EUROPOS SJUNGA

Europos socialinis fondas

KURKIME ATEIT DRAUGE!

PROJEKTAS MAGISTRANTROS IR DOKTORANTROS STUDIJ MODULI KRIMAS IR PROGRAM ATNAUJINIMAS STRATEGINSE BIOMOKSL SRITYSE

Rekombinogenez
Donatas vingila

Apsvarst ir rekomendavo Vilniaus Universiteto Gamtos moksl fakulteto taryba

(2008 m. kovo 5 d., protokolas Nr. 4).

Recenzavo: prof. habil. dr. Vytautas Ranelis

dr. Violeta Kleizait

Leidin finansuoja Europos Sjungos struktrini fond paramos 2.5 priemons projektas Magistrantros ir doktorantros studij moduli krimas ir program atnaujinimas strateginse modernij biomoksl srityse. Sutarties Nr. Nr. ESF/2004/2.5.0-03-430/BPD-199/ParS-12500-602, SFMIS Nr.
BPD2004-ESF-2.5.0-03-05/0095). Projekt remia Lietuvos Respublika. Projekt i dalies finansuoja
Europos Sjunga.

Mokomoji knyga skirta Vilniaus universiteto magistrantros studij programos Genetika

(62101B105) studentams.
LEIDINYS PLATINAMAS NEMOKAMAI
D. vingila, 2008
Vilniaus universitetas, 2008
ISBN 978-9955-25-439-3

TURINYS
Santrumpos .......................................................................................................................................... 6
1. GENETIN REKOMBINACIJA.................................................................................................... 8
1.1. Genetins rekombinacijos svoka................................................................................................. 8
1.2. Rekombinacijos tipai .................................................................................................................... 9
2. HOMOLOGIN REKOMBINACIJA........................................................................................... 14
2.1. Homologins rekombinacijos modeliai ...................................................................................... 15
2.2. Prokariot homologin rekombinacija ....................................................................................... 19
2.2.1. Rekombinacijos kelio svoka .......................................................................................... 19
2.2.2. Homologins rekombinacijos baltymai E.coli lstelse .................................................. 20
2.2.2.1. RecA baltymas.......................................................................................................... 20
2.2.2.1.1. RecA baltymo biologins funkcijos.................................................................... 20
2.2.2.1.2. RecA biochemins savybs ................................................................................ 22
2.2.2.1.3. Baltymai, giminiki RecA................................................................................... 26
2.2.2.2. RecBCD baltymas (egzonukleaz V) ....................................................................... 28
2.2.2.3. RecE (egzonukleaz VIII) ir RecT ........................................................................... 33
2.2.2.4. RecF, RecO ir RecR baltymai .................................................................................. 34
2.2.2.5. RecG baltymas.......................................................................................................... 35
2.2.2.6. RecJ baltymas ........................................................................................................... 36
2.2.2.7. RecN baltymas.......................................................................................................... 36
2.2.2.8. RecQ ir jam giminiki baltymai................................................................................ 37
2.2.2.9. RuvAB baltymai ....................................................................................................... 40
2.2.2.10. RuvC baltymas........................................................................................................ 42
2.2.2.11. SbcB baltymas (egzonukleaz I) ............................................................................ 43
2.2.2.12. SbcC ir SbcD baltymai ........................................................................................... 43
2.2.2.13. SSB baltymas.......................................................................................................... 43
2.2.2.14. DNR topoizomerazs.............................................................................................. 45
2.2.3. Red rekombinacijos kelias............................................................................................... 46
2.3. Eukariot homologin rekombinacija......................................................................................... 47
2.3.1. Mejozs evoliucija ........................................................................................................... 48
2.3.2. Su rekombinacija susij reikiniai, vykstantys mejozs metu ......................................... 49
2.3.2.1. Chromosom poravimasis ir sinaps ........................................................................ 50
2.3.2.1.1. DGT reikm homologini chromosom poravimesi ........................................ 51
2.3.2.2. Sineptoneminis kompleksas...................................................................................... 53
2.3.2.3. Chromosom puokt............................................................................................ 56
2.3.2.4. Dvigrandi trki susidarymas ir reparacija........................................................... 57
2.3.2.4.1. DGT subrandinimas........................................................................................... 63
2.3.2.4.2. Grandins terpimas ir DGT itaisymas ............................................................ 66
2.3.2.4.3. Holidjaus jungi migracija ir skaldymas. Netaisyklingai suporuot
nukleotid reparacija heteroduplekse ............................................................... 68
2.3.2.5. Rekombinaciniai mazgeliai ...................................................................................... 69
2.3.2.6. Rekombinacija ir chromosom pasiskirstymo dukterines lsteles sutrikimai........ 71
2.3.3. Eukariot homologins rekombinacijos baltymai ir j savybs ...................................... 71
2.3.3.1. Rad51 ir Dmc1 rekombinazs .................................................................................. 73
2.3.3.2. Rad51 nukleoproteininio filamento susidarymo tarpininkai .................................... 78
2.3.3.3. Nuo RAD51 nepriklausoma rekombinacija .............................................................. 80
2.3.4. Homologin rekombinacija augaluose ............................................................................ 81
2.3.5. Chromatino vaidmuo DGT alinime homologins rekombinacijos bdu ....................... 82
2.3.6. Rekombinacijos ,,kartieji takai ................................................................................... 84
2.3.7. Ektopin rekombinacija ................................................................................................... 86
2.3.7.1. Ektopins rekombinacijos mechanizmai .................................................................. 86
2.3.7.3. Pasikartojani sek evoliucija................................................................................. 88
3

2.4. Homologins rekombinacijos panaudojimas .............................................................................. 89

2.4.1. Gen kartografavimas eukariotuose ................................................................................ 90
2.4. 1.1. Eukariot genolapi sudarymo principai................................................................. 90
2.4.1.2. Molekulini ymen panaudojimas genolapiuose.................................................... 92
2.4.1.3. Kiekybini poymi lokus kartografavimo principai............................................. 98
2.4.2. Bakterij gen kartografavimas..................................................................................... 101
2.4.3. Nepusiausvira sankaba................................................................................................... 103
2.4.4. Genetini kamien krimas HR bdu modifikuojant recipiento genom ..................... 107
3. SAIT-SPECIFIN REKOMBINACIJA...................................................................................... 110
3.1. Konservatyvioji sait-specifin rekombinacija .......................................................................... 110
3.1.1. Integracijos-ekscizijos sistemos..................................................................................... 110
3.1.2. Atskyrimo-ekscizijos sistemos ...................................................................................... 111
3.1.2.1. Transpozon kointegrat atskyrimas...................................................................... 111
3.1.2.2. Plazmidi segregacija ........................................................................................... 112
3.1.2.3. Ekscizija raidos metu.............................................................................................. 112
3.1.3. Inversijos sistemos......................................................................................................... 112
3.1.3.1. Hin, Gin, Cin, Pin sistemos .................................................................................... 112
3.1.3.2. Fim sistema............................................................................................................. 113
3.1.3.3. FLP sistema. ........................................................................................................... 114
3.1.4. Konservatyviosios sait-specifins rekombinacijos mechanizmai.................................. 115
3.1.4.1. Reikalavimai substratinei DNR .............................................................................. 115
3.1. 4. 2. Rekombinacijos baltymai ..................................................................................... 117
3.1.5. aflonai .......................................................................................................................... 120
3.1.6. Integronai ....................................................................................................................... 121
3.1.7. Konservatyviosios sait-specifins rekombinacijos panaudojimas gen ininerijoje..... 122
3.2. Transpozicija............................................................................................................................. 123
3.2.1. Prokariot JGE klasifikacija ir struktra ....................................................................... 125
3.2.2. Eukariot judrieji genomo elementai............................................................................. 126
3.2.3. JGE sekos-taikinio ypatybs.......................................................................................... 128
3.2.4. Transpozicijos mechanizmai ......................................................................................... 129
3.2.5. Alternatyvs transpozicijos bdai.................................................................................. 132
3.2.6. Transpozicijos reakcija .................................................................................................. 133
3.2.6.1. Transpozono atskyrimas nuo donoro DNR ............................................................ 133
3.2.6.2. Grandins perneimo reakcija................................................................................. 134
3.2.7. Transpozicijos baltym savybs .................................................................................... 135
3.2.8. Retrotranspozonai ir retropozonai ................................................................................. 137
3.2.8.1. Mieli Ty retrotranspozonai ................................................................................... 137
3.2.8.2. Vaisins musels (D. melanogaster) copia retrotranspozonai ............................... 139
3.2.8.3. mogaus retrotranspozonai .................................................................................... 139
3.2.9. JGE panaudojimas ......................................................................................................... 143
3.2.9.1. Gen terpimas generatyvines lsteles.................................................................. 144
3.2.9.2. Transpozon panaudojimas somatini lsteli gen ininerijoje........................... 144
3.2.9.3. Svarbesni stuburini gyvn JGE, naudojami gen ininerijoje............................ 144
3.2.9.4. Transpozon panaudojimas mutagenezje ............................................................. 146
4. V(D)J REKOMBINACIJA.......................................................................................................... 148
4.1. Pagrindins V(D)J rekombinacijos savybs ............................................................................. 148
4.1.1. RAG rekombinaz ir jos genai ...................................................................................... 151
4.2. DNR gal sujungimas V(D)J rekombinacijos metu ................................................................. 152
4.3. V(D)J rekombinacijos valdymas .............................................................................................. 154
4.4. RAG1/2 vykdoma DNR sek transpozicija.............................................................................. 154
5. ANTIKN KLASI KAITOS REKOMBINACIJA ............................................................... 156
6. NEDSNINGOJI (NEHOMOLOGIN) REKOMBINACIJA................................................... 160
6.1. Nedsningoji rekombinacija bakterijose................................................................................... 160
6.2. Nehomologikas DNR gal susijungimas (NGS) bakterijose .................................................. 162
4

6.3. Nedsningoji rekombinacija eukariotuose................................................................................ 163

6.3.1. Nehomologikas DNR gal susijungimas ..................................................................... 163
6.3.2. Nehomologiko DNR gal susijungimo mechanizmai.................................................. 164
6.3.3. NGS induoli lstelse................................................................................................. 165
6.3.4. NGS mielse .................................................................................................................. 168
6.3.4.1. Mieli NGS reakcijos modelis................................................................................ 170
6.3.5. Nehomologik DNR gal susijungimo bdai .............................................................. 170
7. T-DNR REKOMBINACIJA ....................................................................................................... 172
7.1. sijungim skatinantys augalo veiksniai ................................................................................... 174
7.2. T-DNR sijungimas augalo lstels genom .......................................................................... 174
8. RNR REKOMBINACIJA ........................................................................................................... 177
Literatra: ........................................................................................................................................ 179

Santrumpos
ASR atviro skaitymo rmelis
AT atvirktin transkriptaz
ATP adenozino 5' trifosfatas
bp bazi pora
cM centimorgana
dgDNR dvigrand DNR
DGT dvigrandiai DNR trkiai
DNR deoksiribonukleorgtis
DNR-PK nuo DNR priklausanti proteinkinaz
DNR-PKcs DNR-PK katalizinis subvienetas
FBE FB elementai
GK gen kaset
HJ Holidjaus jungtis
HR homologin rekombinacija
Ig imunoglobulinas
IR invertuotos pasikartojanios sekos
JGE judrieji genomo elementai
JS jonizuojamoji spinduliuot
kbp kilobaz (1000 bp)
KG kandidatinis genas
KKR klasi kaitos rekombinacija
KPL kiekybini poymi lokusas
KSSR konservatyvioji sait-specifin rekombinacija
LTR ilgos galins sekos
Mbp megabaz (milijonas bazi por)
MMC mitomicinas C
MMS metilo metano sulfonatas
MRN Mre11, Rad50 ir Nbs1 baltym kompleksas
MRX Mre11, Rad50 ir Xrs2 baltym kompleksas
NGS nehomologikas DNR gal sujungimas
NR nedsningoji (nehomologin) rekombinacija
NS nepusiausvira sankiba
PIK fosfatidilinozitolio kinaz (-s)
RFLP restrikcijos fragment ilgio polimorfizmo ymenys
6

RNP ribonukleoproteininis kompleksas

RNR ribonukleorgtis
RSS rekombinacijos signalin seka
SK sineptoneminis kompleksas
SNP vieno nukleotido polimorfizmo ymenys
TdT terminalin deoksinukleotidiltransferaz
UV ultravioletin spinduliuot
vgDNR viengrand DNR
VGT viengrandiai DNR trkiai
VPD virus panai dalel

1. GENETIN REKOMBINACIJA
1.1. Genetins rekombinacijos svoka
Genetin rekombinacija (lot. re veiksmo pasikartojimas, combinatio jungimasis, derinimasis) tai nukleorgi molekuli tarpusavio sveika, kurios metu kiekybikai arba kokybikai pakinta
jose esanti genetin informacija. Rekombinacija daniausiai vyksta dalyvaujant baltymams, nors kai
kurie jos atvejai, nustatyti retrovirusuose, rodo, kad galima ir be j. Galima manyti, kad genetins
rekombinacijos reikinys ugim pirmykiame vandenyne, kai tik jame atsirado nukleorgi
molekuli. Manoma, kad tai buvo RNR pasaulis, o pirmieji genomai, vadinami protogenomais,
tikriausiai buvo sudaryti i io cheminio junginio (Gilbert, 1986; Robertson & Ellington, 1998). Jeigu
tolesn genom evoliucija vyko aklojo laikrodininko, kaip vaizdingai gamtin atrank pavadino R.
Dawkins, veikiama tai rekombinacija buvo ir ilieka pagrindinis aliavos jam tiekjas (Dawkins,
2000). Be rekombinacijos genomai bt statikos, maai kintamos struktros. Ilg laik palaipsniui
besikaupianios mutacijos sukelt tam tikrus nukleotid sek pokyius genomuose, taiau j
gebjimas evoliucionuoti be rekombinacij bt labai ribotas.
Bgant laikui, kito ne tik genomai, bet ir paios rekombinacijos molekuliniai mechanizmai. Paius
primityviausius neseniai buvo galima tik sivaizduoti. Taiau nauji RNR rekombinacijos tyrimai rodo,
kad ji gali vykti tarp RNR molekuli nedalyvaujant jokiems tarpininkams (Chetverin, 1999; Chetverin,
2004). Labai nedideliu daniu RNR molekuls sveikauja vidinmis sritimis ir reakcijoje dalyvauja 2OH grups.
Pirmiausia buvo atrasta eukariot rekombinacija. Todl, kai kalbame apie organizmus, genetine
rekombinacija galime vadinti tok vyksm, kurio metu gaunami palikuonys, turintys naujus derinius
dviej ar daugiau paveldim faktori, kuriais skyrsi j tvai. Genom, padalyt atskiras
chromosomas, atsiradimas sukr prielaidas naujai genetins informacijos rekombinacijos galimybei.
Lytikai besidauginaniuose diploidiniuose organizmuose homologins chromosomos gametas
pasiskirsto nepriklausomai, taip susidaro gametos, turinios naujas gen kombinacijas. Toks
kombinacinis kintamumas lemia, kad, susiliejus vyrikosioms ir moterikosioms gametoms, atsiranda
organizmas, kuris turi galbt unikal tam tikros ries genom. Kombinacinis kintamumas nors ir
paprastas, taiau labai svarbus rekombinacijos mechanizmas, kuriam nereikia fizini DNR pokyi.
Taiau jam btina chromosom genetin vairov. Jeigu vieno individo chromosomos bt identikos
kit tos paios ries atstov chromosomoms, tai, nepaisant kombinacinio kintamumo ir lytinio
dauginimosi, atsirad palikuonys bt genetikai vienodi. Chromosom genetin vairov nulemia du
mechanizmai: mutacijos ir sukibusi gen rekombinacija. Pastaroji gali bti skirstoma homologin,
sait-specifin, transpozicij ir nedsningj (nehomologin).

Lstels rekombinacin struktra gana konservatyvi, todl pagrindiniai io proceso etapai yra
universals visiems gyviems organizmams. Pagrindiniai universals etapai ie:

trki atsiradimas DNR molekulse;

viengrandi DNR fragment susidarymas;

heteroduplekso (hibridinio DNR fragmento) susiformavimas;

geno konversija ir (ar) krosingoveris.

Vis dlto pamatysime, kad rekombinacijos mechanizmai yra nepaprastai vairs ir gana sudtingi.
Genetins rekombinacijos pasekms irykja ne tik organizm kartose. Rekombinacija nuolat vyksta
kiekvieno individo genome. Tai gali sukelti gen veiklos pokyius, individo somatini lsteli
vairovs susidarym, DNR paaid alinim.

1.2. Rekombinacijos tipai

Daniausiai rekombinacija (be kombinacinio kintamumo) skirstoma homologin, sait-specifin,
transpozicij ir nedsningj (nehomologin). Toks skirstymas gana slyginis, taiau patogus ir
visuotinai priimtas. Vis dlto yra keletas rekombinacijos reikini (klasi kaitos rekombinacija, V(D)J
rekombinacija, T-DNR rekombinacija), kurie turi labai savit bruo arba ypatybi, bding daugiau
nei vienam rekombinacijos tipui. Todl apie iuos reikinius bus kalbama atskirai nepriskiriant j n
vienam i ivardyt tip.

0,5

+
d

50

100

150

200

Atstumas (d) tarp delecij, nt

1 pav. Rekombinacijos danio priklausomumas nuo homologinio fragmento ilgio tarp mainuose
dalyvaujani fago T4 mutant DNR molekuli (Singer ir kt., 1982)
Homologin, arba bendroji genetin rekombinacija tai genetiniai mainai tarp nukleorgi
molekuli, turini identikas arba labai panaias (homologines) sritis. Taiau btinas tam tikras
homologini DNR sek ilgis. Jei homologijos saito ilgis yra trumpesnis u tam tikr kritin dyd, tai
homologin rekombinacija nevyks, nes su DNR negals sveikauti specifiniai homologij
atpastantys ir proces vykdantys baltymai. Homologijos saito ilgio taka rekombinacijos daniui
buvo tiriama vairiuose biologiniuose objektuose. Nustatyta, kad ji labai priklauso tiek nuo
9

sveikaujani molekuli savybi, tiek nuo paties objekto. E. coli lstelse is dydis yra apie 2040
bp, Bacillus subtilis 70 bp, mielse 150-250 bp, induoli lstelse 200 bp. Pirmame paveiksle
pavaizduotas fago T4 mutant rekombinacijos danio priklausomumas nuo homologijos. i mutant
rekombinacija nevyksta, jei sveikaujani molekuli homologini fragment ilgis maesnis nei 50
bp.
DNR dupleks homologin rekombinacija dar gali bti skirstoma konservatyvij ir
nekonservatyvij. Jeigu rekombinacijos produkt susidaro tiek, kiek j buvo ir prie j, tai yra
konservatyvioji rekombinacija. Jeigu rekombinantini molekuli susidaro maiau, tai yra

nekonservatyvioji rekombinacija (2 pav.).

2 pav. Konservatyvioji (A) ir nekonservatyvioji (B) rekombinacija (Takahashi ir kt., 1992)

Manoma,

kad

Escherichia

coli

lstelse

RecF

keliu

vykstanti

rekombinacija

yra

nekonservatyvioji. Rekombinuojant dviem DNR dupleksams, susidaro rekombinacin molekul ir

DNR galai, kurie pradeda kit nekonservatyviosios rekombinacijos etap. Remiantis iomis
prielaidomis galima paaikinti linijini multimerini plazmidi form susidarym vykstant mainams
RecF keliu.
Sait-specifine rekombinacija istorikai buvo vadinamos dvi reikini grups: konservatyvioji saitspecifin rekombinacija ir transpozicija. Kadangi rekombinacijos mechanizmai abiem atvejais labai
skiriasi, todl dabar jau kalbama apie du atskirus rekombinacijos tipus: konservatyvij sait-specifin
rekombinacij (arba tiesiog sait-specifin rekombinacij) ir transpozicij (Leach, 1996).
Svarbiausias sait-specifins rekombinacijos poymis yra tai, kad j vykdo baltymai, kurie
atpasta tik tam tikras specifines sekas ir katalizuoja j genetinius mainus. Tarp sveikaujani DNR
sek daniausiai yra homologija, nes jas atpasta tas pats baltymas arba homologija reikalinga
tarpiniams ios reakcijos etapams. Taiau svarbiausias vaidmuo io tipo rekombinacijoje tenka ne sek
homologijai, bet sveikai tarp baltymo ir DNR bei tarp baltym. Konservatyviosios sait-specifins
rekombinacijos pavyzdys fago integracija E. coli chromosom ir ekscizija i jos (3 pav.).
Svarbiausias ia yra Int baltymas, kuris atpasta attP, attB sekas bei tarp j vykdo rekombinacij.
insercijai reikia, kad attB sekos ilgis bt ne trumpesnis kaip 21 bp, o attP 234 bp. Be to, attP saitas
turi bti superspiralizuotas. Tarp attP ir attB sek 15 bp yra identikos.
10

R
cos

DNR

int
P

gal

bio

E. coli DNR

attB
Int
IHF

Int

XIS

IHF

profagas

attR
P

E. coli ()

attL

3 pav. Fago ir E. coli sait-specifin rekombinacija (pagal Weisberg ir Landy, 1983)

Transpozicin rekombinacija panai sait-specifin tuo, kad jos metu taip pat vyksta sveika tarp
baltymo ir DNR bei tarp baltym molekuli. Taiau baltymai, katalizuojantys transpozicij,
daniausiai specifikai atpasta tik vien i rekombinacijoje dalyvaujani sek, transpozicijai
svarbios genomo judraus elemento sekos, esanios jo galuose. Jas atpastantis baltymas danai
vadinamas transpozaze.
Nedsningoji (nehomologin) rekombinacija vyksta tarp molekuli, neturini jokios homologijos
arba ji labai maa. Retais atvejais, ypa bakterijose, proces lemia lstels sistem, nepritaikyt rekombinacijai, klaidos. Kai kurie autoriai (pavyzdiui, Leachas) silo io tipo rekombinacijos reikinius skirstyti dvi grupes: gal sujungimo ir grandini slysteljimo (Leach, 1996). Taiau toks
grupavimas neatspindi visos nedsningos rekombinacijos reikini vairovs.
vairios rekombinacijos sistemos gali koegzistuoti toje paioje lstelje. Taiau domu tai, kad j
indlis bendrj rekombinacij vairiose organizm grupse yra skirtingas. Mikroorganizmuose vyrauja homologin rekombinacija. O augal lstelse vienam homologins rekombinacijos atvejui tenka
10010 000 nedsningos rekombinacijos vyki.
Danai vartojami terminai reciprokin ir nereciprokin rekombinacija. Reciprokin
rekombinacija tai simetriki dviej DNR dupleks mainai. Tipikas reciprokins rekombinacijos
pavyzdys yra mejozinis krosingoveris, kurio metu homologins chromosomos apsikeiia vienodais
savo fragmentais (4 pav.). Nereciprokin rekombinacija tai nesimetrikas apsikeitimas genetine
informacija. iuo atveju informacija perduodama tik viena kryptimi. Rykiausias nereciprokins
rekombinacijos pavyzdys eukariotuose yra geno konversija. is reikinys pirmiausia buvo aptiktas
grybuose ir pasireik netipikais skilimo santykiais: 5:3, 6:2 (vietoje 4:4). Geno konversijos prieastys
gali bti dvejopos: reparacija heteroduplekse arba dvigrandio trkio reparacija (5 pav.).
11

4 pav. Mejozinis krosingoveris reciprokins rekombinacijos pavyzdys. Jo metu tarp homologini chromosom vyksta simetriki genetiniai mainai (pagal Watson ir kt., 2004)

5 pav. Heteroduplekso reparacijos pasekms: a) skirtingos kilms hibridins DNR fragmentai, susidar rekombinacijos metu; b) heteroduplekso reparacija, kurios metu vyksta geno konversija.
Nesuporuoti nukleotidai heteroduplekse itaisomi pagal recesyvinio alelio DNR sek. Dl ios prieasties dominuojantis alelis E (E) virsta recesyviniu e (e); c) heterodupleksas itaisomas pagal originali DNR sek ir geno konversija nevyksta. obiweb.bcgsc.ca/medgen/medgen520/Block6.htm
Nereciprokin rekombinacija taip pat vyksta transformacijos, transdukcijos ir konjugacijos metu
(6 pav.). iuo atveju, vykstant mainams, recipiento DNR fragmentas sunyksta ir ilieka tik i donoro
gauti aleliai.

12

Donoras
Recipientas

6 pav. Nereciprokin rekombinacija, vykstanti bakterij transformacijos, transdukcijos ar

konjugacijos metu (rodyklmis paymtos endonukleazi veikimo vietos)
Be mint rekombinacijos tip danai iskiriama dar viena homologins rekombinacijos reikini
grup, kuri vadinama ektopine rekombinacija. Tai mainai tarp pasikartojani gen ar pasikartojani
sek, danai esani nealelinse padtyse.

13

2. Homologin rekombinacija
Morganas (T. H. Morgan), tyrindamas vaisines museles, vienas pirmj susidomjo homologins
rekombinacijos reikiniu krosingoveriu (angl. crossing-over). Bandydamas paaikinti jo
mechanizm,

Morganas

ikl

hipotez,

kad

mejozs

metu,

poruojantis

homologinms

chromosomoms, vyksta trkiai ir jos apsikeiia fragmentais. Taip susidaro nauji sukibusi gen aleli
deriniai. reikin Morganas ir jo mokiniai panaudojo gen padiai chromosomose nustatyti.
Nepaisant Morgano ikeltos ir vlesni hipotezi, rekombinacijos molekuliniai mechanizmai ilg
laik buvo neaiks. Iki 1960 m. nebuvo inoma, ar homologin rekombinacija vyksta i pradi
reduplikuojant dal vienos chromosomos, o po to dal kitos, ar ji susijusi tik su chromosom trkiais
ir nauju susidariusi gal sujungimu. iuos skirtingus poirius ireik ,,matric kaitos ir ,,trkiosusijungimo hipotezs (Leach, 1996). Kad rekombinacija gali bti susijusi su chromosomos trkiu,
pirmieji nustat Mezelsonas (M. Meselson), Weigfe ir Kellenbergeris (G. Kellenberger), tirdami fago
rekombinacij. Vliau M. Mezelsonas ir Sthalis (F. Sthal) rod, kad homologin rekombinacija gali
vykti be ymesns DNR replikacijos.
Vis dlto vienareikmikai atsakyti klausim nepavyko iki iol. Dabar yra inoma daugyb
rekombinacijos sistem ir rekombinacijos tarpiniai produktai gali bti subrandinami labai vairiai. Tai
priklauso nuo j DNR struktros ir dalyvaujani ferment. Pavyzdiui, rodyta, kad tam tikra dalis
retrovirus rekombinacijos vyki visikai atitinka ,,matric kaitos hipotez.
Rekombinacij galima slyginai skirstyti tris stadijas: iniciacij, reparacij ir molekuli
atskyrim.
5
3
3
5

5
3
3
5

G
C
A
T

G
A
C
T

3
5
5
3

3
5
5
3

7 pav. Holidjaus jungtis (HJ) ir jos migracija (rodykl rodo HJ migracijos krypt)
Iniciacijos metu suartinamos sveikaujanios molekuls, palyginamas j nukleotid sekos
panaumas. Kadangi homologin rekombinacija labai tikslus procesas, tai ji gali prasidti tik tarp
identik sek. Todl homologija turi bti atpastama ir, jeigu ji yra pakankama, reakcija gali vykti
toliau. Tada arba susidaro pavidalo jungtis (-ys), dar vadinama Holidjaus (Holliday) jungtimi (7
pav.), arba vyksta viengrandi DNR molekuli gal sulipimas (X jungtis nesusidaro). Abiem atvejais
14

susidaro hibridinis DNR fragmentas, vadinamas heterodupleksu, kuris gali plstis dl Holidjaus
jungties migracijos.
Antrame etape atpastami netinkamai suporuoti nukleotidai bei paalinimi susidar plyiai. Jeigu
rekombinuojanios DNR molekuls neidentikos, tai heteroduplekse esantys neteisingai suporuoti
nukleotidai atpastami ir itaisomi.
Paskutiniame etape grandins gali bti atskiriamos labai vairiai. Tai priklauso nuo susidariusi
hibridini molekuli tipo bei lstels ferment. Reparacija nebtinai turi vykti iki atskyrimo. Ji gali
bti atliekama ir atsiskyrus chromosomoms.

2.1. Homologins rekombinacijos modeliai

Atrodyt keista, kad prajus daugiau kaip pusei amiaus nuo to laiko (1953 m.), kai buvo itirta
DNR sandara, iki iol tiksliai neinoma, kaip dvi sveikaujanios molekuls atpasta, aptinka abipus
homologij (Shibata ir kt., 2001; Sagi ir kt., 2006). Mokslinje literatroje yra du io reikinio
aikinimai. Pirmj dar 1964 m. pasil Holidjus (R.A.Holliday). Anot jo, baltymai, atpastantys
homologij, i pradi ivynioja nedideles sveikaujani DNR molekuli spirali dalis, o po to
padeda susidaryti Vatsono-Kriko (Watson-Crick) vandenilinms jungtims tarp grandini i skirting
DNR molekuli (8 A, C pav.). Toks aikinimas vadinamas ,,grandins atskyrimu prie susijungim.
B

C
5 proksimalinis

galas

distalinis
galas

8 pav. Hipotetiniai alternatyvs dviej homologik dgDNR (A, B) bei vgDNR ir dgDNR (C, D)
molekuli poravimosi ir apsikeitimo grandinmis bdai (Stasiak, 1992)
Antrasis aikinimas gali bti pavadintas ,,susijungimu prie grandini atsiskyrim, kuris teigia,
kad tarp dviej DNR dupleks arba duplekso ir viengrands DNR homologik sek susidaro
papildomos vandenilins jungtys. Baltymai iuo atveju turt padti toki keturgrandi ar trigrandi
struktr susidarymui, o po to atskirti ias sekas (8 B, D pav.). Taip susidaryt DNR dupleksai,
15

apsikeit segmentais. model 1977 m. pasil S. McGavin, remdamasis teorinmis prielaidomis

(McGavin 1977).
Homologijos atpainimas iki iol nepakankamai itirtas, vis dlto eksperimentiniai duomenys rodo
aktyv RecA/Rad51 eimos baltym vaidmen iame procese (Kurumizaka ir kt., 2000; Shibata ir kt.,
2001). Nustatyta, kad RecA per 15 min. gali aptikti mainams tinkam homologik DNR esant 2105
heterologins DNR pertekliui (Bazemore ir kt., 1997).
Holidjaus modelis. is, jau standartiniu taps modelis (9 pav.), buvo sukurtas 1964 m. Model
sukr R.A. Holidjus, aikindamas, kaip vyksta homologin rekombinacija E. coli lstelse.

9 pav. Holidjaus homologins rekombinacijos modelis (paaikinimas tekste)

Remiantis iuo modeliu, iskiriamos trys pagrindins homologins rekombinacijos ypatybs:
a) mainus sukelia simetriki homologini grandini trkiai (B);
b) simetriki grandini mainai nulemia heterodupleks susidarym (C);
c) dl main susidariusi X tipo Holidjaus jungtis (C, D) yra sukarpoma dvejopai (D), todl
susidaro dviej ri rekombinaciniai palikuonys. Vieni vadinami sulopytais (F), kiti
sujungtais (H). Pirmuoju atveju vyksta apsikeitimas vidinje dalyje esaniais fragmentais
(geno konversija), antruoju mainai flanginiais segmentais (krosingoveris). Kad grandini
mainai vykt krosingoverio bdu, reikalingas DNR molekuli erdvinis persigrupavimas,
16

vadinamas izomerizacija (G, E). is modelis gali paaikinti daug genetins rekombinacijos
reikini, tarp j ir geno konversij.
Vliau buvo sukurta keletas kit modeli, vienaip ar kitaip interpretuojani eksperiment
rezultatus, nepaaikinamus standartiniu modeliu.
Mezelsono ir Radingo modelis. Holidjaus modelio trkumas buvo simetrik trki
susidarymas. Todl 1975 m. Mezelsonas (M. Meselson) ir Radingas (C.M. Radding) sukr model,
aikinant kaip grandini mainai gali prasidti dl vieno viengrandio trkio DNR molekulje (10
pav.). Pagal teigim, prie atsiradusio trkio (A) 3galo gali prisitvirtinti DNR polimeraz ir pradti
DNR sintez (B). Taip viengrandis DNR molekuls galas yra istumiamas i duplekso. Jis gali bti
terpiamas homologik intaktik DNR ir sukelti D kilpos susidarym. i kilpa gali bti
endonukleazi kerpama ir egzonukleazi suskaldoma. Susidaro asimetrinis heterodupleksas (C).
Polimeraz gali bti prarasta ir vykti struktros izomerizacija susidarant Holidjaus jungiai (D).
Jungtis gali migruoti, jeigu yra homologija, po to gali bti endonukleazi suskaldyta. Priklausomai nuo
kirpimo vietos, susidarys krosoveriniai ar nekrosoveriniai rekombinacijos produktai (E, F). Kaip ir
Holidjaus modelyje, iuo atveju taip pat gali vykti netaisyklingai suporuot nukleotid korekcija
heteroduplekse, sukelianti gen konversij.
A

E
arba
F

10 pav. Mezelsono ir Radingo (1975) homologins rekombinacijos modelis

Trkis gali atsirasti dl nukleazi, topoizomerazi ar kit baltym poveikio, gali bti ir aling
aplinkos veiksni padarinys. iame modelyje pagrindinis prietaravimas buvo tai, kad inicijuojanti
molekul tampa genetins informacijos donoru. Taiau eksperimentini tyrim rezultatai rodo, kad ji
17

turt bti recipientu. i problem isprendia Radingo 1982 m. pasilytas modelis, kuris remiasi E.
coli RecA baltymo katalizuojama reakcija in vitro. Dl baltymo rekombinacij pradjusi molekul
veikia kaip recipientas (11 pav.). Tokia molekul turi viengrand tarp (A), kuris, esant RecA,
sveikauja su homologine molekule ir susidaro D kilpa (B). Tokia kilpa sukarpoma ir susidars 3galas
tampa pradmeniu DNR sintezei (C). Toliau viskas vyksta kaip ir ankstesniame modelyje.
A

11 pav. Radingo pasilytas homologins rekombinacijos modelio variantas (Radding, 1982)

A

12 pav. Dvigrandi trki reparacijos modelis pagal Szostak

Rekombinacijos, kuri sukelia dvigrandiai trkiai, modelis. 1976 m. j sukr Resnikas
(M.A. Resnick), o toliau tobulino Szostakas (J. Szostak) ir kt. (1983 m.). Panagrinkime vien io
18

modelio versij (12 pav.). Dl dvigrandio trkio susidar laisvi galai yra subrandinami
egzonukleazi, skaldani vien i DNR duplekso grandini (A). Susidars viengrandis galas
terpiamas homologik dgDNR ir susidaro D kilpa (B). terpim gali atlikti RecA ir juos panas
baltymai. DNR sintez nuo 3galo istums i dgDNR vien grandin, su kuria gali sveikauti (esant
homologijai) viengrandis 3galas i kitos dvigrandio trkio puss (C). Nuo io galo taip pat gali
prasidti DNR sintez. Vykstant iai sintezei plyys upildomas informacija, esania homologinje
grandinje (D). Tuo metu susidaro dviguba Holidjaus jungtis, kuri vliau gali bti nukleazi
suskaldoma (E).

2.2. Prokariot homologin rekombinacija

2.2.1. Rekombinacijos kelio svoka
Genetiniai tyrimai parod, kad E. coli laukinio tipo kamiene rekombinacijai vykti reikalingi RecA,
RecBCD, SSB, DNA polimeraz I, DNR giraz ir DNR ligaz. Taiau mutant ir supresori analiz
atskleid dar vis grup papildom homologins rekombinacijos sistemos baltym. Be to, vieno ar kito
baltymo poreik nulm pats substratas, t. y. rekombinuojamosios DNR molekuls. Tiriant E. coli
mutantus, kuriuose paeistas rekombinacijos procesas, pavyko atrasti mutacijas, kurios atkurdavo HR
dan beveik iki normalaus lygio. Remiantis tuo galima daryti ivad, kad bakterijoje egzistuoja
keletas rekombinacijos keli. Rekombinacijos kelias tai seka vyki, kuri metu DNR molekuls
sveikauja tarpusavyje iki galutini produkt (hibridini DNR molekuli) susidarymo dalyvaujant HR
sistemos baltymams. vyksm katalizuojanius baltymus koduoja lstels HR sistemos genai.
Rekombinacijos kelio svok 1973 m. pasil Klarkas (A. Clark). E. coli yra inomi trys
rekombinacijos keliai: RecBCD, RecE ir RecF. Mutant tyrimai parod, kad kai kurie baltymai veikia
daugiau nei viename kelyje. Pavyzdiui, RecA baltymas reikalingas visais atvejais, iskyrus nuo RecE
priklausom plazmidi rekombinacij.
RecBCD kelias yra pagrindinis laukinio tipo lstelse. Jis jungiamas, kai lstelje atsirada DNR,
turinti dvigrandius trkius (DGT). DGT bakterij lstelse gali susidaryti dl mutagen (pavyzdiui,
dl jonizuojamosios spinduliuots), dl replikacijos proceso sutrikim, o taip pat vykstant bakterij
lytiniam procesui (konjugacijai, transdukcijai). E. coli laukinio tipo lstelse RecBCD keliu vyksta 99
proc. vis rekombinacijos vyki transdukcijos ir konjugacijos metu. io kelio svarbiausi komponentai
yra RecA, RecBCD, SSB, RuvA, RuvB, RuvC ir (ar) RecG baltymai bei ypatinga DNR seka,
vadinama (chi, angl. crossover hotspot instigator).
RecF rekombinacijos kelias buvo aptiktas mutantiniuose kamienuose, kuriuos buvo terptos
supresorins mutacijos sbcB/CD. Rekombinacij iuo keliu daniausiai sukelia DNR molekulse
atsirad viengrandiai tarpai. Jie gali susidaryti dl DNR replikacijos sutrikim, kuriuos sukelia
mutagenai. RecF kelias gali bti panaudotas ir DGT paalinti. Jis priklauso nuo rekombinacijos gen
rec A, recF, recJ, recN, recO, recQ, recR, ruvABC (arba RecG) ir ssb.
19

RecE kelias aptiktas mutantiniuose kamienuose, turiniuose sbcA mutacij. Konjugacinei

rekombinacijai vykti iuo keliu reikalingi beveik visi baltymai, dalyvaujantys RecF kelyje, taiau
plazmidi rekombinacijai pakanka RecE ir RecT baltym. Manoma, kad is rekombinacijos kelias
atsirado i kriptinio profago rekombinacijos sistemos.
2.2.2. Homologins rekombinacijos baltymai E. coli lstelse
Geriausiai itirta HR sistema yra E. coli lstelse. 1965 m. Klarkas (J. Clark) ir Margulis (A.
Margulies) prane gav pirmuosius E. coli mutantus, kuriuose paeista homologin rekombinacija. E.
coli F recipientinis kamienas buvo paveiktas cheminiu mutagenu. Kryminant tok mutant su Hfr
donoru, beveik nesusidarydavo rekombinantai. i mutacija buvo kartografuota lokuse, pavadintame
recA, atitinkaniame madaug 58- genolapio minut. Jo koduojamas baltymas pavadintas RecA. Nuo
tada prasidjo homologin rekombinacij valdani gen tyrimai. 1979 m. recA genas buvo klonuotas.
Mutagenezs bdu nustatyta ne maiau 25 E. coli gen, kuri produktai veikia vairiuose homologins
rekombinacijos etapuose (Kowalczykowski ir kt., 1994).
2.2.2.1. RecA baltymas
2.2.2.1.1. RecA baltymo biologins funkcijos
1. Rekombinacijoje ir reparacijoje. Geno recA mutacijos yra pleotropins: 5104 kart
sumajs rekombinacijos danis, padidjs mutant jautrumas UV, X spinduliams bei cheminiams
mutagenams, sultjs augimas, pastarj nulemia didelis negyv lsteli skaiius. Kartais j kiekis
laboratorinse recA mutant kultrose siekia 50 proc. Be dideli konjugacijos sutrikim, recA
mutantuose stipriai paeista bendroji ir specifin transdukcija bei redgam genotipo fago gyvenimo
ciklas. Genetiniai tyrimai parod, kad spinduliuots sukelti paeidimai blokuoja DNR replikacij. ios
paaidos nemaa dalimi yra itaisomos homologins rekombinacijos bdu padedant RecA baltymui.
Nustatyta, kad recAuvrA dvigubi mutantai jautresni UV nei pavieni gen mutantai. Tai atsitinka
todl, kad RecA tiesiogiai dalyvauja paalinant UV indukuotus aduktus. Nustatyta, kad RecA taip pat
tiesiogiai veikia DNR skersini ryi reparacijoje (Sladek ir kt., 1989).
2. SOS indukcijoje. Be tiesioginio dalyvavimo reparacijoje, RecA koordinuoja lstels atsak
DNR paaidas ir per SOS sistem. Atsiradus DNR paaidoms lstelje (pvz., po apvitos UV), RecA
aktyvuojamas. Manoma, kad RecA aktyvuoja kai kurios vgDNR formos, kurios susidaro lstelje dl
spinduliuots poveikio. Prisijungs prie vgDNR, RecA tampa aktyvus ir paveikia su juo sveikaujant
LexA baltym. Dl sveikos pakinta LexA erdvin struktra ir pasireikia jo autoproteazinis
aktyvumas. LexA suskyla dvi dalis. Kadangi LexA yra represorius, tai jam suskilus, derepresuojama
transkripcija keli deimi gen, sudarani SOS regulon (Kuzminov, 1999). regulon eina
svarbs reparacijos ir rekombinacijos eig kontroliuojantys genai: recA, recN, recQ, ruvA, ruvB, lexA,
uvrA, B, D, umuC, umuD. SOS atsakas nra desperatikas bandymas igyventi, kaip galt atrodyti i
20

pavadinimo, o prasta ir logika lstels reakcija DNR sintezs slopinim. Priklausomai nuo raikos
pobdio ir jungimo slyg, SOS regulono genus galima suskirstyti tris grupes. Pirmai grupei
priklauso genai uvrA, uvrB, uvrC ir polB, kuris atsakingas u viengrandi trki alinim arba
tolerantikum paaidoms. Taip pat indukuojama ir LexA represoriaus gamyba. i gen raika
padidja apie 10 kart, palyginti su normaliu lygiu. Jeigu j raika nepadeda atkurti normal DNR
sintezs lyg, traukiami antros grups genai recA ir recN, kurie vykdo rekombinacin reparacij. J
raika, palyginti su norma, padidja 2050 kart. Jeigu DNR paaidos labai didels ir negali bti
paalinamos rekombinacins reparacijos bdu, tai DNR sintezei atkurti traukiama treia gen grup
(sfiA, umuDC). Kadangi prastomis slygomis i gen raika labai nedidel, tai SOS atsako metu ji
gali padidti daugiau kaip 100 kart. UmuDC operono veikla slopina rekombinacin reparacij ir daro
manom DNR sintez per paaidas. Sfi baltymas slopina lstels dalijimsi tam tikr laik. Kai DNR
sintez atnaujinama, ios trys gen grups ijungiamos, tikriausia, atvirktine tvarka. Jeigu lstel
negeba itaisyti paaidas, ji va.
3. SOS mutagenezje. Nors replikacija per paaidas didina igyvenimo galimyb, taiau danai ji
yra mutacij prieastis. Mutacij atsiranda todl, kad slopinamas DNR polimerazi darbo tikslumas.
io tipo DNR replikacija vis dlto padeda igyventi, nes klaid danis nesiekia 100 proc., be to, daugelis mutacij i esms neutralios. Nors RecA vaidmuo dar nepakankami itirtas, taiau jis nekelia abejoni. Replikacijos per paaidas metu susidaro baltym kompleksas mutasoma. DNR polimeraz III,
susidrusi su paaida (pavyzdiui, 5 TC 3 pirimidin dimeru), atnaujina replikacij tik tam tikru atstumu (apie 1 kbp) emiau jos. RecA baltymas aktyviai jungiasi prie tokio vgDNR tarpo, sudarydamas
nukleoproteinin filament. Represorius LexA atpasta darin, kaip aplinkos streso signal, ir jungiasi prie jo. Tokia baltym sveika sukelia LexA autoproteoliz ir represoriaus funkcijos praradim.
Taip pat indukuojama UmuD baltymo sintez. UmuD jungiasi su RecA filamentu bei panaiai kaip
LexA vykdo autoproteoliz. Susidaro mutagenikai aktyvs UmuD2 dariniai, kurie sveikauja su
UmuC, sudarydami UmuD2C kompleks. Jis jungiasi prie vairi RecA nukleoproteininio filamento
viet. ie UmuD2C RecA baltymai kartu su DNR polimeraze III sudaro mutasom, kurioje slopinamas DNR polimerazs 35 korekcinis aktyvumas (Lawrence ir Woodgate, 1999). Taigi RecA kartu
su kitais baltymais sudaro slygas vykti replikacijai per paaidas.
4. Nuo rekombinacijos priklausomoje replikacijoje. Ilgai vyravo nuomon, kad nuo oriC prasidjusi E. coli chromosomos replikacija, kuri vykdo DNR polimerazs III, pasibaigia terminacijos take (Kuzminov, 1999). Taiau vlesni tyrimai parod, kad replikacijos akut gali ustrigti ir baltymai
gali atsiskirti nuo DNR dar nepasibaigus replikacijai. Jeigu replikacijos nepavykt atnaujinti, viena i
dukterini lsteli t. Manoma, kad apie 1520 proc. replikacini akui susiduria su panaiais
sunkumais. Be to, eksperimentais rodyta, kad E. coli lstels, neturinios ori funkcijos, beveik normaliai dauginasi. To prieastis indukuota pastovi DNR replikacija (angl. induced-stable DNA replication). Jai vykti reikalingi RecA, RecBCD, Pri baltymai bei chi sekos. Dl RecA baltymo susidaro D
21

kilpos, o terptos vgDNR 3 galas yra potencialus pradmuo DNR replikacijai. Panai funkcij gali atlikti ir R-kilpos, kurios susidaro, kai dgDNR terpiamas RNR molekuls galas. Nuo jo prasidjusi
DNR sintez vadinama konstitutyvija DNR replikacija (angl. constitutive-stable DNA replication). R
kilpai susidaryti reikalingi RecA ir Pri helikaz. Abu replikacijos procesai pavadinti bendru vardu
nuo rekombinacijos priklausoma replikacija. Kai kurie mokslininkai mano, kad btent dl io proceso
sutrikimo va didelis recAar recBrecC mutant lsteli skaiius.
2.2.2.1.2. RecA biochemins savybs
1981 m. keliose laboratorijose pradtos tirti biochemins RecA savybs. Nustatyta, kad RecA
molekulin mas yra 37842 Da. J sudaro 352 aminorgtys. Normaliomis slygomis E. coli lstelse
yra 8000 10000 io baltymo molekuli. SOS atsako metu j skaiius padidja iki 70000 (Cox 2003).
Jis aptinkamas beveik visose bakterijose iskyrus kai kurias endosimbiontines. Iki iol sukurti
maiausiai keturi RecA kristalins sandaros vaizdai. Du i j sukurti E. coli ir du Mycobacterium
tuberculosis RecA baltymams. ie vaizdai beveik vienodi. Baltyme iskiriami trys domenai.
Didiausias centrinis erdinis ir du maesni amino (N) ir karboksilinio (C) gal. erdiniame
domene (34 269 aminorgi liekanos) RecA panaus helikazes ir kai kuriuos kitus baltymus. Tai
pati konservatyviausia baltymo dalis, kuri labai panai visose bakterijose. Konservatyvumas ilieka ir
eukariot RecA homologuose. 47-74 aminorgtys svarbios ATP prisijungimui ir hidrolizei. ioje
vietoje esanti GPESSGKT seka atitinka Walker A sekos motyv (G/A)XXXXGK(T/S), kuris bdingas
daugeliui NTP prisijungiani baltym. RecA Lys72Arg mutantinis baltymas neturi ATPazs
aktyvumo. C galo domenas (270352 aminorgtys) maai konservatyvus net bakterij RecA
baltymuose.
Baltymas geba polimerizuotis ant vgDNR ir dgDNR molekuli, sudarydamas spiralinius nukleoproteininius filamentus. Prie vgDNR jis jungiasi ymiai spariau. ioje struktroje ir vyksta DNR molekuli poravimasis bei grandini mainai. Filamentai yra taisyklingos sandaros, RecA baltymo
monomerai yra isidst greta vienas kito. Elektroniniu mikroskopu nustatytas tikslesnis baltymo ir
DNR sveikos vaizdas (13 pav.). Egzistuoja bent dvi aktyvaus (su ATP susijungusio) presinapsinio
RecA nukleoproteininio filamento ant vgDNR bsenos. Jas stipriai veikia Mg2+ jonai ir kai kurie kiti
veiksniai, esantys reakcijos miinyje. Kai Mg2+ trksta, vgDNR ir RecA sveika bna ribota (14 pav.).
i RecA bsena vadinama Ac (nuo angl. closed udaras). Kai Mg2+ yra perteklius (68 mM),
palyginti su ATP, RecA pereina Ao bsen, kuri palanki mainams.

22

0,1 m

13 pav. Spiralinis RecA baltymo filamentas ant vgDNR in vitro (rodykle parodyta DNR molekul
be baltymo. Nuotrauka padaryta elektroniniu mikroskopu, pagal Stasiak ir DiCapua, 1982)
O

O
ATP
ATP
Mg+2

Ac
Mg+2

Ao
DNR

P
14 pav. Numanomos RecA funkcins bsenos (pagal Cox 2003). Kai nra ATP, baltymas neaktyvus ir yra O bsenoje. A bsen baltymas pereina, kai, esant ATP ar dATP, prisijungia prie
vgDNR. Esant maoms magnio koncentracijoms, RecA yra santykinai udaras (Ac) pradti poravim ir grandini mainus. Kai yra magnio perteklius, palyginti su reikalingu prisijungti ATP, tai
RecA pereina atvir mainams bsen. P bsena atsiranda, kai baltymas sveikauja su dgDNR
Toks perjimas i Ac Ao bsen tiesiogiai susijs su Mg2+ ir RecA baltymo C galo aminorgi
sveika. Jeigu nuo RecA C galo paalinama 17 aminorgi, tai inyksta Mg2+ pertekliaus poreikis
DNR main reakcijai. RecAC17 mutante vyksta intensyvs mainai ir be Mg2+ pertekliaus. RecA poravimasis su dgDNR perjungia baltym P bsen, kurioje jis hidrolizuoja ATP apie 30 proc. maiau
nei susijungs su vgDNR. Nukleoproteininiame filamente esanti vgDNR yra 1,5 karto itsta, palyginti su normaliu B formos DNR molekuls ilgiu. Tokia itsta jos bsena yra palanki homologijos paiekai ir grandini apsikeitimui. J stabilizuoja sveikos tarp deoksiribozi ir azotini bazi. DgDNR po
to patenka nukleoproteinin filament ir susidaro trij nari (vgDNR, dgDNR ir RecA) kompleksas.
iame komplekse RecA ieko homologijos tarp vgDNR ir dgDNR (Kurumizaka ir kt., 2001). ios sveikos metu dgDNR dalinai ivyniojama nenutraukiant bazi por. Tai, matyt, yra svarbu homologijos
23

paiekai. Manoma, kad itsta vgDNR bsena leidia bazms suktis horizontalioje ploktumoje. Todl,
aikinant homologijos atpainim, silomas bazi por kaitos modelis (angl. base pairs switching model). Pagal j trij nari komplekse tiek vgDNR, tiek dgDNR yra itstos 1,5 karto. iuo atveju homologijos paieka ia vyksta sukantis bazms. Taip gali susidaryti naujos Watson-Crick poros tarp
vgDNR ir dgDNR. is modelis buvo eksperimentikai tikrinamas panaudojant RecA mutantus, kuriuose paeistas homologijos atpainimas. Gauti mutantai RecAR243Q ir RecAK286N, kurie negaljo
vykdyti main tarp vgDNR ir dgDNR. iuose baltymuose vykusios aminorgi pakaitos:
Arg243Gln ir Lys286Asn. Nors jie sudarydavo normalius nukleoproteininius filamentus su
vgDNR, taiau, matyt, neatpaino homologijos tarp vgDNR ir dgDNR. Lys-286 yra baltymo C gale,
o Arg-243 netoli io domeno. Ityrus C domeno struktr tirpale, branduoli magnetiniu rezonanso
tyrimu nustatyta, kad i baltymo dalis prisijungusi prie dgDNR. K286N mutacija slopina baltymo
gebjim ivynioti DNR. Tai rodo, kad homologijos atpainimui tarp mint DNR molekuli
reikalingas dalinis dgDNR ivyniojimas molekuli poravimosi metu.
RecA baltymas yra nuo DNR priklausoma ATPaz, taiau DNR molekuli poravimuisi ir
genetiniams mainams nebtina ATP hidroliz. RecA katalizuojami mainai ir be ATP hidrolizs gali
siekti tkstanius bazi por (Cox 2003). Tai jis gali atlikti dl savo, kaip motorinio baltymo, savybi.
RecA gali hidrolizuoti vairius dNTP ir rNTP. Taiau tik ATP ir dATP tarnauja kaip kofaktoriai main
reakcijoje. ATP skaldymas leidia baltymui vykdyti mainus tarp DNR molekuli, kurios turi didesnes
heterologines sritis. dATP skatina kai kurias RecA katalizuojamas reakcijas, didina nukleoproteininio
filamento stabilum bei DNR main greit (Menetski ir Kowalczykowski, 1989). Kadangi RecA
baltymas vykdo grandini mainus, o j metu sunaudojamas ATP, tai i pradi padaryta ivada, kad
ATP hidrolizs energija btina mainams. Taiau dabar aiku, kad abi reakcijos nra tiesiogiai
susijusios. Tai rodyta panaudojant ir mutantinius RecA. Buvo gautas RecA baltymas RecAK72R,
kuris jungiasi su ATP, bet jo nehidrolizuoja. Toks pakits RecA taip pat gali vykdyti mainus.
Grandini mainams, kuriuos vykdo RecA, tirti daniausiai naudojama sistema, sudaryta i
iedins viengrands ir linijins dvigrands DNR molekuli (15 A pav.).
RecA vykdom grandini main reakcij ioje sistemoje galima suskirstyti kelet etap:
1. Stechiometrinis RecA baltymo jungimasis prie vgDNR. Susidaro nukleoproteininis
kompleksas, kuriame vgDNR yra RecA filamento viduje. Prie vgDNR besijungiantis SSB
baltymas palankiai veikia i reakcij, nes paalina antrines struktras, kurios gali susidaryti
ioje DNR (16 pav.). Filamente esanti vgDNR 5060 proc. ilgesn.
2. Nukleoproteininis filamentas sveikauja su ,,nuoga dgDNR. Poravimasis pagal homologij
tikriausiai vyksta dl daugkartini atsitiktini kontakt. Manoma, kad ios sveikaujanios
DNR yra RecA susukamos tarpusavyje trigrand struktr. Toks grandini poravimasis gali
vykti didelse srityse ir joms nereikia laisv DNR molekuli gal (paranemin jungtis). Jeigu
tokie galai yra (plektonemin jungtis) kaip nagrinjamu atveju, reakcija pereina kit stadij.
24

3. Vyksta grandini mainai, susidaro heterodupleksas. Mainai vyksta gana ltai (2-10 bp per
sekund) ir pasiymi polikumu. Jis nustatomas vgDNR, ant kurios susidar filamentas,
atvilgiu ir yra 53 krypties. Mainai prasideda, kai dgDNR komplementarios grandins
3galas perkeliamas ant vgDNR (15 A pav.).
A

linijin DNR

vgDNR

linijin DNR

dgDNR
su tarpu

SSB
RecA
3

dgDNR
su trkiu

linijin vgDNR

RecA
3

dgDNR
su trkiu

linijin dgDNR, turinti

viengrand tarp

15 pav. DNR grandini main reakcijos, vykdomos RecA, in vitro. Rekombinacijos reakcijos
substratu daniausiai yra bakteriofag X174 ar M13 DNR molekuls (West,1992)
Reakcijai reikalingas ATP. Po main reakcijos susidaro dgDNR su trkiu ir linijin vgDNR
molekul. RecA pradeda ir baigia i reakcij, bdamas ant vgDNR, o vykus mainams, jis aptinkamas
ant trk turinios dgDNR. Kitas reakcijos produktas linijin vgDNR (istumta i DNR duplekso)
jungiasi su RecA baltymu, esaniu tirpale. Taiau grtamoji reakcija nevyksta, nes du
nukleoproteininiai filamentai tarpusavyje nesveikauja. Iki iol nerodyta, kad main reakcija vyksta
tarp dviej visikai homologik DNR dupleks. Taiau RecA gali vykdyti mainus, jeigu viena i
dgDNR molekuli turi viengrand tarp (15 pav., B). Prie tokios dgDNR molekuls vietos RecA
baltymas jungiasi labai efektyviai. Tarpo vietoje RecA, stechiometrikai prisijungs prie viengrands
DNR duplekso srities, prapleia j dgDNR pus.

25

PRIESINAPS

substratai

DNR HETERODUPLEKSO
PRAPLTIMAS

SINAPS

priesinapsinis
kompleksas

homologijos
paieka

recA,
SSB,

C
B
c

bendra
molekul

grandins
istmimas

reakcijos
produktai

(paranemin)
A

b
5

(plektonemin)

16 pav. RecA atliekami DNR grandini mainai. Pavaizduotas ant vgDNR susidars RecA
filamentas bei jo sveikos su linijine dgDNR bdai. SSB baltymas ioje reakcijoje reikalingas
antrinms DNR struktroms ant vgDNR paalinti (Kowalczykowski, 1991; Kowalczykowski ir
Eggleston, 1994).
Mainai ioje sistemoje vyksta 3 bp/s greiiu 53 kryptimi vgDNR, ant kurios susidar
filamentas, atvilgiu. SSB baltymas antrinms struktroms paalinti nebtinas, jeigu tarpas nevirija
300 nukleotid. i main reakcija nehomologinms sritims yra jautresn u anksiau inagrint.
Heterologins keli deimi bp ilgio sritys neturi didels reikms mainams. Taiau 120 bp intarpai
ar delecijos labai slopina reakcij, galutini jos produkt (dvigrands iedins DNR su trkiu bei
linijins dgDNR su viengrandiu fragmentu) neaptinkama. O pirmoji reakcija vykdavo net tuomet, kai
vgDNR esantis heterologinis intarpas bdavo 1000 nukleotid ilgio.
2.2.2.1.3. Baltymai, giminiki RecA
Panas RecA baltymai aptikti beveik visuose iuo aspektu tirtuose prokariotuose (Cox 2003).
Iimt sudaro endosimbiozini bakterij gentis Buchnera sp. ios bakterijos dl savo gyvenimo bdo
yra praradusios nema genomo dal, kurioje yra recA, ir kai kurie kiti genomo stabilum palaikantys
genai. Visi iki iol klonuoti eubakterij recA genai gali komplementuoti RecA fenotip E. coli
lstelse. Nustatyta ne maiau kaip 60 RecA baltym aminorgi sek i vairi prokariot. Krinta
akis didelis i baltym struktrinis ir funkcinis konservatyvumas: 55100 proc. juos sudarani
aminorgi yra vienodos. Ypa konservatyvi baltymo erdin sritis. Kai kurie RecA baltymai
skiriasi savo karboksiliniu galu.
Trumpai galima paminti kelet RecA panai ir grandini mainus vykdani prokariot baltym.
RecA i Proteus mirabilis. io baltymo panaumas E. coli RecA siekia 73 proc. Jis gali
komplementuoti recA geno mutacij ir turi visas E. coli baltymui bdingas savybes.
26

Bacillus subtilis RecA (RecE). Koduojantis genas anksiau vadintas recE. 60 proc. panaumas
E. coli RecA.
Bakteriofago T4 UvsX baltymas. J koduoja uvsX genas. Labai skiriasi nuo vis io tipo
prokariot baltym. Panaumas RecA tik 23 proc. is baltymas yra nuo vgDNR priklausoma NTPtaz, vykdo DNR renatracij ir DNR grandini mainus. ATP-tazinis aktyvumas specifinis, nes
hidrolizs metu susidaro ADP ir AMP. Grandini mainai, dalyvaujant UvsX, vyksta efektyviau, jeigu
iam baltymui padeda su vgDNR sveikaujantis ir spiral stabilizuojantis baltymas G32P. Jis savo
savybmis yra SSB analogas. Dar viena fago T4 homologins rekombinacijos ypatyb yra ta, kad jai
reikalingas dar vienas papildomas baltymas, vadinamas UvsY. is fago baltymas yra UvsX vykdom
main tarpininkas, nes padeda pastarajam prisijungti prie vgDNR, skatina nukleoproteininio filamento
susidarym. Funkcijos atvilgiu UvsY yra RecO ir Rad52 homologas (Sugiyama ir kt., 1998).
RecA giminiki archebakterij baltymai. Pirmkart archebakterij recA tipo genas buvo
klonuotas i Sulfolobus solfataricus (Seitz ir kt., 1998). Jo koduojams RadA baltymas yra nuo DNR
priklausoma ATPaz, sudaro su DNR nukleoproteinin spirals pavidalo filament, katalizuoja
grandini mainus. RadA filamentas yra deiniakrypts spirals pavidalo. Sek palyginimas parod, kad
RadA i archebakterij labiau panaesnis Rad51 ir Dmc1 nei bakterij RecA baltym. RadA i S.
solfataricus jungiasi prie DNR kaip oktamerinis iedas, jeigu nra nukleotidini kofaktori. Jei yra
ATP, tada RadA sudaro spirals pavidalo nukleoproteinin filament ant vgDNR (Yang ir kt., 2001).
Vykstant mainams in vivo, RadA, kaip RecA ir Rad51 baltymai, susiduria su vairiais trukdiais,
kylaniais tiek i kit baltym, tiek i DNR. Pavyzdiui, tam tikromis slygomis E. coli SSB baltymas
gali konkuruoti su RecA. Panaiai atsitinka ir eukariotuose, todl reikalingi baltymai-pagalbininkai.
Eubakterijose i misij atlieka RecF, RecO ir RecR. Jie skatina RecA prisijungim prie vgDNR
fragmento, kur uima SSB. Mielse panai funkcij atlieka Rad52 ir Rad55/Rad57. Jie padeda Rad51
nustumti RPA nuo vgDNR. Archebakterijose iki iol nerasta RecF, RecO, RecR ir Rad52 homolog.
Taiau yra RadA paralogas RadB (17 pav.), kurio funkcija dar neitirta. Manoma, kad jis gali veikti
kaip DNR grandini main tarpininkas (Komori ir kt., 2000).

27

337

A. fulgidus
Halobacterium

343
1

M. jannaschii
Euryarchaea

Crenarchaea

352
1

M. thermo.
P. abyssii
P. furiosus

311

1
1

P. horikoshii

A. pernix

399
529
319
324

S. solfataricus
A. fulgidus
Halobacterium

234

225

228
251

262

400

1
1

334

I domenas

RecA

RadB

239

P. furiosus
P. horikoshii
A. pernix
S. solfataricus

Dmc51

212

M. thermo.

Rad51

218
1

P. abyssii

Crenarchaea

221

M. jannaschii
Euryarchaea

RadA

356

II domenas
353

1
A

17 pav. Archebakterij baltym RadA ir RadB palyginimas su Rad51, Dmc1 ir RecA (Komori ir
kt., 2000)
RecA baltymas i chloroplast. is baltymas (molekulin mas 39 kDa) imunologikai artimas
E. coli RecA, aptiktas irni (Pisum sativum) chloroplastuose. Vliau panaus baltymas (40.5 kDa)
aptiktas ir baltaiedio vairenio (Arabidopsis thaliana) chloroplastuose. 1993 m. buvo aptiktas pirmas
RecA homologas eukariotuose tai irni chloroplast RecA baltymas, kuris panaus E. coli RecA
tuo, kad vykdo grandini mainus esant ATP ir Mg2+. Nors is baltymas klonuotas i eukariotini
organizm lsteli, taiau savo sandara jis labai artimas prokariot RecA rekombinazei. Eubakterij ir
chloroplast RecA baltym panaumas yra endosimbiotins teorijos, teigianios, kad chloroplastas kilo
i eubakterij, dar vienas i rodym. inoma nemaai prokariot baltym, kurie kaip ir RecA vykdo
grandini mainus, taiau nehidrolizuoja ATP ir savo sandara nepanas j. io tipo baltym
pavyzdiu prokariotuose gali bti E. coli RecT baltymas ir bakteriofago baltymas .
2.2.2.2. RecBCD baltymas (egzonukleaz V)
Egzonukleaz V tai didelis daugiafunkcinis baltymas, kur sudaro RecB (134 kDa), RecC (129
kDa) ir RecD (67 kDa) subvienetai. Juos koduoja recB, recC ir recD genai. RecBCD yra DNR
helikaz, nuo DNR priklausoma ATPaz, be to, turi nuo ATP priklausom egzonukleazin aktyvum
bei silpn ATP skatinam viengrands DNR endonukleazin aktyvum (Churchill ir kt., 1999). is
28

baltymas yra pagrindinis RecBCD rekombinacijos kelio komponentas, padedantis sisavinti linijines
DNR molekules, kurios susidaro dl dvigrandi trki. Tokios molekuls bakterij lstelje atsiranda
konjugacijos, transformacijos ir transdukcijos metu. RecBCD fenotipo mutantai buvo gauti E. coli F
recipient paveikus cheminiais mutagenais. Sukryminus mutantin F kamien su Hfr donoru,
transkonjugant ieiga buvo sumajusi 102103 karto. E. coli recB ir recC nuliniams mutantams
bdingas panaus fenotipas: sumajusi konjugacin, transdukcin ir fag rekombinacija, padidjs
jautrumas DNR paaidas sukeliantiems veiksniams (UV, X spinduliams, cheminiams mutagenams),
sumajs transformacijos efektyvumas bei lsteli gyvybingumas. Genas recD buvo aptiktas tik
nustaius, kad RecD polipeptidas yra sudedamoji egzonukleazs V dalis. RecD fenotipo mutantai
pasiymi normalia konjugacija ir fag rekombinacija. Kai kurie recD genotipo kamienai yra
hiperrekombinogeniki. Toki kamien gyvybingumas yra normalus, nepadidjs jautrumas UV ir X
spinduliams. Esant mutacijai recD gene, baltymas prarasdavo nukleazs savybes, o helikazs
aktyvumas ilikdavo, dl to ilgai buvo manoma, kad btent is subvienetas turi nukleazs aktyvum
(Palas ir Kushner, 1990). Mutacijos recB ir recC genuose panaikindavo visus baltymo aktyvumus.
Taiau naujesni baltymo struktros tyrimai parod, kad vienintelis aktyvus nukleazs saitas yra RecB
subvienete (Singleton ir kt., 2004). RecBCD baltymas viena veikliausi ir greiiausi helikazi.
Vieno prisijungimo metu gali ivynioti iki 30 000 bp ir tai atlieka 1000 bp/s greiiu (Roman ir kt.,
1992). inoma, kad RecB subvienetas turi 35 helikazin aktyvum. Taiau dabar nustatyta, kad
RecD taip pat turi helikazin aktyvum, tik jis veikia 53 kryptimi. Mutacij pagalba inaktyvavus
bet kur i i subvienet, baltymas vis tiek ivynioja dgDNR. Tai rodo, kad RecBCD baltyme yra
aktyvs abu subvienetai. Todl dabar silomas bipoliarinis RecBCD veikimo modelis (Dillingham ir
kt., 2003). Pagal j, dvi DNR helikazs papildo viena kit. Jos juda prieingo poliarikumo principu,
taiau ta paia kryptimi ant skirting dgDNR grandinli (18 pav.).

18 pav. RecBCD heterotrimeras panaudoja dvi aktyvias helikazes: RecB ir RecD. RecD juda
viena DNR grandimi 53 kryptimi, o RecB kita grandimi 35 kryptimi. RecD helikaz
ivynioja DNR greiiau nei RecB, todl susidaro kilpa (Matson, 2003)
RecC baltymas atpasta chi sek. io polipeptido sandaros tyrimai rodo, kad jis turjo kilti i
helikazi, tik dabar neturi io aktyvumo.
Genai recB, recC, recD buvo klonuoti chromosomos thyA argA fragmento sudtyje. Genai recB
ir recD sudaro operon, recC yra transkribuojamas nepriklausomai, nors ta paia kryptimi.
Egzonukleazs V kiekis lstelje nedidelis (apie 10 molekuli).
29

RecBCD baltymo biologins funkcijos:

1. Egzonukleaz

svarbi

keturi

tip

rekombinacijai

konjugacijai,

transdukcijai,

transformacijai fragmentuota chromosomine DNR ir fago redgam rekombinacijai. Visiems

iems procesams bendra yra tai, kad viena reakcijoje dalyvaujani DNR molekuli kur laik
bna linijins dvigrands struktros.
2. RecBCD kartu su RecA baltymu dalyvauja paeistos DNR reparacijoje alinant dvigrandius
trkius.
3. Svetimai DNR patekus lstel, egzonukleaz V j skaldo. iam tikslui tiesiogiai
panaudojamas fermento nukleazinis aktyvumas, o netiesiogiai helikazinis. Dl pastarojo
duplekso grandinls yra atskiriamos, o susidar viengrandiai galai gali bti suardomi ir kit
nukleazi. Todl laukinio kamieno lsteli transformacijos linijine dgDNR efektyvumas sudaro
tik 4 proc. efektyvumo, gaunamo t pat kamien transformuojant iedine DNR. efektyvum
daugiau kaip 10 kart padidina mutacija recD gene. Kadangi egzonukleaz V atlieka apsaugin
funkcij sergdama bakterijos lstel nuo svetimos DNR, nenuostabu, kad daugelis
bakteriofag koduoja specifinius RecBCD fermento inhibitorius. Bakteriofago baltymas
slopina RecBCD aktyvumus, tiesiogiai jungdamasis prie pastarojo. Tai yra btina, norint
apsaugoti DNR nuo degradacijos, kai vyksta fago replikacija besisukanio rato bdu. Geno 2
produktas saugo fago T4 DNR nuo egzonukleazs V. io geno koduojamas baltymas jungiasi
prie linijins bsenos fago genomo gal ir ukerta keli RecBCD baltymui.
4. Kartu su RecA dalyvauja nuo rekombinacijos priklausomoje replikacijoje (r. 2.2.2.1.1.
skirsn).

30


5 GCTGGTGG 3
3
5
RecBCD

Bh
Bnuc
C

ATP
ADP

SSB

3
5

C
3
5

RecA

3
5

Homologika dgDNR

19 pav. Ankstyvieji RecBCD HR kelio etapai (pagal Spies ir Kowalczykowski, 2005). A

RecBCD prisijungia prie DNR ir ivynioja grandines dl RecB ir RecD helikazini aktyvum.
Juddami DNR molekule ie subvientetai traukia DNR galus ir RecC pleitas skelia dgDNR
molekul dvi grandines; B 5 galas per RecD patenka RecB nukleazs domen. 3 gal turinti
grandin keliauja tiesiai RecB nukleazs aktyvj centr, kuriame intensyviai skaldoma. 5
uodega taip pat skaldoma, taiau reiau nei 3 galas, nes dl savo padties negali efektyviai
konkuruoti su 3 u nukleazs aktyvj centr; C atpains sek, RecC stipriai prisijungia toje
vietoje prie 3 uodegos ir neleidia jos toliau skaldyti; D 5 galas dabar gali lengviau sveikauti
su nukleazs saitu ir dl to gali bti daniau skaldomas; E pabaigoje RecBCD ukrauna RecA
baltym ant DNR 3uodegos. Mechanizmas neaikus. Manoma, ia dalyvauja RecB nukleazs
domenas prie baltymo disociacij nuo DNR. Bh ir Bnuc RecB subvieneto helikazs ir nukleazs
domenai
RecBCD baltymas geba atpainti specifines DNR sekas, vadinamas (chi). Pirmiausia i seka
buvo atrasta fage dl cis mutacijos, kuri sukl spartesn fago augim pasinaudojus eimininko E.
coli homologins rekombinacijos sistema. iuo atveju rekombinacijos danis padidjo 10 kart ir
pasireik tam tikru atstumu emiau sekos, tai pagerindavo fago pakavimosi proces (Lam ir kt.,
1974). E. coli genome ios sekos aptinkamos 5 kbp atstumu viena nuo kitos, jas sudaro atuoni
31

nukleotidai 5-GCTGGTGG-3. J aptinkama ymiai daniau nei atsitiktinis atuoni nukleotid

derinys. E. coli MG1655 4,6 Mbp dydio genome yra 1001 tokia seka. Daugiau kaip 60 proc. sek
orientuotos replikacijos ori kryptimi. i orientacija turt skatinti RecBCD vykdom DGT,
susidarani DNR replikacijos metu, reparacij. Sekos atpainimas efektyvus tik tada, kai baltymas
prisijungia i GG-3 puss. Paviens sekos atpainimo tikimyb yra apie 3040 proc. Dl sveikos su
pakinta RecBCD baltymo savybs (19 pav.). Pirmiausia tai sukelia baltymo nukleazinio aktyvumo
poliarikumo pokyius: slopinamas DNR duplekso 3galo skaldymas ir padidja 5galo skaldymas
(Dixon ir Kowalczykowski, 1993), o neaktyvuotos bsenos egzonukleaz V, juddama dvigrande
linijine DNR molekule, intensyviau skaldo 3gal nei 5gal (19 pav.). Todl aktyvuotas RecBCD
baltymas pagamina ilg vgDNR fragment, kurio 3gale yra seka. Grandins nuo 3galo skaldymo
slopinimas jauiamas apie 10 kbp atstumu emyn nuo saito. Pakinta ir helikazinis baltymo
aktyvumas. Sekos atpainimas sukelia trumpalaik (keli sekundi trukms) judanio baltymo
sustojim. Sveikaudamas su saitu, RecBCD paskutin kart kerpa vien i DNR grandini 46
nukleotid atstumu i GG-3 puss (20 pav.) Po to jis vl juda toliau, taiau jau dukart liau. Be to,
RecBCD gyja gebjim ukrauti RecA baltym ant naujai pagamintos vgDNR (Anderson ir kt.,
1997). Taigi reaguodamas sekos poveik, RecBCD fermentas vykdo du pagrindinius homologins
rekombinacijos iniciacijos udavinius: 1) subrandina DGT, sukurdamas dgDNR viengrands DNR
fragment, usibaigiant seka; 2) katalizuoja nukleoproteininio RecA filamento susidarym ant
vgDNR. domu tai, kad SOS indukcijos metu RecBCD baltymas tampa nuo nepriklausomas. Jis
gyja savybi, kurios pasireikia paprastai tik po sveikos su seka: slopina nukleazin ir didina
rekombinacin aktyvum.

20 pav. RecBCD baltymo ir sekos sveika. Rodykl vir rodo krypt, kuria juddamas
RecBCD atpasta i sek
Taip bakterija mobilizuoja savo rekombinacijos sistem atsiradusioms paaidoms paalinti. Bent
por deimtmei vyravo nuomon, kad RecBCD fermento ir sekos sveika bdinga tik E. coli
giminingoms bakterijoms. Vliau io poirio teko atsisakyti, nes panai DNR ir baltym sveika HR
metu nustatyta ir kitose bakterijose (Biswas ir kt., 1998; Chedin ir kt., 1998; Sourice ir kt., 1998).
Trump (58 bp) sek pakako apsaugoti linijin DNR nuo RecBCD tipo baltym poveikio. Tai rodo,
kad i rekombinacijos baltym reguliacija galbt neuniversali, taiau yra plaiai paplitusi. Kai kurios
32

bakterij rys turi baltymus, neabejotinai homologikus RecBCD, kitos tik funkcinius io baltymo
pakaitalus. B. subtilis AddAB helikaz/nukleaz sudaryta i dviej subvienet, kuriuos koduoja addA
ir addB genai. Vienintelis AddAB variklis AddA baltymas, turi SF1 helikazs ir nukleazs domen,
kuris labai panaus RecB baltym. Kaip ir RecB, AddA yra 35 helikaz, o jos 35 nukleazs
aktyvum slopina sveika su B. subtilis rekombinogenika seka Bs (5- AGCGG-3). Kitas subvienetas
AddB neturi didesnio panaumo su RecC ar RecD subvienetais, o jame aptinkamas ATPazs motyvas
ir antros nukleazs saitas panaus AddA baltymo. AddB skaldo DNR spirals grand, turini 5gal.
Netgi nebdamas savo sandara labai panaus RecBCD, AddAB fermentas gali komplementuoti
rekombinacijos ir reparacijos sutrikimus recBrecC E. coli lstelse. AddAB, taip pat kaip ir
RecBCD, jungiasi prie dgDNR, turinios bukus galus, naudoja ATP hidroliz savo judjimui tokia
molekule ir j ivynioja. Taiau skirtingai nei RecBCD, kuris linijin dgDNR skaldo asimetrikai,
AddAB hidrolizuoja abi duplekso grandis vienodai. AddAB homologai aptikti 12-oje gramteigiam
bakterij ri (Spies ir Kowalczykowski, 2005).
sekos leidia atpainti savo arba tos paios ries individ DNR. Svetima DNR, patekusi
bakterijos lstel, toki sek neturi arba j aptinkama tik atsitiktinai. Taigi pernelyg retai. Toki DNR
suskaldys nukleazs.
2.2.2.3. RecE (egzonukleaz VIII) ir RecT
ie baltymai yra svarbs RecE rekombinacijos kelyje. Viena jo ypatybi yra ta, kad plazmidi
rekombinacija iuo keliu gali vykti nepriklausomai nuo RecA baltymo. RecE rekombinacijos kelias
pradeda veikti recB arba recC genotipo kamien terpus sbcA (angl. suppresor of recBC) mutacij
(Barbour ir kt., 1970). Dl ios mutacijos aktyvuojamas laukiniame kamiene neveikiantis recE genas,
dl to atsigauna minto mutanto rekombinacinis aktyvumas bei slopinamas jautrumas mitomicinui.
Gen recE gali aktyvuoti vairios mutacijos. Kai kurios j gali paalinti dal koduojamosios geno sekos
ir dl to likusi dalis gali susilieti su aukiau esanio geno DNR. Baltymas, kuris praranda nema
molekuls dal i NH2 galo, gyja didesn nukleazin aktyvum. RecE taip pat gerai toleruoja
papildomas aminorgtis, kuri gali atsirasti dl mutacij sukelto gen suliejimo. Dabar nustatyta, kad
recE lokusas susideda i dviej atviro skaitymo rmeli. Aukiau esantis recE genas koduoja
egzonukleaz VIII. Antrasis genas, pavadintas recT, koduoja 30 kDa baltym (Hall ir kt., 1993). ie
genai yra kil i kriptinio rac profago, kuris aptinkamas daugelyje, taiau ne visuose E. coli kamien.
Komplementacijos testai parod, kad recE ir recT reikalingi konjugacijai recBrecCsbcB+ (recA+)
kamiene (Clark ir kt., 1993). Delecin analiz atskleid, kad, paalinus recT gen, iame kamiene sumaja konjugacijos danis ir padidja jautrumas UV spinduliuotei bei mitomicinui C. Abiej gen
paalinimas dar labiau padidina jautrum UV ir mitomicinui C, taiau konjugacijos danis ilieka toks
pats kaip ir esant recT delecijai.

33

RecE turi specifin dvigrands DNR egzonukleazin aktyvum. Jis skaldo vien DNR duplekso
grandin i 5galo. Dl ios reakcijos susidaro mononukleotidai ir sveika viengrand DNR. Taigi E.
coli recBrecC kamiene supresorinis sbcA mutacijos poveikis pasireikia tuo, kad aktyvuota egzonukleaz VIII pakeiia neveikiani egzonukleaz V ir sukuria rekombinacijai reikalingus viengrandius 3galus. RecE aktyvum slopina 5 viengrandiai galai ilgesni nei 250 nukleotid.
RecT baltymas vykdo DNR renatracij, po to DNR grandini mainus. RecT gali jungtis tik prie
vgDNR ir suporuoti iedin vgDNR su linijine dgDNR (tai tradiciniai RecA vykdomos reakcijos
substratai). Taiau btina, kad dgDNR bt paveikta egzonukleazs ir turt atvir viengrand
homologikos sekos DNR fragment. Tos nukleazs funkcij ir atlieka RecE. Dl i savybi RecE ir
RecT baltymai gali komplementuoti recA mutacij, kai vyksta plazmidi ir fag rekombinacija. ATP
RecT baltymui nereikalingas. Genai recE ir recT savo sandara bei funkcijomis panas red
sistemos ir genus. Vis dlto j koduojami baltymai skiriasi molekuline mase, antigeninmis
savybmis ir neturi didesns homologijos su fago baltymais.
2.2.2.4. RecF, RecO ir RecR baltymai
E. coli recB ar recC mutant konjugacijos sutrikimus galima paalinti iuos kamienus terpus
dvi papildomas mutacijas sbcB ir sbcC (arba sbcD). sbcB mutacija inaktyvuoja egzonukleaz I
(Kushner ir kt., 1972), sbcC mutacija daro neveikliu vien i dviej SbcCD nukleazs gen (Connelly
ir kt., 1998). Pastaroji nukleaz E. coli laukinio tipo lstelse skaldo kryiaus pavidalo struktras ar
segtukus, kurie susidaro palindrominse sekose DNR replikacijos metu. Dl i dviej mutacij
aktyvuojamas RecF HR kelias. domu tai, kad konjugacijos ir transdukcijos, vykstani iuo keliu
recBCsbcBC lstelse, danis yra beveik toks pat kaip ir laukinio tipo lstelse, kuriose ie procesai
vyksta RecBCD keliu. Kai kuriose bakterij ryse (pavyzdiui, Deinococcus radiodurans) RecF
kelias yra svarbiausias (Spies ir Kowalczykowski, 2005). HR recBCsbcBsbcC genotipo lstelse
priklauso nuo RecF, RecA, RecN, RecJ, RecO, RecQ, RecR ir SSB baltym. iuo atveju subrandinti
DGT padeda RecJ ir RecQ baltymai (r. 2.2.2.6. ir 2.2.2.8. skirsnius). RecQ helikaz atsako madaug
u 75 proc. konjugacins rekombinacijos vyki recBCsbcBsbcC genotipo kamiene. Lik 25 proc.
tenka kitoms helikazms: UvrD (helikaz II) ar HelD (helikaz IV) (Mendonca ir kt., 1995). Skirtingai
nei RecBCD baltymas RecQ neskatina RecA nukleoproteininio filamento susidarymo. Todl vgDNR,
susidariusi dl RecQ poveikio ir susijungusi su SSB, turi bti apsaugota nuo nukleazi. Viena toki
nukleazi egzonukleaz I ir yra inaktyvuojama supresorins sbcB mutacijos. Tai ypa svarbu, nes
ios nukleazs pagrindinis substratas yra vgDNR padengta SSB baltymo.
Genas recF buvo atrastas tiriant mutacij, kuri nulemia jautrum UV bei paeidia rekombinacij
E. coli recBCsbcBC kamienuose. Jis koduoja 40 kDa baltym. Laukinio tipo E. coli kamienuose
recF+ reikalingas vidumolekulinei ir tarpmolekulinei iedini plazmidi rekombinacijai. Genas recF
nebtinas plazmidi rekombinacijai recBCsbcA genotipo kamienuose.
34

Mutacij recO ir recR genuose fenotipas yra panaaus recF mutacijas. ie genai koduoja RecO
(26 kDa) ir RecR (22 kDa) baltymus.
Labai svarbus RecBCD kelio poymis skatinti RecA prisijungim prie vgDNR. Todl
nenuostabu, kad RecF kelyje taip pat yra baltym, atliekani i funkcij. Genetiniai tyrimai rodo,
kad RecA baltymo ukrovimas ant SSB baltymu padengtos vgDNR susijs su RecF, RecO ir RecR
baltym veikla. Gauti RecA mutantai (RecA803), kurie slopina recF mutacijos nulemt jautrum UV.
Tokie mutantiniai RecA paalina SSB nuo vgDNR daug greiiau nei laukinio tipo RecA. Geno ssb
perraika duoda lsteli fenotip, pana recF mutanto. Tai rodo, kad RecF dalyvauja, kai RecA
alina SSB nuo vgDNR. Taip pat inoma nemaai recA aleli, slopinani recF, recO ir recR
mutacijas. Tiek genetiniai, tiek biocheminiai tyrimai rodo, kad ie trys baltymai veikia kaip vienas
kompleksas (Wang ir kt., 1993; Spies ir Kowalczykowski, 2005).
RecFOR baltymai sudaro vairius kompleksus. RecO sveikauja su RecR bei SSB ir skatina RecA
nukleoproteininio komplekso susidarym ant vgDNR padengtos SSB baltymo. RecO skatina
viengrandi DNR susijungim. RecR sveikauja su RecF ir jungiasi prie vietos, kur dgDNR pereina
vgDNR. Biocheminiai tyrimai rodo, kad RecF taip pat links jungtis prie toki sait DNR molekulje.
iam procesui reikalinga ATP hidroliz. RecF (ar RecFR) atpasta vg ir dgDNR fragment, nioje
turint 5gal (21 pav.). Tokios sandaros DNR molekul gali pagaminti RecQ ir RecJ baltymai,
veikdami kartu. RecOR (ar tik RecO) jungiasi prie DNR-RecF(R) ir modifikuoja SSB bei vgDNR
kompleks taip, kad RecA baltymas gali jungtis prie vgDNR (21 pav.).
3
5
RecF
RecO
RecR
F

RecA
3
5

21 pav. RecFOR baltym funkcija susidarant RecA nukleoproteininiam filamentui (pagal Spies ir
Kowalczykowski, 2005). Pilkais rombais pavaizduotas SSB baltymas
RecF kelio baltymai turi savo funkcinius homologus visuose organizmuose nuo bakteriofago iki
mogaus (Beernink ir Morrical, 1999)

35

2.2.2.5. RecG baltymas

Geno recG mutantuose yra padidjs jautrumas UV ir sumajs (35 kartus) rekombinacijos
lygis (Lloyd & Buckman, 1991). Tiriant io geno biologines funkcijas lstelje, recG mutacija buvo
terpta kamienus jau turinius pavieni rec gen mutacijas. Tiriant tokius dvigubus mutantus pagal
mutantinio efekto sustiprjim (sumajus rekombinacijos dan), galima nustatyti, su kuri gen
funkcijomis persidengia recG veikla. yms poveikiai gauti recGrecB, recGrecJ genotipo
kamienuose. Jokio poveikio nepastebta derinyje su recD, recF, recN, recQ mutacijomis. Reikming
sutrikim nustatyta dvigubuose mutantuose su ruv (ruvA, ruvB, ruvC) genais. iuo atveju konjugacins
ir transdukcins rekombinacijos danis bei atsparumas UV sumadavo iki keli imt kart (Lloyd,
1991). Tai rodo, kad ruv ir recG genai yra alternatyvi rekombinacijos keli komponentai laukinio tipo
lstelse.
RecG aminorgi seka panai DNR ir RNR helikazi. Savo savybmis is baltymas panaus
RuvAB kompleks. Jis kaip ir RuvA specifikai jungiasi prie Holidjaus struktr. RecG kaip ir RuvB
turi nuo DNR priklausom ATP-azin aktyvum. RecG negali ivynioti paprast helikazini substrat.
Jis, matyt, negeba karpyti Holidjaus jungi (Kowalczykowski ir kt., 1994).
2.2.2.6. RecJ baltymas
Genas recJ koduoja 63 kDa baltym, kuris viengrands DNR atvilgiu turi 53 egzonukleazin nuo
ATP nepriklausom aktyvum (Lovett ir Kolodner, 1989). RecJ reikalingas rekombinacijai RecF ir
RecE keliais vykti. Nesant veiklaus RecBCD baltymo, mutacija recJ gene 1000 kart sumaina konjugacin rekombinacij ir padidina lstels jautrum UV. Laukinio tipo lstelse, kuriose pagrindinis kelias rekombinantams susidaryti yra RecBCD, mutacijos recJ gene turi nedidel tak konjugacinei rekombinacijai. Nuo io geno labai priklauso plazmidin rekombinacija netgi laukinio tipo recB+recC+
kamienuose. Todl, paeidus recJ gen, plazmidi rekombinacija sumaja 4000 kart (Kolodner ir
kt., 1985). Atrodo, kad genai recJ, recD ir recN funkcikai yra ekvivalentiki, nes atskira mutacija viename i i gen tik neymiai pakeiia konjugacins rekombinacijos dan. Silpnai ireiktas
mutantinis fenotipas ir dvigubuose i gen mutantuose. Tuo tarpu trigubame recJrecDrecN mutante
rekombinant ieiga sumaja 50100 kart ir kamienai tampa jautresni UV (Lloyd ir Buckman,
1991).
2.2.2.7. RecN baltymas
Mutacija recN gene recBCsbcBC genotipo kamienuose 100 kart sumaina konjugacin ir
transdukcin rekombinacij. O jos poveikis recBCsbcA kamieno lstelse yra neymus. io geno
svarb RecF rekombinacijos kelyje rodo ir tai, kad recBCsbcBC kamiene jo raika padidja 2030
kart. Geno recN transkripcija pavaldi LexA baltymui, todl genas aktyvuojamas SOS atsako metu.
is genas yra klonuotas, bet biochemikai jo produktas dar nra gerai itirtas. Manoma, kad RecN
36

dalyvauja susidarant arba padaro prieinamesnius vgDNR 3galus, kurie gali bti panaudoti grandini
mainams. is poiris pagrstas genetiniais tyrimais. Bakterij recBCsbcA kamienuose, kuriuose dl
egzonukleazs VIII veiklos nuolat susidaro 3 viengrandiai DNR galai, recN mutacija neturi labai
ireikto fenotipo. Taiau recBCsbcBC genotipo lstelse, kuriose nra nukleazs, galinios
pagaminti tokius viengrandius galus, recN yra btinas. Galbt RecN dalyvauja toki viengrandi
3gal stabilizacijoje (Kowalczykowski ir kt., 1994). Dl kai kuri recN mutacijos savitum, palyginti
su kit RecF kelio gen mutacijomis, RecN dalyvauja ir RecBCD kelio vykiuose (Skaar ir kt., 2002).
Vis dlto io baltymo funkcija ilieka neaiki. Jis gali bti struktrinis baltymas arba fermentas. N gale
turi ATP/GTP suriimo domen. Galbt lemia teising erdvin rekombinacijoje dalyvaujani
molekuli isidstym.
2.2.2.8. RecQ ir jam giminiki baltymai
E. coli recQ genas nustatytas 1984 m. (Nakayama ir kt., 1984). E. coli recBCsbcB genotipo
kamiene recQ1 mutacija nulemia 20 kart padidjus jautrum UV ir 2070 kart sumajus
konjugacins rekombinacijos efektyvum. Tai rodo, kad recQ yra RecF kelio dalis. Kartu jis yra ir
RecE kelio baltymas, nes dalyvauja plazmidi rekombinacijoje recBCsbcA genotipo kamiene (Luisi-DeLuca ir kt., 1989). Geno recQ mutacija nekeiia lstels gyvybingumo, o padidjs jo produkto
kiekis yra alingas. Geno recQ promotorius turi LexA represoriaus prisijungimo viet ir io geno
ekspresija paklsta SOS reguliacijai. RecQ pasiymi nuo DNR priklausomu dATPazs bei DNR
helikazs aktyvumais. ATP ar dATP hidroliz reikalinga RecQ baltymui ivyniojant dgDNR. RecQ
funkcijos panaios RecBCD. Jis atskiria DNR duplekso grandines, ivynioja molekul 35 kryptimi DNR grandins, prie kurios prisijungs is baltymas, atvilgiu. RecA gali panaudoti atsiradusius
3galus grandini mainams. Manoma, kad 5 viengrandius galus skaldo RecJ.
RecQ supresuoja nehomologin rekombinacij E. coli lstelse (Handa ir kt., 1997). recQ mutantuose padidja nehomologins rekombinacijos danis. RecQ baltymas sudarytas i 610 aminorgi.
Gautas jo katalizinio centro kristalins struktros vaizdas parod, kad jame yra 4 subdomenai (Bernstein ir kt., 2003).
RecQ tipo baltymai sudaro atskir helikazi grup, kurios nariai pasiymi dideliu konservatyvumu
tiek bakterij, tiek mogaus lstelse. Jiems visiems bdingas 400 aminorgi helikazs ir RQC bei
HRDC domenai (Cobb ir Bjergbaek, 2006) (22 pav.).

37

22 pav. RecQ eimos helikazi sandaros palyginimas (Cobb ir Bjergbaek, 2006)

S. cerevisiae panai helikaz koduoja SGS1 genas, kuris yra supresorius lto augimo fenotipo
top3 mutantuose. mogaus genome yra net penki io tipo helikazi genai (WRN, BLM, RECQ4,
RECQ5b ir RECQL) (Cobb ir Bjergbaek, 2006). RecQ eimos helikazs labai svarbios genomo
stabilumui palaikyti. Mutacijos iuose genuose padidina rekombinacijos dan. Pavyzdiui, Sgs1
mutantins miels, auginamos prastomis slygomis, pasiymi ankstyvu senjimu, padidjusiu
mitozinio krosingoverio daniu, genomo nestabilumu, neproporcingais seserini chromatidi mainais,
chromosom aberacijomis, heterozigotikumo praradimu (Onoda ir kt., 2001; Ajima ir kt., 2002),
nehomologine rekombinacija (Yamagata ir kt., 1998). Mutacijos mogaus helikazi genuose sukelia
kelet lig, paveldim kaip autosominiai recesyviniai poymiai. Individai, turintys mutacij BLM
gene, suserga Bliumo (Bloom), WRN gene Vernerio (Werner), RECQ4 Rotmundo-Tomsono
(Rothmund-Thomson) sindromais. ioms patalogijoms bdingas genomo nestabilumo padidjimas ir
polinkis sirgti viu. Bloomo sindromu sergani pacient lstelse padidja homologini
chromosom telomer susijungimo danis. iose lstelse sutriks telomer remonto procesas
(Lillard-Wetherell ir kt., 2004). mogaus lsteli kultroje ijungus helikazs RecQL1 geno veikim,
padidja seserini chromatidi main danis (LeRoy ir kt., 2005).
RecQ helikazi funkcin konservatyvum rodo eksperimentai. mogaus BLM ir WRN genai supresuoja hiperrekombinacin fenotip, atsiradus dl mutacij SGS1 gene, kepimo mieli lstelse.

38

Holliday jungtis

RecA sudaryta struktra

Ivyniotos DNR fragmentas

D kilpa

RNR/DNR hibridas

RNR
DNR 3

G kvadrupleksas (G4)
3

23 pav. RecQ helikazi substratai (Bennett ir Keck, 2004)

RecQ helikazs labai svarbios DNR replikacijai. Mutantuose aptinkama vairi io proceso
sutrikim. ie baltymai dalyvauja replikacijos proceso kontrolje bei ustrigusi replikacijos akui
itaisyme. Bakterij recQ mutantuose pastebtas isiderins replikacijos akui, ustrigusi UV
spinduli sukelt DNR paaid vietose, subrandinimas. Tokiuose mutantuose padidja nedsningos
rekombinacijos danis. mogaus lstelse, neturiniose BLM ar WRN gen, kaupiasi nesubrandinti
replikacijos tarpiniai produktai (Lonn ir kt., 1990; Poot ir kt., 1992). Ustrigusi replikacijos akui
vietose skatinama HR. Nors HR yra labai svarbi genomo stabilumui palaikyti, taiau padidjs jos
danis gali sukelti patalogij, destabilizuoti genom. Taigi egzistuoja ryys tarp RecQ helikazi ir
replikacijos paaid itaisymo HR bdu. RecQ helikazs ypatingos tuo, kad gali atakuoti labai vairias
neprastas DNR struktras, susidaranias DNR replikacijos ir rekombinacijos metu. ia galima
paminti danai susidaranias triaks DNR struktras, D kilpas, segtukus, G kvadrupleksus (G4
DNR) (23 pav.). G4 DNR nebdinga B formos DNR molekulms. ios struktros susidaro G
turtingose genomo vietose dl labai stabili Hoogsteeno vandenilini jungi tarp keturi guanin.
Toks RecQ helikazi lankstumas substrato atvilgiu galjo susidaryti evoliucijos metu kaip atsakas
DNR replikacijos sutrikimus, atsiradusius dl vairiausi prieasi. Replikacijos akuts paaid
reparacija intensyviai tiriama. Taiau labai daug klausim neatsakyta. inoma daug DNR struktr ir
paaid, kurios gali blokuoti replikacij. Paaidos pavojingumas priklauso nuo to, kurioje DNR
molekuls grandinje ji vyko. Paaidos atsiliekanioje grandinje neturt sukelti replikacins akuts
sustojimo, o tik viengrandi DNR fragment susidarym. O paaidos pirmaujanioje grandinje gali
ne tik sustabdyti replikacij, bet ir iardyti replikasom. Antrins struktros, susidaranios DNR
grandinje, yra didelis kliuvinys akuts judjimui. Savita RecQ helikazi savyb efektyviai alinti
G4 DNR darinius (24 pav.). Daug yra paaikinim, kaip HR gali atnaujinti DNR sintez suirus
replikacinei akutei. Manoma, kad paaidos pirmaujanioje grandinje gali sukelti akuts grim
39

(regresij) ir susidaro keturak struktra, primenanti Holidjaus jungt (25 pav.). Tokios molekuls
gali bti sukarpomos (kaip ir Holidjaus jungtis) ir dl to gali susidaryti DGT, kurie bus taisomi HR
bdu, arba gali vykti akuts judjimo krypties perjungimas ir replikacija atsinaujins, nes paeista
sritis bus replikuota pagal kit, naujai susintetint DNR. Nesant RecQ helikazi, keturaks molekuls
subrandinimas vyksta pirmuoju keliu, susidaro DGT, skatinama HR. Taip buvo nustatyta E. coli, kur
ustrigusios replikacijos akuts gelbjamos panaudojant HR mechanizm (Michel ir kt., 2001). Todl
replikacijos akuts sugrinimas galt ukirsti keli pernelyg danai HR. RecQ helikazs gali
sveikauti su tokiomis akotomis molekulmis ir jas subrandinti arba tam mobilizuoti kitus baltymus.
5

3
5

G4 DNR grandinje
slopina DNR replikacij

3
5

3
5

RecQ helikaz juddama

DNR grandine paalina G4

3
5

24 pav. RecQ helikazs gali paalinti replikacijos metu susidaranias vairaus sudtingumo antrines struktras (Bennett ir Keck, 2004)

25 pav. Replikacins akuts grimas, kur gali katalizuoti RecQ helikazs

Yra duomen, rodani, kad eukariot RecQ helikazs svarbios telomer struktrai palaikyti
(Bennett ir Keck, 2004). Kadangi iose chromosomos dalyse yra daug G, todl jose turt susidaryti
G4 dariniai, kuriuos paalina RecQ baltymai. Be to, nustatyta, kad mieli Sgs1 baltymas dalyvauja nuo
telomerazs nepriklausomame telomerini sek ilginime. is vyksmas priklauso nuo HR ir reikalauja
Sgs1 (Johnson ir kt., 2001).
Apibendrinus galima pasakyti, kad RecQ eimos helikazs yra labai svarbios koordinuojant DNR
replikacijos, rekombinacijos ir reparacijos procesus bakterijose bei eukariotuose. Todl mutacijos
40

genuose, koduojaniuose iuos baltymus, sukelia genomo destabilizacij ir su ja susijusius

nepageidaujamus genetins mediagos persitvarkymus.
2.2.2.9. RuvAB baltymai
Rekombinacijos tarpiniai produktai daniausiai sudaryti i dviej dgDNR molekuli, sujungt
Holidjaus jungtimi (HJ). Kad rekombinacija bt ubaigta, mainuose dalyvavusios molekuls turi
bti atskirtos ir nuo j paalinti RecA baltymai. HJ gali migruoti susidarant DNR heterodupleksui.
Teorikai jos judjimas yra izoenerginis, jis gali vykti spontanikai. Kaip rodo tyrimai in vitro
fiziologinmis slygomis, savaiminis judjimas yra neefektyvus. J galt vykdyti ir RecA, taiau
bakterij lstelje t ymiai efektyviau atlieka kiti baltymai (RuvAB kompleksas ir RecG baltymas).
RuvA ir RecG specifikai jungiasi su Holidjaus jungtimi. RecG, pats bdamas ATPaze, gali
katalizuoti grandini migracij, o RuvA tai vykdo tik kartu su RuvB, nes pastarasis pasiymi
ATPaziniu aktyvumu. In vitro nustatyta, kad RuvA ir RuvB baltymai sveikauja tiesiogiai. Esant
RuvA, HJ migracijai vykdyti reikia 2040 kart maesns RuvB koncentracijos. RuvA svarbus
nukreipiant RuvB reikiam taikin (HJ). Taiau RuvA vaidmuo tuo neapsiriboja. Jis svarbus ir HJ
migracijos metu galbt dl to, kad palaiko j tam tikroje erdvinje bsenoje. Pagal vien i naujesni
modeli RuvA baltymas, sudarytas i keturi subvienet, jungiasi prie HJ ir pakeiia jos erdvin
struktr iskleist kvadratin ploktumin. DNR molekuli grandins guli baltymo vagelse ir
nepersidengia. Du RuvB heksamerai jungiasi i prieing pusi prie HJ viet, kur yra heterodupleksai.
Tada prie tokio baltym ir DNR komplekso jungiasi dar vienas RuvA baltym ketvertas ir udaro
DNR vadinamj vlio kiauto struktr. Jos egzistavim patvirtina Mycobacterium leprae RuvA
baltym kristalin bsena, primenanti vlio kiaut su keturiomis angomis DNR molekulms (Roe ir
kt., 1998). RuvB baltymai, prisijung i RuvA on, traukia per savo angas dgDNR ir taip priveria HJ
migruoti. is baltym kompleksas vadinama RuvAB translokaze (Kuzminov, 1999). RuvAB gali
vykdyti i reakcij net esant nemaoms nehomologinms sritims (~1 kbp). DNR spirals judjimo
metu yra laikinai ivyniojamos (26 A pav.).
RuvAB kompleksas skiriasi nuo paprast helikazi, nes jis naudoja ATP tik grandini atskyrimo
etape, t. y. ne stechiometrikai kaip kiti helikazin aktyvum turintys baltymai. Savo heksamerine iedine struktra RuvB panaus SV40 viruso T antigen, dalyvaujant DNR replikacijoje.

41

26 pav. Holidjaus jungties ir RuvA, RuvB bei RuvC baltym sveikos modelis. A RuvAB
komplekso migracija. RuvA atpasta Holidjaus jungt. RuvB vykdo Holidjaus jungties
migracij. Rodyklmis parodyta DNR judjimo kryptis; B RuvBC komplekso susidarymas; C
hipotetinio RuvABC komplekso vaizdas i viraus ir ono. RuvA ir RuvC prisijung i skirting
Holidjaus jungties pusi stabilizuoja RuvB prisijungim. RuvAB vykdo grandini migracij, o
RuvC ,,skaito DNR pirmin sek tol, kol suranda tinkam viet grandini skaldymui
RecG baltymas, vykdydamas HJ migracij, hidrolizuoja ymius ATP kiekius, todl jis labiau yra
paprasta helikaz. RuvAB ir RecG funkcijos nra visikai ekvivalentikos. RuvAB fenotipo mutantai,
skirtingai nuo RecG, yra jautresni UV spinduliuotei. RecG vykdoma grandini migracija maiau
pakanti heterologiniams intarpams.
2.2.2.10. RuvC baltymas
Rekombinacijoje dalyvavusias molekules atskiria ruvC geno produktas. RuvC baltymas jungiasi
prie Holidjaus struktros kaip dimeras. Manoma, kad tuo metu nuo RuvAB translokazs atoka
vienas RuvA subvienet ketvertas. Kerpamos grandinls turi bti homologikos. Kirpimo vietoje
aptinkama seka: 5-[A/T]TT[G/C]-3 (Shah ir kt., 1994, Shida ir kt., 1996). Po io kirpimo DNR
molekuls atsiskiria, kiekvien j trkio viet sujungia DNR ligaz. Dabar jau aiku, kad visi trys
baltymai RuvA, RuvB, RuvC tam tikru momentu bna prisijung prie HJ (26 C pav.). Kadangi ruv
mutant fenotipai rekombinacijos atvilgiu yra vienodi, todl manoma, kad j koduojami baltymai
veikia kartu (Mandal ir kt., 1993). Toks Ruv baltym ir DNR darinys kartais vadinamas rezolvasoma
(Sharples ir kt., 1999). Ruv mutantuose jautrumas UV yra padidjs, o rekombinacijos danis
sumajs. Genetin analiz rodo, kad E. coli, be RuvC, turi ir kit rezolvaz, nes ruvC mutacijos
neymiai paeidia rekombinacijos eig laukiniame kamiene. Kiekvienu atveju ios mutacijos gali bti
komplementuotos padidinus RusA (kriptins E. coli rezolvazs) raik. Tai rodo, kad visuose
mutantuose yra paeistas grandini atskyrimas ir visi trys Ruv baltymai veikia ioje stadijoje.
42

In vitro nustatyta, kad RuvB sustiprina RuvC prisijungim prie HJ ir skatina pastarojo
endonukleazin aktyvum. RuvC taip pat skatina RuvB vykdom HJ migracij. Taiau in vitro
nenustatyta, kad RuvA ir RuvC baltymai tiesiogiai sveikaut. HJ, bdama iskleistoje bsenoje, turi
dvi puses, kurios skiriasi DNR grandini orientacija HJ centro atvilgiu. Vienoje pusje DNR
grandini 53 kryptis sutampa su laikrodio rodykls kryptimi, o irint i kitos puss, yra prieinga
laikrodio rodykls krypiai. RuvA ir HJ kristal tyrimai rodo, kad RuvA tetrameras jungiasi prie
vienos puss (53 prie laikrodio rodykl), o kit pus palieka RuvC dimerui.
Genetiniai ruv mutant tyrimai rodo, kad Ruv baltymai vykdo RecA nukleoproteinini filament,
susidariusi ant dgDNR, disociacij (Adams ir kt., 1994). Jeigu E. coli kamiene yra padidjusio aktyvumo RecA441 baltymas, tai toki lsteli ruv mutantai negyvybingi.
Genai, koduojantys RuvA ir RuvB homologus, plaiai paplit bakterijose. Taiau RuvC homolog
pasitaiko reiau. ruvA ir ruvB genai danai sudaro operon, kartais jame yra ir ruvC. Taiau kai kuriais
atvejais (Synechocystis) ie genai isklaidyti po genom ir yra skirtinguose operonuose (Sharples ir kt.,
1999). RuvC neaptikta Mycoplasma genitalium, M. pneumonine, B. subtilis, Borrelia burgdorferi genomuose. Kai kurie i i organizm turi RusA rezolvaz, taiau mintose mikoplazm ryse nra
RuvC ir RusA baltym gen.
2.2.2.11. SbcB baltymas (egzonukleaz I)
Genas sbcB dar vadinamas xonA. Geno alelis sbcB buvo atrastas kaip rekombinacijos ir
reparacijos atvilgiu defektyvaus fenotipo supresorius recBC kamiene (Kushner ir kt., 1971). i sbcB
mutacija atkuria konjugacins rekombinacijos dan ir atsparum UV bei mitomicinui beveik iki
normalaus lygio, nes slopina SbcB baltymo destruktyvj egzonukleazin 35 aktyvum. Kai nra
io aktyvumo, neskaldomi viengrandiai 3 galai, kurie gali bti panaudoti RecF rekombinacijos
kelyje.
Egzonukleazs I struktriniame gene aptinkama dviej ri mutacij. Mutacijos, vadinamos
sbcB, atkuria rekombinacij ir atsparum UV spinduliams recBC lstelse. Kita mutacija, vadinama
xonA, slopina tik jautrum UV, bet nepaalina HR sutrikim recBC genotipo bakterijose (Kushner ir
kt., 1972). Egzonukleazs I aktyvumas abiej ri mutantuose yra stipriai sumajs. Taiau iki iol
neaiku, kas lemia i dviej aleli skirtumus (Spies ir Kowalczykowski, 2005). Kitas i aleli
skirtumas pasireikia dl nevienodo poveikio nedsningai rekombinacijai. Mutacijos xonA saite
padidina nedsningos rekombinacijos dan. RecBC fenotipui slopinti dar reikia mutacijos sbcC gene.
Egzonukleaz I yra 53 kDa baltymas, kuris turi 35 egzonukleazin aktyvum, pasireikiant vgDNR
atvilgiu. Jeigu vgDNR 3-galas yra fosforilintas, fermentas hidrolizs nevykdo.
2.2.2.12. SbcC ir SbcD baltymai
iuos baltymus koduojantys genai buvo atrasti mutagenezs bdu. Mutacija bent viename i j
buvo reikalinga tam, kad kartu su sbcB galt slopinti recBC kamien mutantin fenotip. Genai
43

sbcC ir sbcD persidengia. Jie koduoja du SbcCD nukleazs subvienetus E. coli lstelse (Gibson ir kt.,
1992; Spies ir Kowalczykowski, 2005). Neseniai nustatyta, kad SbcC ir SbcD gali paalinti baltymus,
kovalentikai prisijungusius prie DNR molekuli gal (Connelly ir kt., 2003). Taip pat i nukleaz
pasiymi nuo ATP priklausomu dgDNR egzonukleaziniu aktyvumu, gali skaldyti palindrom vietoje
susidaranius segtukus ar kryiaus pavidalo DNR molekuli darinius. ie baltymai svarbs ir tuo, kad
yra eukariot Rad50 ir Mre11 baltym, dalyvaujani vairiuose eukariot rekombinacijos procesuose,
homologai. J homologai taip pat aptinkami bakteriofaguose ir archebakterijose. Kai kuri bakterij
ri (pavyzdiui, Neisseria gonorrhoeae) genome i gen nra.
2.2.2.13. SSB baltymas
Mutacija ssb gene neigiamai veikia tuos biocheminius procesus, kurie susij su laikinu vgDNR
susidarymu: replikacij, rekombinacij, reparacij, mutagenez. Temperatrai jautrios ssb-1 mutacijos
pagalba is genas lokalizuotas E. coli genolapio 92 min (Glassberg ir kt., 1979). Be replikacijos
sutrikim, iam mutantui bdingas ir bendras rekombinacijos danio sumajimas tam tikroje
temperatroje. Pavyzdiui, fago P1 vykdomos transdukcijos danis ssb-1 mutante sumajs penkis
kartus. io geno produktas yra spiral destabilizuojantis baltymas, inomas SSB (angl. single strand
binding) pavadinimu. Vienintelis iki iol nustatytas io baltymo aktyvumas gebjimas jungtis prie
vgDNR. Homologins rekombinacijos metu SSB skatina grandini mainus, nes apsaugo susidarani
vgDNR nuo kai kuri nukleazi. Sprendiant pagal klonuoto ssb geno nukleotid sek, jo produktas
turt bti sudarytas i 177 aminorgi liekan. Fiziologinmis slygomis SSB yra tetrameras.
Kiekvienas subvienetas turi jungimosi prie DNR sait (27 pav.). Tokio saito dydis, priklausomai nuo
slyg (ypa nuo drusk koncentracijos), gali bti nuo 35 iki 65 nukleotid.

27 pav. SSB ir taisyklingo RecA nukleoproteininio filamento susidarymas (Kuzminov, 1999).

Vientisa linija pavaizduota vgDNR; SSB baltymas karoliuk ketvertais; RecA filamentas
staiakampiu apvaliais kampais
44

Dl vgDNR SSB konkuruoja su RecA, taiau prisijungs ATP, RecA gyja gebjim pakeisti SSB
ant vgDNR molekuls. E. coli lstelse i RecA savyb aktyvuoja RecBCD ar RecFOR baltymai (r.
2.2.2.2. ir 2.2.2.4. skirsnius). SSB baltymas geba prisijungti ir prie vgDNR srii, sudarani antrines
struktras ir sunkinani RecA-ATP sveik su DNR. Po to RecA-ATP paalina SSB nuo tokios
grandins, todl gali susidaryti vientisas nukleoproteininis RecA-DNR filamentas. SSB svarbus ne tik
presinapsinje, bet ir postsinapsinje DNR main fazje. iuo atveju jis ukerta keli susidaryti
tinklinms struktroms tarp DNR molekuli, nes po main atsirad istumtos vgDNR galai kur laik
nedalyvauja rekombinacijoje dl SSB veikimo.
2.2.2.14. DNR topoizomerazs
E. coli chromosoma yra neigiamai superspiralizuota. Lstels baltymai prisitaik sveikauti su
tokia DNR. Superspiralizacijos sumajimas slopina homologin rekombinacij. Superspiralizuotos
DNR fragmento pakeitimas svetima DNR turt sumainti supervij skaii. Jis energetikai bt
naudingas tuo, kad tokioje molekulje sumat tempimas. Visi superspiralizacijos pokyiai lstelje
yra susij su baltym, vadinam topoizomerazmis, veikla. ie fermentai katalizuoja viengrandi ir
dvigrandi DNR trki susidarym ir paalinim, o kartu ir DNR superspiralizacij, ir atpalaidavim.
Jos yra dviej tip: I tipo topoizomerazs relaksuoja superspiralizuot DNR, kirpdamos vien DNR
duplekso grandin; II tipo topoizomerazs katalizuoja superspiralizacij, sukeldamos ir paalindamos
dvigrandius trkius DNR molekulje.
I tipo DNR topoizomerazs skirstomos dvi negiminikas grupes A ir B. A grupei priskiriami
fermentai, kurie sudaro laikin kovalentin jungt su kirptos grandins 5galu. Jie paprastai sveikauja
tik su neigiamai superspiralizuota DNR. iai grupei priklauso E. coli topoizomeraz I ( baltymas),
topoizomeraz III i termofilini prokariot, mieli topoizomeraz 3. B grups topoizomerazs sudaro
kovalentin jungt su kirptos DNR 3-galu. Jos gali atpalaiduoti tiek teigiamai, tiek neigiamai
superspiralizuot DNR. Iki 1994 m. ios grups fermentai buvo aptinkami tik eukariotuose ir kai
kuriuose virusuose. 1994 m. i hipertermofilins metanbakters Methanopyrus kandleri iskirta DNR
topoizomeraz V, kuri priklauso iai grupei.
Topoizomeraz I (-baltymas). Mutacijos topA gene maina E.coli augimo greit, didina jautrum UV ir MMS, ltina transpozicij. TopA fenotipo mutantams bdinga sumajusi (1000 kart) vidumolekulin plazmidin rekombinacija bei redukuota recA geno raika. TopA mutantin fenotip
slopina mutacijos genuose, koduojaniuose DNR giraz bei topoizomeraz IV. E. coli topoizomeraz I
gali komplementuoti kepimo mieli lsteli, turini top3 mutacij, sultjusio augimo fenotip. Galbt topoizomerazs I vaidmuo genetinje rekombinacijoje yra stabilizuoti DNR molekuli poravimsi
vidiniuose homologijos saituose (28 pav.).

45

28 pav. Topoizomeraz I maina neigiamos DNR superspiralizacijos laipsn ir dl to skatina DNR

molekuli poravimsi RecA katalizuojamoje main reakcijoje (Kuzminov, 1999)
Topoizomeraz II (DNR giraz). Du jos subvienetus koduoja gyrA ir gyrB genai. 1976 m. M.
Gelertas (M. Gellert) atrado baltym kaip aktyvum skatinant fago integracin rekombinacij in
vitro. DNR giraz palaiko E. coli lstels chromosomos neigiamos superspiralizacijos bsen.
Biologikai aktyvus baltymas yra A2B2 bsenoje. Neigiama DNR duplekso superspiraliazacija
palankiai veikia RecA katalizuojam vgDNR terpim dgDNR in vitro. terpimo vietoje sumaja
neigiamos superspiralizacijos laipsnis dgDNR molekulje. Vliau, veikiant topoizomerazei, jis vl
grinamas buvus lyg. DNR girazs mutantuose arba lstelse, paveiktose io fermento
inhibitoriais, yra stipriai paeista UV sukelt paaid DNR molekulje rekombinacin reparacija
(Hays ir Boehmer, 1978). Girazs inhibitoriai sumaina nuo recA+ priklausom reparacij ir
rekombinacij tarp tandemini pasikartojani sek UV apvitintame fage . Lsteli ekstraktuose
DNR girazs inhibitoriai i dalies (5080 proc.) slopina tetramerini plazmidi virtim maesnmis.
DNR giraz ypa svarbi bakterij nedsningai rekombinacijai (r. 6.1. skirsn).
2.2.3. Red rekombinacijos kelias
Netrukus po to, kai E. coli buvo atrastas recA genas (Clark ir Margulies, 1965), nustatyta, kad
recA mutacijos neturi takos homologinei rekombinacijai tarp fago DNR. Nustatyta, kad fago
genai red ir red yra reikalingi iai nuo RecA nepriklausomai rekombinacijai (Franklin, 1967). Gauti
red (angl. recombination defective) mutantai, kuri HR E. coli laukinio tipo kamienuose buvo daugiau
ar maiau paeista ir visikai nevyko recA kamiene. red genas koduoja egzonukleaz. Genas red
koduoja baltym, kuris vykdo vgDNR molekuli suporavim homologijos vietose. Bakteriofago
homologins rekombinacijos sistema kartais vadinama Red keliu. Treiasis genas red btinas E.
coli RecBCD fermentui slopinti. Gam () baltymas jungiasi prie RecBCD ir slopina jo aktyvum (Karu
ir kt., 1975). Gam analogus turi daugelis E. coli bakteriofag, kurie sintetina linijinius savo genomus.
Gaminantis iam baltymui, E. coli kamienas darosi panaus RecBC fenotipo mutant. Siekiant
standartizuoti genetin nomenklatr pasilyta mintus fago baltymus vadinti Exo, Bet, Gam.
Nepaisant i pastang, mokslinje literatroje vartojami ir kiti anksiau minti baltym pavadinimai.
Gautas egzonukleazs baltymo kristalas ir nustatyta, kad tirpale j sudaro trys iedo subvienetai.
Baltymas sveikauja su linijine dgDNR. Juddama dgDNR molekule, egzonukleaz skaldo vien jos
grandin i 5galo.

Taigi susidaro viengrandiai

3galai,

kurie

dalyvauja

homologinje
46

rekombinacijoje. Red produktas savo savybmis panaus RecE baltym. Pats Red rekombinacijos
kelias primena RecE keli, kuris, manoma, taip pat yra fagins kilms. Bet baltymas () jungiasi prie
vgDNR, skatina grandini susijungim homologijos vietose ir katalizuoja j mainus, kuri metu DNR
duplekso grandin pakeiiama jai homologika vgDNR. Main reakcijai vykti reikalingas
homologikos sekos vgDNR tarpas dgDNR molekulje. Mainai vyksta 53 kryptimi vgDNR, prie
kurios prisijungs Bet baltymas. Kita galima io baltymo funkcija apsaugoti vgDNR galus,
susidaranius veikiant Exo, nuo eimininko nukleazi poveikio. Taigi fago rekombinacija gali vykti
keturiais keliais: 1) Red, 2) RecBCD, 3) RecE, 4) RecF. Homologin rekombinacija tarp fago
molekuli yra svarbi fago genomo pakavimui kapsid (29 pav.).

replikacija

cos gal sujungimas

COS

RecB
CD

RecA
,

RecE,
RecF

Re
d

Rekombinacija

replikacija pagal besisukanio

rato mechanizm

pakavimas

29 pav. Lizinis fago ciklas ir jo ryys su rekombinacija. Monomeriniai fago genomo iedai
netinkami pakavimui. Tinkama pakavimui galvut fago DNR gali susidaryti rekombinacijos
bdu (Red, RecBCD, RecE, RecF)
Prokariot homologins rekombinacijos tyrimai svarbs tiek teorikai, tiek praktikai. Dabar
aiku, kad evoliucijos eigoje is procesas iliko gantinai konservatyvus. Todl prokariot baltymai bei
j veikla yra paradigma, su kuria gali bti lyginami eukariot rekombinacijos komponentai. i
informacija taip pat labai svarbi genetinje ininerijoje.

2.3. Eukariot homologin rekombinacija

Eukariotuose homologin rekombinacija vyksta mejozs ir mitozs metu. Mejozinis krosingoveris tai genetikai determinuotas reikinys, btinas taisyklingam chromosom pasiskirstymui gametas. Jo metu susidarantys DGT yra genetikai determinuoti. Mitozinis krosingoveris reikalingas dvi47

grandi trki, atsiradusi somatini lsteli genetinje mediagoje, itaisymui. Taigi abiem vyksmams reikalingas DGT susidarymas. Mieli lstelse mejozinio krosingoverio danis daugiau kaip
tkstant kart yra didesnis nei mitozinio. Taiau mejozin rekombinacija nra paprastas proces,
vykstani lstelse mitozs metu, pagreitinimas. Tarp i dviej reikini yra keletas svarbi skirtum:

mejozin rekombinacija, kaip taisykl, vyksta tarp homologini chromosom, o mitozin

daniau tarp seserini chromatidi;

mejozinis krosingoveris yra grietai reguliuojamas ir susijs su interferencijos reikiniu. Mejozinio krosingoverio metu susidaro sudtinga nukleoproteinin struktra, vadinama sineptoneminiu kompleksu.

Homologin rekombinacija vyksta mejozs profazje. Ji prasideda leptotenoje ir pasibaigia diplotenoje.

2.3.1. Mejozs evoliucija
iuolaikiniame eukariotiniame organizme mejoz valdo imtai gen. Nemaa j dalis svarbi ir mitozei, taiau kai kurie genai bdingi tik mejozei. Sunku sivaizduoti mejozs atsiradim be mitozs.
Pastarosios aparatas taip pat reikalingas genomams mejozs metu atskirti. Darant prielaid, kad mejoz
kilo i mitozs, bandoma isiaikinti, kurie mitozs mechanizmai galjo bti svarbs mejozs atsiradimui, o kurie ne. iuo poiriu, verta tyrinti vairias mitozs formas. inomos dvi mitozs formos:

udaroji mitoz, aptinkama daugelyje vienalsi (pirmuoni, gryb, dumbli);

atviroji mitoz, bdinga daugumai daugialsi organizm.

Primityvi (udaroji) mitozs forma ypatinga tuo, kad jos metu branduolio apvalkalas ilieka viso
proceso metu ir genom atskyrimas baigiasi branduolio persmauga (30 pav.). Dar vienas ios mitozs
poymis maas chromatino kompaktizacijos laipsnis. Tokia mitoz, pavyzdiui, vyksta tripanosomose ir kai kuriose mielse. Manoma, kad toki organizm mejoz taip pat turt pasiymti tam tikrais
senoviniais poymiais. Be to, primityvios mejozs atvej iekoma organizmuose, kuriuose lytinis dauginimasis yra retas reikinys. Kai kurios mieliagrybi rys (pavyzdiui, S. cerevisiae) turi normali
mejoz, panai auktesni eukariot. Taiau kai kuriose kitose, mejozs procesas labai primityvus.
Toks jis yra Schizosaccharomyces pombe, todl gali bti nagrinjamas mus dominaniu klausimu.
iame organizme mejozs metu nesusidaro sineptoneminis kompleksas, nra krosingoverio interferencijos, vietoje centrosomos jos primityvesnis variantas, vadinamas verpsts poliniu knu (angl. spindle pole body). Profazs metu lstels branduolys kelet kart juda i vieno lstels galo kit. iuos
judjimus valdo verpsts polinis knas, prisitvirtins prie vieno i lstels poli. Tokie judesiai reikalingi krosingoveriui vykti. ia krosingoveri danis maesnis nei kepimo mielse.

48

Udaroji
mitoz

Atviroji
mitoz

Verpst

Verpst

30 pav. Udaroji ir atviroji mitoz (Cooper, 2000)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=mitosis,closed&rid=cooper.figgrp.1376

Be to, galima daryti prielaid, kad mejozs atsiradimas buvo nemanomas be linijini chromosom, turini telomerus, susiformavimo. Kadangi neabejojama, kad organizm formos, kuriose kilo is
reikinys, seniai inykusios ir visi samprotavimai iuo klausimu yra hipotetiniai, vis dlto galima manyti, kad pirmykt mejoz buvo panai iuo metu egzistuojani S. pombe.
2.3.2. Su rekombinacija susij reikiniai, vykstantys mejozs metu
Rekombinacija mejozs metu pirmiausia susijusi su vairiais chromosom morfologijos bei elgsenos pokyiais, nauj sublstelini struktr susidarymu ir inykimu bei pokyiais DNR molekulse.
Susisteminta i vyki dinamika chronologine tvarka pateikiama 1 lentelje.
1 lentel. vykiai mejozs profazje, susij su homologine rekombinacija (pagal Roeder, 1997)
Citologiniai
Chromosom
Dvigrandi
Mejozs
morfologija ir SK* Puokts raida
trki (DGT)
rekombinacijos
profazs stadija
poymiai
morfogenez
reparacija
Leptotena
Formuojasi ainiai
Telomeros pradeda Atsiranda DGT Ankstyvieji
elementai
suartti
mazgeliai
Zigotena

Prasideda
chromosom
sinaps

Telomeros sudaro
telkinius

Inyksta DGT

Ankstyvieji
mazgeliai

Pachitena

SK susidarymas

Telomeros
atsiskyrusios

Dvigubos HJ

Vlyvieji
mazgeliai

Diplotena

SK iirimas;
chromosom
kondensacija

Rekombinacijos
produktai

Chiazmai

Diakinez

Tolesn chromosom kondensacija

Chiazmai

*SK sineptoneminis kompleksas.

49

1 lentelje pateikiama vyki seka iek tiek skiriasi vairiose ryse. Pavyzdiui, DGT dinamika
atspindi j raid S. cerevisiae, o rekombinacini mazgeli ir sineptoneminio komplekso formavimosi
eiga tirta kituose organizmuose (kiekvien i lentelje pateikt reikini toliau aptarsime atskirai).
2.3.2.1. Chromosom poravimasis ir sinaps
Chromosom paskirstymas dukterines lsteles mitozs metu yra daug paprastesnis nei mejozje.
Po replikacijos mitozje kohezinai laiko seserines chromatides sukibusias. Jos isidsto lstels viduryje, po to pasiskirsto dukterines lsteles. Mejozs metu vyksta viena DNR replikacija ir du branduolio
pasidalijimai. Prie pirmj dalijimsi homologins chromosomos privalo susirasti viena kit, susiporuoti, ir redukcinio dalijimosi metu tiksliai pasiskirstyti dukterines lsteles. Apie 30 proc. persileidim yra sutrikusio chromosom paskirstymo padarinys (Hassold ir Hunt, 2001). Tik nedaugelis mogaus aneuploidij leidia embrionui igyventi. Tas pats pasakytina ir apie kit organizm chromosom
pasiskirstymo sutrikimus. Nors nemaa dalis mechanizm ir baltym, dalyvaujani iame procese,
evoliucikai konservatyvs, vis dlto egzistuoja ir gana ryks tarpriniai skirtumai. Iki iol neaiku,
kaip mejozs profazje homologins chromosomos (homologai) suranda ir atpasta viena kit. vairi
ri organizm homologins chromosomos gali atpainti viena kit dl skirting mechanizm: DNR
molekuli tarpusavio sveikos, DNR ir baltym sveikos vadinamuosiuose poravimosi centruose, sveikos tarp centromer heterochromatino, telomer tarpusavio ryio ir chromosom teritorij susidarymo (Gerton ir Hawley, 2005). io klausimo sprendim sunkina ir tai, kad daugelio organizm homologini chromosom poravimasis skiriasi nuo j sinapss. Poravimasis tai chromosom isidstymas
greta tam tikru atstumu. Sinaps artimas kontaktas tarp chromosom susidarant sineptoneminiam
kompleksui. Vienuose organizmuose homologai isidsto lygiagreiai per vis savo ilg, o daugelyje
kit suartja tik tam tikrais segmentais. Mutant tyrimai rodo, kad poravimasis skiriasi nuo sinapss.
Gauti mutantai, kuri chromosomos poruojasi, taiau sinaps nevyksta, triploiduose visos trys chromosomos poravimosi metu isidsto greta, o sinapsje konkreiame take dalyvauja tik dvi. Sineptoneminis kompleksas gali susidaryti ir tarp nehomologini chromosom, taiau poruojasi tik homologins
chromosomos.
Visi lytikai besidauginantys organizmai mejozs metu turi pirma suporuoti, sukabinti, po to paskirstyti chromosomas dukterines lsteles, taiau t atlieka pasitelkdami iek tiek skirtingus mechanizmus. Vienas didiausi skirtum yra tai, kad kai kuriuose organizmuose (pavyzdiui, mielse, induoliuose) sinapsei vykti reikia rekombinacijos, o kiti (pavyzdiui, muss, kirmls) naudoja mechanizmus, leidianius sinapsei vykti be rekombinacijos. Be to, yra organizm (pavyzdiui, S. pombe),
kuriuose mejozs metu i viso nesusidaro sineptoneminis kompleksas. Kodl atsirado toki skirtum,
neaiku. Homolog poravimasis daugelyje ri priklauso nuo mejozei specifik DGT susidarymo.
Pastaruosius, kaip matysime vliau, sukelia baltymai, homologiki S. cerevisiae baltymui Spo11 jie
ir pradeda rekombinacij. Kitose ryse homolog poravimuisi nereikia DGT. Be to, yra ri, kuri
50

homologini chromosom jungimasis poras vyksta anksiau nei atsiranda DNR trki. Molekulin
chromosom poravimosi, kuris nepriklauso nuo DGT, prigimtis neaiki. Galbt j iuo atveju lemia
dviej DNR dupleks homologik sek fizins sveikos, taiau vairov neapsiriboja apraytais atvejais. Nors daugelio organizm (pavyzdiui, kukurz, pels, mogaus) chromosomos poruojasi tik generatyvinse lstelse, bet pasitaiko ir iimi. Kai kuri organizm, pavyzdiui, dvisparni brio atstov, homologini chromosom poravimasis vyksta ir somatinse lstelse. Dar prie prasidedant mejozei Drosophila melanogaster chromosomos jau bna isidsiusios poromis. Toks chromosom poravimasis somatinse ir generatyvinse D. melanogaster lstelse inomas jau beveik 100 met. Vaisin musel nra unikali iuo poiriu ris. Heksaploidini kviei somatinse lstelse taip pat vyksta
homologini chromosom poravimasis. Vaisins musels patinliuose mejozinis homolog poravimasis yra paprasiausia somatinio poravimosi tsa. Manoma, kad j nulemia heterochromatino srii tarpusavio sveikos. Yra daug duomen, patvirtinani, kad egzistuoja specifins cis-padtyje veikianios sekos, kurios dalyvauja musi ir kirmli homologini chromosom atpainime. Nematodo Caenorhabditis elegans tokios sekos buvo atrastos kiekvienos i ei chromosom galuose ir pavadintos
HRR (angl. homologue recognition regions). Kiek kitokio pobdio sekos dalyvauja X ir Y chromosom poravimesi. D. melanogaster patinliuose ios chromosomos poruojasi dl sveikos tarp rRNR
gen. Panai funkcij atlieka mogaus X ir Y chromosomose esantis pseudoautosominis rajonas,
PAR1 vienintel didesns homologijos tarp i chromosom vieta. Pauki Z ir W chromosomos
taip pat nehomologikos. J poravimasis ir genetiniai mainai taip pat priklauso nuo pseudoautosominio
rajono sek. Aniasnapis turi net 10 lytini chromosom. Todl penkios heterosom poros privalo turti unikalius pseudoautosominius rajonus ar poravimosi ir rekombinacijos centrus, kad susidaryt
normalios XXXXX gametos patelse ir YYYYY patinliuose.
Atlikti vairi organizm citogenetiniai tyrimai rodo, kad skirtingos chromosomos uima tam tikrus branduolio domenus arba teritorijas. Tai turt skatinti chromosom poravimsi, nes tokiu bdu
efektyviai sumainamas branduolio tris.
Telomer susitelkimas puokts pavidalo struktr mejozs metu, manoma, taip pat padeda
homolog poravimuisi ir rekombinacijai. S. pombe mutantai, kuri sutriks telomer suartjimas ir
puokts susidarymas pasiymi sumajusiu rekombinacijos daniu.
2.3.2.1.1. DGT reikm homologini chromosom poravimesi
Manoma, kad daugelyje ri mejozei specifik DGT sukelta DNR molekuli sveika su giminikomis sekomis homologinje chromosomoje padeda homologams isidstyti greta vienas kito ankstyvos-vidurins leptotenos stadijoje. Toki nuo DGT priklausom homolog sveik vietos matomos
kaip 400 nm tiltai tarp chromosom ai. DGT susidarymas, taigi ir poravimasis, priklauso ir nuo
chromatino struktros. DGT link susidaryti atviruose chromatino rajonuose arba jautriose nukleazms
chromatino vietose. Histono H2B ubikvitilinimas btinas mobilizuojant ir (arba) stabilizuojant DGT
51

susidarymo mechanizm. Nors yra nustatytas ryys tarp chromatino struktros, homolog poravimosi
ir rekombinacijos, i vyki tarpusavio priklausomumas dar tik pradedamas tirti.
Nustatyta, kad mielse chromosom poravimasis susijs su homologijos paieka visame genome.
Jeigu kokio nors mieli geno kopija terpiama nauj viet genome, mejozs metu vyksta jos sveika
su prastoje chromosomos vietoje esania to geno kopija. Homologijos paiek tarp chromosom tikriausiai vykdo E. coli rekombinacijos baltymo RecA homologai Rad51 ir Dmc1. Pavyzdiui, mielse
S. cerevisiae ektopins rekombinacijos danis tarp vienod sek, esani homologinse chromosomose, nedaug skiriasi nuo ektopins rekombinacijos tarp sek, esani heterologinse chromosomose.
Ektopin rekombinacija gali sukelti genomo nestabilum. Mielse ios rekombinacijos danis gana
didelis. O kitame eukariote, vaisinje muselje, jis daug maesnis. Greita ir nuo DGT nepriklausoma
sinaps ir sineptoneminio komplekso susidarymas muselse, kirmlse ir kai kuriuose kituose organizmuose galbt yra bdas ukirsti keli ektopinei rekombinacijai. Kaip rodo mutant tyrimai, nehomologini chromosom sinaps gali slopinti Mnd1-Hop2 baltym kompleksas. Neseniai nustatyta, kad
dvigubuose mnd1rad51 ir hop2rad51 mieli mutantuose ektopins rekombinacijos danis tarp nehomologini chromosom yra daug didesnis nei pavieniuose i gen mutantuose.
Sinapss susidarymas daugelyje organizm taip pat priklauso nuo DGT. Mielse, vairenyje, pelje, turiniuose mutacij SPO11 geno homologuose, sinaps labai redukuota arba i viso neaptinkama.
Manoma, kad gali bti du nuo rekombinacijos priklausomo homologini chromosom poravimosi bdai: vienas i j priklauso nuo Rad51 gebjimo aptikti homologikas sekas, o kitas siejamas su Dmc1
ir Mnd1-Hop2 baltym veikimu. Tyrimai rodo, kad Mnd1-Hop2 heterodimeras daugiau kaip tris kartus
skatina Dmc1 vykdom grandins terpim. Ne visi organizmai turi DMC1, HOP2 ir MND1 ortologus.
Juos turi induoliai, augalai, pirmuonys ir miels, bet neturi muss, kirmls bei kai kurie grybai (pavyzdiui, Neurospora crassa). Galbt tai nulemia, kad pirmosios grups organizmuose sinapsei ir sineptoneminiam kompleksui susidaryti reikalingi DGT, o antrosios ne (2 lentel).
2 lentel. Homologini chromosom poravimosi ir sinapss vairiuose organizmuose savybi palyginimas (Gerton ir Hawley, 2005)
Pirmas bdas (pavyzdiui, muss, kirmls)
Antras bdas (pavyzdiui, miels, pel, mogus)
1. Nuo DGT nepriklausomas homologini
1. Nuo DGT priklausomas homolog poravimasis
chromsom poravimasis
2. Didelis ektopins rekombinacijos danis
2. Maas ektopins rekombinacijos danis
(mielse)
3. Nra Mnd1-Hop2
3. Mnd1-Hop2 homologai aptinkami
4. Rekombinacija priklauso nuo Rad51
4. Rekombinacija priklauso nuo Dmc1
N. Kleckner nuomone, ankstyvas homolog poravimasis mejozje gali bti susijs su netvirt paranemini jungi tarp DNR dupleks susidarymu (Kleckner, 1996). Eksperimentikai nustatyta, kad
bakterij RecA baltymas homologijos vietose tarp DNR molekuli gali sudaryti tokias paranemines
jungtis. Aptariamu klausimu doms chromosom poravimosi tyrimai organizmuose, kuriuose nevyksta mejozin rekombinacija, arba kuri nerekombinuoja tik tam tikros chromosomos. Pavyzdiui, mejo52

zinis krosingoveris nevyksta Drosophila patinliuose ir Bombyx mori patelse, o taip pat vaisins musels (D. melanogaster) pateli ketvirtojoje homologini chromosom poroje. Nors Drosophila patinliuose nevyksta mejozin rekombinacija, nesusidaro SK, taiau chromosomos poruojasi (31 pav.). Poravimosi metu susidaro bivalentai, kurie isidsto tam tikrose profazinio branduolio vietose. Toks
chromosom udarymas savotikas kienes, dar vadinamas chromosom teritorijomis, matyt, yra
pakankamas surakinti homologus tarpusavyje bent jau centromeros rajonais ir utikrinti taisykling
chromosom paskirstym. Tradicins mejozs metu i funkcij atlieka chiazmai, o B. mori lstelse
sineptoneminis kompleksas, kuris io organizmo lstelse egzistuoja labai ilgai, net iki anafazs I
(Hawley, 2002). Vaisins musels X ir Y chromosom tyrimai rodo, kad ios chromosomos poruojasi
tik vienoje vietoje, konkreiai bobbed lokuse, kuriame sutelkti 18S-28S rRNR genai. O poravimasis
tarp didij chromosom (2 ir 3) musels patinliuose prasideda daugelyje euchromatino viet. Taiau toliau is procesas vyksta dalyvaujant heterochromatino sritims ir tarp j susidaranioms ssajoms. Nei lytini chromosom, nei autosom poravimosi atveju genetiniai mainai patinliuose nevyksta.

31 pav. Mejoz Drosophila patinliuose (pagal Hawley, 2002). Tradicin mejoz (A), kurios metu
susidaro chiazmai ir netradicin mejoz vaisins musels patinliuose (B), kurios metu chiazmai
nesusidaro (paveiksle parodyta tik vienos homologini chromosom poros teritorija)
2.3.2.2. Sineptoneminis kompleksas
1956 m. pirmkart apra M. J. Moses ir D.W. Fawcett (Zickler ir Kleckner, 1999). Sineptoneminis kompleksas tai mejozei bdinga sublstelin struktra. SK susidaro tarp homologini chromosom mejozs profazje (1 lentel). Leptotenoje pradeda formuotis ainiai elementai tai baltym
struktros, kurias sudaro dvi vienos chromosomos chromatids. Zigotenoje homologini chromosom
ainiai elementai suartja visu ilgiu ir susijungia baltymais, sudarydami SK centrin rajon (32 pav.).
Subrendusiame SK ainiai elementai vadinami oniniais ir yra vienas nuo kito vienodu madaug 100
nm atstumu. Kiekvienas SK yra apsuptas chromatino kilp, kurios prisitvirtinusios prie onini element. Labai nedaug DNR yra centriniame rajone. Tarp onini element centriniame rajone susidaro
53

centrinis ir skersiniai elementai. Vieni skersiniai elementai kerta vis centrin rajon, o kiti siekia tik
centrin element.

32 pav. Sineptoneminio komplekso diagrama (pagal Roeder, 1997)

SK einani chromosom DNR yra chromatino kilp pavidalo. Kiekviena kilpa savo pagrindu
prisitvirtinusi prie oninio elemento. i kilp dydis vairiose ryse nevienodas. Todl labai skiriasi ir
DNR kiekis, tenkantis SK ilgio vienetui. Pavyzdiui, 1 m SK ilgio tenka 1200 kbp mogaus, 500 kbp
mieli DNR. Manoma, kad kilp ilgis gali priklausyti nuo DNR sek, kuriomis jos sveikauja su oniniu elementu, bei chromosomos struktros. Pavyzdiui, kilp dydis 23 kartus maesnis telomeriniuose galuose. Taip pat svarbus ir lsteli tipas, nes kai dirbtin chromosoma, susidedanti daugiausia i
mogaus DNR, dauginama mielse, mogaus DNR kilpos pasidaro mieli DNR kilp dydio. SK
diagrama sukurta remiantis stebjimais elektroniniu mikroskopu. Mikroskopu SK rasta vairi organizm mejozinse lstelse (33, 34 pav.).

33 pav. Keturi SK drugio Hyalophora columbia branduolyje. Matomi oniniai elementai ir chromatino kilpos (preparatas nudayta sidabro nitratu); vaizdas gautas elektroniniu mikroskopu (Roeder, 1997)

54

34 pav. Saccharomyces cerevisiae branduolys pachitenos stadijoje. Nuotraukoje matomos 16

chromosom, kuri kiekvienoje yra du oniniai elementai (LE), susiformavs SK centrinis elementas ir chromatino kilpos. Taip pat matomas branduollis (NLL) ir verpsts poliniai knai
(SPB). Juostel = 3m (Kleckner, 1996)
SK susidarymas tarp homologini chromosom prasideda keliose vietose dalyvaujant vadinamajam sinapss iniciacijos kompleksui, kur eina bent du baltymai (Zip2, Zip3) (Chua ir Roeder, 1998).
is kompleksas skatina Zip1 baltymo, kuris aptinkamas SK centriniame rajone, polimerizacij. Zip1
suartina homologines chromosomas per vis j ilg. Tyrimai, atlikti naudojant antiknus, parod, kad
sinapss iniciacijos kompleksas gana tolygiai isidsts iilgai homologini chromosom.
SK sudt eina ir daugiau baltym: Red1, Hop1, Mek1, SYCP1, SYCP2, SYCP3 ir kt. (Page ir
Hawley, 2004). Red1 btinas ainiams elementams susidaryti. Hop1 - taip pat aini element baltymas, bet jo lokalizacija priklauso nuo Red1. Mek1 mejozei specifin serino/treonino kinaz, dalyvaujanti SK susidaryme ir fosforilinanti Red1. Fosforilintas Red1 sudaro heterooligomer Red1-Hop1,
kuris btinas SK susidarymui. SYCP2 ir SYCP3 yra onini/aini element baltymai. Sycp1 mutantinse pelse susidaro normals ainiai elementai, homologai isidsto greta, taiau sinaps nevyksta (de
Vries ir kt., 2005). Tai rodo, kad SYCP1 yra skersini element baltymas. Sycp3 mutantini peli
spermatocituose nesusidaro ainiai elementai. Spermatocituose nevyksta ir SYCP2 lokalizacija ainiuose elementuose. Sycp2 mutantins pels pasiymi lytiniu dimorfizmu sutrikim atvilgiu: patinai
sterils (sutrikusi mejoz lytinse lstelse), patels pusiau fertilios (stipriai sumajs vados dydis).
Scyp2 mutantuose sinaps nevyksta.
Nepaisant to, kad SK susidarymas jau seniai tiriamas ir inomi pagrindiniai jo etapai, pagrindin
klausim, kas nulemia SK lokalizacijos viet, lieka neatsakyta. Daugelyje organizm mejozin rekombinacija prasideda anksiau nei susidaro SK ir yra reikalinga pastarojo susidarymui (Henderson ir Keeney, 2005). Dvigrandiai trkiai, sukeliantys mejozin rekombinacij, atsiranda ankstyvoje profazje
(1 lentel) prie SK susiformavim. Tai bdinga daugeliui organizm: mielms ir kitiems grybams,
augalams, induoliams. i organizm mutantuose, kuriuose sutriks DGT susidarymas, arba kuriuose
55

netinkamai subrandinami rekombinacijos tarpiniai produktai, SK formavimasis vyksta daug reiau ir

nenormaliai. Nustatyta, kad kai kuriais atvejais SK susidarym galima sukelti tokius mutantus paveikus DNR paaidas sukelianiomis mediagomis. Taiau SK ir rekombinacijos priklausomumas nra
universalus. Pavyzdiui, D. melanogaster ir C. elegans mutantai, net ir negaldami vykdyti mejozin
rekombinacij, sudaro normalius SK. Be to, net ir ryse, kuriose normali SK raida priklauso nuo rekombinacijos, SK defektai, esant rekombinogenezs sutrikimams, vairuoja. Pavyzdiui, kepimo mieli mutantuose su paeistu rekombinacijos mechanizmu SK susidaro atsitiktinai ir ne iki galo: tik kai
kurios chromosomos patiria visik sinaps. Taigi minti stebjimai rodo, kad mejozin rekombinacija
skatina SK susidarym ir kad jo priklausomumas nuo rekombinacijos kai kuriose ryse labiau ireiktas. Vienu i bd, patvirtinani tok priklausomum, galt bti tai, kad SK raida prasideda rekombinacijos vietose. Taip Sardaria macrospora SK susidarymo pradios takai erdvikai sutampa su krosingoverio vietomis. Be to mutantuose, kuriuose maesnis krosingoverio danis, susidaro maiau SK.
iuolaikiniai molekulins genetikos metodai taip pat danai patvirtina teigin, kad sinaps prasideda
mejozins rekombinacijos vietose. Kepimo mielse kai kurie SK baltymai (Zip3, Zip2, Zip1 ir Msh4)
eina sinapss pradios komplekso sudt. Bent vienas i i baltym (Zip3) gali patekti mejozines
chromosomas dl sveikos su rekombinacijos baltymais (Agarwal ir Roeder, 2000).
Yra duomen, kad centromeros taip pat gali bti svarbios SK susidarymui, taiau nuomons iuo
klausimu labai prietaringos. Vieni mokslininkai mano, kad centromera gali bti ta vieta, kurioje prasideda SK formavimasis, kiti atvirkiai teigia, kad i chromosomos struktra yra klitis SK polimerizacijai.
SK susidarymas svarbus mejozs poymis, taiau tiksli jo reikm nenustatyta. SK gali bti reikalingas tam tikriems homologins rekombinacijos etapams, pavyzdiui, rekombinuojani struktr
stabilizacijai. Jis, matyt, svarbus krosingoverio interferencijoje. Organizmuose (S. pombe, A. nidulans),
kuri mejozje nesusidaro SK, nra krosingoverio interferencijos. S. cerevisiae zip1 mutantuose, kuriuose paeista SK raida, taip pat nra interferencijos (taiau krosingoveris vyksta). Jeigu paeidim
yra tam tikrose pels ir kukurzo SK vietose, krosingoverio interferencija tokiuose mutantuose taip pat
sumaja arba tampa neigiama.
2.3.2.3. Chromosom puokt
Profazje chromosom telomeros sudaro struktr, vadinamj puokt (angl. bouquet). is darinys daniausiai irykja perjime i leptotenos zigoten (35 pav.).

56

35 pav. Puokts susidarymo ir isisklaidymo modelis. Proleptotena: telomeros (rausvi takai)

po DNR replikacijos juda link branduolio apvalkallio vidins puss ir matomos branduolio periferinje dalyje. Leptotena: chromosom telomeros atsitiktinai prisitvirtinusios prie vidins branduolio apvalkallio puss. Zigotena: perjimo i leptotenos zigoten stadijoje telomeros sudaro
sankaup puokt. Chromosom galai isidst greta ir dl to gali vykti j sveika. Perjimas
i zigotenos pachiten susijs su intensyvia sinapss raida ir chromosom kondensacija. Tai isklaido telomeras. Pachitena: homologai susiporav, SK susidaro per vis homologini chromosom ilg. Skirting susiporavusi chromosom telomeros isisklaid po vis branduolio apvalkalo vidin paviri (pagal Scherthan, 2001)
Jis randamas gryb, augal ir gyvn lstelse (Golubovskaya ir kt., 2002). Evoliucinis puokts konservatyvumas ir tai, kad jos susidarymas sutampa su homolog poravimosi pradia, leidia
manyti, kad ji svarbi homologijos paiekai (Bass ir kt., 2000). Puokts susidarymas vyksta dviem
etapais: 1) telomeros prisitvirtina prie vidinio branduolio apvalkallio paviriaus; 2) jos susivienija
glaud telkin. Iki iol inoma labai nedaug gen, kurie valdo puokts susidarym. Geriausiai itirti
taz1, lot2-s17/rap1 (S. pombe) ir ndj1/tam1 (S. cerevisiae) genai. Augaluose taip pat atrasta keletas
puokts raid veikiani gen: sy1 (rugiuose), pam1 (kukurzuose). Visuose mutantuose ne tik sutriks puokts susidarymas, bet randama ir homologini chromosom sinapss defekt. Taiau
daugelio mutant su homologini chromosom sinapss defektais lstelse puokt susidaro normaliai. Manoma, kad homolog sinaps vyksta vliau nei puokts susidarymas. Kukurz pam1 mutante sutriks arba visikai nevyksta telomer suartjimas. Be to, kaip prasta tokiems mutantams, jame
sutrikusi ir homologini chromosom sinaps: ji arba nepilna, arba vyksta tarp nehomologini chromosom.
Nors tikslus puokts vaidmuo neaikus, bet tikriausiai ji reikalinga homologini chromosom
sveikai bei homologijos paiekai labiau nutolusiuose chromosom rajonuose.
2.3.2.4. Dvigrandi trki susidarymas ir reparacija
DGT susidarymas pagrindinis akstinas organizm lstelse vykti mejoziniam ir mitoziniam krosingoveriui. i trki atsiradimas mejozinse, o kai kuriais atvejais ir mitozinse lstelse yra genetikai uprogramuotas. Kad DGT gali bti genetikai determinuoti, parod poravimosi tipo perjungimo
tyrimai S. cerevisiae lstelse. iuo atveju trkius sukelia sait-specifin nukleaz HO. Tiek DGT susidarymas, tiek vlesni rekombinacijos vykiai pirmiausia pradti tirti kepimo mielse S. cerevisiae. Dirbant su ia rimi, gauti ir pirmieji eukariot mutantai, kuriuose sutrik rekombinacijos procesai. Atliekant genetin mieli mutant, kuriuose sumajs HR danis, sutriks sporuliacijos procesas bei
57

sumajs spor gyvybingumas, analiz, nustatyta daugiau kaip 30 gen, dalyvaujani rekombinacijoje (Krogh ir Symington, 2004). Todl, analizuojant eukariot rekombinacij, didelis dmesys bus
skiriamas btent iems organizmams.
DGT sukeltos homologins rekombinacijos modeliams atsirasti pradi dav mieli transformacijos eksperimentai (Orr-Weaver ir kt., 1981). Jie atskleid kelet svarbi DGT reparacijos poymi.
Pirma, nustatyta, kad plazmid, turinti DGT rajone, homologikame tam tikrai chromosomos DNR sekai, gali bti reparuota ir dl krosingoverio terpta chromosom. Antra, plazmid, turinti tarp homologijos rajone, gali bti ulopyta, upildant j informacija, esania sveikoje, homologik sek turinioje DNR molekulje. Treia, kai mieli lstel transformacijos bdu vedama suskaldyta plazmid
turjo veikiani replikacijos pradios sek, 50 proc. reparacijos vyki buvo susij su krosingoveriu
(plazmid siterpdavo homologik viet chromosomoje) ir 50 proc. atvej susidarydavo autonomikai besireplikuojanti plazmid. Analizuodami iuos rezultatus, Szostak ir kolegos (1983) pasil DGT
itaisymo model, kuris buvo pritaikytas ir mejozs metu susidarani DGT reparacijai aikinti. Pradin modelio versija iek tiek skyrsi nuo dabartins (36 pav. ), kuri teigia, kad DNR trkio vietoje skaidoma 53 kryptimi. iuolaikinis modelis pagrstas keliose laboratorijose gautais rezultatais (Paques
ir Harber, 1999). Nustatyta, kad susidarantys 3 vgDNR galai danai bna ilgesni nei 1 kbp. Toki
DNR gal terpimas homologik nepaeist DNR molekul bei nuo j vykstanti DNR sintez nulemia dvigub HJ susidarym. Atsitiktinis toki HJ suskaldymas duoda krosoverinius ir nekrosoverinius
rekombinacijos produktus. Dvigub HJ egzistavimas buvo rodytas panaudojus dvikrypt (2D) elektroforez.

36 pav. DGT reparacijos modelis pagal Szostak ir kt. (1983). Po DGT susidarymo DNR grandins
skaidomos 53 kryptimi, susidaro viengrandiai 3galai, kurie yra labai rekombinogeniki ir
terpiami homologik DNR dupleks. Nuo toki terpt DNR gal gali prasidti DNR sintez
(rodyklmis pavaizduotos galimos HJ suskaldymo vietos)
58

Toli grau ne visus rekombinacijos vairiuose organizmuose atvejus (pavyzdiui, nevienod geno
konversijos ir krosingoverio dan) buvo galima paaikinti naudojant Szostak ir kt. model, todl buvo
sukurta dar keletas nauj (Paques ir Harber, 1999). Viena tokia modeli grup buvo pavadinta nuo sintezs priklausomo DNR grandini susijungimo vardu (angl. synthesis-dependend strand annealing,
SDSA). ios ries modeliai sukurti siekiant paaikinti kai kuriuos mieli, induoli, E.coli, Ustilago,
Drosophila tyrimo rezultatus. Pagrindin modeli savyb yra ta, kad naujai susintetintos DNR grandins atsiskiria nuo matricos ir sveikauja tarpusavyje. Tai sudaro slygas trk turjusios molekuls
naujai susintetintiems fragmentams susijungti vienam su kitu (37 pav.). Toks terpt DNR gal atsiskyrimas nuo matricos gali vykti veikiant topoizomerazms ar helikazms. Remiantis iuo modeliu
galima paaikinti krosover trkum tarp palikuoni.

37 pav. Paprasiausias SDSA modelis. Abu DGT vietoje susidar DNR 3galai dalyvauja naujos
DNR sintezje
prasta manyti, kad geno konversija vyksta nedidelse DNR atkarpose. Taiau kai kuri eksperiment
duomenys, visikai prietarauja iai nuomonei (Paques ir Harber, 1999). Pavyzdiui, buvo nustatyta,
kad geno konversija kepimo mieli VII chromosomoje gali vykti nuo TRP5 iki ADE5 lokuso. Mieli
genomo sekoskaitos duomenimis, ie du lokusai nutol per 400 kbp. Panai rezultat buvo gauta ir
daugiau. Jie neatitiko Szostak ir kt. modelio. Malkova ir kt., tirdami HO sukelt geno konversij MATa/MAT diploiduose, nustat, kad geno konversijos apimtis gali skirtis priklausomai nuo mieli kamieno genotipo (Malkova ir kt., 1996). Laukiniame kamiene reparacija vyko geno konversijos bdu,
taiau trumpose DNR atkarpose. rad52 diploiduose chromosoma, turinti trk, beveik visada buvo prarandama. Taiau rad51 diploiduose reparacijos efektyvumas siek 45 proc. lygio, nustatyto laukiniame
59

kamiene. Taiau iuo atveju DGT reparacija vyko ne pagal prast schem ir buvo didels apimties.
Toks nuo RAD52 priklausantis ir nuo RAD51 nepriklausomas reparacijos reikinys buvo pavadintas
trkio sukelta replikacija (angl. break-induced replikation, BIR) (38 pav. ).

38 pav. Trys modeliai, aikinantys trkio sukelt replikacij (BIR). Pirmame modelyje teigiama,
kad trkusios chromosomos 3galas terpiamas sveik DNR grandin ir pradeda DNR sintez joje susidarant D kilpai. Antrame modelyje (priimtiniausiame) pavaizduota, kad 3galo terpimas
sukelia ne tik pirmaujanios, bet ir vluojanios grandins DNR replikacij. Rezolvaz suskaldo
Holidjaus tipo jungtis. Treiame modelyje pavaizduota pusiau konservatyvi (D-kilpoje) ir konservatyvi DNR replikacija, kurias sukelia trkis vienoje i chromosom.
Manoma, kad trkio sukelta replikacija turt bti labai svarbi chromosom gal reparacijoje. Pasitelkus anksiau aptartus modelius, bandoma aikinti pavieni chromosom telomer gal palaikym
mieli lstelse, neturiniose telomerazs. Pats procesas priklauso nuo RAD52 ir kai kuri kit gen.
DGT

39 pav. Viengrandi DNR gal susijungimo (SSA) modelis. is rekombinacijos mechanizmas

naudojamas tada, kai DGT vyksta tarp vienakrypi pasikartojani sek (mlyni staiakampiai).
DNR grandini i abiej trkio pusi subrandinimas nulemia viengrandi DNR gal, turini
komplementarias sritis, susidarym ir j susijungim. Nekomplementarius vgDNR galus paalina
nukleazs
Jeigu DGT i abiej pusi supa homologikos sekos, tai toks chromosomos trkis gali bti efektyviai paalintas susijungus viengrandiams chromosom galams (angl. single strand anealing, SSA).
Taiau iuo atveju prarandama viena i homologik sek (39 pav.).
Mielse io homologins rekombinacijos mechanizmo efektyvumas siekia beveik 100 proc., jeigu
trk supanios homologikos sekos yra ne trumpesns nei 400 bp. Reparacija vyksta efektyviai net
60

tuomet, kai tarp homologik sek atstumas siekia 15 kbp. Majant homologik sek ilgiui, rekombinacijos efektyvumas maja. Pavyzdiui, jeigu toki atkarp ilgis yra 60 bp, tai rekombinacijos efektyvumas tik 5 proc.
Daug naudingos informacijos apie mejozinio krosingoverio mechanizmus taip pat dav kartj
rekombinacijos tak tyrimai. Ityrus paaikjo, kad tokiose rekombinogenikose genomo vietose taip
pat susidaro DGT, o juos patyrusios DNR molekuls turi 3 viengrandius galus. Tokie galai susidaro
ir veikiant S. cerevisiae HO endonukleazei MAT lokuse. Rekombinacija iame mieli lokuse svarbi
dauginimuisi. Du skirtingi MAT lokuso aleliai a ir nulemia mieli dauginimosi tip. Konkreiu momentu reikiasi tik vienas i i aleli. Naujo alelio raika MAT lokuse vadinama dauginimosi tipo perjungimu. Sudygusios i sporos mieli lstels yra haploidins (40 pav.). Dygstant sporai, i vadinamosios motinins lstels susidaro dukterin. Dauginimosi tip gali perjungti tam tikru momentu tik motinin lstel. i galimyb priklauso nuo asimetriko ASH1 geno mRNR paskirstymo dukterines lsteles mitozs metu. Dl aktyvios pernaos, kurioje dalyvauja motoriniai baltymai, ASH1 mRNR perneama dukterin lstel, kur ir vyksta jos transliacija. Susintetintas Ash1 baltymas slopina HO geno,
koduojanio to paties pavadinimo nukleaz, raik dukterinse lstelse. Motininse lstelse jis neslopinamas ir veikia labai trump laik perjimo i lstels ciklo stadijos G1 S stadij metu. Todl
motinins lstels gali perjungti savo dauginimosi tip.

40 pav. Saccharomyces homotalinis gyvenimo ciklas (pagal Haber, 1998)

Skirting dauginimosi tip lstels poruojasi tarpusavyje ir susidaro MATa/MAT diploidin lstel, kuri nepalankiomis slygomis gali pradti mejoz ir gali susidaryti haploidins sporos. MAT lokusas kaip ir jam giminingi HML ir HMR lokusai, yra treiojoje S. cerevisiae chromosomoje. Skirtingai
nuo MAT HML ir HMR lokusuose esanti genetin informacija nepasireikia todl, kad jie yra heterochromatino bsenoje (Haber, 1998). MATa ir MAT aleliai gali pasireikti tik bdami MAT lokuse (41
61

pav.). Jie skiriasi madaug 700 bp. Perjungimas nuo vieno alelio kit vyksta rekombinacijos bdu.
HO nukleaz MAT lokuse sukelia dvigrand trk, kurio itaisymas vyksta geno konversijos bdu, panaudojant informacij, esani tyliniuose HML ar HMR lokusuose.
Homologikos sekos
HML, HMR ir MAT lokusuose

HML

MATa

a
HMR

Centromera
Dauginimosi tipo
perjungimas

MAT

41 pav. Dauginimosi tipo lokusas treioje chromosomoje. Be veikianio MAT lokuso, yra du neveikls lokusai HMR ir HML. Kai HO endonukleaz sukelia DGT, dauginimosi tipas gali bti perjungtas itaisant trk geno konversijos bdu. iuo atveju panaudojama genetin informacija,
esanti tyliniuose HMR ir HML lokusuose
iuose lokusuose esani unikali informacij apie a arba dauginimosi tip, supa identikos sekos, kurios svarbios geno konversijai vykti. MAT lokuse trki itaisym galima daniausiai paaikinti
pasinaudojant Szostak ir kt. pasilytu DGT reparacijos modeliu (Szostak ir kt., 1983).
HR yra pagrindinis DGT alinimo bdas S. cerevisiae lstelse. Nehomologini DNR gal sujungimo (NHEJ) vaidmuo iame organizme nra toks svarbus kaip auktesniuose eukariotuose. Paeidus
kur nors NHEJ gen, mieli lstelse nepastebta nei DGT reparacijos sutrikim, nei padidjusio jautrumo JS ar MMS. Tuo tarpu HR sutrikimai sukelia rykius pokyius fenotipe. Mutagenez ir mutant
genetiniai tyrimai dav daugiausia informacijos apie HR mielse. Gauti mieli mutantai, kuriuose HR
procesas paeistas vairiose stadijose. Dalis tarpini HR produkt buvo itirti biochemikai. iuo metu
inoma daugiau kaip10 gen, dl kuri mutacij chromosomose nesusidaro DGT. Norint iaikinti,
koks genas (-i) atsakingas u genetikai nulemt DGT susidarym, buvo tiriami mutantai, kuriuose
blokuotas DNR gal, atsiradusi dl DGT, subrandinimas. iuose mutantuose buvo iekoma
kovalentikai prisijungusi baltym molekuli DGT vietoje prie DNR 5' galo. Toki iskirt DNR
baltymas kompleks analiz parod, kad prie DNR 5 galo kovalentikai prisitvirtins Spo11 baltymas.
Mutacija SPO11 gene buvo aptikta dar anksiau ir blokavo mejozins rekombinacijos pradi.
Mejozs metu Spo11 katalizuoja DGT susidarym 150 200 mieli genomo viet. Tai mejozei
specifikas baltymas savo seka panaus maj IIB topoizomerazs i Sulfolobus shibatae subvienet.
io tipo topoizomerazs sudaro kovalentin 5 fosfotirozilin jungt su DNR ir dl to sukelia laikinus
DGT DNR molekulje. Kai vyksta substrato topoizomerizacija, jungt ir trk paalina pats baltymas.
62

Spo11, atrodo, katalizuoja tik pirmj i dviej topoizomerazins reakcijos etap ir keliuose mutantuose
(rad50S, sae2, mre11-S, mre11-58) aptinkamas trkio vietoje kovalentikai prisijungs prie 5gal.
Tyr-135 io baltymo aktyvaus centro tirozinas. Mutacijos ioje vietoje slopina Spo11 gebjim
katalizuoti DGT susidarym. Manoma, kad laukinio tipo lstelje Spo11 nuo DNR 5gal paalina
baltym Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) kompleksas ir Sae2. Lik laisvi 5galai yra skaldomi. Spo11 skaldo
DNR neatsitiktinai, taiau sait-specifikumu nepasiymi. DGT vietos daniausiai sutampa su chromatino
sritimis, kurios jautrios DNazei I. Paprastai tai gen nekoduojamosios 5 sritys.
Dar devyni genai: MEI4, MER2/REC107, REC102, REC103/SKI8, REC104, REC114, MRE11,
RAD50 ir XRS2, taip pat du mejozei bdingi RNR splaisingo veiksniai Mer1 ir Mre2 reikalingi DGT
susidarymui mejozs metu (Keeney, 2001). MRE11, RAD50 ir XRS2 yra RAD50 epistazins grups
nariai taip pat reikalingi alinant JS sukeltus DGT mitozinse S. cerevisiae lstelse.
Daugelio gen, reikaling DGT susidarymui (iskyrus koduojanius MRX komplekso baltymus),
vaidmuo nepakankamai itirtas.
2.3.2.4.1. DGT subrandinimas
Dl Spo11 baltymo veikimo DGT vietoje susidar dvigrandiai DNR galai turi bti tinkamai subrandinti, kad prasidjusio rekombinacijos proceso metu trkiai bt efektyviai paalinami. iame etape svarbiausi vaidmen, matyt, atlieka Mre11 komplekso baltymai. Mre11 kompleksas nepaprastai
svarbus atsako DGT atsiradim komponentas, nes dalyvauja beveik visuose DNR gal metabolizmo
procesuose: DGT aptikime, subrandinime, homologinje rekombinacijoje ir mejozje, telomer prieiroje ir kt. (Assenmacher ir Hopfner, 2004). Toki funkcij gausyb galima paaikinti tuo, kad is
baltym kompleksas turi net kelet fermentini ir nefermentini aktyvum (3 lentel).
3 lentel. Mre11 komplekso aktyvumas
Aktyvumas
DNR subrandinimas
35 egzonukleaz
53 egzonukleaz
vgDNR endonukleaz
Segtuko atidarymas
Baltymo, prisijungusio prie DNR molekuls galo,
atskyrimas
DNR ivyniojimas
DNR gal ir seserini chromatidi sujungimas
Koaktyvatoriaus savybs
DNR ligaz IV
ATM (angl. ataxia telangiectasia mutated) baltymas
WRN (angl. Werner syndrome helicase)

Pastabos
Aktyvumas priklauso nuo ATP
Bdinga tik bakteriofago T4 46/47 gen
koduojamiems baltymams
Aktyvumas nepriklauso nuo ATP
Aktyvumas priklauso nuo ATP
Escherichia coli SbcCD, aktyvumas
priklauso nuo ATP
Aktyvumas priklauso nuo ATP
Manoma, kad susijs su ATP hidrolize

Mieli mre11, rad50, xrs2 mutantai yra panaios ivaizdos. Jiems bdingas pakits rekombinacijos danis, jautrumas DGT sukeliantiems veiksniams, mejozs sutrikimai ir sultjs vegetatyvini ls63

teli augimas. Genetiniais metodais nustatyta, kad Mre11 kompleksas yra btinas genomo stabilumui.
i mutant lstels sensta, trumpja j telomeros, padaugja chromosom aberacij, sumaja NGS
danis ir kt. Nustatyta, kad mielse Mre11 sveikauja su Rad50 ir Xrs2 baltymais, sudarydami stabil
kompleks Mre11-Rad50-Xrs2 (dar vadinamj MRX). Kai nra Mre11, Rad50 ir Xrs2 tarpusavyje
nesveikauja. Panaus baltym kompleksas Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) aptiktas ir stuburini gyvn
lstelse. Skirtingai nei kepimo mielse mutacijos MRE11, RAD50 ir NBS1 genuose sukelia didelius
sutrikimus, pavyzdiui, polink sirgti viu ir kitomis ligomis. Mutacijos mogaus NBS1 ir RAD50 genuose lemia vadinamj Nijmegen sindrom (angl. Nijmegen breakage syndrome - NBS) ir lig primenani ataksij telengiaktazij (angl. ataxia telengiectasia-like disorder, ATLD). Pacientams pasireikia sultjs augimas, odos paeidimai, imuniteto sutrikimai, polinkis sirgti viu. NBS ir ATLD sindromai primena AT ir lsteli lygmenyje: padidja i lsteli jautrumas jonizuojamajai spinduliuotei,
sutrinka DGT reparacija. Mre -/- genotipo grauik ir viiuko lsteli linijos negyvybingos. Pels,
kuri pavieniai RAD50 ir NBS1 genai ijungti, va embrioniniu laikotarpiu. Tiesa, kai kurie peli
embrionai gali igyventi, jeigu juose paaidos yra antrajame ar treiajame NBS1 geno egzonuose.
Mre11 ir Rad50 baltymai organizm evoliucijos metu iliko konservatyvs. Veikdami kartu, jie
sudaro 35 egzonukleaz, kurios aktyvum skatina ATP, ir kuri gali sveikauti su vairios struktros
DNR galais bei segtukais. Mre11 ir Rad50 ortolog aptinka ne tik eukariotuose, bet ir visose karalystse, skaitant bakteriofagus (gp 47 gp 46 T4), eubakterijas (SbcC SbcD E. coli) ir
archebakterijas (Rad50 Mre11). HsRad50/ScRad50 aminorgi panaumas 51 proc., o
HsMre11/ScMre11 net 61 proc. Dl didelio evoliucinio Mre11/Rad50 komplekso konservatyvumo
galima manyti, kad is pirminis DGT aptikimo/reparacijos veiksnys galjo evoliucionuoti kartu su
rekombinacijos procesais. Treiasis Mre11 komplekso subvienetas NBS1 (arba jo funkcinis
homologas kepimo mielse Xrs2) maiau konservatyvus ir aptinkamas net ne visuose eukariotuose
(DAmours ir Jackson, 2002). Pavyzdiui, augaluose (A. thaliana) aptikti RAD50 ir MRE11 gen
homologai, taiau nerasta XRS2/NBS1 homolog. Savo struktra Nbs1 ir Xrs2 baltymai, matyt, nra
homologiki. A. thaliana rad50 mutanto lstels yra gyvybingos, jose padidjs rekombinacijos
danis, jautrios MMS. Toks augalas yra sterilus.
Gyv organizm evoliucijos metu Nbs1/Xrs2 baltymai prie Mre11/Rad50 komplekso prisijung
galbt tada, kai eukariotuose susiformavo lstels ciklo kontrols mechanizmai ir is kompleksas tapo
svarbus genomo vientisumui palaikyti. Nustatyta, kad Mre11 kompleksas sveikauja su daugeliu kit
baltym, svarbi reparacijos ir lstels ciklo valdymui.
Pati DGT prigimtis ir ypatybs leidia suprasti, kad i trki alinimas reikalauja tam tikr tiek
struktrini, tiek fermentini savybi. Kad bt galima sugauti ir suartinti nutrkusius DNR molekuls
galus, btini tam tikr sandar turintys baltymai. Fermentinis aktyvumas btinas tuos galus paruoiant
sujungimui. Mre11 kompleksas turi visas tam reikalingas savybes. Mre11/Rad50 darinio tyrimai
elektronins mikroskopijos metodais atskleid labai savit struktr, leidiani nesunkiai sivaizduoti
64

i baltym struktrin vaidmen suartinant laisvus dgDNR galus. Mre11 komplesas yra bipoliarins
sandaros, susideda i rutulio pavidalo galvos ir dviej ilg uodeg (42 pav.)
Zn kablys

Zn kablys

Nbs1

Mre11

Mre11

Nbs1

Rad50 ABC domenai

42 pav. Mre112/Rad502/Nbs12 baltym komplekso struktros modelis. Mre11 jungiasi prie Rad50
spiralini uodeg netoli Rad50 ABC domen. Rad50 spiralins uodegos kyo i ABC domen. Uodegos viruje turi cinko kablius, kuriais Mre11 kompleksas dalyvauja molekuli sveikoje (Assenmacher ir Hopfner, 2004)
Mre11 komplekso galva, kuri sudaro sudaro Rad50 ABC ATPazs domenai ir Mre11 dimeras,
turi nukleazs aktyvum. Nors tiesiogiai nerodyta, taiau mutagenezs rezultatai rodo, kad Nbs1/Xrs2
jungiasi prie Mre112:Rad502, sudarydamas kompleks (Lee ir kt., 2003). Iskirtiniausia Mre11 komplekso savyb antiparalelins 60 nm ilgio spirals pavidalo uodegos, kyanios i Rad50 ABC
ATPazs domen. Uodeg viruje yra kablio pavidalo struktros, kurios, dalyvaujant cinko atomui,
gali sudaryti tiltelius: kablys/Zn/kablys (43 pav).
Zn kabliai

N
ATM

ATM

43 pav. Mre11 komplekso sveikos su DNR ir ATM baltymu modelis. Teorikai vienas
Mre112/Rad502/Nbs12 baltym kompleksas gali suartinti dvi seserines chromatides. Kita galima
alternatyva: vienas Mre11 kompleksas jungiasi prie vieno DNR molekuls galo ir iuo atveju skirting DNR gal susijungimas vyksta dl tarpmolekulins sveikos, kurioje dalyvauja kablio pavidalo struktros (Assenmacher ir Hopfner, 2004)

65

Pagrstas eksperiment duomenimis vienas i Mre11 komplekso veiklos modeli teigia, kad sveikoje dalyvauja du Mre112/Rad502 kompleksai. Kiekvienas i j turi po galv, kurios i pradi
jungiasi prie skirting DNR gal ar seserini chromatidi, po to cinko kabliai sukabina jas tarpusavyje. I vis Mre11 komplekso baltym Nbs1/Xrs2 funkcijos ir struktra maiausiai itirtos. Nbs1 fosforilinamas, kai DNR molekulje atsiranda DGT. Jo fosforilinim, matyt, atlieka ATM kinaz. Nbs1 baltymas MRN komplekse tikriausiai atlieka reguliacin funkcij, kuri susijusi su komplekso lokalizacija
branduolyje, signalo perdavimu ir katalizine aktyvacija. is baltymas taip pat reguliuoja nuo ATP priklausom DNR ivyniojim bei egzonukleazin komplekso aktyvum ir yra svarbus subrandinant segtuko pavidalo struktras (Lee ir kt., 2003). Taip pat nustatyta, kad mieli Xrs2 jungiasi prie antrini
DNR struktr bei padeda Mre11/Rad50 surasti DGT. Taigi minti baltymai galbt atsakingi u
Mre11 komplekso gebjim aptikti DNR paaidas. Be to, Nbs1/Xrs2 veikia Mre11 komplekso sveik
su kitais baltymais DGT vietoje.
Neseniai nustatyta, kad Mre11 komplekso homologai SbcC ir SbcD, aptinkami E. coli, gali paalinti prie DNR molekuli gal kovalentikai prisijungusius baltymus (Connelly ir kt., 2003). Remiantis
tokiu giminik baltym aktyvumu, galima manyti, kad ir Mre11 kompleksas geba paalinti kovalentikai prisijungus Spo11 baltym nuo DNR molekuli gal. Tokiam DNR gal subrandinimui reikalingas ATP ir Mre11 komplekso endonukleazinis aktyvumas. Prisijungs Spo11 paalinamas kartu su
nedideliu DNR fragmentu, susidaro vars 3-OH galai, tinkami main reakcijai. Rad50 vykdomos
ATP hidrolizs reikm nra visikai aiki. Manoma, kad ATP hidroliz reikalinga DNR prisijungimui
prie Mre11 komplekso. Be DNR gal atpainimo, ATP sukelti Rad50 ABC domeno struktriniai pokyiai gali skatinti DNR grandini atsiskyrim, kartu palengvindami Mre11 vykdom DNR gal brandinim.
2.3.2.4.2. Grandins terpimas ir DGT itaisymas
Kepimo mielse genai, dalyvaujantys HR, priklauso RAD52 epistazinei grupei. j eina: RAD50,
RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57, RAD59, RDH54/TID1, MRE11 ir XRS2. Lstels, kuriose
paeisti ie genai, yra jautrios JS, bet ne UV. J DNR kaupiasi DGT, yra sutrikusi mitozin ir (ar) mejozin rekombinacija. Pagal fenotip i gen mutantus dar galima suskirstyti maesnes grupes.
Rad51, rad54, rad55 ir rad57 pavieniai mutantai yra vienodo fenotipo, todl jie jungiami RAD51
eim. ios eimos nariai reikalingi ne visuose HR vykiuose. Be to, j jautrumas JS ne taip ireiktas
kaip rad52 mutanto. Rad50, mre11 ir xrs2 mutantai fenotipikai taip pat vienodi, todl jie sudaro kit
grup. Dl funkcinio savitumo homologinje rekombinacijoje RAD59 ir RDH54/TID1 galima priskirti
dar vienai atskirai grupei. Kaip rodo mutant tyrimai, RAD52 reikalingas beveik visiems HR keliams
kepimo mielse. iuo poiriu jis unikalus. Pavienio Rad52 mutanto jautrumas JS toks pats kaip ir
dvigubo Rad52 ir bet kurio kito minto geno mutanto. Literatros duomenimis, kepimo mielse re-

66

kombinacija gali vykti bent dviem keliais Rad51 ir RAD52 keliu, kuris jau nepriklauso nuo RAD51
geno (Symington, 2002).
Anksiau ivardytus mieli HR genus arba j homologus turi ir induoliai, taiau induoli lstels HR dalyvauja daugiau gen. Pavyzdiui, vietoje dviej ScRAD51 paralog RAD55 ir RAD57 induoli lstelse veikia bent penki RAD51 tipo genai: XRCC2, XRCC3, RAD51B (RAD51L1; hREC2;
R51H2) RAD51C (RAD51L2) ir RAD51D (RAD51L3).
Daugel met HR auktesniuosiuose eukariotuose laikyta nelabai svarbia alinant DGT. Manyta,
kad DGT reparacij atlieka iimtinai NGS baltymai. Taiau i nuomon buvo klaidinga, tai rod eksperimentai, kuri metu buvo ijungti HR genai viiuko B limfocit lsteli linijoje DT40. Be to, gautos peli ir peli embrionini kamienini lsteli linijos, kuriose HR genai neveikls. Tokie
organizmai ar lsteli kultros daniausiai davo, arba j gyvybingumas buvo labai sumajs.
S. cerevisiae lstelse grandins terpimo nepaeist DNR dupleks stadijoje veikia keletas gen
(44 pav.). Kai kurie i j (ScRAD51, ScRAD55, ScRAD57, ScDMC1) yra homologiki E. coli recA.
Mutacijos iuose genuose sutrikdo DGT itaisym. ScRad51 baltymas katalizuoja in vitro
viengrandi DNR gal terpim vientis dgDNR molekul. Su vgDNR jis sudaro nukleoproteinin
kompleks, pana RecA-DNR filament. ScRad51 vykdomiems grandini mainams reikia mieli
baltymo savo savybmis panaaus E. coli SSB. Toki funkcij atlieka heterotrimerinis RPA baltymas
(angl. replication protein A). is baltymas apsaugo viengrandius DNR galus nuo nukleazi, neleidia
tokioje molekulje susidaryti antrinms struktroms (pavyzdiui, segtukams) ir galbt koordinuoja
baltym, sveikaujani su viengrandiais DNR galais, veikimo eilikum (Kowalczykowski, 2000).
RPA sudarytas i trij subvienet: RPA70, RPA32 ir RPA14. Toks stabilus kompleksas jungiasi prie
vgDNR 53 kryptimi. RPA baltymas sveikauja su daugeliu baltym (RAD51, RAD52, Wernerio
ir Bloomo sindrom helikazmis, BRCA2, MRX kompleksu ir kt.) (Fanning ir kt., 2006). Jo
paalinimui nuo vgDNR ir ScRad51 filamento susidarymui reikalingi Rad52, Rad55 ir Rad57.
Kadangi, terpiant grandin, susidaro baltym kompleksas, tai tokia struktra vadinama
rekombinosoma, kuri sudaro Rpa, Rad51, Rad52, Rad55, Rad57.

67

44 pav. Homologins rekombinacijos somatinse lstelse eiga (Gill ir Fast, 2007). Dvigrandius
DNR galus, susidariusius dl DGT, subrandina dar iki galo neiaikintos nukleazs (apie galim
MRE11 baltym komplekso vaidmen iame procese rayta 2.3.2.4.1. skirsnyje). Susidariusius
viengrandius galus padengia RPA baltymas. Po to susidaro Rad51 filamentas ir RPA paalinamas
nuo DNR. Rad52p ir Rad55p/Rad57p skatina filamento susidarym. Rad54p taip pat dalyvauja
iame etape. Tuo pat metu vyksta homologijos paieka visame genome. Kai surandamos homologikos sekos, gal subrandinimas baigiasi. iuo metu ant donorins vgDNR randami Rad51p,
Rad52p ir Rad54p. Toliau seka grandins terpimas ir Rad51p nukleoproteininio filamento iirimas. Pastarj skatina helikaz Srs2p. iame etape gali vykti tam tikras DNR skaldymas nuo 3OH galo. Toliau seka DNR sintez ant donoro DNR ir atkuriama dgDNR bsena. Vyksta neteisingai suporuot nukleotid reparacija. Sudaromos kovalentins jungtys DNR molekulje. iame
etape taip pat reikalingi Rad55p ir Rad57p. Mielse visas procesas nuo DGT susidarymo trunka
apie 1 val.
2.3.2.4.3. Holidjaus jungi migracija ir skaldymas. Netaisyklingai suporuot nukleotid
reparacija heteroduplekse
Rekombinacijos metu susidaranti hibridin DNR molekul su dviem Holidjaus jungtimis i tikrj egzistuoja ir buvo aptikta atlikus 2-D elektroforez. HJ migracij mielse, manoma, vykdo
ScRad54, Sgs1 baltymai. Kad bt baigta DGT reparacija, HJ turi bti suskaldytos. Kadangi bakterijose tai atlieka specials baltymai (RuvABC, RecG), tai panai buvo iekoma ir eukariotuose. Susidomta Rad51 paralogais XRCC3 ir Rad51C, kurie, atrodo, turi rezolvazs aktyvum. Pavyzdiui,
Rad51C -/- lstels neturi io aktyvumo (Liu ir kt., 2004). Taip pat manoma, kad, subrandinant HJ, gali
68

dalyvauti ir RecQ eimos helikazs bei topoizomerazs. Be to, vieno ar kito baltymo, pasiyminio
rezolvazs aktyvumu, dalyvavimas priklauso nuo situacijos (Wyman ir Kanaar, 2006). Netaisyklingai
suporuotus nukleotidus, esanius heteroduplekse, mieli lstelse itaiso E. coli MutS ir MutL homologai. Eukariotuose aptikta ne maiau septyni MutS homolog (MSH1-MSH7) (Kang ir kt., 2005).
MSH2/MSH6 (MutS) ir MSH2/MSH3 (MutS) heterodimerai, juddami DNR, atpasta netaisyklingai suporuotus nukleotidus ir jungiasi prie j. MSH4-MSH5 atpasta HJ ir jungiasi prie j mejozs
metu. i baltym vaidmuo nra iki galo itirtas, taiau manoma, kad j heterodimeras gali dalyvauti
DGT reparacijos tarpini produkt stabilizacijoje (Snowden ir kt., 2004). MutL homolog daug rasta
kepimo mieli ir mogaus lstelse. Kepimo mielse tai baltymai: Mlh1, Pms1, Mlh2, Mlh3, mogaus lstelse: Mlh1, Pms1, Pms2, kurie veikia taip pat kaip heterodimerai MutL (MLH1/PMS2) ir
MutL (MLH1/PMS1).
2.3.2.5. Rekombinaciniai mazgeliai
Rekombinacijos metu veikiantys baltymai daniausiai sudaro didesnius ar maesnius kompleksus.
Vienas i sudtingiausi io tipo darini yra rekombinaciniai mazgeliai. Tai maos, tamsi takeli pavidalo struktros, matomos elektroniniu mikroskopu ant chromosom mejozs metu (45 pav.). J aptikta beveik visuose tirtuose organizmuose (Zickler ir Kleckner, 1999). Mazgeliai yra dviej tip. Pirmojo tipo mazgeliai labai vairaus dydio (30200 nm skersmens). Jie matomi ant aini element dar
prie sinaps bei ant naujai susidariusi SK zigotenos ir ankstyvos pachitenos stadijose. Mazgeli
skaiius priklauso nuo SK segmento ilgio. Antrojo tipo mazgeliai vienodesni (100 nm). Aptinkami ant
SK vidurins pachitenos stadijoje. Pirmojo tipo mazgeliai vadinami mejoziniais, zigotenos arba ankstyvaisiais. Antrojo tipo rekombinaciniais arba vlyvaisiais. Tiek vieni, tiek kiti mazgeliai yra fermentiniu aktyvumu pasiymini baltym kompleksai. Manoma, kad ankstyvieji mazgeliai svarbs homologijos paiekai, chromosom poravimuisi. ie vykiai vyksta prie sinaps. Antrojo tipo mazgeliai
svarbs reciprokinei rekombinacijai. Tiriant rekombinacini mazgeli sandar imunocitocheminiais
metodais, paaikjo, kad j sudt eina rekombinacijos procese dalyvaujantys baltymai: Rad51,
Dmc1, RPA, Blm, Mlh1, Atm (angl. Ataxia Telengiectasia Mutated) ir Atr (angl. ATM and RAD3 related). Ankstyvj mazgeli skaiius vlyvoje zigotenoje 410 kart virija vlyvj mazgeli skaii
pachitenos gale. Juose aptinkami Rad51-Dmc1 baltym kompleksai (Moens ir kt., 2007), susij su besiformuojani chromosom erdine dalimi. Kiekvien i baltym telkin supa H2AX histon turintis modifikuotas chromosomos domenas. Pels lsteli branduolyje bna 250300 ankstyvj mazgeli, taiau j skaiius maja chromosomoms kompaktizuojantis. Eksperimentais nustatyta, kad dalis
ankstyvj mazgeli virsta vlyvaisiais, taiau tuo metu juos sudarani baltym sudtis kinta. juos
sijungia RPA, Blm, Msh4 ir topoizomerazs. ie baltymai dalyvauja HJ skaldyme ir netaisyklingai
suporuot nukleotid reparacijoje. Tiriant rekombinacinius mazgelius pastebtas dar vienas domus
dsningumas. Nustatytas priklausomumas tarp mazgeli vlyvojoje pachitenoje ir chiazm skaiiaus.
69

Chiazmai tai fiziniai neseserini chromatidi persikryiavimai homologinse chromosomose (46

pav.). Pagal chiazm skaii nustatomas krosingoverio danis lstels branduolyje. Krosingoveri
skaiius viename branduolyje mejozs metu vairiuose organizmuose gana panaus. Pavyzdiui, pels
lstelse 20, lelijos 50. Taiau DNR molekuli tarpusavio sveik, apie kurias sprendiama i
RAD51/DMC1 sankaup, aptinkam imunocitochemikai, skaiiai gerokai skiriasi (250 pels,
2000 lelijos lstelje).

45 pav. Susiformav SK segmentai su ankstyvaisiais rekombinaciniais mazgeliais zigotenos stadijoje nustatyti penkiose augal ryse (Anderson ir kt., 2001). Rodyklmis parodyti kai kurie rekombinaciniai mazgeliai. SK vietos be mazgeli paymtos intarpo enklais (^).A Cyphomandra betacea; B Tradescantia edwardsiana; C Psilotum nudum; D Allium cepa; E Lilium
longiflorum; F Pilnas zigotenos bivalentas i Lycopersicon esculentum

46 pav. Chiazmai susidaro mejozs pirmoje profazje (www.igh.cnrs.fr/equip/demassy/meiosisI.gif)

Tai rodo, kad ne visos DNR-DNR sveikos perauga reciprokin rekombinacij. i sveik skaiius iek tiek koreliuoja su SK ilgiu (pels 200 m, lelijos lstelse 3000 m). Todl galima manyti, kad ios baltym sankaupos dalyvauja SK susidaryme. SPO11-/- pelse Rad51/Dmc1 telkini nenu70

statyta, todl manoma, kad rekombinaciniai mazgeliai svarbs sinapsei. DNR-DNR sveikos, kurios
nepereina reciprokin rekombinacij, greiiausiai paalinamos baltym, kurie turi helikazitopoizomerazi aktyvumus. Jie sugeba atskirti panaias susivijusias ar net susimazgiusias molekules.
i funkcij gali atlikti topoizomerazinis kompleksas RPA/Msh4/Blm, kuriame gali dalyvauti ir topoizomeraz IIIa. Ji atskiria DNR-DNR jungtis Rad51/Dmc1 sankaup vietose.
Vlyvj rekombinacini mazgeli skaiius (1122 viename iurks lstels branduolyje) ir pasiskirstymas atitinka Mlh1 baltymo telkini pasiskirstym. Tai patvirtina j svarb homologinje rekombinacijoje.
2.3.2.6. Rekombinacija ir chromosom pasiskirstymo dukterines lsteles sutrikimai
1968 m. Henderson ir Edvards ikl hipotez, kad egzistuoja ryys tarp homologins rekombinacijos ir chromosom atsiskyrimo sutrikim (ang. non-disjunction). Pastebta, kad rekombinacijos danio majim, stebim didjant moters amiui, galima susieti su trisomija (Henderson ir Edwards,
1968). Jie man, kad vyresnio amiaus moter mejozines chromosomas tarpusavyje laiko maiau
chiazm, dl to sutrinka chromosom atsiskyrimas pirmojoje mejozje. i hipotez paskatino intensyvius citogenetinius reikinio tyrinjimus. Didioji dalis rezultat gauti tiriant pels oocitus. Vlesni
tyrimai buvo atliekami ir su mogaus oocitais. Hipotez i esms nebuvo nei patvirtinta, nei paneigta.
Pavyzdiui, 1987 m. ityr 34 eimas, turinias palikuoni, sergani Dauno sindromu, Werner ir kt.
nustat, kad yra ryys tarp sumajusio rekombinacijos danio ir mogaus trisomijos. Nors gauta ir
prieing duomen.
Danai stebima, kad tarp 21-os poros chromosom chiazm nesusidaro arba jie susidaro tik distalinse i chromosom srityse. Distaliniai chiazmai taip pat sukelia chromosom pasiskirstymo sutrikimus. Nustatyta, kad rekombinacijos sumajimas gali lemti ir kit chromosom trisomijas ( 15,
16, 18, X; 21, X, Y).
rodyta, kad, nepriklausomai nuo rass, socialins padties ar turim palikuoni skaiiaus, keturiasdeimtmets moters palikuoniams trisomijos rizika yra apie 15 kart didesn nei dvideimtmets,
taiau io reikinio prieastys nra iki galo itirtos. Matyt, takos tam turi daugelis su organizmo senjimu susijusi veiksni, tarp kuri ir rekombinacijos pokyiai.
2.3.3. Eukariot homologins rekombinacijos baltymai ir j savybs
Tiek virus ir bakterij, tiek mogaus ir kit organizm genai, dalyvaujantys HR, yra konservatyvs. Ypa konservatyvi genetini main reakcija, kuri vyksta dalyvaujant RecA/Rad51 eimos baltymams. Taiau ir kiti rekombinacijos etapai pasiymi gana dideliu juose dalyvaujani baltym konservatyvumu. 4 lentelje pateikiamos S. cerevisiae ir mogaus pagrindini HR baltym savybs.

71

4 lentel. Baltymai, dalyvaujantys homologinje rekombinacijoje kepimo mieli (Sacharomyces

cerevisiae) ir mogaus (Homo sapiens) lstelse
S. cereH.
Biocheminis aktyvumas/funkcija
Baltymaipartneriai
visiae
sapiens
Rad 50
Rad50
ATPazinis aktyvumas; jungiasi prie DNR
Mieli lstelse: Mre11;
esant ATP
mogaus lstelse: Mre11,
Nbs1, Brca1, BLM ir kt.
Mre11
Mre11 3'5' dgDNR egzonukleazinis ir vgDNR en- Mieli lstelse: Rad50, Xrs2,
donukleazinis aktyvumai; ivynioja DNR du- Zip2, Zip3;
mogaus lstelse: Mlh1, Trf2,
pleksus ir skaldo segtukus
Ku70, BLM.
Xrs2
Nbs1
mogaus lstelse valdo DNR duplekso
Mieli lstelse: Mre11;
ivyniojim ir MRN komplekso nukleazin
mogaus lstelse: Sp100,
aktyvum; mobilizuoja MRN kompleks
Trf1, Trf2, E2f1
DNR paaid vietas
Rad51
Rad51
Nuo DNR priklausomas jungimosi prie DNR Mieli lstelse: Rad52,
aktyvumas; nuo ATP priklausomas homolog- Rad54, Rad55, Rdh54/ Tid1,
ini DNR molekuli poravimo ir main akty- Sgs1, Zip3, Dmc1, Mlh1, ir kt.
vumas
mogaus lstelse: Rad51C,
Rad52, Rad54, Rad54b, WNR,
Xrcc3, c-Abl, p53, Brca1,
Brca2 ir kt.
Rad51B Jungimosi prie DNR aktyvumas (sustiprja
mogaus lstelse: Rad51C

komplekse su Rad51C); proteinkinazinis aktyvumas; ATPazinis aktyvumas, skatinamas

DNR
Rad51C Jungiasi prie DNR (geriau, kai yra komplekse mogaus lstelse: Rad51,

su Rad51B); DNR skatinamas ATPazinis ak- Rad51B, Rad51D, Xrcc3

tyvumas; nuo ATP nepriklausomas DNR
grandini main aktyvumas; nuo ATP nepriklausomas, Mg2+ reikalaujantis homologik
DNR grandini poravimas; suformuoja filamentines struktras komplekse su Xrcc3
Rad51D
Jungimosi prie DNR aktyvumas pavieniui arba mogaus lstelse: Rad51C,

komplekse su Xrcc2; DNR skatinamas ATP- Xrcc2

azinis aktyvumas; nuo ATP nepriklausomas,
Mg2+ reikalaujantis homologik DNR grandini poravimas; suformuoja filamentines struktras komplekse su Xrcc2; suformuoja filamentines struktras komplekse su Xrcc2
Rad52
Rad52
Jungimosi prie DNR aktyvumas; vgDNR su- Mieli lstelse: Rpa, Rad51,
lipim (renatracij) sukeliantis aktyvumas;
Rad52, Rad59;
silpnas grandini main aktyvumas; silpnas
mogaus lstelse: Rpa,
poravimo pagal homologij aktyvumas
Rad51, Rad52, Ube2I/Ubc9,
Ubl1, Xpb, Xpd, c-Abl
Rad54
Rad54
Jungimosi prie DNR aktyvumas; nuo dgDNR Mieli lstelse: Rad51,
priklausomas ATPazinis aktyvumas; dgDNR Mus81;
ivyniojimas; dgDNR topologij modifikuomogaus lstelse: Rad51,
jantis aktyvumas
Mus81
Rdh54/
Rad54B Jungimosi prie DNR aktyvumas; nuo dgDNR Mieli lstelse: Rad51,
Tid1
priklausomas ATPazinis aktyvumas
Dmc1;
mogaus lstelse: Rad51
72

4 lentels tsinys
S. cereH.
Biocheminis aktyvumas/funkcija
visiae
sapiens
Rad55
Xrcc2
Mielse: ATPaz; mogaus lstelse: jungimosi prie DNR aktyvumas tiek pavienio
baltymo, tiek komplekse su Rad51D; nuo ATP
nepriklausomas, Mg2+ reikalaujantis homologik DNR grandini suporavimas baltymui veikiant komplekse su Rad51D; komplekse
su Rad51D sudaro filamentines struktras
Rad57
Xrcc3
Mielse: ATPaz; mogaus lstelse: jungimosi prie DNR aktyvumas tiek pavienio
baltymo, tiek komplekse su Rad51C; nuo ATP
nepriklausomas, Mg2+ reikalaujantis homologik DNR grandini suporavimas tiek
dalyvaujant iam baltymui, tiek veikiant komplekse su Rad51C; komplekse su Rad51C sudaro filamentines struktras
Rad59
Jungimosi prie DNR aktyvumas; vgDNR

molekuli renatravimo aktyvumas

Baltymaipartneriai
Mieli lstelse: Rad51,
Rad57;
mogaus lstelse: Rad51D

Mieli lstelse: Rad55, Zip3;

mogaus lstelse: Rad51,
Rad51C

Mieli lstelse: Rad52, Rad51

2.3.3.1. Rad51 ir Dmc1 rekombinazs

Jau rodyta, kad E. coli ir kit bakterij lstelse RecA baltymas vaidina pagrindin vaidmen homologinje rekombinacijoje, todl, atsiradus techninms galimybms, panai baltym ir j gen pradta iekoti eukariotuose. 1992 m. klonuoti du mieli genai, kurie kodavo baltymus, homologikus
RecA baltymui. Pirmiausia, i S. cerevisiae klonuotas RAD51 genas, o netrukus i mieli mejozini
transkript klonotekos iskirtas DMC1 (angl. disrupted meiotic cDNA) genas. S. cerevisiae RAD51 genas buvo klonuotas beveik vienu metu ikart trijose laboratorijose. Jo koduojamas baltymas yra struktrinis ir funkcinis RecA homologas. Abu baltymai turi 54 proc. panai aminorgi. ScRad51 baltyme skiriami trys rajonai: N galo domenas (1154 aminorgtys); konservatyvus centrinis (erdinis)
rajonas (155 374 a. r.); C galo sritis ( 375 400 aminorgtys). Konservatyviajame rajone, kuris turi
A ir B Walker motyvus, aminorgi sekos panaumas siekia 61 proc. ScRad51 neturi C gale 112
aminorgi, bding RecA, taiau turi papildomai 120 aminorgi N gale. Be to, ScRad51 turi
numanom leucino utrauktuk tarp 296 ir 317 aminorgi. Paaikjo, kad pirmieji S. cerevisiae
rad51 (angl. radiation) mutantai buvo gauti dar 1974 m. Juose sumajs mitozins ir mejozins rekombinacijos danis bei padidjs jautrumas JS, cisplatinai, bleomicinui, MMC, MMS. Nepaisant i
sutrikim, mieli S. cerevisiae RAD51 nuliniai mutantai yra gyvybingi. Mejozs metu tokiose lstelse
kaupiasi DGT, sutrinka sporuliacija.
Dmc1 ir Rad51 baltymai turi biochemini panaum ir skirtum, tiek tarpusavyje, tiek palyginti
su RecA (5 lentel). Pavyzdiui, ScRad51, HsRad51 kaip ir RecA turi nuo DNR priklausom ATPazin aktyvum. Polimerizuojasi ant vgDNR ir dgDNR molekuli sudarydamas spirals pavidalo
73

filamentus. Taiau tik ScRad51-vgDNR nukleoproteininis filamentas tinkamas substratas genetiniams

mainams. Tarp ScRad51 bei RecA yra ir keletas skirtum. RecA DNR grandini mainus vykdo 5'3'
kryptimi vgDNR, ant kurios susidars filamentas. ScRad51 tokius mainus vykdo abiem kryptimis: tiek
5'3', tiek 3'5'. Yra ir daugiau i baltym biochemini savybi skirtum. Palyginti su RecA,
ScRad51 vykdom main apimtys labai ribotos. ScRad51 efektyvum ioje reakcijoje galima padidinti
pridjus ScRpa ir Rad51 paralogus (Rad55 ir Rad57).
5 lentel. E. coli RecA ir mogaus Rad51 ir Dmc1 baltym savybi palyginimas
Savybs
RecA
Rad51
Dmc1
Molekulin mas (Da) 37842
36966
37707
Natyvi forma
Heksameriniai iedai
iedas
Oktamerinis iedas
Reikalavimai subvgDNR>>dgDNR
vgDNR>dgDNR
vgDNR>dgDNR
stratinei DNR
Jungiasi prie vgDNR
Spiralinis nukleoproSpiralinis nukleoied pavidalo dariniai
teininis filamentas
proteininis filamentas
Jungiasi prie dgDNR
Spiralinis nukleoproSpiralinis nukleoSpiralinis
teininis filamentas
proteininis filamen- nukleoproteininis
tas
filamentas tam tikromis
slygomis
Stechiometrija
1 monomeras : 3 nt
1 monomeras : 3 nt Nenustatyta
Grandins perneimas 2-10 bp/s, > 6 kbp
Ltas, < 1,5 kbp
Ltas
Perneimo kryptis
53
35 ir 53
35ir 53
1993 m. buvo klonuoti mogaus ir pels RAD51 genai. HsRad51 sudarytas i 339 aminorgi,
molekulinis svoris 36.9 kDa. HsRad51 ir EcRecA panaumas siekia 5556 proc. ScRad51 ir
HsRad51 aminorgi panaumas yra 83 proc., 67 proc. i j identikos. Taigi RAD51 yra
konservatyvus eukariotuose. Jo homolog aptikta grybuose, augaluose, vabzdiuose, paukiuose,
induoliuose (6 lentel). Nors ir didelis i baltym panaumas, mogaus baltymas nekomplementuoja
mieli rad51 mutantinio fenotipo.
6 lentel. vairi organizm Rad51 ir jo pagalbiniai baltymai (Modesti ir Kanaar, 2001)
Rad51 asistuojantys baltymai
Organizmas
Rad51
Rad52
Rad51 paralogai
S. cerevisiae
+
+
Rad55, Rad57
C. elegans
+

D. melanogaster
+

Rad51C, Rad51D
Viiukas
+
+
Xrcc2, Xrcc3, Rad51B, Rad51C, Rad51D
mogus
+
+
Xrcc2, Xrcc3, Rad51B, Rad51C, Rad51D
induoli RAD51 baltymas gaminamas dideliais kiekiais kiauidi, sklidi ir limfoidiniuose
audiniuose.

74

Manoma, kad penki anksiau minti HsRAD51 tipo genai (RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2
ir XRCC3) galjo atsirasti dl RAD51 duplikacijos. Vliau jie, matyt, gijo nauj savybi ir gali bti
vadinami HsRAD51 paralogais.
Mieli RAD51 nuliniai mutantai yra gyvybingi, taiau nepavyko gauti gyvybing RAD51
kamienini pels embriono lsteli ir viiuko B limfocit. Neigyvena induoli RAD51 -/-, RAD51B
-/-, RAD51D -/- mutantai. Jie va embriono stadijoje. XRCC -/- genotipo peliukai va gimdami. Tai
rodo i gen svarb lsteli dalijimuisi ir (ar) genomo stabilumo palaikymui. I io tipo baltym,
aprayt mogaus lstelse, didiausiu funkciniu konservatyvumu RecA atvilgiu isiskiria HsRad51.
Jis kaip ir RecA turi nuo DNR priklausom ATPazin aktyvum, polimerizuojasi ant vgDNR ir
dgDNR molekuli, sudarydamas spirals pavidalo filamentus. Taiau HsRad51, palyginti su RecA,
nra labai efektyvus DNR grandini mainuose. Jam reikalingi papildomi baltymai (HsRpa, HsRad52 ir
kt.) mainams vykdyti.
Viena svarbiausi eukariot Rad51 baltym savybi j saveika su daugeliu kit baltym (4 lentel). Pavyzdiui, nustatyta, kad ScRad51 tiesiogiai sveikauja su kitais Rad52 epistazins grups
baltymais (Rad52, Rad54, Rad55, Rdh54/Tid1) ir Sgs1 (WRN ir BLM homologas). Kaip minta, su
kai kuriais i j Rad51 sudaro rekombinosom ir aptinkamas DGT vietose mejozins rekombinacijos
metu. HsRad51 sveikauja su dar daugiau baltym. Jis taip pat sudaro vairius kompleksus su savo paralogais, pavyzdiui, HsRad51-Rad51C-Xrcc3.
Rad51 paralog savybs dar tik pradedamos tirti. Pavyzdiui, Rad51B turi proteinkinazs aktyvum. Jis sveikauja su daugeliu svarbi lstels baltym (p53, ciklinu E, Cdk2 ir kt.). Galbt Rad51B
dl savo kinazinio aktyvumo veikia lstels cikl, todl jis vluoja G1 stadijoje. Rad51B ir Rad51C
sudaro kompleks, gali sveikauti su vairios sandaros DNR molekulmis, ypa su dgDNR, turinia
viengrand 3'gal. Unikalus Rad51B gebjimas specifikai jungtis prie HJ. Be jungimosi prie DNR,
Rad51B, C, D turi nuo DNR priklausom ATPazin aktyvum. Rad51C (skirtingai nuo Rad51B) gali
vykdyti grandini mainus panaiai kaip ir Rad51. iam vyksmui nereikalingas ATP, nes Rad51C gali
denatruoti DNR. Tai tikriausiai unikali io baltymo savyb. iurkno lsteli linija, kurioje paeisti
XRCC2 ir XRCC3 genai, yra jautri JS. Joje stebimas chromosom nestabilumas, kuris greiiausiai yra
sutrikusios HR paskm.
Taigi Rad51 paralogai atlieka ne perteklines funkcijas, kaip manyta anksiau, bet turi unikali savybi. J vaidmuo HR labai specifikas. Jie veikia tik tam tikromis slygomis, tam tikro tipo lstelse
arba tik tam tikrose lstels ciklo stadijose. Pavyzdiui, XRCC2 ir XRCC3 genai veikia smegenyse, kuri lstelse Rad51 raika labai maa. Vis dlto n vienas i i mogaus baltym negali pakeisti
ScRad51 DGT sukeltoje rekombinacijoje, o HsRad51 paralogai negali pakeisti HsRad51. Tai rodo io
baltymo svarb induoli DNR metabolizme ir organizmo raidoje. Tiriant mogaus Rad51 transgen
viiuko lsteli kultroje, rodyta, kad jeigu is genas ijungiamas, tai lstelse, esaniose G2 ir M
stadijose, kaupiasi chromosom trkiai ir jos va. HsRad51 baltymo vaidmuo organizmo raidoje pa75

mau m aikti, kai buvo nustatyta jo sveikos su p53 ir BRCA baltymais. Dar vienas HR baltym
dalyvavimo organizmo raidoje pavyzdys vaisins musels spindle (spnB) genas. Jeigu is genas ijungiamas, patels organizme sutrinka oogenez. I toki oocit besiformuojaniame embrione paeidiamas bendrojo kno plano susidarymas. Oocitams bdinga ryki ventralizacija, kuri, matyt, sukelia signalini molekuli paskirstymo sutrikimai. Kai spindle genas buvo klonuotas, pasirod, kad jo
seka giminika recA/ RAD51 eimai. Vaisins musels lervos, turinios mutacij spindle gene, nepasiymjo padidjusiu jautrumu DNR paaidas sukeliantiems veiksniams, taiau jose buvo susilpnjusi
mejozin rekombinacija ir sutriks chromosom atsiskyrimas.
Eukariot lstelse be Rad51 yra ir kita pana aktyvum turinti rekombinaz Dmc1. Jeigu
Rad51 labai svarbus DNR trki reparacijai mitozs metu, nors veikia ir mejozje, tai Dmc1 reikiasi
tik mejozs metu ir reikalingas mejozinei rekombinacijai. Mieli Dmc1 mutantai nesudaro spor.
Rad51 ir Dmc1 baltym aminorgi panaumas siekia 54 proc.
Abi rekombinazs veikia mejozje, todl domi j tarpusavio sveika. Ryys tarp i baltym buvo nustatytas atradus mejozei specifin baltym Hed1, kuris, nesant Dmc1, slopina Rad51 aktyvum.
Mutacijos HED1 gene panaikina mejozs slopinim dmc1 mutantuose ir aktyvuoja Rad51 mejozei
specifik DGT itaisymui (Tsubouchi ir Roeder, 2006). Imunocheminiai tyrimai rodo, kad Hed1 ir
Rad51 tiesiogiai sveikauja vienas su kitu. Tai patvirtina iuo metu vyraujani nuomon, kad kepimo
mielse mejozs metu daugum grandini main atlieka Dmc1 baltymas. Vis dlto tam tikromis slygomis j gali pakeisti Rad51 (Sheridan ir Bishop, 2006; Tsubouchi ir Roeder, 2006). Rad51 aktyvumo
valdyme mejozs metu dalyvauja ir su ainiais elementais susij baltymai (Xu ir kt., 1997; Niu ir kt.,
2005). rodyta, kad trys tarpusavyje susij aini element baltymai (Red1, Hop1 ir Mek1) reguliuoja
rekombinacijos proces, slopindami nuo Dmc1 nepriklausom rekombinacij. Taiau skirtingai nei jie
Hed1 slopina Rad51 labiau tiesiogiai ir specifikai.
Dmc1 panaumas RecA ir Rad51 nustatytas ityrus mutantus ir atlikus klonuoto geno sekos analiz. Tam tikr Dmc1 ir Rad51 skirtum aptikta tiriant baltymus EM. Dmc1 tirpale links sudaryti atuoni subvienet iedo pavidalo struktras. Panaius darinius jis sudarydavo ir sveikaudamas su
DNR. Dl ios prieasties i pradi manyta, kad baltymas genetinius mainus vykdo kitaip nei Rad51,
taiau vliau nustatyta, kad tam tikromis slygomis Dmc1 taip pat sudaro nukleoproteininius filamentus, prastus RecA tipo rekombinazms (Sehorn ir kt., 2004; Bugreev ir kt., 2005). Netikta tai, kad
ilg io baltymo nukleoproteinini filament ant vgDNR susidarym skatina ne Mg2+, bet Ca2+ jonai.
Jie taip pat skatina ir Dmc1 vykdomus grandini mainus.
Savo funkcijoms lstelje atlikti Dmc1 ir Rad51 naudoja skirtingus papildomus veiksnius. Rad51
polimerizacij DGT vietoje skatina Rad52 ir Rad55-Rad57. Tuo tarpu Dmc1 iedo susidarymas bent i
dalies priklauso nuo Rad51, o jo aktyvumas nuo Sae3-Mei5 baltymo (Tsubouchi ir Roeder, 2003).
Rad54 ir Tid1/Rdh54 baltymai skatina abiej rekombinazi aktyvumus, taiau in vivo Rad54 paprastai

76

veikia su Rad51, o Tid1/Rdh54 su Dmc1. Dmc1 vykdom rekombinacij dar skatina Hop2-Mnd1
(Henry ir kt., 2006).
Abi rekombinazs danai veikia kartu. Tai rodyta daugeliu eksperiment. Chromosom imunologinis daymas atskleid, kad tiek Rad51, tiek Dmc1 sudaro nuo DGT priklausomus telkinius, kuri
lokalizacija, vykstant grandini mainams mejozje, daniausiai sutampa. Tai patvirtina ir tyrimai, atlikti EM (Tarsaunas ir kt., 1999). ie baltym telkiniai susidaro tuo pat metu kaip ir DGT ir pradeda
nykti tuojau po to, kai chromosomose vyksta sinaps (47 pav.). Tai dar kart patvirtina, kad pagrindinis rekombinacijos kelias eukariotuose priklauso nuo abiej rekombinazi, bet neatmetama ir j veikimo atskiruose rekombinacijos keliuose galimyb.

47 pav. RAD51 ir DMC1 baltym lokalizacija iurks spermatocituose nustatyta imunoaukso EM

metodu. DMC1 irykina antiknai, susij su 5 nm dydio aukso dalelmis; RAD51 antiknai,
sujungti su 10 nm dydio aukso dalelmis. Centromeros nudaytos su mogaus CREST serumu
bei 15 nm dydio aukso dalelmis. Paveiksle matomi RAD51/DMC1 baltym telkiniai ant homologini chromosom visikos sinapss metu pachitenos stadijoje (pagal Tarsounas ir kt., 1999)
7 lentel. Pagrindini mejozs gen eukariotuose ir j prokariotini homolog filogenetinis paplitimas (pagal Ramesh ir kt., 2005)

Augalai

Grybai

Gyvnai

Pirmuonys

EUKARIOTAI

Giardia
Trypanosoma/
Leishmania
Entamoeba
Plasmodium
Homo
Mus
Drosophila
Anopheles
Caenorhabditis
Saccharomyces
Schizosaccharo.
Neurospora
Encephalitozoon
Arabidopsis
Oryza/Zea
Archebakterijos
Bakterijos

Spo11 Mre11 Rad50 Hop1 Hop2 Mnd1

Rad52

Dmc1

Rad51

+s

+s(2)

+p

+p

+p
+p
+p
+p

+p
+p

+p

+p

+p

+s

+s

+s

+s

+p

+s

+p

+p

+n

+p

+p

+n

+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p

+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p

+n
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p

+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p

+p

+n
+p
+p
+p

+p
+p

+p

+n
+p
+p
+p

+p
+p

+p

+n

+p
+p

+p
+p
+p
+p

+p(3)

+p

+p

+p

+p

+p

+p(3)

+p

+p

+p

+p

SbcC

TopoVI

SbcD

Msh4, Msh5 Msh2, Msh6 Mlh1 Mlh2 Mh3 Pms1

+s, +s

+s

+p, +p

+p

[+p]

+p

+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p

+n, +n
,
+ p, + p
+ p, + p
,
+p,
+ p, + p
+p,+p
,
(+n), +p
,

+n, +n
+p(2), +p
+p, +p
+p, +p
+p, +p
+p, +p
+p, +p
+p,+p
+p
+p, +p
+p, +p

+n
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p

+p
+p

+p

+p

+p

+p
+p

+p

(+n)

+n(2)
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p
+p

+p

+p,+p

+p, +p(2)

+p

+p

+p

+p, +p(2)

+p

+p(2)
RadA
RecA

MutS

+s

+s

+n
MutL

Molekuliniai evoliucijos tyrimai rodo, kad Rad51 ir Dmc1 baltym geno-protvio duplikacija turjo vykti labai anksti eukariot evoliucijoje (Ramesh ir kt., 2005). Matyt, kad ie baltymai eukariotuose yra danai aptinkami, nes buvo iskirti ne tik i kepimo mieli, bet i daugelio kit organizm,
77

tarp j ir mogaus (7 lentel). Tiesa, iki iol Dmc1 homolog neaptikta Diptera brio atstovuose ir
nematoduose. Manoma, kad io geno delecija mintose organizm grupse vyko daug vliau evoliucijos eigoje ir abiem atvejais nepriklausomai. Kitas kratutinumas A. thaliana lstelse Dmc1 yra btinas krosingoveriui tarp homologini chromosom. io augalo Dmc1 mutantuose diplotenoje nesusidaro chiazmai. Tuo tarpu Rad51 mutante chiazmai susidaro. Dmc1 baltymo geno inaktyvacija tiek A.
thaliana, tiek pelse sukelia sterilum. Dmc1 -/- mutantuose sutrinka sinaps mejozje. Ji netgi pradeda vykti tarp nehomologini chromosom.
2.3.3.2. Rad51 nukleoproteininio filamento susidarymo tarpininkai
vairi organizm genom sekoskaitos duomenys rodo, kad evoliucijos eigoje kito baltym, tarpininkaujani Rad51 vykdomoje DNR grandini main reakcijoje, sudtis (Modesti ir Kanaar, 2001) (8
lentel). Nuo Rad51 priklausomi DNR grandini mainai in vitro labai blogai vyksta, jeigu reakcijos
miin prie ar kartu su rekombinaze terpiamas RPA baltymas. , mainus slopinant RPA poveik,
galima paalinti su Rad52 baltymu. Tyrimai rodo, kad Rad52 baltymas sveikauja su Rad51 ir RPA.
Rad52 skatina Rad51 nukleoproteininio filamento susidarym ant vgDNR, paalindamas nuo jos RPA
(44 pav.). Mutacijos, dl kuri paalinamas Rad52 C-galinis rajonas, arba 409 412 aminorgtys, atsakingos u sveik su Rad51, blokuoja Rad52 kaip nukleoproteininio filamento susidarymo tarpininko funkcij. Galbt Rad52 reikalingas ne tik Rad51 pakrovimui ant RPA padengtos vgDNR, bet ir
Rad51 lokalizacijai DGT vietoje.
8 lentel. Rekombinazs ir pagalbiniai veiksniai
Ssb funkcinis homologas
Organizmai
Rekombinaz
T4
UvsX
Gp32
E. coli
RecA
SSB
S. cerevisiae
Rad51
RPA
Stuburiniai
Rad51
RPA

Tarpininkai
UvsY
RecO, RecR, RecF, RecBCD
Rad52, Rad55, Rad57
Rad52, Rad51B, Rad51C, Rad51D,
Xrcc2, Xrcc3, [Brca1, Brca2]

Rad55 ir Rad57 taip pat yra Rad51 nukleoproteininio filamento susidarymo tarpininkai (44 pav.).
Rad55 ir Rad57 yra Rad51 paralogai, turintys 2030 proc. identik su Rad51 aminorgi. Nuliniai
rad55 ir rad57 mutantai yra jautrs JS. Tyrimai rodo, kad ie du baltymai tikriausiai skatina Rad51
filamento susidarym ir j stabilizuoja. Jie sudaro stabil heterodimer, kuris jungiasi prie vgDNR ir
turi silpn ATPazs aktyvum. Sustiprinta Rad51 raika arba mutacijos, didinanios io baltymo giminikum vgDNR, supresuoja rad55 ir rad57 mutantin fenotip. Rad55 sveikauja su Rad51, taiau
nesveikauja su RPA. Tai rodo, kad io baltymo kaip tarpininko vaidmuo skiriasi nuo Rad52. domu ir
tai, kad Rad52 mieli mutantai pasiymi daug didesniais sutrikimais nei mutantins pagal gen induoli lsteli linijos. Prieingai mieli Rad55/Rad57 mutantai neisiskiria didesniais rekombinacijos sutrikimais, nors induoli lstels, kuriose nuslopinti Rad51 paralogai, yra negyvybingos. Taigi
galima daryti ivad, kad galbt induoli lstelse dal svarbi Rad52 funkcij perm Rad51 paralo78

gai. Gana netikta ir tai, kad, remiantis sekoskaitos duomenimis, C. elegans lstelse neaptikta Rad51
vykdomoje main reakcijoje tarpininkaujani baltym. Dl didelio nematodo CeRad51 geno panaumo su HsRAD51 (59 proc. identik aminorgi) negalima teigti, kad jo koduojamas baltymas galjo gyti papildom savybi. Tiktina, kad C. elegans Rad51 tarpininkai yra kiti baltymai, neturintys
panaumo Rad52 ar Rad51 paralogais. Kad negiminiki baltymai gali atlikti panaias funkcijas, rodo
E. coli homologins rekombinacijos tyrimai. iame organizme RecA baltymo prisijungim prie
vgDNR skatina tiek RecBCD, tiek RecFOR baltymai. J struktra nepanai nei tarpusavyje, nei su
Rad52 ar Rad51 paralogais.
Rad54 baltymas priklauso chromatin permodeliuojani baltym Swi2/Snf2 eimai. Jis skatina
Rad51 jungimsi prie vgDNR in vitro esant RPA bei stabilizuoja nukleoproteinin filament. Vis dlto
genetiniai rad54 mutant tyrimai nepatvirtina in vivo tokios io baltymo funkcijos. iuose mutantuose
susidaro Rad51 telkiniai ir jie egzistuoja ilgiau nei laukinio tipo kamienuose. Vlgi in vitro eksperimentai rodo, kad Rad54 ir jam giminikas Rdh54 skatina D-kilpos susidarym. Abu ie baltymai yra
nuo dgDNR priklausomos ATPazs, galinios sukelti superspiralizacijos pokyius. J vykdomas grandini atskyrimas DNR molekulje gali skatinti homologijos paiek bei nauj vandenilini jungi susidarym homologijos vietoje. Taip pat manoma, kad Rad54 baltymas gali pakeisti nukleosomas ar
baltymus, slopinanius grandins terpim DNR molekul. Mieli rad54 mutantuose vyksta DNR i
MAT ir HML lokus poravimasis, taiau nevyksta DNR sintez nuo 3galo. Tai rodo, kad is baltymas
ypa svarbus ir posinapsinje stadijoje. Yra duomen, patvirtinani Rad54 gebjim skatinti
heteroduplekso pltimsi.
Manoma, kad stuburiniuose gyvnuose Rad51 padeda ir BRCA baltymai (Powell ir Kachnic,
2003). BRCA1 vaidmuo HR pradjo aikti tiriant mutant lsteli kultras. Lsteli linijos, kuriose
nra BRCA1 baltymo, jautresns jonizuojamajai spinduliuotei. Tokiose lstelse HR danis sumajs
kelet kart. Daugiau inoma apie BRCA2 vaidmen HR. BRCA2 baltymas labai didelis, j sudaro
3418 aminorgtys (385 kDa). Bene vienintel abejoni nekelianti io baltymo funkcija, HR skatinimas. is baltymas sveikauja su keletu HR baltym, tarp j ir RAD51. Pastarasis jungiasi su BRCA2
pasikartojaniomis sekomis, vadinamomis BRC, kurias koduoja labai didelis BRCA2 11-tas egzonas.
Nors yra atuonios tokios BRC sekos, RAD51 stipriausiai sveikauja su dviem i j (BRC3 ir BRC4).
Manoma, kad BRCA2 skatina RAD51 nukleoproteininio filamento susidarym lstels ciklo S fazje,
neleisdamas vykti chromosomos persitvarkymams. BRCA2 -/- lstelse ioje stadijoje stebimos rekombinacijos klaidos, dl kuri susidaro chromosom aberacijos. Dar vienas galimas teigiamas
BRCA2 poveikis HR yra RPA paalinimas nuo vgDNR. BRCA2 nebdingas tik induoliams. Jo homolog taip pat aptinkama augaluose ir grybuose (Kowalczykowski, 2005). Vienas toks baltymas pavadintas BRH2 (angl. BRCA2 homologue), iskirtas i Ustilago maydis. Dl maesns savo molekulins
mass bei paprastesns sandaros (turi tik vien BRC sek) is baltymas daug patogesnis eksperimentuose in vitro nei BRCA2. Panaudojus BRH2, nustatyta, kad jis ukrauna RAD51 ant DNR toje vie79

toje, kur jungiasi vg ir dgDNR. Taigi jis eukariotuose veikia kaip bakterij RecFOR baltym funkcinis homologas. ie ir kiti tyrim duomenys rodo, kad BRCA2 ir jo homologai kitose organizm grupse veikia kaip RAD51 tarpininkai HR bdu alinant DGT.
2.3.3.3. Nuo RAD51 nepriklausoma rekombinacija
Nuo RAD51 priklausomas rekombinacijos kelias yra pagrindinis bdas alinti DGT mitozinse
mieli lstelse ir geno konversijai vykti, taiau kai kuriais atvejais rekombinacija gana efektyviai
vyksta ir rad51 mutantuose. Tai rodo papildomo rekombinacijos kelio egzistavim. Pastarasis reikalauja RAD52 ir galbt RAD59. Kaip minta, RAD52 geno delecija mielse sukelia labai didelius
rekombinacijos sutrikimus: visikai isiderina geno konversija, sutrinka viengrandi DNR gal
susijungimas, telomer atstatymas, rekombinacija tarp invertuot homologik sek. O mutacija
RAD51 gene neturi takos vgDNR gal susijungimui, tik 510 kart sumaja rekombinacija tarp
invertuot homologik sek, telomer rekombinacija taip pat ne visikai sutrinka. Tiek mogaus, tiek
mieli Rad52 baltymas, kaip rodo EM, i monomer sudaro iedo pavidalo struktras. Ivalytas Rad52
jungiasi prie vgDNR ir skatina komplementari DNR grandini susijungim (48 pav.). i reakcij
palankiai veikia ir RPA baltymas, kur RAD52 vliau paalina nuo vgDNR. HsRad52 skatina grandini mainus ir D-kilp susidarym.

48 pav. RAD52 vykdomas vgDNR gal susijungimas (pagal Symington, 2002). Po susijungimo
likusius nesuporuotus vgDNR galus paalina RAD1-RAD10 nukleaz, kuri skelia jungt tarp vg ir
dgDNR
RAD59 buvo nustatytas mutantuose, kuriuose sutrikusi nuo RAD51 nepriklausoma rekombinacija
tarp invertuot homologik sek. RAD59 svarbus vgDNR galams susijungti. Jeigu viengrandiai galai
yra trumpi, sujungim vykdo Rad52. Ivalytas Rad59 jungiasi prie vgDNR ir dgDNR bei skatina kom80

plementari vgDNR molekuli susijungim. Taiau Rad59 negali pakeisti Rad52 nuo Rad51 nepriklausomoje rekombinacijoje. Taigi is baltymas vertinamas kaip Rad52 aktyvum skatinantis veiksnys.
2.3.4. Homologin rekombinacija augaluose
HR augaluose tirti verta dl keleto svarbi prieasi. Pirma, augaluose skirtingai nei gyvnuose,
svarbiausi HR gen ijungimas neduoda letalaus fenotipo. Todl, tiriant gautus mutantus, galima
daugiau suinoti apie i gen funkcijas. Antra, augaluose generatyvins lstels susidaro i somatini
vlyvoje organizmo raidos stadijoje. Todl pokyi, vykusi somatiniuose audiniuose, perdavimo kitoms kartoms galimyb yra didesn (Schuermann ir kt., 2005).
Augal HR tyrimai stipriai pasistmjo priek dl nauj transpozonins, T-DNR bei iRNR
mutagenezs metod panaudojimo ir A. thaliana genomo sekos nustatymo (Arabidopsis Genome
Initiative, 2000). Augaluose mejozin rekombinacija taip pat prasideda DGT susidarymu. Skirtingai
nei daugelis kit organizm Arabidopsis turi net tris Spo11 baltymo paralogus. A. thaliana SPO11-1
geno mutante beveik nevyksta sinaps, labai sumajs chiazm skaiius. Tolesniame etape daugelyje
organizm svarbus vaidmuo tenka MRX (MRN) baltym kompleksams. Gauti vairenio Mre11 ir
Rad50 ortolog mutantai. Juose vyksta chromosom fragmentacija, sutrinka sinaps. Tai rodo, kad
vairenio MRE11-RAD50 kompleksas dalyvauja ankstyvuosiuose HR etapuose. Iki iol augaluose nerasta treiojo MRX (MRN) komplekso komponento homolog. Tolesniame main etape dalyvauja A.
thaliana DMC1 ir RAD51 genai. Skirtingai nei gyvn augal RAD51 -/- mutantai igyvena. Be to,
ios rekombinazs augaluose sveikauja su dviem BRCA2 paralogais, kuri mutant augaluose fenotipas labai panaus Rad51 -/- ar Dmc1 -/- paralog mutantus: vyksta chromosom fragmentacija, nra
sinapss. Augaluose aptikta ir RAD51 bei XRCC3 giminik gen. Augal XRCC3 geno mutantai yra
sterils, paeistos vlyvosios j mejozs stadijos. Taiau mejozs metu susidarantys bivalentai atrodo
normaliai. Iki iol neaiku, ar augaluose yra RAD52 geno homolog.
Manoma, kad kai kurie bakterij MutS ir MutL baltym homologai skatina HJ migracij ir sukarpym. Arabidopsis MLH1 mutantas neturi mejozs sutrikim. Mutacija AtMSH4 gene maina chiazm
skaii, ltina ir sutrikdo sinaps. Galbt augal MSH4 kaip ir mogaus veikia kartu su MSH5, palaikydami greta viena kitos homologines chromosomas, sujungtas HJ (Snowden ir kt., 2004). Arabidopsis
genome aptiktas ir ATM homologas. Jo mutant fenotipas panaus XRCC3 mutant.
Homologin rekombinacija vyksta ir augal mitochondrij bei chloroplast genomuose. ie organoidai turi savas homologins rekombinacijos sistemas. domiausia tai, kad mitochondrijose ir plastidse, kaip ir bakterij lstelse, homologin rekombinacija yra pagrindinis genetini main bdas. Nustatyta, kad chloroplastuose vyksta vidumolekulin ir tarpmolekulin homologin rekombinacija. Pavyzdiui, dl rekombinacijos tarp toje paioje molekulje esani vienos krypties pasikartojani sek
gali susidaryti kviei ir miei, regeneruot i mikrospor lsteli kultros, albino mutantai.

81

Nepaisant to, kad augal HR jau labai seniai naudojama praktikoje (kryminimui ir atrankai hibrid, kurie, kuriant naujas veisles, isiskiria naujais poymi deriniais) ir to, kad jau padaryta paanga
augal genomikoje, dar lieka nemaai neatsakyt klausim apie HR mechanizmus ioje organizm
grupje.
2.3.5. Chromatino vaidmuo alinant DGT homologins rekombinacijos bdu
DGT alinimo mechanizmai in vitro daniausiai tiriami naudojant nuogas DNR molekules ir
vairius rekombinacijos baltymus, taiau tokia DNR labai skiriasi nuo DNR, egzistuojanios lstelje
fiziologinmis slygomis. Lstelje DNR yra organizuota chromatin ir glaudiai susijusi su baltymais. Tokia organizacija leidia suglausti ir apsaugoti DNR nuo nukleazi poveikio. Chromatino
struktros vienetas yra nukleosoma. Jos erdin dal sudaro ~146 bp DNR atkarpa, dukart apvyniota
aplink histon oktamer, kur sudaro po dvi keturi ri histon molekuls: H2A, H2B, H3 ir H4. i
baltym molekuls turi domenus, kurie dalyvauja baltym tarpusavio sveikoje bei j sveikoje su
DNR. Tokios sveikos lemia nukleosomos erdins dalies susidarym. Be to, ie histonai turi laisvus
NH2 galus, vadinamus histon uodegomis, kurios isikiusios i nukleosomos. H2A bei H2B dar turi
ir karboksilinio galo uodegas. Eukariotuose aptinkama ir keletas retesni histon, kuri aminorgi sudtis iek tiek pakitusi. Tokie histonai daro tak tiek paios nukleosomos struktrai, tiek chromatino organizacijai. Chromatino sandar stipriai veikia ir vairs fermentai, kurie gali kovalentikai
modifikuoti histonus bei pakeisti, permodeliuoti paties chromatino organizacij. Histonus modifikuoti
kovalentikai gali daug baltym: histon acetiltransferazs (HAT), histon metiltransferazs, proteinkinazs, ubikvitinproteinligazs ir SUMO proteinligazs.
Didelis chromatino suglaustumas trukdo aptikti ir itaisyti DGT. Taiau jau seniai inoma, kad
DGT sukelia chromatino persitvarkym. Vliau buvo iaikinta, kad DGT sumaina chromatino gij
kompaktikum, keiia nukleosom padt ir sukelia histon oktamer atsipalaidavim. Dl i pokyi paaidos labiau prieinamos paaid jutikliams. DGT taip pat sukelia histon uodeg potransliacines modifikacijas. Svarbiausia modifikacija yra histono H2A (induoliuose H2AX) isikiusios
karboksilinio galo dalies [KATQAS*QEY- COOH] motyvo fosforilinimas tai vadinama fosforilinimu. Fosforilinama 139 serino liekana. Per kelet minui fosforilintas H2AX (vadinamas -H2AX)
iplinta per tkstanius bazi por, supani DGT. H2AX nra emesniuosiuose eukariotuose. Taiau
motyvas, kuris fosforilinamas iame histone, aptinkamas kituose H2A eimos nariuose.
Yra du alternatyvs DGT alinimo keliai: HR ir NR, kuri pasirinkim, matyt, lemia lstels bsena. induoli lstelse NR vaidina svarbiausi vaidmen alinant DGT lstels ciklo G1 stadijoje, o
HR S stadijoje, nes tuo metu atsiranda papildoma genetins mediagos kopija, kuri galima panaudoti kaip ablon alinant DGT. Lstels atsakui DGT labai svarbios PIK kinazs: ATM (Tel1 S. cerevisiae), ATR (Mec1 S. cerevisiae) ir DNR-PK. ie baltymai jungiasi prie trkusi arba jau subrendusi
DNR gal daniausiai per adapterinius baltymus. iuo metu vyrauja nuomon, kad dvigrandius tr82

kius pirmiausia aptinka MRN/MRX arba Ku70-Ku80 (Downs ir kt., 2007). i baltym savyb sveika su DGT. Jie pritraukia PIK kinazes, o pastarosios fosforilina H2AX. DGT efektorinis baltymas
MDC1, mobilizuojamas DGT viet nepriklausomai nuo H2AX ir atpasta io histono fosforilinim.
ATM baltymas vienas svarbiausi lstels atsake DGT susidarym. is baltymas daniausiai
aptinkamas besidalijani lsteli branduoliuose, kur DGT susidarym energingai reaguoja. ATM
350 kDa oligomerinis baltymas, kuris turi kinazs aktyvum. aktyvum skatina mediagos, sukelianios DGT in vivo ir linijins DNR molekuls in vitro. Atomins jgos elektroninis mikroskopas
parod, kad ATM monomerai jungiasi prie DNR gal. Apvitinus lsteles jonizuojamja spinduliuote,
ATM fosforilina H2AX, Chk2, p53, NBS1, BRCA1 ir kt. baltymus, vykdo autofosforilinim. Pastarasis sukelia baltymo perjim i oligomerins bsenos monomerin, kuri svarbi DGT alinimui. Taigi
ATM veikia ir kaip DGT jutiklis, ir kaip signalo neiklis. Intensyvus H2AX histono uodegos fosforilinimas (H2AX susidarymas) aplink atsiradus trk, manoma, sutelkia t viet MRN kompleks,
RAD51, BRCA1 ir kt. baltymus, dalyvaujanius DGT alinimo procese (Shiloh, 2003).
Matyt, chromatino dekondensacija yra viena pirmj DGT atsiradimo pasekmi. Ji sukelia tolesnius vykius, kuri vienas pirmj histono H2AX fosforilinimas. J gali vykdyti visos trys PIK kinazs, bet svarbiausias vaidmuo tenka ATM. Apie DGT susidar H2AX idiniai sutampa su 53BP1
sankaupomis bei vliau atsirandaniais BRCA1 ir MRN baltym telkiniais. Mutant tyrimai parod,
kad H2AX reikalingas ne i baltym sutelkimui DGT viet, o j palaikymui DGT saituose. Kai
H2AX iplinta abi trkio puses, prie jo jungiasi MDC1 baltymas. Pastarasis tiesiogiai sveikauja su
MRN kompleksu, kuriame esantis NBS1 sveikauja su ATM ir j aktyvuoja. Taigi DGT reaguojantys
baltymai gali jungtis prie chromatino tokia tvarka: MDC1, MRN ir ATM. ATM kinaz vykdo histono
fosforilinim ir pagamina daugiau H2AX vis didesniu atstumu nuo trkio vietos. Prie modifikuoto
histono vl jungiasi nauji, jau minti, baltymai. H2AX mutantai, kurie gali bti fosforilinami, taiau
dl mutacij uodegos rajone negali prisijungti MDC1, nesukelia 53PB1 ir NBS1 telkini susidarymo
bei negali aktyvuoti ATM (Su, 2006). mogaus lstelse, kuriose neveikia MDC1 genas, sutrinka
H2AX gausjimas. Manoma, kad MDC1, prisijungs prie H2AX, j apsaugo nuo fosfatazs ir (arba)
padeda ilikti ATM aktyvios bsenos. Pelse su neveikliu H2AX genu pastebima daug anomalij: jos
jautrios JS, linkusios sirgti onkogeninmis ligomis, j kamieninse lstelse sumajs HR danis.
Matyt, viena i H2AX funkcij skatinti efektyv DGT alinim HR bdu.
Jau minta, kad, atsiradus DGT, ATM vyksta yms pokyiai: dimer/oligomer monomerizacija, Ser1981 autofosforilinimas. Daugeliu atvej ATM aktyvacijai btinas MRN/MRX kompleksas, kuris, kaip rodo naujausi tyrimai, skatina ATM autofosforilinim ir monomerizacij. Tai vyksta, kai
MRN/MRX suria DNR galus arba galbt padidina DGT koncentracij tam tikroje lstels branduolio
vietoje. Esant dideliam DGT kiekiui, ATM aktyvuojasi savaime. Be to, yra nustatyta, kad NBS1 baltymas reikalingas ATM autofosforilinimui.

83

Apibendrinus galima daryti ivad, kad dvigrandiai trkiai chromatine sukelia kelet signal.
Vienas j chromatino dekondensacija, kuri skatina ATM aktyvacij, chromatino ir 53BP1 sveik
bei RAD51 reparacijos komplekso sutelkim. Kitas signalas MRN/MRX komplekso jungimasis prie
DNR gal, esani DGT. Jis vyksta nepriklausomai nuo ATM/ATR ir sukelia ATM aktyvacij. Manoma, kad MRN gali kooperuotis su BRCA1, kuris taip pat sugeba jungtis prie paeistos DNR. Treiasis signalas vgDNR atsiradimas. Prie jos jungiasi RPA ir po to ATR ir Rad17 kompleksai. Nors ie
keliai nepriklausomi, jiems visiems reikalingas MRN/MRX, kuris padeda susidaryti vgDNR-RPA
kompleksui. Taiau iki iol nra tiksliai inoma, kaip Rad51 ir jam asistuojantys baltymai sutelkiami
DGT viet.
Chromatino permodeliavimas tikriausiai palengvina reparacijos ir kontrols baltym prijim prie
DNR paaidos vietos. Kaip minta, pats chromatino atpalaidavimas DGT vietoje gali aktyvuoti ATM
ir panaius baltymus. Todl dar viena atsako ypatyb daugelio baltym kaupimasis apie DGT. Be
anksiau mint, aptinkama vairi baltym kompleks, kurie sudaryti i skirting subvienet. Daugelio j kataliziniai subvienetai yra ATPazs. RSC (angl. remodels the structure of chromatin) komplekso katalizin subvienet mielse koduoja STH1 genas. is subvienetas in vivo jungiasi prie DGT ir galbt tiesiogiai dalyvauja reparacijoje. Nuo RSC aktyvumo priklauso nukleosom padties DGT vietoje
pokyiai. Mieli kamienai, neturintys veiklaus RSC komplekso, yra jautrs jonizuojamajai spinduliuotei. Kitas baltym kompleksas SW1/SNF taip pat lokalizuojasi DGT vietoje, tik daug liau nei
RSC. S. cerevisiae lstelse, kuriose paeisti i baltym genai, sutrinka sinaps tarp sveikos ir DGT
turinios homologik sek.
Jau inoma, kad induoli ir daugelio kit eukariot lstelse, skirtingai nei bakterijose, genai,
koduojantys baltymus, veikianius alinant DGT, valdomi ne tik transkripcijos, bet ir potransliaciniame lygmenyje. Daugialsiuose organizmuose p53 ir jo homologai sukelia reparacijai reikaling ferment gen transkripcij. Svarbs vykiai, susij su iuo reikiniu, valdomi potransliaciniame lygmenyje: vyksta baltym fosforilinimas, j migracija lstels viduje, nauj kompleks susidarymas bei skilimas.
2.3.6. Rekombinacijos ,,kartieji takai
Main danis mejozs metu vairiose genomo vietose nevienodas. Jo skaitmenin iraika, tenkanti fizikinio atstumo vienetui, gali skirtis keliomis eilmis net toje paioje chromosomoje. Tame paiame genome yra vietos, kur rekombinacijos danis daug didesnis u vidutin lyg (kartieji takai) arba maesnis u j (altieji takai). Kartieji HR takai labai svarbs genetins vairovs susidarymui ir taisyklingam chromosom paskirstymui dukterines lsteles mejozs metu (Nishant ir Rao,
2005). mogaus ir kit organizm tyrimais rodyta, kad mejozinio krosingoverio danio skirtumai priklauso nuo ries, individo ir lyties. HR danis buvo nustatomas mikroskopu pagal chiazmus tarp homologini chromosom arba pagal rekombinantini palikuoni skaii atliekant kryminimus ir nau84

dojant fenotipinius ymenis. Dabar, kai inomos mogaus ir kai kuri svarbiausi modelini organizm genomo sekos, kai sudaryti tkstani molekulini ymen genolapiai, galima daug tiksliau nustatyti rekombinacijos dan ir jo svyravimus. Gautas vaizdas labai sudtingas ir jame sunku surasti bendruosius dsningumus, galiojanius vairioms rims.
Teoriniai modeliai teigia, kad HR lygis gali turti takos genetiniam kintamumui. Pavyzdiui, genomo vietose, kur rekombinacija labai maa arba visikai nevyksta, galima tiktis neatsitiktini aleli
derini. Tokiose vietose turi bti ir daug maesnis DNR polimorfizmo lygis.
Bene daugiausia is reikinys tiriamas mieli, vaisins musels ir mogaus genomuose. S. cerevisiae kartieji takai koreliuoja su DGT vietomis, kurios paprastai yra promotori sekose, taiau DGT
atsiradimui transkripcija nebtina. Naudojant nukleazes, nustatyta, kad ,,kartiesiems takams bdinga maai kondensuota chromatino struktra. Gerai itirtas S. pombe ,,kartasis takas yra ade6 lokuse,
turiniame mutacij M26. ioje vietoje pastebtas rekombinacijos danio priklausomumas nuo DNR
sekos 5-ATGACGT-3 (Schuchert ir kt., 1991). i seka yra heterodimerinio baltymo Mts1/Mts2
jungimosi vieta. Dl mutacijos poveikio atsiranda chromatino erdvins struktros pokyi, kurie
nulemia didesn jautrum nukleazei. Anksiau HR danis mogaus genome buvo nustatomas
palyginant tv ir palikuoni fenotipus genealoginiuose mediuose. Dabar yra sukurtas metodas, kur
naudojant galima vertinti rekombinacijos dan, mogaus spermatozoiduose. Nustatant HR dan
genetiniai atstumai lyginami su fiziniu atstumu tarp ymen. T manoma padaryti, kai inomos
genom sekos.
Isams genetiniai ir fiziniai vaisins musels genolapiai buvo inomi dar prie genomikos er.
Tiksls fiziniai genolapiai buvo sudaryti panaudojus ymen in situ hibridizacij ant politenini
chromosom, kuri vienos juostos dydis yra apie 21 kbp. Remiantis gautais duomenimis, apskaiiuota,
kad HR danis visame genome yra 1,5 cM/Mbp. Moterikosios lyties individuose jis vidutinikai
lygus 3,0 cM/Mbp, o vyrikosios lyties individ genomuose normaliomis slygomis HR visikai
nevyksta. Danio svyravimo ribos nuo 0 cM/Mbp iki 5 cM/Mbp. HR beveik nevyksta vaisins musels
patelse 4-oje homologini chromosom poroje ir yra labai sumajusi prie metacentrini (2-os ir 3os) chromosom centromer. Akrocentrinje X chromosomoje HR danio sumajimas prie
centromeros neymus. Rekombinacijos sumajimas labiau pasireikia prie telomer.
19961998 m. buvo sudarytas pirmas isamus mogaus genolapis. Jis sudarytas naudojant
mikrosatelitinius ymenis vadinamose CEPH (pranc. Centre dEtude du Polymorphisme Humain)
eimose. Panaudoti 5264 mikrosatelitai (Dib ir kt., 1996). 2001m., palyginus genetinius ir fizinius
(nukleotid sek) mogaus genolapius, apskaiiuotas vidutinis rekombinacijos danis 1,3 cM/Mbp
(Yu ir kt., 2001). i skaitin reikm labai artima nustatytai vaisinje muselje. Vidutinis HR danis
skirting lyi individuose nevienodas. Vyrikosios lyties jis siek apie 0,9 cM/Mbp, o
moterikosios 1,7 cM/Mbp. Aptikti rajonai, kuriuos galima vadinti altaisiais HR rajonais,
kuriuose HR danis keleto megabazi intervale buvo <0,3 cM/Mbp, taip pat genomo vietos, kuriose jis
85

buvo neprastai didelis (> 3,0 cM/Mbp). Panaus, tik didesns apimties darbas atliktas dar kart. Kong
ir kt. (2002) sudar genolap ityr 146 Islandijos eimas ir panaudoj 5136 mikrosatelitus, tai atitiko
1257 mejozes. Pastarojo genolapio skiriamoji geba buvo penkis kartus didesn nei ankstesnio.
Nustatytas vidutinis HR danis buvo iek tiek maesnis 1,1 cM/Mbp. Kratutins reikms svyravo
nuo 0 cM/Mbp iki 5 cm/Mbp. Maas rekombinacijos danis nustatytas prie metacentrini chromosom
centromer. Taip pat pastebtas atvirktinis priklausomumas tarp chromosomos ilgio ir vidutinio HR
danio joje. Todl galima manyti, kad btinas tam tikras krosingoveri skaiius taisyklingam
homologini chromosom poravimuisi ir pasiskirstymui. Ryks rekombinacijos danio skirtumai
pastebti net tos paios chromosomos skirtinguose petyse.
Iki iol neitirtos prieastys, lemianios HR danio skirtumus. Aiku, kad tam takos gali turti
nukleotid seka, taiau tuo paaikinti visko nemanoma. Pavyzdiui, moter autosomose rekombinacijos danis yra apie 1,65 karto didesnis nei vyr. Islandikame genolapyje krosingoverio danis vyr
chromosomose didesnis prie telomer, o moter prie centromer, taiau autosomose iki iol neaptikta DNR sek skirtum, kurie priklauso nuo lyties. Todl, remiantis prielaida, kad rekombinacija turi
takos evoliucijai, moter indlis iam procesui turt bti didesnis.
2.3.7. Ektopin rekombinacija
2.3.7.1. Ektopins rekombinacijos mechanizmai
Daugelis rekombinacijos tyrim buvo atliekama su genais, kurie haploidiniame genome sutinkami
vienkart, taiau nereikt pamirti, kad organizmuose, ypa eukariotuose, yra daug pasikartojani
gen ir daugyb pasikartojani sek. Kartais pakanka net nedideli homologik sek gabaliuk, kad
rekombinacija vykt neprastoje vietoje (gr. ektopos nutols). Dl to ilgesns pasikartojanios
struktros turt labai iplsti homologins rekombinacijos galimybes, o tai galt paveikti genomo
stabilum.
Intensyviausiai tyrinjama mieli S.cerevisiae, S. pombe ektopin rekombinacija. iems darbams
sukuriamos vairios genetins konstrukcijos, kuriomis galima dirbtinai padidinti konkretaus geno
kopij skaii genome. Ektopin rekombinacija gali vykti tiek vienos chromosomos ribose
(tarpchromatidin, viduchromatidin), tiek tarp skirting chromosom (49 pav.). Jos pobdis
priklausys nuo pasikartojani sek isidstymo (pratgiui, ibarstytai) bei krypties (vienakrypts,
invertuotos). Kadangi mielse yra daug disperguot gen eim, didelis heterochromosomins
ektopins rekombinacijos danis turt sukelti danas chromosom aberacijas. Pavyzdiui, diploidiniai
mieli kamienai turi apie 70 kopij 6 kb dydio retrotranspozono Ty. Taiau tiesioginiai
rekombinacijos danio tarp i element tyrimai parod, kad jis yra kur kas maesnis nei reikt tiktis
remiantis gautais tyrim su dirbtinmis sistemomis duomenimis. Jeigu natraliai esanios
pasikartojanios sekos rekombinuot tuo paiu daniu kaip ir dirbtinai terptos, tai sunku sivaizduoti,

86

kaip organizmui pavykt ivengti letali genomo persitvarkym. iam prietaravimui paaikinti
sukurtos bent dvi hipotezs.
A

3
4

49 pav. Rekombinacijos tarp pasikartojani gen atvejai (Petes ir Hill, 1988). A rekombinacija
tarp eukariot chromosom. Chromatids pavaizduotos po DNR replikacijos. B ektopin
rekombinacija prokariot chromosomoje, kurioje vykusi dalin replikacija. Pasikartojantys genai
pavaizduoti staiakampiais. Rekombinacijos metu (A) gali vykti geno konversija (1, 2), delecijos
(3, 4, 6), duplikacijos (3, 6), translokacijos (5); susidaryti dicentrins chromosomos (3, 5, 6) ir
acentriniai fragmentai (3, 5, 6)
Viena j teigia, kad lstelse yra mechanizmas, kuris specifikai slopina ektopin natrali
pasikartojani sek rekombinacij. Manoma, kad i funkcij atlieka RecQ eimos helikazs ir
topoizomerazs. Pavyzdiui, mutacija mieli TOP3 gene didina rekombinacijos dan tarp
pasikartojani sek, sultina mutantini kamien augimo tempus. SGS1 geno mutantuose padidja
rekombinacija tarp homeologini (panai) sek. Svarbus gali bti ir chromosom poravimasis, nes jis
priveria rekombinuoti tik alelines sekas. Ne vieno eksperimento rezultatai parod, kad rekombinacija
tarp vienod sek, esani homologinse chromosomose, yra 10100 kart danesn nei tarp t pai
sek, esani heterologinse chromosomose. Rekombinacija tarp arg4 sek nehomologinse
chromosomose buvo 1020 kart retesn, nei joms esant homologinse chromosomose alelinse
padtyse. Pastebta, kad padties poveikis pradeda mati, kai genas yra nutols > 20 kbp nuo alelins
padties homologinje chromosomoje. Todl chromosom isidstymas greta viena kitos poravimosi
metu, sinaps bei alelin homologin rekombinacija maina ektopins rekombinacijos galimyb
(Goldman ir Lichten, 2000).
Gali bti, kad natraliai esani pasikartojani gen sekos specifikai slopina tarpusavio
sveikas. iuo poiriu lemiamos reikms gali turti pasikartojani sek homologijos laipsnis bei j
kopij dydis. Eksperimentais nustatyta, kad mielse mejozs metu vykstantiems reciprokiniams
mainams reikalingi 150250 bp homologiki fragmentai. Jeigu jie trumpesni, arba homologija tarp j
nra 100 proc., rekombinacijos danis labai sumaja. Panai homologija reikalinga ir mitoziniams
mainams.
mogaus genome taip pat vyksta pasikartojani sek, gen segment, gen ir gen sankaup
ektopin rekombinacija. Kai kuriais atvejais tai sukelia alingus genetins mediagos persitvarkymus
ir gali bti lig prieastis. Nustatyta nemaai toki atvej. Pavyzdiui, talasemija susergama dl
87

globino geno delecijos, atsirandanios dl netolygaus pasikartojani io lokuso segment

krosingoverio. Madaug puss hemofilija A sergani pacient gene koduojaniame VIII faktori, yra
vykusi inversija. Tai nulemia rekombinacija tarp dviej pasikartojani ir prieingai viena kitai
orientuot sek, kuri viena yra gene, o kita 5 padtyje nuo jo. Ektopin rekombinacija yra kai kuri
daltonizmo, augimo hormono geno (GH1) praradimo, periferins neuropatijos, vadinamos CharcotMarie-Tooth liga, ir kit lig prieastis. Ektopinei rekombinacijai galima priskirti ir kai kuriuos
specifinius homologins rekombinacijos atvejus: pavyzdiui, antigen vairovs susidarym
Trypanosoma ir Neisseria.
2.3.7.3. Pasikartojani sek evoliucija
Ji susijusi su reikiniu, pavadintu bendra arba suderinta gen eimos evoliucija. Gen eima yra gen,
kilusi i bendro protvio ir todl panai savo DNR seka bei funkcijomis, grup. Gen eimos evoliucija bei jos mechanizmai nuo seno yra diskusij objektas (Nei ir Rooney, 2005). Apie 1970 m. buvo
iaikinta, kad Xenopus rRNR koduoja didelis skaiius pratgiui isidsiusi pasikartojani gen. X.
laevis ir X. mulleri rRNR gen eimas sudaro 450 pasikartojani sek. Kiekviena j sudaryta i 18S,
5,8S ir 28S gen, iorini transkribuojam tarpikli (ETS1 ir ETS2), vidini transkribuojam tarpikli
(ITS1 ir ITS2) ir tarpgentinio tarpiklio IGS. Panaudodami DNR ir RNR hibridizacij, Braunas ir kt. nustat, kad IGS nukleotid sekos labai panaios toje paioje ryje, taiau labai (apie 10 proc.) skiriasi
X. laevis ir X. mulleri ryse (Brown ir kt., 1972). reikin buvo sunku paaikinti tuo metu populiariu divergencins evoliucijos modeliu, kuriuo remiantis ios sekos abiejose ryse turt bti panaios. Be to, abiej ri 18S ir 28S gen sekos buvo beveik vienodos. I tikrj jos labai panaios net
labai nutolusiuose evoliuciniu poiriu organizmuose (pavyzdiui, augaluose ir gyvnuose). Tam paaikinti Braunas pasil nauj model, kuris pavadintas suderinta gen eimos evoliucija (angl. concerted evolution). Pagal j visi gen eimos nariai tam tikros ries genome evoliucionuoja kartu. Mutacija, atsiradusi vienoje ar kitoje sekoje, po to iplinta po visus eimos narius, o naujai atsirads alelis
paplinta po vis gen eim. Jo plitim, Brauno nuomone, lemia netolygus krosingoveris. Jis vyksta
atsitiktinai tarp vairi gen eimos nari. Todl suvienodina (homogenizuoja) juos. Gen skaiius gali
padidti ir sumati atsitiktinai, bet j atliekam funkcij svarba ilaiko j daugma pastov. Tokios
evoliucijos mechanizmas aikinamas ir geno konversija (Jeffreys 1979) (50 pav.). Jos vaidmuo panaus netolygaus krosingoverio, iskyrus tai, kad netolygus krosingoveris gali padidinti ar sumainti
geno kopij skaii, o geno konversija negali. Pagal model galima paaikinti rRNR gen evoliucij, jis imtas taikyti ir kitoms gen eimoms. Vis dlto vliau jo universalumu suabejota ir pasilytas
kitas, vadinamas gimimo ir mirties evoliucijos modelis (angl. birth and death evolution) (Nei &
Hughes, 1992). Pagal model, vieni nauji genai, atsirad dl duplikacij, ilieka genome ilg laik, o
kiti prarandami arba dl mutacij tampa neveikls. Daug geriau is modelis tinka daugeliui multigenini eim: imunoglobulin, atsparumo ligoms gen, MHC gen, MADS ir homeosekas turini gen.
88

Suderintos evoliucijos modelis visikai neatsivelgia stabilizuojanios atrankos poveik. Jau rodyta, kad i atranka alina nesinonimines pakaitas DNR molekulse. Todl evoliucijos metu veikia netolygus krosingoveris, stabilizuojanti atranka ir mutacijos. Nepaisant to, kad gimimo ir mirties evoliucijos modelis yra naujesnis ir universalesnis, tenka pripainti, kad tais atvejais, kai analizuojam gen
sekos labai maai skiriasi, gen eimos evoliucij galima paaikinti tiek vienu, tiek kitu modeliu.

50 pav. Suderinta gen eimos evoliucija geno konversijos bdu. Pasikartojantys geno () konversijos ciklai paveria pasikartojanius genus vis labiau homogenikais kiekvienoje chromosomoje

2.4. Homologins rekombinacijos panaudojimas

Ilgus tkstantmeius mogus, to neinodamas, naudojo homologin rekombinacij, ivesdamas
gyvn ir augal veisles. Naudingomis savybmis pasiymini individ atranka daniausiai bdavo
tam tikr rekombinant atranka. 20 a. pabaigoje, sukrus molekulini ymen technologijas, atsirado
galimyb atlikti selekcij ne tik fenotipo, bet ir genotipo lygmenyje. Molekulin selekcija,
panaudodama klasikinius rekombinogenezs dsningumus bei gen ininerijos metodus, turi plaias
perspektyvas ivedant naujas veisles.
Pradedant Morgano ir jo mokini darbais, genetin rekombinacija buvo panaudojama dviem praktiniams tikslams:
1) genetini lokus kartografavimui chromosomose;
2) genetini kamien konstravimui.
Ir iandien tai yra pagrindins homologins rekombinacijos praktinio pritaikymo sritys, taiau
pltojama ir treioji gen terapija.

89

2.4.1. Gen kartografavimas eukariotuose

1911 m. Morganas ikl hipotez, kad sankiba ir rekombinacija rodo gen isidstymo chromosomose tvark. 1913 m. jo mokinys Sturtevantas (A.H. Sturtevant) sukr pirmj (D. melanogaster)
genolap.
Ypa svarbi mogaus gen sankibos analiz. Pirma, ji naudojama pagal geneologinius duomenis
nustatyti genams, atsakingiems u paveldim lig. Informacija apie sankib yra btina tuomet, kai nra
ymen, rodani lig sukelianius alelius. Tai svarbu tiksliai diagnozei bei genetinei individ ir eim
konsultacijai. Antra, ji gali bti panaudojama klonuojant genus. Pavyzdiui, sankibos analiz buvo
panaudota nustatant CFTR (angl. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) baltym
koduojanio geno padt kit ymen atvilgiu ir j klonuojant.
2.4.1.1. Eukariot genolapi sudarymo principai
Tam tikros ries genolapio sudarymas yra santykinio genetinio atstumo tarp jai bding gen
(ymen) apskaiiavimas, j tarpusavio isidstymo tvarkos nustatymas bei paskirstymas atskiras
sankibos grupes. Sankibos grup sudaro visi vienoje chromosomoje esantys genai (ymenys). Gen
isidstymo tvarka bei j lokalizacija tam tikrose chromosomose daniausiai nustatoma pagal rekombinacijos (krosingoverio) tarp i gen dan. Norint sukurti tikslesn genolap, reikia rekombinacijos
dan apskaiiuoti kiek galima didesniam ymen por skaiiui. Vertt prisiminti, kad genolapiai gali
bti sudaromi naudojant ir kitus metodus: delecijas, restrikcin analiz, molekulinius ir florescuojanius zondus, heteroploidij ir kt. ie metodai danai naudojami kartu su ms aptariamu rekombinacijos danio apskaiiavimo principu, nes jis iki iol tebra svarbiausias sudarant genolapius.
Norint geriau suprasti genolapi krimo metodik, reikt prisiminti rekombinacijos ir gen pasiskirstymo mejozje dsningumus, kuriuos nustat Mendelis ir Morgano mokyklos atstovai. Mejozs
metu du to paties lokuso aleliai, esantys skirtingose chromosomose, patenka gametas vienodu daniu.
Jeigu iuos alelius pavadinsime a ir A, tai diploidinis heterozigotinis pagal lokus individas (jo genotipas aA) sudarys gametas, i kuri pus turs alel A, o kita pus a. Kito lokuso aleliai B ir b gametas pateks taip pat santykiu 1:1 (50 proc. gamet turs alel B, o kitos 50 proc. alel b). Jeigu ie du
lokusai (a/A ir b/B) nesukib (yra skirtingose chromosomose), tai j aleliai gametas pateks nepriklausomai vieni nuo kit ir diheterozigotoje (AaBb) susidarys keturi tip gametos: AaBb AB, Ab, aB,
ab. Dabar uraykime pagal iuos du lokusus homzigotini, taiau genetikai skirting individ (P1 ir
P2) kryminim, kurio metu turt susidaryti diheterozigotiniai F1 palikuonys:
P1 AABB P2 aabb
F1 AaBb.
Uraykime F1 hibrido analizuojamj kryminim, kuris danai atliekamas norint nustatyti, ar
genai yra sukib:
90

F1 AaBb P2 aabb.
F1 individe susidarys keturi ri gametos (AB, Ab, aB, ab). Eksperimente apie i gamet genotip galime sprsti i analizuojamojo kryminimo palikuoni fenotipo:
Fa
AaBb tvinis fenotipas;
Aabb rekombinantinis fenotipas;
aaBb rekombinantinis fenotipas;
aabb tvinis fenotipas.
Visos keturios palikuoni grups bus vienodo dydio (skilimo santykis 1:1:1:1). Du fenotipai Ab
bei aB skiriasi nuo tv ir yra rekombinantiniai. Jie, esant nepriklausomam poymi paveldjimui, sudaro 50 proc. analizuojamojo kryminimo palikuoni. Jeigu genai A ir B yra sukib (jeigu yra toje paioje chromosomoje), rekombinantai susidarys tik vykus krosingoveriui tarp i gen, o j danis bus
maesnis nei 50 proc. Tai galima paaikinti tuo, kad krosingoveris vyksta keturi chromatidi stadijoje (kiekviena homologin chromosoma dukart didesn ir sudaryta i dviej chromatidi) ir jame dalyvauja dvi neseserins chromatids. Todl didiausias krosingoverio danis, kuris gali bti tarp dviej
sukibusi gen, yra 50 proc. Bet toks jis gali bti tik tuo atveju, jeigu lokusai bus toli vienas nuo kito,
pavyzdiui, skirtinguose chromosomos galuose. Tuo atveju tarp j visada vyks bent vienas krosingoveris (51 pav.).

51 pav. Bivalento keturi chromatidi stadijoje diagrama (mejozs diplotenos stadija). Krosingoveris tarp dviej i keturi chromatidi gali duoti maksimal 50 proc. rekombinacijos dan
tarp gen, esani skirtinguose chromosom galuose (Ab ir aB rekombinantai). Kai genai yra
ariau vienas kito, perkrya tarp j susidarys ne visada ir rekombinacijos danis bus maesnis nei
50 proc. (pagal Jones ir kt., 1997)
Krosingoverio metu susidaro nauji tv gen ar ymen deriniai. Jie gali susidaryti dvejopai (kaip

minta anksiau): nepriklausomai pasiskirstant dviej nesukibusi lokus aleliams arba vykus krosingoveriui tarp sukibusi lokus. Rekombinantini palikuoni procentin dalis bendrajame palikuoni
skaiiuje yra rekombinacijos arba krosingoverio danis. is dydis mums parodo santykin atstum tarp
dviej lokus chromosomoje. Rekombinacijos danis (K) tarp dviej lokus gali bti nustatomas i
analizuojaniojo arba grtamojo kryminimo palikuoni skaiiaus fenotipinse grupse:
K = n1/n 100 proc., n visas palikuoni skaiius; n1 palikuoni krosover skaiius.
Jeigu i 200 palikuoni 12 yra rekombinantiniai, tai rekombinacijos danis tarp 1 ir 2 lokus yra 6
proc. (12 : 200 100 proc. = 6 proc.). Tarkime, kad rekombinacijos danis tarp A ir B lokus lygus 6

91

proc.; tarp B ir C 20 proc.; o tarp A ir C 24 proc. Turdami iuos duomenis, galime idstyti lokusus vienas kito atvilgiu chromosomoje tokia tvarka: A, B, C.

Rekombinacijos danis 1 proc. pavadintas centimorgana (cM) Morgano garbei. Reikt atkreipti
dmes tai, kad ms sudarytame genolapyje genetiniai atstumai nesutampa (nra adityvs): 6 + 20 =
26 yra tikslesnis atstumas tarp lokus A ir C (aukiau pateiktame pavyzdyje jis lygus 24 cM). Netikslus rekombinacijos danis tarp mint lokus gaunamas dl dvigubo krosingoverio, kurio metu susidar palikuonys kaip rekombinantai nevertinami (todl realus rekombinacijos danis gaunamas maesnis
nei yra i tikrj) (52 pav.).

52 pav. Bivalento diagrama keturi chromatidi stadijoje (diplotenoje) rodo, kaip dvigubi krosingoveriai toje paioje chromatidi poroje duoda rekombinantinius palikuonis, fenotipikai nesiskirianius nuo tvin (nerekombinantin) fenotip turini individ. Dl ios prieasties apskaiiuotas genetinis atstumas yra maesnis (pagal Jones ir kt., 1997).
Todl genolapiai sudaromi sudjus atstumus tarp ymen, nutolusi nedideliais intervalais. Taip
pat tenka pripainti, kad genetiniai atstumai ne visada koreliuoja su fiziniais, nes kai kuriose genomo
vietose krosingoveris vyksta daniau nei kitose.
2.4.1.2. Molekulini ymen panaudojimas genolapiuose
Dabar genolapiai sudaromi daniausiai naudojant molekulinius ymenis, kurie turi nemaai privalum, palyginti su tradiciniais morfologiniais. Pastaruosius pirmasis panaudojo Mendelis. Genolapiams juos pritaik Sturtevandtas, kuris ir buvo pirmojo genolapio autorius. 1913 m. jis sudar vaisins
musels (Drosophila melanogaster) X chromosomos genolap ir darb paskelb Eksperimentins
zoologijos urnale (Journal of Experimental Zoology) (Sturtevandt, 1913). Morfologiniai ymenys
yra labai negauss, palyginti su molekuliniais. Todl, naudojantis tik jais, sukurti tikslius genolapius
nemanoma. Molekuliniai ymenys gali bti skirstomi dvi grupes: biocheminius ir DNR ymenis.
Biocheminiai ymenys pradti naudoti 20 a. antrojoje pusje. Plaiausiai naudojami biocheminiai ymenys yra izofermentai. Jie naudojami ir sudarant genolapius. Taiau izoferment, kaip ir morfologini ymen, vairov nedidel. inoma tik kelios deimtys skirting izofermentini sistem. DNR ymenys sukurti ir pradti naudoti daug vliau 20 a. atuntajame deimtmetyje. DNR ymenimis laikomi polimorfini lokus aleliai, besiskiriantys nukleotid seka ir daniausiai neutrals fenotipo atvilgiu, t.y. ie ymenys nepasireikia fenotipe ir yra tik tam tikros DNR skirtingi variantai, kuriuos
galima aptikti naudojant vairius molekulins biologijos metodus: DNR skaldym restrikcijos endo92

nukleazmis, molekulin hibridizacij, polimerazin grandinin reakcij ir kt. DNR ymenys turi kelet savybi, dl kuri jie nepakeiiami sudarant genolapius:

jie ymiai maiau veikiami aplinkos slyg nei morfologiniai ar biocheminiai ymenys;

informatyvs bet kurioje organizmo raidos stadijoje;

j nustatymas gali bti automatizuotas;

nepaprastai didel vairov leidia kartografuoti chromosom sritis, turinias maai gen;

daniausiai fenotipikai neutrals;

vienodi bet kurioje organizmo dalyje;

nesveikauja tarpusavyje.

Panagrinkime vienos i molekulini DNR ymen grups, vadinamos RFLP (angl. restriction
fragment length polymorphism), nustatym ir panaudojim sudarant genolapius. Kaip sako pats pavadinimas, ia naudojamos restrikcijos endonukleazs tai fermentai, kurie atpasta DNR specifines
sekas ir skaldo jas (II klass restrikcijos endonukleazs). vykus mutacijai tam tikro fermento atpainimo sekoje, DNR toje vietoje neskaldoma. Kadangi mutacijos retas, taiau neivengiamas reikinys,
tai netgi giminik individ genomo DNR sek, kurias atpasta tam tikros restriktazs, isidstymas
gali skirtis tai yra DNR polimorfizmas. Todl, suskaldius ta paia restrikcijos endonukleaze dviej
skirting individ DNR, susidarys daugyb DNR fragment ir kai kurie i j skirsis savo dydiu. Pavyzdiui, daugelio augal genomas sudarytas i 108 109 nukleotid. vykus net nedaugelio i j mutacijoms, naudojant vairias restriktazes, galima gauti nemaai potenciali molekulini ymen. Suskaldius genomin DNR restriktazmis, susidaro toks didelis DNR fragment skaiius, kad net ifrakcionavus juos elektriniame lauke agarozs ar poliakrilamido gelyje, matomas beveik vientisas leifas (53 pav.). Didesni DNR fragmentai gelyje sutelkti ariau neigiamo elektrodo, o maesni ariau
teigiamo. Jeigu klonuoti vien tok fragment ir j paymti radioaktyvia ar florescuojania yme, tai
galime gauti molekulin zond, su kuriuo galima nustatyti tam tikr DNR lokus. Toks hibridizuojamas zondas jungsis prie jam homologikos DNR sekos fragmento.

53 pav. Restrikcijos endonukleaze suskaldyt genomins DNR pavyzdi (19) vaizdas po elektroforezs
agarozs
gelyje.
M

DNR
fragment
dydio
standartas;
www.mun.ca/.../scarr/Southern_Blot_analysis.html

93

54 paveiksle matome vaizd, kur galima igauti, atlikus trij giminik individ genomo DNR,
suskaldytos tam tikra restriktaze, hibridizacij pagal Sauthern su turimu hipotetiniu zondu. Pirmojo
individo (aa) genomins DNR autoradiogramoje matoma viena lta juosta. Taip yra todl, kad tiriamas
individas yra homozigotinis io lokuso atvilgiu, o zondu nustatomi du vienodo dydio DNR fragmentai, esantys homologinse chromosomose. Homozigotinis individas turi du vienodus to lokuso alelius.
iuo atveju abejose diploidinio organizmo chromosomose restriktazs atpainimo sekos yra identikose vietose. Todl po restrikcijos, elektroforezs, Sautherno blotingo ir autoradiografijos i bsena matoma kaip viena juosta fotoploktelje. Kitas individas (a'a') gali duoti kitokio dydio juost, nes jo
DNR sekoje, kuri atpasta restriktazs, vykusi mutacija taip pat gali bti homozigotins bsenos.
Mutacija gali arba panaikinti restriktazs atpainimo sek, arba sukurti nauj kitoje vietoje. Dl to pakis zondu nustatomo DNR fragmento dydis (gali pakisti ir nustatom fragment skaiius) ir judjimo
elektriniame lauke agarozs gelyje greitis. Treiasis individas yra pirmj dviej hibridas (aa') ir turi
dvi skirtingo dydio juostas, atitinkanias pirmojo ir antrojo individ juostas. Taigi ia jau turime tam
tikro RFLP lokuso heterozigot. Kadangi iame lokuse yra du skirtingi aleliai, jis yra polimorfikas.
Lokuse matomas restrikcijos fragment ilgio polimorfizmas. Du skirtingo dydio DNR fragmentai,
matomi treiame takelyje, yra to paties RFLP lokuso aleliai. Kadangi lokus identifikuoja ymtas molekulinis zondas, todl lokusui suteikiamas zondo pavadinimas.

54 pav. Hibridizacija pagal Southern su radioaktyviu molekuliniu zondu leidia nustatyti RFLP
lokuso alelius individuose. Pirmajame takelyje: homozigota aa pagal didesnj RFLP alel; antrajame: homozigota a'a' pagal maesnj RFLP alel; treiajame: heterozigota aa'. Kodominuojantis
RFLP ymen pobdis leidia nustatyti visus tris galimus vieno lokuso genotipus
Svarbus RFLP ymen poymis j kodominuojantis paveldjimo pobdis, kur atspindi galimyb nustatyti tiksl konkretaus individo genotip aa, a'a' ar aa' duotajame lokuse. Dl ios prieasties
RFLP ymenys daug informatyvesni u morfologinius ymenis, kuriems daniausiai bdingas visikas
dominavimas, t. y. galimyb atskirti tik du fenotipus, kuriuos nulemia (AA ar Aa) ir aa genotipai.
Restrikcijos fragment ilgio polimorfizmas atsiranda dl mutacij. Kadangi grtamj mutacij
tikimyb tame paiame lokuse labai maa, todl RFLP ymenys labai pastovs ir patikimi. Be to, j
vairov keliomis eilmis didesn nei standartini morfologini ar biochemini ymen.
RFLP aleliai, kurie aptinkami naudojant ymtus molekulinius zondus, daniausiai paveldimi pagal tuos paius Mendelio dsnius kaip ir morfologiniai ymenys (pavyzdiui, ied spalva, stiebo for94

ma ir kt.). iuo atveju taip pat galima atlikti kryminim tarp tvini individ, kurie turi skirtingus to
paties lokuso alelius. F1 hibridai bus heterozigotiniai ir turs abu RFLP alelius (54 pav.). Tarpusavyje
kryminant F1 hibridus, gaunama F2 palikuoni populiacija. Analizuojant iuos palikuonis pagal vairi lokus aleli pasiskirstym, galima nustatyti, ar du konkrets RFLP lokusai paveldimi nepriklausomai vienas nuo kito, ar jie yra sukib. Esant lokus sankibai, kaip ir morfologini ymen atveju apskaiiuojami rekombinant susidarymo daniai. Nustatytas rekombinacijos danis rodo atstum tarp
dviej tarpusavyje sukibusi RFLP lokus.
Paprasiausias bdas RFLP ymen genolapiui sudaryti sukryminti homozigotines linijas, kurios skiriasi viena nuo kitos RFLP lokus, nustatom naudojant tam tikrus zondus, aleliais. Po to augal F1 hibridai gali bti vairiai panaudojami vadinamosioms genolapio populiacijoms (angl. mapping
population) gauti.
3) Kai kuriais atvejais i F1 hibrid galima gauti dvigubus haploidus. Augalai iuo atveju regeneruojami i iedadulki, kurios yra haploidins. Po to atkuriamas diploidikumas. Todl gautuose dvigubuose haploiduose kiekvienas lokusas yra homozigotinis.
4) Gali bti atliekamas F1 hibrid grtamasis kryminimas su vienu i tv.
5) F1 hibridai dauginami savidulkos bdu ir taip gaunama F2 populiacija.
6) Rekombinantins inbred-linijos gaunamos i F1 hibrid. iuo atveju sukuriama ilgaam genolapio populiacija.
Genolapio populiacij paprastai sudaro tviniai individai, F1 hibridai ir vienu i aprayt bd
gauti F1 palikuonys. Tvai ir F1, F2 kart individai analizuojami naudojant daug skirting molekulini
zond. Naudojant molekulinius zondus nustatomi vis genolapio populiacijos individ genotipai ir apskaiiuojamas rekombinacijos danis tarp RFLP ymen lokus. Taigi pirmiausia iskiriama tiriamo
genomo DNR, o tada, naudojant zondus, analizuojami RFLP ymen paveldjimo dsningumai ioje
grupje. ymen skaiius priklauso nuo tv giminingumo laipsnio (kuo maiau giminiki, tuo didesn skirtum tikimyb), zond skaiiaus ir kokybs.
Paprastai vienai riai naudojami keli zond ir restrikcijos endonukleazi deriniai ir gaunama
daug RFLP molekulini ymen.
Turint zondus ir genolapio populiacij, galima pradti jos individ RFLP ymen analiz (55
pav.).

95

P1 x F1 grtamojo kryminimo populiacija

P1

P2

a a aa

F1

a a

aa a a aa a a aa a a aa a a aa a a aa a a

bb

bb b b b b b b bb

10

11

12

1-as zondas

bb bb

2-as zondas

F1
a

a b
a b
a b
a b

bb bb b b b b b b bb b b
R

aa bb
a a b b
a a b b
a a b b

tvinis 4
rekomb 2
rekomb 2
tvinis 4

33%

55 pav. Supaprastinta RFLP lokus kartografavimo, naudojant grtamj kryminim, schema.

Genolapio populiacij sudaro tvai (P1 ir P2), F1 ir P1F1 palikuonys. Dviej skirting lokus
aleliai nustatyti molekuliniais zondais 1 ir 2. Rekombinantai yra individai, kurie dvejose autoradiogramose (kiekvieno zondo atskirai) turi i viso tris juostas. Paveikslo apaioje paaikinta, kaip
susidaro rekombinantai tarp i dviej lokus (a lokusas nustatomas zondu 1, o b zondu 2) (pagal Jones ir kt., 1997)
Diagrama, pateikta 55 paveiksle, labai supaprastinta, nes joje analizuojama tik 12 individ ir naudojami tik du molekuliniai zondai 1 ir 2. vairs zondai duoda skirtingus RFLP juost vaizdus individ genominje DNR. Paveikslo apaioje paaikinta, kaip vertinami gauti rezultatai pagal juost pasiskirstymo tvark, kaip atpastami rekombinantai ir tvin fenotip turintys individai, kaip apskaiiuojamas rekombinacijos danis tarp dviej lokus. iame pavyzdyje rekombinantai yra individai (3, 6, 9,
12), kurie dvejuose geliuose (su dviem zondais) turi tris juostas. Taigi i 12 grtamojo kryminimo
palikuoni keturi yra rekombinantai. Todl rekombinacijos danis tarp RFLP lokus bus 33 proc.
Naudojant daugiau zond, rezultat analiz atliekama pagal t pat princip: dvi autoradiogramos, gautos naudojant skirtingus zondus, lyginamos tarpusavyje, nustatoma, koki dal tarp vis palikuoni sudaro rekombinantai (56 pav.). Jeigu panaudoti 80 zond (n = 80), tai gausime 3160 galim lokus por
[(n 1) (n/2)] ir i duomen pagrindu galima sukurti tiksl genolap. Taiau iuo atveju skaiiavimai atliekami naudojant kompiuterines programas. Genolapio populiacijos analizs duomenys raomi
pasinaudojant paprastu binariniu kodu ir kiekvieno zondo indikatoriumi. Vienos chromosomos genolapis galt atrodyti kaip linija, suskaldyta statmen brkneli, kuri kiekvienas ymi tam tikro lokuso padt. Lokusai daniausiai pavadinti j nustatymui naudot zond pavadinimais.

96

56 pav. Rekombinacijos dani reikmi panaudojimas genolapiams sudaryti (Jones ir kt., 1997).
Norint sukurti RFLP genolap, btina apskaiiuoti rekombinacijos dani reikmes dideliam lokus por skaiiui, po to nustatyti lokus isidstymo tvark, geriausiai atitinkani j paskirstym
sankibos grupes. Tai gali bti atlikta tik naudojant kompiuterines programas
Po to, kai panaudojus molekulinius ymenis sudaromas genolapis, toliau kartografuojami morfologiniai, biocheminiai ir kiti ymenys jame. Molekulini ymen genolapis pranaesnis u sudarytus
tik morfologini ar biochemini ymen pagrindu, nes jis yra daug tikslesnis ir isamesnis. Jame beveik nra tui viet, nes daugelis molekulini ymen (RFLP, AFLP, RAPD, SNP ir kt.) tolygiai

F1 hibrid

tvo

Fenotipai
motinos

pasiskirsto genome.

57 pav. Sankibos tarp molekulini, biochemini ir genetini ymen nustatymo schema (pagal
Paterson ir kt., 1991). Pavyzdiui, nustatant, ar lokusas, lemiantis skl spalv, sukibs su tam tikru RFLP lokusu, atliekami individ, besiskiriani skl spalva ir RFLP lokuso aleliais, kryminimai. Genolapio populiacijoje (iuo atveju F2) nustatomi tvin ir rekombinantin fenotip turintys individai. Matyti, kad 12 ir 17 individai turi naujus poymi derinius, todl i 20 tirt palikuoni du yra rekombinantai
97

Norint sukurti jungtin genolap, kuriame be molekulini ymen bt kartografuoti ir morfologiniai, biocheminiai ymenys, reikia nustatyti pastarj padt molekulini ymen atvilgiu. Toks genolapis labai perspektyvus, nes gali bti panaudotas svarbiems genams, nulemiantiems, pavyzdiui,
atsparum biotiniam ar abiotiniam stresui, adaptyvum, klonuoti. Taigi norint kartografuoti morfologinius ar kitokius ymenis molekuliniame genolapyje, reikia turti mus dominanio poymio alternatyvias iraikas, t.y. btinas poymio fenotipinis kintamumas. Pavyzdiui, populiacija gali bti polimorfika aleli, lemiani skl spalv, atvilgiu. ie aleliai pasiskirstys gametas su tam tikrais RFLP
ymenimis (57 pav.). Apskaiiavus rekombinacijos danio tarp io ir RFLP lokuso aleli reikmes,
galima nustatyti pigmentacijos geno viet genolapyje. T pat princip galima panaudoti ir lokusams,
nulemiantiems atsparum ligoms, kenkjams, sausrai ir kt.
2.4.1.3. Kiekybini poymi lokus kartografavimo principai
Dauguma augal ir gyvn poymi, turini praktin reikm, yra kiekybiniai. Nuo kokybini
juos skiria variacinis kintamumas, kuris pastebimas ir homozigotinse, genetikai grynose linijose (58
pav.).
80

60
40
20
0
60

20

40

60

80

100

120

20

40

60

80

100

120

F1

40
20
0

58 pav. Dviej tabako linij, besiskiriani vainiklapi ilgiu, kryminimo rezultatai. Abscisi ayje vainiklapi ilgis (mm); ordinai augal, turini tam tikr vainiklapi ilg, skaiius grynojoje linijoje
Kiekybini poymi pavyzdiu gali bti derlingumas, atsparumas stresui, auktis, svoris. Gen
kurie lemia iuos fenotipus, paprastai bna keli ar keliolika. Jie isklaidyti vairiose genomo vietose,
tarpusavyje susij tik fiziologikai ir vadinami poligenais. Naudojant molekulinius ymenis, galima
nustatyti, kiek ir kokiose genomo vietose esantys vadinamieji kiekybini poymi lokusai (angl. quantitative trait loci QTL) veikia sudtingo poymio pasireikim.
Kiekybini lokus kartografavimas tapo manomas tik atradus molekulinius ymenis. Naudojant
juos, buvo sukurti labai isams genolapiai, o pagal juos nustatoma ir kiekybini lokus padtis. Tarkime, mus dominantis kiekybinis poymis yra augalo auktis. iuo atveju genolapio populiacija gaunama sukryminus dvi tvines linijas, kurios skiriasi tiek savo aukiu, tiek RFLP lokus aleliais (59 A
pav.). RFLP aleliai ir kiekybini poymi lokusai (KPL), lemiantys augalo aukt, pasiskirsto palikuoni kartose. Paprastumo dlei sivaizduokime, kad turime vien KPL, kuris susideda i tam tikro skai98

iaus greta esani genetini determinant. ie, tarpusavyje sveikaudami, ir valdo kiekybinio poymio (augalo aukio) pasireikim. Taigi is KPL gali bti paveldimas labai vairiai daugybs molekulini ymen atvilgiu, kurie gali bti greta jo, labiau nutol arba visai kitoje sankibos grupje. Taigi
apie ias situacijas isamiau (59 pav.).
1. RFLP lokusas a yra glaudiai susijs su KPL. Tarkime, F1 RFLP alelis a yra toje paioje homologinje chromosomoje, kaip ir em augalo aukt lemiantys KPL aleliai, o RFLP alelis a yra toje
paioje homologinje chromosomoje, kaip ir aukt augalo g lemiantys KPL aleliai. Tada F1 augalai
bus tarpinio aukio ir heterozigotiniai aa'. Grtamojo kryminimo palikuonyse RFLP alelis a paveldimas kartu su emesn g lemianiais augalo KPL aleliais, o alelis a' paveldimas kartu su kiekybini
poymi lokuso auktagikumo aleliais. Jeigu nustatysime augal, turini a bei a' alelius, aukt ir j
pavaizduosime koordinai sistemoje, tai gausime dvi atskiras individ grupes, kuri aukiai grupuosis apie tam tikr modalin klas (59 B 1 pav.).
2. RFLP lokusas b artimai susijs su KPL, lemeniu augalo aukt. iuo atveju F1 palikuonys bus
heterozigotos bb ir kaip ir ankstesniu atveju tarpinio aukio. Taiau juose vykus krosingoveriui
tarp aukio ir RFLP lokus, susidarys nedidelis skaiius rekombinant, turini naujus aukio aleli
ir RFLP aleli derinius. Nors tarp palikuoni dauguma b alel turini palikuoni bus emagiai, o b
auktagiai, taiau keletas rekombinant turs kitus i aleli derinius. i situacija grafikai pavaizduota 59 B 2 pav. Dvi kreivs jau iek tiek persidengia.
3. RFLP lokusas c nutols nuo KPL toje paioje chromosomoje dar didesniu atstumu. Didelis krosingoverio danis F1 nulems ioje situacijoje, nauj derini tarp RFLP ir aukio aleli susidarym, o
dvi kreivs beveik sutaps (59 B 3 pav.).
4. RFLP lokusas d nesusijs su KPL. Jeigu molekulinis ymuo ir KPL yra skirtingose chromosomose, tai jie bus paveldimi nepriklausomai ir bus kreivi visikas persidengimas (59 B 4 pav.).
Taigi KPL kartografavimo logika gana paprasta. Mes siejame tam tikr KPL su turimais kartografuotais molekuliniais ymenimis, analizuojame j tarpusavio paveldjimo dsningumus ir nustatome
KPL padt genolapyje. Ji ymima kaip tam tikras intervalas, o ne pavienis takas, nes toje chromosomos dalyje gali bti sutelkta vairus skaiius genetini determinant, darani tak poymio ekspresyvumui. Eksperimentiniame darbe su KPL efektu bna siejamas labai vairus skaiius RFLP lokus.
Taigi mes galime atidti efekto tikimyb lokuso padties atvilgiu ir po to kartografuoti KPL ariausiai
esani ymen atvilgiu. Grtant prie 59 paveiksle pateiktos situacijos galime teigti, kad turime vien KPL, esant tarp 1 ir 2 RFLP lokus. Taiau realioje situacijoje kiekybini poymi lokus, darani tak tam tikram kiekybiniam poymiui, bna daugiau. Naudojant i metodik, sudting poym
galima genetikai iskaidyti, o turimus konkreius molekulinius ymenis, susijusius su svarbiausiais
poym veikianiais KPL, panaudoti molekulinje selekcijoje.

99

A
P1

++++++

++++++

F1

++++++

P2

Grtamasis
kryminimas su P2
Genolapio populiacija

B
Lokusas

F1 sankiba

Fenotipas
aa

++++++

aa

bb

++++ ++

++++++

++++++

Ivada
1-as lokusas yra arti
KPL
poveikis

bb

poveikis

cc cc

2-as lokusas sukibs

su KPL

poveikis

3-as lokusas sukibs

su KPL, bet yra nuo
jo toli

poveikis

4-as lokusas
nesukibs su KPL

dd /dd

Visi lokusai

Tikimyb pagal poveik

C
Didiausia tikimyb,
kad KPL yra tarp
a ir b

Lygis, kuriam esant,

stebimas atsitiktinis
poveikio pasireikimas

a b c

Lokuso padtis

59 pav. Kiekybinio poymio lokuso (KPL) kartografavimo metodika (pagal Jones ir kt., 1997).
A genolapio populiacija gaunama sukryminus tvines linijas, besiskirianias savo RFLP ymenimis ir kiekybinio poymio (aukio) iraika. Heterozigotinis F1 augalas kryminamas su vienu
i tv (P2) (grtamasis kryminimas) ir gaunama palikuoni, besiskiriani analizuojamais poymiais, populiacija; B KPL ir vairi molekulini ymen lokus sukibimas gali bti vertinamas pagal tai, kaip augalo auktis susijs su vienu i dviej kiekvieno molekulinio ymens lokuso
aleliu.; C KPL padtis genolapyje nustatoma pagal didiausi tikimybs reikm, apskaiiuot
kiekvienam lokusui. i reikm tai santykis tarp tikimybs, kad stebimas efektas yra dl KPL ir
ymens lokuso sankibos ir tikimybs, kad stebimas efektas yra atsitiktinis

100

2.4.2. Bakterij gen kartografavimas

Kartografavim bakterijose sunkina tai, kad jos yra haploidins ir nesidaugina lytiniu bdu. Taiau
ios problemos skmingai sprendiamos naudojant vairius DNR perklimo i vienos bakterij lstels
kit bdus. Vienas i j konjugacija, yra labiausiai panai eukariot kryminimsi: lsteldonoras (F+) kryminama su lstelerecipientu (F). F plazmid, aptinkama lstelse donoruose, yra
btina kryminimuisi ir chromosomins DNR pernaai recipiento lstel. Bakterijos chromosoma
perneama tik tuo atveju, kai F plazmid yra integruota j. Tai labai retas atvejis, bet yra atrinkti kamienai, kuriuose F jau yra chromosomoje. iuo atveju DNR pernaa yra ymiai danesn. Tokie kamienai vadinami Hfr (angl. high frequency of recombination). Kryminant Hfr su F kamienu, pastarj (recipient) plazmid gali perneti didelius donoro chromosomos fragmentus (netgi vis chromosom). Kartografuojant naudojami du metodai. Pirmasis nutrauktas poravimasis. iuo atveju HfrF
konjugacijos proces tam tikrais laiko momentais nutraukia terps su antibiotikais supurtymas arba
antibiotik, slopinani DNR replikacij, pridjimas. ymenys, esantys i vienos F plazmids sijungimo chromosom puss, perneami pirmiausia, o i kitos vliausiai, todl j isidstym galima
nustatyti pagal konjugacijos laik, reikaling genui perneti recipient. Labiau nutolusiems genams
perneti reiks daugiau laiko (60 A pav.). Antrasis metodas remiasi rekombinacijos danio tarp ymen nustatymu (60 B pav.). Konjugacija tinka apytiksliam mutacij kartografavimui, taiau nelabai
naudinga arti esani gen isidstymo tvarkai nustatyti. Tam naudojamas bendrosios transdukcijos
metodas. Jo esm sudaro bakterins chromosomos fragment pakavimas bakteriofago galvutes ir tokios DNR perneimas recipiento lstel, kurioje DNR rekombinuoja su eimininko chromosoma.
Svetim DNR savo galvut bakteriofagas gali pakuoti per klaid. Kadangi galvut telpa nedaug
DNR (pvz., 100 kb E. coli bakteriofago P1 galvut), todl tik tokio dydio fragmente esantys ymenys gali bti perneami kartu (61 pav.). Tai vadinama kotransdukcija.

101

A)
30

20

Laikas nuo perneimo

10

0 pradios (min.)

ori T
Konjugacija nutraukta
po 30 min.

c+

Rekombinacijos
danis

Konjugacija nutraukta
po 20 min.

b+

a+

b+

a+

b+

a+
a+

a+

a+
b+

a+

c+

20
40
Laikas (min.)

a+

Konjugacija nutraukta
po 15 min.

60

B)
c+

b+

a+

c-

b-

a-

DNR i Hfr donoro

Recipiento
chromosoma

c+ atranka ir vairi rekombinantini

genotip bakterij kolonij skaiiaus
nustatymas
c+

b-

a-

c+

b+

a-

c+

b+

a+

60 pav. Gen isidstymo tvarkos bakterijos chromosomoje nustatymas konjugacijos bdu: A

konjugacijos nutraukimas. Konjugacija nutraukiama stipriai supurius paimtus (po 15, 20, 30
min.) besikryminani bakterij mginius ir isjus lsteles ant selektyvi tiriamiems ymenims
(a+, b+, c+) terpi. Per 10 min. perneamas a+, per 17 b+, per 25 c+. Todl i gen isidstymo
tvarka: a+, b+, c+. a+ yra ariausiai F plazmids perneimo pradios tako oriT. B pernet gen
rekombinacija su recipiento chromosoma. Donoro ir recipiento lstels sumaiomos, tarp j vyksta
konjugacija. Po to bakterijos pasjamos ant selektyvios mitybins terps, kur gali daugintis tik recipiento lstels, gavusios c+ gen. Tai rodo, kad ias bakterijas buvo pernetas donorins DNR
fragmentas nuo oriT iki c+. Po to pagal rekombinacijos tarp a, b, c aleli dan (pagal rekombinantinius genotipus) nustatomas atstumas tarp i gen (pagal Leach, 1996)

102

61 pav. Kartografavimas kotransdukcijos bdu. Metodas naudojamas gretim gen isidstymo

tvarkai chromosomoje nustatyti. Kotransdukcijos danis, rodantis atstum tarp gen, priklauso
nuo dviej proces: pakavimosi fago galvut ir rekombinacijos su recipiento chromosoma. A
pakavimasis: tikimyb, kad du genai pakavimo metu pateks fago galvut kartu, priklauso nuo atstumo tarp j. Paveiksle pavaizduoti genai a ir b kartu pakuojami tris, b ir c eis, a ir c vien
kart. B rekombinacija: ant transdukuoto fragmento yra trys genai ir keturi intervalai (14), kurie gali dalyvauti rekombinacijoje su chromosoma (pagal Leach, 1996)
Kuriant genetinius kamienus, daniausiai reikia pakeisti tik nedidel DNR srit nepakeiiant aplinkui esanios DNR. Todl btina terpti tik nedidel donoro DNR fragment. Dl ios prieasties bendroji transdukcija yra labai patogus metodas bakterij rekombinantiniams kamienams sukurti.
2.4.3. Nepusiausvira sankiba
Nepusiausvira sankiba tai neatsitiktinis ryys tarp skirting lokus aleli (62 pav.). Pastaruoju
metu susidomjimas nepusiausvira sankiba (angl. linkage disequilibrium, LD) labai padidjo dl dviej
prieasi:
1) patobulinti genomo tyrimo metodai leidia greitai nustatyti haplotipus (chromosomai bdingus
aleli rinkinius) daugelyje genetini lokus. Toki metod pavyzdiu gali bti vieno nukleotido
polimorfizmo (angl. single nucleotide polymorphism, SNP) nustatymas, DNR sekoskaita ir kt.;
2) atlikus isami tam tikros populiacijos individ genomo analiz, patikima nepusiausvira sankiba
(keli deimi kbp ir daugiau) leidia nustatyti genetinius rajonus, susijusius su tam tikru fenotipu (poymiu), pavyzdiui, atsparumu vienai ar kitai ligai. Ir prieingai, tuo atveju, kai nepusiausvira sankiba spariai sumaja u tam tikro geno rib, atsiranda galimyb identifikuoti u
poym atsaking gen, ityrus nedidel kandidatini gen skaii (Rafalski ir Morgante, 2004).
103

Nepusiausvira sankiba atspindi bendrj chromosom kilm. Jeigu chromosomoje yra bent keli
polimorfiniai lokusai, tai kiekviena nauja mutacija visada yra nepusiausviroje sankiboje, nes i pradi
ji aptinkama tik vieninteliame haplotipe. Bgant laikui, rekombinacija maina nepusiausviros sankibos
apimt. Nepusiausviros sankibos tarp aleli egzistavimas atspindi tam tikro haplotipo populiacijoje vykusios rekombinacijos istorij.
Nepusiausviros sankibos tyrim pradia galima bt laikyti 1909 metus, kai Weinbergas pastebjo ir apra dviej gretim lokus aleli ssajos dsningumus populiacijoje (Xiong ir Guo, 1997).
Daugiausia nepusiausviros sankibos tyrim atlikta dirbant su mogaus populiacijomis. Individuals
SNP haplotipai konkreiame gene metodikai yra analizuojami iekant ssajos su dominuojaniuoju
fenotipu. Didels apimties nepusiausvira sankiba gali sumainti SNP lokus skaii, kuris turi bti ianalizuotas siekiant apibdinti genotipus kaip visum.
1-as lokusas
A

2-as lokusas
B

Ryys tarp sukibusi aleli

62 pav. Nepusiausvira sankiba tarp aleli dviejuose lokusuose. Esant nepusiausvirai sankibai, nustaius alel viename lokuse, kartu gaunama informacija ir apie atitinkam alel kitame lokuse
Populiacijoje randama nepusiausvira sankiba yra daugelio veiksni sveikos padarinys. Ypa
svarbu yra nauj mutacij danis ir rekombinacijos greitis (danis). Naujos mutacijos sukuria naujus
haplotipus. Bgant laikui, nepusiausvira sankiba maja. Rekombinacija suardo haplotipus ir maina
nepusiausvir sankib. Tai vyksta tuo greiiau, kuo didesnis rekombinacijos danis. Daniausiai, bet
ne visada, nepusiausvira sankiba palaipsniui maja tolstant nuo tam tikro pasirinkto alelio. Tai rodo
didesn rekombinacijos tikimyb platesniame chromosomos intervale. Kur nevyksta rekombinacija,
ten yra visika nepusiausvira sankiba. Be to, nepusiausvir sankib veikia ir dauginimosi bdas. Pavyzdiui, augalai skirtingai nei induoliai gali daugintis savidulkos bdu ir krymikai. O tai lemia didelius nepusiausviros sankibos skirtumus j chromosomose. Ryse, kuriose vyrauja savidulka (vairenyje, sojoje, mieyje), rekombinacija dl didelio i ri individ homozigotikumo vyksta tarp identik haplotip. Todl iuo atveju ji nesumaina nepusiausviros sankibos. Tokiose ryse nepusiausvira sankiba gali siekti nuo deimi iki imt kbp (9 lentel). Krymadulkse augal ryse (kukurzuose, daugumoje spygliuoi) stebima daug maesn nepusiausvira sankiba. Kai kuriose kukurz
populiacijose nepusiausvira sankiba tesiekia kelet imt bp (Tenaillon ir kt., 2001).
9 lentel. Nepusiausviros sankibos dydis vairiose organizm ryse (Tenaillon ir kt., 2001)
104

Ris
mogus
Galvijai
Baltaiedis vairenis
Soja
Paprastoji egl
Vynmedis
Kukurzas
Kukurzo imbredlinijos (JAV)

NS
5 60 kbp
> 10cM
50 100 kbp
> 50 kbp
~ 100 bp ir ~ 200 bp
> 500 bp
~ 400 bp
~ 1 kbp

Siekiant nustatyti ry tarp genotipo ir fenotipo, individai i vairi populiacij genotipuojami pagal daugel lokus, atskirt nedideliais intervalais vieni nuo kit. Po to iekoma ryio tarp nustatyt
polimorfizm lokusuose ir tam tikro fenotipo. Kiek lokus reikia itirti vienam genomo ilgio vienetui,
norint surasti toki koreliacij, labai priklauso nuo nepusiausviros sankibos lygio konkreioje populiacijoje. Uuot tyrus vis genom, galima nustatyti kelet konkrei gen, remiantis j genetinmis ypatybmis ar genolapio duomenimis. Tada konkretaus geno SNP arba haplotipai sujungiami ir lyginami
su individ, turini t ar kit haplotip, fenotipu. Taip iekoma statistikai reikming skirtum tarp
polimorfizmo pasiskirstymo skirtingo fenotipo individuose.
Kuriant genolapius, daniausiai naudojamos i F1 gautos palikuoni genolapio populiacijos. Perspektyvi alternatyva kartografuoti genus ssajos analizs (angl. association analysis) metodu gamtinse populiacijose. Nepusiausvira sankiba yra svarbiausias ssajos analizs veiksnys. Atstumas, kuriuo
pasireikia nepusiausvira sankiba, nulems, kiek reiks ymen ir kokiu danumu jie turi bti pasiskirst genome (63 pav.). Ssajos analiz, dar vadinama nepusiausviros sankibos kartografavimu (angl. LD
mapping), pirmiausia pradta naudoti kai kuri mogaus lig, pvz., Alzheimerio, cistins fibrozs ir
kit lig prigimiai nustatyti. Ssajos metodas tiria, ar tam tikras alelis daniau randamas serganiuose
ar sveikuose individuose. Koreliacij paieka vykdoma populiacijos lygmenyje (Lander ir Schork,
1994). Neseniai metodas pradtas taikyti ir kituose organizmuose, tarp j ir augaluose. Naudojant gamtines populiacijas kartografavime manoma ymiai padidinti genolapi skiriamj geb. Potencialiai
ssajos analiz gali nustatyti gene vienintel polimorfizm, kuris atsakingas u fenotipo pokyt. Galbt
pirmkart nepusiausvir sankib kartografavimui panaudojo Fisheris 1947 m. Jis lokus isidstymo
tvark nustat naudodamas rezus faktoriaus (Rh) aleli danius (Cardon ir Bell, 2001). Genetins ssajos ir sankibos analizs pagrstos tuo paiu dsningumu tai greta esani DNR sek paveldjimas
kartu. Sankibos analizje toks sukibusi gen paveldjimas tiriamas tik keliose kartose. Ssajos analiz
remiasi toki gretim DNR sek isaugojimu draugje daugyb kart. Didelse ir spariai auganiose
populiacijose (pvz., mogaus) rekombinacija yra svarbiausia jga, kuri, keiiantis kartoms, suardo sankib ir ssajas tarp DNR sek (ar gen aleli). Kadangi sankibos analiz apima tik nedidel laikotarp
(kelet kart), todl rekombinacijai tam tikrame genomo rajone vykti nra daug galimybi. Rajonai,
siejami su tam tikra anomalija (ar poymiu), kurios tikra prieastis yra mutacija. Danai jie labai dideli
ir gali apimti imtus ar net tkstanius gen. O ssajos analiz remiasi rekombinacijos istorija tam tik105

roje populiacijoje, todl tokie su liga susij rajonai krymikai besidauginani individ populiacijoje
teorikai gali bti labai mai (genas ar jo dalis). I kartos kart mutantinis alelis atskiriamas nuo originaliam haplotipui bdingo aleli rinkinio. Taiau tam tikros DNR sekos bdingos senoviniam genotipui gali ilikti. Tai ir yra nepusiausvira sankiba, suteikianti genetin pagrind ssajos metodui.

63 pav. Nepusiausviros sankibos (NS) dydio ir skiriamosios gebos priklausomumas iekant ssaj tarp DNR polimorfizmo ir fenotipo (Rafalski, 2002): A kai nepusiausvira sankiba didel, ji
pamau maja didjant atstumui nuo geno, atsakingo u fenotip (genas ovalas viesiai pilkoje
zonoje); B kai nepusiausvira sankiba maa, ir ji dar staigiai maja u prieastinio geno rib, tai,
norint rasti susijus su poymiu ymen (rodykl), reikia nustatyti ymiai daugiau ir daniau isidsiusi ymen
Nepusiausvirai sankibai vertinti daniausiai naudojami statistiniai metodai yra r2 ir D'. Tarkime,
turime aleli por A ir a viename lokuse ir B bei b kitame. J daniai atitinkamai yra A, a, B, b.
Tada galim haplotip daniai bus AB, ab, aB, Ab. Nepusiausviros sankibos statistikos esm skirtumas tarp stebim ir teorikai laukiam haplotip dani: Dab = (AB AB). Abiej metod savitumas i skirtum matavimo specifika (Flint-Garcia ir kt., 2003):
2

r =

( Dab )

A a B b

( Dab )
D' =
,
min ( A b a B )

Dab < 0;

( Dab )
D' =
,
min ( A B a b )

Dab > 0.

Nustatyti molekulin ymen, esant nepusiausvirinje sankiboje su tam tikru kiekybini poymi
lokusu, yra tas pats kaip rasti adat ieno kupetoje. Todl pirmasis ingsnis nustatyti konkreius
(kandidatinius) genus, dalyvaujanius i poymi genetinje kontrolje. Taigi pirmiausia genolapyje
reikia nustatyti sankib tarp konkretaus geno (ar jo ymens) ir kiekybinio poymio lokuso. Toliau, pasitelkiant ssajos analiz, iekoti ryio tarp konkretaus geno polimorfizmo ir mus dominanio poymio
kintamumo. Konkretus genas gali bti keli ri. Funkcinis konkretus genas tai inomas genas, kuris galbt veikia poymio iraik. Jis gali bti numanomas a priori remiantis iniomis apie mus dominanio poymio biocheminius ir raidos kelius. Raikos konkretus genas bna tada, kai geno raikos
pokyiai sutampa su streso poveikiu ar organizmo raidos pokyiais ir susij su atitinkam kiekybini
106

poymi kintamumu. Padties konkrets genai tai genai, kurie genolapyje patenka konkretaus KPL
interval. Genai, atitinkantys visus iuos tris kriterijus (funkcij, raik ir padt), yra patikimi kandidatiniai genai, kurie gali bti patvirtinti kartografuojant nepusiausvir sankib gamtinse populiacijose
arba genetins transformacijos bdu. Tik tada bus galima sukurti instrument molekulinei sudting
poymi selekcijai.
Svarbiausiu 20 a. genetikos laimjimu bt galima laikyti iaikinim, kaip genas kontroliuoja
elementar poym, o, irint i iandienos perspektyvos, svarbiausia, k genetika gali duoti 21 a., galt bti gen ir aleli, valdani sudtingus (kiekybinius) poymius, nustatymas ir praktinis j naudojimas.
2.4.4. Genetini kamien krimas homologins rekombinacijos bdu modifikuojant
recipiento genom
Homologin rekombinacija, pritaikyta keiiant chromosomoje esant gen modifikuota kopija,
pirmkart pritaikyta E. coli genome. Tam panaudoti i fago sukurti vektoriai, kurie buvo terpiami
bakterijos chromosom homologins rekombinacijos bdu, prie tai panaikinus fago gebjim vykdyti
sait-specifin rekombinacij. Nauj postm panaaus pobdio darbams dav skmingi bandymai,
atlikti su mielmis S. cerevisiae, o vliau pritaikyti ir peli genetikoje. Szostakas ir kt. rod, kad DNR,
terpta S. cerevisiae, gali transformuoti mieli lsteles, vykstant homologinei rekombinacijai su
chromosominiais genais (r. 2.3.2.4.skirsn). Jie taip pat nustat, kad i rekombinacij skatino dvigrandis trkis DNR homologijos vietoje. Nustatyta, kad toks trkis itaisomas nukopijuojant chromosomoje esani informacij. ie darbai dav pradi panaiems eksperimentams su induoliais, pirmiausiai pelmis, ir j lsteli kultromis. Pels savo anatomija ir fiziologija panaios mog. Kaip
induoli modelin sistema pels labai tinka dl mao dydio ir didelio vislumo. 80 proc. pels gen
turi vienintel gen ortolog mogaus genome. Daugiau kaip 90 proc. mogaus ir pels genomo gali
bti sugrupuota chromosom segmentus, kuriuose ryki sintenija (Waterston ir kt., 2002).
Kryptinga genomo modifikacija homologins rekombinacijos bdu pels kamieninse embriono
lstelse dabar yra prastas metodas, leidiantis modifikuoti bet kur pasirinkt genomo lokus. Pradioje metodo panaudojim pels ir kit induoli lsteli kultrose sunkino tai, kad nedsninga rekombinacija ioje sistemoje yra 100010000 kart danesn u homologin. Pavyzdiui, kai pirmkart
mogaus -globino lokus buvo terptas vektorius homologins rekombinacijos bdu, tai nustatytas
ios rekombinacijos danis transformuotose lstelse buvo lygus 0,001 (Smithies ir kt., 1985). Todl
btina grieta rekombinant po homologins rekombinacijos atranka. Reikjo sukurti bdus, kuriais
galima veikti i problem. Vienas i toki PGR metodas. Naudojant PGR metod galima aptikti
retus homologinius rekombinantus transformuot lsteli masje ir padidinti j kiek. Embriono kamienins lstels gaunamos i pels blastocisto (Evans ir Kaufman, 1981; Martin, 1981). Lsteles manoma auginti sintetinje terpje, kurioje galima skmingai atrinkti rekombinantus. Po genetinio per107

tvarkymo tokios lstels vl virkiamos pels blastocist ir i j gali formuotis vis tip lstels.
Gaunamas individasmozaika (chimera), sudarytas i lsteli, turini tvin ir rekombinacin genotipus. Jeigu i transformuot embrionini lsteli susiformuoja bent iek tiek mozaikins pels generatyvini lsteli, tai kai kurie j palikuonys visose savo lstelse gali turti pakitus gen. 1987 m. gauta
homologin rekombinacija paeist pels hipoksantino fosforiboziltransferazs (HPRT) gen (Doetschman ir kt., 1987; Thomas ir Capecchi, 1987).
Dar vienas svarbus aspektas iuose eksperimentuose genotipas, kuriame galima bt tirti gautas
mutacijas. Vienas daniausiai naudojam yra 129 peli kamienas. I jo lengviausia gauti kamienini
lsteli linijas.
Modifikuojant peli genom homologins rekombinacijos bdu, naudojami dviej tip vektoriai:
pakeitimo ir terpimo (64 pav.).

64 pav. Homologins rekombinacijos vektori, naudojam genams modifikuoti, klasifikacija

(Mller 1999): A pakeitimo vektorius. Antrasis tikslinio geno egzonas modifikuojamas, j terpus atsparumo neomicinui (neo) gen, esant linijiniame vektoriuje. HSV timidino kinazs genas
(tk) prarandamas homologins rekombinacijos metu. Juodi staiakampiai egzonai; itisins x pavidalo figros krosingoverio vieta; punktyrins linijos kai kurios homologikos sekos. P1 ir
P2 PGR pradmenys, naudojami rekombinant, gaut HR bdu, atrankai; B terpimo vektorius,
kuris suskaldytas homologijos rajone tarp 2-ojo ir 3-ojo egzon. Neo genas ymuo atrankai.
Homologin rekombinacija sukelia vektoriaus sek siterpim ir dalin genomo sek duplikacij.
Plona linija plazmids kontrai
Dauguma pels nulini mutant gauti panaudojant pakeitimo vektorius (Mller, 1999). Nustatyta,
kad tokiuose gen pakeitimo ar ijungimo eksperimentuose homologins rekombinacijos daniui takos turi keli veiksniai:
108

1) rekombinacijos danis didja, kai didja homologijos saito tarp vektoriaus ir tikslinio lokuso ilgis madaug nuo 0,5 kbp iki 10 kbp. 0,5 kbp yra minimalus homologijos saito dydis ioje sistemoje;
2) rekombinacijos danis didesnis naudojant i to paties organizmo genomo paimt DNR;
3) absoliuts rekombinacijos daniai, matyt, priklauso nuo paties lokuso savybi. Tai gali nulemti
jo chromatino organizacija.
Dabar, kai atliekamos sudtingos manipuliacijos genetiniams peli kamienams sukurti, vis plaiau
taikomos sait-specifins rekombinacijos sistemos. J konstravimo ir panaudojimo principai bus aptarti
3.1.7. skirsnyje.
induoli gen ijungimo metod, panaudojant homologin rekombinacij embrion kamieninse
lstelse, sukrimas turjo didiul reikm visiems induoli biologijos tyrimams. Todl nenuostabu,
kad trys daugiausia ioje srityje nusipeln mokslininkai (M.R. Capecchi, M.J. Evans ir O. Smithies)
2007 m. vertinti Nobelio premija.

109

3. Sait-specifin rekombinacija
Tai iek tiek pasens terminas. Istorikai iai reikini grupei buvo priskiriami gana vairs rekombinacijos vyksmai, pavyzdiui, fag integracija ir ekscizija ar judrij element transpozicija. Dabar apie transpozicij ir taip vadinamj konservatyvij sait-specifin rekombinacij (KSSR) kalbama
atskirai. Vis dlto ioms reikini grupms bdingi kai kurie bendri bruoai, skiriantys juos nuo homologins rekombinacijos ir nedsningos rekombinacijos, ir bent i dalies pateisinantys senojo termino
vartosen. Sait-specifinje rekombinacijoje dalyvaujanios baltym molekuls (rekombinazs) atpasta specifines sekas ir sveikauja su jomis. io tipo persitvarkymai nukleorgi molekulse vyksta
nepriklausomai nuo recA (Rad51) geno veiklos. Nepaisant i panaum, egzistuoja dideli skirtumai
tarp transpozicijos ir KSSR. Skiriasi i reikini mechanizmai bei galutiniai rezultatai, todl apie juos
kalbsime atskirai.

3.1. Konservatyvioji sait-specifin rekombinacija

1962 m. A. M. Campbell atrado konservatyvij sait-specifin rekombinacij (KSSR). Mokslininkas, aikindamas reikin, ikl hipotez, kad fagas gali siterpti ir isikirpti i E. coli genomo
(Campbell, 1962). Pagrindin KSSR savyb yra ta, kad ji vyksta tarp vairaus dydio specifini sek.
DNR trkiai ir sujungimai labai tiksls, juose nevyksta DNR sintez, nesusidaro delecij ar duplikacij. KSSR reciprokin rekombinacija. Sveikoje dalyvaujanios DNR molekuls turi vairaus dydio
(priklausomai nuo sistemos) identikas sritis. Be to, KSSR metu susidaro laikina kovalentin jungtis
tarp suskaldytos DNR molekuls galo ir rekombinazs baltymo. Taip yra laikinai isaugoma fosfodiesterins jungties energija. O transpozicijoje dalyvaujanios DNR molekuls daniausiai neturi jokios
homologijos, DNR trkis ir sujungimas susij su didesne ar maesne DNR sinteze. i rekombinacija
nereciprokin. Tarp transpozazs (ar integrazs) ir DNR nesusidaro laikina kovalentin jungtis.Vykstant KSSR, du skirtingi replikonai gali bti sujungiami vien, replikonai gali bti atskirti, taip
pat gali vykti DNR rajono inversija. Pagal tai KSSR sistemos skirstomos integracijos-ekscizijos, atskyrimo-ekscizijos bei inversijos sistemas.
3.1.1. Integracijos-ekscizijos sistemos
Bene geriausiai itirti io tipo reikiniai fag integracija ir ekscizija. Kaip minta, Campbell, tirdamas liamboidinius fagus, atrado io tipo rekombinacijos mechanizm. Campbell teisingai numat,
kad lizogenins bsenos metu fagas yra integravsis bakterijos chromosom. Integracijos metu
vyksta sait specifin-rekombinacija tarp fago attP ir bakterijos attB sait (65 pav.). Rekombinacijai
reikalingi du baltymai: fago koduojamas Int baltymas ir E. coli baltymas IHF (angl. Integration host
factor). Profagas bakterijos chromosomoje atsiduria attL ir attR sait apsuptyje. Tuo metu, kai fagas
isikerpa i bakterijos chromosomos, vyksta rekombinacija tarp i sek. Jos yra attP ir attB hibridai.
110

Profago ekscizijai reikalingi Int, IHF ir Xis () baltymai. Proceso metu lstelje dar dalyvauja ir E. coli
koduojamas baltymas Fis. iam KSSR tipui priklauso nemaai vairiausi fag integracijos ir ekscizijos sistem (pavyzdiui, 80, P2, P4, P22 ir kt.).

65 pav. Fago integracijoje bei ekscizijoje dalyvaujantys baltymai ir rekombinacijos saitai

3.1.2. Atskyrimo-ekscizijos sistemos

3.1.2.1. Transpozon kointegrat atskyrimas
Tn3 tipo tanspozon okinjimas vyksta dviem etapais. Pirmajame etape vyksta replikatyvioji
transpozicija tarp replikono donoro, turinio transpozon, ir replikono, neturinio io judraus genomo
elemento. I abiej replikon susidariusi jungtin DNR molekul vadinama kointegratu. Jame donoro
ir recipiento replikonai atskirti viena kryptimi orientuoto transpozono Tn3 kopij (66 pav.), transpozicij vykdo tnpA geno produktas baltymas TnpA (transpozaz). Antras etapas KSSR. ia vyksta
kointegrato skaldymo (replikon atskyrimo) reakcija specifiniuose res saituose, kurie yra kiekvienoje
Tn3 kopijoje. i reakcij vykdo transpozono koduojama rezolvaz, geno tnpR produktas. Reakcijos
pabaigoje vl susidaro du replikonai, i kuri kiekvienas turi po Tn3 kopij.

66 pav. Kointegrato susidarymas ir suskaidymas vykstant Tn3 transpozicijai. Pirm etap vykdo
Tn3 transpozaz. Antras etapas kointegrato suskaidymas yra KSSR, kuri vykdo judraus genomo elemento koduojama rezolvaz. bla laktamazs genas

111

3.1.2.2. Plazmidi segregacija

Kad plazmids bt stabiliai perduodamos i motinins lstels dukterinms, jos turi turti mechanizmus, utikrinanius j paskirstymo patikimum. Yra du pagrindiniai i mechanizm tipai: 1)
daugiakopijins plazmids pasiskirsto atsitiktinai. Po to j skaiius dukterinse lstelse pasiekia prast lyg; 2) maakopijins plazmids negali pasikliauti atsitiktinumu. Svarb vaidmen toki plazmidi
paskirstyme dukterines lsteles atlieka ir konservatyvioji sait-specifin rekombinacija. io mechanizmo dka dimeriniai (arba multimeriniai) plazmids dariniai, atsirandantys dl homologins rekombinacijos, suskaldomi iki atskir plazmidi. Pavyzdiui, fagas P1 lizogeninje bsenoje daniausiai
egzistuoja ne integruotas bakterijos chromosom, bet kaip dimerins plazmids. Prie E. coli dalijantis, dimerins plazmids turi bti paverstos monomerinmis, kurios vliau patenka dukterines lsteles. Iskyrim atlieka P1 baltymas Cre rekombinaz. Rekombinacij jis vykdo specifiniuose lox saituose. Kitas pavyzdys daugiakopijin plazmid ColE1. i plazmid turi sait-specifins rekombinacijos
sek cer, kurioje vykstant KSSR multimerins plazmids paveriamos monomerais ia veikia Cer
rekombinaz. baltym koduoja E. coli genai xerC ir xerD. domu tai, kad paiai bakterijai i gen
produktai reikalingi genomams, susidariusiems po replikacijos, atskirti. Tai vyksta dif saite, kur atpasta ie baltymai. Taigi fagas ir ia pasinaudoja eimininko rekombinacijos aparatu.
3.1.2.3. Ekscizija raidos metu
Jei aplinkoje trksta azoto, tai kai kuri melsvabakteri (pavyzdiui, Anabaena) lstels gali diferenciuotis specializuotas lsteles, heterocistas (67 pav.). Jos skirtos atmosferinio azoto fiksavimui.
Aktyvs genai, reikalingi iam sudtingam procesui utikrinti, susidaro vykstant dviem KSSR reakcijoms. J metu isikerpa DNR segmentai (11 kbp ir 55 kbp), siterp koduojamsias atitinkam gen
sekas. Procese dalyvaujanios rekombinazs vadinamos XistA ir XistR.

67 pav. Anabaena sp.heterocistos. dbpedia.org/resource/Heterocyst

3.1.3. Inversijos sistemos

iuo atveju rekombinazs vykdo tam tikr sek inversijas. Dl to pakinta gen raika. Danai io
tipo rekombinacijos nulemia bakterij patogenikumo pokyius.
3.1.3.1. Hin, Gin, Cin, Pin sistemos
Hin sistema veikia Salmonella typhimurium ir keiia iuelio baltymus koduojanij gen (H1 ir
H2) raik (68 pav.). Tai padeda bakterijai apsisaugoti nuo eimininko imuninio atsako. Fage Mu vei112

kia Gin sistema, fage P1 Cin sistema. Dl j sukelt inversij keiiamos fago ataugli savybs tai
leidia fagui ukrsti platesn eiminink rat. Pin sistem koduoja E. coli e14 segmentas, kuris greiiausiai yra defektyvus fagas.
H2 flagelinas

hin

H2

H1 represorius

rh1

H1
H1 genas neveikia

Inversija

H1 flagelinas
H2 ir rh1 genai neveikia

H2

rh1

H1

hin

68 pav. Hin rekombinazs vykdoma rekombinacija Salmonella typhimurium genome. Dl fragmento, esanio tarp sek hix (raudoni trikampiai), inversijos veikia vienas ar kitas flagelino genas.
H2 flagelino genas (H2) ir H1 flagelino geno represoriaus genas (rh1) pavalds tam paiam promotoriui. Todl, vykstant i gen raikai, H1 flagelino genas (H1) yra neveikus. vykus inversijai, H2 flagelino ir H1 represoriaus genai tampa neveikliais, nes paalinamas j promotorius, todl
gali reiktis H1 genas. www.mun.ca/.../Topics/Site_specific_Recomb.html
Hin, Gin, Cin ir Pin rekombinazs funkcikai yra vienodos ir gali pakeisti viena kit. Jos labai panaios ir savo struktra (aminorgi homologija 60 proc.).
3.1.3.2. Fim sistema.
E. coli fimA genas koduoja svarbiausi fimbrij baltym. ios ataugos bdingos daugeliui gramneigiam bakterij ir svarbios prisitvirtinti prie eimininko lsteli (Gally ir kt., 1993). Fimbrijos yra
stiprus imunogenas. Todl, siekdamos ivengti imuninio atsako, bakterijos vykdo fimbrij tip kait.
Tokia vadinamoji fazi kaita vyksta labai vairiai. Vienas i mechanizm DNR segmento inversija.
Fim sistemos veikla vienas toki atvej. Inversijos metu kinta 314 bp DNR segmento, turinio fimA
promotori, orientacija (69 pav.). Taigi is segmentas in cis valdo fimA geno raik. Todl fimA genas
veikia, kai mintas 314 bp segmentas yra orientuotas viena kryptimi, ir neveikia, kai orientuotas kita
kryptimi. Rekombinacij (inversij) valdo du genai fimB ir fimE. Ji gali vykti veikiant vienam i j.
Inversijai reikalingi ir papildomi baltymai, pavyzdiui, IHF. i KSSR sistema skiriasi nuo Hin tipo invertazi. FimB ir FimE baltymai panas (48 proc. aminorgi identikos). Jie taip pat giminiki fago integrazs eimos sait-specifinms rekombinazms.

113

69

pav.

Fim

invertuojamo segmento sinapss modelis (pagal I. Blomfield;

www.kent.ac.uk/blomfield/). Sinapsei vykti, be invertuojam segment (juodos rodykls), FimB ar
FimE baltym (spalvoti ovalai i abiej segment pusi), dar reikalingi ir papildomi veiksniai:
IHF bei Lrp. Manoma, kad i baltym jungimasis paalina antrines DNR struktras, trukdanias
vykti rekombinacijai
3.1.3.3. FLP sistema
Kepimo mieli S. cerevisiae branduolyje danai randamos plazmids, kurios vadinamos 2 (70

pav.). ios plazmids yra rykus egoistins DNR pavyzdys, jos nesuteikia eimininkui jokios naudos, taiau turi apie 50100 savo kopij. Taip pat jos turi KSSR sistem, kuri invertuoja didel plazmids segment. Inversij vykdo plazmids koduojama FLP rekombinaz. Ji atpasta FRT sait ir sukelia jame dvigrand trk, skatindama rekombinacij. Inversija reikalinga plazmids kopij padauginimui. Plazmids kopij skaiius negali bti padidinamas prastu bdu, nes eukariot lstelse DNR replikacija vyksta tik vienkart lstels ciklo metu. Replikacijai vykstant nuo ARS (70 pav.), susidaryt
tik dvi plazmids kopijos vieno ciklo metu. Todl ia panaudojamas sait-specifins rekombinacijos
mechanizmas. Plazmid turi dvi invertuotas 599 bp sekas, kuriose yra rekombinacijos saitai FRT.
iuose saituose, veikiant FPL, vyksta rekombinacija, invertuojamas plazmids segmentas ir nuo ARS
prasidjusi dvikrypt replikacija perjungiama replikacij pagal besisukanio rato mechanizm (71
ir 72 pav.). FLP geno raik valdo REP2, REP1 ir D genai. J koduojami baltymai slopina FLP raik.
Slopinimo efektyvumas priklauso nuo plazmids kopij skaiiaus. Kuo daugiau yra jos kopij, tuo
slopinimas stipresnis. Kai mieli lstelje yra maai ios plazmids kopij, FLP geno veikla jungiama
ir vyksta sait-specifin rekombinacija.

70 pav. 2 plazmids genolapio schema. ARS (angl. autonomous replication sequence) dvikrypts replikacijos pradios vieta; FLP sait-specifins rekombinazs geno vieta. REP2, REP1, D
genai, valdantys FPL geno raik;. STB trumpos vienakrypts pasikartojanios sekos, reikalingos
plazmidi paskirstymui dukterines lsteles mitozs ir mejozs metu. Rodyklmis paymtos sekos, dalyvaujanios inversijoje www.sci.sdsu.edu/.../plasmids/yeast-plasmid.html
114

FLP rekombinaz
d

a
b

71 pav. FLP rekombinazs vykdoma inversija www.sci.sdsu.edu/.../plasmids/yeast-plasmid.html

72 pav. Dl FLP vykdomos rekombinacijos tarp FRT1 ir FRT2 sek nuo ARS prasidjusi dvikrypt replikacija perjungiama replikacij pagal besisukanio rato mechanizm, nes replikacijos akuts nukreipiamos viena paskui kit (pagal Ghosh ir kt., 2006)

3.1.4. Konservatyviosios sait-specifins rekombinacijos mechanizmai

Daugelio KSSR sistem veikimas buvo pademonstruotas in vitro paprastuose drusk tirpaluose.
Buvo igryninti rekombinaciniai baltymai, o rekombinacijai svarbios sekos iaikintos pasitelkus mutacin analiz. i tyrim pradia galima laikyti 1975 m. paskelbt H. A. Nesho straipsn, kuriame
buvo aprayta in vitro atlikta sait-specifin rekombinacija naudojant fago ir E. coli baltym ekstraktus. Vliau pavyko igryninti ios sistemos baltymus, dalyvaujanius rekombinacijoje. KSSR mechanizmai panas. Rekombinacijos saitai kerpami substratinje DNR tam tikrose vietose, kuriose abiej
sait sekos yra vienodos. Trki galai sujungiami naujai, trkio-sujungimo reakcijos vyksta per tarpin
kovalentin baltymo (rekombinazs) ir DNR kompleks. Rekombinaz kur laik ilieka kovalentikai
prisijungusi prie laisv DNR gal. Taip isaugoma fosfodiesterins jungties energija. Taigi KSSR metu vyksta labai darnios skaldymo ir sujungimo reakcijos, kuri metu DNR neprarandama ir nauja nesintetinama. J metu nedalyvauja joks makroerginis veiksnys.
3.1.4.1. Reikalavimai substratinei DNR
KSSR sistemos skiriasi savo DNR substratais, pavyzdiui, rezolvazs ir invertazs sveikauja tik
su superspiralizuota DNR, turinia tik tam tikra tvarka organizuotus rekombinacijos saitus: rezolvazms jie turi bti toje paioje DNR molekulje, orientuoti ta paia kryptimi, invertazms toje paioje
DNR, taiau orientuoti prieingomis kryptimis. Taiau yra ir iimi, pavyzdiui, kai kurios io tipo
rekombinazs (pavyzdiui, Cre, FLP) gali sveikauti su bet kokios konfiguracijos rekombinacijos saitais, esaniais toje paioje DNR, tiek skirtingose DNR molekulse arba orientuotais atsitiktine tvarka
115

toje paioje molekulje, taip pat joms nereikia superspiralizuotos DNR. Int baltymo atveju rekombinacijos saitai gali bti bet kokios konfiguracijos, taiau attP seka turi bti superspiralizuota. Kitiems att
saitams rekombinacijos metu superspiralizacija nebtina. Visi rekombinacijos saitai panas tuo, kad
turi vienodas sritis, kuriose ir vyksta grandini mainai. Kiekvienas po rekombinacijos susidars saitashibridas turi hibridin DNR fragment, kuriame kiekviena DNR grandin yra skirtingos kilms (susidar dl dviej skirting DNR gal sujungimo). i sritis rekombinacijoje yra esmin. Homologija joje
btina. Pavyzdiui, attP ir attB sait konservatyvaus rajono ilgis siekia 15 bp, o persidengiani sek
ilgis hidridiniame saite 6 nt (73 pav.). Tok persidengimo (hibridin) rajon supa prieinga kryptimi
orientuotos atpainimo sekos. Prie j jungiasi rekombinacijos baltymai. Rekombinacijos saitai pagal
savo sandar gali bti skirstomi paprastus ir sudtingus. Paprast sait atveju rekombinacijai vykti
pakanka informacijos, esanios persidengimo rajone bei atpainimo sekose. io tipo saitams priklauso
attB, lox, FRT (74 pav. ). Antrojo tipo sait struktra daug sudtingesn, pavyzdiui, Hin sistemos saitams bdinga ne tik persidengimo rajonas bei atpainimo sekos, taiau ir taip vadinamasis rekombinacijos enhanceris. Prie pastarosios sekos jungiasi baltymas Fis.

73 pav. Bakteriofago integracijai btinas jo paties koduojamas Int baltymas ir bakterijos IHF
baltymas. Jie jungiasi tam tikrose vietose prie DNR sek, vadinam attP ir attB. Abu
rekombinacijos saitai (attP ir attB) turi konservatyvias 15 bp sekas. Po rekombinacijos susidaro
attR ir attL saitai, kurie yra attP ir attB hibridai (pagal Weisberg ir Landy, 1983)

116

Baltymas

Seka (saitas)
lox

Cre

FRT

FLP

attB

Int

attP

Int

gix, hix

Gin, Hin

res

rezolvaz

74 pav. KSSR rekombinazi atpainimo sek struktra. Visose sekose yra vietos (viena prie kit
nukreiptos rodykls), prie kuri jungiasi rekombinazs. ios atpainimo vietos supa persidengimo rajon, kuriame vyksta DNR trkiai ir grandini mainai (neutuuoti staiakampiai; dydis
nuo 2 bp iki 8 bp). Kai kurie rekombinacijos saitai turi tik rekombinazi prisijungimo vietas (lox,
FRT, attB), o kiti turi vietas, prie kuri jungiasi papildomi baltymai (IHF utuuoti staiakampiai; Fis apskritimai; Xis X). (Pagal Sadowski, 1993)
3.1.4.2. Rekombinacijos baltymai
Rekombinazs turi katalizinius centrus, vykdanius grandini mainus. Prisijung prie rekombinacijos saito atpainimo sek, jos tam tikrose vietose skaldo DNR, sudarydamos lipnius galus. Reakcijos
metu susidaro laikina kovalentin jungtis tarp rekombinazs subvienet ir DNR molekuls gal. Priklausomai nuo baltymo struktros, trkio chemijos ir grandini main mechanizm, iki iol inomas
sait-specifines rekombinazes galima skirstyti integrazs ir rezolvazs/invertazs eimas (Sadowski,
1993). ie pavadinimai gana slyginiai, nes didiul integrazs eim patenka ir kai kurios invertazs
(FLP, FimB, FimE ir kt.), ir rezolvazs (Cre, XerCD ir kt.). Todl dabar integrazs eimos baltymai
vadinami tirozino rekombinazmis, o rezolvazs eimos serino rekombinazmis (Grindley ir kt.,
2006). Skirting eim rekombinazs neturi jokio panaumo. J vykdom grandini main reakcijos
taip pat skiriasi. Todl manoma, kad skirting eim rekombinazs atsirado ir evoliucionavo nepriklausomai viena nuo kitos.

75 pav. Cre rekombinazs ir DNR sinapsinis kompleksas. Keturi Cre baltymo subvienetai laiko
rekombinacijos tarpin produkt su Holidjaus jungtimi beveik kvadratinje ploktumoje. Aktyvs
subvienetai nuspalvinti geltonai, neaktyvs - mlynai (pagal Grindley ir kt., 2006)
117

Tirozino rekombinazi eima. Tyr rekombinazs labiausiai paplitusios prokariotuose, taiau j

randama ir eukariotuose: grybuose, iueliniuose, net kai kuriose sudtingesni eukariot retrotranspozon eimose. Kaip rodo PSI-BLAST paiekos rezultatai, joms giminik baltym yra apie 1000 tai
fag ir transpozon (, P2, P22, 21, 80, HP1, Tn916, Tn1545) integrazs, taip pat kai kurios rezolvazs (Cre, XerCD) ir invertazs (FimBE, FLP). iuos baltymus sudaro apie 300400 aminorgi,
jie panaiai skaldo DNR molekules. Visi jie turi bendr katalizin domen su panai sek motyvais.
Trki vietoje susidaro 5-OH viengrandiai galai i 68 nukleotid. Baltymas kur laik bna prisitvirtins prie 3galo fosfotirozinine jungtimi. Integrazs panaios ir savo struktra. Naudojant X spinduli kristalografij, suinota nemaai tirozino rekombinazi detali. Itirtos Cre, Flp ir Int sinapsini
kompleks struktros. ie baltymai sudaro C formos apkabas apie DNR substrat (75 pav.). Ypa konservatyvus i baltym karboksilinis domenas, kuriame esanios aminorgi liekanos dalyvauja rekombinazs katalizuojamoje grandini main reakcijoje. Labai svarbus katalizinio cento sudt einantis Tyr. Greta jo yra konservatyvus aminorgi motyvas RKHRH. Be tirozino, dar labai svarbios
Arg ir His. Mutacijos ias aminorgtis koduojamojoje DNR ukerta keli rekombinacijos procesui,
taiau neturi takos prisijungimui prie DNR. U pastaraj reakcij atsakingas NH2 galas, kuris nekonservatyvus. Nustatyta, kad Tyr342 Int baltyme (40 kDa) yra vieta, kuria reakcijos metu baltymas prisijungia prie DNR molekuls 3galo. is baltymas turi katalizin domen, vadinam c170 (aminorgi liekanos nuo 170 iki 356). Nepaisant sek panaumo, tirozino eimos baltymai yra dviej tip.
Vieno j subvieneto Tyr yra nukleofilas ir skaldo DNR, esani greta kito subvieneto (trans kirpimas,
nepavaizduota). Kitais atvejais Tyr atakuoja sek toje DNR grandinje, prie kurios prisitvirtins j neantis subvienetas (76 pav.). Beveik prie keturis deimtmeius (1971) enzimologai pastebjo, kad tirozino rekombinazs vykdo mainus, nesukeldamos tikr dvigrandi trki. I pradi mainai vyksta
tarp virutini skirting dupleks grandini, po to tarp apatini i DNR molekuli grandini. Tai
galbt leidia ivengti galim alutini ios reakcijos produkt susidarymo.

118

3' P-tirozinas

a
5'
3'

R1

R3

5'OH

R2

5'
3'

5'OH

R4
Virutini DNR
grandini mainai

b
5'
3'

5'
3'

c
5'
3'

5'
3'

R1
Holliday jungtis

R2

R4

R3

Apatini grandini
skaldymas

R1
5'OH P

R2

5'OH P

R4

R3

Apatini grandini mainai

ubaigia rekombinacij

5'
3'
5'
3'

76 pav. Tirozino rekombinazi vykdomi grandini mainai (pagal Watson ir kt., 2004). Rekombinacija prasideda, kai kiekvieno DNR duplekso viena i grandini nukleofilikai atakuojama prie
jos prisitvirtinusio rekombinazs subvieneto tirozino (neparodyta): A virutins DNR grandins
yra skaldomos, tarp j 3galo ir baltymo susidaro kovalentin fosfotirozino jungtis ir sukuriami
laisvi 5-OH galai. Vykstant iai reakcijai, DNR fosfodiesterins jungties energija perduodama
fosfotirozinui. Kitas etapas virutini grandini mainai. Jie vyksta, kai laisvi 5-OH galai atakuoja kito mainuose dalyvaujanio DNR duplekso 3 fosfotirozino jungtis; B susidaro Holidjaus jungtis. Kompleksas gali izomerizuotis, neaktyvs subvienetai virsti aktyviais, ir atvirkiai.
Tai leidia vis vyksm pakartoti jau dalyvaujant apatinms DNR dupleks grandinms ir prie j
prisijungusiems rekombinazs subvienetams, kuri tirozino OH grups vykdo fosfodiesterini
jungi nukleofilin atak; C susidaro naujos fosfotirozino jungtys ir laisvi apatini grandini
5-OH galai, kurie nukleofilikai atakuoja trans padtyje esanias fosfotirozino jungtis; D tai atlaisvina rekombinazes nuo DNR ir ubaigia sait-specifin main reakcij
Serino rekombinazi eima. i eima gana nevienalyt, nes jai priklausantys baltymai labai skiriasi
savo dydiu (nuo 180 iki 800 aminorgi liekan). Daugiausia informacijos apie i baltym savybes gauta tiriant rezolvaz. is baltymas sudarytas i 183 aminorgi, o jo katalizinis domenas
(apie 100 aminorgi) yra N gale. Serino nukleofilas yra 10-oje padtyje nuo N galo. Determinantai,
atsakingi u DNR sek atpainim, yra karboksiliniame baltymo gale. rezolvaz tirpale yra dimerinis baltymas. Nors gerai itirtos Gin ir Hin rekombinazs yra panaaus dydio, taiau kiti ios eimos
baltymai daug didesni. Kai kurie j turi sek atpainimo domen N gale. Vis dlto serino rekombinazs turi nesunkiai atpastam katalizin domen, kuriame yra serino nukleofilas, sudarantis rekombinazs aktyvj sait. Daniausiai main mechanizmai tiriami panaudojant Tn3 ir rezolvazes bei Hin
119

ir Gin invertazes. Grandini mainai vyksta sinapsiniame komplekse, kur sudaro keturi rekombinazs
subvienetai ir du krosingoverio rajonai (77 pav.). Susidariusi sinaps aktyvuoja rekombinazs subvienetus skaldyti krosingoverio rajonus ir sudaryti dvigrandius DNR trkius. i reakcija kovalentikai
sujungia keturis rekombinazs subvienetus per fosfoserino jungtis su DNR grandini 5galais ir sukuria laisvus 3-OH galus. Skaldymas vyksta labai darniai, j atlieka rekombinazs, esanios cis padtyje.
Kai krosingoverio vietoje DNR molekuls suskaldomos, laisvi DNR galai pergrupuojami rekombinantin konfigracij. DNR topologijos tyrimai parod, kad vyksta vienos sinapsinio komplekso puss
pasisukimas kitos atvilgiu 180. vykus subvienet mainams, laisvi 3-OH galai atakuoja 5 fosfoserino jungtis ir susidaro rekombinantins DNR molekuls.

77 pav. Serino rekombinazi vykdomi DNR grandini mainai (pagal Watson ir kt., 2004)

3.1.5. aflonai
aflonai (angl. shufflons) pirmiausia buvo atrasti konjugatyvioje plazmidje R64 (strr, tetr). Tai
daugiasaits inversijos sistemos, kuriose yra keletas invertuojam genomo rajon (78 pav.).
120

78 pav. Septyni pilV gen persitvarkymai R64 aflone. Plaiomis rodyklmis paymti 19 bp rekombinacijos saitai. Rci sait-specifin rekombinaz, vykdanti plazmids rajon A, B, C, D inversij. PilVA, PilVA, PilVB vairs PilV baltymo variantai (pagal Komano, 1999)
R64 plazmid nulemia dviej tip pili susidarym: storo standaus ir plono lankstaus. Storas pilius
reikalingas konjugacijai ant kieto paviriaus ir skystojoje terpje, o plonas tik skystojoje terpje. aflonai sudaryti i ei-septyni rekombinacijos sait ir greta esanio rci geno, koduojanio integrazs
eimos rekombinaz. Rekombinacijai nereikalingi IHF ir Fis baltymai, nes ji normaliai vyksta ir ihfA,
ihB, ir fis mutantuose. Taiau reikalingi kiti pagalbiniai baltymai: HU-1 ir HU-2. aflono DNR inversija labai sultja hupAhupB mutantuose. Dl inversijos kinta PilV baltymo C galas, N galas yra pastovus (78 pav.). Invertuojami rajonai apsupti septyni 19 bp dydio rekombinacijos sait. A, B, C, D invertuojami rajonai skiriasi savo dydiu ir DNR sekomis. Atsitiktin rekombinacija tarp rekombinacijos
sait lemia vairi plazmids izomer susidarym. PilV baltymo struktros pokyiai lemia recipient,
kur konjugacijos bdu skystojoje terpje bus perduota R64 plazmid. Recipientais gali bti E. coli
K12, E. coli B, E. coli C, S. typhimurium, Shigella flexneri kamienai.
Po aflon atradimo buvo nustatytos dar kelios daugiasaits inversijos sistemos, pavyzdiui, Min
sistema atrasta bakteriofagui P1 giminikoje E. coli 15T- plazmidje. 3,5 kbp inversijos rajone yra ei
rekombinacijos saitai (mix). Rekombinacij tarp bet kuri dviej mix sait vykdo Min rekombinaz.
Manoma, kad rekombinacijos sukelti genomo persitvarkymai slygoja bakteriofago eiminink vairov. Kitos panaios sistemos buvo aptiktos kai kuriuose patogenikuose mikroorganizmuose. ios sistemos padeda jiems apsisaugoti nuo eimininko imuninio atsako, nes lemia antigen vairov.
3.1.6. Integronai
Paprastos integracijos-ekscizijos sistemos (pavyzdiui, fago ) terpia jiems specifikus att saitus
tik vien savo genomo kopij. O DNR molekuls, vadinamos integronais, turi rekombinacijos sait
(attI), kur gali siterpti daug skirting arba toki pai genetini element, vadinam gen kasetmis. Gen kasets tai nedideli genetiniai elementai, daniausiai sudaryti i atsparumo antibiotikui
geno ir 59 bazi elemento (attC saito). Todl integronai tai sait-specifins rekombinacijos sistemos,
skirtos gen kasei sugavimui, mobilizacijai ir jose esani gen raikos utikrinimui. Svarbiausios
integrono dalys sait-specifins rekombinazs genas (intI) ir rekombinacijos saitas attI. sait bna
siterpusios gen kasets (79 pav.).
121

79 pav. Integrono In1 struktra. intI1 integrazs genas. Neutamsintas trikampis attI saitas,
utamsinti trikampiai attC saitai (59-bazi elementai). Sulenktos rodykls promotorius. Staiakampio pavidalo rodykls genai (pagal Komano, 1999)
Integrono koduojama rekombinaz vykdo rekombinacij tarp ariausiai esanio rekombinacijos
saito attI ir gen kaseti saito attC. Daugelis attC sek skiriasi. J dydis gali vairuoti nuo 57 bp iki
141 bp. Panaumas yra tik sait pakraiuose: kairje pusje yra RYYYAAC, deinje GTTRRRY
sekos. R purinai, Y pirimidinai, vieta, kurioje vyksta grandini skaldymas. attI saite yra dvi
viena kryptimi orientuotos ios sekos motyvo kopijos. Nedideliu daniu gen kasets gali isikirpti i
integrono ir egzistuoti kur laik savarankikai. Gen kasetse randama per 60 atsparumo
antibiotikams gen. Integronai, turintys daug kasei, lemia bakterij atsparum daugeliui antibiotik.
Pavyzdiui, choleros sukljo Vibrio cholerae genome nustatytas milinikas integronas (126 kbp) turi
179 gen kasetes. Integronai nra judrieji genomo elementai tai KSSR sistemos, kuri koduojama
rekombinaz priklauso integrazi eimai ir konservatyviuose domenuose turi labai svarbias Arg, His,
Arg ir Tyr liekanas. Integronai labai svarbs horizontaliam gen perneimui tai savotikos natraliai
egzistuojanios gen klonavimo ir raikos sistemos. J dka bakterijose plinta atsparumo genai.
Kartais juose aptinkami ir kai kurie kiti genai (metabolizmo, restrikcijos-modifikacijos). Integron
egzistavimas svarus argumentas, palaikantis teorij, kad bakterij genomas sudarytas i atskir
moduli.
3.1.7. Konservatyviosios sait-specifins rekombinacijos panaudojimas gen ininerijoje
Trys KSSR rekombinazs plaiausiai naudojamos genetiniams pertvarkymams atlikti heterologinse sistemose tai 38 kDa Cre rekombinaz, atpastanti 34 bp lox sekas, 43 kDa FLP rekombinaz,
atpastanti 24 bp FRT rekombinacijos saitus, ir R rekombinaz, koduojama mieli Zygosaccharomyces rouxii plazmids pSR1, bei atpastanti RS sekas. Visi ie baltymai priklauso tirozino rekombinazi eimai ir gali sveikauti su rekombinacijos saitais, esaniais vairiose bsenose (toje paioje DNR,
skirtingose DNR, iedinje ar linijinje DNR, orientuotais ta paia arba prieinga kryptimis). Rekombinacija tarp dviej invertuot rekombinacijos sait sukels tarp j esanios DNR inversij. Jeigu saitai
orientuoti ta paia kryptimi, tai tarp j esanti DNR bus paalinta ir sudarys iedo pavidalo molekul.
Atvirkias iam procesui bt iedins DNR, turinios KSSR rekombinazs sait, sijungimas linijin DNR (80 pav.). Tai galima panaudoti specifinims lokusams chromosomoje ymti ir pertvarkyti.
Jeigu rekombinacijos saitai bus dviejose skirtingose DNR chromosomose, tai vyks reciprokin rekombinacija ir chromosomos pei translokacijos. Todl ios sistemos panaudojamos chromosomoms pertvarkyti.

122

80 pav. KSSR panaudojimas kryptingiems DNR persitvarkymams sukelti. Cre ir FLP rekombinazs; lox ir FRT j atpastami rekombinacijos saitai; luc ir -gal reporteriniai luciferazs ir
-galaktozidazs genai. TK-neor timidino kinazs ir neomicino fosfotransferazs genai
ie rekombinacijos procesai vyksta nukleotido tikslumu, po reakcijos ilieka aktyvs saitai. Todl
kiekvienas toks procesas yra grtamas ir reakcijos produktai yra pusiausvyroje. Siekiant ukirsti keli
grtamajai reakcijai, rekombinazs geno raika perduodama indukuojamam promotoriui. Sukurta ir
daugiau bd iai problemai sprst, pavyzdiui, vienas i rekombinacijos sait terpiamas tarp rekombinazs geno ir jo promotoriaus. iuo atveju pageidaujama rekombinacija atskiria rekombinazs gen
nuo jo raik skatinani sek.
Taigi aptartos rekombinacijos sistemos, priklausomai nuo rekombinacijos sek padties, eksperimentikai leidia sukelti pageidaujamas inversijas, delecijas, terpti ar perkelti norim viet DNR
fragmentus.

3.2. Transpozicija
Transpozicijos reikinys, anksiau priskirtas sait-specifinei rekombinacijai, dabar vertinamas kaip
savitas rekombinacijos procesas, besiskiriantis nuo konservatyviosios sait-specifins rekombinacijos.
Transpozicij vykdo judrieji genomo elementai (JGE), kurie koduoja rekombinaz, vadinam transpozaze (arba integraze). Kai kurie JGE neturi io baltymo geno arba dl mutacij j yra prarad. Jeigu
toki element galins sekos nepaeistos, tai jie gali pasinaudoti svetima transpozaze (integraze), kuri
koduoja giminiki JGE, esantys trans padtyje. Vykstant transpozicijai, nesusidaro kovalentin jungtis
tarp rekombinazs ir suskaldytos DNR gal, rekombinacija ia nra reciprokin, tarp judraus genomo
elemento ir sekos taikinio nra jokios homologijos, transpozicijos metu vyksta didesn ar maesn
DNR sintez.
JGE apibrtos struktros DNR molekuls, galinios okinti i vieno lokuso kit tiek tame paiame genome, tiek tarp skirting genom. Transpozon atradimas glaudiai susijs su nestabili mu123

tacij, sukeliani margum augaluose, tyrimais. Jomis domjosi H. De Vries (1905) ir padar ivad,
kad j perdavimas palikuonims nepavaldus Mendelio dsniams. Daug nuodugniau i poymi paveldjim tyr kukurz genetikas R. A. Emersonas (Fedorof, 2000). Pigmentacijos pokyius jis aikino
inhibitoriaus, slopinanio pigmentacijos gen, veikimu bei io inhibitoriaus praradimu. Taiau pat
reikin ityr ir transpozonus atrado 19461950 m. B. McClintock kukurzuose (McClintock, 1950;
Fedorof, 2000). Ketvirtojo deimtmeio pradioje ji pradjo tyrinti chromosom trkius ir susidomjo
kukurz lokusu, esaniu netoli 9 chromosomos centromeros, ir kur pavadino Dissociation (Ds). Tok
keist pavadinim lokusui suteik todl, kad jis galdavo atskirti chromosomos trumpj pet, t.y. sukeldavo savotik chromosomos disociacij. Taiau ji greitai sitikino, kad chromosomos disociacijai reikalingas dar vienas lokusas, kur pavadino Activator (Ac). 1948 m. ji galutinai sitikino, kad Ds
keiia savo padt chromosomoje. Ryys tarp Ds transpozicijos ir grd margumo paaikjo, kai
McClintock pradjo tirti C lokuso, atsakingo u grd pigmentacij, paveldjim palikuoni kartose.
Naudodama citologinius ir genetinius metodus, ji nustat, kad nestabilaus c-m1 alelio atsiradimas sutampa su Ds transpozicija i ankstesns jo vietos nauj viet C lokuse. Reversija atsirasdavo, kai Ds
inykdavo i lokuso. Ji padar ivad, kad margumas atsiranda dl danos Ds transpozicijos augalo
raidos metu. Atradus transpozicijos reikin, patvirtinti ir Emersono bei Rhoades stebjimai. 1983 m.
u iuos darbus B. McClintock gavo Nobelio premij. Prokariotuose JGE buvo atrasti 1963 m., kai L.
Taylor apra prokariot element, galint sukelti mutacijas, todl pavadint Mu (Mutator). Kaip ir ,
Mu lizogenizuoja E. coli lsteles, taiau skirtingai nuo neturi att saito bakterijos chromosomoje. Dl
ios prieasties Mu siterpia eimininko genom beveik atsitiktinai ir sukelia mutacijas. Nustatyta,
kad apie 12 proc. Mu lizogenizuot lsteli turjo auksotrofines mutacijas. 1970 m. pradioje atrasti
transpozonai. Taip jie buvo pavadinti dl gebjimo perneti (lot. transpositio perneimas) poym
(pavyzdiui, atsparum antibiotikams) i vieno lokuso kit. JGE labai skiriasi savo struktra, sudaryti
i DNR ir RNR. Danai naudojamas transpozon skirstymas dvi klases: pirmosos klass transpozonai
plinta dl savo genomo RNR kopij, kurios atvirktins transkripcijos metu paveriamos cDNR. iuos
elementus dar galima grupuoti :
1. Retrovirusus.
2. Retrotranspozonus.
3. Retropozonus (LINEs ir SINEs).
Antrosos klass transpozonai neturi RNR stadijos. Jie vadinami paprasiausiai transpozonais.
Pastarasis JGE skirstymas yra patogus, taiau toli grau neatspindi egzistuojanios vairovs. Dl
to dar naudinga susipainti su N. Kleckner pasilyta klasifikacija, kuria remiantis prokariot ir eukariot elementai skirstomi keturias grupes.

124

3.2.1. Prokariot JGE klasifikacija ir struktra

Pirma klas. Priklauso terptins sekos (IS) ir i j sudaryti sudtiniai transpozonai. terptins sekos yra ~ 700 1500 bp. Savo galuose turi invertuotas sekas ir bent vien gen, koduojant transpozicijai reikaling baltym transpozaz. IS element inoma daugiau nei 17 eim, kuriose yra per 500
JGE. Sudtiniai transpozonai sudaryti i dviej IS ir tarp j esani gen, todl jie yra didesni 5 10
kbp. Aktyvi transpozaz koduoja vienas i IS (81 pav.).
A

Transpozazs genas
10-30bp

10-30bp

700-1500bp

Transpozazs
genas

Atsparumo antibiotikams genai

IS elementas

IS elementas
5-10Kbp

81 pav. A IS elemento sandaros schema; B sudtinio transpozono sandaros schema

Antra klas. Jai priklauso Tn3 ir jam giminiki transpozonai. Skirtingai nuo sudtini transpozon
ie patys koduoja savo transpozaz ir kitas savybes (82 pav.). Savo galuose ie JGE turi invertuotas
pasikartojanias sekas. Tn3 turi tris genus: transpozazs, rezolvazs ir -laktamazs.

82 pav. Tn3 giminik transpozon struktros schema

Treia klas. iai JGE grupei priskiriami okinjantys bakteriofagai (Mu, D108). Mu yra didelis, DNR turintis virusas, sudarytas i briaunainio pavidalo galvuts, spiralins struktros uodegos ir
ei uodegos fibrili (83 pav.). Lizogeninje bsenoje fagas atsitiktinai siterpia bakterijos genom
konservatyviosios transpozicijos bdu (r. toliau). Lizs metu jis vykdo replikacin transpozicij.

83 pav. Bakteriofagas Mu www.biochem.wisc.edu/.../inman/empics/virus.htm

125

JGE paplit visose gyvose btybse ir nuo j didele dalimi priklauso i organizm genomo plastikumas. Mu struktra gana sudtinga, nes jis, be transpozazs geno, turi daug kit gen, utikrinani jo, kaip bakteriofago, egzistavim (84 pav.).
Lizs
genai

Represorius

G-segmentas

Galvuts ir uodegos genai

Integracijos
replikacijos
genai
eimininko
DNR

eimininko
Kintamas DNR
galas

lys

c AB

S U U S

Transpozazs
genai

84 pav. Bakteriofago Mu genetins organizacijos schema. G segmentas, priklausomai nuo savo

orientacijos, lemia bakteriofago uodegos fibrili sandar ir eiminink vairov
Ketvirta klas. Jai priskiriami JGE, nepatenkantys anksiau ivardytas klases. Jie labai skiriasi
tarpusavyje ir todl jiems reikalinga atskira klasifikacija. Gerai itirtas Tn7 transpozonas. Jis koduoja
penkis transpozicijai reikalingus baltymus: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD, TnsE dl i baltym transpozicija vyksta dvejopai, skiriasi transpozono siterpimo vietos. Esant TnsD, Tn7 siterpia chromosomoje esant attTn7 sait, o esant TnsE tam tikr plazmidi replikonus. TnsC baltymas yra transpozicijos reguliatorius: jis, sveikaudamas su TnsA ir TnsB, aktyvuoja transpozaz ir labai svarbus siterpimo vietai parinkti. TnsA ir TnsB tiesiogiai dalyvauja skaldant ir sujungiant DNR. TnsB turi panaumo
su retrovirus integrazmis, o TnsA yra giminikas restrikcijos endonukleazms.
3.2.2. Eukariot judrieji genomo elementai
Juos taip pat siloma skirstyti keturias klases. Be to, ie elementai gali bti autonominiai ir neautonominiai. Pastarieji gali keisti savo viet tik tada, kai yra autonominis (aktyvus) elementas in trans.
Autonominio elemento koduojama transpozaz atpasta neautonominio elemento galus ir inicijuoja
transpozicij.
Pirmai klasei priklauso transpozonai, pavyzdiui, kukurz Ac ir jo defektyvus darinys Ds (85
pav.), vaisins musels P elementas ir kt. J struktra ir transpozicijos mechanizmas panaus prokariot transpozon. iai klasei priklauso gausi Tc1/Mariner eima: Tc1 ir Tc3 yra C. elegans, o Mariner
D. melanogaster transpozonai.

126

4563 bp

(a)

Transpozaz
11 bp invertuotos galins sekos

(b)

85 pav. A autonominio Ac elemento schema; B neautonominio (defektyvaus) elemento Ds

schema
Antrai klasei priskiriami retrotranspozonai. ie elementai savo genetine struktra, transpozicijos
mechanizmu labai panas retrovirusus (86 pav.). Gerai itirti mieli Ty, vaisins musels Copia retrotranspozonai.

86 pav. Retrotranspozon ir retrovirus struktros palyginimas. Rodyklmis staiakampyje paymtos ilgos galins pasikartojanios sekos (angl. long terminal repeats, LTR). Gag koduoja kapsids baltym; PR proteazs genas; IN integrazs genas; RT koduoja atvirktin transkriptaz
ir RNaz H
Retrovirusai nuo kit retroelement skiriasi tuo, kad savo genome turi env gen (86 pav.). io geno koduojamas baltymas leidia ukrsti retrovirusais eimininko lsteles.
Treiai klasei priklauso LTR neturintys retrotranspozonai, dar vadinami retropozonais. Kaip ir retrotranspozonai jie turi RNR faz, taiau nepanas retrovirusus. iai JGE grupei priklauso induoli
LINE ir SINE elementai, vaisins musels I faktorius.
Ketvirtai klasei priskiriami FB (angl. foldback) elementai. iuose labai savitos struktros dariniuose yra daug ilg invertuot pasikartojani sek (87 pav.). Pirmiausia jie buvo atrasti vaisinje
muselje (Potter ir kt., 1980). Tai i atskir moduli sudaryt transpozon grup. FB elementai (FBE)
link gausiai sudaryti antrines struktras. Galini invertuot sek ilgis labai vairus: nuo keli imt
bazi por iki keli kilobazi. Kai kurie FBE sudaryti tik i ilg invertuot sek. Taiau kituose FBE
tarp i sek yra vidurinis rajonas, kuriame siterp ASR (Daskalova ir kt., 2005). Pavyzdiui, Arabidopsis FBE FARE2 koduoja tris baltymus, vienas i kuri giminikas kukurz transpozono MuDR
transpozazei. Vis dlto daugelio FBE transpozicija priklauso nuo kit JGE transpozazi. FBE plaiai
paplit eukariot genomuose. Transpozicijos mechanizmas nepakankamai itirtas, bet RNR stadijos
tikriausiai neturi.
127

87 pav. FB element struktra: M vidurinis rajonas; IR ilgos invertuotos galins sekos, sudarytos i moduli: labiausiai nutolusio krato domeno (IR-FD); iorinio domeno (IR-OD); vidinio
domeno (IR-ID). Balti trikampiai sekos-taikinio duplikacijos, atsiradusios FB elemento siterpimo metu (pagal Casals ir kt., 2005)
3.2.3. JGE sekos-taikinio ypatybs
Transpozonai siterpia nehomologikas jiems sekas. Specifikumas sekos-taikinio atvilgiu labai
skiriasi. Kai kurie JGE daniausiai siterpia tik tam tikrus saitus, kiti nra tokie iranks. Dabar manoma, kad sijungimas nra visikai atsitiktinis (Craig, 1997). Yra du pagrindiniai integracijos viet
pasirinkimo bdai. Vienas i j priklauso nuo tiesiogins rekombinazs (transpozazs ar integrazs)
sveikos su seka-taikiniu. Antras nuo rekombinazs ir papildom baltym, kuriuos gali koduoti tiek
JGE, tiek eimininkas, sveikos. Abiem atvejais svarbi ir DNR taka. Pavyzdiui, fagas Mu links integruotis mao specifikumo sek N-Y-G/C-R-N. Bakterij transpozonas Tn5 beveik nepasiymi
specifikumu, kuris priklauso nuo rekombinacijos saito, todl patogus naudoti inercinje mutagenezje. Kai kurie JGE nesiintegruoja transkribuojamus genomo rajonus. Kai kurie transpozonai turi kartus rekombinacijos saitus. Pavyzdiui, IS10/Tn10 link okinti vietas, kuri tokia seka: 5NGCTNGACN-3. Rekombinacijos saito pasirinkimas laiko atvilgiu priklauso nuo transpozicijos sistemos ir gali vykti vairiose rekombinacijos stadijose. Pavyzdiui, Tn7 nepalieka savo buvimo vietos
iki neidentifikuoja attTn7 saito, kur daniausiai integruojasi. io saito atpainimui reikia nukleoproteininio komplekso, kur eina rekombinacijos baltymai ir substratin DNR (transpozono galai ir seka-taikinys). IS10/Tn10 sistemoje rekombinacijos saito atpainimas nevyksta tol, kol elementas nepalieka savo buvimo vietos. JGE atpasta arba tam tikras sekas, arba specifin DNR erdvin struktr,
daniausiai ilenkt DNR. S. cerevisae Ty3 elementas integruojasi RNR polimerazs III transkribuojam gen promotorius, o jam giminikas Ty5 heterochromatino sritis.
Tiriant JGE rekombinacij su eimininko DNR, nustatyta, kad seka, kuri siterpia JGE, yra padvigubjusi ir supa integruot element i abiej pusi (Grindley, 1978). Padvigubjim sukelia tai,
kad, JGE siterpdamas eimininko DNR, skaldo j ne tiksliai toje paioje vietoje, o su keleto nukleotid poslinkiu (88 pav.). Ityrus nemaai transpozon siterpimo viet, nustatyta, kad daniausiai duplikacija bna 5 ar 9 bp dydio. Vis dlto yra tam tikr iimi. Pavyzdiui, Tc1/Mariner eimos elementai atpasta TA dinukleotidus ir, siterpdami j, sukelia 2bp TA duplikacij.

128

88 pav. Sekos-taikinio duplikacija transpozicins rekombinacijos metu

Prie kai kuri bakterij transpozonus (Tn3 eimos, bakteriofago Mu, Tn7) pasireikia savitas
imunitetas, nes ie JGE negeba sijungti DNR rajonus, kurie jau turi vien transpozono kopij. Taiau
in cis potencialiam transpozicijos saitui, jau turiniam transpozon, toks imunitetas ribotas. Tiriant Tn7
transpozicijos imunitet E. coli chromosomoje, nustatyta, kad atsparumas prie naujos transpozono
kopijos sijungim siekia apie 190 kbp. Mu atveju is poveikis ilieka 20 kbp atstumu. io reikinio
molekulin prigimtis geriausiai itirta Mu sistemoje. Mu transpozicijoje dalyvauja du baltymai: MuA
transpozaz atpasta elemento galus ir prie j jungiasi, vykdo DNR skaldym ir sujungim su recipiento DNR ir MuB baltymas, priklausomas nuo ATP, sveikauja su DNR ir aktyvuoja transpozaz.
DNR saitas, prie kurio prisijungs MuB, yra vieta, prie kurios pirmiausiai jungiasi MuA. Imunitetas
transpozicijai pasireikia tuo, kad MuB paalinamas nuo potenciali sek-taikini, greta kuri jau yra
siterps fagas Mu. iuo atveju MuA, prisijungs prie Mu gal atspariame transpozicijai saite, veikia
kaip savotika luota, kuri paalina i tos vietos MuB. Taigi didesnis kiekis MuA, prisijungusi prie
DNR, maina tose vietose prisijungusi MuB koncentracij ir tokios sekos tampa netinkamomis naujo
JGE siterpimui.
3.2.4. Transpozicijos mechanizmai
Transpozicija vyksta transpozazei endonukleolitikai skaldant fosfodiesterines jungtis JGE galuose ir prijungiant iuos galus prie taikinio DNR. iai rekombinacijos reakcijai reikalingas sudtingas
nukleoproteininis kompleksas. Jis dar vadinamas transpozosoma, kuri paprasiausiu atveju sudaryta i
rekombinazs, transpozono gal ir taikinio DNR. Sudtingesniais atvejais dalyvauja ir papildomi baltymai. Pagal transpozicijos mechanizm ir galutin rezultat j bt galima skirstyti replikatyvij ir
nereplikatyvij. Replikatyviosios transpozicijos metu viena transpozono kopija lieka senoje vietoje, o
129

kita peroka nauj. iuo atveju skaldoma tik viena DNR grandin i abiej transpozono gal. Todl
transpozonas nepalieka donorinio saito (89 pav.). Jo laisvi 3-OH galai, susidar dl transpozazs sukelt viengrandi trki, perneami ant sekos-taikinio, kur sukelia viengrandius trkius ir vykdo
transesterifikacijos reakcij. Taip susidaro replikacijos akuts, nukreiptos viena prie kit. Replikacijos metu padauginamas JGE. Jeigu transpozicija vyksta tarp skirting molekuli, tai susidaro j bendras darinys, vadinamas kointegratu (89 pav.). Kointegratas yra laikinas DNR darinys, kuris suskaldomas atskiriant vien nuo kito replikonus, turinius po JGE kopij. Kointegratas gali bti suskaldytas
homologins arba konservatyviosios sait-specifins rekombinacijos bdu. Pavyzdiui, transpozonas
Tn3 turi res saitus, kuriuose jo koduojamas TnpR baltymas, vykdo sait-specifin rekombinacij ir atskiria vien nuo kito kointegrat sudariusius replikonus. Kointegrato susidarymo reakcija buvo itirta
panaudojant fag Mu. io tipo transpozicija vienos molekuls viduje sukelia inversijas ir delecijas.
Replikatyvioji transpozicija bdinga Tn3, Tn1000 (), Mu (lizs metu), IS6 ir kt.

89 pav. Replikatyviosios transpozicijos modelis (angl. copy and paste) ir kointegrato susidarymas
(paaikinimas tekste) (pagal Haren ir kt., 1999)
Nereplikatyviosios transpozicijos metu JGE ikerpamas i donoro molekuls ir siterpia nauj
viet, transpozicijos metu elementas nereplikuojamas. Pavyzdiui, taip vyksta fago Mu nereplikatyvioji transpozicija (90 pav.). i transpozicija gali vykti ir kitaip. JGE galuose sukeliami dvigrandiai trkiai, o sekoje-taikinyje viengrandiai, transpozonas visikai atskiriamas nuo donoro saito. Toks mechanizmas danai vadinamas anglikai cut and paste, transpozono isikirpimas donoro molekulje
130

sukelia dvigrand trk, kuris gali bti letalus, jeigu jo neitaisys reparacins sistemos. Tn10 ir Tn5,
isikirpdami i donoro saito, savo galuose sudaro segtuk pavidalo struktras (91 pav.). Nereplikatyvioji transpozicija gali vykti dalyvaujant ir P elementui, Tn7, IS10, Ac ir kt.

90 pav. Fago Mu nereplikatyviosios transpozicijos schema

Viengrandiai trkiai
JGE galuose
3'OH

3'OH

Segtuko susidarymas

Segtuko suskaldymas
3'OH

3'OH

Sujungimas su sekataikiniu

91 pav. JGE (Tn10, IS10, Tn5 ir kt.), sudarani laikin segtuko struktr, transpozicijos modelis
131

3.2.5. Alternatyvs transpozicijos bdai

Transkripcijos panaudojimas. LTR elementai (retrotranspozonai, retrovirusai) tiesiogiai nedalyvauja transpozicijoje. Dl to panaudojama j RNR kopija, kuri susidaro nuo genome esanios elemento DNR, transkripcijos metu (92 pav.). Atvirktin transkriptaz susintetina cDNR nuo RNR. Daniausiai cDNR yra 2 bp ilgesn u integruot genom LTR elemento kopij. Rekombinacijos metu integraz paalina iuos papildomus nukleotidus, o likusi cDNR siterpia sek-taikin. Retropozonai, LTR
neturintys retroelementai, okinja dar kitaip. Jie tiesiogiai dalyvauja transpozicijos procese. i JGE
mRNR transliacija vyksta citoplazmoje ir susidaro vienas arba du baltymai. Vienas i j yra daugiafunkcinis, atlieka nukleazs ir atvirktins transkriptazs funkcijas. Manoma, kad is baltymas jungiasi
prie RNR ir susidaro ribonukleoproteininis (RNP) kompleksas, kuris patenka branduol. Ten RNP
sveikauja su seka-taikiniu, kuriame endonukleaz sukelia viengrand trk (93 pav.). Po to vyksta atvirktin transkripcija, kurioje pradmuo yra taikinio sekos 3-OH galas, kuris komplementariai prisijungia prie elemento 3gale esanios poly(A) sekos (Boeke, 2003). Neisiaikinta, kas sukelia antrj
trk kitoje grandinje. Kaip kitas galas siterpia nauj viet, irgi tiksliai neinoma.

92 pav. LRT element transpozicija. Vingiuota linija pavaizduota RNR, tiesia DNR molekuls
(pagal Boeke, 2003)

132

AA

A
AA

AA

AA

AA

O
H

AA

A
AA

AA

A
AA

AA

93 pav. Retropozon transpozicija. Vingiuota linija RNR, tiesi DNR molekuls (pagal Boeke,
2003)
3.2.6. Transpozicijos reakcija
Transpozicijos sistem (Mu, Tn3, HIV, P, IS eima, IS4 eima, Tc/Mariner) in vitro sukrimas
padjo nustatyti svarbiausius ios rekombinacijos etapus (Haren ir kt., 1999). Paaikjo, kad visais atvejais transpozicijos metu vykstani DNR grandini skaldymo ir sujungimo reakcijos labai panaios tai transpozazs arba integrazs katalizuojama DNR fosfodiesterins jungties hidroliz ir po to
vykstanti transesterifikacijos reakcija. N vienai i j nereikia iorini energijos altini. Transpozicijos reakcij galima suskirstyti tris stadijas: 1) transpozono atskyrimas nuo donoro DNR dl viengrandi ar dvigrandi trki jo galuose; 2) transpozono gal perneimas ant sekos-taikinio; 3) rekombinacij patyrusi sek subrandinimas.
3.2.6.1. Transpozono atskyrimas nuo donoro DNR
Kai kuri JGE (Mu, retrovirus, IS3 eimos element) transpozazs katalizuoja viengrandius trkius abiejuose galuose, dl to susidaro laisvi 3-OH galai. Retrovirusuose ios reakcijos metu atskeliami du nukleotidai nuo 3galo dvigrandje cDNR ir todl joje susidaro 5 viengrandiai galai. Jei
transpozicijos metu JGE i karto visikai atsiskiria nuo donoro DNR, tai turi bti skaldoma ir komplementari DNR grandin. Jeigu 3-OH galai susidaro visuose JGE, tai komplementari grandin skaldoma
gana retai ir gana vairiai, pavyzdiui, Tc/Mariner eimos ar P elemento transpozicijos metu komple133

mentarios grandins skaldymas vyksta transpozone keleto nukleotid nuo galo atstumu (2 nt - Tc1/3; 3
nt Mariner; 17 nt P elemente). Taip susidaro laisvas elementas, kuris turi atitinkamo ilgio viengrandius 3-OH galus.
Kai kuriuose elementuose (IS10, Tn10, Tn5) ie trkiai nra analogiki. 5galo juose skaldymas
vyksta tik susidarius laisvam 3galui. ioje padtyje esanti OH grup kaip nukleofilas, atakuoja antrj grandin. Todl transpozono galuose susidaro segtuko pavidalo struktros (94 pav.), kurios hidrolizuojamos ir susidaro laisvi 3-OH ir 5 fosfato galai.

94 pav. DNR molekuls antrosios grandins skaldymas ir segtuko susidarymas transpozicijos

metu. DNR pirmosios grandins skaldymas ir 3-OH galo susidarymas bei vliau segtuko skaldymas vyksta dalyvaujant vandens molekulei ir transpozazei
Tai panau V(D)J rekombinacijos mechanizm (r. 4.4. skirsn). Panaiai okinja Ac, Tam3,
hobo, Ascot-1.
Yra ir daugiau antrosios grandins skaldymo variant. Tn7 transpozaz sudaryta i dviej polipeptid TnsA ir TnsB, kuri kiekvienas skirtas skirtingoms DNR spirals grandinms skaldyti.
3.2.6.2. Grandins perneimo reakcija
Transpozono 3galai, susidar po trkio, perneami ant taikinio DNR. Kaip ir hidroliz i reakcij
vykdo transpozaz arba integraz. ie baltymai katalizuoja nukleofilin sekos-taikinio atak, kurioje
kaip nukleofilas veikia 3-OH grups, esanios transpozono galuose (95 pav.). Kadangi iam procesui
vykti nereikalingas iorinis energijos altinis, manoma, kad panaudojama sekos-taikinio fosfodiesterins jungties energija.

134

95 pav. Transpozono galuose esanios 3-OH grups nukleofilikai sveikauja su taikinio DNR seka.
Kaip minta, dl transpozicijos sukeliamo DNR molekuli skaldymo ir sujungimo pobdio siterpus element i abiej pusi supa sekos-taikinio duplikacijos. io vyksmo metu atsiradusius tarpus
DNR molekulje paalina eimininko reparacijos/replikacijos baltymai. Kadangi JGE transpozazi ir
integrazi vykdomos reakcijos panaios, tai ir i baltym struktra turi bti labai panai.
3.2.7. Transpozicijos baltym savybs
Transpozazs ir integrazs daug funkcij atliekantys baltymai. Jie turi atpainti JGE galus, juos
suartinti sineptoneminiame komplekse, atpainti skaldomas fosfodiesterines jungtis, vykdyti grandins
perneim, po to atlaisvinti viet eimininko baltymams, kurie itaiso DNR paaidas rekombinacijos
vietoje. Svarbus i baltym bruoas tas, kad sekos atpainimo ir katalizinis domenai lokalizuoti skirtingose to paties polipeptido vietose arba net skirtinguose daugiakomponenio komplekso polipeptiduose. Vis dlto bendras funkcinis organizacijos principas yra aikus: specifikas DNR sek atpainimo domenas daniausiai lokalizuotas transpozazi N galuose, o katalizinis domenas su svarbi DDE
aminorgi liekanomis daniausiai ariau C galo. DNR atpastama tada, kai identifikuojami elemento galai, esantys greta donoro DNR, kai susidaro transpozosoma, kai atitinka transpozono DNR ir
transpozazs katalizin kien. iame procese labai svarbi transpozono gal struktra. Daugelio
transpozon galai sudaryti i dviej funkcini rajon. Toliau nuo galo esantis vidinis rajonas utikrina
specifin sekoms transpozazs prisitvirtinim. Kitas rajonas atitinka 24 galines bp, kurios btinos
skaldyti DNR ir grandinei perneti. is rajonas giminikuose transpozonuose gana konservatyvus. Labai danai transpozon galuose randamas CA-3 dinukleotidas. Jis randamas Mu, Tn7, IS30, Tn552,
IS3 eimos element, retrovirus genomuose. eimininko baltymai taip pat jungiasi prie transpozono
gal. ie baltymai daro tak transpozosomos susidarymui, nes veikia transpozazs geno raik ir
transpozicijos aktyvum.
Transpozazi atpainimo ir katalizinis domenai yra skirtingose baltymo vietose, tai, galbt padeda
baltymui ilikti lanksiam. i savyb reikalinga transpozazei N galu sveikaujant su vidiniu transpozono galo atpainimo rajonu ir kataliziniu domenu su ioriniu atpainimo rajonu. Atpainimo domene
transpozazs turi spiral-poskis-spiral (angl. helix-turn-helix, HTH) motyv, kuriuo jungiasi prie
DNR (96 pav.). is domenas labai paprastas vienuose JGE, pavyzdiui, IS transpozazi, o kituose su135

darytas i dviej dali, pavyzdiui, Mu, Ac, Tc transpozazi ir gali atpainti skirtingas DNR sekas. Pavyzdiui, MuA baltyme u tai atsakingi du greta esantys subdomenai 1 ir 1. Mutacijos fago Mu rajone, kuris koduoja iuos subdomenus, panaikina arba susilpnina MuA gebjim atpainti elemento
galus. Abu subdomenai turi HTH motyv ir kiekvienas atpasta pus sekos, prie kurios jungiasi.

96 pav. vairi transpozon transpozazi struktra. Tikri arba galimi spiral-poskis-spiral

(HTH) motyvai (pavaizduoti tamsiai pilka spalva). Katalizinio domeno konservatyvioji dalis, turinti DDE motyv, nuspalvinta viesiai pilkai. Skaiiai rodo baltym sudarani aminorgi
skaii (pagal Haren ir kt., 1999)
Integrazi sveika su DNR iek tiek skiriasi nuo transpozazi sveikos su DNR. Integrazs neturi
specifinio prisijungimo prie DNR. J N gale esantis HLH motyvas, atrodo, dalyvauja ne atpainimo, o
baltym multimerizacijos procese. is skirtumas galbt atspindi transpozon ir retroelement biologijos skirtumus. DNR sekos, su kuriomis sveikauja integrazs, yra nukleoproteininje dalelje greta paties fermento, o transpozazs turi atpainti transpozono galus ir jungtis prie j, kai JGE jau siterps
eimininko DNR. Be to, virusi DNR gal atpainim gali palengvinti ir tai, kad jie yra fiziniai DNR
molekuls galai.
Transpozazi ir integrazi struktros tyrimai atskleid konservatyvius i baltym rajonus, kuri
centre yra DDE motyvas ir keletas papildom gana konservatyvi aminorgi (ypa K ir R) liekan
(97 pav.). ie konservatyvs rajonai buvo pavadinti N2, N3 ir C1. Pagrindinis ios triados vaidmuo
sujungti dvivalenius katijonus, reikalingus katalizs reakcijai. DDE motyvo svarba buvo rodyta mutagenezs eksperimentais. Mutacijos, kurios paeisdavo integrazi genus, kliud cDNR gal subrandinimui ir sujungimui. Tai rodo, kad DDE eina katalizin centr. Nors mutagenezs eksperiment su
transpozazmis atlikta maiau nei su integrazmis, jie taip pat patvirtino DDE motyvo svarb transpozicijos katalizje. Svarbus vaidmuo transpozicijos reakcijoje tenka ir dvivaleni metal (Mg2+, Mn2+,
Ca2+, Zn2+, Co2+) jonams. Jie veikia kaip kofaktoriai ir dalyvauja susidarant transpozosomai. Ypa
svarbs Mg2+ jonai, su kuriais sveikauja DDE motyvas (Mitzuuchi, 1992).
136

HIV-1 (IN)

wql

64
D

cth

(51)

wht

116
D

ngsnf

(35)

ynpqsQgvi

152
E

snNKel

Mu (MuA)

ing

269
D

gyl

(66)

iti

336
D

ntrga

(55)

kgwggaKpv

392
E

rafgvg

Tn7 (TnsA)

(hgk

28
D

yip)

(85)

mst

114
D

flvdc

(34)

ertleKlel

149
E

rrywqq

Tn7 (TnsB)

yei

273
D

ati

(87)

lla

361
D

rgelm

(34)

rrfdaKgiv

396
E

stfRtl

Tn3

asa

689
D

gmr

(75)

imt

765
D

tagas

(129)

riltqlNrg

895
E

srHava

Tc1

iws

86
D

esk

(90)

fqq

177
D

ndpkh

(108)

sqspdlNpi

286
E

hmweele

N2

N3

C1

97 pav. Transpozazi ir integrazi DDE motyvai. N2, N3 ir C1 - konservatyvs rajonai (pagal Haren ir kt., 1999)
Dar viena svarbi eukariot ir prokariot JGE transpozazi savyb jungimasis kompleksus
(multimerizacija). Tai svarbu sinapsiniam kompleksui susidaryti, protomerams katalizs metu sveikauti, transpozazs aktyvum valdyti. Susidarant transpozosomai, dalyvauja nevienodas rekombinazs
subvienet skaiius. Pavyzdiui, Tn5 transpozicijos metu kompleks eina du transpozazs subvienetai, o Mu transpozaz ir retrovirus integrazs sveikauja su DNR kaip tetramerai.
3.2.8. Retrotranspozonai ir retropozonai
3.2.8.1. Mieli Ty retrotranspozonai
Ty (angl. transposon yeast) elementai tai pasikartojanios DNR sekos, paplitusios mieli genome. J transpozicijos danis maesnis nei daugelio bakterij transpozon: ~ 10-7-10-8. Nors atskir Ty
element sandara gana skirtinga, juos galima grupuoti dvi klases: Ty1 ir Ty917. Ty elemento dydis
yra apie 6,3 kbp. Retrotranspozonas, siterps mieli genom, sukelia 5 bp dydio sekos taikinio duplikacijas. Elementas savo galuose turi vienakryptes pasikartojanias sekas (delta), kurios yra 330 bp
ilgio (98 pav.). Pavieniai Ty elementai skiriasi nuo bendr vienos ar kitos klass poymi, nes turi delecij, intarp ir kit mutacij. Mieli genome yra apie 30 Ty1 kopij ir madaug eios Ty917 kopijos. Be to, elementai gali egzistuoti ir pavieniui. Tada jie vadinami solo, s. i sek mieli genome
yra apie 100. Ty elementas transkribuojamas dvejopai, dl to susidaro dviej ri poli(A)+RNR, kuri
labai gausu mieli lstelse (apie 5 proc. visos mRNR). i Ty mRNR transkripcija prasideda nuo
promotoriaus, esanio kairiajame elemente. Vienos ries transkripto ilgis yra 5 kbp, antros 5,7 kbp
(99 pav.). Abiem atvejais transkripcija prasideda nuo retrotranspozono kairje pusje esanio elemento, o ilgesniojo pasibaigia deiniajame elemente.

137

98

pav.

Mieli

S.

cerevisiae

Ty

retrotranspozono

sandara.

LTR

elementas.

http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol/11 proc.20Yeast proc.20Retrotransposons.pdf

99 pav. Ty transkripcija. 5,7 kbp transkripto susidarymas

Ty yra du ASR, kurie nuskaitomi ta paia kryptimi ir neymiai persidengia. TyA koduoja DNR suriant baltym. TyB seka turi sritis, homologikas retrovirus atvirktinei transkriptazei, proteazei ir
integrazei. ie ASR savo sandara ir savybmis analogiki retrovirus gag ir pol genams. Rekombinacija vyksta ir tarp Ty element j aktyvios transpozicijos metu. Mieli genome tarp viena kryptimi
orientuot Ty element gali vykti geno konversija, kurios metu vieno elemento seka paveriama kito
seka. Ty retrotranspozonai gali isikirpti i genomo dl rekombinacijos tarp galini sek. Todl gana
daug s pavieni kopij genome galbt ir yra ios homologins rekombinacijos rezultatas.
Ty kaip ir retrovirusai okinja per RNR kopij. Nors jie nesuformuoja infekcini daleli, taiau
lstelse, kuriose buvo aktyvuota transpozicija, kaupiasi virusus panaios dalels (VPD) (100 pav.).
Jose yra visa Ty RNR kopija, proteaz, atvirktins transkriptazs aktyvum turintis baltymas ir integraz.

100 pav. VPD, kuri sudaro Ty retrotranspozonas, sandara: Ty RNR (juoda kreiv) naudojama kaip matrica dgDNR sintezei. http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol/11 proc.20Yeast

proc.20Retrotransposons.pdf
TyA koduoja polipeptid, kuris skaldomas ir suformuoja virus panaios dalels apvalkal. Galima teigti, kad Ty retrotranspozonai veikia kaip retrovirusai, kurie prarado env gen, todl negali taisyklingai savo genomo patalpinti dalelje. Mieli genome daugelis Ty neaktyvs, nes prarado gebjim keisti savo viet.

138

3.2.8.2. Vaisins musels (D. melanogaster) copia retrotranspozonai

Vaisinje muselje labiausiai paplit JGE copia retrotranspozonai, FB eimos ir P elementai.
Copia eima taip pavadinti dl didelio skaiiaus labai panai sek, nuo kuri nuskaitoma mRNR. i
element kopij skaiius (2060) priklauso nuo musels kamieno. Sekos ibarstytos po genom. Copia
retrotranspozono dydis madaug yra 5000 bp. Jo galuose esani vienakrypi pasikartojani sek
ilgis 276 bp. Kiekviena tokia seka turi invertuotas sekas galuose. Copia turi vien ASR, nuo kurio susidaro 4227 bp ilgio transkriptas. ASR seka panai retrovirus gag ir pol sekas. Taiau ie elementai
negali suformuoti virusus panai daleli.
3.2.8.3. mogaus retrotranspozonai
Daugiau kaip 45 proc. mogaus genomo sudaro JGE (Batzer ir Deininger, 2002), i kuri 32 proc.
genome sudaro LTR neturintys retrotranspozonai, dar vadinami retropozonais tai pasikartojanios
sekos, kurios plinta atvirktins transkripcijos bdu ir skirtingai nei retrotranspozonai ar retrovirusai
neturi ilg galini sek (LTR). J dalis kai kuri eukariot genomuose sudaro net 50 proc. Retropozonai skirstomi dvi grupes: ilgus LINE (angl. long interspersed elements) ir trumpus SINE (angl.
short interspersed elements). LINE elementams priskiriamos sekos, didesns nei 500 bp, SINE maesns nei 500 bp. LINE elementai skirtingai nei SINE, gali turti ASR, kurie koduoja baltymus, reikalingus transpozicijai.
induoli genomuose daniausiai aptinkami LINE retropozonai L1. Jie sudaro apie 17 proc.
mogaus DNR (Ostertag ir Kazazian, 2001). Viso L1 elemento dydis apie 6500 bp. Taiau induoliuose daugelis i element yra neaktyvs, nes gali bti prarad 5gal arba patyr kitas mutacijas. I
mogaus genome esani 520 000 L1 retropozon tik 30005000 turi vis sek. i element genome
yra 5 netransliuojamas rajonas (UTR), kuriame yra vidinis promotorius, du ASR ir 3 UTR galas, usibaigiantis AATAAA poliadenilinimo signalu bei poliA uodega. Retrotranspozicija, kurios metu elemento kopija siterpia nauj genomo viet, vyksta keliais etapais: transkripcijos, RNR subrandinimo
(procesingo), mRNR eksporto citoplazm, transliacijos, potransliacins modifikacijos ir RNP susidarymo, sugrimo branduol, jame vykstanios atvirktins transkripcijos ir sijungimo genom (101
pav.). L1 transkripcij, matyt, vykdo RNR polimeraz II. Jos susintetinti transkriptai tradicikai yra
modifikuojami: paalinami intronai, prijungiama poliA ir 7-metilguanozino kepur. L1 turi poliadenilinimo signal, dl kurio tikriausiai i modifikacija vykdoma. Taiau L1 ASR neturi intron, prie
transkript neprijungiama metilguanozino kepur. L1 mRNR yra nebdinga induoli lstelms, nes
yra bicistronin. J transliacijos mechanizmo detals dar nelabai aikios. ASR1 koduoja baltym, kuris
sveikauja su RNR ir turi aperono savybi. ASR2 koduoja apie 150 kDa baltym, turint tris konservatyvius domenus: N gale endonukleazs, centre atvirktins transkriptazs ir daug cisteino turtint
domen. L1 nukleaz skaldo DNR, kurios apytiksl seka AA/TTTT. Skaldymo vietos pasirinkim
veikia ir saito chromatino struktra. Atvirktin transkripcija pradmeniu naudoja taikinio sekos gal
139

(angl. target primes reverse transcription, TPRT). Pirmiausia ji buvo aprayta nariuotakoj retropozone R2. Jis turi tik vien ASR, kuris koduoja baltym, pasiymint II tipo restrikcijos endonukleazs ir
AT savybmis. Manoma, kad pana mechanizm turi ir L1 elementas.
Naujas L1

Naujas Alu
L1
ORF1

ORF2

Transkripcija: subrandinimas?
An

L1 RNR

U6 sn RNR
An

TTTTT

1
RF

RF
O

RF
O

1p

OR
F2
p

1p

An

OR
F2
p

Matricos
kaita

TPRT

TPRT

An

Transliacija

RNP susidarymas
ORF1p ORF1p ORF1p

ORF2p
An
ORF2p
An

Cis pirmenyb
Alu mobilizacija

101 pav. Aktyvaus L1 elemento transkripcija ir transpozicija: RNP ribonukeoproteininis kompleksas. TPRT atvirktin transkripcija nuo taikinio sekos galo kaip pradmens.
www.igh.cnrs.fr/.../workbucheton.html

Nustatyta, kad L1 koduojami baltymai veikia daniausiai in cis (vadinamoji cis pirmumo taisykl).
iuo atveju tam tikro elemento koduojami baltymai sveikauja su juo paiu. Iimtis yra Alu, SVA
elementai ir kai kurie pseudogenai (101 pav.). J transpozicijai gali bti panaudota L1 endonukleaz ir
atvirktin transkriptaz (Ostertag ir Kazazian, 2001; Chen ir kt., 2007).
L1 retrotranspozonai, dalyvaudami vairiuose rekombinacijos vykiuose, gali sukelti mogaus ligas. Tarp genome esani L1 sek gali vykti homologin rekombinacija (102 pav.), jos gali siterpti
genus ir sutrikdyti j veikl (103 pav.). inoma ne maiau 13 mogaus lig, kurias sukl L1 intarpai
(Ostertag ir Kazazian, 2001). Daugiausia j nustatyta X chromosomoje. L1 elementai gali sukelti ir
alia esanios genetins mediagos transdukcij. Pirmiausia tai buvo nustatyta 1994 m. mogaus distrofino gene, kur siterp L1 retropozonas, kuris savo 3gale turjo daugiau kaip 500 papildom nukleotid (Holmes ir kt., 1994). L1 elementai gali perneti emiau esani gen egzonus, ir siterp naujose vietose sukurti hibridinius genus. mogaus genomo duomen bazi analiz parod, kad apie 20
140

proc. L1 intarp 3gale turi transdukuotas svetimas sekas. Kadangi retrotranspozonai gali bti nuskaitomi ir nuo aukiau j esani promotori, tai gali bti perneamos ir tos sekos, kurios yra aukiau
elemento 5galo.

102 pav. Homologin rekombinacija tarp L1 ar kit JGE gali sukelti delecijas vienoje i sveikaujani DNR molekuli

103 pav. Retrotranspozono siterpimas gen gali sukelti geno inaktyvavim arba sustiprinti jo
raik. http://newfish.mbl.edu/Course/Lectures01/PDF/voytaslecture.pdf
I SINE element mogaus genome labiausiai paplitusios Alu sekos. ie retropozonai gavo pavadinim nuo restrikcijos endonukleazs AluI, kuri skald i pasikartojani sek frakcij (Houck ir kt.,
1979). Alu sekos yra apie 300 bp dydio ir daniausiai aptinkamos gen intronuose ir 3 netransliuojamose srityse, taip pat tarpuose tarp gen. mogaus genome i retropozon yra daugiau kaip1000
000 kopij (apie 10 proc. genomo). Beveik neabejojama, kad Alu sekos kilo i 7SL RNR geno (Batzer
ir Deininger, 2002) (104 pav.). Pirmiausia, matyt, vyko io geno duplikacija, po to naujos struktros
plitimas genomuose. Alu sekas, kaip ir 7SL RNR genus, transkribuoja RNR polimeraz III. Alu transpozicijos mechanizmas panaus LINE L1 ir kit LINE element. Kadangi Alu neturi gen, tai savo
transpozicijai reikalingus baltymus pasiskolina i L1. Tik keletas Alu sek, vadinam pagrindinmis arba genais pradininkais, gali vykdyti retropozicij, t.y. gaminti savo kopijas, kurios siterpia
kitas genomo vietas. Nors yra dar neatsakyt klausim, manoma, kad pagrindins prieastys, lemianios Alu gebjim daugintis, yra ios: transkripcinis aktyvumas, specifini transkript gebjimas s141

veikauti su retropozicijos sistemos komponentais ir galbt poliA uodegos homogenikumas ir ilgis,

nuo kurio priklauso atvirktins transkripcijos pradmens susidarymas. Nors daugelis Alu sek turi vidin RNR polimerazs III promotori, taiau vien jo nepakanka transkripcijai in vivo. Dar reikalingos
tam tikros sekos, esanios u elemento rib. Taigi is reikinys labai priklauso nuo Alu genetins apsupties, nuo genomo vietos, kurioje jis yra. Netgi aktyvios Alu sekos gali greitai bti nuslopinamos,
nes jose yra 24 ar daugiau CpG dinukleotid, kuriuose danai vyksta mutacijos dl 5-metilcitozino
liekan deamininimo. Alu sekos, siterpusios nauj viet genome, metilinamas daniausiai vyksta pagal tos vietos situacij. Po to vyksta visikas elemento nuslopinimas dl mutacij, kuri metu
5-metilcitozinas virsta timinu. Be to, Alu sekos gali prarasti aktyvum ir dl mutacijos oligo(dA) uodegoje, kuri taip pat svarbi retropozicijai. Dl i prieasi daugelis Alu sek turi maas galimybes
daugintis.

7SL
EN

TTTT

Alu
A

kairysis monomeras

(A)n

(A)n

TTTT

deinysis monomeras

104 pav. 7SL RNR geno ir Alu retropozono sandara. 7SL RNR geno transkripcija vyksta nuo vidinio RNR polimerazs III promotoriaus (A) ir enhancerio (EN). Alu seka turi sudtingesn RNR
polimerzs III promotori (A + B). RNR polimerazs III vykdomos transkripcijos nutraukimas
vyksta TTTT sekoje. Alu retropozonas sudarytas i dviej dali, kurios iek tiek skiriasi. 3 segmente yra 31 bp intarpas. Pilna Alu seka dar turi 3 oligo(dA) uodeg. Alu centre yra A turtinga
sritis. siterpus element i abiej pusi supa trumpos vienakrypts pasikartojanios sekos (ali
trikampiai), kurios susidaro elemento siterpimo metu dl sekos taikinio padvigubjimo.
biol.lf1.cuni.cz/ucebnice/en/repetitive_dna.htm
Mutacijos, kurios vyksta genuose pradininkuose, perduodamos j kopijoms. Todl taip atsiranda Alu sek poeimiai (105 pav.). Pagal j pobd ir pokyi skaii galima nustatyti, kada susidar
vienas ar kitas toks poeimis. Evoliucikai senesnse Alu sek grupse toki svarbi sistematiniu poiriu mutacij yra maiau, taiau jose daugiau atsitiktini mutacij.
mogaus genome Alu sek pagausjimas vyko evoliucijos eigoje nevienodu greiiu. Didysis i
sek plitimas vyko madaug prie 40 mln. met. Nuo to laiko j retropozicijos danis sumajo bent
dviem eilmis. io reikinio prieastys aikinamos tik hipotezmis. Manoma, kad galbt mogaus genomas surado priemones apriboti i element transpozicijos dan, arba tuo, kad genome visos tinkamos siterpimo vietos jau yra uimtos. Tik mogui bdingi Alu poeimiai sudaro labai nedidel (0,5
proc.) ms genome esani Alu sek populiacijos dal. siterpusios kai kurios Alu sekos sukelia gen
mutacijas, taiau beveik visos mutacijos, kurios lieka, yra neutralios. Kai kurios Alu sekos siterp
tam tikras genomo vietas visai neseniai, todl moni genomai Alu sekomis skiriasi. Tai vadinama Alu
intarp polimorfizmu. Tokios polimorfikos sekos aptinkamos tik kai kuriose moni populiacijose
142

arba tik kai kuriose eimose. Toki Alu sek yra apie 1200. Jos lemia moni genetin polimorfizm ir
tiriamos aikinantis monijos kilms ir demografijos klausimus. Individai, kuri Alu sek polimorfizmas vienodas, yra bendros kilms. inant Alu biologijos ypatybes, tikimyb, kad moni populiacijoje
t pai genomo viet siterp nepriklausomai dvi Alu sekos, lygi 0. Dl i prieasi Alu polimorfizmo tyrimai labai populiars ir moni populiacij genetikoje.
Pirmoji Alu seka

Jo
(81)

Seniausi (J)

Jb
(81)
S
(48)

Viduriniai (S)

Sg
(31)

Jauniausi (Y)

Sc
(35)

Sx
(37)

Sp
(37)

Sq
(44)

Y
(19)

Yb8
(3)

Ya5
(4)

Ya8
(4)

105 pav. Alu sek poeimiai. Jie skirstomi pagal 16 diagnostini poymi
Alu sek intarpai gali sukelti gen raikos pokyius, kurie gali pakeisti promotori metilinimo status, suardyti promotorius arba neti papildomas reguliacines sekas, pavyzdiui, kai kuriuose Alu poeimiuose aptinkamus steroidini hormon jungimosi saitus. Lygiagreiai Alu gali tiesiogiai siterpti
koduojani geno dal, suardyti ASR, sukelti nonsens ar rmelio poslinkio mutacijas arba sutrikdyti
geno splaising. Alu sek intarpai atsakingi u ~0,1 proc. mogaus lig (neurofibromatoz, hemofilij,
kai kurias vio formas, Aperto sindrom ir kt.).
Alu sek genome labai daug, todl tarp j gali vykti homologin rekombinacija, kuri gali sukelti
delecijas, duplikacijas ir translokacijas. Vienuose genomo lokusuose jos danis didesnis nei kituose.
Tai, matyt, priklauso ne nuo i sek kiekio, bet nuo j panaumo. Kadangi senesns Alu sekos yra
labiau divergavusios (~ 20 proc.) viena nuo kitos, tai rekombinacijos tikimyb tarp j yra maesn nei
tarp jaunesni Alu sek, kuri divergencija sudaro maiau nei 1 proc. iuo poiriu CpG dinukleotid
motyv metilinimas ir j mutacijos yra savotikas apsauginis mechanizmas nuo homologins rekombinacijos tarp Alu sek. Manoma, kad apie 0,3 proc. mogaus lig sukelia homologin rekombinacija
tarp Alu retropozon (Batzer ir Deininger, 2002). Homologins rekombinacijos tarp i sek danis
priklauso ir nuo individo genotipo. Nustatyta, kad individuose, kuriuose paeistas TP53 genas, homo143

login rekombinacija vyksta daniau. Alu sek siterpimas nauj viet gali sukelti skirtumus tarp homologini chromosom lokus, dl to gali sumati krosingoverio danis tarp j. Dl ios prieasties
gali susidaryti genetinis barjeras tarp individ ar populiacij ries viduje. Manoma, kad tai galjo nulemti ir nauj ri atsiradim.
3.2.9. JGE panaudojimas
JGE tai ne tik domus genetinis reikinys, bet ir nepakeiiama priemon tiriant ir pertvarkant
biologinius procesus vairiuose organizmuose. Transpozon praktinis panaudojimas vairiausi gyv
btybi molekulinje genetikoje toks spdingas, kad jo nemanoma pervertinti. Galima teigti, kad
JGE naudojami trims pagrindiniams tikslams: 1) genams terpti generatyvines lsteles; 2) somatini
lsteli transgenezje/gen terapijoje; 3) mutagenezje (Largaespada, 2003).
3.2.9.1. Gen terpimas generatyvines lsteles
Stuburini gyvn generatyvini lsteli transgenez buvo atlikta varliagyvio Xenopus tropicailis,
zebrauvs (Dana rario), pels (Mus musculus) lsteli kultrose. Buvo panaudoti transpozonai, aktyvs stuburiniuose gyvnuose. Vliau pritaikytos ir heterologins sistemos. Pavyzdiui, viiuko generatyvines lsteles buvo terptas aktyvus D. melanogaster elementas Mariner. Transpozonai patogs
tuo, kad juos terpti transgenai patenka recipiento genom nepatyr pokyi. Tai patogu lyginant su
linijins DNR terpimu mikroinjekcij metu pronukleus. Pastaruoju atveju tokia DNR sudaro konkatamerus ir, siterpdama genom, patiria vairius pokyius. Transpozon transgenezs trkumas, kad
nemanoma vien lokus terpti daug transgeno kopij. Didesnis kopij skaiius vertinamas kaip bdas ivengti visiko geno nutildymo. Norint ivengti endogenini transpozon mobilizacijos, rekomenduojama stuburini gyvn gen ininerijoje naudoti evoliucikai tolim ri JGE.
3.2.9.2. Transpozon panaudojimas somatini lsteli gen ininerijoje
Transpozonai kaip vektoriai utikrina stabil transgeno siterpim chromosom. Daugiausia ia
linkme dirbama kuriant mogaus gen terapijos metodus. Transpozon pagrindu sukurti vektoriai yra
maiau imunogeniki nei virusiniai, todl labiau tinkami pakartotiniam gydymui. Transpozon sistemos plaiai naudojamos kuriant peli linijas, kuriose stipri vairi onkogen raika. Transpozonai vis
plaiau naudojami biotechnologijoje. Nors manoma, kad, kuriant transgeninius gyvnus, kurie gamina
svetimus baltymus, geriau naudoti generatyvini lsteli transgenez, taiau greiiau ir pigiau svetimus genus (monoklonini antikn, augimo ir krejimo faktori ir kt.) terpti tam tikras dideli gyvn somatines lsteles.
3.2.9.3. Svarbesni stuburini gyvn JGE naudojami gen ininerijoje
I stuburini retroelement bene geriausiai itirti ir, genetikai modifikavus, gen pernaai pritaikyti yra LINE elementai (Ostertag ir Kazazian, 2001). mogaus L1 elemento promotorius aktyvus tik
gemalinse lstelse, taiau L1 transkriptus galima gauti naudojant ir heterologin promotori. L1 ret144

ropozonas klonuotas i hemofilija A serganio paciento geno, koduojanio faktori VIII. Elementas
buvo pertvarkytas, jo 3UTR srit terpus atsparumo neomicinui (Neo) gen. Toks L1 pagrindu sukurtas vektorius buvo aktyvus mogaus ir pels lsteli kultrose (Moran ir kt., 1996). Dar viename L1
variante Neo genas buvo pakeistas alio fluorescuojanio baltymo genu (angl. green fluorescent protein, GFP). iuo atveju transpozicij galima nustatyti pagal fluorescuojani lsteli atsiradim. L1
sistemos privalumas yra tai, kad naudojant i sistem, galima sukelti mutacijas atsitiktine tvarka visame genome. Pagrindinis trkumas nedidelis vienai gametai tenkani intarp skaiius, kur lemia
tai, kad L1 vektorius netoleruoja didesnio dydio svetimos DNR. Daniausiai L1 vektoriai mogaus
lsteles, auginamas kultroje, terpiami naudojant adenovirusus. Po to vyksta L1 retrotranspozicija
lstels genom.
Dar vienas perspektyvus stuburini JGE yra transpozonas Tol2, atrastas uv genome ir vertinamas kaip labai perspektyvus uv gen ininerijoje. Tol2 pirmasis stuburini gyvn cut and paste
tipo transpozonas. Jo transpozazs gen gali valdyti svetimas promotorius. Pats elementas buvo modifikuotas terpus j gen kaset (Kawakami ir kt., 2000). Tokia dviej komponent sistema gali bti
naudojama vairi gen pernaai. Ji efektyviai panaudota zebrauvs generatyvini lsteli transgenezje. Kol kas nepavyko Tol2 elemento pritaikyti induoli lstelms.
Tc1/Mariner elementai aptikti vis ligi iol tirt stuburini genomuose, taiau neaktyvs dl mutacij transpozazs gene. Mariner ir Tc1 transpozazs buvo igrynintos ir gali bti panaudojamos
transpozicijos reakcijoje in vitro. Svarbu tai, kad jokio kito baltymo iai reakcijai vykti in vitro nereikia. Labai nuodugniai itirti du ios grups elementai Mos1 ir Himar1 paplit vabzdiuose. Jie veikia
ir heterologinse sistemose. Pavyzdiui, Mos1 gautas i D. mauritania, taiau veikia ir geltonj kartin platinaniame moskite Aedes aegypti (Coates ir kt., 1998). Todl daug vili dedama i
Tc1/Mariner tipo transpozon panaudojim stuburini gyvn gen ininerijoje. Mos1 jau pavyko
terpti viiuko, o Mariner ir Tc3 zebrauvs generatyvines lsteles. Kitas tos paios grups elementas Minos i D. hydei veiklus ir mogaus lsteli kultrose. is transpozonas kaip gen gaudykl
panaudotas HeLa lsteli kultrose. J bandoma pritaikyti ir insercinei mutagenezei induoli lstelse.
Dar vienas domus ir perspektyvus Tc1/Mariner eimos atstovas Sleeping Beauty (SB). Tai dirbtiniu
bdu, panaudojant neveiklius laiini uv genomo elementus, sukurtas transpozonas. Tai pirmasis
stuburini transpozonas, kur pavyko atkurti i neveikli endogenini element. i atkrimo procedra
buvo labai sudtinga, j sudar 10 ingsni, todl gautas elementas pavadintas SB10. Neblog rezultat gauta naudojant iuos transpozonus somatini lsteli gen ininerijoje. SB transpozon klonuotas
faktoriaus IX genas buvo terptas hemofilija B sergani peli linij. Kad efektas bt ilgalaikis, nuolat reikia terpti transpozon su mintu genu ir plazmid, turini aktyv transpozazs gen. Panaus
reikmingas laimjimas gautas terpus FAH gen peli, sergani tirozinemija, kepen lsteles bei
LAMB3 gen mogaus odos lsteli kultr, paimt i paciento, serganio epidermolysis bulbosa sin-

145

dromu. Taip pat sukurti binariniai vektoriai, kuriais adenovirusai nea mogaus hepatocit lsteles
tiek SB transpozon, tiek SB10 transpozaz ir utikrina laikin transgeno raik (Yant ir kt., 2002).
3.2.9.4. Transpozon panaudojimas mutagenezje
Transpozonai plaiai naudojami D. melanogaster ir augal mutagenezje. Pavyzdiui, jau nuo
1982 m. iam tikslui jie naudojami vaisinje muselje (Spradling ir Rubin, 1982; Walbot 2000).
Transpozonai mutagenezje patogs tuo, kad jie kartu paymi ir siterpimo viet. O cheminiai ar fiziniai mutagenai sukelt paaid vietose nepalieka lengvai aptinkam pdsak. Vis dlto, ypa eukariotuose, transpozono siterpimas gen ne visada slygoja akivaizd fenotipo pokyt. Tai lemia eukariotams bdingas gen funkcij perteklius (angl. functional redundancy) arba ankstyvas letalus fenotipas.
Siekiant veikti iuos sunkumus, buvo sukurti modifikuoti transpozonai, kurie turi gen reporter ir (ar)
tam tikras reguliacines sekas. Jiems siterpus genus arba alia j, indukuojama geno reporterio raika.
Tokie JGE pagrindu sukurti vektoriai vadinami gen gaudyklmis, kurios bna trij ri: 1) enhanceri (angl. enhance didinti, stiprinti); 2) promotori ar 5 geno dalies; 3) poliadenilinimo signalo ar 3
geno dalies.
Enhanceri gaudykls turi reporterin gen su labai silpnu promotoriumi. siterpus tokiam vektoriui greta recipiento geno, gaudyklje esant gen-reporter veiks originalaus geno enhanceriai. Tai sukels geno-reporterio raik ir leis atrinkti klonus, kuriuose transpozono vektorius siterp greta gen.
Pirmiausiai tokie modifikuoti JGE buvo panaudoti vaisinje muselje ir pelje ( Furth ir kt., 1994;
Duffy 2002). Promotori ar 5 geno dali gaudykls buvo sukurtos retrovirus pagrindu ir ibandytos
peli embrioninse kamieninse lstelse. Vektoriai turjo splaisingo akceptori, u kurio buvo terptas atsparumo antibiotikui (puromicinui, G418) genas. iuo atveju siterpim recipiento gen galima
nustatyti pagal sulieto baltymo atsiradim. Poliadenilinimo sek ar geno 3gal gaudykls turi vidin
promotori, kuris valdo gen-reporter arba atsparumo antibiotikui gen, u kurio statytas splaisingo
donoras, bet nra splaisingo akceptoriaus ar poli(A) sekos. Jeigu vektorius siterpia DNR srit be gen, geno reporterio koduojamas baltymas nesusidaro, nes transkriptas nra nei karpomas, nei poliadenilinamas. Dl to RNR transkriptas yra nestabilus ir neeksportuojamas i branduolio. Jeigu vektorius
siterpia gen ir dar ta paia geno orientacijai kryptimi, tai vyksta emiau esani egzon splaisingas
ir susidaro stabilus sulietas poliadenilintas transkriptas. Taigi iuo atveju yra reporterinio geno raika.
Taip galima atrinkti lsteli klonus, kurie turi transpozono intarpus genuose, net jeigu nra gen raikos embrioninse kamieninse lstelse prastomis slygomis.
Transpozonai plaiai panaudojami augal funkcinje genomikoje. Kukurzuose buvo atrasti ie
JGE: Ac, Supressor-Mutator/Enhancer (Spm/En) ir Mutator (Mu). Jiems giminiki elementai aptikti ir
kitose augal ryse: pavyzdiui, Tam3 aptiktas Antirrhinum majus; Tag1 A. thaliana; Slide1 Nicotiana tabacum. Visi ie elementai giminiki Ac. Endogeniniai transpozonai buvo panaudoti klonuojant kukurz, ioveinio, petunijos genus. Kai kuri i transpozon eimininko genome yra nemaas
146

kopij skaiius. Pavyzdiui, kukurz genome yra per 100 Mu kopij. Tai panaudojama didels apimties mutagenezei vykdyti. Taiau kartais tai sukelia ir nepatogum, nes tame paiame genotipe yra
daug nauj transpozono intarp, kurie sunkina rezultat analiz. Mu eima viena skmingiausiai panaudot io pobdio darbuose. J sudaro autonominis elementas MuDR bei neautonominiai elementai
Mu1 ir Mu8. Panaudojus iuos elementus, klonuota keletas kukurz gen. ios eimos elementai okinja nauj viet 2050 proc. daniau nei Ac ir Spm. Be to, naujai atsirad aleliai gana stabils. Taiau iki iol nepavyko panaudoti ios eimos JGE kitose augal ryse. 1986 m. pirmkart augal
transpozonai panaudoti heterologinje sistemoje. rodyta, kad kukurz Ac/Ds elementas gali bti aktyvus N. tabacum. Vliau jis pritaikytas mutagenezei ir kitose augal ryse: vairenyje, ryiuose, pomidoruose, petunijoje, linuose, morkose, liucernoje, bulvse ir kt. Kitose ryse gali veikti ir Spm/En
bei Tag1 elementai.
Augal retrotranspozonai taip pat sukelia savaimines mutacijas ir ilieka labai stabils naujoje vietoje. Be to, skirtingai nuo DNR transpozon jie peroka labai tolimas genomo sritis. Taiau j transpozicijos danis augaluose labai maas. Vienas perspektyviausi yra ryi retrotranspozonas Tos17.
Jis aktyvuojasi audini kultrose gana dideliu daniu ir sukelia stabilius intarpus.
Pateikti kai kurie JGE praktinio pritaikymo pavyzdiai. i molekuli iskirtins savybs rodo,
kad ie elementai bus labai svarbs gyvn ir augal gen ininerijoje bei gen terapijoje.

147

4. V(D)J rekombinacija
4.1. Pagrindins V(D)J rekombinacijos savybs
V(D)J rekombinacija tai rekombinacija tarp variable (liet. kintamas), diversity (liet. vairov) ir joining (liet. jungtis) gen segment, ypa svarbi stuburini gyvn imunitetui. Ji nulemia T ir
B limfocit receptori bei sekretuojam imunoglobulin (Ig) vairovs susidarym (Brandt ir Roth,
2002). ios molekuls svarbios atpastant svetimus baltymus, patekusius mogaus ir kit stuburini
gyvn organizm. i somatin rekombinacija vyksta T ir B limfocit raidos metu. Antigeno atpainim nulemia variabilusis imunoglobulino ar receptoriaus molekuls rajonas, kurio koduojamosios sekos susidaro dl V(D)J rekombinacijos (106 pav.). Kiekvienoje T ir B limfocit lstelje susidaro vis
kitokia imunoglobulino geno variabilioji dalis. inomi septyni lokusai, dl kuri rekombinacijos susidaro T ir B limfocit antigen receptori vairov (Jung ir kt., 2006). Jiems priklauso Ig sunkiosios
grandins lokusas (IgH) ir du lengvosios grandins lokusai (Ig ir Ig), kurie koduoja B limfocit antigen receptorius bei sekretuojamus antiknus, taip pat keturi T lsteli receptori lokusai , , , .
Geriausiai Ig genetika itirta pelje. is organizmas turi tris Ig lokusus. Vienas koduoja sunkij Ig
grandin, o du lengvj. Kiekviename lokuse yra pastovioji ir variabilioji dalis. Pastarojoje yra vairus skaiius V, D, J segment. Kad susidaryt veiklus genas, konkrets vieno ar kito tipo segmentai
turi bti sujungti betarpikai (107 pav.). Pels IgH lokusas yra madaug 3 Mbp dydio ir aptinkamas
netoli 12-os chromosomos galo. Jame yra per 150 VH geno segment, 12-13 DH ir 4 JH. Panai ir mogaus IgH lokuso variabiliosios dalies struktra. Vykstant sunkiosios grandins lokuso persitvarkymui,
vienas i DH segment sujungiamas su kokiu nors JH segmentu. Po to vienas i daugelio VH segment
prijungiamas prie DHJH. Kiekvienas toks segmentas apsuptas trump sek, vadinam rekombinacijos
signalinmis sekomis (angl. recombination signal sequence, RSS). ias sekas atpasta baltymai, vadinami RAG1 ir RAG2 (angl. recombination activating gene). Veikdami kartu jie sukelia dvigrandius
trkius. i rekombinacija ypatinga tuo, kad jos metu vyksta specifini sek atpainimas ir netikslus
DNR gal, susidariusi proceso metu, sujungimas.

148

106 pav. Imunoglobulino (Ig) molekuls sandara ir genai. Ig arba antiknai sudaryti i dviej sunkij (5070 kDa) ir dviej lengvj (22 kDa) grandini. Sunkiosios ir lengvosios grandini NH2
galas yra variabilus. Jam bdinga unikali aminorgi seka. is baltymo rajonas specifikai sveikauja su antigenu (pagal Passarge, 1995)
V1

V2

V3

J4 J3

Vn

V4

J2

J1

Vn

J4
V4 J3
V1

V2 V3

J2

J1

Nanomeras

Nanomeras

Heptametras

Heptametras

Rekombinacija

V3 J2

Veiklus genas
V1

V2

V3J2

J1

+
V4

Vn

J5

J4

Ikirptas fragmentas

107 pav. V(D)J rekombinacija lemia dalies genetins mediagos praradim. Rekombinacijoje dalyvauja specifins RSS sekos, supanios kiekvien geno V, (D), J segment

149

RSS yra dviej tip. Kiekvien j sudaro vidutinio konservatyvumo sekos i septyni (heptameras)
ir devyni (nanomeras) nukleotid, atskirtos viena nuo kitos maiau konservatyviu tarpikliu i 12 arba
23 bp (Gellert, 2002). DNR molekuls skaldymas ir rekombinacija vyksta riboje tarp heptamero ir koduojamosios sekos. Dl rekombinacijos dalis genetins mediagos yra prarandama, o po DNR gal
subrandinimo nehomologins rekombinacijos bdu tarpusavyje sujungiamos koduojamosios skirting
gen segment sekos (susidaro vadinamoji koduojamoji jungtis) ir heptameras prie heptamero (signalin jungtis). Lstelje rekombinacija vyksta tarp signalins sekos, turinios 12 bp tarpikl, ir kitos, turinios 23 bp tarpikl. is reikinys vadinamas 12/23 taisykle. VH ir JH gen segmentus supa 23 bp
RSS, o DH i abiej pusi 12 bp RSS. Todl 12/23 taisykl lemia, kad didiausia dalis IgH lokuso
persitvarkym, kuriuose dalyvauja VH geno segmentai, turs DH geno segment, terpt tarp VH ir JH
gen segment (108 pav.). Panai tvarka galioja ir kituose lokusuose. Pavyzdiui, Ig lokuse visi V
segmentai sujungti su 12bp RSS, o J segmentai su RSS, turiniomis 23 bp tarpikl. Todl V ir J sujungimas vyksta daug efektyviau nei V ir V, ar J ir J sujungimai, kuriems vykus nesusidaro ASR. Signalini sek atpainimas, mintos taisykls gyvendinimas ir DNR molekuli skaldymas priklauso nuo
RAG baltym. RSS stuburiniuose gyvnuose labai konservatyvios. Tie patys motyvai aptinkami vairiose ryse nuo ryklio iki mogaus.

108 pav. A rekombinacijos signalins sekos (RSS); B j idstymo tvarka antigen receptori
lokusuose; (pagal Gellert, 2002)
Kaip parod mutagenezs eksperimentai, tam tikri pokyiai iose sekose visgi toleruojami. Svarbiausi yra trys nukleotidai, esantys heptamere prie rekombinacijos saito. Mutacijos kitose heptamero
vietose leidia vykti rekombinacijai. Nanomeras labiau variabilus nei heptameras (Gellert, 2002). Rekombinacija tarp toje paioje molekulje esani RSS yra 1000 kart efektyvesn nei tarp esani skirtingose molekulse. Lstelse toki tarpchromosomins rekombinacijos atvej nustatyta limfoidinio
audinio augliuose, taiau jie yra reti.
Koduojamosios ir signalins jungi sandaros tyrimai atskleid tiek j susidarymo skirtumus, tiek
paties rekombinacijos proceso kai kurias ypatybes. Signalins jungtys daniausiai yra tikslios ir susida150

ro susijungus heptamerams galais. Nedidelis i jungi skaiius gali turti keleto nukleotid intarpus
tarp heptamer gal. Koduojamosios jungtys labai vairios. Danai jos bna praradusios kelet nukleotid nuo vienos ar abiej koduojamj sek gal arba turi papildom nukleotid, kuri nebuvo
pradinje DNR, intarpus. Visi ie pokyiai labai svarbs antigen receptori vairovei susidaryti, nes
koduojamoji jungtis lemia Ig ir TCR jungimosi su antigenu saito struktr. Kadangi i jungtis yra atsitiktins sandaros, tai apie 2/3 toki jungi yra netinkamos, kadangi sukelia rmelio poslinkius arba
prielaikin baltymo sintezs nutraukim. Jeigu pirmasis persitvarkymas neskmingas, galimi ir vlesni. Koduojamosios jungties susidarymo metu papildomi nukleotidai gali bti terpti dvejopai: 1) terminalin deoksinukleotidiltransferaz (TdT) gali prijungti 15 visikai nauj (nematricini) nukleotid.
Nukleotid prijungimui prie DNR gal dalyvaujant iam fermentui, nereikia DNR matricos. Nematricini intarp koduojamosiose jungtyse neaptinkama pelse, kuri TdT genas ijungtas. 2) nukleotidai
jungiami koduojamsias jungtis pagal matric. Rekombinacijoje is bdas svarbesnis. Vadinamieji P
(palindrominiai) nukleotid intarpai susidaro ant paskutinij koduojamosios sekos bazi prie pat RSS.
J susidarymo mechanizm nulemia segtuko, esanio koduojamosios jungties gale, suskaldymo pobdis. Jeigu RAG baltymai segtukus skaldo ne simetrikai centre, tai gaunami isiki viengraniai
DNR galai, kurie prie sujungim ar jo metu paveriami dvigrandiais (109 pav.). Todl koduojamojoje jungtyje gali susidaryti trumpi palindromai. Daug maiau inoma apie nukleotid praradim susidarant io tipo jungtims. Manoma, kad ia dalyvauja viena ar kelios endonukleazs (Gellert, 2002).

109 pav. Galimos segtuk, susidarani V(D)J rekombinacijos metu, skaldymo vietos
Lstelse, kuriose vyksta V(D)J rekombinacija, aptinkama daugiau nesujungt signalini gal nei
koduojamj. Todl galima manyti, kad pastarieji sujungiami greiiau. Pavyzdiui, peli timocituose
TCR lokuse aptinkama 1000 kart daugiau signalini gal nei koduojamj. Taiau pels lstelse,
turiniose scid mutacij, abiej tip gal randama madaug vienodai. Tai rodo, kad veikiant iai mutacijai sutrinka koduojamj jungi susidarymas.
V(D)J rekombinacijos stadijos: 1) RAG1 ir RAG2 baltymai, veikdami kartu kaip rekombinaz, atpasta RSS, vykdo j sugretinim pagal 12/23 taisykl bei skaldo DNR riboje tarp heptamero ir greta
esanios koduojamosios sekos; 2) sujungiami DNR galai nehomologins rekombinacijos bdu.
4.1.1. RAG rekombinaz ir jos genai
RAG1 ir RAG2 baltymai bdingi tik limfinms lstelms. Visi kiti rekombinacijai reikalingi
veiksniai nra tokie specifiki ir bdingi visoms lstelms. Pelse su ijungtais Rag1 ar Rag2 genais
V(D)J rekombinacija visikai nuslopinta. Tokiose pelse nra subrendusi B ar T lsteli. Kadangi jo151

ki kit sutrikim tokiose pelse nepastebta, tai rodo, kad ie genai veikia tik imuninje sistemoje.
RAG lokuso struktra labai savita. Visose tirtos ryse ie genai yra greta vienas kito, taiau orientuoti
prieprieine kryptimi. Daugelyje genom (Xenopus, viiuko, pels ir mogaus) jie neturi intron.
Todl spjama, kad stuburiniuose gyvnuose ie genai yra transpozonins kilms. Pradedant uvimis,
vis stuburini Rag1 ir Rag2 genai labai panas. emesniuosiuose eukariotuose V(D)J rekombinacija
nevyksta, juose nra ir panai gen. Rekombinacijai vykti btina abiej baltym kooperacija. domu
tai, kad, paalinus didelius abiej gen fragmentus, j koduojami baltymai ilieka aktyvs. Taiau pastebta, kad nors tokie sutrumpinti baltymai efektyviai vykdo rekombinacijos pradi, baigiamajame
etape atsiranda sutrikim. Todl manoma, kad paalintos baltym dalys svarbios rekombinacijai valdyti.

Hidroliz
OH P

Viengrandi trki
susidarymas
H
P O

Transesterifikacija
P
HO
P

Koduojamj sek
galai (segtukai)

HO

Signalini sek
galai

110 pav. RAG baltym vykdomas DNR skaldymas. Pirmiausia baltymai katalizuoja viengrandi
trki susidarym. Po to OH grups, esanios trkio 3gale, atakuoja kit DNR molekuls grand,
vyksta transesterifikacijos reakcija ir viengrandiai trkiai paveriami dvigrandiais. Dl to susidaro du segtukai ir du buki DNR galai (Gellert, 2002)
Daniausiai DNR skaldymo reakcija buvo tiriama naudojant sutrumpintus i baltym variantus,
nes sveiki baltymai buvo netirps ir (ar) neaktyvs. ie baltymai skaldo RSS esant Mn2+ arba Mg2+ jonams. Taiau Mg2+ jonai labiau tinka tada, kai yra RSS pora, o Mn2+ pakanka skaldyti pavienms RSS
jungtims. Pirmiausia, RAG1/RAG2 vykdomos reakcijos metu sukeliamas viengrandis trkis kiekvienos RSS signalinio heptamero 5gale ir susidaro 5-P RSS gale bei 3-OH koduojamosios sekos gale.
Po to 3-OH grup sveikauja su antrja tos paios molekuls grandimi ir susidaro segtukas koduojamosios jungties gale bei bukas signalins jungties galas (110 pav.). Reakcij, ypa 23-RSS skaldym,
skatina chromosomos HMG1 ir HMG2 baltymai. Tai nespecifikai su DNR sveikaujanios molekuls, kurios geba jungtis prie DNR ir j ilenkti. ie baltymai bei nespecifin DNR taip pat skatina
RAG1 ir RAG2 jungtis prie 12/23 RSS poros (palyginti, pavyzdiui, su 12/12 RSS pora).
152

4.2. DNR gal susijungimas V(D)J rekombinacijos metu

DNR gal susijungimas V(D)J rekombinacijos metu turi daug panaum, palyginti, su DGT alinimu nehomologins rekombinacijos bdu. Vis dlto neaikum ia yra daugiau nei RAG baltym katalizuojamoje trki susidarymo stadijoje. Svarbiausi veiksniai, dalyvaujantys susidarant koduojamajai
ir signalinei jungtims, yra nuo DNR priklausoma proteinkinaz (DNR-PK), DNR ligaz IV, Xrcc4,
Artemid (Artemis), histonas H2AX ir Mre11/Rad50/Nbs1 baltym kompleksas (Fugnann ir kt., 2000;
Gellert, 2002).
DNR-PK tai baltym kompleksas, kur sudaro katalizinis subvienetas (DNR-PKCS) ir Ku baltym heterodimeras (Ku70 ir Ku80). is baltymas priklauso serino/treonino proteinkinazi eimai. Jo
vaidmuo V(D)J rekombinacijoje paaikjo tiriant pels scid mutacij. i mutacija sukelia peli imunodeficit, jose sutrinka V(D)J rekombinacija, DGT reparacija ir padidja jautrumas JS. Mutacija yra
vykusi pels DNR-PKCS gene. Toki peli lstelse labiausiai sutrinka koduojamj jungi susidarymas. Scid lstelse kaupiasi segtukai, kartais koduojamosiose jungtyse aptinkamos didels delecijos
arba neprastai ilgi palindromai. Tai rodo, kad DNR-PKCS dalyvauja skaldant segtukus koduojamj
sek galuose.
Ku baltym veiklos paeidimai taip pat trukdo vykti V(D)J rekombinacijai. Ku baltymai, kaip heterodimerai, jungiasi prie DNR gal, DNR segtuk ir viengrandi tarp. Manoma, kad ie baltymai
padeda ligazei IV/Xrcc4 sujungti bukus arba beveik bukus DNR molekuli galus.
Dar du veiksniai, dalyvaujantys V(D)J rekombinacijoje, DNR ligaz IV ir Xrcc4 buvo nustatyti
genetikai. Xrcc4 sudaro kompleks su ligaze IV, stabilizuoja baltym in vivo bei skatina jo aktyvum in vitro. Lsteli linijos, kuriose paeistas vieno ar kito baltymo genas, igyvena, taiau yra jautrios JS, jose nesusidaro koduojamosios ir signalins jungtys. Pels, kuriose paalintas kuris nors i i
gen, nugaita vlyvoje embriono stadijoje dl dideli nerv sistemos raidos sutrikim.
Vien i mogaus T-B-SCID (angl. severe combined immune deficiency) lemia mutacijos baltymo
Artemis gene. Genui suteiktas graik deivs Artemids (vaik ir gyvn globjos) vardas, prasmingai
atspindi jo kaip genomo sargo, funkcij (Brandt ir Roth, 2003). io baltymo kompleksas su DNRPKCS dalyvauja segtuk, kurie yra koduojamj sek galuose, skaldyme. Artemis turi egzonukleazs
ir endonukleazs aktyvum, kurie rekombinacijos metu priklauso nuo fosforilinimo. Pastarj atlieka
DNR-PKCS (Drouet ir kt., 2006).
H2AX histonas yra vienas i H2A histono variant. induoli lstelse jis sudaro nuo 2 iki 25
proc. H2A histono kiekio. Nustatyta, kad jis susidaro vykus DNR trkiams, atsirandantiems V(D)J
rekombinacijos metu.

153

4.3. V(D)J rekombinacijos valdymas

V(D)J rekombinacij valdo RAG1/2 baltymai bei rekombinacinio aparato sveika su DNR. Rag1
ir Rag2 genai veikia tik limfini lsteli raidos pradioje. Daugiausia RAG2 baltymo susintetinama
lstels ciklo G1 stadijoje. Tokiais RAG2 susidarymo pokyiais galima paaikinti, kodl V(D)J rekombinacija daugiausia vyksta ioje ciklo stadijoje. Netgi limfinse lstelse, kuriose reikiasi Rag1 ir
Rag2 genai, tik nedidel dalis RSS sek yra prieinamos rekombinacijos aparatui. Tai priklauso ir nuo
lstels tipo. Nors rekombinacijos procesas vyksta B ir T lstelse, taiau Ig genai visikai persitvarko
tik B, o TCR genai tik T lstelse. Be to, persitvarkymas vyksta tam tikra tvarka: IgH lokusas persitvarko anksiau nei Ig lengvosios grandins lokusai, o TCR anksiau nei TCR. Rekombinacijos
sek prieinamumas priklauso nuo chromatino struktros, transkripcijos enhanceri ir kt. Yra nemaai
eksperimentini patvirtinim, kad kai kurios transkripcij reguliuojanios sekos (transkripcijos enhanceriai) labai svarbios V(D)J rekombinacijai. Vienas geriausiai itirt iuo poiriu reguliatori yra introne esantis enhanceris (iE), kuris aptinkamas tarp paskutiniojo JH geno segmento ir C egzon.
Dirbtinai sukelta su iE sveikaujani E2A ir EBF raika aktyvuoja DH ir JH rekombinacij nelimfoidinse lstelse. Taip pat rodyta, kad iE gali sukelti i gen segment rekombinacij transgeninje
DNR. Visikai paalinus iE, DH ir JH, rekombinacija sumaja madaug tredaliu: apie 30 proc. periferini B limfocit turi nepakitus IgH lokus. Tai rodo, kad rekombinacijos aktyvacijai reikalingi ir
kiti veiksniai.
V(D)J rekombinacijos sait prieinamum veikia ir vairios chromatino modifikacijos. Svarbs ir
chromatin permodeliuojantys kompleksai, pavyzdiui, SWI/SNF, kurie padaro genomin DNR, prieinam RAG rekombinazs aparatui (Jung ir kt., 2006).

4.4. RAG1/2 vykdoma DNR sek transpozicija

RAG baltym vykdomos chemins reakcijos tyrimai rodo, kad ie baltymai veikia labai panaiai
kaip DNR transpozazs. RAG1/2 katalizuojamas segtuko susidarymas yra tiesiogin transesterifikacijos reakcija, labai panai t, kuri vykdo vaisins musels JGE Hobo, kukurz Ac/DS, ioveinio
Tam3 ir kt. RAG katalizuojamai transpozicijai reikia 12 ir 23 RSS poros, kad j apsuptas DNR fragmentas bt pernetas nauj viet (111 pav.). Taiau ne visais atvejais sek-taikin siterpia abu tokios judrios DNR galai.

154

111 pav. RAG baltym katalizuojama reakcija. Reakcijos metu susidaro du buki RSS galai, kurie
sveikauja su kita DNR. Reakcijai vykti reikalingos 12 ir 23 bp ilgio tarpiklius turinios RSS (Gellert, 2002).
RAG baltym transpozazs savybs leido geriau sivaizduoti V(D)J rekombinacijos evoliucij ir
kilm. Jau seniai (1979) japon mokslininkai, remdamiesi RSS sek sandaros ypatybmis, ikl hipotez, pagal kuri jos primena invertuotas sekas transpozon galuose (Gellert, 2002). is poiris dar
labiau sustiprjo, kai buvo nustatyta RAG lokuso struktra. Jo kompaktikumas, dviej intron neturini struktrini gen artumas primin transpozonus. Paplitimas stuburiniuose gyvnuose, pradedant
kremzlinmis uvimis ir baigiant induoliais, taip pat rodo i gen galim transpozonin kilm. Kadangi emesnieji eukariotai neturi nei panai gen, nei jiems giminik sek, manoma, kad RAG lokusas pateko stuburinius i neinomo organizmo horizontalaus perdavimo bdu. Galbt toks senovinis transpozonas, sudarytas i RAG gen ir juos supani sek pateko stuburini gyvn protvio genom. Po to sekos ir genai buvo atskirti ir transpozicija tapo nemanoma.

155

5. Antikn klasi kaitos rekombinacija

Antikn klasi kaitos rekombinacija (KKR) yra imunoglobulin gen persitvarkymo procesas,
kuriam vykus, daugelis B limfocit vietoje vienos klass antikn pradeda gaminti kitos klass antiknus. Vien ar kit antikn klas nulemia imunoglobulin gen sunkiosios grandins pastovusis rajonas (C), jame esantys genai (106 ir 112 pav.). ios rekombinacijos metu imunoglobulin sunkiosios
grandins variabilieji rajonai, susidar dl V(D)J rekombinacijos ir koduojantys sveikos su antigenais
vietas, prijungiami prie persitvarkiusio chromosomos rajono, kuris koduoja pastovij (C) imunoglobulino grandins dal. Visos B lstels antikn gamyb pradeda sintetindamos IgM molekules, kurios
sijungia plazmin membran ir veikia kaip antigen receptoriai. iuo atveju variabiliosios dalies gen segmentai bna prisijung prie pastoviosios dalies C geno segmento. Vykstant KKR, C segmentas pakeiiamas vienu i emiau esani C, C ar C segment, kurie koduoja atitinkamai IgG, IgE ir
IgA antiknus. Tokia rekombinacija reikalinga sukurti imunoglobulin genus, kuri reikia geresnei
apsaugai nuo vairi ri patogen. Didelio afinikumo antiknai IgG ir IgA yra svarbs neutralizuojant virusus ir slopinant mikroorganizm dauginimsi. Individai, kurie negeba savo organizme gaminti
i antikn, suserga hiper-IgM (HIGM) sindromu. J organizmas neveikia bakterij ir virus, pacientai anksti mirta.
Iki sveikos su antigenu antikn vairov lemia jau minta V(D)J rekombinacija. Po sveikos su
antigenu bei padedant lstels T helperiams, B limfocitai patenka periferini limfoidini organ germinalinius centrus ir virsta centroblasto B lstele. ia vyksta antroji antikn diversifikacijos banga,
tik kart somatini hipermutacij (SHM) ir (ar) gen konversijos bdu vl tame paiame V rajone
(Li ir kt., 2004). Dl ios gen pertvarkos susidaro didelio afinikumo antigen suriimo vietos imunoglobulin molekulse. Somatins hipermutacijos daniau aptinkamos induoliuose, o geno konversija kai kuriuose paukiuose. Toje paioje centroblasto B lstelje vyksta ir antikn klasi kaitos rekombinacija. Tiek SHM, tiek KKR daniausiai vyksta Ig genuose, taiau retkariais ie persitvarkymai
gali vykti ir kituose genuose tai viena i daniausi B lsteli limfom prieasi. mogaus lstelse
SHM danis madaug milijon kart virija spontanini mutacij dan. Daniausiai vyksta bazi pakaitos, nors retkariais pasitaiko insercijos bei delecijos.
KKR vyksta chromosomos viduje tarp C segmento S (S) sekos ir emiau esani S sek. Jos
vadinamos atitinkamai donoro ir akceptoriaus sekomis. J dydis svyruoja nuo 1 kbp iki 12 kbp. J aptinkama prie kiekvien C rajon, iskyrus C (112 pav.). Pels genome akceptoriaus sekomis gali bti
S3, 1, 2b, 2a, ar , esanios 12-oje chromosomoje, o mogaus S3, 1, 1, 2, , ar 2, esanios
14-oje chromosomoje. T lsteli-pagalbininki sintetinami limfokinai, sveikaudami su B lstelmis,
aktyvuoja atskir S sek promotorius. Kadangi ios sekos nieko nekoduoja, susidars transkriptas vadinamas steriliu. Jis, manoma, sudaro RNR-DNR hibrid su matricine DNR seka ir taip atveria viengrand nematricins DNR srit, kurios ilgis gali siekti apie 1 kbp (Shinkura ir kt., 2003). Toks darinys
156

vadinamas R kilpa. Ji, manoma, svarbi KKR ir linkusi mutuoti. KKR vyksta intronuose ir nepaeidia
transliacijos skaitymo rmelio. Rekombinacijos takai daniausiai aptinkami vairiose S sek vietose,
labai retai u j rib. S sekos sudarytos i pratgiui pasikartojani pentamer (danai GAGCT ir
GGGGT) arba 49 bp sekos. S sekos pasiymi nevienodu homologijos laipsniu, taiau KKR vyksta ne
pagal homologins rekombinacijos model. Rekombinacijos vietose homologijos saito dydis yra tik 1
4 nt. Homologijos nebuvimas ir S sek polimorfizmas sunkina KKR mechanizmo tyrim. Taigi pateikta vairi aikinim. Paprasiausias modelis teig, kad vyksta DNR skaldymas ir sujungimas. S rajonuose sukeliami DGT arba vienas nuo kito netoli esantys VGT (Kataoka ir kt., 1980). I tikrj tokius
trkius pavyko aptikti B lsteli S sekose KKR metu. I988 m. pasilytas kilpos ikirpimo modelis: teigiama, kad KKR metu susidaro keturi laisvi DNR galai, kurie gali bti vairiai sujungti. Rekombinacijos metu susidaro iedin ekstrachromosomin DNR. Toki molekuli buvo aptikta limfocit lstelse
(Jessberger ir kt., 1996). Kadangi ilg laik nepavyko nustatyti, kokie baltymai sukelia trkius iose
vietose, todl pradta S sek atpainim aikinti antrini struktr susidarymu (Maizels 1999; Manis ir
kt., 2002).

112 pav. Klasi kaitos rekombinacija (KKR) ir somatin hipermutacija imunoglobulin sunkiosios grandins lokuse. A pels sunkiosios grandins lokusas (kairje) po V(D)J rekombinacijos
koduoja sunkij grandin. Jos determinuojami IgM antiknai (deinje) yra penkianariai, sudaryti i imunoglobulin molekuli, turini dvi sunkisias ir dvi lengvsias grandines. B KKR sujungia nauj pastovj rajon su variabiliuoju V(D)J rajonu, ir pradedami sintetinti naujos klass
antiknai (deinje). Parodyta klasi kaita i C C1 ir dl to susidarantys IgG1 antiknai.
C somatins hipermutacijos modifikuoja tiek sunkiosios, tiek lengvosios grandins sekas. Hipermutav antiknai pasiymi didesniu giminikumu antigenams. vaigduts ymi mutacijas genuose ir pokyius baltymuose. KKR ir SHM vyksta panaiu metu, nors paveiksle SHM ir parodyta
vliau http://genomebiology.com/content/figures/gb-2000-1-4-reviews1025-1.jpg
mogaus ir pels S sekos turtingos GC, o viena DNR grandin ypa turtinga G. Tai palanku susidaryti G4 DNR. Taiau varliagyvi lstelse S rajonai, nors taip pat sudaryti i nehomologik pasi157

kartojani sek, taiau turtingi AT. Taigi is modelis susiduria su rimtais prietaravimais. Eksperimentais nustatyta, kad S sekos reikalingos klasi kaitos rekombinacijai. Paalinus didij dal pels
S rajono pasikartojani sek, KKR danis labai sumaja. iuolaikinius KKR modelius galima suskirstyti dvi grupes (Manis ir kt., 2002). Vienuose modeliuose pripastamas tiesioginis S sek
transkripcijos vaidmuo rekombinacijoje, kituose jos vaidmuo netiesioginis. Be to, rekombinazs ar kito
baltymo, sukelianio trkius S sekose, klausimas vis laik buvo aktualus. Tik 1999 m. buvo atrastas
AID (angl. activation-induced cytidine deaminase) baltymas (Muramatsu ir kt., 1999). is baltymas
reikalingas ne tik KKR, bet ir SHM bei geno konversijai imunoglobulin genuose vykti. AID veikia
tik centroblasto B lstelje. Peli lstelse, neturiniose io baltymo geno, visikai nevyko KKR ir
SHM. Jose nustatytas padidjs IgM, kur gamina aktyvuoti B limfocitai, kiekis. Panas sutrikimai
aptinkami ir monse. Tokie pacientai suserga HIGMII sindromu. O viiuko DT-40 lsteli linijoje,
kurioje AID genas neveikia, negaljo vykti geno konversija. Ektopin AID geno raika sukelia SHM
neprastoje pels B limfocit raidos stadijoje, ji vyksta ir kitose lstelse, netgi gali sukelti SHM E. coli. Tai rodo, kad AID yra vienintelis B lstelms bdingas baltymas, kuris reikalingas KKR ir SHM (Li
ir kt., 2004). AID homologikas apolipoproteino B mRNR redaguojanio fermento kataliziniam polipeptidui 1 (APOBEC-1). Pastarasis baltymas sait-specifikai deaminina citidin uracil apoB mRNR
molekulje ir sukuria prielaikin stop kodon. Dl to susidaro trumpesnis baltymas, kuris jungiasi prie
kito receptoriaus nei pradinis jo variantas. AID sveikauja su DNR ir deaminina citozino liekanas joje.
Eksperimentais nustatyta, kad vgDNR molekulje AID deaminina dC dU. Taiau panaaus aktyvumo
neturi dgDNR ir DNR-RNR hibridinse molekulse. Deamininti citozinai, veikiant tam tikriems reparacijos mechanizmams, S sekose taip subrandinami, kad susidaro DGT (113 pav). Taigi AID sukelia
daug DGT S rajonuose. Kai susijungia du skirtingi S rajonai, vyksta KKR. Kitais atvejais S sekose
vyksta delecijos ar translokacijos. DGT reparacijos baltymai (ATM, 53BP1, H2AX) reikalingi tokiems nutrauktiems DNR galams atpainti. J sujungime svarbiausias vaidmuo tenka nehomologini
DNR gal sujungimo baltymams (DNR-PKcs, Ku70/80 ir kt.). Pelse su neveikianiais pavieniais
Ku70, Ku80, DNR-PKcs ar H2AX genais aptinkami dideli KKR sutrikimai (Li ir kt., 2004). Chromatino struktra ir jo modifikavimas taip pat svarbs ankn klasi kaitos rekombinacijai.
KKR modelis dar nra ibaigtas. Pagal j susintetinta ir subrandinta centroblasto B lsteleli citoplazmoje AID deaminaz keliauja branduol, kur sveikauja su V ir S rajon vgDNR ir deaminina dC
dU. Taip susidaro nesuporuoti nukleotidai. Jie gali bti itaisyti pradin variant arba gali vykti mutacija, pavyzdiui, dU gali paalinti uracilo N-glikozilaz (UNG) ir susidarys abazinis saitas, kuris
svarbus KKR, nes konvertuojamas viengrand trk dalyvaujant AP-endonukleazei. I viengrandi
trki R kilpos vietoje, manoma, susidaro ir DGT, kurie jau alinami NGS bdu (113 pav.). Transkripcijos vaidmuo KKR betarpikai susij su AID veikimu. Jos metu susidaro R kilpa ir vgDNR, kuri yra
deaminazs substratas.

158

113 pav. AID baltymo vaidmuo susidarant DGT S sekose. Pavaizduota C geno S seka, kurioje
susidariusi R-kilpa. Dl AID veikimo viengrands DNR molekulse C deamininamas iki U, o pastarj paalina UNG baltymas, sukurdamas abazin (apirimidinin) sait. Pastarj skaldo AP endonukleaz ir sukelia viengran tk. Toki VGT visuma nulemia DGT atsiradim S sekoje. DGT itaisomas NGS bdu, kas ir nulemia KKR (Yu ir Leeber, 2003)
Neseniai atlikti tyrimai rodo, kad KKR gali vykti mutantinse lsteli linijose, kuriose AID baltymas pakeistas mieli I-Sce endonukleaze, o S sekos prie ir 1 genus endonukleazs atpainimo
saitais (Zarrin ir kt., 2007). Todl iai rekombinacijai ypa svarbu, kad tam tikrose vietose susidaryt
DGT, kuriuos evoliucikai nulm AID ir lstels reparacijos sistemos veikla. Daug sudtingiau atsakyti klausim, kodl pirmiausia sujungiami dideliu (C ir C1 atveju 100 kbp) atstumu nutol DNR
fragmentai. Galbt tai lemia B lstelms specifika IgH lokuso struktrin organizacija, arba tai priklauso nuo DGT atpastani ir jo subrandinime dalyvaujani baltym savybi.

159

6. Nedsningoji (nehomologin) rekombinacija

Nedsningoji rekombinacija vyksta tarp DNR (RNR) sek, turini labai ma (keleto nukleotid)
homologij arba neturini jokios. Nedsningosios rekombinacijos danis vairiuose organizmuose
labai skiriasi. Bakterijose nedsningosios rekombinacijos danis labai nedidelis 10-710-8, o induoli ir augal lstelse i rekombinacija yra daug efektyvesn u homologin. Mieli lstelse is skirtumas maesnis ir homologins rekombinacijos danis apie 10 kart virija nedsningosios dan. Kodl egzistuoja tokie skirtumai, neaiku. Be to, homologins ir nedsningosios rekombinacijos indlis
auktesnij eukariot lstelse labai priklauso nuo lstels bsenos, lstels ciklo stadijos ar net lsteli tipo.

6.1. Nedsningoji rekombinacija bakterijose

1967 m. N. Franklin pirmoji pradjo tyrinti reikin bakterij lstelse. J sudomino tam tikr
delecij susidarymas E. coli lstelse. Mint delecij danis nepriklaus nuo lstels homologins
rekombinacijos (rec) sistemos gen. Pat vyksm N. Franklin apibdino kaip retus, atsitiktinius rekombinacinius vykius, nereikalujanius homologijos. Franklin (1971 m.) pasil du aikinimus, kaip
gali atsirasti tos spontanikos, nuo recA nepriklausanios, delecijos:
1. DNR replikacijos klaidos, kurias sukelia replikacins akuts slysteljimai. Vykstant DNR
replikacijai, tam tikrose DNR sekose gali susidaryti kilpos ar segtukai, kuriuos replikacin
akut gali praleisti, praokti. Taip naujai susintetintoje DNR grandinje gali susidaryti delecijos.
2. Baltym, skaldani ir vl sujungiani DNR, veiklos klaidos. Baltymai gali suklysti ir
skaldyti DNR neprastose vietose arba gali netaisyklingai sujungti nutrauktas DNR molekules.
Nedsningj rekombinacij tyr mokslininkai eksperimentais patvirtino Franklin hipotezi teisingum. Pavyzdiui, Farabough ir kt. (1978 m.), tirdami delecij susidarymo dsningumus, nustat,
kad jos susijusios su trump (3 20 bp) vienakrypi pasikartojani sek buvimo vietomis. Toki
sek DNR retkariais prarandama ir po replikacijos bakterijos chromosomoje bdavo viena pasikartojania seka maiau.
Tarp baltym, su kuri veikla siejama nedsningoji rekombinacija, svarbausi DNR topoizomerazs. J vaidmuo buvo intensyviai tirinjamas ir rodyta, kad topoizomerazs dalyvauja nedsningoje
rekombinacijoje. 1981 m. iuos darbus pradjo H. Ikeda ir kolegos (Ikeda ir kt., 1982). Jie sukr nelstelin sistem nedsningajai rekombinacijai tarp nehomologik molekuli ( ir pBR322) tirti panaudojant bakteriofago morfogenez in vitro E. coli ekstraktuose. reakcijos miin dta plazmid
pBR322, kurios vienas i gen lemia atsparum ampicilinui. Aptikta, kad 1,3 10-7 daniu susidarydavo fago dalels, turinios atsparumo ampicilinui gen. Rekombinantini fag ieiga padiddavo, jei160

gu pakavimo miin bdavo pilama oksolinins rgties. Atlikus toki fag DNR analiz, nustatyta,
kad vyko nedsningoji rekombinacija tarp fago ir plazmids DNR molekuli. Ityrus reikin paaikjo, kad nedsningosios rekombinacijos prieastis yra DNR girazs klaidos. is fermentas sukelia laikinus dvigrandius DNR molekuli trkius, po to vl sujungia DNR molekuli galus. Sveikoje su
DNR dalyvauja du GyrA ir du GyrB subvienetai. Taiau kartais sujungiami ne tie DNR molekuli galai. Taip gali susidaryti nehomologik fago ir plazmids molekuli hibridai. Kadangi oksolinin rgtis slopina girazs vykdom DNR molekuli sujungim, klaid tikimyb iuo etapu padidja ir nedsningosios rekombinacijos danis iauga. Ikeda ir kt. man, kad nedsningosios rekombinacijos mechanizm galima paaikinti reakcijoje dalyvaujani girazs molekuli subvienet mainais (114 pav.).
DNR girazs dalyvavimas nedsningojoje rekombinacijoje buvo nustatytas ir Bacillus subtilis lstelse. Panaius DNR persitvarkymus sukelia vairios topoizomerazs (fago T4 topoizomeraz II, eukariot topoizomeraz II, topioizomeraz I). Aprayti atvejai, kai klysta ir kiti baltymai (M13 geno II baltymas, fago integraz, Tn3, Mu transpozazs ir kt.).
A)

B)

C)

D)

E)
114 pav. Girazs dalyvavimo nedsningojoje rekombinacijoje modelis, grindiamas fermento
subvienet main hipoteze (Ikeda ir kt., 1982). A DNR dupleksai be baltym; B staiakampiai
girazs subvienetai A ir B. Du suglausti vienspalviai staiakampiai atitinka prast fermento struktr, sudaryt i dviej A ir dviej B subvienet (A2B2); C girazs-DNR kompleksas sveikauja
su kitu tokiu pat baltymo ir DNR kompleksu ir sudaro tetramerin darin A4B4; D tetramerins
formos disociacija dimerin gali vykti per apsikeitim skirting ferment subvienetais ir sukelti
DNR grandini mainus bei nedsning rekombinacij; E rekombinantins DNR molekuls

161

6.2. Nehomologikas DNR gal susijungimas (NGS) bakterijose

Tik 2002 m. atrastas is savitas nedsningosios rekombinacijos reikinys bakterijose (Weller ir kt.,
2002). Iki tol manyta, kad toks DNR gal sujungimo bdas bdingas tik eukariotams. Tiesa, iek tiek
anksiau buvo aptikti induoli Ku baltym ir ligazs IV homologai kai kuriose bakterijose (Aravind ir
Koonin, 2001; Doherty ir kt., 2001). Pirmiausia B. subtilis nustatytas YkoU baltymas, homologikas
induoli Ku70/Ku80 heterodimerui, taip pat YkoV, turintis nedidel panaum su induoli DNR ligaze IV. Kiek vliau Mycobacterium tuberculosis aptikti baltymai, kurie dalyvauja io tipo rekombinacijoje. Genetiniai ykoU ir ykoV mutant tyrimai parod, kad jie buvo jautresni JS, taiau normaliai
reagavo UV spindulius ir alkilinani mediag poveik. Tai rodo, kad minti batymai dalyvauja JS
sukelt DGT alinime. Be to, nustatyta, kad ie baltymai nesusij su homologine rekombinacija, nes
recAykoUdvigubi mutantai buvo jautresni JS nei pavieniai mutantai. Ku i M. tuberculosis su DNR
sveikauja kaip homodimerai, kurie jungiasi prie linijins DNR gal. Be to, jie tiesiogiai sveikauja su
DNR giraze ir skatina DNR gal susijungim (Wilson ir kt., 2003).
Bakterijose kaip ir mielse (r. 6.3.4. skirsn), neaptikta DNR-PKcs. Taigi is nehomologik
DNR gal susijungimo sistemos komponentas atsiranda vlesniuose evoliucijos etapuose. Be to, ir kit
NGS baltym aptinkama ne visose bakterij ryse (10 lentel).
10 lentel. NGS komponentai vairiose bakterij taksonominse grupse (Wilson ir kt., 2003)
Sistematin padtis
Ris
K L
P
N
Archaea
Archaeoglobi
Archaeoglobus fuldigus
+
+

Methanococci
Methanosarcina sp.

+
Bacteria
Actinomycetales
Mycobacterium turbeculosis
+
+
+
+
Mycobacterium leprae

Streptomyces coelicolor
+
+
+
+
Bacteroidetes
Cytophaga hutchinsonii
+
+
+
+
Firmicutes
Bacillales
Bacillus sp.
+
+
+

Oceanobacillus iheyensis
+
+

Staphylococcus aureus

Clostridia
Desulfitobacterium hafniense
+
+
+
+
Clostridium perfringens

Alphaproteobacteria
Rhizobiales
Kelios rys
+
+
+
+
Sphingomonadales
Novosphingobium aromaticivorans
+
+
+
+
Betaproteobacteria
Burkholderia fungorum
+
+
+
+
Neisseria meningitidis

Gammaproteobacteria
Pseudomonas sp.
+
+
+
+
Xanthomonas sp.
+
+
+
+
Escherichia coli

K Ku baltymai, L DNR ligaz, P praimaz, N nukleaz.

162

6.3. Nedsningoji rekombinacija eukariotuose

6.3.1. Nehomologikas DNR gal susijungimas
Pagrindinis nedsningosios rekombinacijos mechanizmas eukariotuose yra NGS (angl. nonhomologous end joining NHEJ). is mechanizmas labai efektyvus ir alina bet kokius DGT, atsiradusius auktesnij eukariot lstelse. Pirmoji tai pastebjo McClintock 1940 m. pradioje, tirdama
kukurz mitoz. Jeigu kukurz lstel paveldi DGT turini chromosom, kuri po to dalyvauja DNR
replikacijoje, tai trkio galai (kuri po replikacijos bus du) labai veiksmingai sujungiami tarpusavyje ir
susidaro dicentrin chromosoma. Tokia chromosoma bus vl nutraukta kitoje mitozje, vl regeneruos
trkusius galus ir vl susidarys nauja dicentrin chromosoma. Kitos mitozs metu vl atsiras dvigrandis trkis chromosomoje, nes dvi jos centromeros bus traukiamos prieingus lstels polius
(115 pav.). Toks trkio-sujungimo-tilto (angl. breakage-fusion-bridge) ciklas kartosis daugyb kart
iki prie nutrkusio chromosomos galo neprisijungs telomerins sekos.
Centromera
Telomera
Trkis

Sujungimas

Rekombinacija

Tiltas
Mitoz

Trkis

115 pav. Trkio-sujungimo-tilto ciklas kukurz lstelse

D. Roth ir J. Wilson tyr DNR gal susijungim bedioni lstelse. P. Pfeiffer panaius tyrimus
atliko Xenopus kiauinio ekstraktuose. Kaip parod pirmieji tokio pobdio tyrimai, tarpusavyje gali
bti sujungti vairs DNR molekuli galai (pavyzdiui, bukas ir lipnus), kurie neturi jokios homologijos arba turi tik keleto nukleotid (1 5 nt) homologij. Tyrimais rodyta, kad svetimos DNR siterpimas induoli lsteli genom vyksta gana lengvai ir nepriklauso nuo sek tarpusavio panaumo.
Nemaa dalis ios krypties tyrim buvo atlikta su SV40 transfekcija auginamas bedioni lsteles.
SV40, kurio genomas (5,2 kbp) yra dvigrands DNR pavidalo, turi tam tikr privalum tokiems darbams atlikti:
1. Kai SV40 genomas yra linijinis, viruso gyvenimo ciklas negali prasidti iki tol, kol galai nebus
sujungti ir nesusidarys iedin DNR molekul. Todl, terpus lstel linijin SV40 DNR, galima vertinti jos gebjim sujungti i DNR molekuli galus.
163

2. Kadangi SV40, bdamas aktyvus, sukelia lizs zon susidarym ant lsteli gazono, tai vieno
ar kito tipo DNR gal sujungimo efektyvum galima vertinti statistikai. Kiekviena tokia lizs
zona yra individualaus SV40 klono, atsiradusio po gal sujungimo, altinis. SV40 DNR gal
struktr galima keisti panaudojant restrikcijos endonukleazes. Todl, padauginus atskir
klon, galima itirti, kas vyko DNR molekulje jos gal sujungimo metu.
3. SV40 T antigeno intronas nesvarbus viruso dauginimuisi ir lsteli lizei. i 350 bp dydio
srit galima kelti polilinker ir restriktazi pagalba sukurti vairius SV40 DNR galus.
Tyrimo strategija, naudojant SV40 model, pavaizduota 116 paveiksle. Kaip minta anksiau, ie
tyrimai parod, kad tarpusavyje gali susijungti labai vairs DNR molekuli galai.
SV40 su polilinkeriu introne

Bgl Sac Xba Xho Sma

Skaldymas restriktazmis
Xba

Sma
CV1 lsteli trasfekcija ir gal
sujungimas

T antigeno raika
Lizs zona (dmel)

Individuali dmeli analiz

116 pav. vairios sandaros DNR gal sujungimo tyrimas panaudojant SV40

6.3.2. Nehomologiko DNR gal sujungimo mechanizmai

DGT susidaro dl fosfodiesterini jungi trki abiejose DNR molekuls grandinse. Juos gali
sukelti jonizuojamoji spinduliuot, tam tikros chemins mediagos (pavyzdiui, kai kurie prieviniai
vaistai). Dvigrandi trki gali atsirasti ir spontanikai DNR replikacijos metu. Lstelje susidarantys
laisvieji radikalai taip pat gali sukelti DGT. Dvigrandiai trkiai susidaro mejozs profazje, taip pat
limfini lsteli raidos metu vykstant V(D)J rekombinacijai. Judrieji genomo elementai taip pat gali
sukelti DGT. Pasak kai kuri mokslinink, induoli lstelje per dien susidaro bent 10 DGT (Harber, 2000). Nors DGT sukurti DNR galai topologikai primena natraliai egzistuojanius linijini
chromosom galus (eukariot telomerus), lstel juos vertina nevienodai. DGT labai pavojingos paaidos, nes laiku nepaalintos ar neteisingai itaisytos gali sukelti lstels t arba j paversti vine.
Kad apsisaugot nuo i pavoj, lstelse atsirado vairiausi DGT alinimo mechanizm. Trys pagrindiniai DGT alinimo mechanizmai yra jau ms aptarta homologin rekombinacija, viengrandi
164

gal susijungimo bdas bei NGS. Nors evoliuciniu poiriu tai labai konservatyvs mechanizmai, taiau j vaidmuo alinant DGT labai skiriasi emesniuosiuose ir auktesniuosiuose eukariotuose. induoli lstelse DGT itaisomi NGS ir HR bdu, mielse dominuoja HR. Kokiu bdu bus itaisyti
DGT, priklauso ir nuo organizmo raidos stadijos bei lastels ciklo stadijos. Pavyzdiui, raidos pradioje ir lstels ciklo G2 stadijoje alinant DGT svarbesn yra HR (Postawa ir Blasiak, 2003).
Ilg laik NGS buvo vertinamas kaip pagrindinis DGT alinimo bdas induoli lstelse. Dabar
tapo aiku, kad HR ia taip pat labai svarbi. Ypa alinant DGT, atsiradusius DNR replikacijos metu.
Paskaiiuota, kad apie 3050 proc. trki, sukelt sait-specifins nukleazs I-SceI induoli lstelse,
gali bti itaisoma HR, o likusieji NGS bdu.
Mutagen sukeliami DGT daniausiai negali bti sujungti tiesiogiai, todl danai j vietose stebimas DNR subrandinimas ir sintez. Dl to NGS danai slygoja klaidas pradinje nukleotid sekoje.
Tiek mieli, tiek induoli lstelse NGS vykti reikia t pai pagrindini komponent: prie DNR gal prisijungiani baltym Ku70 ir Ku80, DNR ligazs IV bei XRCC4. Stuburini lstelse dar reikalingas DNR-PKcs, kurio homolog mielse iki iol nesurasta. io proceso metu kepimo mielse dar
dalyvauja Rad50, Mre11 ir Xrs2, trys baltymai, kurie turi endonukleazin ir egzonukleazin aktyvumus.
Mieli kamienai, kuriuose nra veiklaus i trij baltym komplekso, nevykdo nehomologik DNR
gal sujungimo. Stuburiniuose MRE11-RAD50-NBS1 komplekso tyrim iame procese labai sunkina
tai, kad jis btinas lsteli gyvybinei veiklai. Lstels mutants, paprasiausiai neigyvena (Jackson,
2002). Jeigu mielse susidar laisvi dvigrandiai DNR galai nekomplementars, tai NGS pumpuruojaniose mielse nra efektyvus ir i paaid paalina tik dviejose lstelse i 1000. O induoli lstelse gali bti sujungiami iuo bdu bet kokie DNR galai. DGT alinimo sutrikimai susij su kai kuriomis mogaus paveldimomis ligomis: Nijmegen ir Bloomo sindromais, ataksija telangiektazija, krties
viu.
6.3.3. NGS induoli lstelse
Manoma, kad is bdas svarbiausias trkiams induoli lstelse alinanti. Prieingai nei HR nehomologik DNR gal susijungimui nereikalinga homologija ir tarpusavyje gali bti sujungti labai
vairs DNR galai (117 pav.). induoli lsteli linij, jautri JS, genetiniais tyrimais nustatyti baltymai, kurie dalyvauja NGS. Tokioms lsteli linijoms bdingas paeistas DGT itaisymas NGS bdu,
todl po j apvitos JS kaupiasi nereparuoti DGT ir lstels va. Pasinaudojus genetins komplementacijos reikiniu iose lstelse, nustatyti genai, kurie koduoja iam vyksmui svarbius baltymus. Nustatyta, kad XRCC5, XRCC6 ir XRCC7 genai koduoja nuo DNR priklausomos proteinkinazs (DNR-PK)
subvienetus. XRCC5 ir XRCC6 koduoja su DNR sveikaujanio DNR-PK Ku70/80 heterodimero 80 ir
70 kDa subvienetus, o genas XRCC7 DNR PK katalizin subvienet (DNR-PKcs). mogaus Ku70
baltymas yra apie 69 kDa, o Ku80 apie 83 kDa (Critchlow ir Jackson, 1998; Smith ir Jackson, 1999).
ie baltymai, j abiej kompleksas bei j kompleksas su DNR gauti kristal pavidalo ir nustatyta j
165

sandara (Walker ir kt., 2001). Baltymai yra iedo, umauto ant DNR gal, formos. DNR-PKcs yra ~
465 kDa, prisijungs prie DNR gal, turi serino/treonino kinazs aktyvum (Hammarsten ir kt., 2000).
Baltymas giminikas PIK kinazms. NGS reikalingas ir XRCC4/DNR ligazs heterodimeras. i ir
pagalbini baltym atliekamas NGS vyksta trimis etapais: 1) prisijungimas prie DNR gal ir tilto tarp
j sudarymas; 2) DNR gal subrandinimas; 3) ligavimas (118 pav.).

A
5

3
5

5
3

3
5

Ligavimas

Komplementars arba buki galai

B
5

5
3

3
5

DNR polimeraz

Bukas ir isikis 5'

galas

C
5

3
5

Ligavimas

5
3

3
5

5
3

DNR galus
ilygiuojantis baltymas

5' ir 3' isiki

galai
3

Ligavimas

DNR polimeraz

117 pav. Nehomologikas vairi DNR gal sujungimas (Postawa ir Blasiak, 2003). A komplementarius ar bukus DNR galus sujungia DNR ligaz; B buko ir 5 isikiusio galo papildomas
subrandinimo etapas; C 5 ir 3 isikiusi gal susijungimas ir ilygiuojantys baltymai, kurie
stabilizuoja sinaps ir dl kuri kiti baltymai, pavyzdiui, polimeraz, paveria galus tinkamais sujungti
Pirmiausia Ku baltymai jungiasi prie DNR gal. Galbt jie ir aptinka paeistas DNR vietas. Po to
Ku mobilizuoja DNR-PKcs DGT viet bei skatina pastarojo kinazin aktyvum. Nors pagrindiniai
DNR-PKcs vykdomo fosforilinimo taikiniai lstelje dar nenustatyti, taiau manoma, kad is baltymas
gali: 1) fosforilinti XRCC4 ir paalinti ligazs IV/XRCC4 kompleks nuo DNR gal, prie kuri prisijung Ku baltymai. Tai btina DNR gal subrandinimo etape; 2) valdyti Ku baltym atsijungim nuo
DNR gal; 3) fosforilinti Ku70 ir Ku80. Sudtingesni nekomplementari gal sujungimas susijs su
prie ligavim vykstaniu j subrandinimu ir polimerizacija. io proceso DNR gal subrandinimo stadijoje taip pat dalyvauja nukleazs ir DNR polimerazs. Pavyzdiui, nukleazs paalina isikiusius
viengrandius galus, o polimerazs upildo viengrandius tarpus. Nukleazinis kompleksas
Mre11/Rad50/Nbs1 gali dalyvauti tiek DNR gal subrandinimo valdyme, tiek j apsaugoje nuo skaldymo, signalizuoti apie DGT susidarym. Gal subrandinime dar gali dalyvauti egzonukleaz FEN-1
bei helikazs WRN ir BLM. Galiausiai treiajame NGS etape susiformuoja patvarus DNR ligazs IV ir
XRCC4 kompleksas, kurio reikia kovalentinms jungtims tarp DNR gal susidaryti.
166

DGT
Yku70/80 prisijungimas

DNR-PKCS/Artemis mobilizacija
ir kinazs aktyvacija

DNR-PK vykdomas
baltym fosforilinimas

DNR gal nukleazinis

subrandinimas
fosforilinimas
Tarp upildymas

Ku70
Ku80

DNR ligazs IV ir XRCC4

mobilizacija, DNR spirals
grandini sujungimas

DNR-PKcs
Artemid (Artemis)
Pol
DNR ligaz IV
XRCC4

118 pav. DGT alinimas nehomologini DNR gal susijungimo bdu induoli lstelse (Dudov ir kt., 2004)
Intensyvs tyrimai iaikina vis naujas io proceso detales. Tiriant mogaus SCID lsteles aptikta
mutacija naujame gene, koduojaniame baltym Artemis. Baltymas svarbus limfini lsteli diferenciacijai kaul iulpuose. Jis turi 5 egzonukleazs aktyvum, todl galbt dalyvauja DNR gal subrandinime. Artemis ir DNR-PKcs kompleksas skaldo isikiusius 5 ir 3 vgDNR galus. is endonukleazs aktyvum turintis baltymas, matyt visikai paalina 5 vgDNR galus, o 3galai sutrumpinami iki
keturi nukleotid. Kitas baltymas polinukleotidkinaz (PNK), tikriausiai dalyvauja NGS mogaus
lstelse. Kadangi pataloginiai DGT, susidar dl JS ar laisvj radikal, sukuria netinkamus sujungimui DNR galus, tai PNK, prireikus, fosforilina 5galus. Be to, nustatyta, kad nebaltyminis veiksnys,
inozitolo fosfatas (IP6), gali specifikai sveikauti su Ku70/80 ir skatinti DNR gal sujungim in vitro.
Manoma, kad bus atrasti ir nauji NGS dalyvaujantys veiksniai.
NGS gen ijungimas gyvnuose arba j lsteli kultrose nulemia jautrum JS, taiau beveik nepakeiia jautrumo tiems mutagenams, kurie nesukelia DGT. Mutantuose sutrinka V(D)J rekombinacija. Tai rodo, kad NGS baltymai dalyvauja iame procese. Tokiuose organizmuose pasireikia SCID.
Iki iol nenustatyta, kad mogus turt paeistus Ku ar DNR-PKcs genus. Taiau inomi SCID sergantys asmenys, kuri Artemids genas mutavs. DNR-PKcs -/- pels iorikai normalios, o Ku -/- pels
yra maos, anksti sensta (Ferguson ir Alt, 2001). Tai rodo, kad Ku dalyvauja didesniame rekombinacijos/reparacijos vyki skaiiuje nei DNR-PKcs. Netikta buvo tai, kad mutacijos pels DNR ligazs IV
167

ar XRCC4 genuose sukelia embrion t. Vienas i pastebt sutrikim tokiuose peli embrionuose
naujai susidarani neuron apoptoz. natraliai kylant klausim, kodl ie du baltymai svarbesni u
Ku, bandoma atsakyti remiantis iniomis apie NGS mechanizm. Lstelse, kurios neturi DNR ligazs
IV ar XRCC4, Ku ir DNR-PKcs vis tiek jungiasi prie DNR gal DGT vietoje. Susidar neveikls
kompleksai slopina tolesn DGT reparacij. Ku -/- lstelse DGT itaisymas gali vykti, kad ir silpniau,
kitais bdais, kurie gali kompensuoti NGS nebuvim. Tai patvirtina ir viiuko lsteli linijos DT40
tyrimai. LIG4 -/- lstels jautresns JS nei Ku70 -/- lstels. Taiau LIG4-/-|Ku70 -/- dvigub mutacij
turinios lstels yra panaaus jautrumo kaip ir Ku70 -/- (Adachi ir kt., 2001). Kai DNR-PKcs arba Ku
neaktyvs peli lstelse, tai atsiranda polinkis susirgti limfoma. Kadangi mons, turintys paaidas
i baltym genuose, iki iol neiaikinti, tai manoma, kad i gen ijungimas nesuderinamas su
mogaus igyvenimu. poir patvirtina ir lsteli linij tyrimai. mogaus Ku70 -/- lstels greitai
va, nes jos beveik nesidalija ir patiria apoptoz. Taiau ligazs IV neveikimas lsteli nenuudo, o
padidina j jautrum JS. Visa tai rodo, kad gyvn lsteli mutant pagal NGS genus igyvenimas dar
priklauso ir nuo j tipo.
6.3.4. NGS mielse
Mielse tai ne pagrindinis DGT alinimo bdas. Kaip minta anksiau, svarbiausias yra HR mechanizmas. Gen ijungimo eksperimentai atskleid, kad svarbiausi NGS komponentai konservatyvs
tiek mielse, tiek induoliuose (11 lentel, 119 pav.) Yra ir tam tikr skirtum, susijusi ne tik su paties mechanizmo svarba lstelje, bet ir su jo enzimologija (Daley ir kt., 2005). Pirma, mielse nra
induoli DNR-PKcs homologo. Antra, iuose organizmuose, sujungiant nehomologikus DNR galus,
svarb vaidmen atlieka Rad50/Mre11/Xrs2 kompleksas, kurio reikm HR analizavome anksiau (r.
skirsn 2.3.2.4.1). iuos baltymus koduojani gen suardymas mieli lstelse sukelia tokius paius
sutrikimus kaip ir YKU70, YKU80 ir DNL4 ijungimas.
11 lentel. Bakterij, mieli ir mogaus lsteli svarbiausi baltymai, kurie dalyvauja NGS (Postawa ir Blasiak, 2003)
Bakterijos
Miels
mogaus lstels
Yko U
Yko70/80
Ku70/80
DNR-PKcs

Rad50/Mre11/Nbs1
Rad50/Mre11/Xrs2
SbcC/SbcD/
Sir2/Sir3/Sir4
Sir2A//

Dnl4
LigIV
YkoV
Lif1, Lif2
XRCC4

Nej1

Neabejotinai Ku yra svarbiausi NGS baltymai, nes jie gaminami tiek bakterij, tiek mogaus lstelse (Doherty ir kt., 2001). Eukariot Ku yra heterodimeras, kurio subvienetus koduoja du genai, atsirad dl geno pradininko duplikacijos. mogaus lsteli Ku baltym homologai kepimo mielse vadinami Yku70 ir Yku80, nors abu yra apie 70 kDa dydio. Mieli NGS taip pat reikia DNR ligazs, ku168

ri koduoja DNL4 genas. Fermentas, matyt, atlieka tik i vienintel funkcij, kuri lemia jo gebjimas
prisijungti prie Ku-DNR gal komplekso. induoli DNR ligaz IV tiesiogiai sveikauja su XRCC4
baltymu. Mielse io baltymo homologas vadinamas Lif1 (Herrmann ir kt., 1998). XRCC4 savo sandara primena Rad50, nes turi sferos pavidalo galv bei spirals formos uodeg (Sibanda ir kt., 2001), kuria XRCC4 jungiasi prie ligazs. Nors XRCC4 ir Lif1 nelabai panas, centrinis Lif1 rajonas, kuris
jungiasi prie Dnl4, yra panaios sandaros. Taip pat Lif1 C galo dalis sveikauja su Xrs2 baltymu. Be
to, atrastas ir Lif2 veiksnys, kuris sveikauja su Lif1. Mutacija LIF2 gene maina DGT reparacijos aktyvum madaug tiek pat kaip ir mutacijos LIF1 bei DNL4 genuose. Efektyviam NGS mielse dar reikalingas Nej1 (angl. nonhomologous end joining regulator 1). NEJ1 geno mutantuose, palyginti su
laukinio tipo lstelmis, NGS sumaja atuonis kartus. dnl4/nej1 dvigubuose mutantuose gal sujungimo efektyvumas toks pat kaip ir pavieniuose mutantuose. Nej1 baltymas sveikauja su Lif1 baltymo
sferine galva. Taiau tiksli baltymo funkcija nenustatyta (Daley ir kt., 2005).
Dar keletas mieli baltym dalyvauja subrandinant DGT galus. Vienas i j Pol4 polimeraz. is
baltymas savo N gale turi BRCT domen, kuriuo sveikauja su Dnl4. Isamesni tyrimai rodo, kad Pol4
dalyvavimas labai priklauso nuo DNR gal savybi (Daley ir kt., 2005). Pol4, kaip ir induoli Pol
bei Pol, turi unikali savyb upildyti isikiusius 3galus. Taiau DGT, turini isikiusius
viengrandius 5galus, reparacijai is baltymas nereikalingas. Rad27, homologikas induoli FEN1,
endonukleolitikai skaldo nukarusius 5galus. Jis tiek fizikai, tiek funkcikai sveikauja su Pol4 ir
Dnl4/Lif1. Rad27 ir Pol4, matyt, veikia subrandinant ir upildant 5galus NGS reakcijoje. Mieli 3
NGS nukleazs iki iol nenustatytos. induoli lstelse, manoma, darb atlieka Artemis (Ma ir kt.,
2002). Taiau, atrodo, kad jai artimiausias mieli homologas Pso2/Snm1, susijs tik su segtuk ir
skersini ssiuv reparacija. Mre11 turi 35 egzonukleazs aktyvum, taiau ar dalyvauja NGS
subrandinant 3galus, neaiku.
SIR2, SIR3 ir SIR4 dalyvauja nuslopinant genus mielse. J delecijos taip pat sumaina NGS
efektyvum, taiau is poveikis netiesioginis. Kadangi ie baltymai aptinkami DNR paaid vietose ir
sveikauja su Ku baltymais, galima manyti, kad dl j geriau prie DNR gal prieina fermentai ir (arba)
Yku70/80 kompleksas.

169

119 pav. Saccharomyces cerevisiae NGS modelis (Dudov ir kt., 2004): A paprastas DNR gal sujungimas NGS bdu; B DNR gal subrandinimas prie sujungim. Jeigu galai nra komplementars, prie sujungim jie subrandinami upildant tarpus (Pol4) arba skaldant juos (Rad27)

6.3.4.1. Mieli NGS reakcijos modelis

Ikart po DGT susidarymo ir iki DNR 5galo subrandinimo prie DNR molekuli gal jungiasi
MRX baltym kompleksas (119 pav.). iuo momentu Ku taip pat turi jungtis prie laisv DNR gal i
abiej trkio pusi. Kokia mint baltym prisijungimo tvarka, neaiku. MRX gali sudaryti tiltel tarp
DNR molekuls (-i) fragment in vitro nebtinai prisitvirtins prie j gal, o Ku turi jungtis btent
prie j. Po to Yku80 ir Xrs2 prisijungia atitinkamai: Dnl4 (Lig4) ir Lif1 (Daley ir kt., 2005) bei mobilizuoja Pol4. Susidars kompleksas turi bti lankstus, nes gali bti reikalinga DNR gal korekcija.
lankstum, matyt, utikrina Lif1 spiralin uodega, Yku80 C galas ir Ku translokacijos. Toliau DNR
galai sugretinami ir j nukleotidai suporuojami, po to DNR grandys sujungiamos dalyvaujant ligazei.
DGT vietoje bna dvi Dnl4 molekuls. Manoma, kad pradioje sujungiama tik viena DNR duplekso
grandin, po to ir kita. Jeigu atkurti fosfodiesterins jungties nepavyksta, tai Dnl4, matyt, gali mobilizuoti papildomus baltymus DNR gal subrandinimui.
170

6.3.5. Nehomologik DNR gal sujungimo bdai

NGS danai vertinamas kaip DGT itaisymo bdas, palankus atsirasti mutacijoms. Ypa tais atvejais, kai galai susijungia mikrohomologijos sritimis. Taiau NGS gali vykti ir be klaid. iuo metu teigiama, kad galimi du NGS keliai (Liang ir kt., 2005). Pirmasis, kuriame dalyvauja Ku ir DNR-PKcs
bei ligazs IV XRCC4 kompleksas, vyksta be klaid. DNR molekuli galai susijungia labai tiksliai.
Eksperimentai rodo, kad is kelias danesnis mielse ir induoli lstelse (Budman ir kt., 2005). Pavyzdiui, sujungiant isikiusius 4 bp galus, neteisingo nukleotid suporavimo tikimyb yra tik 1 proc.
Jeigu vienu metu susidaro DGT keliose vietose, gali bti sujungiami netinkami DNR galai, susidaryti
translokacijos. Taiau ir iuo atveju klaidos tikimyb tik keletas nuoimi. Taiau egzistuoja ir jam
alternatyvus kelias (120 pav.). Jis nustatytas stuburini gyvn mutantini lsteli kamienuose. Pavyzdiui, grauik lsteli, neturini Ku80 baltymo, linijoje xrs6 taip pat vyksta DNR gal susijungimas, tik jis yra netikslus. is kelias aptiktas ir XRCC -/- ir ligaz IV -/- induoli lsteli linijose.
Tai rodo, kad egzistuoja nuo Ku nepriklausomas klaidas links daryti DNR gal susijungimo mechanizmas.

120 pav. Du NGS keliai (Liang ir kt., 2005)

Pagrindin io mechanizmo ypatyb nukleotid praradimas DNR galuose bei mikrohomologijos
panaudojimas sujungiant DNR molekules. Todl literatroje jis apibdinamas kaip su mikrohomologija susijs gal susijungimas (angl. microhomology mediated end joining, MHEJ). iame procese, manoma, dalyvauja nukarusi vgDNR gal endonukleaz I (FEN1).

171

7. T-DNR rekombinacija
Augal molekulins biologijos ir biotechnologijos suklestjimas labai susijs su augal transformacijos, kuri sukelia Agrobacterium, atradimu ir panaudojimu. i bakterija geba perneti savose
plazmidse (Ti ar Ri) esanios DNR atkarp augalo lsteli branduolio genom. Perneama DNR vadinama T-DNR (angl. transfered DNA). i savyb panaudojama gen ininerijoje augal terpiant
naujus genus, taip pat tiriant augalo gen funkcijas j ijungimo bdu. Rekombinacijos poiriu TDNR siterpimas augalo genom yra labai savitas reikinys. T-DNR yra didelje (~ 200 kbp) pTi
(angl. tumour inducing plasmid) plazmidje. Atsakingi u jos perneim genai yra u T-DNR rib. Pati
T-DNR yra gana didel ir gali talpinti deimtis gen (Gelvin, 2003). Vieninteliai cis veikiantys elementai yra dvi 25 bp ilgio isigim pasikartojanios vienakrypts sekos, esanios i abiej perneamos
DNR rib. Kadangi T-DNR nra pernaai reikaling gen, j gali bti terpiami vairs transgenai ir
reguliacins sekos. Pati pernaa yra gana sudtinga ir gali bti suskirstyta bakterin ir augalin etapus.
Bakterinis etapas tikriausiai kils i konjugacijos, nes j mechanizmas ir dalyvaujantys baltymai labai
panas. Augalinis etapas apima vykius nuo T-DNR patekimo augalo lstel iki jos siterpimo genom.
Agrobacterium puola paeistus augalo audinius, kuri aizdos iskiria tam tikrus fenolinius junginius. ios mediagos sukelia bakterijos chemotaks paeisto audinio link. Bakterijos lstels prisitvirtina prie eimininko lsteli sienels (121 pav.). ia vyksta tarpusavio atpainimas, kuriame dalyvauja
tiek bakterijos, tiek augalo baltymai. I augalo receptori pamintinas vitronektino tipo baltymas.

121 pav. Agrobacterium tumefaciens prisitvirtinusi prie augalo lstels.

http://depts.washington.edu/agro/index ; microbewiki.kenyon.edu/index.php/Agrobacterium
domu tai, kad j, kaip specifin receptori, naudoja ir daug induoli patogen. Augalo iskiriamus fenolius bakterija atpasta, naudodama dviej komponent sistem. Membranoje esantis VirA
baltymas veikia kaip jutimin kinaz, kuri, aktyvuojama augalo jungini, vykdo autofosforilinim
(122 pav.). Po to VirA fosforilina VirG. is atsako reguliatorius aktyvuoja vairius vir genus. Augalo
gaminami junginiai gali ne tik aktyvuoti, bet ir slopinti i signalin grandin. Taip daugelis augal
ri apsisaugo nuo agrobakterijos infekcijos. Vir gen raika sukelia T-DNR paruoim, kanallio
tarp bakterijos ir augalo lstels susidarym ir DNR perna (122 pav.). T-DNR paruoim pradeda
172

VirD2 ir VirD1 baltymai. Sveikaudami tarpusavyje, jie veikia kaip sait-specifin endonukleaz. Sukls viengrand trk, VirD2 kovalentikai prisijungia prie vgT-DNR 5galo. Susidaro dar nesubrandintas T-DNR kompleksas. J nuo T-DNR rajono tikriausiai atskiria viena i daugelio bakterijos helikazi.
Todl plazmidje susidaro viengrandis tarpas. J greitai paalina bakterijos reparacijos sistema. Mobilizuot vgT-DNR molekul subrandina (supakuoja) VirE2 tuiavidures cilindro formos filamentines
struktras. VirE2 dengia vgT-DNR. Taip pastaroji apsaugoma nuo nukleazi ir tinka keliauti eimininko lstels branduol.

122 pav. T-DNR perneimo augalo branduol schema. LB, RB kairioji ir deinioji T-DNR ribos;
BPK branduolio poros kompleksas (Ziemienowicz, 2001).
Tiksli T-DNR komplekso susidarymo vieta dar neinoma (Tzfira ir Citovsky, 2002). T-DNR ir
Vir baltym pernaa vyksta dalyvaujant IV tipo sekrecijos sistemai. Ji sudaryta i 12 baltym, kurie
suformuoja du funkcinius darinius: virulentik pili ir neiklio kompleks. Pastarasis substratus pernea per lstels membran. Agrobakterijoje neikl sudaro virD4 geno ir 11 virB operono gen koduojami baltymai. I pastarj VirB1, VirB2 ir VirB5, matyt, sveikauja su eimininko lstels receptoriais. Neatmetama galimyb, kad VirD2, VirE2 ir VirF gali bti perneami nepriklausomai nuo virB
operono.
173

eimininko lstelje T-DNR kompleksas turi patekti branduol. Tai aktyvus procesas, kuriame
svarbs VirE2 ir VirD2 baltymai. Su jais sveikauja ciklofilino aperono eimos baltymai RocA, Roc4
ir CypA. Jeigu slopinama VirD2-CypA sveika, agrobakterija praranda gebjim sukelti auglius (123
pav.). Galbt augalo aperonai padeda VirD2 baltymui ilaikyti tam tikr erdvin sandar. VirE2 sveikauja su kitais augalo baltymais VIP1 ir VIP2.

123 pav. A. tumefaciens sukeltas auglys ant pelargonijos stiebo

microbewiki.kenyon.edu/index.php/Agrobacterium

7.1. sijungim skatinantys augalo veiksniai

augalo genom sijungia ne visos T-DNR molekuls, taiau procentikai daugiau nei kitais metodais terpiant DNR. Galbt tai nulemia T-komplekse esantys VirD2 ir VirE2 baltymai. Manoma, kad
VirD2 gali daryti tak sijungimo efektyvumui ir tikslumui. Laukinio tipo T-DNR raika augalo lstelse nulemia augli susidarym, nes skatina hormon (auksin, citokinin) ir jungini, vadinam opinais, gamyb. Pastarieji yra aminorgi ir fosforilint angliavandeni dariniai ir skirstomi du tipus:
oktopinus ir napalinus. Kadangi opinus gali sisavinti tik agrobakterija, tai ji sau sukuria ekologin ni, kuri niekam daugiau negali priklausyti. virF lokusas bdingas tik oktopinus koduojanioms Ti
plazmidms. Manoma, jis sprendia galim eiminink rat.

7.2. T-DNR sijungimas augalo lstels genom

T-DNR subrandinimas ir perneimas augal neblogai itirtas, taiau jos siterpimo augalo
chromosomas mechanizmai iki iol neaiks (Li ir kt., 2005; Loyter ir kt., 2005). T-DNR esanti informacija (pavyzdiui, transgenai) patiria maiau pokyi integracijos genom metu nei naudojant kitus
metodus (polietilenglikol, elektroporacij, liposomas, gen patrank) (Gelvin 2003). Todl, dirbant
iuo metodu, iek tiek maesn genetinio nestabilumo rizika. Visi ankstesni tyrimai, atlikti vairiuose
modeliniuose augaluose, rodo, kad T-DNR sijungia nedsningosios rekombinacijos bdu (Gheysen ir
kt., 1991, Brunaud ir kt., 2002). A. thaliana toki sijungimo viet analiz parod, kad jos daugma
pasiskirsiusios tolygiai visose penkiose chromosomose, taiau daug reiau siterpimas vyksta centromer srityse. Nustatyta apie 40 proc. siterpim genus. Intronuose siterpimai danesni, palyginti su
egzonais. Tiriant T-DNR rekombinacij atlikta nemaai eksperiment, kuri rezultatus apibendrina du
174

modeliai (Mayerhofer ir kt., 1991). Kadangi neaiku, ar rekombinacijoje dalyvauja vgT-DNR ar dgTDNR, tai vienas j vadinamas dvigrandi trki modeliu, kitas vgDNR tarpo reparacijos modeliu.
Pirmasis modelis teigia, kad vyksta dgT-DNR integracija DGT viet augalo genome. T-DNR galai
iek tiek ivyniojami ir jungiasi su augalo DNR i abiej trkio pusi. Antrasis modelis teigia, kad rekombinacija prasideda viengrandiu DNR trkiu, po to augalo DNR susidaro viengrandis tarpas ir ioje vietoje sijungia vgT-DNR. Manoma, kad abiem atvejais VirD2, sveikaudamas su augalo baltymais, dalyvauja atpastant trki vietas. iuos modelius tobulino kiti mokslininkai. Pavyzdiui, Tinlandas (Tinland) ir kolegos mano, jog rekombinacijos vieta labiausiai priklauso nuo T-DNR 3galo.
Pasak j, rekombinacija prasideda, kai i T-DNR vieta atpasta maas homologijos sritis virutinje
augalo DNR grandinje (Tinland ir kt., 1995). Tada apatinje augalo DNR grandinje atsiranda viengrandis trkis ir jo vietoje VirD2 prijungia vgT-DNR 5gal. Nukars T-DNR 3galo fragmentas (iki
homologijos vietos) paalinamas, o antrj terptos T-DNR grandin sintetina augalo reparacijos sistema (124 pav.) (Tinland ir Hohn, 1995). ie samprotavimai pagrsti eksperiment rezultatais:
1) T-DNR augalo lstel perneama vgDNR pavidalo (Tinland ir kt., 1994); 2) nukleotid sek tarp
T-DNR 3galo ir rekombinacijos vietos palyginimas rodo, kad tarp j egzistuoja keleto nukleotid ilgio homologijos sritis (Tinland ir kt., 1995; Brunaund ir kt., 2002). Pavyzdiui, atlik 9000 rekombinacijos viet analiz, Brunaund ir kt. nustat, kad T-DNR linkusi siterpti genomo rajonus, kurie turtingi A-T. Tarp vgT-DNR kairiojo (3) galo ir augalo DNR susidaro trumpas DNR dupleksas. Be to
jame vyksta delecijos. Deinysis vgT-DNR galas taip pat poruojasi su augalo DNR, sudarydamas kit
DNR dupleks i 2-3 bp (124 pav.); 3) VirD2 bna prisijungs prie vgT-DNR 5galo (Ward & Barnes,
1998; Young ir Nester, 1988), skaldo ir liguoja DNR in vitro (Panseqrou ir kt., 1993); 4) mutacijos
virD2 gene sukelia netiksl T-DNR 5galo sijungim (Tinland ir kt., 1995). Taiau is modelis negali
paaikinti sudting T-DNR siterpimo atvej (Krizkova ir Hrounda, 1998) bei greitos T-DNR raikos
(Li ir kt., 2005). Tai lengviau bt galima sivaizduoti darant prielaid, kad rekombinacijoje dalyvauja
dgT-DNR. Kad egzistuoja tokia dgT-DNR, tiesiogiai rodo eksperimentai su mieli endonukleaze ISceI (Tzfira ir kt., 2003). ie eksperimentai parod, kad T-DNR pirmiausia jungiasi endonukleazs
sukelt DGT vietas. Be to, pati T-DNR, kuri turjo I-SceI atpainimo sek, buvo daniausiai jungiama
augalo genom tik suskaldyta io fermento. Kadangi I-SceI endonukleaz skaldo tik dgDNR, tai akivaizdu, kad prie rekombinacij vgT-DNR buvo paveriama dgT-DNR.

175

124 pav. T-DNR integracijos augalo genom modelis. Patogumo dlei pavaizduota tik virutin
augalo DNR molekuls grandin, T(n) T turtingas rajonas, kuris, manoma, yra tinkama vieta
kairiojo (3) T-DNR galo rekombinacijai. Galbt is T-DNR galas ieko tinkamos vietos, kol randa nedidel homologik sek ikart u T turtingo rajono. Susidaro trumpas skirtingos kilms
DNR molekuli dupleksas; (2) eimininko DNR molekulje emiau homologijos vietos sukeliamas viengrandis trkis. Dl jo atsirads 3-OH galas yra pradmuo DNR sintezei per T-DNR tol, kol
pasiekiamas jos deinysis (5) galas, prie kurio prisitvirtins VirD2 baltymas. Naujai susintetintos
dgT-DNR siterpimas augalo DNR daniausiai susijs su eimininko DNR delecijomis. T-DNR rekombinacija su eimininko DNR sukelia T-DNR 3galo fragmento delecij (1). Deinysis T-DNR
galas siterpia eimininko DNR labai tiksliai. (1) ir (3) endonukleazi veikimo vietos (Brunaud ir
kt., 2002)
Pati T-DNR rekombinacija augale, matyt, vyksta nedsningosios rekombinacijos (NGS) bdu.
Dabar jau pripastama, kad Agrobacterium baltymai negali vykdyti DNR reparacijos, todl T-DNR
integracij aptarnauja eimininko baltymai. Pavyzdiui, mielse T-DNR integracija vyksta HR ir NGS
bdu (Van Attikum ir Hooykas, 2003). Kadangi augaluose dominuoja nehomologin rekombinacija,
tai iuo bdu turt vykti T-DNR rekombinacija. rodyta, kad rekombinacijos metu prie dgT-DNR
jungiasi augalo KU80 baltymas, kuris yra svarbus NGS (Li ir kt., 2005). A. thaliana ku80 -/- mutanto
somatinse lstelse nevyksta T-DNR rekombinacija, o esant io geno perraikai, vairenio augalai jautresni Agrobacterium infekcijai bei atsparesni DNR paaidas sukeliantiems veiksniams.

176

8. RNR rekombinacija
1962 m. nustatyta, kad tarp giminik poliovirus genom vyksta apsikeitimas genetiniais ymenimis. Madaug tuo pat metu atrasta RNR replikaz polimeraz, kuri gali sintetinti RNR ant RNR
matricos. 1965 m. Q replikaz buvo panaudota RNR pagausinimui nelstelinje sistemoje. Nors tai ir
buvo RNR rekombinacijos tyrim pradia, taiau dar ilgai jos mechanizmai ir mastai buvo neaiks.
Skirtingai nei DNR rekombinacijos atveju nenustatyta specifini gen, valdani proces. Kadangi
nebuvo nelstelini eksperimentams tinkam sistem, tai RNR rekombinacija buvo stebima tik in vivo
ir visada egzistavo galimyb, kad ji vyksta ne tarp RNR molekuli, o tarp j cDNR kopij (Chetverin,
1999). Be to, ilg laik vyravo nuomon, kad RNR rekombinacija vyksta tik replikacijos matric kaitos bdu (Nagy ir Simon, 1998).
RNR rekombinacija buvo msl daugiau nei tris deimtmeius po jos atradimo. Dabar padaryta didiul jos tyrim paanga ir jau aiku, kad ios rekombinacijos mechanizmai labai vairs. Vyraujantis
RNR rekombinacijos tipas nedsningoji rekombinacija. Ji susijusi su keleto ri transesterifikacijos
reakcijomis, kurias vykdo paios RNR molekuls, arba proces katalizuoja tam tikri baltymai. Kadangi homologin rekombinacija vyksta molekuli homologijos vietose, tai is rekombinacijos bdas
saugo genomo sandar, o nedsningoji rekombinacija keiia j. Kadangi viruso genomo didij dal
sudaro jam gyvybikai svarbs genai, dauguma nedsningj (nehomologini) rekombinant paprasiausiai neigyvena. Dl ios prieasties ilgai vyravo klaidinga nuomon, kad RNR rekombinacija daniausiai vyksta homologins rekombinacijos bdu. ios rekombinacijos danis labai skiriasi
vairiuose virusuose. Pavyzdiui, kryminantis vairi serotip koronavirusams ir pikornavirusams jis
siekia 10-5/nukleotidui (nt), taiau RNR faguose jis labai maas ir tesiekia 10-11/nt. Nedsningosios rekombinacijos danis daugelyje RNR virus buvo panaus ir siek 10-5/nt (Chetverin, 1999). Kad nra
koreliacijos tarp homologins ir nedsningosios RNR rekombinacijos, rodo, jog tai visikai skirtingi
procesai. 1997 m. buvo sukurtos pirmosios nelstelins sistemos RNR rekombinacijai tirti. Viena i j
pasiymi iskirtinmis savybmis, nes proces galima grietai kontroliuoti nuo pradios iki galo
(Chetverin ir kt., 1997). i sistema sudaryta i RNR bakteriofago Q replikazs, tam tikros sandaros
RNR molekuli fragment, turini specifines 5 ir 3 galines sekas, kuriose yra polimerazs atpainimo saitai, ir rNTP. Q replikazs gali pagausinti tik RNR molekul, turini ias specifines 5 ir 3
sekas, ir taip sudaryti RNR molekuli kolonij (125 pav.). Pagal i metodik galima gauti atskiras
molekuli kolonijas, uneus tinkam RNR ant agarozs gelio, kuriame yra replikaz ir rNTP.

177

Membrana su
rNTP
5 fragmentas
3 fragmentas
Agaroz su Q replikaze
Svetimos RNR
fragmentai

Rekombinacija

Besireplikuojanti rekombinatin RNR

Vienas
fragmentas

Abu RNR
fragmentai

125 pav. RNR rekombinacijos tyrimo sistema pagal Chetverin. RNR kolonijos agarozs gelyje,
turiniame Q replikaz ir rNTP. Kolonijos irykintos panaudojus hibridizacij su ymtu zondu.
http://rna.protres.ru/rus/#Molecular proc.20Colony

Siekiant gauti kompaktikas kolonijas, RNR molekuls uneamos ant agarozs, turinios replikaz ir padengiamos nailono membrana impregnuota rNTP (Chetverin ir kt., 1997). RNR rekombinacijai
tirti substratais naudojami atskirti vienas nuo kito RQ (angl. replicable by Q) RNR 5 ir 3 fragmentai. Molekulin kolonij galima gauti tik tada, kai RNR fragmentai rekombinacijos bdu susijungs
vien molekul. Pagal susidaranias RNR kolonijas sprendiama apie rekombinacijos dan ioje sistemoje tam tikromis slygomis, o ityrus kolonij sudaranias molekules, galima nustatyti, kokiu bdu
vyko rekombinacija. Kadangi RNR kolonijos susidarydavo, tai akivaizdiai rod, kad RNR rekombinacija gali vykti be DNR tarpininko. RNR rekombinacijos danis, naudojant Q replikaz, lygus 10-5
10-4/nt. Rekombinant sekoskaita parod, kad jie susidar nehomologins rekombinacijos bdu. Homologins rekombinacijos bdu rekombinantai susidarydavo, kai sistem buvo terpiama dNTP ir
atvirktin transkriptaz. is fermentas vykdo homologin rekombinacij matric kaitos bdu. RNR
rekombinacijos mechanizmas, esant Q replikazei, skiriasi nuo matric kaitos mechanizmo. Toki rekombinant struktros tyrimai parod, kad j susidarymas vyksta transesterifikacijos reakcijos metu.
iuo atveju 5 RNR fragmento 3-OH galas atakuoja 3 fragmento fosfodiesterines jungtis ir sudaro
naujas. i reakcija nevykdavo, jeigu 5 fragmento 3-OH grup bdavo paalinama (Chetverin, 1999;
Chetverin, 2004). Kai reakcijoje nedalyvaudavo Q replikaz ir rNTP, fragment rekombinacija buvo
keletu eili retesn. Tai rod, kad replikaz kakokiu bdu katalizuoja RNR molekuli rekombinacij.
Savaimins RNR rekombinacijos mechanizmas buvo visikai kitoks. ioje rekombinacijoje dalyvauja
ne 3-OH, o 2-OH grups. Panaios savaimins reakcijos vyksta ir in cis, todl RNR molekulse buvo
aptinkamos delecijos. RNR savaime yra rekombinogenika ir rekombinacijai be jos paios tereikia
Mg2+ jon. Tokios rekombinacijos danis labai maas ir siekia 10-9 h-1 vienai nukleotido jungiai
37C temperatroje. Tokie spontaniki RNR persitvarkymai gali bti svarbs RNR ir DNR genom
178

evoliucijai. Jeigu lstels baltymai j ir nepadidina, esamo danio pakanka, kad mogaus lstelje
kiekvien minut susidaryt nauja rekombinantin RNR. Per vis mogaus gyvenim jo kne gali susidaryti iki 1020 rekombinantini RNR molekuli. Net neymios j dalies atvirktin transkripcija ir
integracija gali sukelti mogaus genomo pokyius.
Rekombinacija gali didinti virus patogenikum. Buv ne tokie kenksmingi virusai po rekombinacijos gali tapti labai virulentiku kamienu. Pavyzdiui, taip atsirado labai virulentikas ,,Hong Kongo tipo gripo virusas. Tokie persitvarkymai yra labai pavojingi. Aprayti keli atvejai, kai poliomelit
sukl vakcinoje buvusi virus neurovirulentiniai revertantai. Reversijas daniausiai sukelia genetins
keli poliovirus serotip, paprastai einani vakcin sudt, rekombinacijos.

Literatra
1.

Adachi N, Ishino T, Ishii Y, Takeda S, Koyama H (2001) DNA ligase IV-deficient cells are
more resistant to ionizing radiation in the absence of Ku70: implications for DNA doublestrand break repair. Proc Natl Acad Sci USA 98: 12109-12113.

2.

Adams DE, Tsaneva IR, West SC (1994) Dissociation of RecA filament from duplex DNA
by the RuvA and RuvB DNA repair proteins. Proc Natl Acad Sci USA 91: 99019905.

3.

Adams MM, Carpenter PB (2006) Typing the loose ends together in DNA double strand break repair with 53BP1. Cell Division 1:19.

4.

Agarwal S, Roeder GS (2000) Zip3 provides a link between recombination enzymes and synaptonemal complex proteins. Cell 102: 245-255.

5.

Ajima J, Umezu K, Maiki H (2002) Elevated incidence of loss of heterozygosity (LOH) in an

sgs1 mutant of Saccharomyces cerevisiae: roles of yeast RecQ helicase in suppression of
aneuploidy, interchromosomal rearrangement, and the simultaneous incidence of both events
during mitotic growth. Mutat Res 504: 157-172.

6.

Anderson DG, Churchill JJ, Kowalczykowski SC (1997) Chi-activated RecBCD enzyme

possesses 5'3' nucleolytic activity, but RecBC enzyme does not: Evidence suggesting that
the alteration induced by Chi is not simply ejection of the RecD subunit. Genes Cells 2:11728.

7.

Anderson LK, Hooker KD, Stack SM (2001) The distribution of early recombination nodules
on zygotene bivalents from plants. Genetics 159: 1259-1269.

8.

Arabidopsis-Genome-Initiative (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering

plant Arabidopsis thaliana. Nature 408: 796-815.

9.

Aravind L, Koonin EV. (2001) Prokaryotic homologs of the eukaryotic DNA-end-binding

protein Ku, novel domains in the Ku protein and prediction of a prokaryotic double-strand
break repair system. Genome Res. 11: 1365-74.

10. Assenmacher N, Hopfner KP (2004) MRE11/RAD50/NBS1: complex activities. Chromosoma 113: 157-166.
11. Barbour SD, Nagaishi H, Templin A, Clark AJ (1970) Biochemical and genetic studies of recombination proficiency in Escherichia coli. II. rec+ revertants caused by indirect suppression
of rec- mutations. Proc Natl Acad Sci USA 67:128-135.

179

12. Bass HW, Riera-Lizarazu O, Ananiev EV, Bordoli SJ, Rines HW, Phillips RL, Sedat JW,
Agard DA, Cande WZ (2000) Evidence for the coincident initiation of homolog pairing and
synapsis during the telomere-clustering (bouquet) stage of meiotic prophase. J Cell Sci 113:
1033-1042.
13. Batzer MA, Deininger PL (2002) Alu repeats and human genomic diversity. Nature 3:370379.
14. Bazemore LR, Folta-Stogniew E, Takahashi M, Radding CM (1997) RecA tests homology of
both pairing and strand exchange. Proc Natl Acad Sci USA 94: 11863-11868.
15. Beernink HT, Morrical SW (1999) RMPs: recombination/replication mediator proteins,
trends Biochem Sci 24:385-9.
16. Bennett RJ, Keck JL (2004) Structure and function of RecQ DNA helicases. Critical Rev
Biochem Mol Biol 39: 79-97.
17. Bettina M, Shawn A (2001) Checkpoints: Meiotic chromosome pairing takes an unexpected
twist. Current Biol 11: R865-R868.
18. BiswasI, Maguin E, Ehrlich S D, Gruss A (1995) A 7-base-pair sequence protects DNA from
exonucleolytic degradation in Lactococcus lactis. Proc Natl Acad Sci U S A 92:2244-8.
19. Boeke JD (2003) The unusual phylogenetic distribution of retrotransposons: a hyphotesis.
Genome Res 13: 1975-1983.
20. Brandt VL, Roth DB (2002) A recombinase diversified: new functions of the RAG proteins.
Curr Opinion Immunol 14: 224-229.
21. Brandt VL, RothDB (2003) Artemis: guarding small children and, now, the genome. J Clin
Invest 111: 315-316.
22. Brown DD,Wensink PC, Jordan E (1972) Xenopus laevis and Xenopus mulleri: the evolution
of tandem genes. J Mol Biol 63: 57-73.
23. Brunaud V, Balzergue S, Dubreucq B, Aubourg S, Samson F, Chauvin S ir kt. (2002) TDNA integration into the Arabidopsis genome depends on sequences of pre-insertion sites.
EMBO Rep 3: 1152-1157.
24. Budman J, Chu G (2005) Processing of DNA for nonhomologous end-joining by cell-free extract. EMBO J 24: 849-860.
25. Campbell AM (1962) Episomes. Adv Genet 11: 101-145.
26. Cardon LR, Bell JI (2001) Association study designs for complex diseases. Nat Rev Genet 2:
91-99.
27. Casals F, Cceres M, Manfrin MH, Gonzlez J, Ruiz A (2005) Molecular characterization
and chromosomal distribution of Galileo, Kepler and Newton, three Foldback transposable
elements of the Drosophila buzzatii species complex. Genetics 169: 2047-2059.
28. Chedin F, Noirot P, Biaudet V, Ehrlich SD (1998) A five-nucleotide sequence protects DNA
from exonucleolytic degradation by AddAB, the RecBCD analogue of Bacillus subtilis. Mol
Microbiol 29:1369-1377.
29. Chen J-M, Frec C, Cooper DN (2007) Mechanism of Alu integration into the human genome. Genomic Medicine 1: 9-17.
30. Chetverin AB (1999) The puzzle of RNA recombination. FEBS Lett 460: 1-5.
31. Chetverin AB (2004) Replicable and recombinogenic RNA. FEBS Lett 567: 35-41.
180

32. Chetverin AB, Chetverina HV, Demidenko AA, Ugarov VI (1977) Nonhomologous RNA recombination in cell free system: evidence for a transesterification mechanism guided by secondary structure. Cell 88: 503-513.
33. Chua PR, Roeder GS (1998) Zip2, a meiosis-specific protein required for the initiation of
chromosome synapsis. Cell 93: 349-359.
34. Churchill JJ, Anderson DG, Kowalczykowski SC (1999) The RecBC enzyme loads RecA
protein onto ssDNA asymmetrically and independently of resulting in constitutive recombination activation. Genes & Development 13: 901-911.
35. Clark A J (1973) Recombination deficient mutants of E. coli and other bacteria. Annu Rev
Genet 7: 67-86.
36. Clark A J, Sharma V, Brenowitz S, Chu CC, Sandler S, Satin L, Templin A, Berger I, Cohen
A (1993) Genetic and molecular analyses of the C-terminal region of the recE gene from the
rac prophage of Escherichia coli K-12 reveal the recT gene. J Bacteriol 175: 7673-7682.
37. Clark AJ, Margulies AD (1965) Isolation and characterization of recombination-deficient
mutants of Escherichia coli K-12. Proc Natl Acad Sci USA 53: 451-459.
38. Coates CJ, Jasinskiene N, Miyashiro L, James AA (1998) Mariner transposition and transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proc Natl Acad Sci USA 95: 37483751.
39. Cobb JA, Bjergbaek L (2006) RecQ helicases: lessons from model organisms. Nucleic Acids
Res 34: 4106-4114.
40. Connelly JC, de Leau ES, Leach DR (2003) Nucleolytic processing of a protein-bound DNA
end by the E. coli SbcCD (MR) complex. DNA Repair 2: 795-807.
41. Connelly JC, Kirkham LA, Leach DR (1998), the SbcCD nuclease of Escherichia coli is a
structural maintenance of chromosomes (SMC) family protein that cleaves hairpin DNA.
Proc Natl Acad Sci USA 95: 7969-7974.
42. Cox MM (2003) The bacterial RecA protein as a motor protein. Annu Rev Microbiol 57:
551-577.
43. Craig NL (1997) Target site selection in transposition. Annu Rev Biochem 66: 437-474.
44. Critchlow SE, Jackson SP (1998) DNA end-joining: from yeast to man, trends Biochem Sci
23: 394-398.
45. DAmours D, Jackson SP (2002) The Mre11 complex: At the crossroads of DNA repair and
checkpoint signalling. Nature Rev Mol Cell Biol, 3: 317-327.
46. Daley JM, Palmbos PL, Wu D, Wilson TE (2005) Nonhomologous end joining in yeast. Annu Rev Genet 39: 431-451.
47. Daley JM, Vander Laan RL, Suresh A, Wilson TE (2005) DNA joint dependence of Pol X
family polymerase action in nonhomologous end joining. J Biol Chem 280: 29030-29037.
48. Daskalova SM, Scott NW, Elliott MC (2005) Folbos, a new foldback element in rice. Genes
Genet Syst 80: 141-145.
49. Dawkins R The blind watchmaker. Penguin books. 2000
50. de Vries FA, de Boer E, van den Bosch M, Baarends WM, Ooms M, Yuan L, Liu JG, van
Zeeland AA, Heyting C, Pastink A (2005) Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex
assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev 19: 1376-1389.
181

51. Dib C, Faure S, Fizames C, Samson D, Drouot N et al. (1996) A comprehensive genetic map
of the human genome based on 5,264 microsatellites. Nature 380: 152-154.
52. Dillingham MS, Spies M, Kowalczykowski SC (2003) RecBCD enzyme is a bipolar DNA
helicase. Nature 423: 893-897.
53. Dixon DA, Kowalczykowski SC (1993) The recombination hotspot is a regulatory sequence that acts by attenuating the nuclease activity of the E. coli RecBCD enzyme. Cell 73: 8796.
54. Doetschman T, Gregg RG, Maeda N, Hooper ML, Melton DW, Thompson S, Smithies O
(1987) Targetted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature
330: 576- 578.
55. Doherty AJ, Jackson SP,Weller GR (2001) Identification of bacterial homologues of the Ku
DNA repair proteins. FEBS Lett 500: 186-188.
56. Downs JA, Nussenzweig MC, Nussenzweig A (2007) Chromatin dynamics and the preservation of genetic information. Nature 447: 951-957.
57. Drouet J, Frit P, Delteil C, de Villartay J-P, Salles B, Calsou P (2006) Interplay between Ku,
Artemis, and the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit at DNA ends. J Biol Chem
281: 27784-27793.
58. Dudov Z, Dud A, Chovanec M (2004) Non-homologous end-joining factors in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Rev 28: 581-601.
59. Duffy JB (2002) GAL4 system in Drosophila: a fly geneticists Swiss army knife. Genesis
34: 1-15.
60. Evans MJ, Kaufmann MH (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse
embryos. Nature 292: 154-156.
61. Fanning E, Klimovich V, Nager AR (2006) A dynamic model for replication protein A
(RPA) function in DNA processing pathways. Nucleic Acids Res 34: 4126-4137.
62. Ferguson DO, Alt F W (2001) DNA double strand break repair and chromosomal translocation: lessons from animal models. Oncogene 20: 5572-5579.
63. Flint-Garcia SA, Thornsberry JM, Buckler IV ES (2003) Structure of linkage disequilibrium
in plants. Annu Rev Plant Biol 54: 357-374.
64. Franklin NC (1967) Deletions and functions of the center of the f80-l phage genome. Evidence for a phage function promoting genetic recombination. Genetics 57: 301-318.
65. Fugnann SD, Lee AJ, Shockett PE, Villey IJ, Schatz DG (2000) The Rag proteins and V(D)J
recombination: complexes, ends, and transposition. Annu Rev Immunol 18: 495-527.
66. Furth PA, Onge S, Boger H, Gruss P ir kt. (1994) Temporal control of gene expression in
transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proc Natl Acad Sci USA 91: 93029306.
67. Gally DL, Bogan JA, Eisenstein BI, Blomfield IC (1993) Environmental regulation of the fim
switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media. J Bacteriol 175: 6186-6193.
68. Gellert M (2002) V(D)J recombination: RAG proteins, repair factors, and regulation. Annu
Rev Biochem 71: 101-132.
69. Gelvin SB (2003) Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the gene-jockeying tool. Microbiol Mol Biol Rev 67: 16-37.
182

70. Gerton JL, Hawley RS (2005) Homologous chromosome interactions in meiosis: diversity
amidst conservation. Nat Rev Genet 6: 477-487
71. Gheysen G, Villarroel R, Van Montagu M (1991) Illegitimate recombination in plants: a model for T-DNA integration. Genes Dev 5: 287-297.
72. Ghosh SK, Hajra S, Paek A, Jayaram M (2006) Mechanisms of chromosome and plasmid
segregation. Annu Rev Biochem 75: 211-241.
73. Gibson FP, Leach DR, Lloyd RG (1992) Identification of sbcD mutations as cosuppressors of
recBC that allow propagation of DNA palindromes in Escherichia coli K-12. J Bacteriol 174:
1222-1228.
74. Gilbert W (1986) Origin of life: the RNA world. Nature 319: 618.
75. Gill EE, Fast NM (2007) Stripped-down DNA repair in a highly reduced parasite. BMC Mol
Biol 8: 24-37.
76. Glassberg J, Meyer RR, Kornberg A (1979). Mutant single-strand binding protein of Escherichia coli: genetic and physiological characterization. J Bacteriol 140: 14-19.
77. Goldman AS, Lichten M (2000) Restriction of ectopic recombination by interhomolog interactions during Saccharomyces cerevisiae meiosis. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9537-9542.
78. Golubovskaya IN, Harper LC, Pawlowski WP, Schichnes D, Cande WZ (2002) The pam1
gene is required for meiotic bouquet formation and efficient homologous synapsis in maize
(Zea mays L.).Genetics. 162: 1979-1993.
79. Grindley ND (1978) IS1 insertion generates duplication of a nine base pair sequence at its
target site. Cell 13: 419-427.
80. Haber J (2000) Partner and pathways repairing of double strand break, trends Genet 16:
259-264.
81. Haber JE (1998) Mating-type gene switching in Saccharomyces cerevisiae. Annu Rev Genet
32: 561-599.
82. Hall SD, Kane MF, Kolodner RD (1993) Identification and characterization of the Escherichia coli recT protein, a protein encoded by the recE region that promotes renaturation of
homologous single-stranded DNA. J Bacteriol 175: 277-287.
83. Hammarsten O, DeFazio LG, Chu G (2000) Activation of DNA dependent protein kinase by
single-stranded DNA ends. J Biol Chem 275: 1541-1550.
84. Hanada K, Ukita T, Kohno Y, Saito K, Kato J, Ikeda H (1997) RecQ DNA helicase is a suppressor of illegitimate recombination in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 94: 38603865.
85. Haren L, Ton-Hoang B, Chandler M (1999) Integrating DNA: transposases and retroviral integrases. Annu Rev Microbiol 53: 245-281.
86. Hassold T, Hunt P (2001) To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.
Nat Rev Genet 2: 280-291.
87. Hawley RS (2002) Meiosis: how male lies do meiosis. Curr Biol 12: 1473-1483.
88. Hays JB, Boehmer S (1978) Antagonists of DNA gyrase inhibit repair and recombination of
UV-irradiated phage l. Proc Natl Acad Sci USA 75: 4125-4129.
89. Henderson KA, Keeney S (2005) Synaptonemal complex formation: where does it start?
Bioessays 27: 995-998.
183

90. Henderson SA, Edwards RG (1968) Chiasma frequency and maternal age in mammals. Nature 218: 22-28.
91. Herrmann G, Lindahl T, Schar P (1998) Saccharomyces cerevisiae LIF1: a function involved
in DNA double-strand break repair related to mammalian XRCC4. EMBO J 17: 4188-4198.
92. Holmes SE, Dombrovski BA, Krebs CM, Boehm CD, Kazazian HH (1994) A new retrotransposable human L1 element from the LRE2 locus on chromosome 1q produces a chimaeric insertion. Nat Genet 7: 143-148.
93. Houck CM, Rinehart FP, Schmid CW (1979) A ubiquitous family of repeated DNA sequences in the human genome. J Mol Biol 132: 289-306.
94. http://rna.protres.ru/rus/#Molecular proc.20Colony
95. http://www.lifesciences.ynu.edu.cn/wljc/xbswx/6/images/pic/pic0609s.gif
96. Jackson SP (2002) Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinigenesis 23: 687696.
97. Jeffreys A (1979) DNA sequence variants in the G -, A -, - and -globin genes of man.
Cell 18: 1-10.
98. Jessberger R, Wabl M, Borggrefe T (1996) Biochemical studies of class switch recombination. Curr Top Microbiol Immunol 217: 191-202.
99. Johnson FB, Marciniak RA, McVey M, Stewart SA, Hahn WC, Guarente L (2001) The Saccharomyces cerevisiae WRN homolog Sgs1p participates in telomere maintenance in cells
lacking telomerase. EMBO J 20: 905-913.
100. Jones N, Ougham H, Thomas H (1997) Markers and mapping: we are all geneticists now.
New Phytol 137: 165-177.
101. Jung D, Giallourakis C, Mostoslavsky R, Alt FW (2006) Mechanism and control of V(D)J
recombination at the immunoglobilin heavy chain locus. Annu Rev Immunol 24: 541-570.
102. Kang J, Huang S, Blaser MJ (2005) Structural and functional divergente of MutS2 from Bacterial MutS1 and eucaryotic MSH4-MSH5 homologs. J Bacteriol 187: 3528-3537.
103. Karu, A E, Yoshiyuki E, EcholsH, Linn S (1975) The protein specified by bacteriophage .
J Biol Chem 250: 7377-7387.
104. Kataoka T, Kawakami T, Takahashi N, Honjo T (1980) Rearrangement of immunoglobulin
1-chain gene and mechanism for heavy-chain class switch. Proc Natl Acad Sci USA 77:
919-923.
105. Kawakami K, Shimata A, Kawakami N (2000) Identification of a functional transposase of
the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in
the zebrafish germ line. Proc Natl Acad Sci USA 97: 11403-11408.
106. Keeney S (2001) Mechanism and control of meiotic recombination initiation. Curr Top Dev
Biol 52: 1-53.
107. Kleckner N (1996) Meiosis: how could it work? Proc Natl Acad Sci U S A 93: 8167-8174.
108. Kolodner R, Fishel RA, Howard M (1985) Genetic recombination of bacterial plasmid DNA:
effect of recF pathway mutations on plasmid recombination in Escherichia coli. J Bacteriol
163: 1060-1066.
109. Komano T (1999) Shufflons: multiple inversion systems and integrons. Annu Rev Genet 33:
171-191.
184

110. Komori K, Miyata T, DiRuggiero J, Holley-Shanks R, Hayashi I, Cann I K O, Mayanagi K,

Shinagawai H, Ishino Y (2000) Both RadA and RadB are involved in homologous recombination in Pyrococcus furiosus. J Biol Chem 275 (43): 33782-33790.
111. Kong A, Gudbjartsson DF, Sainz J, Jonsdottir GM, Gudjosson SA et al. (2002) A highresolution recombination map of the human genome. Nature Genet 31: 241-247.
112. Kowalczykowski S, Dixon DA, Eggleston AK, Lauder SD, Rehrauer WM (1994) Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli. Microbiol Rev 58: 401-465.
113. Kowalczykowski SC (1991) Biochemistry of genetic recombination: energetics and mechanism of DNA strand exchange. Annu Rev Biophys Biophys Chem 20: 539-575.
114. Kowalczykowski SC (2000) Some assembly required. Nature Struct Biol 7: 1087-1089;
115. Kowalczykowski SC (2005) Catalyst of catalyst. Nature 433: 591-592.
116. Kowalczykowski SC, Eggleston AK (1994) Homologous pairing and DNA strand-exchange
protein. Annu Rev Biochem 63: 991-1043.
117. Krizkova L, Hrouda M (1998) Direct repeats of T-DNA integrated in tobacco chromosome:
characterization of junction regions. Plant J 16: 673-680.
118. Krogh BO, Symington LS (2004) Recombination proteins in yeasts. Annu Rev Genet 38:
233-271.
119. Kurumizaka H, Aihara H, Ikawa S, Shibata T (2000) Specific defects in double-stranded
DNA unwinding and homologous pairing of a mutant RecA protein. FEBS Lett 477: 129134.
120. Kushner SR, Nagaishi H, Clark AJ (1972) Indirect suppression of recB and recC mutations
by exonuclease I deficiency. Proc Natl Acad Sci USA 69: 1366-1370.
121. Kushner SR, Nagaishi H, Templin A, Clark AJ (1971) Genetic recombination in Escherichia
coli: the role of exonuclease I. Proc Natl Acad Sci USA 68: 824-827.
122. Kuzminov A (1999) Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage . Microbiol Mol Biol Rev 63: 751-813.
123. Lam ST, Stahl MM, McMilin KD, Stahl FW (1974) Rec-mediated recombinational hot spot
activity in bacteriophage lambda. II. A mutation which sauses hot spot activity. Genetics 77:
425-433.
124. Lander ES, Schark NJ (1994) Genetic dissection of complex traits. Science 265: 2035-2048.
125. Largaespada DA (2003) Generating and manipulating transgenic animals using transposable
elements. Reprod Biol Endocrinol 1: 80-89.
126. Lawrence C, Woodgate R (1999) Translesion Replication In P.J. Smith and C.J. Jones (eds.),
Frontiers in molecular biology:DNA recombination and repair. Oxford University Press, Oxford, England, pp. 38-65.
127. Leach DRF. Genetic recombination. London. Blackwell Science Ltd, 1996.
128. Lee JH, Ghirlando R, Bhaskara V, Hoffmeyer MR, Gu J, et al. (2003) Regulation of
Mre11/Rad50 by Nbs1: effects on nucleotide-dependent DNA binding and association with
ataxia-telangiectasia-like disorder mutant complexes. J Biol Chem 278: 45171-45181.
129. Li J, Vaidya M, White C, Vainstein A, Citovsky V, Tzfira T (2005) Involvement of ku80 in
T-DNA integration in plant cells. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19231-19236.

185

130. Li Z, Woo CJ, Iglesias-Ussel MD, Ronai D, Scharff MD (2004) The geenration of antibody
diversity through somatic hypermutation and class switch recombination. Genes & Development 18: 1-11.
131. Liang L, Deng L, Chen Y, Li GC, Shao C, Tischfield J A (2005) Modulation of DNA end
joining by nuclear proteins. J Biol Chem 280: 3144231449.
132. Liu Y, Masson YJ, Shah R, ORegan P, West SC (2004) Rad51C is required for Holliday
junction processing in mammalian cells. Science 303: 243-246.
133. Lloyd RG (1991) Conjugational recombination in resolvase deficient ruvC mutants of Escherichia coli K-12 depends on recG. J Bacteriol 173: 5414-5418.
134. Lloyd RG, Buckman C (1991). Genetic analysis of the recG locus of Escherichia coli K-12
and of its role in recombination and DNA repair. J Bacteriol 173:1004-1011.
135. Lloyd RG, Buckman C (1991). Overlapping functions of recD, recJ, and recN provide evidence of three epistatic groups of genes in Escherichia coli recombination and DNA repair.
Biochimie 73: 313-320.
136. Lonn U, Lonn S, NylenU, WinbladG, German J (1990) An abnormal profile of DNA replication intermediates in Blooms syndrome. Cancer Res 50: 3141-3145.
137. Lovett ST, Kolodner RD (1989) Identification and purification of a single-stranded DNAspecific exonuclease encoded by the recJ gene of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA
86: 2627-2631.
138. Loyter A, Rosenbluh J, Zakai N, Li J, Kozlovsky SV, Tzfira T, Citovsky V (2005) The plant
VirE2 interacting protein1. A molecular link between the Agrobacterium T-complex and the
host cell chromatan? Plant Physiol 138: 1318-1321.
139. Luisi-DeLuca C, Lovett ST, Kolodner RD (1989) Genetic and physical analysis of plasmid
recombination in recB recC sbcB and recB recC sbcA Escherichia coli K-12 mutants. Genetics 122: 269-278.
140. Ma Y, Pannicke U, Schwarz K, Lieber MR (2002) Hairpin opening and overhang processing
by an Artemis/DNA-dependent protein kinase complex in nonhomologous end joining and
V(D)J recombination. Cell 108: 781-94.
141. Maizels N (1999) Immunoglobulin class-switch recombination: will genetics provide new
clues to mechanism? Am J Hum Genet 64: 1270-1275.
142. Malkova A, Ivanov EL, Haber JE (1996) Double-strand break repair in the absente of RAD51
in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci USA 93:
71317136.
143. Mandal TN, Mahdi AA, Sharples GJ, Lloyd RG (1993) Resolution of Holliday intermediates
in recombination and DNA repair: indirect suppression of ruvA, ruvB, and ruvC mutations. J
Bacteriol 175: 4325-4334.
144. Manis JP, Tian M, Alt FW (2002) Mechanism and control of class-switch recombination,
Trends Genet 23: 31-38.
145. Martin GR (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in
medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78: 7634-7638.
146. Matson SW (2003) Dual engines moving on antiparallel trauks. Nature Structural Biol 10:
499-500.

186

147. Mayerhofer R, Koncz-Kalman Z, Nawrath C, Bakkeren G, Crameri A, Angelis K, Redei GP,

Schell J, Hohn B, Koncz C (1991) T-DNA integration: a mode of illegitimate recombination
in plants. EMBO J 10: 697-704
148. McClintock B (1950) The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc Natl Acad Sci
USA 36: 344-355.
149. McGavin S (1977) A model for the specific pairing of homologous double stranded nucleic
acid molecules during genetic recombination. Heredity 39: 15-25.
150. Mendonca VM, Klepin HD, Matson SW (1995) DNA helicases in recombination and repair:
construction of a uvrD helD recQ mutant deficient in recombination and repair. J Bacteriol 177: 1326-1335.
151. Menetski JP, Kowalczykowski SC (1989) Enhancement of Escherichia coli RecA protein enzymatic function by ATP. Biochemistry 28: 5871-5881.
152. Michel B, Flores MJ, Viguera E, Grompone G, Seigneur M, Bidnenko V (2001) Rescue of
arrested replication forks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci USA 98: 81818188.
153. Mitzuuchi K (1992) Transpositional recombination: mechanistic insights from studies of Mu
and other elements. Annu Rev Biochem 61: 1011-1051.
154. Modesti M, Kanaar R (2001) Homologous recombination from model organisms to human
disease. Genome Biol 2: I0I4.I-I0I4.5.
155. Moens PB, Marcon E, Shore JS, Kochakpour N, Spyropoulos B (2007) Initiation and resolution of interhomolog connections: crossover and non-crossover sites along mouse synaptonemal complexes. J Cell Sci 120: 1017-1027.
156. Moran JV, Holmes SE, Naas TP, DeBerardinis RJ et al. (1996) High frequencyretrotransposition in cultured mammalian cells. Cell 87: 915-927.
157. Mller U (1999) Ten years of gene targeting: targeted mouse mutants, from vector design to
phenotype anglysis. Mechanisms of Development 82: 3-21.
158. Munishkin AV, Voronin LA, Chetverin AB (1988) An in vivo recombinant RNA capable of
autocatalytic synthesis by Q beta replicase. Nature 333: 473-475.
159. Muramatsu M, Sankaranand VS, Anant S, Sugai M, Kinoshita, K, Davidson NO, Honjo T
(1999) Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member
of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J Biol Chem 274: 1847018476.
160. Nagy PD, Simon AE (1997) New insights into the mechanisms of RNA recombination. Virology 235: 1-9.
161. Nakayama H, Nakayama K, Nakayama R, Irino N, Nakayama Y, Hanawalt PC (1984) Isolation and genetic characterization of a thymineless death-resistant mutant of Eschenichia coli
K-12: identification of a new mutation (recQI) that blocks the recF recombination pathway.
Mol Gen Genet 195: 474-480.
162. Nash H A (1975) Integrative recombination of bacteriophage lambda DNA in vitro. Proc Natl
Acad Sci USA 72: 1072-1076.
163. Nei M, Hughes AL (1992) Balanced polymorphism and evolution by the birth-and-death
process in the MHC loci. In 11th HistocompatibilityWorkshop and Conference, ed. K Tsuji,M Aizawa, T Sasazuki, pp. 2738. Oxford, UK: Oxford Univ. Press.
187

164. Nishant KT, Rao MRS (2005) Molecular features of meiotic recombination hot spots. BioEssays 28: 45-56.
165. Niu H, Wan L, Baumgartner B, Schaefer D, Loidl J, Hollingsworth NM (2005) Partner chose
during meiosis is regulated by Hop1-promoted dimerization of Mek1. Mol Biol Cell 16:
5804-5818.
166. Oakley TJ, Hickson ID (2002) Defending genome integrity during S-phase: putative roles for
RecQ helicases and topoisomerase III. DNA repair 1: 175-207.
167. Onoda F, Seki M, Miyajima A, Enomoto T (2001) Involvement of SGS1 in DNA damageinduced heteroallelic recombination that requires RAD52 in Saccharomyces cerevisiae. Mol
Gen Genet. 264: 702-708.
168. Orr-Weaver T L, Szostak JW, Rothstein RJ (1981) Yeast Transformation: A Model System
for the Study of Recombination. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6354-6358.
169. Ostertag EM, Kazazian HH (2001) Biology of mammalian L1 retrotransposons. Annu Rev
Genet 35: 501-538.
170. Page SL, Hawley RS (2004) The genetics and molecular biology of the synaptonemal complex. Annu Rev Cell Dev Biol 20: 525-558.
171. Palas KM, Kushner SR (1990) Biochemical and physical characterization of exonuclease V
from Escherichia coli. Comparison of the catalytic activities of the RecBC and RecBCD enzymes. J Biol Chem 265: 3447-3454.
172. Pansegrau W, Schoumacher F, Hohn B, Lanka E (1993) Site-specific cleavage and joining of
single-stranded DNA by VirD2 protein of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmids: analogy
to bacterial conjugation. Proc Natl Acad Sci USA 90: 11538-11542.
173. Paques F, Haber JE (1999) Multiple pathways of recombination induced by double-strand
breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 63: 349-404.
174. Pasqualucci L, Neumeister P, Goossens T, Nanjangud G, Chaganti RS., Kuppers R, DallaFavera R (2001) Hypermutation of multiple proto-oncogenes in B-cell diffuse large-cell
lymphomas. Nature 412: 341-346.
175. Passarge E. Color atlas of genetics. New York. Thieme, 1995.
176. Pastwa E, Blasiak J (2003) Non-homologous DNA end joining. Acta Biochimica Polonica 50
(4) 891-908.
177. Paterson AH, Tanksley SD, Sorrells ME (1991) DNA markers in plant improvement. Advances in Agronomy 46: 39-90.
178. Petes TD, Hill CW (1988) Recombination between repeated gens in microorganisms. Annu
Rev Genet 22: 147-168.
179. Poot M, Hoehn H, Runger TM, Marin GM (1992) Impaired S-phase transit of Werner syndrome clls expressed in lymphoblastoid cell lines. Exp Cell Res 202: 267-273.
180. Potter S, Truett M, Phillips M, Maher A (1980) Eucaryotic transposable genetic elements
with inverted terminal repeats. Cell 20: 639-647.
181. Radding CM (1982) Homologous pairing and strand exchange in genetic recombination. Annu Rev Genet. 16: 405-437.
182. Rafalski A (2002) Application single nucleotide polymorphism in crop genetics. Curr Opinion Plant Biol 5: 94-100.
188

183. Rafalski A, Morgante M (2004) Corn and humans: recombination and linkage disequilibrium
in two genomes of similar size. Trends Genet 20: 103-111.
184. Robertson MP, Ellington AD (1998) How to make a nucleotide. Nature 395: 223-225.
185. Roe SM, Barlow T, Brown T, Oram M, Keeley A, Tsaneva IR, Pearl LH (1998) Crystal
structure of an octameric RuvA-Holliday junction complex. Mol Cell 2: 361-372.
186. Roeder GS (1997)Meiotic chromosomes: it takes two to tango. Genes & Development 11:
2600-2621.
187. Roman LJ, Eggleston AK, Kowalczykowski SC (1992) Processivity of the DNA helicase activity of Escherichia coli recBCD enzyme. J Biol Chem 267: 4207-4214.
188. Sadowski P (1993) Sait-specific genetic recombination: hops, lips, and slops. FASEB J 7:
760-767.
189. Sagi D, Tlusty T, Stavans J (2006) High fidelity of RecA-catalyzed recombination: a watchdog of genetic diversity. Nucleic Acids Res 34: 5021-5031.
190. Scherthan H (2001) A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 621-627.
191. Schuermann D, Molinier J, Fritcsh O, Hohn B (2005) The dual nature of homologous recombination in plants. Trends Genet 21: 172-181.
192. Seitz EM, Haseltine CA, Kowalczykowski SC (2001) DNA recombination and repair in the
Archaea. Advances in Applied Microbiol 50: 101-169.
193. Shah R, Bennett RJ, West SC (1994) Genetic recombination in E.coli: RuvC protein cleaves
Holliday junctions at resolution hotspots in vitro. Cell 79: 853-864.
194. Sharples GJ, Ingleston SM, Lloyd RG (1999) Holliday junction processing in bacteria: insights from the evolutionary conservation of RuvABC, RecG, and RusA. J Bacteriol 181:
5543-5550.
195. Shibata T, Nishinaka T, Mikawa T, Aihara H et al. (2001) Homologous genetic recombination as an intrinsic dynamic property of a DNA structure induced by RecA/Rad51-family
proteins: a possible advantage of DNA over RNA as genetic material. Proc Natl Acad Sci
USA 98: 8425-8432.
196. Shida T, Iwasaki H, Saito A, Kyogoku Y, Shinagawa H (1996). Analysis of substrate specificity of the RuvC Holliday junction resolvase with synthetic Holliday junctions. J Biol Chem
271: 26105-26109.
197. Shiloh Y (2003) ATM and related protein kineses: safegarding genome integrity. Nature Rev
3: 155-168.
198. Shinkura R, Tian M, Smith M, Chua K, Fujiwara Y, Alt FW (2003) The influence of transcriptional orientation on endogenous switch region function. Nat Immunol 4: 435-441.
199. Sibanda BL, Critchlow SE, Begun J, Pei XY, Jackson SP et al. (2001) Crystal structure of an
XRCC4-DNA ligase IV complex. Nat Struct Biol 8: 1015-1019.
200. Singer BS, Gold L, Gauss P, Doherty DH (1982) Determination of the amount of homology
required for recombination in bacteriophage T4. Cell 31: 25-33.
201. Singleton MR, Dillingham MS, Gaudier M, Kowalczykowski SC, Wigley DB (2004) Crystal
structure of RecBCD enzime reveals a machine for processing DNA breaks. Nature 432: 187193.
202. Skaar EP, Lazio MP, Seifert HS (2002) Roles of the recJ and recN genes in homologous recombination and DNA repair pathways of Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol 184: 919-927.
189

203. Sladek FM, Munn MM, Rupp WD, Howard-Flandres P (1989) In vitro repair of psoralenDNA cross-links by recA, uvrABC, and the 5-exonuclease of DNA polymerase I. J Biol
Chem 264: 6755-6765.
204. Smith GCM, Jackson SP (1999) The DNA-dependent protein kinase. Genes Dev 13: 916934.
205. Smithies O, Gregg RG, Boggs SS, Koralewski MA, Kucherlapati RS (1985) Insertion of
DNA sequences into the human chromosomal -globin locus by homologous recombination.
Nature 317: 230-234.
206. Snowden T, Acharya S, Butz Ch, Berardini M, Fishel (2004) hMSH4-hMSH5 recognizes
Holliday junctions and forms a meiosis-specific sliding clamp that embraces homologous
chromosomes. Mol Cell 15:437-451.
207. Sourice S, Biaudet V, El Karoui M, Ehrlich SD, Gruss A (1998) Identification of the Chi site
of Haemophilus influenzae as several sequences related to the Escherichia coli Chi site. Mol
Microbiol 27:1021-9.
208. Spies M, Kowalczykowski. Homologons recombination by RecBCD and RecF pathways. In:
N. P. Higgins, Ed., The Bacterial chromosome. Washington DC, ASM Press, 2005.
209. Spradling AC, Rubin GM (1982) Transposition of cloned elements into Drosophila germ line
chromosomes. Science 218: 341-347.
210. Stasiak A (1992) Three-stranded DNA structure; is this the secret of DNA homologous recognition? Mol Microbiol 6: 3267-3276.
211. Stasiak A, DiCapua ED (1982) The helicity of DNA in complexes with RecA protein. Nature
299: 185-186.
212. Sturtevant AH (1913) The linear arrangement of six sex-linked factors in Drosophila, as
shown by their mode of association. Journal of Experimental Zoology 14: 43-59.
213. Su TT (2006) Cellular responses to DNA damage: one signal, multiple choises. Annu Rev
Genet 40: 187-208.
214. Symington LS (2002) Role of the RAD52 epistasis group gens in homologous recombination and double-strand break repair. Microbiol Mol Biol Rev 66: 630-670.
215. Szostak JW, Orr-Weaver TL, Rothstein RJ, Stahl FW (1983) The double-strand-break repair
model for recombination. Cell 33: 25-35.
216. Takahashi NK, Yamamoto K, Kitamura Y, Luo S-Q et al. (1992) Nonconservative recombination in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 89: 5912-5916.
217. Tenaillon MI, Sawkins MC, Long AD, Gaut RL et al. (2001) Patterns of DNA sequence polymorphism along chromosome 1 of maize (Zea mays ssp. mays L.). Proc Natl Acad Sci USA
98: 9161-9166.
218. Thomas KR, Capecchi MR (1987) Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse
embryo-derived stem cells. Cell 51: 503-512.
219. Tinland B, Hohn B (1995) Recombination between prokaryotic and eukaryotic DNA: integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA into the plant genome. Genet Eng 17: 209-229.
220. Tinland B, Hohn B, Puchta H (1994) Agrobacterium tumefaciens transfers single-stranded
transferred DNA (T-DNA) into the plant cell nucleus. Proc Natl Acad Sci USA 91: 80008004.

190

221. Tinland B, Schoumacher F, Gloeckler V, Bravo-Angel AM, Hohn B (1995) The Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integration of T-DNA into
the plant genome. EMBO J 14: 3585-3595.
222. Tsubouchi H, Roeder GS (2003) Budding yeast Hed1 down-regulates the mitotic recombination machinery when meiotic recombination is impaired. Genes & Dev 20:1766-1775.
223. Tzfira T, Citovsky V (2002) Partners-in-infection: host proteins involved in the transformation of plant cells by Agrobacterium, t Cell Biol 12: 121-129.
224. Tzfira T, Frankmen L, Vaidya M, Citovsky V (2003) Site-specific integration of Agrobacterium T-DNA via double-stranded intermediates. Plant Physiol 133: 1011-1023.
225. van Attikum H, Hooykaas PJJ (2003) Genetic requirements for the targeted integration of
Agrobacterium T-DNA in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res 31: 826-832.
226. Walbot V (2000) Saturation mutagenesis using maize transposons. Curr Opin Plant Biol 3:
103-107.
227. Walker JR, Corpina RA, Goldberg J (2001) Structure of the Ku heterodimer bound to DNA
and its implications for double-strand break repair. Nature 412: 607-614.
228. Wang TCV, Chang HY, Hung JL (1993) Cosuppression of recF, recR and recO mutations by
mutant recA alleles in Escherichia coli cells. Mutat Res 294: 157-166.
229. Ward E, Barnes W (1988) VirD2 protein of Agrobacterium tumefaciens very tightly linked to
the 5' end of T-strand DNA. Science 242: 927-930.
230. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R. Molecular biology of the gene.
Pearson/Benjamin Cummings/CSHL Press 2004.
231. Weisberg R, Landy A (1983) Site-specific recombination in phage lambda, p. 211-250. In R.
W. Hendrix, J. W. Roberts, F. W. Stahl, and R. A. Weisberg (ed.), Lambda II. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
232. Weller GR, Kysela B, Roy R, Tonkin LM, Scanlan E, Della M, Devine SK, Day JP, Wilkinson A, di Fagagna F, Devine KM, Bowater RP, Jeggo PA, Jackson SP, DohertAJ (2002)
Identification of a DNA nonhomologous end-joining complex in bacteria. Science 297: 16861689.
233. West SC (1992) Enzymes and molecular mechanisms of genetic recombination. Annu Rev
Biochem 61: 603-640.
234. Wilson T E, Topper LM, Palmbos P L (2003) Non-homologous end-joining: bacteria join the
chromosome breakdance, TIBS 28: 62-66.
235. Wyman C, Kanaar R (2006) DNA double-strand break repair: alls well that ends well. Annu
Rev Genet 40: 363-383.
236. Xiong M, Guo S-W (1997) Fine-scale genetic mapping based on linkage disequilibrium: theory and applications. Am J Hum Genet 60: 1513-1531.
237. Xu L, Weiner BM, Kleckner N (1997) Meiotic cells monitor the status of the interhomolog
recombination complex. Genes & Dev 11: 106-118.
238. Yamagata K, Kato J-I, Shimamoto A, Goto M, Furuichi Y, Ikeda H (1998) Bloom's and
Werner's syndrome genes suppress hyperrecombination in yeast sgs1 mutant: implication for
genomic instability in human diseases. Proc Natl Acad Sci USA 95: 8733-8738.
239. Yang S, Yu X, Seitz E M, Kowalczykowski S C, Egelman E H (2001) Archaeal RadA protein binds DNA as both helical filaments and octameric rings. J Mol Biol 314: 1077-1085.
191

240. Yant SR, Ehrhardt A, Mikkelsen JG, Meuse L et al. (2002) Transposition from a gutless adeno-transposon vector stabilizes transgene expression in vivo. Nat Biotechnol 16: 16.
241. Young C, Nester EW (1988) Association of the VirD2 protein with the 5' end of T-strands in
Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 170: 3367-3374.
242. Yu A, Zhao Ch, Fan Y, Jang W, Mungall A J et al. (2001) Comparison of human genetic and
sequence-based physical maps. Nature 409: 951-953.
243. Yu K, Lieber MR (2003) Nucleic acid structures and enzymes in the immunoglobulin class
switch recombination mechanism. DNA Repair 2: 1163-1174.
244. Zarrin A, Del Vecchio C, Tseng E, Gleason, Zarin P, Tian M, Alt FW (2007) Antibody classwitching mediated by yeast endonuclease-generated DNA breaks. Science 315: 377-381.
245. Zickler D, Kleckner N (1999) Meiotic chromosomes: integrating structure and function. Annu Rev Genet 33: 603-754.
246. Ziemienowicz A (2001) Odyssey of Agrobacterium T-DNA. Acta Biochimica Polonica 48:
623-635.

192