiausių
nustatytų esterių kiekių, gautų, naudojant tris kitus anksčiau minėtus fermentus. Todėl,

115
priklausomai nuo tikslo bei esamų sąlygų, KA transesterinimo proceso trukmę ir eigą
galima keisti, pasirenkant atitinkamą fermentinį preparatą.
Kadangi kiti nauji naudoti fermentiniai preparatai neprilygo arba pasižymėjo
panašiu aktyvumu kaip ir anksčiau tirta lipazė Lipolase 100L, ji ir pasirinkta
tolimesniems eksperimentams. Atsižvelgus į tai, kad tirtų reakcijų eiga tret-butanolyje
bei n-heksane taip drastiškai skyrėsi (3.33 pav.), nutarta įvertinti ir kitų organinių
tirpiklių įtaką KA transesterinimo β-citroneloliu efektyvumui (3.35 pav.). Naudotų
tirpiklių sąrašas pateiktas 3.4 lentelėje.

3.4 lentelė. Tyrimams naudoti organiniai tirpikliai bei jų logP vertės

Nr. Pavadinimas LogP Nr. Pavadinimas LogP
1 n-Oktanas +4,78 11 tret-Butilmetilo eteris +0,94
2 Izooktanas +4,37 12 tret-Butanolis +0,83
3 n-Heptanas +4,00 13 Piridinas +0,62
4 Cikloheksanas +3,80 14 2-Butanonas +0,61
5 n-Heksanas +3,50 15 Tetrahidrofuranas +0,50
6 n-Pentanas +3,25 16 Acetonas -0,26
7 Toluenas +2,50 17 Acetonitrilas -0,36
8 Benzenas +2,00 18 Dimetilformamidas -0,83
9 Diizopropilo eteris +2,00 19 Dioksanas -1,10
10 tret-Amilo alkoholis +1,30 20 Dimetilsulfoksidas -1,30

Kaip žinoma, organinių tirpiklių naudojimas gali išspręsti prasto reaguojančių

medžiagų tirpumo, žemo lipazių savitumo ir sudėtingo susidariusių produktų gryninimo
problemas, būdingas vandeninėje aplinkoje vykstančioms reakcijoms [67]. Be to,
nustatyta, kad nepoliniai tirpikliai daugeliu atvejų yra tinkamesni už polinius, mat
pastarieji, kitaip nei nepoliniai tirpikliai, patraukia vandenį iš fermento aktyvaus centro,
taip sumažindami jo katalizinį aktyvumą [68]. Įprastai lipazių katalizuojamoms esterių
sintezės reakcijoms naudojami įvairūs nepoliniai tirpikliai [69].
Yra duomenų, kad >3 logP (kur P - tirpiklio pasiskirstymo tarp 1-oktanolio ir
vandens koeficientas) vertės tirpikliai paprastai tinkamiausi aliejų ir riebalų įvairių
modifikacijų reakcijoms, o mažesnės logP vertės tirpikliai naudojami, kai substratai labai

116
skiriasi poliškumu. Kadangi idealiu atveju abu substratai turi būti ištirpę reakcijos
mišinyje bent jau dalinai, paprastai pasirenkama vidutinio poliškumo terpė.

Santykinis esterių kiekis reakcijos mišinyje, %

80

70

60

50
3 val.
40
24 val.
30

20

10

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

3.35 pav. Įvairių organinių tirpiklių įtaka Lipolase 100L lipazės katalizuojamo KA
transesterinimo β-citroneloliu efektyvumui. Skaičiai atitinka 3.4 lentelėje nurodytus tirpiklius.

Taigi paaiškėjo, kad tirtomis sąlygomis reakcija apskritai nevyko diizopropilo

eteryje, piridine, tetrahidrofurane, dimetilformamide, dioksane bei dimetilsulfokside.
Nors ir būtų galima daryti išvadą, kad transesterinimas nevyksta mažiausios logP vertės
tirpikliuose (dimetilformamide, dioksane bei dimetilsulfokside) (3.35 pav. 18 - 20
stulpeliai), tačiau tai nepaaiškina, kodėl reakcija nevyksta diizopropilo eteryje (9
stulpelis), kurio logP yra +2,00 ar piridine (+0,62; 13 stulpelis) bei tetrahidrofurane
(+0,50; 15 stulpelis), kai tuo tarpu, pavyzdžiui, acetone (-0,26; 16 stulpelis) bei
acetonitrile (-0,36; 17 stulpelis) – vyksta. Tad šiuo atveju ryškios tiesioginės
priklausomybės tarp reakcijos efektyvumo bei logP vertės nenustatyta, kas neretai
nurodoma ir įvairiuose literatūriniuose šaltiniuose, kai pažymima, kad svarbios ir kitos
tirpiklių charakteristikos, pavyzdžiui, dielektrinė konstanta ir pan. [68].
Transesterinimo reakcija produktyviausiai vyko hidrofobiniuose tirpikliuose,
kurių logP vertė didesnė arba lygi 3,50 - n-oktane, izooktane, n-heptane, cikloheksane ir
n-heksane (3.35 pav. 1 - 5 stulpeliai) – čia susidariusių esterių išeigos siekė 72 %.
Palyginus su procesais, vykstančiais kituose tirpikliuose, galima teigti, kad reakcijos
neblogai vyko ir kiek mažesnės logP vertės tirpikliuose: benzene (+2,00), toluene (+2,50)
bei n-pentane (+3,25) (3.35 pav. 6 - 8 stulpeliai). Gauti rezultatai atitinka literatūroje
rastus duomenis, kur teigiama, kad neretai didesnis fermentų aktyvumas pastebimas, kai

117
logP vertė yra didesnė už 2. Be to, labiau hidrofobiniuose tirpikliuose stebimas ir
didesnis fermentų stabilumas [421]. Minėtuose organiniuose tirpikliuose buvo vykdoma
ir kita anksčiau tirta Lipolase 100L katalizuojama reakcija – RA transesterinimas
metilacetatu (3.36 pav.). Tad buvo palygintas fermento aktyvumas, katalizuojant
skirtingas reakcijas tuose pačiuose 20 organinių tirpiklių (3.4 lentelė).

25
Santykinis esterių kiekis reakcijos

20
mišinyje, %

15

10

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

3.36 pav. Tirpiklių įtaka Lipolase 100L lipazės katalizuojamo RA transesterinimo

metilacetatu efektyvumui. Reakcijos sąlygos: 35oC temperatūra, RA ir metilacetato
molinis santykis 1:4, 48 val.

Šių palyginamųjų tyrimų metu nustatyta, kad abi reakcijos nevyko tuose pačiuose
anksčiau minėtuose penkiuose organiniuose tirpikliuose: diizopropilo eteryje, piridine,
tetrahidrofurane, dimetilformamide, dioksane bei dimetilsulfokside. Tačiau įdomu tai,
kad skyrėsi tirpikliai, kuriuose reakcija vyksta efektyviausiai. Kaip minėta, KA
transesterinimas β-citroneloliu efektyviausiai vyksta didžiausios logP vertės tirpikliuose,
tuo tarpu RA transesterinimo metilacetatu reakcija produktyviausia tret-butilmetilo
eteryje, kurio logP siekia tik +0,94. Tai galėtų būti paaiškinta skirtingu acilakceptorių
hidrofobiškumu: β-citronelolis yra hidrofobiškesnis už metilacetatą, todėl, siekiant
užtikrinti efektyvų visų reaguojančių medžiagų tirpumą reakcijos mišinyje, terpenolio
atveju, matyt, reikalingi hidrofobiškesni tirpikliai.

3.3.2 Vieną ar daugiau hidroksi- ir/ar karboksigrupių turinčių rūgščių esterinimas

Tiriant lipazių savitumą, dažnai kaip substratai naudojami skirtingą

hidroksigrupių skaičių turintys alkoholiai (dioliai, trioliai), tačiau duomenų apie lipazių
katalizuojamas vieną, dvi ir daugiau karboksigrupių turinčių rūgščių esterinimo reakcijas
literatūroje aptinkama ypatingai mažai ir dažniausiai tai yra patentuoti tyrimai. Tad,

118
pasirinkus penkias skirtingas karboksirūgštis - oksalo, glutaro, citrinų, ftalo bei galo
(3.37 pav.), – buvo siekiama įvertinti lipazių gebą katalizuoti šių rūgščių esterinimo
dviem skirtingais alkoholiais – β-citroneloliu bei oleilo alkoholiu - reakciją. Šių
eksperimentų metu naudotas vienas labiausiai tyrinėjamų lipazių preparatų - Novozym
435 – pasižymintis ypatingai plačiu substratiniu savitumu bei geba katalizuoti ir įvairias,
paprastai lipazėms nebūdingas, reakcijas.

3.37 pav. Tyrimams naudotų karboksirūgščių struktūrinės formulės: A – oksalo; B – glutaro; C –

citrinų; D – ftalo; E – galo.

Pirmiausia buvo ištirta Novozym 435 lipazės geba katalizuoti minėtų rūgščių
esterinimo β-citroneloliu n-heksane reakciją. Duomenys pateikti 3.38 paveiksle.

N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3.38 pav. Novozym 435 lipazės katalizuojamo karboksirūgščių (1 – oksalo, 3 – glutaro, 5 – ftalo,
7 – galo, 9 – citrinų) esterinimo β-citroneloliu n-heksane, esant 40oC temperatūrai, metu po 24
val. susidariusių produktų chromatografinis vaizdas. N - fermentas+tirpiklis. Kontrolės: rūgštys
be fermento: 2 – oksalo; 4 – glutaro; 6 – ftalo; 8 – galo; 10 – citrinų.

Paaiškėjo, kad tirtomis sąlygomis vyksta tik oksalo bei glutaro rūgščių
esterinimas (3.38 pav. 1 ir 3 takeliai), kitais atvejais, kaip tikėtina, reakcija nevyko dėl
naudotų karboksirūgščių struktūrų sterinių efektų, mat lipazių savitumą tam tikroms
rūgštims ar alkoholiams paprastai nulemia du pagrindiniai veiksniai: steriniai efektai ir
hidrofobinės sąveikos [175, 176] (3.37 (C – E) pav.), tačiau įdomu tai, kad oksalo
rūgšties atveju produktas susidaro ir reakcijos mišinyje be fermento (3.38 pav. 2 takelis).
Nors literatūroje ir aptinkama duomenų, kad kai kuriais atvejais spontaninė oksalo

119
rūgšties esterinimo reakcija gali vykti, visgi mūsų tirtos sąlygos yra per švelnios bet
kokiems literatūroje aprašytiems savaiminiams virsmams, todėl būtinas šio atvejo
detalesnis ištyrimas kitais metodais.
Literatūroje yra duomenų, kad tam tikrais atvejais iš Novozym 435 preparato gali
atsiplauti pats fermentas ir/ar įvairūs priedai, kurie kaip substratai gali dalyvauti įvairių
nepageidaujamų šalutinių reakcijų metu [131]. Todėl, norint įsitikinti, kad minėtų
junginių susidarymas nėra sąlygotas iš Novozym 435 preparato atsiplovusių priedų
buvimo, vykdytos oksalo rūgšties esterinimo ne tik β-citroneloliu, bet ir oleilo alkoholiu
reakcijos, naudojant du fermentus – Novozym 435 bei Lipex 100T. Be to, žinant, kad
Novozym 435 lipazė efektyvesnė bevandenėje aplinkoje, šį kartą vandens pašalinimui iš
reakcijos mišinio naudoti ir molekuliniai sietai. Tyrimo rezultatai pateikti 3.39 paveiksle.

LE C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

3.39 pav. Novozym 435 ir Lipex 100T katalizuojamo oksalo rūgšties esterinimo β-citroneloliu (1
- 6) bei oleilo alkoholiu (7 - 12) n-heksane, esant 40oC temperatūrai, metu po 24 val. susidariusių
produktų chromatografinis vaizdas. 1,7 – Novozym 435 ir molekuliniai sietai; 2,8 – Novozym
435; 3,9 – Lipex 100T ir molekuliniai sietai; 4,10 – Lipex 100T; 5,11 – molekuliniai sietai; 6,12
– be fermento. Kontrolės: LE – linalolio esteris, C – β-citronelolis.

Reakcija vyko visais atvejais. Įdomu, kad produktas be fermento susidaro ir β-

citronelolio, ir oleilo alkoholio atveju (3.39 pav. 6 ir 12 takeliai). Kadangi iki šiol naudoti
tik imobilizuoti komerciniai lipazių preparatai, tyrimai pakartoti, vykdant oksalo rūgšties
esterinimo β-citroneloliu bei oleilo alkoholiu reakcijas, katalizuojamas skysto komercinio
lipolizinio fermento – Lipozyme TL100L (3.40 pav.).
Produktas 1

X
Produktas 2
Produktas 3
MO OA 1 2 3 4

3.40 pav. Novozym 435 (1) ir Lipozyme TL100L (2) katalizuojamos oksalo rūgšties esterinimo
oleilo alkoholiu bei Lipozyme TL100L katalizuojamos oksalo rūgšties esterinimo β-citroneloliu
(4) n-heksane, esant 40oC temperatūrai, reakcijos metu susidariusių produktų chromatografinis
vaizdas. Kontrolės: MO – metiloleatas; OA – oleilo alkoholis. 3 – reakcijos mišinys be fermento.

120
 Taigi paaiškėjo, kad oksalo rūgšties esterinimo oleilo alkoholiu reakcijos metu
skirtingomis sąlygomis susidaro trys produktai. Įdomu tai, kad oksalo rūgšties esteriai
gaunami be fermentų katalizės (3.40 pav. 3 takelis), nes nustatytas didžiausias produkto 1
kiekis (bet mažiausias produkto 3 kiekis), o abiejų fermentinių preparatų naudojimas
esterių išeigų nepadidina. Be to, tik skystos lipazės Lipozyme TL100L atveju stebimas
produkto 2 susidarymas (3.40 pav. 2 ir 4 takeliai). Savaiminio ir fermentinio oksalo
rūgšties esterinimo dviem tirtais alkoholiais skirtumas yra produktų 2, 3 ir X susidarymas.
Deja, esamomis sąlygomis jų identifikuoti nepavyko – tai bus atlikta ateityje Chemijos
fakulteto Organinės chemijos katedroje.
Kadangi, kaip minėta, skystos lipazės Lipozyme TL100L atveju stebimas
produkto 2 susidarymas (3.40 pav. 2 ir 4 takeliai) su oleilo alkoholiu, o naudojant β-
citronelolį, atsiranda dar vienas papildomas produktas X, kurio buvimas kitais tirtais
atvejais nenustatytas (3.40 pav. 4 takelis), buvo nutarta palyginti reakcijos eigos
ypatumus, naudojant ir kitą skystą fermentinį preparatą – Resinase A2X (3.41 pav.).

C 1 2 3 4 OA 5 6 7 8

3.41 pav. Resinase A2X katalizuojamos oksalo rūgšties esterinimo β-citroneloliu (1 - 4) bei oleilo
alkoholiu (5 - 8) n-heksane, esant 40oC temperatūrai, reakcijos metu susidarančių produktų
priklausomybės nuo laiko chromatografinis vaizdas. 1,5 – po 1 val.; 2,6 - po 3 val.; 3,7 - po 24
val.; 4,8 – po 48 val. Kontrolės: C - β-citronelolis.; OA – oleilo alkoholis.

Akivaizdu, kad Resinase A2X lipazės katalizuojamos esterinimo reakcijos eiga

yra kokybiškai panaši į anksčiau naudoto Lipozyme TL100L fermento atvejį, kai
esterinimo β-citroneloliu (3.41 pav. 2 - 4 takeliai) metu susidaro vienu produktu daugiau
nei reakcijos su oleilo alkoholiu metu (3.41 pav. 6 - 8 takeliai).
Taigi tirtų reakcijų metu gautų produktų nustatymui TLC metodu (pagal
medžiagos pasiskirstymo koeficientą – Rf) trūksta atskaitos taško – kontrolių, t.y.,
konkrečių grynų medžiagų - atitinkamų karboksirūgščių mono- ar diesterių-, su kuriomis
būtų galima palyginti susidariusių produktų išsidėstymą chromatogramose, tačiau tyrimų

121
metu mes jų neturėjome, kadangi, kaip paaiškėjo, įsigyti galima tik trumpagrandžių
esterių – etilo bei butilo, bet ne mūsų tirtų. Todėl VU Chemijos fakultete Organininės
chemijos katedroje buvo atlikta minėtų produktų cheminė analizė bei masių
spektrometrija. Tam tikslui Novozym 435 lipazės katalizuojamos glutaro rūgšties
esterinimo β-citroneloliu n-heksane, esant 40oC, reakcijos mišiniai buvo išfrakcionuoti
TLC metodu ant dviejų skirtingų chromatografinių plokštelių. Kadangi ir GC, ir HPLC
metodams trukdytų jodo pėdsakai, viena iš identiškai paruoštų chromatogramų buvo
ryškinta jodo garų kameroje, o kita – ne. Iš pastarosios, lyginant su dėmių padėtimis jodu
ryškintoje chromatogramoje (3.42 (A) pav.), buvo išskusti silikagelio sluoksniai su
atitinkamomis medžiagomis ir pateikti 1H BMR spektroskopinei analizei atlikti.

3.42 pav. Novozym 435 lipazės katalizuojamo glutaro rūgšties esterinimo β-citroneloliu n-
heksane, esant 40oC temperatūrai, chromatografinis vaizdas (A) bei chromatogramoje pažymėto
produkto - glutaro rūgšties ir β-citronelolio diesterio - struktūrinė formulė ir vandenilių cheminiai
poslinkiai 1H BMR spektre (CHF, doc. V. Masevičius) (B).

Gauti 3.42 (A) paveiksle pažymėtos medžiagos analizės duomenys patvirtino, kad
reakcijos metu susidarantis produktas yra glutaro rūgšties ir β-citronelolio diesteris
(struktūrinė formulė pateikta 3.42 (B) pav.). GC-MS analizės metu nustatyta, kad
junginys yra pakankamai grynas. Pagrindinės priemaišos yra: acto rūgštis (TLC eliucijos
sistemos sudedamoji dalis) bei alkanai (iš petrolio eterio). Atitinkamai buvo paruošti ir
kitų reakcijų metu susidarančių produktų mėginiai, tyrimai taip pat bus atlikti Chemijos
fakultete.

Skyriaus apibendrinimas:

Buvo atlikta naujų substratų (acilakceptorių), tinkamų Lipolase 100L ir Lipex

100L lipazių katalizuojamam RA transesterinimui, atranka. Tyrimams pasirinkti įvairūs

122
iki šiol mūsų netirti di- ir trihidroksiliai aromatiniai alkoholiai (rezorcinolis, katecholis,
pirogalolis, hidrochinonas) bei terpenoliai (β-citronelolis, geraniolis, linalolis). Nustatyta,
kad tirtomis sąlygomis vyksta tik RA transesterinimo dviem terpenoliais - β-citroneloliu
bei geranioliu – reakcijos.
Palyginus minėtų lipazių katalizuojamų vienuolikos skirtingų aliejų (RA, JA, SA,
AA, RiA, KS, LSA, RLA, KA, VSA, DA) transesterinimo β-citroneloliu reakcijų tret-
butanolyje bei n-heksane efektyvumą, paaiškėjo, kad daugeliu atvejų sintezė efektyvesnė
n-heksane, o iš visų tirtų aliejų produktyviausiai transesterinamas KA. Kadangi didžiąją
KA sudėtyje esančių RR dalį sudaro sočiosios RR, iš kurių apie 46 % - lauro rūgštis
(C12:0), galima daryti išvadą, kad tirti fermentai yra savitesni sočioms trumpesnės
anglies grandinės RR. Atlikus aktyviausių tiriamos KA transesterinimo β-citroneloliu
reakcijos atžvilgiu fermentų atranką, nustatyta, kad reakciją efektyviausiai katalizuoja
Lipolase 100L, Lipozyme TL100L bei Resinase A2X - po 24 val. susidariusių esterių
kiekis viršija 70 %.
Įvertinus kitų pasirinktų organinių tirpiklių įtaką Lipolase 100L katalizuojamo
KA transesterinimo β-citroneloliu efektyvumui, paaiškėjo, kad tirtomis sąlygomis
reakcija produktyviausiai vyko hidrofobiniuose tirpikliuose, kurių logP vertė didesnė
arba lygi 3,50 - n-oktane, izooktane, n-heptane, cikloheksane ir n-heksane – čia
susidariusių esterių išeigos siekė 72 %. Reakcija apskritai nevyko diizopropilo eteryje,
piridine, tetrahidrofurane, dimetilformamide, dioksane bei dimetilsulfokside.
Ištyrus pasirinktų komercinių lipolizinių fermentinių preparatų gebą katalizuoti
įvairių vieną ar daugiau karboksi ir/ar hidroksigrupių turinčių organinių rūgščių
esterinimo β-citroneloliu bei oleilo alkoholiu reakcijas, nustatyta, kad tirtomis sąlygomis
iš visų pasirinktų rūgščių (oksalo, glutaro, ftalo, galo, citrinų) reakcijos efektyviausiai
1
vyksta tik su glutaro ir oksalo rūgštimis. VU Chemijos fakultete H BMR
spektroskopijos ir GC-MS analizės metodais patvirtinta, kad Novozym 435 lipazės
katalizuojamos glutaro rūgšties esterinimo β-citroneloliu reakcijos metu susidaro glutaro
rūgšties β-citronelolio diesteris.
Įdomu tai, kad oksalo rūgšties esterinimo β-citroneloliu ir oleilo alkoholiu metu
gaunamas skirtingas produktų skaičius, kuris kinta ir naudojant skirtingus komercinius
lipolizinius fermentus. Gautų produktų nustatymas TLC metodu (pagal medžiagos

123
pasiskirstymo koeficientą – Rf) nebuvo galimas, nes trūko kontrolių (konkrečių grynų
medžiagų), su kuriomis būtų galima palyginti susidariusių produktų išsidėstymą
chromatogramose. Įsigyti, deja, galima tik trumpagrandžių esterių – etilo bei butilo, bet
ne mūsų tirtų, todėl VU Chemijos fakultete Organininės chemijos katedroje bus atlikta ir
kitų tiriamų reakcijų metu susidariusių produktų cheminė analizė bei masių
spektrometrija.

3.4 Lipazių tinkamumo riebalinių atliekų (pamuilių) utilizavimui

tyrimas

Lietuvos Mokslo, inovacijų ir technologijų agentūros (MITA) finansuojamos De

minimis pagalbos (inovacinio čekio), kurio gavėjas buvo AB “NAUJOJI RINGUVA”,
dėka atlikti tyrimai „Lipolizinių fermentų skatinamų riebalinių atliekų virsmų produktų
susidarymo iš pamuilių biotechnologinio panaudojimo perspektyvos“, kurių tikslas buvo
ištirti riebalinių gamybos atliekų – pamuilių – biotechnologinio utilizavimo ir gautų
produktų praktinio panaudojimo galimybes.
Įvairiose pramonės šakose susikaupiančių riebalinių atliekų utilizavimo ir/ar
praktinio panaudojimo problemos sprendimo būdai yra sudėtingi, todėl nėra išspręsti iki
šiol ir yra aktualūs ne tik Lietuvoje, bet ir visame pasaulyje. Muilo gamybos metu
susidariusios riebalinės atliekos (pamuilės) dažniausiai panaudojamos žemesnės kokybės
techninės paskirties muilui (taip vadinamam, ūkiniam) ir plovimo bei valymo
priemonėms (pavyzdžiui, šveitimo pastoms) gaminti.
Galimas ir kitoks šių atliekų panaudojimas – pamuilės gali būti potenciali
biodyzelino ar kitos paskirties RR esterių gamybos žaliava, transesterinant bei esterinant
jas atitinkamais alkoholiais. Kaip žinoma, svarbiausia priežastis, stabdanti biodyzelino
komercializacijos procesą, yra dideli gamybos kaštai, kurių 70 - 80 % sudaro žaliavos
(maistinių aliejų) kaina [252, 304]. Riebalinių atliekų naudojimas vietoj grynų aliejų
galėtų veiksmingai (60 - 90 %) sumažinti biodyzelino kainą bei dirbamos žemės plotus,
skirtus reikalingoms aliejingoms kultūroms auginti [254].
Riebalinės atliekos savo sudėtimi gana skiriasi nuo įprastai naudojamų šviežių
aliejų: joms būdingas gerokai didesnis vandens bei laisvų RR kiekis [331], todėl šiuo
atveju tradicinė cheminė katalizė negali būti taikoma [332, 333], ir tinkamiausi yra

124
fermentų katalizuojami procesai, nes lipazės gali esterinti visas atliekose esančias laisvas
RR [334]. Pavyzdžiui, palyginus komercinės Novozym 435 lipazės katalizuojamas
biodyzelino sintezės reakcijas, kai kaip žaliava buvo naudotas atliekų bei grynas aliejus,
nustatyta, kad, nors didesnis vandens kiekis atliekose ir sumažino reakcijos greitį, tačiau
jos pusiausvyrai įtakos neturėjo - galutinės produktų išeigos buvo panašios [335]. Tai
patvirtina lipazių pritaikymo galimybę, perdirbant riebalines atliekas [334].
Kita biodyzelino gamybos žaliava – dumbliai, mat kai kurios jų rūšys sukaupia
ypatingai daug lipidų [326], kurie savo sudėtimi yra analogiški iš įprastų augalinių
kultūrų (rapsų, saulėgrąžų, palmių ir kt.) gaunamiems aliejams [327, 328]. Tai -
mikroskopiniai autotrofiniai ir heterotrofiniai organizmai [321, 322], sparčiai
besidauginantys ir augantys tiek sintetinėse, tiek ir natūraliose terpėse - nuotekose [323].
Tad pamuilės galėtų būti panaudotos kaip dumblių auginimo terpė.

3.4.1 Pamuilių cheminės sudėties analizė

Tyrimų metu buvo siekiama įvertinti ne tik lipazių gebą katalizuoti negrynintose
pamuilėse esančių laisvų RR esterinimo bei TAG transesterinimo alkoholiais reakcijas,
bet ir dumblių potencialą utilizuoti susidariusias atliekas, panaudojant jas kaip augimo
terpę. Kadangi fermentų katalizuojamų procesų efektyvumui bei dumblių augimui labai
didelę įtaką turi reakcijos mišinio bei augimo terpės, atitinkamai, sudėtis, pirmiausia ir
buvo atlikta kokybinė ir kiekybinė pamuilių sudėties analizė. Pagrindinių cheminių
elementų sudėtis pamuilėse buvo nustatyta atominės absorbcinės spektrometrijos metodu
VU Chemijos fakultete (prof. S. Tautkus) (3.5 lentelė), o riebalinių komponentų analizė
dujinės chromatografijos metodu buvo atlikta Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ir
Veterinarijos akademijos Gyvulininkystės instituto chemijos laboratorijoje (dr. G.
Švirmickienė) (3.6 lentelė).

3.5 lentelė. Pamuilėse esančių pagrindinių cheminių elementų kiekis

Metalas Kiekis, g/kg drėgnos masės
Kalcis 3,41
Magnis 0,29
Natris 1,33
Kalis 0,017
Geležis 2,3
Švinas 0,0019

125
3.6 lentelė. Pamuilėse esančių riebalų rūgščių kiekis
Riebalų rūgštis Santykinis kiekis, % nuo viso RR kiekio
Tetradekano (miristo, C14:0) 5,10
Heksadekano (palmitino (C16:0) 31,97
9-Heksadeceno (palmitoleino, C16:1) 2,87
Oktadekano (stearino, C18:0) 17,01
cis-9-Oktadeceno (oleino, C18:1) 38,48
11- Oktadeceno (vakeno, C18:1) 2,36
trans- 9,12-Oktadekadieno (linolo, C18:2) 2,21

Atlikus cheminę sudėties analizę, nustatyta, kad pamuilėse daugiausiai yra kalcio,
geležies, natrio bei magnio, nustatytas nedidelis kiekis kalio bei aptikti švino pėdsakai
(3.5 lentelė). Įvertinus pamuilėse esančių RR kiekius, nustatyta, kad dominuoja
ilgagrandės RR (C16 - C18), o sočiosios sudaro 54 % viso pamuilėse esančių RR kiekio
(3.6 lentelė). Pamuilėse esančių riebalinių komponentų sudėtis įvertinta ir TLC metodu -
n-heksanu ekstrahuotų pamuilių mišinių chromatografinis vaizdas pateiktas 3.43 pav.

3.43 pav. Pamuilių mišinio, ekstrahuoto n-heksanu, viršutinės (1) ir apatinės (2) fazių
chromatografinis vaizdas. TO, OR – kontrolės.

Taigi paaiškėjo, kad didžiąją pamuilėse esančių riebalinių komponentų dalį

sudaro laisvos RR, kiek mažiau randama TAG, be to, aptinkama ir DAG bei MAG
pėdsakų. Vadinasi, lipazių katalizuojami procesai turės apimti ne tik laisvų RR
esterinimo, bet ir TAG, DAG bei MAG transesterinimo reakcijas. Be to, nors pamuilės n-
heksane išsisluoksniuoja į skaidrią viršutinę ir drumstą apatinę fazes, akivaizdu, kad jų
sudėtis yra praktiškai identiška (3.43 pav. 1 - 2 takeliai), tad lipzių katalizuojamoms
reakcijoms turi būti naudojama ne viena konkreti fazė, bet jų mišinys.

3.4.2 Pamuilių, kaip potencialios biodyzelino žaliavos, transesterinant bei esterinant

jas atitinkamais alkoholiais, panaudojimo tyrimas

Lipazių katalizuojamų pamuilių esterinimo bei transesterinimo alkoholiais

reakcijų tyrimų pradžioje buvo įvertintas šių atliekų tirpumas dešimtyje pasirinktų

126
organinių tirpiklių (tūrio santykiu 1:1), kurie įvairių riebalų esterinimo bei
transesterinimo reakcijų metu paprastai yra lipazių substratai (acilakceptoriai): metanolis,
etanolis, 1-butanolis, 1-pentanolis, 1-heksanolis, izopropanolis, izobutanolis, izoamilo
alkoholis, metil- bei butilacetatas. Pamuilių ir šių tirpiklių mišinių fotovaizdas pateiktas
3.44 paveiksle.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3.44 pav. Pamuilių ir įvairių organinių tirpiklių mišinių (tūrio santykiu 1:1) fotovaizdas: 1 –
metanolis; 2 – etanolis; 3 – 1-butanolis; 4 - 1-pentanolis; 5 - 1-heksanolis; 6 – izopropanolis; 7 –
izobutanolis; 8 – izoamilo alkoholis; 9 – metilacetatas; 10 – butilacetatas.

Kaip matome iš 3.44 paveiksle pateikto fotovaizdo, ilgesnės anglies grandinės

(C4 - C6) alkoholių bei acetato atveju mišinys išsisluoksniuoja į dvi fazes: skaidrią
viršutinę bei drumstą apatinę (3.44 pav. 3 – 5, 7, 8 ir 10 mėginiai), o pamuilės su trumpos
grandinės (C1 - C3) alhoholiais bei acetatu sudaro drumstą mišinį (3.44 pav. 1, 2, 6 ir 9
mėginiai). Tai gali būti paaiškinta skirtingu mišinius sudarančių komponentų
hidrofiliškumu. Kaip žinoma, alkoholio molekulėje esanti polinė hidroksigrupė suteikia
junginiui hidrofiliškumo, o nepolinė anglies grandinė - hidrofobiškumo. Ilgėjant anglies
grandinei, molekulė tampa vis labiau hidrofobine, todėl tik tokie trumpagrandžiai
alkoholiai kaip metanolis, etanolis, 1-propanolis bei jo izomeras 2-propanolis
(izopropanolis) yra tirpūs vandenyje (taip pat tirpus ir tret-butanolis - vienintelis iš visų
keturis anglies atomus turinčių izomerų, tačiau jis kaip acilakceptorius nenaudotas, nes
tretiniai alkoholiai ir jų esteriai yra prasti lipazių substratai [180, 181]). Ilgesnės anglies
grandinės junginiai su vandeniu nesimaišo, todėl pastarųjų atveju ir susidaro dvi fazės:
vandeninė (gautos pamuilės buvo tiršta gelsvos spalvos vandeninga masė) ir hidrofobinė
- naudotas tirpiklis.
Taigi buvo tirta šių tirpiklių įtaka komercinių lipolizinių fermentų katalizuojamų
pamuilėse esančių riebalinių komponentų virsmų efektyvumui, kai reakcijos mišinyje jie
buvo naudoti kaip fermentų substratai (acilakceptoriai). Reakcijos mišinį sudarė pamuilių
mišinys, tirpiklis (vanduo, tret-butanolis ar n-heksanas) bei fermentas - imobilizuotas

127
Lipex 100T ir skystas Lipolase 100L preparatai. Reakcijos vykdytos, esant 30oC
temperatūrai. Tyrimų rezultatai pateikti 3.45 paveiksle.
A

Santykinis esterių kiekis reakcijos

90
80
70
60 Vanduo

mišinyje, %
50
tret-Butanolis
40
30 n-Heksanas
20
10
0

lis
is
Pe olis

k s is

lis
Bu lis
Et s

lis

tila tas

s
i

ta
ol
l
ol

no
no

no
o

ho

Bu eta

ta
an

an
an

pa

ta
ta

ko

ce
nt
et

c
oa b u
ro

al

ila
M

He

op

o
1-

ilo

et
Iz
1-

1-

Iz

M
m
Iz
B
Santykinis esterių kiekis reakcijos

80
70
60
50 Vanduo
mišinyje, %

40 tret-Butanolis
30 n-Heksanas
20
10
0
lis
is
Pe olis

ks s

lis
Bu lis
Et s

lis

tila tas

s
He oli
i

ta
op n ol
ol

no

no
o

ho

Bu eta
n
an

ta
n
an

pa

ta
ta

ko

ce
nt
et

c
oa b u
ro

al

ila
M

o
1-

ilo

et
Iz
1-

1-

Iz

M
m
Iz

3.45 pav. Komercinių lipazių Lipex 100T (A) ir Lipolase 100L (B) katalizuojamų pamuilių
esterinimo ir transesterinimo įvairiais acilakceptoriais skirtinguose tirpikliuose reakcijų metu po
5 val. susidariusių esterių santykinis kiekis reakcijos mišinyje.

Akivaizdu, kad abiejų tirtų fermentų atveju reakcija efektyviausiai vyksta n-

heksane, kai mišinys ekstrahuotas metanoliu, t.y., kai acilakceptorius yra metilo alkoholis
(Lipex 100T atveju esterių išeiga siekia 78 % (3.45 (A) pav.), o Lipolase 100L – 71 %
(3.45 (B) pav.)). Pamuilių transesterinimo/esterinimo visais alkoholiais, išskyrus
izopropanolį, reakcijos efektyvesnės n-heksane, o, kai kaip acilakceptoriai naudoti
acetatai, Lipex 100T katalizuojamos reakcijos visuose tirpikliuose vyksta vienodai
neefektyviai, tuo tarpu Lipolase 100L atveju reakcijos produktyvesnės tret-butanolyje bei
vandenyje. Iš visų tirtų alkoholių izopropanolis išsikyrė labiausiai: reakcija efektyviausiai
vyko vandenyje, o gauta esterių išeiga gerokai mažesnė, palyginus su kitais naudotais
alkoholiais. Prastas lipolizinių fermentų katalizinis aktyvumas izopropanolio atžvilgiu
galėtų būti susijęs su tuo, kad tai yra antrinis alkoholis (visi kiti naudoti alkoholiai –

128
pirminiai), o, kaip žinoma, lipazių aktyvumas skirtingų alkoholių klasių atžvilgiu yra
išsidėstęs tokia tvarka: pirminiai > antriniai > tretiniai alkoholiai [179].
Kadangi didžiausia esterių išeiga gauta pamuilių transesterinimo/esterinimo
metanoliu n-heksane metu, ištirta reakcijos trukmės įtaka jos eigai. Chromatografinės
analizės duomenys pateikti 3.46 paveiksle.
A B

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

3.46 pav. Komercinių lipazių Lipex 100T (A) ir Lipolase 100L (B) katalizuojamo pamuilių
esterinimo bei transesterinimo metanoliu n-heksane eigos chromatografinis vaizdas. 3 – po 30
min.; 4 – po 1 val.; 5 – po 1,5 val.; 6 – po 2 val.; 7 – po 3 val. Kontrolės: 1 – MO; 2 – pradinis
reakcijos mišinys.

Paaiškėjo, kad jau po 30 min. susidaręs metilo esterių kiekis, ilginant reakcijos
trukmę, nekinta - reakcijos mišinių sudėtis identiška visais tirtais laiko tarpais (3.46
pav.). Kadangi reakcija tokia greita net ir esant švelnioms sąlygoms (30oC temperatūra),
gauti rezultatai leidžia daryti išvadą, kad gali būti sukurtas ekonominiu atžvilgiu
patrauklus pamuilių panaudojimo RR esterių sintezei metodas.
Atsižvelgus į gautus rezultatus, pasirinkti trys alkoholiai, kuriuos naudojant
reakcijos vyko efektyviausiai (metanolis, etanolis bei 1-butanolis) ir tirtos analogiškos
reakcijos be tirpiklių. Pasirinkti penki komerciniai lipoliziniai fermentai (Lipex 100T,
Lipolase 100L, Resinase A2X, Lipozyme TL100L ir Lecitase Ultra) ir tyrimų metu
palygintas jų aktyvumas pamuilių transesterinimo/esterinimo atitinkamais alkoholiais
reakcijų metu (3.47 pav.).
A
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120
100 Metilo esteriai
80 TAG
60 RR
mišinyje, %

40 DAG
20 MAG
0
L
X
0L

a
T
ys

00

ltr
00

A2
in

10

U
1
1
iš

TL

e
se
x
m

as

as
pe

la

e
is

in

cit
m
Li

po
in

es

zy

Le
ad

Li

po
Pr

Li

129
 B

Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120
100 Etilo esteriai
80 TAG
60 RR

mišinyje, %
40 DAG
20 MAG
0

0L
X
0L
0T

a
ys

ltr
A2

10
in

10
10

U
iš

TL

e
se
x
m

as

as
pe

la

e
is

in

cit
m
Li

po
in

es

zy

Le
ad

Li

po
Pr

Li
C
Santykinis medžiagų kiekis reakcijos

120
100 Butilo esteriai
80 TAG
60 RR
mišinyje, %

40 DAG
20 MAG
0

L
X
0L
T

a
ys

00

ltr
A2
00
in

10

U
1
1
iš

TL

e
se
x
m

as

as
pe

la

e
is

in

cit
m
Li

po
in

es

zy

Le
ad

Li

po
Pr

Li

3.47 pav. Skirtingų komercinių lipazių katalizuojamo pamuilių transesterinimo bei esterinimo
metanoliu (A), etanoliu (B) bei 1-butanoliu (C) metu po 1 val. susidariusių produktų santykinis
kiekis reakcijų mišiniuose.

Iš visų tirtų fermentų Lecitase Ultra pasižymėjo prasčiausiu aktyvumu, kai kaip
acilakceptoriai naudoti metanolis bei etanolis: reakcijų mišiniuose vis dar lieka
santykinai didelis TAG kiekis, o esterių išeigos bent 10 % mažesnės, palyginus su kitais
fermentais. Visų fermentų atveju reakcijos veiksmingiausios, kai acilakceptorius yra
metanolis (išlieka ta pati tendencija kaip ir anksčiau tirtų reakcijų metu). Visgi akivaizdu,
kad reakcijos be tirpiklio vyksta ne taip efektyviai kaip n-heksane, kuriame didžiausa
gauta esterių išeiga siekia 78 % (Lipex 100T), o sistemoje be tirpiklių – 61 % (Lipolase
100L).
Tyrimų metu pamuilės buvo ekstrahuotos ir kitais paprastai lipazių
katalizuojamoms reakcijoms naudojamais tirpikliais - vandeniu, tret-butanoliu, toluenu,
n-heksanu (šio mišinio chromatografinis vaizdas pateiktas 3.43 pav.) bei n-heptanu.
Buvo ištirtos bei palygintos Lipex 100T ir Lipolase 100L lipazių katalizuojamos pamuilių
esterinimo bei transesterinimo metanoliu šiuose tirpikliuose reakcijos (3.48 pav.).

130
 Santykinis metilo esterių kiekis reakcijos
90
80
70
60

mišinyje, %
50 Lipex 100T
40 Lipolase 100L
30
20
10
0
Vanduo tret-Butanolis Toluenas n-Heptanas n-Heksanas

3.48 pav. Lipex 100T ir Lipolase 100L lipazių katalizuojamo pamuilių esterinimo bei
transesterinimo metanoliu skirtinguose tirpikliuose metu po 3 val. susidariusių produktų
santykinis kiekis reakcijų mišiniuose.

Paaiškėjo, kad reakcija vėlgi efektyviausiai vyksta n-heksane: Lipex 100T

katalizuojamos reakcijos metu po 3 val. susidariusių esterių išeiga siekia 81 % (3.48
pav.), o po 4 val. mišinį sudaro praktiškai vien produktas – metilo esteriai (3.49 pav.).

MO TO OR 1 2

3.49 pav. Lipex 100T katalizuojamo pamuilių esterinimo/transesterinimo metanoliu n-heksane

metu susidariusių produktų chromatografinis vaizdas. 1 - po 1 val.; 2 - po 4 val. Kontrolės: MO –
metilo oleatas; TO – trioleinas; OR – oleino rūgštis.

Visuose tirtuose tirpikliuose abiejų fermentų aktyvumas buvo panašus, išskyrus

tolueną, kuriame Lipex 100T katalizuojamos reakcijos metu esterių išeiga siekia 73 %, o
Lipolase 100L – 50 %. Tai gali būti susiję su skirtingu fermentų stabilumu šiame
organiniame tirpiklyje. Reikėtų atsižvelgti į tai, kad Lipex 100T yra imobilizuotos, o
Lipolase 100L – skystos formos komerciniai preparatai, o, kaip žinoma, imobilizacija
neretai padidina fermentų atsparumą bei stabilumą įvairių organinių tirpiklių atžvilgiu.
Kadangi laboratorijoje vykdomi dumblių auginimo bei įvairių bioproduktų
išskyrimo iš jų biomasės tyrimai, ieškoma ne tik efektyvių medžiagų ekstrakcijos metodų
(tyrimų metu vienas metodas buvo patentuotas), bet ir alternatyvių dumblių auginimo

131
terpių. Todėl buvo atliktas pamuilių, kaip dumblių auginimo terpės, panaudojimo
tyrimas. Dumblių pritaikymo utilizuoti susidariusias atliekas tyrimams buvo pasirinktos
dvi plačiai pasaulyje tiriamos jų rūšys – Chlorella vulgaris bei Scenedesmus dimorphus.
Buvo siekiama ištirti pamuilių, kaip dumblių auginimo terpės komponentų, panaudojimo
galimybę, tačiau visomis tirtomis sąlygomis abi dumblių padermės visai neaugo net ir
įvairiai skiestose pamuilėse. Tai gali būti susiję su kai kurių pagrindines gyvybines
dumblių funkcijas užtikrinančių makrokomponentų - azoto, fosforo junginių bei kitų
mineralinių medžiagų - trūkumu.

Skyriaus apibendrinimas
Ištyrus pamuilių sudėtį, nustatyta, kad didžiąją šiose atliekose esančių riebalinių
komponentų dalį sudaro laisvos RR: dominuoja ilgos grandinės RR (C16 - C18), o
sočiosios sudaro 54 % viso pamuilėse esančių RR kiekio. Taip pat aptinkama ir TAG,
DAG bei MAG.
Fermentinis riebalinių atliekų esterinimas/transesterinimas, susidarant įvairiems
RR esteriams, yra efektyvus pamuilių utilizavimo būdas. Komercinio preparato Lipex
100T katalizuojamo n-heksanu ekstrahuotų pamuilių esterinimo/transesterinimo
metanoliu, esant 30oC temperatūrai, metu po 4 val. susidariusių esterių išeiga siekia
beveik 100 %.
Pamuilių, kaip dumblių auginimo terpės, panaudojimas pasirodė esąs
neveiksmingas: visomis tirtomis sąlygomis abi tirtos dumblių padermės visai neaugo
kaip terpę naudojant įvairiai skiestas pamuiles. Tai gali būti susiję su kai kurių
pagrindines gyvybines dumblių funkcijas užtikrinančių makrokomponentų (azoto,
fosforo junginių bei kitų mineralinių medžiagų) trūkumu.

132
IŠVADOS
1. tret-Butanolis yra tinkamesnis organinis tirpiklis lipazių katalizuojamoms aliejų
hidrolizės, o n-heksanas – transesterinimo reakcijoms vykdyti. Įvairių organinių
tirpiklių, naujų priedų, džiovinimo agentų naudojimas bei alkoholio pakeitimas jo
acto rūgšties esteriu rapsų aliejaus transesterinimo metanoliu produktyvumui
didinti gali pasižymėti ir neigiamu efektu, priklausomai nuo naudojamo fermento
bei kitų reakcijos parametrų.

2. Oleino rūgšties esterinimas trimetilolpropanu yra efektyvesnis triesterių gavimo

būdas nei metiloleato transesterinimas, o palankiomis sąlygomis gautos produktų
išeigos patvirtina šio proceso pritaikymo pramoninei biotepalų gamybai
potencialą.

3. Lipolase 100L katalizuojamas kokosų aliejaus transesterinimas terpenoliu - β-

citroneloliu – yra efektyvus vertingomis savybėmis pasižyminčių esterių gavimo
būdas, gaunant didžiausias produktų išeigas, kai reakcijos vykdomos
hidrofobiniuose tirpikliuose, kurių logP vertė didesnė arba lygi 3,50.

4. Priklausomai nuo naudojamos organinės rūgšties struktūros, lipazės gali gana

efektyviai katalizuoti ne tik mono-, bet ir dikarboksirūgščių (glutaro bei oksalo)
esterinimą alkoholiais, susidarant atitinkamiems diesteriams bei kitiems
produktams, kurių skaičius kinta, naudojant skirtingus alkoholius bei komercinius
lipazių preparatus.

5. Lipolase 100L bei Lipex 100L katalizuojamas muilo gamybos atliekų

esterinimas/transesterinimas, susidarant įvairiems riebalų rūgščių esteriams, gali
būti efektyvus tokių atliekų utilizavimo būdas.

133
PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA

1. Kiriliauskaitė V, Bendikienė V, Juodka B. Environment-friendly biodiesel

production by transesterification of rapeseed oil: effect of reaction parameters.
Journal of Environmental Engineering and Landscape Management.
2013;21(1):42-51.
2. Kiriliauskaitė V, Bendikienė V, Juodka B. Synthesis of trimethylolpropane
esters of oleic acid by Lipoprime 50T. Journal of Industrial Microbiology and
Biotechnology. 2011;38(9):1561-6.
3. Bendikienė V, Kiriliauskaitė V, Juodka B. Production of environmentally
friendly biodiesel by enzymatic oil transesterification. Journal of Environmental
Engineering and Landscape Management. 2011;19(2):123-9.
Publikacijos nerecenzuojamuose leidiniuose:
1. Kiriliauskaitė V, Šinkūnienė D, Bendikienė V. Lipazių katalizuojamų
biotechnologijai svarbių procesų tyrimas. Konferencijos “Mokslas Gamtos
mokslų fakultete” pranešimai. ISBN: 978-9955-33-602-0.Vilniaus universiteto
leidykla, Vilnius. 2010;74-84.

PATENTAS
Bendikienė V, Romaškevičius O, Kiriliauskaitė V. Method and system of algal cells
disruption and isolation of bioproducts therefrom. International Application No.
PCT/2013LT/000005. Lietuvos Respublikos Valstybinis Patentų Biuras: „Dumblių
ląstelių ardymo ir bioproduktų išskyrimo būdas ir sistema“, Nr. 6018; 2014-04-25.

KONFERENCIJOS
1. Bendikienė V, Arelis A, Kiriliauskaitė V. Study of green algae Chlorella
vulgaris cultivation in piggery wastewater. The International Conference
“Biotechnology and quality of life” and XII International Specialized Exhibition
“BIOTECH WORLD’ 2014” March 18-20, 2014, Moscow.
2. Bendikienė V, Kiriliauskaitė V. Lipid analysis by thin-layer chromatography.
Proceedings of IV International Conference on Science and Education. Goa,
India. February 23-March 2, 2013. P. 59-63.

134
 3. Kiriliauskaitė V, Budrienė S, Juodka B, Bendikienė V. The investigation of
substrate specificity of some lipase-catalyzed esterification reactions. Stendinis
pranešimas Vilniaus universiteto konferencijai, skirtai Vilniaus universiteto
Biochemijos ir biofizikos katedros 50 metų jubiliejui „Biochemija ir biofizika
Vilniaus universitete“, vykusiai 2012-09-29:
4. Bendikienė V, Kiriliauskaitė V, Juodka B, Kostkevičienė J, Leigaitė K,
Vaičiulytė S. The investigation of algal-based biofuel and biomaterials.
Proceedings of 5th International Conference “Modern Achievements of Science
and Education”. Netanya, Israel. 27 September – 4 October, 2011. P. 34-36.
5. Bendikienė V, Juodka B, Kiriliauskaitė V, Šinkūnienė D. The study of
biotechnologically important processes catalyzed by lipopytic enzymes. Modern
Achievements of Science and Education. IV International Conference, September
11-18, 2010, Budva, Montenegro. p. 198-200.
6. Bendikienė V, Budrienė S, Juodka B, Kiriliauskaitė V. The investigation of
substrate specificity of some lipase-catalyzed esterification reactions. XI-toji
tarptautinė Lietuvos biochemikų draugijos konferencija "LBD 50". 2010 m.
birželio 15-17 d. d., Tolieja (Molėtų raj.). P. 22.

PROJEKTAI
1. 2011 m. atlikti tyrimai „Lipolizinių fermentų skatinamų riebalinių atliekų virsmų
produktų susidarymo iš pamuilių biotechnologinio panaudojimo perspektyvos“.
De minimis pagalbos (inovacinio čekio) gavėjas - AB „NAUJOJI RINGUVA“,
generalinė direktorė J. Žilninskaitė. Inovacinio čekio paslaugos teikėjas - Vilniaus
universiteto Gamtos mokslų fakultetas, dr. Vida Bendikienė.
2. 2008-2009 metais Lietuvos VMSF (N-16), o 2010 m. – Lietuvos Mokslo Tarybos
projektas (PBT-07/2010-2) „Kontroliuojamo degumo ir atsparių senėjimui
bioskalių esterių kūrimas ir įvertinimas“.

MOKSLO POPULIARINIMAS: parengta paskaita Nacionaliniam Mokslo festivaliui

“Erdvėlaivis Žemė” 2011: “Žaliadumblių biotechnologinio pritaikymo tyrimas”. 2011-
09-15, Vilniaus universitetas, Gamtos mokslų fakultetas.

135
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovei dr. Vidai Bendikienei už suteiktą galimybę būti
nuostabaus kolektyvo dalimi, visapusišką patirties ir įgūdžių perdavimą, įdomių ir
aktualių tyrimų organizavimą, puikias eksperimentinio darbo sąlygas, nesuskaičiuojamas
diskusijų, patarimų bei konsultacijų valandas, palaikymą, kantrybę ir supratingumą.
Pirmaisiais studijų metais mano darbui vadovavusiam prof. habil. dr. Benediktui Juodkai
dėkoju už patarimus metodiniais klausimais, padrąsinimą bei įkvėpimą.
Esu labai dėkinga visiems VU GMF BMBK katedros darbuotojams, ypač abiems
katedros vedėjoms, prof. Vidai Kirvelienei ir prof. Editai Sužiedelienei, už visokeriopą
pagalbą, patarimus bei konsultacijas organizaciniais studijų bei šio darbo rengimo
klausimais. Ypatingai dėkoju dr. Sauliui Servai už itin atidų disertacijos juodraščio
perskaitymą, vertingus komentarus bei patarimus. Taip pat esu dėkinga visiems
studentams ir darbuotojams, su kuriais turėjau galimybę dirbti, diskutuoti bei kurti puikią
bendrą darbinę atmosferą.
Labai dėkoju UAB „Biopolis“ už galimybę savo tyrimams naudoti tiek daug
komercinių lipolizinių preparatų.
Esu itin dėkinga savo tėvams už meilę, tikėjimą manimi ir palaikymą visais
gyvenimo atvejais.

136
LITERATŪRA
1. Bansal P, Roth K. Why companies go green: a model of ecological responsiveness. Acad
Manage J. 2000;43:717-36.
2. Wohlgemuth R. Biocatalysis — key to sustainable industrial chemistry. Curr Opin Biotech.
2010;21:713-24.
3. Robles-Medina A, Gonzalez-Moreno PA, Esteban-Cerdán L, Molina-Grima E.
Biocatalysis: Towards ever greener biodiesel production. Biotechnol Adv. 2009;27:398-
408.
4. Hartmeier W. Immobilized Biocatalysts. 1986. Springer, Verlag, Berlin.
5. Gupta S, Bhattacharya A, Murthy CN. Tune to immobilize lipases on polymer membranes:
Techniques, factors and prospects. Biocatal Agr Biotechnol. 2013;2:171-90.
6. Hwang HT, Qi F, Yuan C, Zhao X, Ramkrishna D, Liu D, Varma A. Lipase-catalyzed
process for biodiesel production: Protein engineering and lipase production. Biotechnol
Bioeng. 2014;111:639-53.
7. Jaeger K–E, Eggert T. Lipases for biotechnology. Curr Opin Biotech. 2002;13:390-7.
8. Lozano P. Enzymes in neoteric solvents: From one-phase to multiphase systems. Green
Chem. 2010;12:555-69.
9. Balcão VM, Pavia AL, Malcata FX. Bioreactors with immobilized lipases: State of the art.
Enzyme Microb Tech. 1996;18:392-416.
10. Hasan F, Shah A, Hameed A. Methods for detection and characterization of lipases: A
comprehensive review. Biotechnol Adv. 2009;27:782-98.
11. Reis P, Holmberg K, Watzke H, Leser ME, Miller R. Lipases at interfaces: A review. Adv
Colloid Interfac. 2009;147-148:237-50.
12. Rodrigues RC, Fernandez-Lafuente R. Lipase from Rhizomucor miehei as a biocatalyst in
fats and oils modification. J Mol Catal B-Enzym. 2010;66:15-32.
13. Rodrigues RC, Fernandez-Lafuente R. Lipase from Rhizomucor miehei as an industrial
biocatalyst in chemical process. J Mol Catal B-Enzym. 2010;64:1-22.
14. Chandrasekeran SM, Bhartiya S. Substrate specificity of lipase in alkoxycarbonylation
reaction: QSAR model development and experimental validation. Biotechnol Bioeng.
2009;30:527-34.
15. Holt J, Hanefeld U. Enantioselective enzyme-catalyzed synthesis of cyanohydrins. Curr
Org Synth. 2009;6:1005-18.
16. Fernandez-Lafuente R. Lipase from Thermomyces lanuginosus: Uses and prospects as an
industrial biocatalyst. J Mol Catal B-Enzym. 2010;62:197-212.
17. Hasan F, Shah A, Hameed A. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme Microb
Tech. 2006;39:235-51.
18. Houde A, Kademi A, Leblanc Danielle. Lipases and their industrial applications. Appl
Biochem Biotech. 2004;118:155-70.
19. Uosukainen E, Linko Y-Y, Lämsä M, Tervakangas T, Linko P. Transesterification of
trimethylolpropane and rapeseed oil methyl ester to environmentally acceptable lubricants.
J Am Oil Chem Soc. 1998;11:1557-63.
20. Du W, Li W, Sun T, Chen X, Liu D. Perspectives for biotechnological production of
biodiesel and impacts. Appl Microbiol Biot. 2008;79:331-7.
21. Fjerbaek L, Christensen KV, Norddahl B. A review of the current state of biodiesel
production using enzymatic transesterification. Biotechnol Bioeng. 2009;102(5):1298-315.
22. Jegannathan KR, Abang S, Poncelet D, Chan ES, Ravindra P. Production of biodiesel
using immobilized lipase – A critical review. Crit Rev Biotechnol. 2008;28:253-64.
23. Nielsen PM, Brask J, Fjerbaek L. Enzymatic biodiesel production: Technical and
economical considerations. Eur J Lipid Sci Tech. 2008;110:692-700.

137
24. Ranganathan SV, Narasimhan SL, Muthukumar K. An overview of enzymatic production
of biodiesel. Bioresource Technol. 2008;99:3975-81.
25. Jaeger K-E, Ransac S, Dijkstra BW, Colson C, van Heuvel M, Misset O. Bacterial lipases.
FEMS Microbiol Rev. 1994;15:29-63.
26. Rahman RNZRA, Leow TC, Salleh AB, Basri M. Geobacillus zalihae sp. nov., a
thermophilic lipolytic bacterium isolated from palm mill effluent in Malaysia.
Microbiology. 2007;7:77.
27. Sztajer H, Maliszewska I, Wieczorek J. Production of exogenous lipase by bacteria, fungi
and actinomycetes. Enzyme Microb Tech. 1988;10:492-7.
28. Wang Y, Srivastava KC, Shen GJ, Wang HY. Thermostable alkaline lipase from newly
isolated thermophilic Bacillus strain, A30-1 (ATCC 53841). J Ferment Bioeng.
1995;79:433-8.
29. Arpigny L J, Jaeger K-E. Bacterial lipolytic enzymes: Classification and properties.
Biochem J. 1999;343:177 – 83.
30. Vakhlu J, Kour A. Yeast lipases: Enzyme purification, biochemical properties and gene
cloning. Electron J Biotechnol. 2006;9(1):69-85.
31. Elibol M, Ozer D. Influence of oxygen transfer on lipase production by Rhizopus arrhizus.
Process Biochem. 2001;36:325-9.
32. Gupta R, Gupta N, Rathi P. Bacterial lipases: An overview of production, purification and
biochemical properties. Appl Microbiol Biot. 2004;64:763-81.
33. Hasan F, Hamed A. Optimization of lipase production from Bacillus sp. Pakistan J Bot.
2001;33:789-96.
34. Fuqua WC, Winans SC, Greenberg EP. Quorum sensing in bacteria: The luxR-luxI family
of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol. 1994;176:269-75.
35. Kameshwar Sharma YVR, Neelima B, Prasidhi T. Isolation, purification and
characterization of secondary structure and kinetic study of lipase from Indian major carp,
Catla catla (Catla). Enzyme Eng. 2014;3(1):1-8.
36. Brady L, Brzozowski AM, Derewenda ZS, Dodson E, Dodson G, Tolley S, Turkenburg JP,
Christiansen L, Huge-Jensen B, Norskov L, Thim L, Menge U. A serine protease triad
forms the catalytic centre of a triacylglycerol lipase. Nature. 1990;343:767-70.
37. Carrasco-Lopez C, Godoy C, de las Rivas B, Fernandez-Lorente G, Palomo JM, Guisan
JM, Fernandez-Lafuente R, Martinez-Ripoll M, Hermoso JA. Crystallization and
preliminary X-ray diffraction studies of the BTL2 lipase from the extremophilic
microorganism Bacillus thermocatenulatus. Acta Crystallogr F. 2008;64:1043-5.
38. Ericsson DJ, Kasrayan A, Johansson P, Bergfors T, Sandstrom AG, Backval JE, Mowbray
SL. X-ray structure of Candida antarctica lipase A shows a novel lid structure and a likely
mode of interfacial activation. J Mol Biol. 2008;376(1):109-19.
39. Kim KK, Hwang KY, Jeon HS, Kim S, Sweet RM, Yang CH, Suh SW. Crystallization and
preliminary-X-ray crystallographic analysis of lipase from Pseudomonas cepacia. J Mol
Biol. 1992;227(4):1258-62.
40. Ransac S, Blaauw M, Lesuisse E, Schanck K, Colson C, Dijkstra BW. Crystallization and
preliminary-X-ray analysis of a lipase from Bacillus subtilis. J Mol Biol. 1994;238(5):857-
9.
41. Schrag JD, Li Y, Cygler M, Lang D, Burgdorf T, Hecht HJ, Schmid R, Schomburg D,
Rydel TJ, Oliver JD, Strickland LC, Dunaway CM, Larson SB, Day J, McPherson A. The
open conformation of a Pseudomonas lipase. Structure. 1997;5:187-202.
42. Guncheva M, Zhiryakova D. Catalytic properties and potential applications of Bacillus
lipases. J Mol Catal B-Enzym. 2011;68:1-21.
43. Nardini M, Dijkstra BW. α/β Hydrolase fold enzymes: The family keeps growing. Curr
Opin Struc Biol. 1999;9:732-7.

138
44. Ollis DL, Cheah E, Cygler M, Dijkstra B, Frolow F, Franken SM et al. The α/β hydrolase
fold. Protein Eng. 1992;5:197-211.
45. Schrag JD, Cygler M. Lipases and α/β hydrolase fold. Methods Enzym (Rubin B., Dennis
E. eds.). Acad Press. 1997;284:85–107.
46. Winkler FK, d'Arcy A, Hunziker W. Structure of human pancreatic lipase. Nature.
1990;343:771-4.
47. Dodson GG, Lawson DM, Winkler FK. Structural and evolutionary relationships in lipase
mechanism and activation. Faraday Discuss. 1996;93:95-105.
48. Uppenberg J, Hansen MT, Patkar S, Jones TA. The sequence, crystal structure
determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida antarctica.
Structure. 1994;2:293-308.
49. Pleiss J, Fischer M, Schmid RD. Anatomy of lipase binding sites: The scissile fatty acid
binding site. Chem Phys Lipids. 1998;93:67-80.
50. Schmid RD, Verger R. Lipases: Interfacial enzymes with attractive applications. Angew
Chem Int Edit. 1998;37:1608-33.
51. Carrasco-Lopez C, Godoy C, de las Rivas B, Fernandez-Lorente G, Palomo JM, Guisan
JM, Fernández-Lafuente R, Martínez-Ripoll M, Hermoso JA. Activation of bacterial
thermoalkalophilic lipases is spurred by dramatic structural rearrangements. J Biol Chem.
2009;284:4365-72.
52. Hjorth A, Carriere F, Cudrey C, Woldike H, Boel E, Lawson DM, Ferrato F, Cambillau C,
Dodson GG, Thim L, Verger R. A structural domain (the lid) found in pancreatic lipases is
absent in the guinea pig (phospho)lipase. Biochemistry. 1993;32:4702-7.
53. Martinelle M, Hult K. Kinetics of acyl transfer reactions in organic media catalysed by
Candida antarctica lipase B. Biochim Biophys Acta. 1995;1251:191-7.
54. Noble MEM, Cleasby A, Johnson LN, Frenken LGJ, Egmond MR. The crystal structure of
triacylglycerol lipase from Pseudomonas glumae reveals a partially redundant catalytic
aspartate. FEBS Lett. 1993;331:123-8.
55. Jaeger K-E, Ransac S, Koch HB, Ferrato F, Dijkstra BW. Topological characterization and
modeling of the 3D structure of lipase from Pseudomonas aeruginosa. FEBS Lett.
1993;332:143-9.
56. Thirstrup K, Verger R, Carriere F. Evidence for a pancreatic lipase subfamily with new
kinetic properties. Biochemistry. 1994;33:2748-56.
57. Van Oort MG, Deveer AMTJ, Dijkman R, Tjeenk ML, Verheij HM, De Haas GH, Wenzig
E, Götz F. Purification and substrate specificity of Staphylococcus hyicus lipase.
Biochemistry. 1989;28:9278-85.
58. Brzozowski AM, Derewenda U, Derewenda ZS, Dodson GG, Lawson DM, Turkenburg JP,
Bjorkling F, Huge-Jensen B, Patkar SA, Thim L. A model for interfacial activation in
lipases from the structure of a fungal lipase-inhibitor complex. Nature. 1991;351:491-4.
59. Derewenda ZS, Sharp AM. News from the interface: The molecular structures of
triacylglyceride lipases. Trends Biochem Sci. 1993;18:20-5.
60. Groshulski P, Li Y, Schrag JD, Bouthillier F, Smith P, Harrison D, Rubin B, Cygler M.
Insights into interfacial activation from an open structure of Candida rugosa lipase. J Biol
Chem. 1993;268:12843-7.
61. Brzozowski AM, Savage H, Verma CS, Turkenburg JP, Lawson DM, Svendsen A, Patkar
S. Structural origins of the interfacial activation in Thermomyces (Humicola) lanuginosa
lipase. Biochemistry. 2000;39:15071-82.
62. Egloff MP, Marguet F, Buono G, Verger R, Cambillau C, van Tilbeurgh H. The 2.45 Å
resolution structure of the pancreatic lipase-colipase complex inhibited by a C11 alkyl
phosphonate. Biochemistry. 1995;34:2751-62.

139
63. Grochulski P, Bouthillier F, Kazlauskas RJ, Serreqi AN, Schrag JD, Ziomek E, Cygler M.
Analogs of reaction intermediates identify a unique substrate binding site in Candida
rugosa lipase. Biochemistry. 1994;33:3494-500.
64. Roussel A, Miled N, Berti-Dupuis L, Riviere M, Spinelli S, Berna P, Gruber V, Verger R,
Cambillau C. Crystal structure of the open form of dog gastric lipase in complex with a
phosphonate inhibitor. J Biol Chem. 2002;277:2266-74.
65. Aloulou A, Rodriguez JA, Fernandez S, van Oosterhout D, Puccinelli D, Carrière F.
Exploring the specific features of interfacial enzymology based on lipase studies. Biochim
Biophys Acta. 2006;1761:995-1013.
66. Klibanov AM. Improving enzymes by using them in organic solvents. Nature.
2001;409:241-6.
67. Persson M, Mladenoska I, Wehtje E, Adlercreutz P. Preparation of lipases for use in
organic solvents. Enzyme Microb Tech. 2002;31:833–41.
68. Idris A, Bukhari A. Immobilized Candida antarctica lipase B: Hydration, stripping off and
application in ring opening polyester synthesis. Biotechnol Adv. 2012;30:550-63.
69. Dhake KP, Thakare DD, Bhanage BM. Lipase: A potential biocatalyst for the synthesis of
valuable flavour and fragarance ester compounds. Flavour Frag J. 2013;28:71-83.
70. Brocca S, Secundo F, Ossola M, Alberghina L, Carrea G, Lotti M. Sequence of the lid
affects activity and specificity of Candida rugosa lipase isoenzymes. Protein Sci.
2003;12(10):2312-9.
71. Chakravorty D, Parameswaran S, Dubey VK, Patra S. Unraveling the rationale behind
organic solvent stability of lipases. Appl Biochem Biotech. 2012;167(3):439-61.
72. Yedavalli P, Rao NM. Engineering the loops in a lipase for stability in DMSO. Protein Eng
Des Sel. 2013;26(4):317-24.
73. Bezbradica D, Karalazić I, Ognjanović N, Mijin D, Šiler-Marinković S, Knežević Z.
Studies on the specificity of Candida rugosa lipase catalyzed esterification reactions in
organic media. J Serb Chem Soc. 2006;71(1):31-41.
74. Bezbradica D, Mijin D, Marinkovic SS, Knezevic Z. The Candida rugosa lipase catalyzed
synthesis of amyl isobutyrate in organic solvent and solvent-free system: A kinetic study. J
Mol Catal B-Enzym. 2006;38:11-6.
75. Janssen PH, Monk CR, Morgan HW. A thermophilic, lipolytic Bacillus sp., and continuous
assay of its p-nitrophenyl-palmitate esterase activity. FEMS Microbiol Lett. 1994;120:195-
200.
76. Levisson M, Van der Oost J, Kengen S. Carboxylic ester hydrolases from
hyperthermophiles. Extremophiles. 2009;13:567-81.
77. Kojima Y, Yokoe M, Mase T. Purification and characterization of alkaline lipase from
Pseudomonas fluorescens AK102. Biosci Biotech Bioch. 1994;58:1564-8.
78. Sidhu P, Sharma R, Soni SK, Gupta JK. Effect of cultural conditions on extracellular lipase
production by Bacillus sp. RS-12 and its characterization. Indian J Microbiol. 1998;38:9-
12.
79. El-Shafei HA, Rezkallah LA. Production, purification and characterization of Bacillus
lipase. Microbiol Res. 1997;52:199-208.
80. Salameh M, Wiegel J. Lipases from extremophiles and potential for industrial applications.
Adv Appl Microbiol. 2007;61:253-83.
81. Yu XW, Tan NJ, Xiao R, Xu Y. Engineering a disulfide bond in the lid hinge region of
Rhizopus chinensis lipase: Increased thermostability and altered acyl chain length
specificity. PloS ONE. 2012;7(10):e46388.0
82. Zhu K, Jutila A, Tuominen EKJ, Patkar SA, Svendsen A, Kinnunen PK. Impact of the
tryptophan residues of Humicola lanuginosa lipase on its thermal stability. Biochim
Biophys Acta. 2001;1547:329-38.

140
83. Arroyo M, Sanchez-Montero JM, Sinisterra JV. Thermal stabilization of immobilized
lipase B from Candida antarctica on different supports: Effect of water activity on
enzymatic activity in organic media. Enzyme Microb Tech. 1999;24:3-12.
84. Yucel Y. Optimization of immobilization conditions of the Thermomyces lanuginosus
lipase on olive pomace powder using response surface methodology. Biocatal Agr
Biotechnol. 2012;1:39-44.
85. Natarajan E, Venkatesh KP. Production and characterization of biodiesel using Pongamia
oil by immobilized Rhizopus oryzae. Adv Biotech. 2012;11:32-4.
86. Tan TW, Lu JK, Nie KL, Deng L, Wang F. Biodiesel production with immobilized lipase:
A review. Biotechnol Adv. 2010;28:628-34.
87. Cao L. Immobilized enzymes: Science or art? Curr Opin Chem Biol. 2005;9:217-26.
88. Padmini P, Raskhit SK, Baradarajan A. Studies on immobilization of lipase on alumina for
hydrolysis of rice bran oil. Bioprocess Eng. 1993;9:43-6.
89. Wisdom RA, Dunnill P, Lilly MD, Macrae RA. Enzyme esterification of fats: Factors
influencing the choice of support for immobilized lipase. Enzyme Microb Tech.
1984;6:443-6.
90. Shaw JF, Chang RC, Wang HJ. Lipolytic activities of a lipase immobilized on six selected
supporting materials. Biotechnol Bioeng. 1990;35:132-7.
91. Zaidi A, Gainer JL, Carta G. Fatty acids esterification using nylon-immobilized lipase.
Biotechnol Bioeng. 1995;48:601-5.
92. Telefoncu A, Dinekaya E, Vorlop KD. Preparation and characterization of pancreatic
lipase immobilized on Eudragit matrix. Appl Biochem Biotech. 1990;26:311-7.
93. Winayanuwattikun P, Kaewpiboon C, Piriyakananon K, Chulalaksananukul W,
Yongvanich T, Svasti T. Immobilized lipase from potential lipolytic microbes for
catalyzing biodiesel production using palm oil as feedstock. Afr J Biotechnol.
2011;10:1666-73.
94. Yagiz F, Kazan D, Akin AN. Biodiesel production from waste oils by using lipase
immobilized on hydrotalcite and zeolites. Chem Eng J. 2007;134:262-7.
95. Nie K, Xie F, Wong F, Tan T. Lipase catalyzed methanolysis to produce biodiesel:
Optimization of the biodiesel production. J Mol Catal B-Enzym. 2006;43:142-7.
96. Zaidi A, Gainer JL, Carta G, Mrani A, Kadri T, Belarbi Y, Mir A. Esterification of fatty
acids using nylon-immobilized lipase in n-hexane: Kinetic parameters and chain-length
effects. J Biotechnol. 2002;93(3):209-16.
97. Serri NA, Kamaruddin AH, Long WS. Studies of reaction parameters on synthesis of
citronellyl laurate ester via immobilized Candida rugosa lipase in organic media.
Bioprocess Biosyst Eng. 2006;29(4):253-60.
98. Silva JE, Jesus PC. Evaluation of the catalytic activity of lipases immobilized on chrysotile
for esterification. An Acad Bras Cienc. 2003;75(2):157-62.
99. Aucoin MG, Erhardt FA, Legge RL. Hyperactivation of Rhizomucor miehei lipase by
hydrophobic xerogels. Biotechnol Bioeng. 2004;85:647-55.
100. Fernandez-Lafuente R, Armisen P, Sabuquillo P, Fernandez-Lorente G, Guisan JM.
Immobilization of lipases by selective adsorption on hydrophobic supports. Chem Phys
Lipids. 1998;93:185-97.
101. Palomo JM, Munoz G, fernandez-Lorente G, mateo C, Fernandez-Lafuente R, Guisan JM.
Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl-sephabeads):
Immobilization, hyperactivation and stabilization of the open form of lipases. J Mol Catal
B-Enzym. 2002;19-20:279-86.
102. Shah S, Solanki K, Gupta MN. Enhancement of lipase activity in non-aqueous media upon
immobilization on multi-walled carbon nanotubes. Chem Central J. 2007;1:30.

141
103. Sorensen MH, Nq JB, Bergstrom L, Alberius PC. Improved enzymatic activity of
Thermomyces lanuginosus lipase immobilized in a hydrophobic particulate mesoporous
carrier. J Colloid Interf Sci. 2010;343:359-65.
104. Wilson L, Palomo JM, Fernandez-Lorente G, Illanes A, Guisan JM, Fernandez-Lafuente R.
Improvement of the functional properties of a thermostable lipase from alcaligenes sp. via
strong adsorption on hydrophobic supports. Enzyme Microb Tech. 2006;38:975-80.
105. Al-Duri B, Yong YP. Lipase immobilization: An equilibrium study of lipases immobilized
on hydrophobic and hydrophilic/hydrophobic supports. Biochem Eng J. 2000;4:207-15.
106. Palomo JM, Penas MM, Fernandez-Lorente G, Mateo C, Pisabarro AG, Fernandez-
Lafuente R, Ramírez L, Guisán JM. Solid-phase handling of hydrophobins: Immobilized
hydrophobins as a new tool to study lipases. Biomacromolecules. 2003;4:204-10.
107. Palomo JM, Ortiz C, Fernandez-Lorente G, Fuentes M, Guisan JM, Fernandez-Lafuente R.
Lipase-lipase interactions as a new tool to immobilize and modulate the lipase properties.
Enzyme Microb Tech. 2005;36:447-54.
108. Palomo JM, Ortiz C, Fuentes M, Fernandez-Lorente G, Guisan JM, Fernandez-Lafuente R.
Use of immobilized lipases for lipase purification via specific lipase-lipase interactions. J
Chromatogr A. 2004;1038:267-73.
109. Wang TH, Lee WC. Immobilization of proteins on magnetic nanoparticles. Biotechnol
Bioproc Eng. 2003;8:263-7.
110. Tiwari A, Dhakate SR. Chitosan-SiO2-multiwall carbon nanotubes nanocomposite: A novel
matrix for the immobilization of creatine amidinohydrolase. Int J Biol Macromol.
2009;44:408-12.
111. Fang H, Niu HT, Tong L, Wang XG. Applications of electrospun nanofibers. Chin Sci
Bull. 2008;53:2265-86.
112. Tiwari A, Terada D, Yoshikawa C, Kobayashi H. An enzyme-free highly glucose-specific
assay using self-assembled aminobenzene boronic acid upon polyelectrolytes electrospun
nanofibers-mat. Talanta. 2010;82:1725-32.
113. Jha BK, Svensson M, Kronberg B, Holmberg K. Titration microcalorimetry studies of the
interaction between Humicola lanuginosa lipase and ionic surfactants. J Colloid Interf Sci.
1999;213:262-4.
114. Derewenda U, Swenson L, Green R, Wei Y, Yamaguchi S, Joerger R, Haas MJ,
Derewenda ZS. Current progress in crystallographic studies of new lipases from
filamentous fungi. Protein Eng. 1994;7(4):551–7.
115. Berg OG, Cajal Y, Butterfoss GL, Grey RL, Alsina MA, Yu BZ, Jain MK. Interfacial
activation of triglyceride lipase from Thermomyces (Humicola) lanuginosa: Kinetic
parameters and a basis for control of the lid. Biochemistry. 1998;37(19):6615–27.
116. Palomo JM, Fuentes M, Fernández-Lorente G, Mateo C, Guisan JM, Fernández-Lafuente
R. General trend of lipase to self-assemble giving bimolecular aggregates greatly modifies
the enzyme functionality. Biomacromolecules. 2003;4(1):1-6.
117. Krishna SH, Karanth NG. Lipases and lipase-catalyzed esterification reactions in
nonaqueous media. Catal Rev. 2002;44:499-591.
118. Miller C, Austin H, Posorske L, Gonzlez J. Characteristics of an immobilized lipase for the
commercial synthesis of esters. J Am Oil Chem Soc. 1988;65:927-31.
119. Dominguez de Maria P, Sanchez-Montero JM, Sinisterra JV, Alcántara AR. Understanding
Candida rugosa lipases: An overview. Biotechnol Adv. 2006;24:180-96.
120. Berger M, Schneider MP. Lipases in organic solvents: The fatty acid chain length profile.
Biotechnol Lett. 1991;13:641-5.
121. Rangheard M-S, Langrand G, Triantaphylides C, Baratii J. Multi-competitive enzymatic
reactions in organic media: A simple test for the determination of lipase fatty acid
specificity. Biochim Biophys Acta. 1993;1004:20-8.

142
122. Böttcher D, Bornscheuer UT. Protein engineering of microbial enzymes. Curr Opin
Microbiol. 2010;13:274-82.
123. Lai J-Q, Hu Z-L, Wang P-W, Yang Z. Enzymatic production of microalgal biodiesel in
ionic liquid [BMIm][PF6]. Fuel. 2012;95:329-33.
124. Watanabe Y, Pinsirodom P, Nagao T, Kobayashi T, Nishida Y, Takagi Y, Shimada Y.
Production of FAME from acid oil model using immobilized Candida antarctica lipase. J
Am Oil Chem Soc. 2005;82(11):825-31.
125. Domínguez de María P, Carboni-Oerlemans C, Tuin B, Bargeman G, van der Meer A, van
Gemert R. Biotechnological applications of Candida antarctica lipase A: State-of-the-art. J
Mol Catal B-Enzym. 2005;37:36-46.
126. Haraldsson GG, Gudmundsson BÖ, Almarsson Ö. The synthesis of homogeneous
triglycerides of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid by lipase. Tetrahedron.
1995;51:941-52.
127. Irimescu R, Furihata K, Hata K, Iwasaki Y, Yamane T. Utilization of reaction medium-
dependent regiospecificity of Candida antarctica lipase (Novozym 435) for the synthesis
of 1,3-dicapryloyl-2-docosahexaenoyl (or eicosapentaenoyl) glycerol. J Am Oil Chem Soc.
2001;78:285-90.
128. Bartling K, Thompson JUS, Pfromm PH, Czermak P, Rezac ME. Lipase-catalyzed
synthesis of geranyl acetate in n-hexane with membrane-mediated water removal.
Biotechnol Bioeng. 2001;75(6):676-81.
129. Jeong G-T, Park D-H. Lipase-catalyzed transesterification of rapeseed oil for biodiesel
production with tert-butanol. Appl Biochem Biotech. 2008;148:131-9.
130. Larios A, García HS, Oliart RM, Valerio-Alfaro G. Synthesis of flavor and fragarance
esters using Candida antarctica lipase. Appl Microbiol Biot. 2004;65:373-6.
131. Zhao H, Song Z. Migration of reactive trace compounds from Novozym 435 into organic
solvents and ionic liquids. Biochem Eng J. 2010;49:113-8.
132. Adlercreutz P. Immobilisation and application of lipases in organic media. Chem Soc Rev.
2013;42:6406-36.
133. Adamczak M, Krishna SH. Enzyme for efficient biocatalysis. Food Technol Biotech.
2004;42(4):251–64.
134. Kapoor M, Gupta MN. Lipase promiscuity and its biochemical applications. Process
Biochem. 2012;47:555-69.
135. Al-Zuhair S. Production of biodiesel: Possibilities and challenges. Biofuel Bioprod Bior.
2007;1:57-66.
136. Miller DA, Prausnitz JM., Blanch W. Kinetics of lipase-catalyzed interesterification of
triglycerides in cyclohexane. Enzyme Microb Tech. 1991;13:98–103.
137. Verger R. Interfacial activation of lipases: Facts and artifacts. Trends Biotechnol.
1997;15:32-8.
138. Benzonana G, Desnuelle P. Kinetic study of the action of pancreatic lipase on emulsified
triglycerides. Enzymology assay in heterogeneous medium. Biochim Biophys Acta.
1965;105:121-36.
139. Schonheyder F, Volqvartz K. On the affinity of pig pancreas lipase for tricaproin in
heterogeneous solution. Acta Physiol Scand. 1945;9: 57–67.
140. Svendsen A. Lipase protein engineering. Biochim Biophys Acta. 2000;1543:223-38.
141. Sarda L, Desnuelle P. Actions of pancreatic lipase on esters in emulsions. Biochim
Biophys Acta. 1958;30(3):513–21.
142. Wong D. Food enzymes: Structure and mechanisms. Chapman & Hall. 1995.
143. Al-Zuhair S. Production of biodiesel by lipase-catalyzed transesterification of vegetable
oils: A kinetics study. Biotechnol Progr. 2005;21:1442-8.
144. Desnuelle P. Pancreatic lipase. Adv Enzymol RAMBL. 1961;23:129-61.

143
145. Patton JS, Carey MC. Watching fat digestion. Science. 1979;204:145–8
146. Verger R, de Haas GH. Enzyme reactions in membrane model. 1. A new technique to study
enzyme reactions in monolayers. Chem Phys Lipids. 1973;10:127–36.
147. Verger R, de Haas GH. Interfacial enzyme kinetics of lipolysis. Annu Rev Biophys Bioeng.
1976;5:77-117.
148. Van Tilbeurgh H, Egloff MP, Martinez C, Rugani N, Verger R, Cambillau C. Interfacial
activation of the lipase-procolipase complex by mixed micelles revealed by X-ray
crystallography. Nature. 1993;362:814-20.
149. Chapus C, Sémériva M. Mechanism of pancreatic lipase action. 2. Catalytic properties of
modified lipases. Biochemistry. 1976;15(23):4988–91.
150. Panaitov I, Verger R. Physical chemistry of biological interfaces. Editors: Baszkin A,
Norde W, Dekker M. New York, Basel, 2000.
151. Reis P, Watzke H, Leser M, Holmberg K, Miller R. Interfacial mechanism of lipolysis as
self-regulated process. Biophys Chem. 2010;147:93-103.
152. Ribeiro BD, de Castro AM, Coelho MAZ, Freire DMG. Production and use of lipases in
bioenergy: A review from the feedstocks to biodiesel production. Emzyme Res. 2011;
doi:10.4061/2011/615803.
153. Macrae AR, Hammond RC. Present and future applications of lipases. Biotechnol Genet
Eng. 1985;3:193-217.
154. Saxena RK, Ghosh PK, Gupta R, Davidson WS, Bradoo S, Gulati R. Microbial lipases:
Potential biocatalysts for the future. Curr Sci. 1999;77:101-15.
155. Jensen RG. Characteristics of the lipase from the mold, Geotrichum candidum: A review.
Lipids. 1974;9:149-57.
156. Charton E, Macrae AR. Substrate specificities for lipases A and B from Geotrichum
candidum CMICC 33546. Biochim Biophys Acta. 1992;1123:59-64.
157. Jensen RG, Dejong FA, Clark RM. Determination of lipase specificity. Lipids.
1983;18:239-52.
158. Jensen RG, Galluzzo DR, Bush VJ. Selectivity is an important characteristic of lipases
(acylglycerol hydrolases). Biocatal Biotransfor. 1990;3:307–16.
159. Fureby AM, Tian L, Adlercreutz P, Mattiasson B. Preparation of diglycerides by lipase-
catalyzed alcoholysis of triglycerides. Enzyme Microb Tech. 1997;20:198-206.
160. Fureby AM, Virto C, Adlercreutz P, Mattiasson B. Acyl migration in 2-monoolein.
Biocatal Biotransfor. 1996;14:89-111.
161. Yang T, Fruekilde M-B, Xu X. Suppression of acyl migration in enzymatic production of
structured lipids through temperature programming. Food Chem. 2005;92:101-7.
162. Holmberg K, Osterberg E. Enzymatic preparation of monoglycerides in microemulsion. J
Am Oil Chem Soc. 1988;65:1544-8.
163. Antczak MS, Kubiak A, Antczak T, Bielecki S. Enzymatic biodiesel synthesis – Key
factors affecting efficiency of the process. Renew Energ. 2009;34:1185-94.
164. Li W, Du W, Li Q, Li R-W, Liu D. Dependence on the properties of organic solvent: Study
on acyl migration kinetics of partial glycerides. Bioresource Technol. 2010;101:5737-42.
165. Li W, Du W, Li Q, Sun T, Liu D. Study on acyl migration kinetics of partial glycerides:
Dependence on temperature and water activity. J Mol Catal B-Enzym. 2010;63:17-22.
166. Wang Y, Wu H, Zong MH. Improvement of biodiesel production by Lipozyme TL IM-
catalyzed methanoysis using response surface methodology and acyl migration enhancer.
Bioresource Technol. 2008;99:7232-7.
167. Du W, Xu Y-Y, Liu D-H, Li Z-B. Study on acyl migration in immobilized Lipozyme TL-
catalyzed transesterification of soybean oil for biodiesel production. J Mol Catal B-Enzym.
2005;37:68-71.

144
168. Sjursnes BJ, Anthonsen T. Acyl migration on 1,2-dibutyrin dependence on solvent and
water activity. Biocatalysis. 1994;9:285-97.
169. Xu X. Enzymatic production of structured lipids: Process reactions and acyl migration.
Inform. 2000;11:1121-31.
170. Hernandez K, Garcia-Verdugo E, Porcar R, Fernandez-Lafuente R. Hydrolysis of triacetin
catalyzed by immobilized lipases: Effect of the immobilization protocol and experimental
conditions on diacetin yield. Enzyme Microb Tech. 2011;48(6-7):510-7.
171. Sonnet PE. Lipase selectivities. J Am Oil Chem Soc. 1988;65:900-5.
172. Akesson B, Gronowitz S, Herslof B, Michelsen P, Olivecrona T. Stereospecificity of
different lipases. Lipids. 1983;18:313-8.
173. Borgstrom B, Brockman HL. Lipases. New York: Elsevier Science Publishing Co. Inc.;
1984.
174. Rogalska E, Cudrey C, Ferrato F, Verger R. Stereoselective hydrolysis of triglycerides by
animal and microbial lipases. Chirality. 1993;5:24-30.
175. Bevinakatti HS, Banerji AA. Lipase catalysis: Factors governing transesterification.
Biotechnol Lett. 1988; 6:397-8
176. Cygler M, Grochulski P, Kazlauskas RJ, Scharg JD, Bouthillier F, Rubin B, Serreqi AN,
Gupta AK. A structural basis for the chiral preferences of lipases. J Am Chem Soc.
1994;116:3180-6.
177. Long K, Ghazali HM, Ariff A, Che Man Y, Bucke C. Substrate preference of mycelium-
bound lipase from a strain of Aspergillus flavus Link. Biotechnol Lett. 1998;20:369-72.
178. Borgdorf R, Warwel S. Substrate selectivity of various lipases in the esterification of cis-
and trans-octadecenoic acid. Appl Microbiol Biot. 1999;51:480-5.
179. Kuo S-J, Parkin KL. Substrate preferences for lipase mediated acyl-exchange reactions
with butter oil are concentration-dependent. J Am Oil Chem Soc. 1993;70:393-9.
180. Bosley JA, Casey J, Macrae AR, Mycock G. Process for the esterification of carboxylic
acids with tertiary alcohols using a lipase from Candida antarctica. 1997. US patent
5658769, vol. 5. p. 658-769.
181. O‘Hagan D, Zaidi NA. The resolution of tertiary α-acetylene-acetate esters by the lipase
from Candida cylindracea. Tetrahedron-Asymmetr. 1994;5:1111-8.
182. Yeo S-H, Nihira T, Yamada Y. Screening and identification of a novel lipase from
Bukholderia sp. YY62 which hydrolyses t-butyl esters effectively. Appl Microbiol Biot.
1998;51:480-5.
183. Chen C-S, Sih CJ. General aspects and optimization of enantioselective biocatalysis in
organic solvents: The use of lipases. Angew Chem Int Edit. 1989;28:695-708.
184. Ghanem A. Trends in lipase-catalyzed asymmetric access to enantiomerically
pure/enriched compounds. Tetrahedron. 2007;63:1721-54.
185. Gutman AL, Shapira M. Synthetic applications of enzymatic reactions in organic solvents.
In: Fiechter A, editor. Advances in biochemical engineering and biotechnology, vol 52.
Heidelberg: Springer; 1995. p. 87-128.
186. Hult K, Berglund P. Enzyme promiscuity: Mechanism and applications. Trends
Biotechnol. 2007;25:231-8.
187. O‘Brien PJ, Herschlag D. Catalytic promiscuity and evolution of new enzymatic activities.
Chem Biol. 1999;6:R91-105.
188. Wu Q, Liu B-K, Lin X-F. Enzyme promiscuity for organic synthesis and cascade process.
Curr Org Chem. 2010;14:1966-88.
189. Copley SD. Enzymes with extra talents: Moonlighting functions and catalytic promiscuity.
Curr Opin Chem Biol. 2003;7:265-72.
190. Babtie A, Tokuriki N, Hollfelder F. What makes an enzyme promiscuous. Curr Opin Chem
Biol. 2010;14:1-8.

145
191. Bornscheuer UT, Kazlauskas RJ. Catalytic promiscuity in biocatalysis: Using old enzymes
to form new bonds and follow new pathways. Angew Chem Int Edit. 2004;43:6032-40.
192. Kazlauskas RJ. Enhancing catalytic promiscuity for biocatalysis. Curr Opin Chem Biol.
2005;9:195-201.
193. Khersonsky O, Roodveldt C, Tawfik DS. Enzyme promiscuity: Evolutionary and
mechanistic aspects. Curr Opin Chem Biol. 2006;10:498-508.
194. Yasutake Y, Yao M, Sakai N, Kirita T, Tanaka I. Crystal structure of the Pyrococcus
horikoshii isopropylmalate isomerase small subunit provides insight into the dual substrate
specificity of the enzyme. J Mol Biol. 2004;344:325-33.
195. Busto E, Gotor-Fernandez V, Gotor V. Hydrolases: Catalytically promiscuous enzymes for
non-conventional reactions in organic synthesis. Chem Soc Rev. 2010;39:4504-23.
196. Gupta MN, Kapoor M, Majumder AB, Singh V. Isozymes, moonlighting proteins and
promiscuous enzymes. Curr Sci. 2011;100:1152-62.
197. Branneby C, Carlqvist P, Magnusson A, Hult K, Brinck T, Berglund P. Carbon-carbon
bonds by hydrolytic enzymes. J Am Chem Soc. 2003;125:874-5.
198. Svedendahl M, Hult K, Berglund P. Fast carbon-carbon bond formation by a promiscuous
lipase. J Am Chem Soc. 2005;127:1798-9.
199. Li C, Feng X-W, Wang N, Zhou Y-J, Yu X-Q. Biocatalytic promiscuity: The first lipase-
catalysed asymmetric aldol reaction. Green Chem. 2008;10:616-8.
200. Majumder AB, Ramesh NG, Gupta MN. Lipase catalyzed condensation reaction with a
tricyclic diketone - Yet another example of biocatalytic promiscuity. Tetrahedron Lett.
2009;50:5190-3.
201. Torre O, Alfonso I, Gotor V. Lipase catalysed Michael addition of secondary amines to
acrylonitrile. Chem Commun. 2004:1724-5.
202. Bjorkling F, Godtfredsen SE, Kirk O. Lipase-mediated formation of peroxycarboxylic
acids used in catalytic epoxidation of alkenes. J Chem Soc Chem Comm. 1990:1301-3.
203. Svedendahl M, Carlqvist P, Branneby C, Allner O, Frise A, Hult K, Berglund P, Brinck T.
Direct epoxidation in Candida antarctica lipase B studied by experiment and theory.
ChemBioChem. 2008;9:2443-51.
204. Wang L, Li C, Wang N, Li K, Chen X, Yu X-Q. Enzyme-mediated domino synthesis of 2-
alkylbenzimidazoles in solvent-free system: A green route to heterocyclic compound. J
Mol Catal B-Enzym. 2010;67:16-20.
205. Wu M-Y, Li K, He T, Feng X-W, Wang N, Wang X-Y, Yu X-Q. A novel enzymatic
tandem process: Utilization of biocatalytic promiscuity for high stereoselective synthesis of
5-hydroxyimino-4,5-dihydrofurans. Tetrahedron. 2011;67:2681-8.
206. Wang J-L, Liu B-K, Yin C, Wu Q, Lin X-F. Candida antarctica lipase B-catalyzed the
unprecedented three-component Hantzsch-type reaction of aldehyde with acetamide and
1,3-dicarbonyl compounds in non-aqueous solvent. Tetrahedron. 2011;67:2689-92.
207. Klibanov AM. Asymmetric transformations catalyzed by enzymes in organic solvents. Acc
Chem Res. 1990;23:114-20.
208. Soliman NA, Knoll M, Abdel-Fattah YR, Schmid RD, Lange S. Molecular cloning and
characterization of termostable esterase and lipase from Geobacillus thermoleovorans YN
isolated from desert soil in Egypt. Process Biochem. 2007;42:1090-100.
209. Bradoo S, Saxena RK, Gupta R. Partitioning and resolution of mixture of two lipases from
Bacillus stearothermophilus SB-1 in aqueous two-phase system. Process Biochem.
1999;35:57-62.
210. Lesuisse E, Schanck K, Colson C. Purification and preliminary characterization of the
extracellular lipase of Bacillus subtilis 168, an extremely basic pH-tolerant enzyme. Eur J
Biochem. 1993;216:155-60.

146
211. Capewell A, Wendel V, Bornscheuer U, Meyer HH, Scheper T. Lipase-catalyzed kinetic
resolution of 3-hydroxy esters in organic solvents and supercritical carbon dioxide.
Enzyme Microb Tech. 1996;19:181-6.
212. Majumder AB, Singh B, Dutta D, Sadhukhan S, Gupta MN. Lipase catalyzed synthesis of
benzyl acetate in solvent-free medium using vinyl acetate as acyl donor. Bioorg Med Chem
Lett. 2006; 16:4041-4.
213. Nunes PA, Pires-Cabral P, Ferreira-Dias S. Production of olive oil enriched with medium
chain fatty acids catalysed by commercial immobilized lipases. Food Chem. 2011;127:993-
8.
214. Sharma UK, Sharma N, Kumar R, Kumar R, Sinha AK. Biocatalytic promiscuity of lipase
in chemoselective oxidation of aryl alcohols/acetates: A unique synergism of CAL-B and
[hmim]Br for the metal-free H2O2 activation. Org Lett. 2009;11:4846-8.
215. Zhang K-P, Lai J-Q, Huang Z-L, Yang Z. Penicillium expansum lipase-catalyzed
production of biodiesel in ionic liquids. Bioresource Technol. 2011;102:2767-72.
216. Ulijn RV, Halling PJ. Solid to solid biocatalysis: Thermodynamic feasibility and energy
efficiency. Green Chem. 2004;6:488-96.
217. Antonini E, Carrea G, Cremonesi P. Enzyme catalyzed reactions in water-organic solvent
two-phase systems. Enzyme Microb Tech. 1981;3:291-6.
218. Lilly MD. Two-liquid-phase biocatalytic reactions. J Chem Technol Biot. 1982;32:162-9.
219. Semenov AN, Khmelnitski Yu L, Beresin IV. Water-organic solvent two-phase systems as
media for biocatalytic reactions: The potential for shifting chemical equilibria towards
higher yield of end products. Biocatalysis. 1987;1:3-8.
220. Tweddell RJ, Kermasha S, Combes D, Marty A. Esterification and interesterification
activities of lipases from Rhizopus niveus and Mucor miehei in three different types of
organic media: A comparative study. Enzyme Microb Tech. 1998;22:439-45.
221. Kim KH, Kwon DY, Rhee JS. Effects of organic solvents on lipase for fat splitting. Lipids.
1984;19(12):975-7.
222. Brink LES, Tramper J. Optimization of organic solvent in multiphase biocatalysis.
Biotechnol Bioeng. 1985;27(8):1258-69.
223. Hirose Y, Kaiya K, Sasaki T, Kurono Y, Ebiikef H, Achiwa K. Drastic solvent effect on
lipase catalysed enantioselective hydrolysis of prochiral 1,4-dihydropyridines. Tetrahedron
Lett. 1992;33:7157-60.
224. Rubio E, Fernandez-Mayorales A, Klibanov AM. Effect of solvent on enzyme
regioselectivity. J Am Chem Soc. 1991;113:696.
225. Terradas F, Teston-Henry M, Fitzpatrick PA, Klibanov AM. Marked dependence of
enzyme prochiral selectivity on the solvent. J Am Chem Soc. 1993;115:390-6.
226. Snellman EA, Sullivan ER, Colwell RR. Purification and properties of the extracellular
lipase, LipA, of Acinetobacter sp. RAG-1. FEBS J. 2002;269:5771-9.
227. Athawale V, Manjrekar N, Athawale M. Effect of reaction parameters on synthesis of
citronellyl methacrylate by lipase-catalyzed transesterification. Biotechnol Progr.
2003;19:298-302.
228. Hilal N, Kochkodan V, Nigmatullin R, Goncharuk V, Al-Khati L. Lipase-immobilized
biocatalytic membranes for enzymatic esterification: Comparison of various approaches to
membrane preparation. J Membrane Sci. 2006;268:198-207.
229. Hilal N, Nigmatullin R, Alpatova A. Immobilization of cross-linked lipase aggregates
within microporous polymeric membranes. J Membrane Sci. 2004;238:131-41.
230. Ved JJ, Pai JS. Preparation of short chain esters by the lipase from Mucor miehei using
heptane and silica gel. Biotechnol Technol. 1996;10:855-6.

147
231. Keng PS, Basri M, Zakaria MRS, Abdul Rahman MB, Ariff AB, Abdul Rahman RNZ,
Salleh AB. Newly synthesized palm esters for cosmetics industry. Ind Crop Prod.
2009;29:37-44.
232. Dhake KP, Tambade PJ, Qureshi RS, Bhanage BM. HPMC-PVA film immobilized
Rhizopus oryzae lipase as a biocatalyst for transesterification reaction. ACS Catal.
2011;1:316-22.
233. Bezbradica D, Mijin D, Marinkovic SS, Knezevic Z. The effect of substrate polarity on the
lipase-catalyzed synthesis of aroma esters in solvent-free systems. J Mol Catal B-Enzym.
2007;45:97-101.
234. Romero MD, Calvo L, Alba C, Daneshfar A. A kinetic study of isoamyl acetate synthesis
by immobilized lipase-catalyzed acetylation in n-hexane. J Biotechnol. 2007;127:269-77.
235. Wolfson A, Atyya A, Dlugy C, Tavor D. Glycerol triacetate as solvent and acyl donor in
the production of isoamyl acetate with Candida antarctica lipase B. Bioprocess Biosyst
Eng. 2010;33:363-6.
236. Castro HF, Oliveira PC, Pereira EB. Evaluation of different strategies for lipase catalysed
synthesis of citronellyl acetate. Biotechnol Lett. 1997;9:229-32.
237. Ikeda Y, Kurokawa Y. Synthesis of geranyl acetate by lipase entrap-immobilized in
cellulose acetate-TiO2 gel fiber. J Am Oil Chem Soc. 2001;78:1099-103.
238. Yadav GD, Borkar I. Kinetic and mechanistic investigation of mikrowave-assisted lipase
catalyzed synthesis of citronellyl acetate. Ind Eng Chem Res. 2009;48:7915-22.
239. Yadav GD, Lathi PS. Synthesis of citronellol laurate in organic media catalyzed by
immobilized lipases: Kinetic studies. J Mol Catal B-Enzym. 2004;27:113 –9.
240. Oxenbøll K, Ernst S. Environment as a new perspective on the use of enzymes in the food
industry. Food Sci Technol. 2008;22:45-7.
241. Gupta R, Rathi P, Bradoo S. Lipase mediated upgradation of dietary fats and oils. Crit Rev
Food Sci. 2003;43(6):635-44.
242. Iding H, Siegert P, Mesch K, Pohl M. Application of alpha-keto acid decarboxylases in
biotransformations. Biochim Biophys Acta. 1998;1385:307-22.
243. Bonratval.W, Karge R, Netscher T. Lipase-catalyzed transformations as key-steps in the
large-scale preparation of vitamins. J Mol Catal B-Enzym. 2002;19-20:67-72.
244. Starodub NF. Biosensors for the evaluation of lipase activity. J Mol Catal B-Enzym.
2006;40:155-60.
245. Svedsen A, Clausen IG, Patkar SA, Borch K, Thellersen M. Protein engineering of
microbial lipases of industrial interest. Methods Enzymol. 1997.
246. Novak J, Kralova B, Demnerova K, Prochazka K, Vodrazka Z, Tolman J, Rysova D,
Smidrkal J, Lopata V. Enzyme agent based on lipases and oxireductases for washing,
degreasing and water reconditioning. European Patent 355,228 (1990).
247. Sharma R, Chisti Y, Banerjee UC. Production, purification, characterization, and
applications of lipases. Biotechnol Adv. 2001;19:627-62.
248. Li S, Li J, Yi J, Shan Z. Cleaner beam house process trial on cattle sofa leather. J Clean
Prod. 2010;18:471-7.
249. Bajpai P. Application of enzymes in the pulp and paper industry. Biotechnol Progr.
1999;15(2):147-57.
250. Jeganathan J, Nakhl G, Bassi A. Hydrolytic pretreatment of oily wastewater by
immobilized lipase. J Hazard Mater. 2007;145(1-2):127-35.
251. Gui MM, Lee KT, Bhatia S. Feasibility of edible oil vs. non-edible oil vs. waste edible oil
as biodiesel feedstock. Energy. 2008;33(11):1646-53.
252. Yan Y, Li X, Wang G, Gui X, Li G, Su F, Wang X, Liu T. Biotechnological preparation of
biodiesel and its high-valued derivatives: A review. Appl Energ. 2014;113:1614-31.

148
253. Kafuku G. Mbarawa M. Alkaline catalyzed biodiesel production from Moringa oleifera oil
with optimized production parameters. Appl Energ. 2010;87(8):2561-5.
254. Talebian-Kiakalaieh A, Amin NAS, Mazaheri H. A review on novel processes of biodiesel
production from waste cooking oil. Appl Energ. 2013;104:683-710.
255. Shariff FM, Rahman RNZRA, Ali MSM, Chor ALT, Basri M, Salleh AB. Crystallization
and preliminary X-ray crystallographic analysis of highly thermostable L2 lipase from the
newly isolated Bacillus sp. L2. Acta Crystallogr F. 2010;66:715-7.
256. Yusuf NNAN, Kamarudin SK, Yaakub Z. Overview on the current trends in biodiesel
production. Energ Convers Manage. 2011;52:2741-51.
257. Agarwal AK, Das LM. Biodiesel development and characterisation for use as a fuel in
compression ignition engines. J Eng Gas Turb Power. 2001;123:440-7.
258. Demirbas A. Biodiesel production via non-catalytic SCF method and biodiesel fuel
characteristics. Energ Convers Manage. 2006;47(15-16):2271-82.
259. Demirbas A. Relationships derived from physical properties of vegetable oil and biodiesel
fuels. Fuel. 2008;87:1743-8.
260. Huang G, Chen F, Wei D, Zhang X, Chen G. Biodiesel production by microalgal
biotechnology. Appl Energ. 2010;87(1):38-46.
261. Huang Y, Zheng H, Yan YJ. Optimization of lipase-catalyzed transesterification of lard for
biodiesel production using response surface methodology. Appl Biochem Biotech.
2010;160:504-15.
262. Demirbas A. Comparison of transesterification methods for production of biodiesel from
vegetable oils and fats. Energ Convers Manage. 2008;49:125-30.
263. Andrade JE, Perez A, Sebastian PJ, Eapen D. A review of biodiesel production processes.
Biomass Bioenerg. 2011;35(3):1008-20.
264. Chincholkar SP, Srivastava S, Rehman A, Dixit S, Lanjewar A. Biodiesel as an alternative
fuel for pollution control in diesel engine. Asian J Exp Sci. 2005;19(2):13-22.
265. Lapuerta M, Armas O, Rodríguez-Fernández J. Effect of biodiesel fuels on diesel engine
emissions. Prog Energ Combust. 2008;34(2):198-223.
266. Leduc S, Natarajan K, Dotzauer E, McCallum I, Obersteiner M. Optimizing biodiesel
production in India. Appl Energ. 2009;86(S1):S125-31.
267. Lee SB, Lee JD, Hong IK. Ultrasonic energy effect on vegetable oil based biodiesel
synthetic process. J Ind Eng Chem. 2011;17(1):138-43.
268. Wu X, Leung DYC. Optimization of biodiesel production from camelina oil using
orthogonal experiment. Appl Energ. 2011;88:3615-24.
269. Srivastava A, Prasad R. Triglycerides-based diesel fuels. Renew Sust Energ Rev. 2000;
4:111-33.
270. Vincente G, Coteron A, Martinez M, Aracil J. Application of factorial design of
experiments and response surface methodology to optimize biodiesel production. Ind Crop
Prod. 1998;8:29-35.
271. Janulis P, Makarevičienė V. Environmental effect of rapeseed oil ethyl ester. Renew Energ.
2003;28:2395-403.
272. Vincente G, Martinez M, Aracil J. Integrated biodiesel production: A comparison of
different homogeneous catalysts systems. Bioresource Technol. 2004;92:297-305.
273. Ramadhas AS, Jayaraj S, Muraleedharan C. Use of vegetable oils as I.C. engine fuels – A
review. Renew Energ. 2004;29:727-42.
274. Boehman AL. Foreward – Biodiesel production and processing. Fuel Process Technol.
2005;86:1057-8.
275. Keskin A, Gürü M, Altiparmak D, Aydin K. Using of cotton oil soapstock biodiesel–diesel
fuel blends as an alternative diesel fuel. Renew Energ. 2008;33:553-7.

149
276. Brennan L, Owende P. Biofuels from microalgae - A review of technologies for
production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renew Sust Energ
Rev. 2010;14:557-77.
277. Naik SN, Goud VV, Rout PK, Dalai AK. Production of first and second generation
biofuels: A comprehensive review. Renew Sust Energ Rev. 2010;14:578-97.
278. Leung DYC, Guo Y. Transesterification of neat and used frying oil: Optimization for
biodiesel production. Fuel Process Technol. 2006;87:883-90.
279. Meka PK, Tripathi V, Singh RP. Synthesis of biodiesel fuel from safflower oil using
various reaction parameters. J Oleo Sci. 2007;56:9-12.
280. Balat M, Balat H. Progress in biodiesel processing. Appl Energ. 2010;87(6):1815-35.
281. Lian S, Li H, Tang J, Tong D, Hu C. Integration of extraction and transesterification of
lipid from Jatropha seeds for production of biodiesel. Appl Energ. 2012;98:540-7.
282. Fukuda H, Kondo A, Noda H. Biodiesel fuel production by transesterification of oils. J
Biosci Bioeng. 2001;92:405–16.
283. Sharma YC, Singh B. Development of biodiesel from karanja, a tree found in rural India.
Fuel. 2008;67:1740-2.
284. Sree R, Babu S, Prasad SPS, Lingaia N. Transesterification of edible and non-edible oils
over basic solid Mg/Zr catalysts. Fuel Process Technol. 2009;90:152-7.
285. Chisti Y. Biodiesel production from microalgae. Biotechnol Adv. 2007;25:294-306.
286. Ma F, Hanna MA. Biodiesel production: A review. Bioresource Technol. 1999;70:1-15.
287. Bajaj A, Lohan P, Jha PN, Mehrotra R. Biodiesel production through lipase catalyzed
transesterification: An overview. J Mol Catal B-Enzym. 2010;62:9-14.
288. Sinha S, Agarwal AK, Garg S. Biodiesel development from rice bran oil:
Transesterification process optimization and fuel characterization. Energ Convers Manage.
2008;49:1248-57.
289. Suehara K, Kawamoto Y, Fujii E, Kohda J, Nakano Y, Yano T. Biological treatment of
wastewater discharged from biodiesel fuel production plant with alkali-catalyzed
transesterification. J Biosci Bioeng. 2005;100(4):437-42.
290. Basri M, Heng AC, Razak CNA, Wan Yunus WMZ, Ahmad M, Rahman RNA, Ampon K,
Salleh AB Alcoholysis of palm oil mid-fraction by lipase from Rhizopus rhizopodiformis. J
Am Oil Chem Soc. 1997;74:113–6.
291. Chen JW, Wu WT. Regeneration of immobilized Candida antarctica lipase for
transesterification. J Biosci Bioeng. 2003;95:466–9.
292. Vasudevan PT, Briggs M. Biodiesel production – Current state of the art and challenges. J
Ind Microbiol Biot. 2008;A35:421-30.
293. Vyas AP, Verma JL, Subrahmanyam N. A review on FAME production process. Fuel.
2010;89:1-9.
294. Saka S, Kusdiana D. Biodiesel fuel from rapeseed oil as prepared in supercritical methanol.
Fuel. 2001;80(2):225-31.
295. He HY, Sun SY, Wang T, Zhu SL. Transesterification kinetics of soybean oil for
production of biodiesel in supercritical methanol. J Am Oil Chem Soc. 2007;84(4):399-
404.
296. Saka S, Kusdiana D, Minami E. Non-catalytic biodiesel fuel production with supercritical
methanol technologies. J Sci Ind Res. 2006;65(5):420-5.
297. Enweremadu CC, Mbarawa MM. Technical aspects of production and analysis of biodiesel
from used cooking oil – A review. Renew Sust Energ Rev. 2009;12-13(9):2205-24.
298. Knothe G. Biodiesel and renewable diesel: A comparison. Prog Energ Combust.
2010;36:364-73.
299. Dunn RO. Effects of minor constituents on cold flow properties and performance of
biodiesel. Prog Energ Combust. 2009;35:481-9.

150
300. Akoh CC, Chang S, Lee G, Shaw J. Enzymatic approach to biodiesel production. J Agr
Food Chem. 2007;55:8995-9005.
301. Pinto AC, Lilian LN, Guarieiroa LLN, Rezendea MJC, Ribeiroa NM. Biodiesel: An
overview. J Brazil Chem Soc. 2005;16:1313-30.
302. Knothe G. Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl
esters. Fuel Process Technol. 2005;86:1059-70.
303. Janaun J, Ellis N. Perspectives on biodiesel as a sustainable fuel. Renew Sust Energ Rev.
2010;14:1312-20.
304. Marchetti JM. Miguel VU. Errazu AF. Technoeconomic study of different alternatives for
biodiesel production. Fuel Process Technol. 2008;89(8):740-8.
305. Chisti Y, Yan J. Energy from algae: Current status and future trends: Algal biofuels – a
status report. Appl Energ. 2011;88(10):3277-9.
306. Ganapathy T, Murugesan K, Gakkhar RP. Performance optimization of Jatropha biodiesel
engine model using Taguchi approach. Appl Energ. 2009;86:2476-86.
307. Hama S, Kondo A. Enzymatic biodiesel production: An overview of potential feedstocks
and process development. Bioresource Technol. 2013;135:386-95.
308. Montefrio MJ, Xinwen T, Obbard JP. Recovery and pre-treatment of fats, oil and grease
from grease interceptors for biodiesel production. Appl Energ. 2010;87(10):3155-61.
309. Sánchez A, Maceiras R, Cancela A, Pérez A. Culture aspects of Isochrysis galbana for
biodiesel production. Appl Energ. 2013;101:192-7.
310. Rodrigues RC, Volpato G, Wada K, Ayub MAZ. Enzymatic synthesis of biodiesel from
transesterification reactions of vegetable oils and short chain alcohols. J Am Oil Chem Soc.
2008;85:925-30.
311. Cao P, Dubé MA, Tremblay AY. High-purity fatty acid methyl ester production from
canola, soybean, palm, and yellow grease lipids by means of a membrane reactor. Biomass
Bioenerg. 2008;32:1028-36.
312. Knothe G. Current perspectives on biodiesel. Inform. 2002;13:900-3.
313. Demirbas A. Biodiesel production from vegetable oils via catalytic and non-catalytic
supercritical methanol transesterification methods. Prog Energ Combust. 2005;31:466-87.
314. Sumathi S, Chai SP, Mohamed AR. Utilization of palm as a source of renewable energy in
Malaysia. Renew Sust Energ Rev. 2008;12(9):2404-21.
315. Santosa SJ. Palm oil boom in Indonesia: From plantation to downstream products and
biodiesel. Clean Soil Air Water. 2008;36(5-6):453-65.
316. Pinzi S, Garcia IL, Lopez-Gimenez FJ, Luque de Castro MD, Dorado G, Dorado MP. The
ideal vegetable oil-based biodiesel composition: A review of social, economical and
technical implications. Energ Fuel. 2009;23(5):25-41.
317. Achten WMJ, Maes WH, Aerts R, Verchot L, Trabucco A, Mathijs E, Singh VP, Muys B.
Jatropha: From global hype to local opportunity. J Arid Environ. 2010;74:164-5.
318. GuanHua H, Chen F, Wei D, Zhang XW, Chen G. Biodiesel production by microalgal
biotechnology. Appl Energ. 2010;87:38-46.
319. Mata TM, Martins AA, Caetano NS. Microalgae for biodiesel production and other
applications: A review. Renew Sust Energ Rev. 2010;14:217-32.
320. Demirbas A. Use of algae as biofuel sources. Energ Convers Manage. 2010;51:2738-49.
321. Oswald WJ. My sixty years in applied algology. J Appl Phycol. 2003;15:99-106.
322. Oswald WJ, Gotaas HB, Ludwig HF, Lynch V. Algae symbiosis in oxidation ponds.
Photosynthetic oxygenation. Sewage and Industrial Wastes. 1953;25(6):692-705.
323. Mulbry W, Westhead EK, Pizarro C, Sikora L. Recycling of manure nutrients: Use of algal
biomass from dairy manure treatment as a slow release fertilizer. Bioresource Technol.
2005;96:451-8.

151
324. Demirbas A, Demirbas MF. Importance of algae oil as a source of biodiesel. Energ
Convers Manage. 2011;52:163-70.
325. Golueke CG, Oswald WJ, Gotaas HB. Anaerobic digestion of algae. Appl Microbiol.
1957;5(1):47-55.
326. Thompson GA. Lipids and membrane function in green algae. Biochim Biophys Acta.
1996;1306:17-45.
327. Chisti Y. Biodiesel from microalgae beats bioethanol. Trends Biotechnol. 2008;26(3):126-
31.
328. Chisti Y. Response to Reijnders: Do biofuels from microalgae beat biofuels from terrestrial
plants? Trends Biotechnol. 2008;26:351–2.
329. Daroch M, Geng S, Wang G. Recent advances in liquid biofuel production from algal
feedstocks. Appl Energ. 2013;102:1371-81.
330. Erickson BE. Dioxin food crisis in Belgium. Anal Chem. 1999;71:541-3.
331. Marmesat S, Macado RE, Velasco J, Dorbangarnes MC. Used frying fats and oils.
Comparison of rapid tests based on chemical and physical oil properties. Int J Food Sci
Tech. 2007;42:601-8.
332. Jacobson K, Gopinath R, Meher LC, Dalai AK. Solid acid catalyzed biodiesel production
from waste cooking oil. Appl Catal B-Environ. 2008;85:86-91.
333. Zhang Y, Dube MA, McLean DD, Kates M. Biodiesel production from waste cooking oil:
1. Process design and technological assessment. Bioresource Technol. 2003;89:1-16.
334. Sanchez F, Vasudevan PT. Enzyme catalyzed production of biodiesel from olive oil. Appl
Biochem Biotech. 2006;135:1-14.
335. Shimada Y, Watanabe Y, Sugihara A, Tominaga Y. Enzymatic alcoholysis for biodiesel
fuel production and application of the reaction to oil processing. J Mol Catal B-Enzym.
2002;17:133-42.
336. Tashtoush GM, Al-Widyan MI, Al-Jarrah MM. Experimental study on evaluation and
optimization of conversion of waste animal fat into biodiesel. Energ Convers Manage.
2004;45:2697-711.
337. Gressel J. Transgenics are imperative for biofuel crops. Plant Sci. 2008;174(3):246-63.
338. Sticklen M. Plant genetic engineering to improve biomass characteristics for biofuels. Curr
Opin Biotech. 2006;17(3):3115-9.
339. Schuchardt U, Sercheli R, Vargas RM. Transesterification of vegetable oils: A review. J
Brazil Chem Soc. 1998; 9:199-210.
340. Demirbas A. Competitive liquid biofuels from biomass. Appl Energ. 2011;88:17-28.
341. Köse Ö, Tüter M, Aksoy HA. Immobilized Candida antarctica lipase-catalyzed
alcoholysis of cotton seed oil in a solvent-free medium. Bioresource Technol. 2002;83:125-
9.
342. Baron AM, Barouh N, Barea B, Villeneuve P, Mitchell DA, Krieger N. Transesterification
of castor oil in a solvent-free medium using lipase from Burkholderia cepacia LTEB11
immobilized on a hydrophobic support. Fuel. 2014;117:458-62.
343. Hideki F, Akihiko K, Hideo N. Biodiesel fuel production by transesterification of oils. J
Biosci Bioeng. 2001;92:405-16.
344. Liu KS. Preparation of fatty acid methyl esters for gas chromatographic analysis of lipids
in biological materials. J Am Oil Chem Soc. 1994;71:1179-87.
345. Atadashi IM, Aroua MK, Abdul Aziz AR, Sulaiman NMN. The effects of catalysts in
biodiesel production: A review. J Ind Eng Chem. 2013;19:14-26.
346. Freedman B, Pryde EH, Mounts TL. Variables affecting the yields of fatty esters from
transesterified vegetable oils. J Am Oil Chem Soc. 1984;61(10):1638-43.
347. Hara M. Environmentally benign production of biodiesel using heterogeneous catalysts.
ChemSusChem. 2009;2(2):129-35.

152
348. Marchetti JM, Errazu AF. Comparison of different heterogeneous catalysts and different
alcohols for the esterification reaction of oleic acid. Fuel. 2008;87:3477-80.
349. Chongkhong S, Tongurai C, Chetpattananondh P. Continuous esterification for biodiesel
production from palm fatty acid distillate using economical process. Renew Energ.
2009;34:1059-63.
350. Fan X, Burton R, Austic G. Preparation and characterization of biodiesel produced from
recycled canola oil. Open Fuels Energy Sci J. 2009;2:113-8.
351. Encinar JM, Juan F, Gonzalez JF, Rodriguez-Reinares A. Ethanolysis of used frying oils:
Biodiesel preparation and characterization. Fuel Process Technol. 2007;88(5):513-22.
352. Ramadhas AS, Jayaraj S, Muraleedharan C. Biodiesel production from high FFA rubber
seed oil. Fuel. 2005;84:335-40.
353. Casimir CA, Shu-wei C, Guan-chiun L, Shaw J. Enzymatic approach to biodiesel
production. J Agr Food Chem. 2007;55:8995-9005.
354. Watanabe Y, Shimada Y, Sugihara A, Noda H, Fukuda H, Tominaga Y. Continuous
production of biodiesel fuel from vegetable oil using immobilized Candida antarctica
lipase. J Am Oil Chem Soc. 2000;77:355-60.
355. Roy I, Gupta A, Khare SK, Bisaria VS, Gupta MN. Immobilization of xylan degrading
enzymes from Melanocarpus albomyces IIS 68 on the smart polymer eudragit L-100. Appl
Microbiol Biot. 2003;61:309-13.
356. Shah S, Gupta MN. Lipase catalyzed preparation of biodiesel from Jatropha oil in solvent-
free system. Process Biochem. 2007;42:409-14.
357. Salis A, Pinna M, Monduzzi M, Solinas V. Comparison among immobilised lipases on
macroporous polypropylene toward biodiesel synthesis. J Mol Catal B-Enzym. 2008;54:19-
26.
358. Akin O, Temelli F, Köseoğlu S. Membrane applications in functional foods and
nutraceuticals. Crit Rev Food Sci. 2012;52:347-71.
359. De Souza MP, Cunha Petrus JC, Guaraldo Gonçalves LA. Degumming of corn oil/hexane
miscella using ceramic membrane. J Food Eng. 2008;86:557-64.
360. Bousquet-Dubouch MP, Graber M, Sousa N, Lamare S, Legoy MD. Alcoholysis catalyzed
by Candida antarctica lipase B in a gas/solid system obeys a ping pong bi bi mechanism
with competitive inhibition by the alcohol substrate and water. Biochim Biophys Acta –
Protein Structure and Molecular Enzymology. 2001;1550:90-9.
361. Kulschewski T, Sasso F, Secundo F, Lotti M, Pleiss J. Molecular mechanism of
deactivation of C. antarctica lipase B by methanol. J Biotechnol. 2013;168:462-9.
362. Liu T, Liu Y, Wang X, Li Q, Wang J, Yan Y. Improving catalytic performance of
Burkholderia cepacia lipase immobilized on macroporous resin NKA. J Mol Catal B-
Enzym. 2011;71:45-50.
363. Liu Y, Liu T, Wang XF, Xu L, Yan YL. Biodiesel synthesis catalyzed by Burkholderia
cenocepacia lipase supported on macroporous resin NKA in solvent-free and isooctane
systems. Energ Fuel. 2011;25:1206-12.
364. Iso M, Chen B, Eguchi M, Kudo T, Shrestha S. Production of biodiesel fuel from
triglycerides and alcohol using immobilized lipase. J Mol Catal B-Enzym. 2001;16:53-8.
365. Yang J, Zhang B, Yan Y. Cloning and expression of Pseudomonas fluorescens 26-2 lipase
gene in Pichia pastoris and characterizing for transesterification. Appl Biochem Biotech.
2009;159:355-65.
366. Lee KW, Min K, Park K, Yoo YJ. Development of an amphiphilic matrix for
immobilization of Candida antarctica lipase B for biodiesel production. Biotechnol
Bioproc Eng 2010;15:603-7.

153
367. Shao P, Meng XH, He JZ, Sun PL. Analysis of immobilized Candida rugosa lipase
catalyzed preparation of biodiesel from rapeseed soapstock. Food Bioprod Process.
2008;86:283-9.
368. Sim JH, Kamaruddin AH, Bhatia S. Biodiesel (FAME) productivity, catalytic efficiency
and thermal stability of Lipozyme TL IM for crude palm oil transesterification with
methanol. J Am Oil Chem Soc. 2010;87:1027-34.
369. Li Z, Li X, Wang Y, Wang Y, Wang F, Jiang J. Expression and characterization of
recombinant Rhizopus oryzae lipase for enzymatic biodiesel production. Bioresource
Technol. 2011;102:9810-3.
370. Yan J, Yan Y, Liu S, Hu J, Wang G. Preparation of cross-linked lipase-coated micro-
crystals for biodiesel production from waste cooking oil. Bioresource Technol.
2011;102:4755-8.
371. Moreira A, Perez VH, Zanin GM, de Castro HF. Biodiesel synthesis by enzymatic
transesterification of palm oil with ethanol using lipases from several sources immobilized
on silica-PVA composite. Energ Fuel. 2007;21:3689-94.
372. Hama S, Yamaji H, Kaieda M, Oda M, Kondo A, Fukuda H. Effect of fatty acid membrane
composition on whole-cell biocatalysts for biodiesel-fuel production. Biochem Eng J.
2004;21:155-60.
373. Shimada Y, Watanabe Y, Samukawa T, Sugihara A, Noda H, Fukuda H, Tominaga Y.
Conversion of vegetable oil to biodiesel using immobilized Candida antarctica lipase. J
Am Oil Chem Soc. 1999;76:789-93.
374. Li Q, Zheng J, Yan Y. Biodiesel preparation catalyzed by compound-lipase in co-solvent.
Fuel Process Technol. 2010;91:1229-34.
375. Royon D, Daz M, Ellenrieder G, Locatelli S. Enzymatic production of biodiesel from
cotton seed oil using t-butanol as a solvent. Bioresource Technol. 2007;98:648-53.
376. Li X, He X, Li Z. Enzymatic production of biodiesel from Pistacia chinensis bge seed oil
using immobilized lipase. Fuel. 2012;92(1):89-93.
377. Anderson EM, Larsson KM, Kirk O. One biocatalyst – many applications: The use of
Candida antarctica B - Lipase in organic synthesis. Biocatal Biotransfor. 1998;16:181-204.
378. Ghamguia H, Karra Châabouni M, Gargouri Y. 1-Butyl oleate synthesis by immobilized
lipase from Rhizopus oryzae: A comparative study between n-hexane and solvent-free
system. Enzyme Microb Tech. 2004;35:355-63.
379. Dossat V, Combes D, Marty A. Continuous enzymatic transesterification of high oleic
sunflower oil in a packed bed reactor: Influence of the glycerol production. Enzyme
Microb Tech. 1999;25:194-200.
380. Li L, Du W, Liu D, Wang L, Li Z. Lipase-catalyzed transesterification of rapeseed oils for
biodiesel production with a novel organic solvent as the reaction medium. J Mol Catal B-
Enzym. 2006;43:58-62.
381. Wang L, Du W, Liu D, Li L, Dai N. Lipase-catalyzed biodiesel production from soybean
oil deodorizer distillate with absorbent present in tert-butanol system. J Mol Catal B-
Enzym. 2006;43:29-32.
382. Kumari A, Mahapatra P, Garlapati VK, Banerjee R. Enzymatic transesterification of
Jatropha oil. Biotechnol Biofuels. 2009;2:1.
383. Du W, Liu D, Li L, Dai L. Mechanism exploration during lipase-mediated methanolysis of
renewable oils for biodiesel production in a tert-butanol system. Biotechnol Progr.
2007;5:1087-90.
384. Türkan A, Kalay Ş. Study of the mechanism of lipase-catalyzed methanolysis of sunflower
oil in tert-butanol and heptane. Turk J Biochem. 2008;33(2):45-9.
385. Fuentes G, Ballesteros A, Verma CS. Specificity in lipases: A computational study of
transesterification of sucrose. Protein Sci. 2004;1:3092-103.

154
386. Garcia-Alles L, Gotor V. Alcohol inhibition and specificity studies of lipase B from
Candida antarctica in organic solvents. Biotechnol Bioeng. 1998;59:163-70.
387. Garcia-Alles L, Gotor V. Lipase-catalyzed transesterification in organic media: Solvent
efects on equilibrium and individual rate constants. Biotechnol Bioeng. 1998;59:684-94.
388. Lu J, Deng I, Zhao R, Zang R, Wang F, Tan T. Pretreatment of immobilized Candida sp.
99-125 lipases to improve its methanol tolerance for biodiesel production. J Mol Catal B-
Enzym. 2010;62:15-8.
389. Samukawa T, Kaieda M, Matsumoto T, Ban K, Kondo A, Shimada Y, Noda H, Fukuda H.
Pretreatment of immobilized Candida antarctica lipase for biodiesel fuel production from
plant oil. J Biosci Bioeng. 2000;90:180-3.
390. Al-Zuhair S, Jayaraman KV, Krishnan S, Chan YH. The effect of fatty acid concentration
and water content on the production of biodiesel by lipase. Biochem Eng J. 2006;30:212-7.
391. Du W, Wang L, Liu D. Improved methanol tolerance during Novozym 435-mediated
methanolysis of SODD for biodiesel production. Green Chem. 2007;9:173-6.
392. Kaieda M, Samukawa T, Kondo A, Fukuda H. Effect of methanol and water contents on
production of biodiesel fuel from plant oil catalyzed by various lipases in a solvent-free
system. J Biosci Bioeng. 2001;91:12-5.
393. Du W, Xu Y, Liu D, Zeng J. Comparative study on lipase-catalyzed transformation of
soybean oil for biodiesel production with different acyl acceptors. J Mol Catal B-Enzym.
2004;30(3-4):125-9.
394. Parawira W. Biotechnological production of biodiesel fuel using biocatalysed
transesterification: A review. Crit Rev Biotechnol. 2009;29(2):82-93.
395. Zieba A, Matachowski L, Lalik E, Drelinkiewicz A. Methanolysis of castor oil catalysed
by solid potassium and cesium salts of 12-tungstophosphoric acid. Catal Lett.
2008;127:183-94.
396. Sánchez-García A, Moreno-Pérez AJ, Muro-Pastor AM, Salas JJ, Garcés R, Martínez-
Force E. Acyl-ACP thioesterases from castor (Ricinus communis L.): An enzymatic system
appropiate for high rates of oil synthesis and accumulation. Phytochemistry. 2010;71:860-
9.
397. Maleki E, Aroua MK, Sulaiman NMN. Improved yield of solvent free enzymatic
methanolysis of palm and jatropha oils blended with castor oil. Appl Energ. 2013;104:905-
9.
398. Thomas TP, Birney DM, Auld DL. Viscosity reduction of castor oil esters by the addition
of diesel, safflower oil esters and additives. Ind Crop Prod. 2012;36:267-70.
399. Ozcanli M, Serin H, Aydin K, Serin S. Ricinus communis (castor oil) methyl ester as a
natural additive for biodiesel fuels. Energy Educ Sci Tech-A. 2011;27:331-6.
400. Saribiyik OY, Ozcanli M, Serin H, Serin S, Aydin K. Biodiesel production from Ricinus
communis oil and its blends with soybean biodiesel. Strojinski Vestnik-J Mech Eng.
2010;56:811-6.
401. Kaieda M, Samukawa T, Matsumoto T, Ban K, Kondo A, Shimada Y, Noda H, Nomoto F,
Ohtsuka K, Izumoto E, Fukuda H. Biodiesel fuel production from plant oil catalyzed by
Rhizopus oryzae lipase in a water-containing system without an organic solvent. J Biosci
Bioeng. 1999;88:627-31.
402. Noureddini H, Gao X, Philkana RS. Immobilized Pseudomonas cepacia lipase for
biodiesel fuel production from soybean oil. Bioresource Technol. 2005;96:769-77.
403. Volkin DB, Staubli A, Langer R, Klibanov AM. Enzyme thermo inactivation in anhydrous
organic solvents. Biotechnol Bioeng. 1991;37:843-53.
404. Yoshida A, Hama S, Nakashima K, Kondo A. Water activity dependence of performance
of surface-displayed lipase in yeast cells: A unique water requirement for enzymatic
synthetic reaction in organic media. Enzyme Microb Tech. 2011;48:334-8.

155
405. Nelson LA, Foglia TA, Marmer WN. Lipase catalyzed production of biodiesel. J Am Oil
Chem Soc. 1996;73:1191-5.
406. Fehér E, Major B, Bélafi-Bakó K, Gubicza L. Semi-continuous enzymatic production and
membrane assisted separation of isoamyl acetate in alcohol — Ionic liquid biphasic system.
Desalination. 2009;241;8-13.
407. Fonteyn F, Blecker C, Lognay G, Marlier M, Severin M. Optimization of lipase-catalyzed
synthesis of citronellyl acetate in solvent-free medium. Biotechnol Lett. 1994;16:693-6.
408. Kamini NR, Iefuji H. Lipase catalyzed methanolysis of vegetable oils in aqueous medium
by Cryptococcus spp. S-2. Process Biochem. 2001;37:405-10.
409. Foresti ML, Ferreira ML. Solvent-free ethyl oleate synthesis mediated by lipase from
Candida antarctica B adsorbed on polypropylene powder. Catal Today. 2005;107-8:23-30.
410. Liou YC, Marangoni AG, Yada RY. Aggregation behaviour of Candida rugosa lipase.
Food Res Int. 1998;31:243-8.
411. Liu Y, Yan Y, Hu F, Yao A, Wang Z, Wei F. Transesterification for biodiesel production
catalyzed by combined lipases: Optimization and kinetics. AlChE J. 2010;56:1659-65.
412. Stamenkovic OS, Velickovic AV, Veljkovic VB. The production of biodiesel from
vegetable oils by ethanolysis: Current state and perspectives. Fuel. 2011;90:3141-55.
413. Wang Y, Zhang LH. Ectoine improves yield of biodiesel catalyzed by immobilized lipase.
J Mol Catal B-Enzym. 2010;62:91-6.
414. Degn P, Zimmermann W. Optimization of carbohydrate fatty acid ester synthesis in
organic media by a lipase from Candida antarctica. Biotechnol Bioeng. 2001;74:483-91.
415. Laane C, Boeren S, Vos K, Veeger C. Rules for optimization of biocatalysis in organic
solvents. Biotechnol Bioeng. 1987;30:81-7.
416. Zaks A, Klibanov AM. Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. J Biol Chem.
1988;263:3194-201.
417. Broos J, Visser AJWG, Engbersen JFJ, Verboom W, van Hoek A, Reinhoudt DN.
Flexibility of enzymes suspended in organic solvents probed by time-resolved fluorescence
anisotropy. Evidence that enzyme activity and enantioselectivity are directly related to
enzyme flexibility. J Am Chem Soc. 1995;117:12657-63.
418. Soumanou MM, Bornscheuer UT. Improvement in lipase-catalyzed synthesis of fatty acid
methyl esters from sunflower oil. Enzyme Microb Tech. 2003;33:97-103.
419. Camacho Páez B, Robles Medina A, Camacho Rubio F, González Moreno PA, Molina
Grima E. Modeling the effect of free water on enzyme activity in immobilized lipase-
catalyzed reactions in organic solvents. Enzyme Microb Tech. 2003;33:845-53.
420. Laane C, Boeren S, Vos K, Veeger C. Rules for optimization of biocatalysis in organic
solvents. Biotechnol Bioeng. 2009;102:2-8.
421. Herbst D, Peper S, Niemeyer B. Enzyme catalysis in organic solvents: Influence of water
content, solvent composition and temperature on Candida rugosa lipase catalyzed
transesterification. J Biotechnol. 2012;162:398-403.
422. Lu J, Nie K, Wang F, Tan T. Immobilized lipase Candida sp. 99-125 catalyzed
methanolysis of glycerol trioleate: Solvent effect. Bioresource Technol. 2008;99:6070-4.
423. Matsuda T, Kanamaru R, Watanabe K, Harada T, Nakamura K. Control on
enantioselectivity with pressure for lipase-catalyzed esterification in supercritical carbon
dioxide. Tetrahedron Lett. 2001;42:8319-21.
424. Knez Z. Enzymatic reactions in dense gases. J Supercrit Fluid. 2009;47:357-72.
425. Rathore V, Madras G. Synthesis of biodiesel from edible and non-edible oils in
supercritical alcohols and enzymatic synthesis in supercritical carbon dioxide. Fuel
2007;86:2650-9.

156
426. Lozano P, Bernal JM, Vaultier M. Towards continuous sustainable processes for enzymatic
synthesis of biodiesel in hydrophobic ionic liquids/supercritical carbon dioxide biphasic
systems. Fuel. 2011;90:3461-7.
427. van Rantwijk F, Sheldon RA. Biocatalysis in ionic liquids. Chem Rev. 2007;107(6):2757-
85.
428. Ma L, Persson M, Adlercreutz P. Water activity dependence of lipase catalysis in organic
media explains successful transesterification reactions. Enzyme Microb Tech.
2002;31:1024-9.
429. Lozano P, Piamtongkam R, Kohns K, De Diego T, Vaultierb M, Iborra JL. Ionic liquids
improve citronellyl ester synthesis catalyzed by immobilized Candida antarctica lipase B
in solvent-free media. Green Chem. 2007;9:780-4.
430. Gotor-Fernandez V, Gotor V. Use of lipases in organic synthesis. Industrial Enzymes.
2007. Chapter 18. 301-315.
431. Yu D, Tian L, Wu H, Wang S, Wang Y, Ma D, Fang X. Ultrasonic irradiation with
vibration for biodiesel production from soybean oil by Novozym 435. Process Biochem.
2010;45:519-25.
432. Kumar G, Kumar D, Poonam, Johari R, Singh CP. Enzymatic transesterification of
Jatropha curcas oil assisted by ultrasonication. Ultrason Sonochem. 2011;18:923-7.
433. Ros PC, Castro HF, Carvalho AK, Soares CM, Moraes FF, Zanin GM. Microwave-assisted
enzymatic synthesis of beef tallow biodiesel. J Ind Microbiol Biot. 2012;39:529-36.
434. Wang J, Huang Q, Huang F, Wang J, Huang Q. Lipase-catalyzed production of biodiesel
from high acid value waste oil using ultrasonic assistant. Chin J Biotechnol. 2007;23:1121-
8.
435. Barnard TM, Leadbeater NE, Boucher MB, Stencel LM, Wilhite BA. Continuous-flow
preparation of biodiesel using microwave heating. Energ Fuel. 2007;21:1777-81.
436. Groisman Y, Gedanken A. Continuous flow, circulating microwave system and its
application in nanoparticle fabrication and biodiesel synthesis. J Phys Chem C.
2008;112:8802-8.
437. Yu D, Wang C, Yin Y, Zhang A, Gao G, Fang X. A synergistic effect of microwave
irradiation and ionic liquids on enzyme-catalyzed biodiesel production. Green Chem.
2011;13:1869-75.
438. Hendrickson HS. Fluorescence-based assays of lipases, phospholipases, and other lipolytic
enzymes. Anal Biochem. 1994;219:1-8.
439. Smeltzer MS, Hart ME, Iandolo JJ. Quantitative spectrophotometric assay for
Staphylococcal lipase. Appl Environ Microb. 1992;58:2815-9.
440. Hernaiz MJ, Sanchez-Montero JM, Sinisterra JV. Influence of the nature of modifier in the
enzymatic activity of chemical modified semipurified lipase from Candida rugosa.
Biotechnol Bioeng. 1997;55:252-60.
441. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem.1976;248-54.
442. Silva RA, Carmona-Ribeiro AM, Petri DFS. Catalytic behavior of lipase immobilized onto
Congo red and PEG-decorated particles. Molecules. 2014;19(6):8610-28.
443. Bluzmanas P. Mikrobiologinė technika. 1970. Vilnius.
444. Kamini NR, Fujii T, Kurosu T, Iefuji H. Production, purification and characterization of an
extracellular lipase from the yeast, Cryptococcus sp. S-2. Process Biochem. 2000;36:317-
24.
445. Lee DP, Deonarine AS, Kienetz M, Zhu Q, Skrzypczak M, Chan M, Choy PC. A novel
pathway for lipid biosynthesis: The direct acylation of glycerol. J Lipid Res. 2001;42:1979-
86.

157
446. Rizzo WB, Craft DA, Somer T, Carney G, Trafrova J, Simon M. Abnormal fatty alcohol
metabolism in cultured keratinocytes from patients with Sjögren-Larsson syndrome. J
Lipid Res. 2008;49(2):410-9.
447. Oliveira AC, Rosa MF. Enzymatic transesterification of sunflower oil in an aqueous-oil
biphasic system. J Am Oil Chem Soc. 2006;83(1):21-5.
448. Žemaitis S, Sendžikienė E. Biodyzelino gamyba taikant vienalaikio aliejaus išgavimo ir
peresterinimo procesą. „Studentų mokslinė praktika 2012“ konferencijos pranešimų
santraukos. II dalis. Vilnius. 2012;213-5.
449. Pocius R, Kazancev K. Biotechnologinio metodo taikymas gaminant biodyzeliną in situ.
„Studentų moksliniai tyrimai 2011/2012“ konferencijos pranešimų santraukos. II dalis.
Vilnius. 2012;405-6.
450. Tang S, Jones CL, Zhao H. Glymes as new solvents for lipase activation and biodiesel
preparation. Bioresource Technol. 2013;129:667-71.
451. Yunus R, Fakhru‘l-Razi A, Ooi TL, Omar R, Idris A. Synthesis of palm oil based
trimethylolpropane esters with improved pour points. Ind Eng Chem Res. 2005;44:8178-
83.
452. Krishna AG, Raj G, Bhatnagar AS., Prasanth Kumar PK, Chandrashekar P. Coconut oil:
Chemistry, production and its applications - A review. Ind Coconut J. 2010;15-27.

158