Karolina Zakaraitė

Laboratorinis darbas Nr. 3

DARBO LĄSTELIŲ KULTŪRŲ LABORATORIJOJE PAGRINDAI.

Ląstelių skaičiavimas Neubauer hemocitometro kameroje.

Gyvų ir mirusių ląstelių kiekio nustatymas tripano mėlio testu

Darbo tikslas: Naudojant hemocitometrą ir dažymo tripano mėliu testą įvertinti ląstelių
esančių suspensijoje gyvybingumą bei jų koncentraciją.

Priemonės ir reagentai: 1) Ląstelių suspensija; 2) Mikroskopas; 3) Neubauer

hemocitometras; 4) Tripano mėlio dažų tirpalas.

Darbo eiga: Paruošiamas 1ml tirpalas, dedama 10µl terpės su ląstelėmis ir 90µl tripano
mėlio dažų ir gerai sumaišoma. Paruoštas tirpalas paimamas pipete ir pilamas Neubauer
kameroje, kurioje per mikroskopą skaičiuojamas ląstelės.

Darbo rezultatai: Pirmiausia suskaičiuojame kiek ląstelių yra mūsų pasirinktose langeliuose.
Skaičiuojame du langelius įstrižai. Pirmame ir ketvirtame langeliuose atitinkamai yra 56
gyvos ir 2 negyvos ląstelės ir 52 gyvos ir 2 negyvos ląstelės.

Pasiskaičiuojame: A - vidutinį ląstelių skaičių skaičiavimo kameros kampiniame laukelyje (t.

y. vidutinis ląstelių skaičius 0,0001 mililitre).

108
A (gyvų) = 56+52=108; =54 ląst/sk.
2

Toliau apskaičiuojame:

10 µl+90 µl
1) ląstelių skiedimo faktorių: B = =10 µl . – tiek kartų praskiedėm ląsteles.
10 µl

2) gyvų ląstelių koncentraciją: c = A ∙ B ∙ 104 ; c = 54 ląst /sk ∙10 µl∙ 104 = 5,4 ∙ 106 ląst/ml

3) gyvų ląstelių kiekį pradinėje suspensijoje: 1 ml = 5,4 ∙ 106

112
4) bendrą (gyvų ir mirusių) ląstelių koncentracija: A (bendras) = 56+2+52+2 = 112; =¿
2
56 ląst/sk.

c = 56 ląst/sk ∙ 10µl ∙104 = 5,6 ∙106 ląst/ml.

5) bendrą (gyvų ir mirusių) ląstelių kiekį pradinėje suspensijoje: 1ml = 5,6 ∙ 106
6) ląstelių gyvybingumą procentais: 112 – 100%
108 – x % x = 96,43%

7) kokį ląstelių skaičių iš pradinės suspensijos paėmėte dažymui tripano mėliu:

1 ml – 5,6 ∙106

0,001l – x x = 5600 = 5,6 ∙103 ląst.

8) kaip paruošti 1 mililitrą norimos gyvų ląstelių koncentracijos tirpalo (0,5 ∙ 106 ląstelių/ml):

5,4 ∙ 106 ląst. – 1 ml.

0,5 ∙106 ląst. – x ml.

(1ml -0,093 ml = 0,907 ml) x = 0,093 ml + 0,907 ml terpės

9) kaip paruošti didžiausią galimą kiekį 0,5∙106 ląstelių/ml gyvų ląstelių koncentracijos
tirpalo, jei turite 1 ml apskaičiuotos koncentracijos ląstelių suspensijos:

5,4 ∙10 6 ląst /ml

x= ∙ 1ml=10,8 ml
0,5 ∙106 ląst /ml

(10,8 ml – 1 ml = 9,8 ml)

1 ml jau turime + 9,8 ml terpės

Išvados: Naudojant hemocitometrą ir dažymo tripano mėliu testą įvertinome ląstelių

esančioje suspensijoje gyvybingumą: iš viso suskaičiuota 108 gyvybingos ląstelės ir tik 4
negyvos (96,43% gyvybingumas). Skaičiuojant ląsteles, ląstelių skaičius gali skirtis dėl putų (
ląstelių tirpalas virsta į putas). Apskaičiavome gyvų ląstelių koncentraciją, kurią gavome 5,4
∙ 106 ląst/ml ir bendrą (gyvų ir negyvų) ląstelių koncentraciją – 5,6 ∙106 ląst/ml.