VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS IR BIOTECHNOLOGIJŲ KATEDRA

Jolita Grendienė

KAPILIARINIO FORMATO RIBOTAI PASIEKIAMOS FAZĖS:

SINTEZĖ, ĮVERTINIMAS IR PANAUDOJIMAS
TIESIOGINEI BIOLOGINIŲ SKYSČIŲ ANALIZEI

Magistro baigiamasis darbas

Studijų programa: cheminė analizė, valstybinis kodas: 62603P105,

studijų kryptis: chemija.

Vadovas: dr. Reda Jarmalavičienė _______ ____

(Moksl. laipsnis, vardas, pavardė) (parašas) (data)

Apginta: Prof. habil. dr. Gintautas Kamuntavičius _ ____

(Fakulteto dekanas) (parašas) (data)

Kaunas, 2010

TURINYS
SANTRAUKA..........................................................................................................................................3
SUMMARY..............................................................................................................................................5
ĮVADAS...................................................................................................................................................7
SANTRUMPOS.......................................................................................................................................9
1. LITERATŪROS APŽVALGA..........................................................................................................10
1.1. Skysčių chromatografija..............................................................................................................10
1.2. Biologinio bandinio paruošimas analizei....................................................................................12
1.3. Ištisinės ribotai pasiekiamos fazės...............................................................................................16
1.4. Kapiliarinė elektroforezė.............................................................................................................20
1.5. Kietafazė mikroekstrakcija..........................................................................................................22
1.6. Miniatiūrizacijos ir metodų apjungimo tendencijos šiuolaikinėje cheminėje analizėje..............23
2. DARBO METODIKA........................................................................................................................26
2.1.Medžiagos.....................................................................................................................................26
2.2. Aparatūra.....................................................................................................................................27
2.3. Ribotai pasiekiamų fazių paruošimas..........................................................................................29
2.4. Bandinio paruošimo metodikos...................................................................................................31
2.5. Apjungto tiesioginio kietafazės mikroekstrakcijos ir kapiliarinės zonų elektroforezės metodo
žingsniai..............................................................................................................................................33
2.6. Chromatografinių parametrų skaičiavimas..................................................................................34
3. REZULTATAI...................................................................................................................................36
3.1. Ribotai pasiekiamų fazių charakterizavimas...............................................................................36
3.1.1. Hidrofobiškumo įvertinimas.................................................................................................36
3.1.2. Efektyvumas.........................................................................................................................38
3.1.3. Hidrodinaminis pralaidumas.................................................................................................39
3.2. Tiesioginė biologinių skysčių kapiliarinė chromatografija panaudojant ribotai pasiekiamas fazes
............................................................................................................................................................40
3.3. Apjungtas tiesioginis kietafazės mikroekstrakcijos ir kapiliarinės zonų elektroforezės metodas
............................................................................................................................................................41
3.3.1. Kapiliarinės zonų elektroforezės salygų optimizavimas......................................................43
3.3.2. Apjungto kietafazės mikroekstrakcijos ir kapiliarine zonų elektroforeze metodo taikymas
biologinių skysčių analizei.............................................................................................................45
3.3.3. Kapiliarinės zonų elektroforezės ir apjungto kietafazės mikroekstrakcijos su kapiliarine
zonų elektroforeze metodų jautrumo palyginimas.........................................................................47
IŠVADOS...............................................................................................................................................49
LITERATŪROS SĄRAŠAS..................................................................................................................50
Publikacijos.............................................................................................................................................60
Padėka.....................................................................................................................................................61

2
 SANTRAUKA

Kapiliarinio formato ribotai pasiekiamos fazės: sintezė, įvertinimas ir

panaudojimas tiesioginei biologinių skysčių analizei

Viena svarbiausių šiuolaikinės chemijos užduočių yra biologinių objektų ir biologinių

sistemų molekuliniai tyrimai. Šiam tikslui vis dažniau naudojami chromatografiniai, elektrokinetiniai
ir kiti molekulinio lygmens medžiagų išskyrimo ir analizės metodai. Didžiausia problema biologinių
bandinių analizėje išlieka bandinio paruošimas. Siekiant pašalinti sudėtingos bandinio matricos
neigiamą įtaką tiksliam ir patikimam analičių nustatymui būtina sukurti ir naudoti nesudėtingus,
sparčius, su analize apjungtus metodus.
Šiuolaikinėje klinikinėje medicinoje biologinių bandinių tyrimų duomenys yra ypač svarbūs
vertinant paciento sveikatos būklę, teisingai diagnozuojant įvairias ligas, tiriant vaistų įsisavinimą.
Tačiau biologinės matricos, pavyzdžiui, serumas ir plazma, yra sudėtingi mišiniai. Farmacijoje vaistų
savybių tyrimai atliekami siekiant įvertinti vaisto veikimo mechanizmą, įsisavinimą, metabolizmą ir
nustatyti terapines, toksines bei mirtinas dozes ir nepageidaujamas reakcijas.
Ribotai pasiekiamos fazės dažniausiai taikomos tiesioginei vaistų analizei biologiniuose
skysčiuose. Šiuo metu ribotai pasiekiamų fazių naudojimas mažos molekulinės masės analičių tyrimui
biologiniuose skysčiuose yra vienas populiariausių bandinio paruošimo metodų. Kietafazė
mikroekstrakcija – bandinio paruošimo mikrometodas, kuris sumažina bandinio paruošimo laiką,
mažina naudojamų medžiagų sąnaudas bei pagerina aptikimo ribas.
Kapiliarinė elektroforezė – mikroanalizės metodas, kuriam būdingas ypatingai didelis
efektyvumas, puikus atskyrimo atrankumas, universalumas, paprastumas bei greitumas. Jis yra plačiai
taikomas biologiškai aktyvių junginių analizei. Sujungta su kietafaze mikroekstrakcija kapiliarinė
elektroforezė naudojama junginių pėdsakų analizei įvairiuose mišiniuose. Ribotai pasiekiamos fazės
kaip adsorbento naudojimas taikant sujungtą tiesioginės kapiliarinės elektroforezės ir kietafazės
mikroekstrakcijos metodą, įgalina vykdyti tiesioginę bei automatizuotą medžiagų analizę be atskiro
bandinio paruošimo etapo.
Šiame darbe susintetintos naujos kapiliarinio formato ištisinės ribotai pasiekiamos fazės,
ištirtas šių fazių hidrofobiškumas, efektyvumas ir hidrodinaminis pralaidumas. Atlikta tiesioginė
plazmos ir salbutamolio analizė kapiliarinės skysčių chromatografijos metodu bei pritaikyta apjungtam
kapiliarinės mikroekstrakcijos ir kapiliarinės zonų elektroforezės metodui. Gautų kapiliarinio formato

3
ištisinių ribotai pasiekiamų fazių sintezė yra nebrangi ir nesudėtinga. Šios ribotai pasiekiamos fazės
gali būti naudojamos įvairių mažos molekulinės masės junginių analizei (vaistų, jų metabolitų ir kitų
junginių) biologiniuose skysčiuose.

4
 SUMMARY

Capillary format restricted access media: synthesis, characterization and

application for direct analysis of biological fluids

One of the most important tasks of modern chemistry is molecular investigation of biological
objects and biological systems. For this purpose, more and more often chromatographic, electrokinetic
and other molecular investigation techniques of separation and analysis are used. Sample preparation
remains one of the main problems in the analysis of biological samples. In order to eliminate the
negative impact of the complex sample matrix on accurate and reliable identification and
quantification of analytes, it is necessary to create and use simple, fast coupled sample preparation and
analysis techniques.
Investigation of biological samples is especially important in modern clinical medicine for
evaluation of patient’s health condition, diagnosis of various diseases and research of assimilation of
drugs. However, biological matrices, such as, serum and plasma, are complex mixtures. In pharmacy,
research on characterization of drugs is conducted in order to evaluate the mechanism of drug action,
assimilation, metabolism and in order to determine therapeutic, toxic and lethal dose and side
reactions.
Restricted access media are most often applied in direct analysis of drugs in biological
liquids. Presently, the use of restricted access media for analysis of small molecular mass analytes in
biological liquids is one of the most popular techniques of sample preparation. Solid-phase
microextraction is a microtechnique for sample preparation which reduces the duration of sample
preparation, decreases expenditure of the materials used and improves the limits of detection.
Capillary electrophoresis is a technique of microanalysis which is characterized by extremely
high efficiency, excellent selectivity of extraction, wide application range, simplicity and high speed.
It is widely applied in the analysis of biologically active compounds. Combined with solid-phase
microextraction capillary electrophoresis is used in trace analysis of various compounds. The use of
restricted access media as an adsorbent in a solid-phase microextraction coupled with capillary
electrophoresis enables direct automated analysis of biological fluids without separate sample
preparation phase
In this work novel pathways of preparation of capillary format non-particulate restricted-
access media are proposed. The products are characterized by evaluating hydrophobicity, efficiency

5
and hydrodynamic permeability. These new adsorbents are applied for direct analysis of salbutamol in
plasma using capillary liquid chromatography and restricted-access media is applied as in-line
preconcentrator in coupled solid phase microextraction–capillary zone electrophoresis method. The
synthesis of capillary format restricted access media is cost-efficient and simple. These restricted
access media can be applied for the analysis of various small molecular weight analytes (as drugs,
metabolites and others) in biological fluids.

6
 ĮVADAS

Viena svarbiausių chemijos užduočių – atskirų komponentų išskyrimas iš mišinių. Didėjant

medžiagų grynumo reikalavimams, taikomi chromatografiniai medžiagų išskyrimo metodai.
Chromatografijoje analizinis procesas susideda iš keturių pagrindinių etapų: bandinio paruošimo,
skirstymo, detekcijos ir duomenų apdorojimo. Tiriant biologinius skysčius bandinio paruošimo etapas
užima apie 60% viso analizės laiko. Bandinių paruošimo metodai paprastai sudaro apie 30% bendros
analizės paklaidos.
Tiesioginis bandinių ekstrakcijos procesas vis dažniau naudojamas greitai įvairių biologinių
bandinių analizei skirstymo sistemose. Šiuo metu ribotai pasiekiamų fazių taikymas mažos
molekulinės masės analičių tyrimui biologiniuose skysčiuose yra vienas populiariausių metodų. Šio
metodo esmė yra ta, kad didelės molekulinės masės molekulės (baltymai) dėl jų dydžio nepasiekia
hidrofobinio atvirkščių fazių sorbento paviršiaus ir nėra ant jo adsorbuojami, todėl išplaunami iš
kolonėlės su tuščiu tūriu, tuo tarpu mažos molekulinės masės analitės yra sulaikomos, ir taip
išskiriamos iš biologinio skysčio.
Ribotai pasiekiamų fazių taikymas tiesioginei biologinių skysčių analizei yra progresyvus
analiziniu požiūriu, kadangi eliminuojamas bandinio paruošimo etapas, sutrumpėja analizės laikas.
Nuo 1985 m. pirmą kartą susintetinus ribotai pasiekiamas fazes, jų įvairovė ir pritaikymo galimybės
išaugo. Šios nejudrios fazės naudojamos tradicinėje efektyviojoje skysčių chromatografijoje,
aplenkiant miniatiūrizaciją. Tik 2003 m. A. Maruškos mokslinė grupė pirmą kartą susintetino
kapiliarinio formato ištisinius ribotai pasiekiamus sorbentus ir panaudojo tiesioginei biologinių
skysčių analizei.
Miniatiūrizacija – aiškus šiuolaikinės chromatografijos bruožas – išpopuliarėjęs dėl
galimybės pasiekti aukštą chromatografinės kolonėlės efektyvumą, naudojant mažesnius analizuojamų
bandinių ir tirpiklių kiekius, bei dėl galimybės pritaikyti bioanalizės metoduose. Kapiliarinė
elektroforezė yra vienas iš miniatiūrizuotų analizės metodų, kuris dėl itin gero skirstymo efektyvumo,
mažo bandinio kiekio poreikio, mažos reagentų išeigos ir trumpo analizės laiko, taip pat plačiai
taikomas. Tačiau biologinių bandinių analizė kapiliarinės elektroforezės metodu sumažina rezultatų
pakartojamumą, kadangi biologinę matricą sudaro daug komponentų (pvz. baltymai, lipidai), kurie
adsorbuojasi lydyto kvarco paviršiuje.
Kietafazė mikroekstrakcija - perspektyvus bandinio sukoncentravimo metodas, kuriam
būdingas: atrankumas, ekstrakcija, sukoncentravimas ir bandinio įleidimas be tirpiklio ar su labai

7
mažu jo kiekiu. Kietafazė mikroekstrakcija sumažina bandinio paruošimo laiką, sumažina naudojamų
medžiagų kaštus bei pagerina aptikimo ribas.
Apjungti kietafazės mikroekstrakcijos ir kapiliarinės elektroforezės metodai naudojami
bandinių sukoncentravimui nejudrioje fazėje bei analičių atskyrimui. Naujų apjungtų metodų taikymo
ir automatizavimo problema vis dar išlieka sudėtinga biologinio bandinio matrica. Taigi ribotai
pasiekiamų fazių kaip sorbento taikymas apjungtame tiesioginiame kapiliarinės elektroforezės ir
kietafazės mikroekstrakcijos metode įgalina vykdyti tiesioginę bei automatizuotą medžiagų analizę be
atskiro bandinio paruošimo etapo.
Darbo tikslas: Susintetinti kapiliarinio formato ribotai pasiekiamas fazes, įvertinti šių fazių
chromatografines charakteristikas ir panaudoti tiesioginei biologinių skysčių analizei.
Uždaviniai:

1. Susintetinti kapiliarinio formato ištisines atvirkščias fazes, turinčias aldehidinių grupių

ir įvertinti susintetintų sorbentų hidrofobiškumą, hidrodinaminį pralaidumą ir efektyvumą.
2. Padengti atvirkščių fazių ištisinius sorbentus baltymu ir pritaikyti tiesioginei biologinių
skysčių kapiliarinei chromatografijai.
3. Panaudoti ribotai pasiekiamas fazes tiesioginei biologinių skysčių analizei apjungtu
kapiliarinės zonų elektroforezės ir kietafazės mikroekstrakcijos metodu.

8
 SANTRUMPOS

KSC – kapiliarinė skysčių chromatografija

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
UV – ultravioletas
NF – normalių fazių
AF – atvirkščių fazių
RPF – ribotai pasiekiama fazė
KE – kapiliarinė elektroforezė
KFME – kietafazė mikroekstrakcija
KZE – kapiliarinė zonų elektroforezė

9
 1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Skysčių chromatografija

Chromatografijos pradininku laikomas rusų mokslininkas Michailas Tswettas, kuris 1903 m.

paskelbė apie augalinių pigmentų mišinio suskirstymą į atskiras spalvotas zonas. Nuo tada kilo šio
metodo pavadinimas – chromatografija (rašymas spalvomis). Chromatografija – efektyvus medžiagų
atskyrimo metodas, šio metodo esmė, kad skirtingos medžiagos pasiskirsto tarp dviejų fazių: judrios ir
nejudrios. Mišinys yra suskaidomas į sudedamasias dalis, dėl skirtingų mišinio sudedamųjų dalių
savybių, kurios gali būti nustatomos ir analizuojamos atskirai. Molekulių perėjimas iš judrios fazės į
nejudrią vadinamas sorbcija, o procesas, kai molekulė pereina iš nejudrios į judrią fazę – desorbcija.
Skysčių chromatografijoje turi būti išlaikytos dvi sąlygos, vykdant chromatografinį medžiagų
atskyrimą:
1. Skirstomo mišinio komponentai turi būti tirpūs judrioje fazėje; nes gali nusifiltruoti ant
nejudrios fazės ir nedalyvauti chromatografiniame procese;
2. Analizuojamo mišinio komponentai turi būti sulaikomi nejudrioje fazėje; kadangi, nesant
sąveikos su sorbentu, gali eliuuoti kartu ir nebus išskirstomi.
Klasifikavimas chromatografinių metodų pagal:
a) judrios fazės agregatinę būseną (dujų, superkritinių skysčių ir skysčių chromatografija);
b) naudojamą atskyrimo mechanizmą (adsorbcinė, paskirstomoji, jonų mainų ir kt.
chromatografija);
c) eksperimento atlikimo metodiką (eliucinė, frontalinė ir išstūmimo).
Skysčių chromatografijos metodų palyginimas. Šiuolaikiniams chromatografinės analizės
metodams būdinga mikro- ar nanoformatas, tai yra miniatiūrizacija. Skirtingi formatai skirstomi pagal
eliuento debitą (nanochromatografija, kai tėkmės greitis matuojamas nl/min, mikrochromatografija -
l/min), kurį lemia kolonėlės vidinis skersmuo. Kapiliarinei chromatografijai būdingi nano- ir
mikroformatai. Kapiliarinė skysčių chromatografija (KSC) turi keletą privalumų lyginant su tradicine
efektyviąja skysčių chromatografija (ESC). ESC naudojamų kolonėlių vidinis skersmuo 2,1–4,6 mm,
o KSC naudojamos 10-300 m vidinio skersmens kapiliarinės kolonėlės. Judrios fazės tėkmės greitis
ESC yra 0,1-5 ml/min ir KSC - 0,2-10 l/min. Analizuojamo bandinio kiekis ESC yra 1-100 l, o
KSC injektuojamo bandinio tūris vos keli nl [1]. Taigi, KSC chromatografijos metodas yra „taupesnis“
tiek nejudrios, tiek judrios fazės kiekiu nei ESC.
10
 KSC naudojami toki patys detekcijos metodai: UV, regimojo spektro, amperometrinė,
fluorescencinė detekcija, kaip ir ESC. „Tiesioginė“ detekcija (atliekama tiesiogiai kapiliare) padidina
chromatografinį efektyvumą, kadangi nėra papildomo sujungimo su detektoriumi. Privalumas, kad
KSC patogu sujungti su masių spektrometru, kadangi nereikalingas srauto paskirstymas norint
kiekybiškai ir kokybiškai aptikti labai mažas analičių koncentracijas [2-4].
Fazių sistemos pagal tai, ar nejudri, ar judri fazė yra poliškesnė, skirstomos į dvi rūšis:
1) Normalių fazių chromatografija – eliucijos procesas, kada nejudri fazė yra labiau
polinė nei judri fazė.
2) Atvirkščių fazių chromatografijoje nejudri fazė yra mažiau polinė nei judri fazė. ESC
šios rūšys sudaro atitinkamai 20 proc. ir 80 proc. visų chromatografinių skirstymų [5].
Atliekant skysčių chromatografiją kolonėlėje, užpildytą nejudria faze (sorbentu), per kurią
teka judri fazė (eliuentas). Skysčių chromatografijos metodu mišinio komponentų išskirstymas gali
būti atliekamas naudojant normalių fazių (NF) arba atvirkščių fazių (AF) sistemas bei izokratinės arba
gradientinės eliucijos chromatografinį režimą.
NF chromatografijai būdinga didelis atrankumas, taip pat naudojama, kuomet skirstomos
medžiagos yra mažai tirpios vandeniniuose tirpaluose [6]. Atskirtas medžiagas galima nesunkiai
sukoncentruoti išgarinant lakų organinį tirpiklį. Todėl NF gali būti naudojama preparatiniams
tikslams. AF chromatografija populiaresnė dėl puikaus suderinamumo su biomolekulėmis, kurios
natūraliai egzistuoja, tirpsta, nedenatūruoja vandeninėse terpėse [7].
Jeigu nejudri fazė yra amfifilinė (pasižymi ir lipofilinėmis, ir hidrofilinėmis savybėmis), gali
būti panaudota tiek NF, tiek AF chromatografijai [8].
Skysčių chromatografijos metodas dažnai taikomas junginių identifikacijai, jų struktūros
nustatymui ir kiekybiniam įvertinimui įvairiose srityse, biomedicinos moksluose - tiriant vaistų
farmokokinetinius parametrus, aplinkotyros moksluose - nustatant teršalus, pesticidus, jų
koncentracijų įtaką, taikomojoje chemijoje – užtikrinant visų gamybos procesų kokybę, maisto
technologijos moksle – nustatant ingredientus, kvapiąsias medžiagas, falsifikatus bei kontroliuojant jų
kokybę [9-13].
Galima teigti, kad ESC dėka galima analizuoti įvairių mišinių kokybinę ir kiekybinę sudėtį,
kad ESC metodas turėjo įtakos chemijoje, biologijoje, medicinoje bei įvairiose technikos šakose.

11
 1.2. Biologinio bandinio paruošimas analizei

Biologiniuose skysčiuose esančių vaistinių, ar kitų komponentų nustatymas yra svarbus jų

poveikio gyvam organizmui supratimui ir paaiškinimui. Biologinių bandinių tyrimų rezultatai yra
svarbūs paciento sveikatos būklei įvertinti, teisingam įvairių ligų diagnozavimui, vaistų įsisavinimui
tirti. Dauguma chromatografinių metodų yra išvystyti, automatizuoti, tačiau šių metodų silpnoji ir
daugiausiai laiko užimanti vieta yra bandinio paruošimo žingsnis, kuris gali sudaryti net iki 60 %
analizės trukmės ir gali sąlygoti apie 30 % didesnę paklaidą. Efektyviosios skysčių chromatografijos
(ESC) metodu analizę biologiniuose skysčiuose apsunkina, kad analizuojamos medžiagos
koncentracija dažniausiai būna maža ir sudėtingoje matricoje. Todėl prieš analizę paprastai atliekamas
bandinio išvalymas ir analitės sukoncentravimas.
Modernios laboratorijos, ypač farmacijos pramonėje, naudojasi naujausių automatizuotų
prietaisų privalumais, apdorodomos kelis šimtus ar net tūkstančius bandinių per dieną. Tačiau
dauguma laboratorijų naudoja klasikinius, tik iš dalies automatizuotus ir miniatiūrizuotus bandinių
paruošimo metodus [14].
Biologinės matricos, pavyzdžiui, serumas ir plazma, yra sudėtingi mišiniai, kurių didžiąją
dalį sudaro baltymai, t.y. albuminas ir kt. Kai baltyminės matricos tiesiogiai injektuojamos į atvirkščių
fazių sorbentą, vyksta baltymų denatūracija ir negrįžtama adsorbcija ant sorbento dalelių, dėl kurios
analizės proceso efektyvumas sumažėja, o kolonėlės užsikemša. Šią problemą galima išspręsti
paruošiant bandinį ir sumažinant bandinio matricos komponentų skaičių.
Pagal analizuojamų biologinių bandinių skaičių nors plazma yra sudėtingas mišinys, tačiau
sudaro apie 70% visų analizuojamų bandinių, kai serumo analizės sudaro 13%, kraujo – 3,3%, tik apie
3,3% šlapimo analizių. Kitų biologinių bandinių (pavyzdžiui, seilės, plaukai, kepenų audiniai ir kt.) –
10,4% [15]. Vaistų savybių tyrimai atliekami, norint įvertinti vaisto veikimo mechanizmą,
pasisavinimą, metabolizmą, nustatyti terapines, toksines bei mirtinas dozes ir nepageidaujamas
reakcijas. Biologinių skysčių analizių atliekamų farmacijoje skaičius pateikiamas 1 lentelėje [16].

1 Lentelė. Farmacijoje atliekamų biologinių skysčių analizių skaičius [16 ].

Stadija Įprastas bandinių skaičius

Tyrimai 2000 – 3000 Bandymai su gyvūnais prieš taikant žmogui
Pritaikymas 15000 – 50000 Priešklinikinės ir klinikinės studijos
Supaprastintas pritaikymas 5000 – 25000 Nauja egzistuojančio vaisto forma

12
 Farmakokinetinėje analizėje dėmesys skiriamas naujų, greitesnių ir tuo pačiu atrankesnių,
jautresnių analizės metodų vystymui. Visa tai nulemia metodo pasirinkimą. Biologinio bandinio
paruošimas analizei priklauso nuo bandinio kiekio, pašalinių bei analizuojamų medžiagų sudėties ir
koncentracijos, bandinių skaičiaus. Labai svarbu atsižvelgti į analitės stabilumą bandinio ruošimo
metu. Baltymai, esantys biologiniame bandinyje, nusodinami dažniausiai organiniais tirpikliais
(etanoliu, metanoliu, acetonu) ir druskomis (dažniausiai amonio sulfatu). Taip pat baltymai gali būti
pašalinti naudojant ultrafiltraciją, dializę arba mikrodializę [17]. Jeigu bandinys nėra pakankamai
švarus, taikomi skysčių arba kietafazės ekstrakcijos metodai. Šių metodų taikymas yra paprastas, bet
ilgai trunka, sunaudojama daug organinių tirpiklių.
Baltymų nusodinimas. Mechanizmai, kurie lemia baltymų agregaciją vandeniniuose
organinių tirpiklių tirpaluose yra labai įvairūs. Į tirpalą, turintį baltymų, įpylus organinio tirpiklio,
sumažėja tirpalo dielektrinė konstanta. Juo mažesnė tirpalo dielektrinė konstanta, juo lengviau
skirtingai įkrautos molekulės sąveikauja viena su kita. Tokiu būdu molekulės sulimpa ir nusėda.
Dažniausiai baltymai nusodinami naudojant acetonitrilą [18], metanolį [19], etanolį [20] arba acetoną
[21].
Ultrafiltracija dažnai naudojama baltymų ir vaistų sąveikai tirti [22-24]. Plazmos bandinys
įdedamas į ultrafiltracijos mėgintuvėlį, kurį sudaro du rezervuarai atskirti pusiau pralaidžia membrana.
Ultrafiltracija turi būti atliekama 37°C temperatūroje, nes vaistų sąveika su baltymais priklauso nuo
temperatūros.
Dažnai taikomas metodas dializė, tačiau vaistų išskyrimas iš biologinio bandinio užtrunka
ilgiau [25,26]. Dializė atliekama 37°C temperatūroje. Kada pasiekiama pusiausvyra, vaisto
koncentracija buferyje atitinka laisvo vaisto koncentraciją plazmoje.
Mikrodializė dažnai taikoma įvairių vaistų analizei: centrinės nervų sistemos
neuromediatorių, įvairių vaistų metabolitų in vivo ir in vitro analizei [27, 28]. Mikrodializė, kaip ir
dializė, yra nuo difuzijos priklausantis procesas, t.y. vaistų molekulės difunduos per membraną tol, kol
bus pasiekta koncentracijos pusiausvyra abipus membranos.
Ruošiant bandinius analizei ypač populiarūs ekstrakcijos skysčiu metodai. Skystiems
bandiniams ekstrahuoti naudojami: skystis – skystis ekstrakcija ir kietafazė ekstrakcija, kietiems –
mechaninė ekstrakcija tirpikliais, Soksleto ekstrakcija, ekstrakcija ultragarsu. Tai paprasti,
nereikalaujantys sudėtingos aparatūros, tačiau daug laiko užimantys metodai (pvz., Soksleto
ekstrakcija gali trukti net 48 valandas). Be to, ekstrahuojant šiais metodais sunaudojami dideli brangių
ir toksiškų tirpiklių kiekiai.

13
 Skystis - skystis ekstrakcijos metodo tikslas - sukoncentruoti analitę vienoje iš dviejų skystų
fazių. Analitė pasiskirsto tarp fazių, priklausomai nuo temperatūros, santykinių tūrių bei tirpumo (1
pav.). Svarbu pasirinkti tinkamas sąlygas, kad pageidautina analitė būtų sukoncentruojama vienoje iš
fazių. Tinkamai optimizuota ekstrakcija užtikrina gerą analitės ekstrakciją, tačiau dažniausiai ne 100%
išgavą. Tačiau kitas metodo trūkumas – emulsijos susiformavimas.

1 pav. Skystis – skystis ekstrakcijos pavyzdys.

Skystis – skystis ekstrakcijos atveju abi fazės, tarp kurių pasiskirsto analitė, yra tarpusavyje
nesimaišantys skysčiai. Paprastai viena fazė yra vanduo, kita – organinis tirpiklis.
Ekstrakciją galima atlikti, jei analitė gerai tirpsta organiniame tirpiklyje. Parenkant
ekstrahentą, reikia atsižvelgti į medžiagų maišumą, tankį bei tirpumą. Tirpikliai yra maišūs, jei juos
sumaišius bet kokiomis proporcijomis nesusidaro dviejų atskirų fazių.
Kietafazė ekstrakcija (KE) yra pagrįsta medžiagų pasiskirstymu tarp skystos ir kietos fazių.
Kietafazė ekstrakcija dažnai naudojama skystų bandinių gryninimui ir sukoncentravimui [29].
Kietafazės ekstrakcijos atveju, lyginant su skysčių ekstrakcija, sunaudojama mažiau organinių
tirpiklių, tačiau jų kiekis vis dėlto nemažas. Kietafazės ekstrakcijos diskai ir šerdelės gali užsikimšti,
todėl norint pilnai automatizuoti šį metodą, reikalinga sudėtinga ir brangi aparatūra.
Atranki ekstrakcija priklauso nuo pasirinktos stacionarios fazės, nuo praplaunančio tirpiklio
ir eliuento. Optimizavus sąlygas galima atlikti selektyvią analičių analizę.
Kietafazė mikroekstrakcija (KFME) - tai naujas koncentravimo metodas, kuriam nereikia nei
tirpiklių, nei sudėtingos aparatūros. Šiuo metodu galima koncentruoti junginius iš dujinių, skystų ir
kietų bandinių.
Kietafazė mikroekstrakcija kapiliare - ekstrakcijai yra naudojama trumpa kapiliarinė
kolonėlė, kurios vidinės sienelės padengtos nejudria faze [30]. Analitės kiekis, sorbuotas nejudria faze
nusistovėjus pusiausvyrai, yra proporcingas jos koncentracijai tirpale.
14
 Biologiniuose skysčiuose esančių vaistų ir jų metabolizmo produktų tyrimui naudojama
efektyvioji skysčių chromatografija. Tačiau baltyminės matricos tiesiogiai injektuojamos į AF kolonėlę
gali užkimšti kolonėlę ir sugadinti chromatografinę sistemą. Nustatant biologiškai aktyvių medžiagų
koncentracijas biologiniuose skysčiuose, prieš atliekant analizę, baltymai atskiriami nu biologiškai
aktyvių medžiagų. Tradicinis biologinio bandinio paruošimas analizei susideda iš daugelio žingsnių:
baltymų nusodinimo, centrifugavimo, vaistų ekstrakcijos iš viršnuosėdinio skysčio, tirpiklio
išgarinimo, nuosėdų tirpinimo ir kt.
Specialių ir atrankių ekstrakcijos įkrovų, leidžiančių atlikti tiesioginę ir daugiakartinę
biologinių bandinių injekciją, sukūrimas yra perspektyvus būdas sumažinti bandinio paruošimo laiką.
Naudojant ribotai pasiekiamas fazes pašalinamos makromolekulės, o analitės paprastai sulaikomos dėl
hidrofobinės ar elektrostatinės sąveikos. RPF sistema leidžia atlikti automatizuotą, supaprastintą ir
pagreitintą bandinio paruošimo žingsnį išvengiant daugelio etapų (2 lentelėje). 2003 m. A. Maruškos
vadovaujama mokslinė grupė pirmą kartą susintetino kapiliarinio formato ištisinius akrilinius RPF
sorbentus ir panaudojo tiesioginei biologinių skysčių analizei [31, 32].

2 lentelė. Bandinio paruošimo žingsniai tradiciniam ir ribotai pasiekiamų fazių metodui [33].
Tradicinis RPF metodas
1. Bandinys 1. Bandinys
2. Baltymų nusodinimas
3. Centrifugavimas
4. Vaistų ekstrahavimas tirpikliu iš
viršnuosėdinio sluoksnio
5. Ekstrahuojamo tirpiklio išgarinimas
6. Nuosėdų tirpinimas judrioje fazėje
7. Bandinio filtravimas per 0,2 µm porų 7. Bandinio filtravimas per 0,2 µm
dydžio filtrą porų dydžio filtrą
8. Injektavimas į tradicinę ESC kolonėlę 8. Injektavimas į RPF kolonėlę

Naudojant RPF sutrumpėja bandinio paruošimo etapas, todėl galima automatizuoti analizės
procesą.
Tiesioginei biologinių skysčių analizei atlikti naudojami du skirtingi būdai: vienos kolonėlės
chromatografinė sistema [34] ir kolonėlių perjungimo metodas - dviejų kolonėlių chromatografinė
sistema [35]. Pagrindinė vienos kolonėlės sistemos problema, kad sunku suderinti bandinio paruošimą
su analize. RPF kolonėlių efektyvumas dažnai yra nepakankamas analizei atlikti. Privalumas yra tai,
kad tiek bandinio paruošimas, tiek analizė atliekami vienoje kolonėlėje ir nereikia papildomos
chromatografinės įrangos modifikavimo.

15
 Norint pailginti chromatografinės kolonėlės naudojimo laiką, buvo pradėtos naudoti
prieškolonės (kolonėlių perjungimo) sistema [36], kurioje pagrindinė biologinio skysčio
makromolekulių frakcija kontaktuoja tik su prieškolone, o į analitinę kolonėlę nepatenka, taigi
analitinė kolonėlė nepatiria neigiamo baltymų biologiniuose skysčiuose, poveikio.
Apibendrinant galima teigti, kad labai retai tyrėjai išvengia biologinio bandinio paruošimo
procedūros. Kuo mažiau prieš injekciją naudojama bandinio paruošimo žingsnių, tuo greitesnė,
taupesnė ir tikslesnė yra analizė.

1.3. Ištisinės ribotai pasiekiamos fazės

Chromatografijoje terminas „ištisinis (monolitinis) sorbentas“ plačiai pradėtas naudoti XX a.

aštuntojo dešimtmečio pabaigoje, devintojo dešimtmečio pradžioje. Iki tol ištisinio sorbento
panaudojimas buvo suvokiamas labai siaurai. Ištisinės polimerinės matricos sintetinamos naudojant
metakrilamidus, metakrilatus, stireną ir divinilbenzeną bei kt. [37-40]. Tirpikliai ir analitės gali
įsiskverbti į polimerinę matricą, kai judri fazė yra pumpuojama per kanalus. Analičių masių mainai
paremti laminarine tėkme kanaluose ir makroporose (> 50 nm), o molekulių difuzija priklauso nuo jų
patekimo į mikro ir mezoporas (< 2 nm, ir 2-50 nm, atitinkamai) [41]. Ištisiniams sorbentams
būdingas geras hidrodinaminis pralaidumas bei efektyvumas.
Ištisinį sorbentą galima susintetinti per porą valandų, jei laikomasi sintezės protokolo.
Gamybos paprastumas yra vienas pagrindinių privalumų ištisinių sorbentų, sąlygojantis vis platesnį jų
pritaikymą chromatografinei analizei [42].
Dažniausiai naudojami, ištisinių polimerų sorbentų sintezei, polimerizacijos metodai yra:
radikalinė polimerizacija [43], polimerizacija iš mikroemulsijos [44], polikondensacija [45]. Tinkamai
pasirinkus visą kompleksą polimerizacijos metu kontroliuojamų parametrų, galima optimizuoti
ištisinio polimerinio sorbento cheminę sudėtį, porėtumą ir gauti porėtas struktūras, pasižyminčias
aukštu hidrodinaminiu pralaidumu. Pagrindinis ištisinių sorbentų privalumas yra jų sintezės
paprastumas net ypatingai mažo skersmens (25-320 μm) lydyto kvarco kapiliaruose.
Chromatografinei analizei skirtų nejudrių fazių pasirinkimas yra labai platus, tačiau šiuo
metu ribotai pasiekiamų fazių naudojimas mažos molekulinės masės analičių tyrimui yra vienas
populiariausių metodų. Ribotai pasiekiamos fazės turi skirtingą vidinį ir išorinį paviršius. Pagal
Desilets, RPF – tai įkrovos, kurios leidžia atlikti tiesioginę biologinių skysčių injekciją, apribojant
sąveikos centrų ir makromolekulių kontaktą. Išorinis nejudrios fazės paviršius yra hidrofilinis, vidinis

16
nejudrios fazės paviršius yra hidrofobinis [46]. Makromolekulės hidrofilinio paviršiaus dėka
nesąveikauja su hidrofobiniais sorbento centrais, o mažos molekulinės masės analitės pasiekia
aktyvius centrus ir yra sorbuojamos (2 pav.).

2 pav. Ribotai pasiekiamų sorbentų schema.

Ribotai pasiekiamos fazės skirstomos pagal baltymų atskyrimo mechanizmą.

Makromolekulės gali būti atskirtos fazinio barjero dėka – dėl porų dydžio, ir dėl cheminio barjero –
baltymo ar polimero ant išorinio dalelių paviršiaus. Boos ir Rudolphi suklasifikavo ribotai pasiekiamų
fazių sorbentus pagal jų paviršiaus chemiją [46], t.y. fazes su skirtingais siejimosi su išoriniais ir
vidiniais paviršiaus tipais (bimodalinės fazės) ir fazes su panašiu siejimusi su abiem paviršiais
(vienamodalinės fazės).
Bimodalinės fazės pasižymi hidrofiliniu išoriniu ir hidrofobiniu vidiniu paviršiumi. Kai
vidiniai ir išoriniai paviršiai turi tas pačias savybes, ribotai pasiekiamos fazės yra vienamodalinės.
Todėl, ribotai pasiekiamos fazės sorbentai gali būti skirstomi į keturias grupes: fizinius išsisklaidymo
barjerus su vienamodaline ar bimodaline fazėmis ar cheminius išsisklaidymo barjerus su
vienamodaline ir bimodaline fazėmis [47], kaip pavaizduota (3 lentelėje.).

17
 3 lentelė. Ribotai pasiekiamų fazių klasifikacija [47].

A tipo RPF. Šios nejudrios fazės buvo panaudotos analičių, turinčių tris kondensuotus
aromatinius žiedus, skirstymui [48].
B tipo RPF. Sukurti sorbentai plačiai taikomi nustatant vaistus ir jų metabolizmo produktus
biologiniuose skysčiuose.
C tipo RPF. Dažniausiai naudojamos įvairių vaistų metabolitų nustatymui šlapime.
D tipo RPF. Porėtas silikagelis (porų dydis 12 nm) imobilizuotas baltymais (žmogaus
plazmos baltymais, jaučio serumo albuminu arba kiškio plazmos baltymais) [49].
Ribotai pasiekiamų fazių pritaikymai. RPF dažniausiai pritaikytos farmakokinetinių tyrimų
analizės srityje, ypač vaistų ir jų metabolitų, esančių biologinėse matricose (plazmoje, serume),
analizėje, kuriant bei tiriant naujus farmacinius preparatus. Taip pat, taikant RPF, galima tyrinėti
maistinius ir gamtinius bandinių kompleksus.
1986 m. rinkoje pasirodė pirmosios komercinės RPF kolonėlės, kurių įvairovė ir pritaikymo
galimybės nuolat didėja. 4 lentelėje išvardintos komercinės RPF kolonėlės ir nurodyti jų pritaikymai.

18
 4 lentelė. Dažniausiai analizuojamos analitės biologiniuose skysčiuose naudojant komercines
ribotai pasiekiamų fazių kolonėles skirtas efektyviajai skysčių chromatografijai.
Firma Kolonėlės Plazma Serumas Šlapimas Literatūra
MerckKGaA Co, Vokietija

LiChrospher RP-4 Citalopramas, epirubicinas, Digoksinas, metadonas - [50, 51-

ADS pirlindolis 55]
LiChrospher RP-8 Betablokatoriai, metotreksatas Linezolidas, ceftazidinas, Linezolidas [56-60]
ADS verapamilas
LiChrospher RP- Artemizininas, barbituratai, Meropenemas, klenbuterolis, Arachidoninė [59, 61-
18 ADS benzodiazepinai, salbutamolis, propafenonas rūgštis, 73]
flunitrazepamas, vietiniai betablokatoriai
anestetikai, nitrendipinas,
karbamazepinas, kokainas,
felodipinas
LiChrospher XDS Neuropeptidas Y, atropinas, - - [74, 75]
betablokatoriai, fenoterolis,
ipratropiumas, prokainas ir
terbutalinas
Regis Technologies, JAV AB, ŠvedijaChromTech

BioTrap 500 MS Flunitrazepamas, Benzodiazepinai - [69, 76,

benzodiazepinai 77]
BioTrap C18 Betablokatoriai [78,79]

SPS C8 Vietiniai anestetikai Antipirinas, barbituratai, - [80-84]

karbamazepinas,
vankomicinas, verapamilas
SPS C18 Karbamazepinas, Betablokatoriai, - [67, 85-
ropivakainas, bupivakainas klenbuterolis, salbutamolis, 89]
amoksicilinas,
chlozoksazonas
GFF Lamotriginas, cefpiramidas, Klenbuterolis, salbutamolis, - [67, 81,
dopaminas, furosemidas, barbituratai, anti-epileptikai, 90-99]
propofolis bilirubinas, kreatininas,
hidroksianizolas, 4-
indoksilsulfatas, lamotriginas
GFF II Granisetronas Metadonas,betablokatoriai, Azolo [54, 67,
barbituratai, karbamazepinas, pesticidai 81, 100-
anti-epileptikai 102]
Supelco, JAV

Hisep Pentoksifilinas, rifapentinas Verapamilas, 10- Katecholamina [83, 103-

hidroksikamptotechinas, i 110]
karbamazepinas,
oksitetraciklinas,
fleroksazinas,
propentofilinas,
sulfamonometoksinas,
miloksacinas
JaponijaShiseido Ltd.,

Capcell Pak MF Aloezinas, aziatikozidas, Barbituratai, cizapridas, - [111-119]

Ph-1 bifenildimetildikarboksilatas, tofisopamas, mikofenolinė
klomipraminas, omeprazolas, rūgštis
tiaketazonas

Capcell Pak MF Mitomicinas C , sildenafilas - Heroinas [120-122]

SCX

19
OlandijaChrompack,
ChromSpher Beta-adrenoreceptorių - Tetraciklinas [123,124]
BioMatrix ligandai

20
 MerckKGaA - viena iš komercinių RPF kolonėlių gamintojų lyderių, gaminanti įvairias
LiChrospher kolonėles, skirtas vaistų veikliųjų medžiagų nustatymui plazmoje [74, 75, 51-55, 56, 57,
61-68], serume [50, 54, 58-60, 69, 70], šlapime [58, 63, 71, 72]. Kiek rečiau LiChrospher kolonėlės
naudojamos vaistų nustatymui seilėse [61] ir audiniuose[52, 54, 66]. Švedijoje gaminamos BioTrap
kolonėlės skirtos betablokatorių, steroidų, benzodiazepinų analizei plazmoje [69, 76], serume [78, 76].
JAV RPF gamina dvi bendrovės: Regis Technologies ir Supelco. Pagrindiniai skirtumai, kad Regis
Technologies gamina B tipo RPF, o Supelco - C tipo RPF kolonėles. Naudojant B tipo RPF kolonėles,
dažniausiai analitės tiriamos serume [54, 67, 80-86, 90-95, 100], plazmoje [84, 87-89, 95-99, 102],
kiek rečiau šlapime [101]. Supelco kolonėlės skirtos vaistų metabolitų nustatymui serume [103-107],
audiniuose [107], šlapime [108], plazmoje [109, 110]. Japonijoje Shiseido Ltd. gaminamos Capcell
kolonėlės sėkmingai taikomos specifines savybes turinčių analičių (tokių kaip aloezinas, aziatikozidas,
heroinas, cizapridas, tofisopamas ir kt.) biologiniuose bandiniuose analizei [111-122]. Šios kolonėlės
palyginti su kitų firmų gaminamomis kolonėlėmis yra brangesnės. Olandijoje Chrompack gamina
dideles poras (120 Å) turinčias ChromSpher kolonėles. Naudojant šias komercines kolonėles
eliuojama >99% baltymų, atlikus 200 biologinio bandinio injekcijų, kolonėlės efektyvumas nekinta
[123, 124].
Nežiūrint plačios komercinių RPF kolonėlių pasiūlos, iki šiol rinkoje nėra kapiliarinio
formato RPF kolonėlių skirtų biologinių bandinių analizei.

1.4. Kapiliarinė elektroforezė

Kapiliarinė elektroforezė (KE) - atskyrimo metodas, kuris atliekamas naudojant siaurus

kapiliarus (20 – 200 μm vidinio skersmens) tiek didelių, tiek mažų biologinių junginių efektyviam
atskyrimui. Šiuos skirstymus sąlygoja aukštos įtampos panaudojimas, kuris gali sukurti kapiliaro
viduje tam tikro greičio buferinių tirpalų ir jonų elektroosmozinį ir elektroforezinį srautus. KE turi
bruožų, būdingų tiek efektyviajai skysčių chromatografijai (ESC) [125].
Elektroforezės sąlygos. Jonizuotų analičių skirstymas KE metodu paremtas skirtingu jų
elektroforeziniu judriu. Elektroforezinis judris – dydis, lygus dalelių elektroforezinio judėjimo
greičiui, įgyjamam 1V/m elektriniame lauke. Elektroforeziniam dalelių judriui įtakos turi daugybė
veiksnių: analitės būsena, elektrinio lauko parametrai, buferinio tirpalo charakteristikos. Analitės
būseną galima nusakyti krūviu, dalelės matmenimis ir forma. Didėjant dalelės suminiam krūviui,

21
judrumas didėja. Kuo stambesnės dalelės, tuo mažesnis jų judrumas. Tai susiję su didesne trinties jėga
bei dalelių elektrostatine sąveika su aplinka.
KE yra skysčių chromatografijos ir elektroforezės derinys, kuris atliekamas kapiliariniame
lygmenyje. Šiai analizei būdingi bruožai:
▪ atskyrimas analičių atliekamas silikagelio kapiliaro viduje;
▪ analizei atlikti naudojamos aukštos elektrinio lauko stiprio reikšmės;
▪ detekcija atliekama kapiliare
▪ skiriamoji geba gaunama tokia kaip kapiliarinės chromatografijos ar didesnė;
▪ injektuojami labai maži bandinio kiekio;
▪ automatizuotas, paprastas naudoti;
▪ platus metodo pritaikymas.
KE instrumento konstrukcija yra paprasta: silikagelio (kvarco) kapiliaras su optinės
detekcijos langu, nuo kurio pašalintas UV nepralaidus polimidinis sluoksnis, reguliuojamas aukštos
įtampos šaltinis, du elektrodai, du buferio rezervuarai, o optinės detekcijos langas fiksuojamas ties
detektoriumi [125].
Nuo pirmųjų Hjerten bandymų 1967 m. [126] iki šių dienų KE metodas labai patobulėjo,
tačiau vienas iš didžiausių šio metodo trūkumų yra nepakankamas detekcijos jautrumas. Šis trūkumas
sustabdė metodo naujas pritaikymo galimybes įvairiose mokslo srityse [127,128]. Todėl pastaruoju
metu didelis dėmesys yra skiriamas KE jautrumo didinimui, atliekamas bandinio sukoncentravimas
adsorbuojant nejudria faze, analitės juostos suspaudimas ir prailginto optinio kelio kapiliarai. Norint
peržengti šių dienų bioanalitinės chemijos ribas yra būtina prisitaikyti prie naujo metodo
miniatiūrizacijos tendencijų.
Kapiliarinės elektroforezės metodo taikymas. Platus šio metodo taikymas yra vienas iš KE
privalumų (pvz., aminorūgščių, vaistų, vitaminų, pesticidų, neorganinių jonų, organinių rūgščių, dažų,
baltymų, karbohidratų, oligonukleotidų, DNR restrikcijos fragmentų ir netgi visos ląstelės bei
bakterijų analizė) [129,130]. Nors KE pritaikymų sritis yra gana plati, techninis lygis vis dar
tobulinamas. Pastaruoju metu intensyviai atliekamas KE metodų standartizavimas. Tai apima smailių
migracijos laikus bei pakartojamumą analizių, sistemos jautrumą, kapiliaro padengimą, elektroosmozę
bei analitės sąveikos su kapiliaru ribas.
Daugelio vaistų koncentracijos serume sudaro 1-30 mg/L. Naujų vaistų koncentracijos yra
dar mažesnės. Norint nustatyti tokias mažas vaistų koncentracijas, esant didelėms baltymų
koncentracijoms bandinyje, vaistus tenka sukoncentruoti KE sistemos kapiliare arba iš anksto prieš
injektuojant mėginį. KE yra ypatingai vertinga analizuojant junginius, kuriems dar nėra sukurti

22
paprasti analizės metodai [125]. Aišku, kad kuo daugiau tyrinėtojų naudosis KE ir kuo daugiau
publikuos rezultatus, tuo lengviau bus standartizuoti šį metodą.

1.5. Kietafazė mikroekstrakcija

Kietafazė mikroekstrakcija - tai naujas ir labai perspektyvus koncentravimo metodas.

Ekstrakcijos tikslas yra atrankiai sukoncentruoti analitę vienoje iš fazių. Vykstant procesui,
analogiškai kaip chromatografinio atskyrimo atveju, analitė pasiskirsto tarp fazių, priklausomai nuo
temperatūros, santykinių tūrių bei giminingumo. Svarbu pasirinkti sąlygas, kurioms esant pageidautina
analitė yra sukoncentruojama vienoje iš fazių. Kruopščiai parinkta bei optimizuota ekstrakcija gali
užtikrinti atrankią analitės ekstrakciją, tačiau dažniausiai ne 100 % išgavą. Priešingai, ypač efektyvus
Soxhlet ekstrakcijos metodas užtikrina maksimalią išgavą, bet neatrankią ekstrakciją [131].
Superkritinių skysčių ekstrakcija yra labiau atranki nei Soxhlet, tačiau ji mažiau efektyvi, kadangi
anglies dioksidas yra palyginti silpnas tirpiklis. Procesui taip pat turi įtakos ekstrahuojamo bandinio
drėgmė. Ekstrakcijos procesas gali būti intensyvinamas keliant temperatūrą ar apdorojant bandinį
mikrobangomis ar ultrgarsu. Perkaitinto skysčio būsenos tirpiklis pasižymi daug didesne tirpinimo ir
ekstrakcijos galia, o mažesnė jo klampa užtikrina didesnius difuzijos greičius bei daug efektyvesnę
ekstrakciją [132].
Kietafazė mikroekstrakcija kapiliare. Ekstrakcijai yra naudojama trumpa kapiliarinė
kolonėlė, kurios vidinės sienelės padengtos nejudria faze. Šis metodas remiasi tais pačiais principais
kaip ir paprasta kietafazė mikroekstrakcija, todėl nebūtina laukti, kol įvyks pilna ekstrakcija. Turi tik
nusistovėti analitės pasiskirstymo tarp tirpalo ir nejudrios fazės pusiausvyra. Analitės kiekis, sorbuotas
judria faze nusistovėjus pusiausvyrai, yra proporcingas jos koncentracijai tirpale. Pasibaigus
ekstrakcijai analitė išstumiama iš kolonėlės, panaudojant minimalų organinio tirpiklio tūrį, ir gautas
ekstraktas analizuojamas.
Kietafazė mikroekstrakcija kapiliare turi ir dar kitų pliusų. Šiam metodui gali naudoti
įprastines kapiliarines dujų chromatografines (DC) kolonėles su termiškai stabiliomis modifikuotomis
fazėmis, kurios yra atsparesnės negu kietafazės mikroekstrakcijos strypelių dangos. Jos taip pat
atsparios ir organiniams tirpikliams. Tokią kolonėlę galima sujungti tiesiai su DC ar KE kolonėle ir po
ekstrakcijos iš karto atlikti analičių nustatymą. Taip būtų iki minimumo sumažinti analičių nuostoliai,
perkeliant jas iš ekstrakcinės sistemos į nustatymo sistemą. Kapiliarinės ekstrakcinės kolonėlės gali
būti panaudojamos daug kartų. Dar vienas metodo privalumas - jis lengvai automatizuojamas.

23
 Galima tikėtis, jog kietafazę mikroekstrakciją kapiliare bus galima naudoti rutininei analizei.
Tai labai perspektyvus metodas, kuris turi būti tobulinamas toliau.
Kietafazės mikroekstrakcijos privalumai ir trūkumai. Metodo tikslumas. Kietafazės
mikroekstrakcijos tikslumui įtakos turi šie veiksniai:
 ekstrahento dangos tūris (storis ir plotas);
 ekstrahento dangos kokybė (įtrūkimai ir pan.);
 ekstrakcijos temperatūra;
 mėginio matricos komponentai (druskos, organiniai junginiai, drėgmė);
 maišymas;
 ekstrakcijos trukmė (jei dirbama nepusiausvyrinėse sąlygose);
 mėginio tūris;
 viršerdvės tūris; ekstrakcijos indo forma;
 trukmė tarp ekstrakcijos ir analizės; adsorbcija ant indo sienelių;
Visi šie parametrai turi būti išlaikomi pastoviais, norint gauti tikslų rezultatų pakartojamumą
[133].
Kietafazė mikroekstrakcija yra efektyvus metodas, taikomas daugelio junginių ekstrakcijai iš
įvairių matricų. Metodas atrankus, greitas, paprastas, pigus, lengvai pritaikomas analizei lauko
sąlygomis, gali būti automatizuojamas.

1.6. Miniatiūrizacijos ir metodų apjungimo tendencijos šiuolaikinėje cheminėje

analizėje

Šiuolaikinėje cheminėje analizėje nustatant biologiniuose skysčiuose esančius vaistų

metabolitus, kur kas perspektyviau naudoti ekstrakcijos ir skirstymo sistemas apjungtas į vientisą
sistemą.
Nors daugelis fizikinės-cheminės analizės metodų yra automatizuoti, bandinio paruošimas
vis dar laikomas lėtu, daug darbo reikalaujančiu analizės proceso etapu. Nors kai kurios didelio
našumo, laboratorijos naudoja naujausią automatizuotą įrangą šimtų ar net tūkstančių analizių
atlikimui per dieną. Tačiau dauguma laboratorijų naudojasi klasikiniais tik šiek tiek miniatiūrizuotais
ar nežymiai automatizuotais metodais [134].

24
 Labai retai analizuotojui tenka galimybė injektuoti bandinius prieš tai jų neapdorojus.
Praktika rodo, jog bandinio paruošimui analizuotojas vidutiniškai naudoja tris metodus. Bandiniui
skysčių ekstrakcija, visiškas tirpiklio išgarinimas ir analičių ištirpinimas tinkamame tirpiklyje yra
tipinė skysto bandinio ruošimo seka. Kai kuriais atvejais tirpalui pakanka ir vieno, pvz. praskiedimo,
žingsnio [134]. Kuo mažiau prieš injekciją naudojamų metodų apdorojimui tuo geriau. Aiški ir
optimizuota bandinio ruošimo strategija yra būtina, siekiant sumažinti apdorojimo žingsnių skaičių -
kiekvienas žingsnis atitinka papildomą laiką ir potencialų paklaidos šaltinį.
KE naudojama daugelyje sričių, tarp jų ir vaistų analizėje. Nors KE metodas nėra
pakankamai jautrus nustatyti mažoms vaistų ir jų metabolitų koncentracijoms biologiniuose
skysčiuose. Siekiant padidinti KE metodo jautrį, taikomi įvairūs bandinio sukoncentravimo būdai
analizės metu (pvz. trumpalaikė izotachoforezė, elektrosuspaudimas).
Apjungti KFME ir KE metodai taikomi bandinių sukoncentravimui nejudrioje fazėje bei
analičių atskyrimui [135]. Bandinys gali būti sukoncentruojamas slėgio pagalba per KFME sorbentą
praleidžiant didelius bandinio tūrius.
Apjungtų KFME ir KE metodų yra trys grupės: netiesioginiai, nuoseklūs ir tiesioginiai (3
pav). Netiesioginiai KFME-KE metodai atliekami dviem būdais: rankiniu [136-139] ir automatizuotu
[140-142]. Bandinys paruoštas naudojant KFME metodą tyrėjo arba roboto perkeliamas į KE sistemą.
Nuosekliai apjungtu KFME-KE metodu vadinamas metodas, kai naudojami sujungti į vieną sistemą
atskiri įrenginiai ir bandinys automatiškai patenka iš KFME įtaiso į KE sistemą [143-145]. Kai analizė
atliekama vienoje sistemoje, metodas vadinamas tiesiogiai apjungtu KFME-KE metodu [146-148].

25
 3 pav. Apjungtų kietafazės mikroekstrakcijos ir kapiliarinės elektroforezės metodų klasifikacija
[148].

Pirmieji du apjungti metodai turi privalumų ir trūkumų, tačiau tiesiogiai apjungtas KFME-
KE metodas savo paprastumu ir pilnai automatizuotu analizės procesu yra pranašesnis už pirmus du.
Šiuo metu didelis dėmesys skiriamas laboratorijų mikroluste kūrimui ir taikymui įvairiose
srityse [149-151]. Taip pat ištisinių sorbentų imobilizavimas mikroluste yra viena naujausių tyrimų
sričių. Sukurtos laboratorijos mikroluste sistemos pritaikytos medicininėje diagnostikoje, aplinkos
monitoringo, maisto, vaistų analizėje [151,152]. Analizė mikroluste yra jautresnė, nes bandinys
mažiau praskiedžiamas ir analizės metu susidaro dar mažesni kiekiai tirpiklių atliekų. Mikrolustuose
ištisiniai sorbentai naudojami įvairiais tikslais: sukoncentravimui, kietafazei ekstrakcijai, arba tiesiog
kaip nejudrios fazės [153].
Įvairios apjungtų metodų kombinacijos bei metodų miniatiūrizacija pateikia galimybę
greičiau ir tiksliau analizuoti vis mažesnius ir mažesnius bandinio kiekius.

26
 2. DARBO METODIKA

2.1.Medžiagos

Acetonas, ≥99,0% (Fluka, Šveicarija),

Acetonitrilas, chromatografinio grynumo (ACN) (Merck, Vokietija),
2-hidroksietilo metakrilatas, (HEMA) (Aldrich, JAV),
Heksilakrilatas, 98,0% (HA) (Aldrich, JAV),
Natrio dihidrofosfatas, chemiškai grynas (LaChema, Čekijos Respublika),
Natrio hidroksidas, chemiškai grynas (NaOH) (Lachema, Čekijos Respublika),
Amonio persulfatas (APS), (BioRad, JAV),
Amonio sulfatas (Merck, Darmstadt, Vokietija),
Triton X-100, grynas analizei, (Merck, Darmstadt, Vokietija),
Druskos rūgštis, 35,0% (HCl) grynas analizei, (Lachema, Čekijos Respublika),
Natrio tetraboratas, grynas analizei, (Lachema, Čekijos Respublika),
Karbamidas, grynas analizei, (Lachema, Čekijos Respublika),
N,N,N‘,N‘-tetrametiletilendiaminas (TEMED), (Reanal, Budapeštas, Vengrija),
Metakriloksipropiltrimetoksisilanas (silanasA174), adhezijos aktyvatorius, (Merck, Darmstadt,
Vokietija),
Metakroleinas, ≥95,0% (MACR) (Fluka, Šveicarija),
Metanolis, analizei švarus (MeOH) (Čekijos Respublika),
Metakrilamidas (MA), grynas sintezei, (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn, Vokietija),
Piperazindiakrilamidas, ≥99,0% (PDA) (Fluka, Šveicarija),
Benzoinės rūgšties metilo (99,0%), etilo (99,0%), propilo (99,0%) ir butilo esteriai (98,0%)
(Lancaster, Anglija),
Vaistai: Salbutamol (veiklioji medžiaga: 4mg salbutamolis), Varšuvos farmacijos fabrikas POLFA,
(Varšuva, Lenkija), Bromhexine (veiklioji medžiaga: 8 mg bromheksinas),(Grindex, Latvija),
Jaučio serumo albuminas, (JSA) V frakcija (Merck, Vokietija),
Jaučio plazma (Endokrininiai preparatai, Lietuva), jaučio plazma laikoma užšaldyta -18°C
temperatūroje mažais kiekiais po 0,5 ml.
Bidistiliuotas vanduo buvo filtruojamas, panaudojant Millipore vandens paruošimo sistemą „Milli Q
water purification system“ (Millipore, JAV).

27
 Lydyto kvarco kapiliarai, 75 μm vidinio skersmens ir 365 μm išorinio skersmens,
(MicroQuartz, Vokietija) užpildyti AF ir RPF sorbentais. Lydyto kvarco kapiliarai: kapiliarinei
elektroforezei atlikti – 50 µm vidinio skersmens ir 365 µm išorinio skersmens (Composite Metal
Servises, Didžioji Britanija) modifikuotas su HEMA, kietafazei mikroekstrakcijai – kapiliarinis
intarpas 75 µm vidinio skersmens ir 365 µm išorinio skersmens (Polymicro technologies, JAV),
užpildytas ištisiniu RPF metakrilamidiniu sorbentu, intarpo ilgis 1 cm sujungtas 3 cm ilgio
politetrafluoretileno (PTFE) žarnele.
Chromolith CapROD RP-18 silikagelio kapiliarinė kolonėlė (Lv = 14,7 cm, 100 μm vidinio
skersmens ir 365 µm išorinio skersmens buvo gauta iš Merck (Darmstadt, Vokietija).

2.2. Aparatūra

Gradientinės kapiliarinės skysčių chromatografijos sistema I. Aparatūra, naudota kapiliarinio

formato AF ir RPF sorbentų charakterizavimui (4 pav.): du ESC siurbliai LKB 2150 (LKB, Švedija);
keičiamo bangos ilgio UV detektorius Spectra 100 (Spectra physics, JAV) su optine kiuvete (Nr. 148-
6078 (Bio-Rad Laboratories GmbH, Vokietija)) detekcijai kapiliare atlikti; injektorius Cheminert C1
su 20 μl kilpa (Valco Instruments Co. Inc., JAV); trišakis srauto paskirstymui (Valco Instruments Co.
Inc, JAV); siurblių valdymo ir chromatografinių duomenų registravimo sistema CSW 1.7 (DataApex
Ltd., Čekija).

4 pav. Aparatūros, skirtos kapiliarinei skysčių chromatografijai, schema 1. 1 – eliuentų rezervuarai, 2

– siurbliai, 3 – maišytuvas, 4 – injektorius, 5 – atliekų atšaka, 6 – injektoriaus kilpa, 7 – bandinio įleidimas, 8 –
nerūdijančio plieno kapiliaras, 9 – trišakis srauto paskirstymui, 10 – tėkmės paskirstymo kapiliaras, 11 –
kapiliarinė kolonėlė, 12 – detekcijos langas, 13 – detektorius, 14 – duomenų registravimo ir apdorojimo
sistema.

28
 Gradientinės kapiliarinės skysčių chromatografijos sistema II. Aparatūra, naudota
kapiliarinio formato AF ir RPF sorbentų charakterizavimui bei tiesioginei biologinių skysčių analizei
atlikti (5 pav.): ESC siurblys 250 (Perkin Elmer, JAV); autoinjektorius Spectra System AS3000 su 20
μl talpos kilpa (Thermo Separation Products, JAV); keičiamo bangos ilgio UV detektorius Spectra 100
(Spectra physics, JAV) su optine kiuvete (Nr. 148-6078 (Bio-Rad Laboratories GmbH, Vokietija))
detekcijai kapiliare atlikti; trišakis srauto paskirstymui (Valco Instruments Co. Inc, JAV);
chromatografinių duomenų registravimo sistema BioFocus 3000 programa (BioRad, JAV).

5 pav. Aparatūros, skirtos kapiliarinei skysčių chromatografijai, schema 2. 1 – autoinjektorius, 2 –

gradientinio režimo siurblys, 3 – eliuentų rezervuarai, 4 – atliekų atšaka, 5 - nerūdijančio plieno kapiliaras, 6 –
tėkmės paskirstymo kapiliaras, 7 – trišakis srauto paskirstymui, 8- detekcijos langas, 9 – kapiliarinė kolonėlė,
10 – detektorius, 11 – duomenų registravimo ir apdorojimo sistema.

Kietafazės mikroekstrakcijos ir kapiliarinės elektroforezės aparatūra. Apjungta KFME ir KE

atlikta naudojant Hewlett-Packard HP3D kapiliarinės elektroforezės sistemą su diodų matricos
detektoriumi (Agilent Technologies, Vokietija) ir HP3D CE ChemStation programinę įrangą sistemos
kontrolei, duomenų rinkimui ir jų analizavimui. Apjungtos tiesioginės KFME-KE principinė schema
pateikta 6 paveiksle.

29
 6 pav. Tiesioginės mikroekstrakcijos – kapiliarinės elektroforezės metodo schema.

Kietafazei mikroekstrakcijai atlikti naudotas kapiliarinis intarpas 75 µm vidinio skersmens ir

365 µm išorinio skersmens (Polymicro technologies, Phoenix, AZ, JAV), užpildytas ištisiniu RPF
metakrilamidiniu sorbentu, intarpo ilgis 1 cm sujungtas 3 cm ilgio politetrafluoretileno žarnele
(PTFE).

2.3. Ribotai pasiekiamų fazių paruošimas

Ištisinės AF matricos buvo gautos atlikus akrilamidinių monomerų polimerizaciją

kapiliarinėje kolonėlėje in situ. Ištisiniam polimeriniam sorbentui gauti naudoti monomeras MA,
tinklintojas PDA, hidrofobinis monomeras HA, reaktyvias aldehidines grupes turintis ACR bei priedai
(AS, Tr-X) ištirpinami 20mM fosfatiniame buferyje, pH 7. Tirpalas degazuojamas kelias minutes
vakuumuojant, kol nustoja skirtis deguonies burbuliukai (paprastai vakuumuojama 3-4 min).
Polimerizacija inicijuojama amonio persulfatu (APS). Komonomerų tirpalas su iniciatoriumi
nedelsiant įtraukiamas į kapiliarą, kuris termostatuojamas 60oC temperatūroje 2 val. vandens vonioje.
Susintetintas sorbentas praplaunamas 40 % vandeniniu metanoliu tirpalu. Susintetintų AF sorbentų
sintezės receptūros pateiktos 5 lentelėje. Kapiliarinio formato AF kolonėlių hidrodinaminis

30
pralaidumas buvo vertinamas nesuformavus detekcijos lango, norint nustatyti šių sorbentų tinkamumą
naudoti chromatografijai.

5 lentelė. Atvirkščių fazių sintezės receptūros ir jų tinkamumas kapiliarinei chromatografijai.

Sintezė %T HA,% MA, PDA, AS,mg HA,µl Tr-X,µl ACR,µl APS,µl NaPB,ml Rezultatai
mg mg
AF I 18,1 7,7 12 46 6 14 10 9 6 0,3 Prateka
AF II 19,1 7,3 12 46 6 14 10 9 6 0,28 Prateka
AF III 20,8 6,8 12 46 6 14 10 9 6 0,25 Prateka
AF IV 21,9 8,7 12 46 6 19 10 9 6 0,25 Prateka
AF V 25,5 7,5 12 46 6 19 10 9 6 0,2 Neprateka
AF VI 24,8 6,5 12 46 6 16 10 9 6 0,2 Neprateka
AF VII 24,5 7,8 12 46 12 19 10 9 6 0,2 Neprateka
AF 22,8 10,1 12 46 6 23 10 9 6 0,25 Prateka
VIII
AF IX 23,6 11,4 12 46 6 27 10 9 6 0,25 Prateka
AF X 24,7* 13,0* 12 46 6 32* 10 9 6 0,25 Prateka
AF XI 24,4 13,1 12 46 6 32 14 9 6 0,25 Prateka
AF XII 22,8 11,8 12 46 6 27 10 9 6 0,26 Prateka
* polimerizacijos mišinyje nevisiškai ištirpo HA kiekis.

Sintezių AF I, AF II, AF III receptūrose buvo pastovūs komponentų kiekiai, bet keičiamas
buferio kiekis atitinkamai 0,3; 0,28; 0,25 ml, visi susintetinti sorbentai buvo hidrodinamiškai
pralaidūs, tačiau HA kiekis sumažėjo nuo 7,7 % iki 6,8 %. Todėl buvo padidintas HA kiekis iki 8,7 %
(AF IV sintezė), siekiant susintetinti hidrofobišką sorbentą. Po to buvo mažintas buferio kiekis iki 0,2
ml (AF V), tačiau gauta hidrodinamiškai nepralaidi kolonėlė esant % T 25,5. Sumažinus HA kiekį iki
7,8 % ir esant % T 24,8 kolonėlė nebuvo tinkama chromatografinei analizei (AF VI). Tuomet AF VII
sintezės receptūroje buvo padidintas du kartus AS kiekis polimerizacijos mišinyje, norint suformuoti
didesnius kanalus AF matricoje, tačiau gauta hidrodinamiškai nepralaidi kolonėlė. Padidinus % T nuo
21,9 iki 22,8 (plg. AF IV ir AF VIII) susintetinta kapiliarinė kolonėlė buvo pralaidi, todėl buvo
didinama HA kiekis nuo 8,7 % iki 10,1 %. AF IX ir AF X sintezių receptūrose didinamas HA kiekis
atitinkamai 11,4 % ir 13,0 %. Tačiau atliekant AF X sintezę pastebėta, kad polimerizacijos mišinyje
nevisiškai ištirpo HA kiekis, todėl padidintas Tr-X kiekis, norint ištirpinti HA (AF XI). Kadangi
visose sintezėse % T svyravo nuo 18,1 iki 25,5, norint nustatyti hidrofobiškumo įtaką buvo išlaikyta
pastovi % T 22,8 ir padidintas HA kiekis 10,1 % iki 11,8 % (plg. AF VIII ir AF XII).
Įvertinus susintetintų AF hidrodinaminį pralaidumą, nustatyta, kad AF V, AF VI ir AF VII
sorbentai nėra tinkami naudoti kapiliarinėje chromatografijoje.
Hidrodinamiškai pralaidžioms kapiliarinėms kolonėlėms pradeginamas detekcijos langas
naudojant įkaitintą volframo siūlelį esant pastoviam distiliuoto vandens srautui per kapiliarą.

31
 Ištisinių akrilamidinių AF sorbentų kapiliarinių kolonėlių parametrai pateikti 6 lentelėje.

6 lentelė. Kapiliarinių kolonėlių, užpildytų susintetintais atvirkščių fazių ištisiniais sorbentais, parametrai.
Kolonėlė Bendras Efektyvusis Hidrofilinis Atskyrimo principas
kolonėlės ilgis, kolonėlės ilgis, LD, padengimas
L, cm cm
AF I 14,5 10,5 nepadengtas AF
AF II 14,0 10,0 nepadengtas AF
AF III 14,3 10,1 nepadengtas AF
AF IV 15,0 11,0 nepadengtas AF
AF VIII 14,4 10,4 nepadengtas AF
AF IX 14,3 10,6 nepadengtas AF
AF X 14,3 10,4 nepadengtas AF
AF XI 14,6 10,2 nepadengtas AF
AF XII 14,3 10,1 nepadengtas AF
RPF-1B 14,3 10,6 0,25 g/l baltymu RPF(padengta AF)
RPF-2B 14,4 10,4 0,5 g/l baltymu RPF (padengta AF)
RPF-3B 14,3 10,5 1 g/l baltymu RPF(padengta AF)
Kapiliarinės kolonėlės: AF - užpildyta susintetintu AF ištisiniu sorbentu, RPF- ribotai
pasiekiamų fazių sorbentas.

Ištisinių atvirkščių fazių charakterizavimui naudotos AF I, AF II, AF III, AF IV, AF VIII, AF

IX, AF X, AF XI ir AF XII kapiliarinės kolonėlės. RPF hidrofilinio sluoksnio padengimui buvo
atrinktos efektyviausios ir hidrofobiškiausios AF IX kapiliarinės kolonėlės. RPF paruošimas buvo
vykdomas per reaktyvias aldehidines grupes prijungiant skirtingos koncentracijos baltymą (0,25 g/l,
0,5 g/l ir 1 g/l). Reakcija atlikta rūgštinėje terpėje (20 mM karbonatinis buferis pH 3,5) 14 val. 25 0C
temperatūroje.

2.4. Bandinio paruošimo metodikos

Kapiliarinei skysčių chromatografijai bandinys ruoštas: Salbutamol tabletė ištirpinama 10 ml

vandens, po to centrifūguojama 5 min prie 5000 aps/min, nufiltruojama per 0,45 μm porų dydžio
membraninį filtrą ir praskiedžiama 25 mM fosfatiniu buferiu (pH 3,43) 1:10 (tūrio santykiu) prieš
sumaišant su jaučio plazma. Plazma sumaišoma su Salbutamol praskiestu ekstraktu tūrio santykiu 5:1.
Kapiliarinei elektroforezei bandinys ruoštas: Salbutamol tabletė ir Bromhexine tabletė
ištirpinama kiekviena atskirai 10 ml vandens, po to centrifuguojama 5 min. 5000 aps/min.,
nufiltruojama per 0,45 μm porų dydžio membraninį filtrą ir praskiedžiama 15 mM natrio fosfatiniu,

32
2,5 M karbamido buferiu pH 3,95 iki 15 ml. Imama po 1 ml vaistų ekstraktų ir sumaišoma
tarpusavyje.
Ribotai pasiekamų fazių kietafazei mikroekstrakcijai ir kapiliarinei zonų elektroforezei
apjungti bandinys ruoštas: Salbutamol tabletė ištirpinama 10 ml vandens, po to centrifūguojama 5 min
prie 5000 aps/min, nufiltruojama per 0,45 μm porų dydžio membraninį filtrą ir praskiedžiama 15 mM
fosfatiniu buferiu (pH 3,27) 1:40 (tūrio santykiu) prieš sumaišant su jaučio plazma. Plazma sumaišoma
su Salbutamol praskiestu ekstraktu tūrio santykiu 5:1.

Darbinių buferių sudėtys:

1. 15 mM natrio fosfatinis buferis, pH 3,27
2. 15 mM natrio fosfatinis buferis, 5 M karbamidas, pH 4,45
3. 15 mM natrio fosfatinis buferis, 5 M karbamidas, 10 % acetonitrilas (ACN)
4. 15 mM natrio fosfatinis buferis, 5 M karbamidas, 20 % ACN
5. 15 mM natrio fosfatinis buferis, 5 M karbamidas, 30 % ACN
6. 15 mM natrio fosfatinis buferis, 2,5 M karbamidas, pH 3,95
7. 5 mM natrio fosfatinis buferis, pH 2,5
8. 5 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,2
9. 5 mM natrio boratinis buferis, pH 9,2
10. 20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,0
11. 67 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,44
Įtampa: 30 kV, injekcija: hidrodinaminė (analitės injektuotos anodiniame kapiliaro gale, o
detekcija atlikta katodinėje pusėje), kapiliarinės kolonėlės temperatūra: 25ºC, detekcija: UV 200 nm,
210 nm ir 254 nm bangos ilgiai.
Naujas kapiliaras buvo praplaunamas 1 M NaOH (15 min.), 0,1 M NaOH (15 min.),
bidistiliuotu vandeniu (20 min.) ir praleidžiamas elektrolitas 10 min.
Prieš naudojimą visi buferiai buvo perfiltruoti per membraninį politetrafluoroetileno filtrą
(porų dydis 0,45 μm).

Kapiliaro vidinio paviršiaus modifikavimas:

Kapiliaro vidinės sienelės modifikavimas buvo atliktas, norint eliminuoti baltymų adsorbciją
ant kapiliaro paviršiaus. Modifikavimo su MA procedūra pateikta 7 lentelėje.

33
 7 lentelė. Lydyto kvarcinio stiklo kapiliaro sienelės modifikavimas su MA.
1 pakopa 2 pakopa
Praplaunama:  Paruošiamas tirpalas iš 0,2g akrilamido ir
 Acetonas 5 min; 1,8ml 20mM NaPB pH 7, tirpalas degazuojamas.
 H2O 10 min;  Imama 1ml paruošto tirpalo, į jį dedama 2,5 µl
 0,1 M NaOH 40 min; 10% TEMED ir 2,5 µl APS.
 H2O 15 min;  Mišinys įtraukiamas į kapiliarą.
 0,1 M HCl 10 min;  Kapiliaras termostatuojamas 250 C
 H2O 15 min; temperatūroje 24 valandas.
 Acetonas 5 min;
 30% γ-
metakriloksipropiltrimetoksisilanas15 min.

2.5. Apjungto tiesioginio kietafazės mikroekstrakcijos ir kapiliarinės zonų

elektroforezės metodo žingsniai

Tiesioginės KFME–KE procesas atliktas tokiais žingsniais (7 pav.): A. Bandinio įleidimas –

slėgio pagalba; B. Mikroekstrakcijos žingsnis. Bandinio zona slėgio pagalba stumiama pro RPF
sorbentą; C. Desorbcijos žingsnis. 80% metanolis stumiamas per RPF sorbentą; D. Elektroforezės
žingsnis.

7 pav. Tiesioginės mikroekstrakcijos–kapiliarinės elektroforezės proceso žingsniai.

Prieš bandinio įleidimą, KFME intarpas praplautas metanoliu (apie 10 sorbento tūrio). Po to
kapiliarinė kolonėlė užpildyta 15 mM fosfatiniu darbiniu buferiu, pH 3,27. Bandinys įleistas naudojant
2 bar slėgį 2 min ir praplautas darbiniu buferiu naudojant 2 bar slėgį 0,5 min. Tada 80% metanolis

34
stumtas per KFME intarpą naudojant 2 bar slėgį 1 min ir sustabdytas už KFME intarpo. Po to atliktas
desorbuotų analičių skirstymas elektroforezės metodu naudojant 20 kV įtampą.

2.6. Chromatografinių parametrų skaičiavimas

Sulaikymo veiksnys k nusako analizuojamos medžiagos sulaikymą chromatografinių fazių

(nejudrios ir judrios) sistemoje ir yra pateikiamas formule [154]:
tR  tm
k (1)
tm
čia tR – junginio eliucijos trukmė, min; tm – nesorbuoto junginio eliucijos trukmė, min.
Atrankumo veiksnys nusako atskiriamojo mišinio komponentų santykinį sulaikymą
kolonėlėje ir pasirinktos nejudrios fazės atrankumą ir yra išreiškiamas formule [155]:
k 2 t R2  t m
  , kai k2>k1 (2)
k1 t R1  t m
čia k1, k2 – pirmojo ir antrojo junginio sulaikymo veiksnys; tR1, tR2 – pirmojo ir antrojo junginio eliucijos trukmė,
min.
Kolonėlės efektyvumą chromatografijoje išreiškia teorinių lėkštelių skaičius N. Šis dydis yra
tiesiog proporcingas atitinkamo mišinio junginio eliucijos trukmės kvadratui ir atvirkščiai
proporcingas to junginio smailės pločio kvadratui, išreiškiamas formulėmis [154]:
2 2
t   t 
N  16 R   5,54 R  (3)
 w  w1 / 2 
čia w – smailės plotis, mm; w1/2 – smailės plotis, esant pusei jos aukščio,mm.
Teorinės lėkštelės aukštis H, kuris yra atvirkščias dydis teorinių lėkštelių skaičiui, yra
aprašomas formule [154]:
L
H (4)
N
čia L – chromatografinės kolonėlės ilgis, µm; N – teorinių lėkštelių skaičius.
Laisvosios energijos pokytis (ΔΔGCH2) pernešant vieną metilo grupę nuo judrios fazės prie
nejudrios fazės apskaičiuotas pagal formulę [155]:
GCH 2   RT ln  CH 2 (5)
čia R – universalioji dujų konstanta; T – absoliučioji eksperimento temperatūra; (α CH2) - metileno grupių

atrankumas.

35
 Ištisinių sorbentų kanalų dydį ir tankį nulemia bendra monomerų (%T ) koncentracija,
apskaičiuota pagal formulę [155]:
abc
0
0 T  100 (6)
m pol
čia a, b, c – sintezei naudotų monomerų kiekiai; g; mpol – bendra sintezės mišinio masė, g.

36
 3. REZULTATAI

3.1. Ribotai pasiekiamų fazių charakterizavimas

3.1.1. Hidrofobiškumo įvertinimas

Šiame darbe buvo analizuojami skirtingo poliškumo AF ištisiniai sorbentai. AF

chromatografijoje hidrofobinės analizuojamo junginio dalys sąveikauja su sorbento alkil- ar aril-
ligandais ir atskyrimo mechanizmas yra pagrįstas būtent šia sąveika. Todėl AF chromatografijoje yra
svarbus nejudrios fazės hidrofobiškumas. Tokios sąveikos stiprumas priklauso nuo daugelio faktorių:
nepolinio ligando dydžio, cheminės struktūros, tankio ir pasiskirstymo tolygumo, bendro nejudrios
fazės paviršiaus ploto, ligandų pasiekiamumo, nejudrios ir judrios fazės tūrio santykio kolonėlėje ir
judrios fazės poliškumo.
Charakterizuojant nejudrias fazes buvo naudoti benzoinės rūgšties esterių homologai.
Duomenys pateikti 8 paveiksle.

8 pav. Sulaikymo veiksnio logaritmo (log k) priklausomybė heksilakrilato kiekio. Judri fazė: 50 tūrio
% 20mM fosfatinis buferis/metanolis; Bandinys: propilbenzoatas (5µl/ml); Tėkmė: 0,2 ml/min; Detekcija: UV
254nm. SSN neviršija 1,19%.

Manoma, kad padengus AF nejudrios fazės paviršių pusiau pralaidžia hidrofilinio polimero
danga, pakinta bendras kolonėlės hidrofobiškumas. Hidrofobiškiausias AF IX kolonėlės sorbentas,

37
kuris pasirinktas tolimesnei tiesioginei biologinių skysčių analizei. Padengus hidrofobiškiausią
kapiliarą skirtingų koncentracijų baltymu iš paveikslo matyti, kad hidrofobiškumas mažėja
priklausomai nuo baltymo koncentracijos.
Taip pat iš paveikslo matyti, kad AF X ir AF XI kolonėlės hidrofobiškumas tarpusavyje
skiriasi labai mažai, ir HA naudotas kiekis (%) yra didesnis už AF IX kolonėlės, tačiau atliekant AF X
sintezę pastebėta, kad polimerizacijos mišinyje nevisiškai ištirpo HA kiekis, todėl padidintas Tr-X
kiekis, norint ištirpinti HA (AF XI). Buvo optimizuotas HA kiekis, kuris dar tirpus polimerizacijos
mišinyje. Kadangi visose sintezėse % T svyravo nuo 18,1 iki 25,5, norint nustatyti hidrofobiškumo
įtaką buvo išlaikyta pastovi % T 22,8 ir padidintas HA kiekis 10,1 % iki 11,8 % (plg AF VIII ir AF
XII), kadangi AF IX kolonėlės bendra monomerų koncentracija yra 23,6% lyginant su AF XII
kolonėle, kurioje % T – 22,8%. Taip buvo atrinktos hidrofobiškiausios AF IX kolonėlės.
Hidrofobiškumas gali būti išreiškiamas laisvąja metileno grupių pernešimo iš judrios prie
nejudrios fazės energija (ΔΔG) [155]. Metileno grupių atrankumas (αCH2), yra hidrofobinės sąveikos
matas. Metileno grupių (hidrofobinis) atrankumai ir laisvosios (metileno grupių pernešimo) energijos
pokyčiai. Neigiamesnės ΔΔG reikšmės parodo didesnius poliškumo skirtumus tarp judrios ir nejudrios
fazės bei didesnį nepolinių homologų giminingumą lipofilinei nejudriai fazei.
Susintetinti AF ir RPF sorbentai buvo palyginti su chromatografinių medžiagų rinkoje
siūloma Chromolith CapROD RP-18 kapiliarine kolonėle. Polimetakrilamidinių grandinių
priskiepijimas beveik nepakeitė bendro sorbento hidrofobiškumo. Trijų tipų sorbentų hidrofobiškumai
išreikšti metileno grupės atrankumu pateikti 8 lentelėje.

8 lentelė. Metileno grupės atrankumas atvirkščių fazių chromatografijoje (judri fazė: 50 tūrio %
acetonitrilas vandenyje).
Sorbentas α(CH2)* ΔΔG(CH2)**,
kJ/mol
C18 silikagelio AF sorbentas 1,59 -1,13
AF IX polimerinis sorbentas 1,44 -0,95

RPF- 2B polimerinis sorbentas 1,39 -0,83

*
- metileno grupės (CH2) atrankumas (žr. 2 formulę);
**
- laisvosios metileno grupės pernešimo (iš judrios į nejudrią fazę) laisvosios energijos pokytis,
skaičiuotas pagal 5 formulę.

Metileno grupių atrankumas (αCH2) ir laisvosios energijos pokytis (ΔΔGCH2) apskaičiuotas tik
efektyviausiam ir hidrofobiškiausiam polimeriniam sorbentui. Palyginus naujai susintetintus ištisinius
38
polimerinius sorbentus su C18 neorganinės kilmės sorbentu, nustatyta, kad C18 neorganinės kilmės
sorbentas buvo šiek tiek hidrofobiškesnis dėl ilgesnių alkilinių grandinių sorbente. Tačiau polimerinių
sorbentų hidrofobiškumas yra pakankamas nepolinių junginių skirstymui skysčių chromatografijos
metodu.

3.1.2. Efektyvumas

Efektyvumas chromatografijoje yra sąlyginai išreiškiamas teorinių lėkštelių skaičiumi N.

Teorinės lėkštelės aukščio H priklausomybė nuo eliuento tėkmės greičio turi parabolinį pobūdį.
Kreivės minimumo taškas atitinka judrios fazės greitį, kuriam esant chromatografinis procesas yra
efektyviausias.
Teorinės lėkštelės aukščio priklausomybė RPF sorbentams parodyta 9 paveiksle. Teorinės
lėkštelės aukštis apskaičiuotas nesulaikomam junginiui (analitei, kuri nesąveikauja su nejudria faze) –
propilbenzoatui.

9 pav. Teorinių lėkštelių aukščio priklausomybė skirtingai sintezei. Teorinis lėkštelių aukštis (H)
paskaičiuotas nesulaikomam junginiui – propilbenzoatui. Judri fazė: 50 tūrio % 20mM fosfatinis
buferis/metanolis; Tėkmė: 0,2 ml/min; Detekcija: UV 254nm. SSN neviršija 1,36%.

AF ištisiniai sorbentai, kurie turi mažesnį teorinės lėkštelės aukštį, juose vyksta spartesni
masių mainai tarp judrios ir nejudrios fazių. Nedideli teorinių lėkštelių aukščio skirtumai pastebėti tarp
AF X ir AF XI sintezių sorbentų, tačiau atliekant AF X sintezę pastebėta, kad polimerizacijos mišinyje
nevisiškai ištirpo HA kiekis, todėl padidintas Tr-X kiekis (Tr-X mažina efektyvumą), norint ištirpinti

39
HA (AF XI). Tendencingai didinat HA kiekį nuo 6,8% iki 11,4%, matome kad efektyvumas didėja
(nuo AF I iki AF IX sorbento). Kuo H, µm reikšmė mažesnė, tuo efektyvumas didžiausias.
Efektyviausias IX sintezės kapiliaras, kuris pasirinktas tolimesnei tiesioginei biologinių skysčių
analizei ir atliktas padengimas skirtingomis baltymo koncentracijomis. Iš paveikslo matyti, kad RPF
kolonėlių sorbentų efektyvumas mažėja. Padengus AF sorbentą hidrofiliniu polimeru nejudrios fazės
frakcija padidėja, dėl to sumažėja hidrodinaminis pralaidumas ir efektyvumas.

3.1.3. Hidrodinaminis pralaidumas

Susintetintų AF ir RPF hidrodinaminis pralaidumas buvo tiriamas naudojant 50 MPa/cm

slėgį. Visi šie ištisiniai sorbentai yra pakankamo mechaninio stabilumo ir gali būti taikomi
chromatografijoje.Duomenys pateikti 10 paveiksle.

10 pav. Judrios fazės tėkmės greičio priklausomybė nuo bendros monomerų koncentracijos. Judri
fazė: vanduo. SSN neviršija 0,98%.

AF sorbentai X ir XI turi mažiausią hidrodinaminį pralaidumą lyginant su AF I sorbentu ir

kitų AF sintezių sorbentais. Tai parodo šių sorbentų morfologijos skirtumus. AF sorbentų I, II ir III
efektyvumo maksimumas pasiekiamas esant dideliems judrios fazės greičiams. Sorbentų pralaidumas
taip pat priklauso ir nuo kanalų dydžio bei kanalų tinklo susiformavimo. Labai sumažinti % T
negalima, nes kuo % T mažesnė, tuo efektyvumas būna mažesnis, bet hidrodinaminis pratekėjimas

40
didesnis. Mano tikslas buvo susintetinti efektyvius ir hidrofobiškus sorbentus, todėl reikėjo rasti
optimalų sorbentų hidrodinaminį pratekėjimą, bei HA kiekį, kuris ištirptų polimerizacijos mišinyje.

3.2. Tiesioginė biologinių skysčių kapiliarinė chromatografija panaudojant ribotai

pasiekiamas fazes

Susintetintos kapiliarinio formato ištisinės RPF buvo testuojamos, norint patikrinti

hidrofilinės dangos kokybę, naudojant AF chromatografijos sąlygas. Testo pagrindas – tiesioginė
jaučio serumo albumino injekcija analizei. Albuminas eliuuojamas su tūriu artimu kolonėlės tuščiam
tūriui, jei dangos kokybė yra gera. Priešingu atveju, baltymas yra dalinai arba visiškai sulaikomas.
Atlikus testą, nustatyta, kad padengiant RPF didesnės nei 0,5% koncentracijos baltymo tirpalu, gauti
sorbentai nesorbavo jaučio serumo albumino. Tokia RPF kolonėlė buvo pasirinkta tiesioginei
biologinių skysčių analizei. Sumažinus baltymo koncentraciją iki 0,25% buvo sorbuota 21% įleisto
baltymo.
Modeliniu biologinio skysčio bandiniu buvo pasirinkta jaučio plazma sumaišyta su
salbutamoliu (veiklioji medžiaga salbutamolis 4 mg/ml) tūrio santykiu 5:1 (11pav.).

11 pav. Jaučio plazmos sumaišytos su salbutamoliu chromatograma. Nejudri fazė: 0,5 % baltymo
tirpalu padengtas RPF sorbentas. Judri fazė: 20mM fosfatinis buferis (pH 3,43) – metanolis (50/50 % tūrio).
Tėkmės greitis: 0,06 ml/min. UV detekcija: 224 nm. Bandinio tūris: 6 µl. SSN neviršija 1,51%.

41
 Naudojant izokratinį eliucijos režimą kapiliarinės skysčių chromatografijos metodu atlikta
tiesioginė modelinio bandinio, sudaryto iš plazmos sumaišytos su salbutamoliu, analizė, kuri atlikta
per 8 min. Izokratinis režimas yra patogus būdas, norint gauti gerą analičių atrankumą, skirstant
nesudėtingus mišinius.
Apibendrinant rezultatus galima teigti, kad buvo ištirti įvairaus hidrofobiškumo AF
akrilamidiniai ištisiniai sorbentai (metileno grupių atrankumas kito nuo 1,39 iki 1,59, naudojant judrią
fazę 50 tūrio % acetonitrilą vandenyje), padengti baltymu ir pritaikyti tiesioginei biologinių skysčių
chromatografinei analizei. AF ištisinių sorbentų padengimas baltymu beveik nepakeitė jų
chromatografinių savybių, tokių kaip hidrofobiškumas ir efektyvumas.

3.3. Apjungtas tiesioginis kietafazės mikroekstrakcijos ir kapiliarinės zonų

elektroforezės metodas

Norint padidinti detekcijos jautrumą, siekiant aptikti ng-pg eilės analičių kiekius, reikia
naudoti kelių metodų derinius. Šiame darbe buvo panaudoti dviejų metodų - mikroekstrakcijos RPF
sorbentu ir kapiliarinės zonų elektroforezės (KZE) - derinį. KZE pasirinkta dėl aukšto skirstymo
efektyvumo, o kietafazė mikroektrakcija dėl mažo tūrio bandinio sukoncentravimo. Originalus
kapiliarinio formato KFME-KZE metodų apjungimas buvo pritaikytas vaistų analizei biologiniuose
skysčiuose.
Lydyto kvarco kapiliaro vidinio paviršiaus dangos tyrimai. Vienas iš pagrindinių procesų,
kuris įtakoja KE yra elektroosmozė. Šis reiškinys yra paviršiaus krūvio ant kapiliaro sienelių
padarinys. Lydyto kvarco kapiliarai, kurie yra paprastai naudojami KE atskyrimams, kontakte su
buferiu, užpildančiu kapiliaro vidų, įgyja jonizuotas silanolines grupes. Šių grupių pKa svyruoja tarp 4-
6. Silanolių jonizacijos laipsnis yra kontroliuojamas pasirenkant buferio pH.
Norint tinkamai kontroliuoti KE, būtina išmatuoti elektrosmozinį srautą (EOS). Tai
atliekama injektuojant neutralų junginį ir išmatuojant laiką, kuris reikalingas šiam junginiui pasiekti
detektorių. Norint įvertinti kapiliaro padengimą EOS testas buvo vykdomas pagal Williams ir Vigh
metodą [156], trijuose skirtinguose pH: 7,2 (fosfatinis buferis, joninė jėga 5 mM), 2,5 (fosfatinis
buferis, joninė jėga 5 mM) ir 9,2 (boratinis buferis, joninė jėga 5 mM) (12 pav.).

42
 Nemodifikuotas Modifikuotas

70

EOS, cm2* s -1*v-1*10 -4

60
50
40
30
20
10
0
5 mM fosfatinis 5 mM fosfatinis 5 mM fosfatinis 5 mM boratinis 5 mM fosfatinis
buf , pH 7,2 buf, pH 2,5 buf , pH 7,2 buf , pH 9,2 buf , pH 7,2
Buferis

12 pav. Elektroosmozės srauto testas. Sąlygos: bandinys 10 % acetonas, injekcija 50 mbar * 15 s.

19,49 min įtampa 30 kV, po to naudojamas 50 mbar slėgis išplauti acetono smailę. Nemodifikuoto kapiliaro
ilgiai: Lv = 49,4 cm, Leff = 40,9 cm, vidinis skersmuo 50µm. Modifikuoto kapiliaro ilgiai: Lv = 39 cm, Leff = 30,5
cm, vidinis skersmuo 50µm. SSN nemodifikuoto kapiliaro neviršija 1,23 %, o modifikuoto 0,93 %.

Kiekvienai bandymų serijai, EOS buvo išmatuotas iš pradžių pH 7,2, paskui pH 2,5, 7,2, 9,2
ir paskutiniame 7,2. EOS testas buvo kartojamas kelis kartus, norint patikrinti rezultatų
pakartojamumą. Pirma neutraliame pH, po to rūgštiniame pH ir neutraliame, ir šarminiame bei
neutraliame pH, norint patikrinti ar padengimas buvo suardytas ekstremaliame pH.
Kapiliaro vidinio paviršiaus modifikavimas slopina elektroosmozę, ypač elektroforezės metu
naudojant bazinius buferius, kurių pH>8. Modifikuoto kapiliaro elektrosmozinė tėkmė buvo 1,28 karto
lėtesnė nei nemodifikuoto, naudojant 50 mM boratinį-fosfatinį buferį, pH 8,5 [157].
Vidinės sienelės danga taip pat sumažina baltymų ir bazinių mažamolekulinių junginių
nespecifinę sorbciją elektroforezės metu. Modifikuotas kapiliaras testuotas naudojant skirtingas jaučio
serumo albumino (5 mg/ml) injekcijas: 25, 100 ir 400 mbar*s. Nustatytas pakankams jaučio serumo
albumino smailių simetriškumas (asimetrijos faktorius atitinkamiems injekcijos tūriams buvo: 0,97,
0,85 ir 0,79). Naudojant nemodifikuotą kapiliarą, atlikus keletą jaučio serumo albumino (0,5 mg/ml)
injekcijų gauti neatsikartojantys rezultatai: analizė po analizės SSN išėjimo trukmei 4-10% (n=15),
diena po dienos SSN išėjimo trukmei 6-18% (n=4). Taip pat pastebėta, kad naudojant nemodifikuotą
kapiliarą reikia injektuoti didesnės koncentracijos bandinį nei naudojant modifikuotą kapiliarą. Gali
būti, kad baltymai sorbavęsi lydyto kvarco paviršiuje sumažina detekcijos jautrį. Asimetriškumo
faktorius nemodifikuotam kapiliarui buvo nuo 0,3 iki 0,61, modifikuotam – viršijo 0,87 [157].

43
 3.3.1. Kapiliarinės zonų elektroforezės salygų optimizavimas

Organinio tirpiklio įtaka skiriamajai gebai. Organinis tirpiklis yra naudojamas

elektroosmozinės tėkmės modifikavimui, analičių tirmupui ir atrankumui, bei pagerinti skiriamąją
gebą (Rs) [125]. Bandant nustatyti optimalų organinio tirpiklio kiekį buferyje, buvo naudojamas 10 %,
20 % ir 30 % acetonitrilo (ACN) priedas (13 pav.).

Nemodifikuotas Modifikuotas

4
3.5
3
Skiriamoji geba

2.5
2
1.5
1
0.5
0
pH 4,45 10% ACN 20% ACN 30% ACN
15m M fosfatinis buferis, 5M karbam idas

13 pav. Acetonitrilo priedo darbiniame buferyje įtaka skiriamajai gebai. Bandinys: bromheksinas
(0,4 mg/ml) ir salbutamolis (0,14 mg/ml) . Nemodifikuoto ir modifikuoto akrilamidu kapiliaro ilgiai L v = 49,4
cm, Leff = 40,9 cm, vidinis skersmuo 50µm. Įtampa 20 kV, injekcija 10 mbar * 5 s (naudojant nemodifikuotą
kapiliarą), 10mbar * 10 s (naudojant modifikuotą kapiliarą). SSN nemodifikuoto kapiliaro neviršija 1,15 %, o
modifikuoto 0,87 %.

Acetonitrilas turėjo įtakos bromheksino ir salbutamolio skiriamajai gebai: nemodifikuotam

kapiliarui skiriamoji geba didėjo, didėjant acetonitrilo koncentracijai buferyje, modifikuotam
kapiliarui mažėja paraboline išraiška. Su minimumu esant 10 % tūrio ACN.

Karbamido įtaka skiriamajai gebai. Karbamidas tirpina baltymus ir denatūruoja

oligonukleozidus [125], bei karbamido priedas darbiniame buferyje turi įtakos vaistų bromheksino ir
salbutamolio skiriamajai gebai (Rs). Naudojant 2,5mM ir 5mM karbamido priedus, 15mM fosfatiniame
buferyje buvo tirta karbamido įtaka bromheksino ir salbutamolio skiriamajai gebai (14 pav.).

44
 Nemodifikuotas Modifikuotas

2.5

Skiriamoji geba
2

1.5

0.5

0
pH 3,27 2,5M 5M
karbamidas, karbamidas,
pH 3,95 pH 4,45
15m M fosfatinis buferis

14 pav. Karbamido priedo darbiniame buferyje įtaka skiriamajai gebai. Bandinys: bromheksinas
(0,4 mg/ml) salbutamolis (0,14 mg/ml). Nemodifikuoto ir modifikuoto akrilamidu kapiliaro ilgiai L v = 49,4
cm, Leff = 40,9 cm, 50µm vidinio skersmens. Įtampa 20 kV, injekcija 10 mbar * 5 s (naudojant nemodifikuotą
kapiliarą), 10mbar * 10 s (naudojant modifikuotą kapiliarą). SSN nemodifikuoto kapiliaro neviršija 1,82 %, o
modifikuoto 1,31 %.

Naudojant modifikuotą kapiliarą, karbamido priedo didinimas buferyje, padidina Rs.

Naudojant nemodifikuotą kapiliarą, karbamido priedo buferyje didinimas, sumažina Rs, tačiau nesant
karbamido Rs buvo mažesnė nei naudojant 2,5 M karbamido priedą.

Kapiliarinės elektroforezės sąlygų optimizavimas. Salbutamolis yra selektyvus (2-

adrenoreceptorių) agonistas. Jo terapinės dozės efektyviai veikia bronchų (2-adrenoreceptorius) ir turi
labai silpną poveikį (arba visai neveikia) į širdies (1-adrenoreceptorius). Salbutamolis pradeda veikti
greitai, todėl ypač tinka dusulio priepuolių nutraukimui bei profilaktikai, sergant lengvos eigos
bronchine astma, o taip pat vidutinio sunkumo ir sunkios eigos bronchinės astmos paūmėjimų
gydymui. Išgertas salbutamolis greitai absorbuojamas iš virškinimo trakto. Išgėrus tabletę, didžiausia
koncentracija serume būna maždaug po 2 val. Pusinės eliminacijos iš serumo periodas trunka apie 5
val. Salbutamolis yra įtrauktas į Pasaulinės Antidopingo Agentūros Draudžiamų Medžiagų Sarašą.
Tačiau, jei sportininkas serga astma, jam leidžiama vartoti salbutamolį. Nepaisant to, salbutamolio
koncentracija griežtai kontroliuojama. Jei laboratorija nustato didesnę negu 1000 ng/l, tai laikoma
teigiamu dopingo testo rezultatu. Nebent sportininkas įrodo, kad tai buvo nenormalus gydymo
rezultatas vartojant salbutamolį.

45
 Bromheksinas skiriamas ligoniams, sergantiems bronchitu, pagerėja plaučių funkcija,
kadangi preparatas lengvina atsikosėjimą. Pastebėta, kad bromheksinas didina egzogeninių liaukų
(pavyzdžiui, ašarų liaukų) sekreciją ir plaučių audinyje didina paviršinio aktyvumo medžiagų sintezę.
Bromheksinas ir salbutamolis pasirinkti analizei, kaip vaistai panašūs savo veikimo
funkcijomis, skiriami gydyti bronchitui. Optimizuota kapiliarinės elektroforezės buferio sudėtis: 15
mM fosfatinis buferis, 2,5 M karbamidas, pH 3,95, ir pritaikyta įtampa 20 kV. Išmatuoti atkuriamumą,
buvo dešimt kartų kartota bandinio tirpalo injekcija optimaliomis sąlygomis (15 pav.).

15 pav. Kapiliarinės elektroforezės sąlygų pritaikymas salbutamolio ir bromheksino skirstymui.

Buferis: 15mM fosfatinis 2,5 M karbamidas, pH 3,95. Injekcija: 10mbar*10s. Įtampa: 20 kV. Bandinys: A -
bromheksinas (0,4 mg/ml), salbutamolis (0,14 mg/ml). SSN neviršija 1,19 %.

Optimizavus KE sąlygas, buvo atliktas bromheksino ir salbutamolio visiškas smailių

atskyrimas. Pirma smailė salbutamolio 15 µg, antra bromheksino 21,5 µg.

3.3.2. Apjungto kietafazės mikroekstrakcijos ir kapiliarine zonų elektroforeze metodo taikymas

biologinių skysčių analizei

Optimizavus KZE analizės sąlygas ir apjungus kietafazės mikroekstrakcijos ir kapiliarinės

zonų elektroforezės metodą, buvo atlikta plazmos sumaišytos su salbutamoliu analizė modeliniame
biologinių skysčių bandinyje (16 pav).
46
 16 pav. Kapiliarinės mikroekstrakcijos ir kapiliarinės zonų elektroforezės metodų apjungimas.
Bandinys: jaučio plazma su salbutamoliu. Buferis: 15mM fosfatinis, pH 3,27. Įtampa 20kV. Detekcija UV
200nm.

A. Naudojant 2 bar išorinį slėgį, bandinys buvo stumiamas per kapiliarinėje kolonėlėje esantį
RPF sorbentą. Analitė buvo sorbuojama ant RPF sorbento, o baltymai buvo atskiriami ir išplaunami su
tuščiu tūriu. Užregistruotas absorbcijos signalo pakilimas 1,5 minutę rodo, kad baltymai pasiekia
detekcijos langą ir yra atskiriami nuo salbutamolio.
B. Bandinio sukoncentravimas buvo atliekamas 3 min, po to apie 0,5 min buvo praplauta 15
mM fosfatiniu darbiniu buferiu, pH 3,27.
C. Analičių desorbcija atlikta naudojant 80 % metanolio injekciją 1 min, po to buvo
praplauta 0,5 min 15 mM fosfatiniu darbiniu buferiu, pH 3,27, kad sistema būtų paruošta
elektrofroreziniam analičių skirstymui.
D. Salbutamolio smailė atskirta apie 8 min, naudojant 20 kV įtampą. Analizuojamo junginio
koncentracija (ir kiekis) sudarė: 0,2 ng/ml (35 pg) salbutamolio.

47
 Apjungto KZE – KME su RPF intarpu metodo pagalba, salbutamolio esančio modeliniame
biologinio skysčio bandinyje gerai atskirtas nuo plazmos, sukoncentruotas, desorbuojamas nuo RPF
intarpo ir atskirimas per 10 minučių.

3.3.3. Kapiliarinės zonų elektroforezės ir apjungto kietafazės mikroekstrakcijos su kapiliarine zonų

elektroforeze metodų jautrumo palyginimas

Buvo atlikti kapiliarinės zonų elektroforezės, apjungto kietafazės mikroekstrakcijos -

kapiliarinės zonų elektroforezės su AF intarpu ir apjungto kietafazės mikroekstrakcijos metodų su RPF
intarpu įteisinimo žingsniai: tiesiškumas, jautrumas ir atsikartojamumas. Tiesiškumas buvo nustatytas
eilei darbinių buferinių tirpalų, paruoštų skiedžiant pradinį žinomos koncentracijos tirpalą. Kiekviena
koncentracija buvo injektuota tris kartus ir smailių aukščių reikšmės nustatytos iš kalibracinės kreivės.
Silpniausias registruojamas signalas turi būti mažiausiai 3 kartus didesnis už triukšmo lygį
(ne analičių nulemti bazinės linijos virpesiai yra vadinami triukšmu). Išreikštas koncentracija jis
vadinamas duotosios analitės aptikimo riba - tai mažiausias kiekis medžiagos, iš kurios dar galima
statistiškai pagrįstai nustatyti analitės buvimo faktą. Kiekybinei analizei reikalingas minimalus
signalas turi viršyti triukšmą 6 kartus. Išreiškus koncentracija jis vadinamas nustatymo riba.
Atsikartojamumas (analitų išėjimo laikams ir smailių plotams) nustatytas penkis kartus
injektavus bandinį, sudarytą iš salbutamolio. KZE ir apjungto KME-KZE naudojant AF ir RPF
intarpus metodų palyginimo duomenys pateikti 9 lentelėje.

9 lentelė. Kapiliarinės zonų elektroforezės ir apjungto kietafazės mikroekstrakcijos su kapiliarine

zonų elektroforeze metodų palyginimas salbutamoliui .
KZE KME-KZE su AF KME-KZE su RPF
intarpu intarpu
Kalibracinės kreivės intervalas 10-100 5-50 5-50
(μg/ml)
Koreliacijos koeficientas 0,9984 0,9986 0,9982
Nustatymo riba (μg/ml) 9,8 0,0045 0,005
Aptikimo riba (μg/ml) 27,8 0,0115 0,0124
Atsikartojamumas išėjimo laikams 0,8 0,4 0,3
SSN (%)
Smailės plotas SSN (%) 1,1 1,7 2,2

KZE metodas atitiko įprastus metodo įteisinimo reikalavimus, tokius kaip tikslumas,
glaudumas ir tiesiškumas (kalibracinės kreivės koreliacijos koeficientas buvo didesnis nei 0,9984,
SSN pakartotinėms injekcijoms (n = 5) buvo mažiau nei 1,1 %.

48
 Naudojant KZE metodą mažiausia nustatoma salbutamolio koncentracija buvo 9,8 μg/ml.
Naudojant apjungtą KME-KZE metodą su RPF intarpu nustatyta salbutamolio koncentracija buvo apie
2000 kartų mažesnė.
Apjungto KME-KZE metodo su AF ir RPF intarpais salbutamolio išėjimo laikų
atsikartojamumas neviršijo 0,4 % (SSN). Smailių plotų atsikartojamumo variacija (1,7 % – 2,2 %) gali
būti iš dalies paaiškinama dėl mažos analitės koncentracijos bandinyje.

49
 IŠVADOS

1) Susintetinti kapiliarinio formato ištisinių atvirkščių fazių sorbentai, turintys aldehidinių grupių,
atrinktos hidrofobiškiausios (sulaikymo veiksnio logaritmo log k) AF IX sorbento kolonėlės
1,62, hidrodinaminis pralaidumas didžiausias AF I sorbento kolonėlės 130,5 nl/min ir
efektyviausios (teorinis lėkštelės aukštis (H)) AF IX sorbento kolonėlės 8,2 µm.
2) Atlikta tiesioginė biologinių skysčių chromatografinė analizė, panaudojant ribotai pasiekiamas
fazes padengtas 0,5 % baltymo tirpalu. Naudojant izokratinę eliuciją jaučio plazmos
sumaišytos su farmaciniu produktu „Salbutamol“ (veiklioji medžiaga salbutamolis (4 mg/ml))
bandinio tiesioginė analizė truko 8 min.
3) Optimizavus analizės sąlygas apjunto kapiliarinės zonų elektroforezės su kietafazės
mikroekstrakcijos metodu pasiektos nustatymo ribos: 4,5 ng/ml salbutamoliui (naudojant
atvirkščių fazių intarpą) bei 5,0 ng/ml salbutamoliui (naudojant ribotai pasiekiamų fazių
intarpą). Lyginant su kapiliarine zonų elektroforeze apjuntų metodų pagalba galima bandinius
sukoncentruoti iki 2000 kartų.

50
 LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Legido-Quiley C., Smith N. W., Mallet D., “Quantification of the sensitivity increase of a μ-
HPLC / ESI / MS system with decreasing column diameter.”, J. Chromatogr. A, 976 (2002)
18-24.
2. Olah T. V., McLoughlin D. A., Gilbert J. D., Rapid Communications in Spectrometry, 11
(1997) 17-19.
3. Espada A., Rivera-Sagredo A.,”Ammonium hydrogencarbonate, an excellent buffer for the
analysis of basic drugs by liquid chromatography–mass spectrometry at high pH”, J.
Chromatogr. A, 987 (2003) 211-220.
4. Nilssen W., “Progress in liquid chromatography–mass spectrometry instrumentation and its
impact on high-throughput screening”., J. Chromatogr. A, 1000 (2003) 413-436.
5. Majors R. E., LC•GC, 686 (1991) 9-15.
6. Nakamura A., Tanaka S., Watanabe T., “Normal-phase HPLC separation of possible
biosynthetic intermediates of pheophytin a and chlorophyll a”, Anal. Sciences, 17 (2001) 509-
513.
7. Atwell S., Meggers E., Spraggon G., "Structure of a Copper-Mediated Base Pair in DNA.", J.
Am. Chem. Soc., 123 (2001) 12364-12367.
8. Svec F., “Less common applications of monoliths II: Preconcentration and solid phase
extraction”. J. Chromatogr. B, 841 (2006) 52-64.
9. Yan W., Gao R., Zhang Z., Yan C., Wang Q., “Cinnamic Acid Polymer-Based Monolithic
Column for Capillary Electrochromatography”., Chromatographia 57 (2003) 819-824.
10. Umemura T., Ueki Y., Tsunoda K., Katakai A., Tamada M., Haraguchi H., "Preparation and
Characterization of Methacrylate-based Semi-micro Monoliths for High-throughput
Bioanalysis," Anal. Bioanal. Chem. 386 (2006) 566-571.
11. Yang Z., Wangs S., “Recent development in application of high performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of
immunosuppressants”, Journal of Immunological Methods, 336 (2008) 98-103.
12. Živanović L., Ličanski A., Zečević M., Jocić B., Kostić M., “Application of experimental
design in optimization of solid phase extraction of mycophenolic acid and mycophenolic acid
glucuronide from human urine and plasma and SPE-RP-HPLC method validation”, Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 47 (2008) 575-585.
13. Rossi D. T., J. of Automated Methods & Management in Chemistry, 32 (2006) 1-6.
14. Z. Sandra, T. Wolfgang, „Enantioselective determination of drugs in body fluids by capillary
electrophoresis“, J. Chromatogr. A 875 (2000) 27.
15. Sadilek P., Satinski D., Solich P., “Using restricted-access materials and column switching in
high-performance liquid chromatography for direct analysis”, Trends in Analytical Chemistry,
26, (2007) 375-384.
16. Li P., Zhao L., “Developing early formulations: Practice and perspective”, International
Journal of Pharmaceutics, 341 (2007) 1-19.
17. Liu Z., Li F., Huang Y., “Determination of unbound drug concentration and protein- drug
binding fraction in plasma”, Biomed. Chromatogr., 13 (1999) 262-266.
18. Carstens J., Jensen K. T., Ivarsen P., Rasmussen L. M., Pedersen E. B., “Development of a
urodilatin-specific antibody and radioimmunoassay for urodilatin in human urine”, Clinical
Chemistry, 43 (1997) 638-643.
19. Nostelbacher K., Kirchgessner M., Stangl G. I., J. Chromatogr. B, 744 (2000) 273-282.
20. Melander W., Horvath C., Archives of Biochemistry and Biophysics, 183 (1977) 200-215.
51
21. Jiang L., He L., Fountoulakis M., “Comparison of protein precipitation methods for sample
preparation prior to proteomic analysis”, J. Chromatogr. A, 1023 (2004) 317-320.
22. Arvidsson T., Eklund E., “Determination of free concentration of ropivacaine and bupivacaine
in blood plasma by ultrafiltration and coupled-column liquid chromatography”, J. Chromatogr.
B., 668 (1995) 91-98.
23. Liu H., Montoya J. L., Forman L. J., Eggers C. M., Barham C. F., Delgado M., “Determination
of Free Valproic Acid: Evaluation of the Centrifree System and Comparison Between High-
Performance Liquid Chromatography and Enzyme Immunoassay”, Ther. Drug Monit. 14
(1992) 513-521.
24. Robieux I., Aita P., Sorio R., Toffoli G., Boiocchi M., “Determination of unbound etoposide
concentration in ultrafiltered plasma by high-performance liquid chromatography with
fluorimetric detection”, J. Chromatogr. B., 686 (1996) 35-41.
25. Pahlman I., Gozzi P., “Serum protein binding of tolterodine and its major metabolites in
humans and several animal species”, Biopharm. Drug Dispos., 20 (1999) 91-99.
26. Girard I., Ferry S., “Protein binding of methohexital. Study of parameters and modulating
factors using the equilibrium dialysis technique”, J. Pharm. Biomed. Anal., 14 (1996) 583-591.
27. Davies M. I., Lunte C. E., “Microdialysis sampling coupled on-line to microseparation
techniques”, Chem. Soc. Rev., 26 (1997) 215-222.
28. Elmquist W. F., Sawchuk R. J., “Application of microdialysis in pharmacokinetic studies”,
Pharm. Res., 14 (1997) 267-288.
29. Gaurav A. K., Malik A. K., Tewary D. K., Singh B., “A review on development of solid phase
microextraction fibers by sol–gel methods and their applications”, Analytica Chimica Acta,
610 (2008) 1-14.
30. Mahugo Santana C., Torres Padrón M.E., Sosa Ferrera Z., Santana Rodríguez J.J.,
“Development of a solid-phase microextraction method with micellar desorption for the
determination of chlorophenols in water samples: Comparison with conventional solid-phase
microextraction method”, J. Chromatogr. A, 1140 (2007) 13-20.
31. R. Jarmalavičienė, O. Kornyšova, D. Westerlund, A. Maruška, “Non-particulate (continuous
bed or monolithic) restricted-access reversed-phase media for sample clean-up and separation
by capillary-format liquid chromatography “, Anal. Bioanal. Chem. 377 (2003) 902.
32. R.Jarmalavičienė, O.Kornyšova, V.Bendokas, D.Westerlund, B.Buszewski, A.Maruška,
“Restricted-access media development for direct analysis of drugs in biofluids using capillary
liquid chromatography”, Anal. Bioanal. Chem. 391 (2008) 2323-2328.
33. A. Maruška, O. Kornyšova, E.Machtejevas. Efektyviosios skysčių chromatografijos pagrindai,
VDU, 2005, Kaunas;
34. Vielhauer S., Rodolphi A., Boos K. S., Siedel D.,“Evaluation and routine application of the
novel restricted-access precolumn packing material Alkyl-Diol Silica: coupled-column high-
performance liquid chromatographic analysis of the photoreactive drug 8-methoxypsoralen in
plasma“, J. Chromat. B, 666 (1995) 315.
35. Brandšteterová E., Kubalec P., Bovanová L., Food Analysis by HPLC, Marcel Dekker, New
York, 2nd Edition, (2000) 621.
36. Perry J.A., Glunz L.J., Szczerba T.J., Rateike J.D., LC GC 8 (1990) 832.
37. Hjerten S., Li M., Mohammed J., Nakazato K., Pettersson G., “Continuous beds: high-
resolving, cost-effective chromatographic matrices”, Nature, 356 (1992) 810-821.
38. Dong J., Xie C., Tian R., Wu R., Hu J., Zou H., “Capillary electrochromatography with a
neutral monolithic column for classification of analytes and determination of basic drugs in
human serum”, Electrophoresis, 26 (2005) 3452-3459.

52
39. Jin W., Fu H., Huang X., Xiao H., Zou H., “Optimized preparation of poly(styrene-
codivinylbenzene-co-methacrylic acid) monolithiccapillary column for capillary
electrochromatography”, Electrophoresis 24 (2003) 3172-3180.
40. Bisjak C.P., Lubbad S.H., Trojer L., Bonn G.K., “Novel monolithic poly(phenyl acrylate-co-
1,4-phenylene diacrylate) capillary columns for biopolymer chromatography”, J. Chromatogr.
A, 1147 (2007) 46-52.
41. Unger K.K. “Packings and Stationary Phases in Chromatographic Techniques”, New York:
Marcel Dekker; 1990.
42. Maruška A., Kornyšova O., J. “Continuous beds (monoliths): stationary phases for liquid
chromatography formed using the hydrophobic interaction-based phase separation
mechanism”, Biochem. Biophys. Methods, 59 (2004) 1–48.
43. B. Preinerstorfer, W. Bicker, W. Lindner, M. Lämmerhofer “Development of reactive thiol-
modified monolithic capillaries and in-column surface functionalization by radical addition of
a chromatographic ligand for capillary electrochromatography”, Journal of Chromatography A,
1044 (2004) 187–199.
44. K. J. Flook, N. R. Camerona, S. A.C. Wren “Polymerised bicontinuous microemulsions as
stationary phases for capillary electrochromatography: Effect of pore size on chromatographic
performance”, Journal of Chromatography A, 1044 (2004) 245–252.
45. M. R. Buchmeiser, “Polymeric monolithic materials: Syntheses, properties, functionalization
and applications”, Polymer, 48 (2007) 2187-2198.
46. Boss K. S., Rudolphi A., “The use of restricted-access media in HPLC, part I – classification
and review”, LC•GC, 15 (1997) 602.
47. N. M. Cassiano . V. V. Lima . R. V. Oliveira A. C. de Pietro . Q. B. Cass, “Development of
restricted-access media supports and their application to the direct analysis of biological fluid
samples via high-performance liquid chromatography”, Anal Bioanal Chem. (2006) 384:
1462–1469.
48. Boos K.-S., Wilmers B., Sauerbrey R., Schlimme E., “Development and performance of an
automated HPLC-analyzer for catecholamines”, Chromatographia, 24 (1987) 363–370.
49. Yoshida H., Morita I., Tamai G., Masujima T., Tsuru T., Takai N., Imai H., Chromatographia,
19 (1985) 466–472.
50. Ortelli D., Rudaz S., Souverain S., Veuthey J.-L., “Restricted Access Materials for Fast
Analysis of Methadone in Serum with Liquid Chromatography-Mass Spectrometry”, J. Sep.
Sci., 25 (2002) 222–228.
51. Ohman D., Carlsson B., Norlander B., “On-line extraction using an alkyl-diol silica precolumn
for racemic citalopram and its metabolites in plasma. Results compared with solid-phase
extraction methodology”, J. Chromatogr. B, 753 (2001) 365-373.
52. Rudolphi A., Vielhauer S., Boos K.S., Seidel D., Bathge I.M., Berger H., “Coupled-column
liquid chromatographic analysis of epirubicin and metabolites in biological material and its
application to optimization of liver cancer therapy”, J. Pharm. Biomed. Anal., 13 (1995) 615-
623.
53. Chiap P., Ceccato A., Gora R., Hubert P., Geczy J., Crommen J., “Automated determination of
pirlindole enantiomers in plasma by on-line coupling of a pre-column packed with restricted
access material to a chiral liquid chromatographic column”, J. Pharm. Biomed. Anal., 27
(2002) 447-455.
54. Sugergat H., Unger K.K., Emmert J., Wendt J., Mandel F., “Determination of Digoxin in
Human Serum by LC/MS with Online Sample Preparation”, LC GC: The Applications Book,
2002, p. 12.

53
55. Chang Y.C., Li C.M., Jong S.B., Liao P.C., Chang L.W., “Quantitative measurement of male
steroid hormones using automated on-line solid phase extraction-liquid chromatography/
tandem mass spectrometry and comparison with radioimmunoassay”, Analyst, 128 (2003) 363.
56. Mislanova C., Hutta M., “Influence of various biological matrices (plasma, blood
microdialysate) on chromatographic performance in the determination”, J. Chromatogr. B, 765
(2001) 167-177.
57. Yu Z., Westerlund D., Boos K.S., J. Chromatogr. B, 689 (1997) 379-386.
58. Ehrlich M., Trittler R., Daschner F.D., Kummerer K., "A new and rapid method for monitoring
the new oxazolidinone antibiotic linezolid in serum and urine by high performance liquid
chromatography-integrated sample preparation." J. Chromatogr.B, 755 (2001) 373-377.
59. Ehrlich M., Daschner F.D., Kummerer K., “Rapid antibiotic drug monitoring: meropenem and
ceftazidime determination in serum and bronchial secretions by high-performance liquid
chromatography-integrated sample preparation”, J. Chromatogr. B, 751 (2001) 357-363.
60. Walles M., Borlak J., Levsen K., “Application of restricted access material (RAM) with
precolumn-switching and matrix solid-phase dispersion (MSPD) to the study of the
metabolism and pharmacokinetics of verapamil”, Anal. Bioanal. Chem., 374 (2002) 1179-
1186.
61. Gordi T., Nielsen E., Yu Z., Westerlund D., Ashton M., “Direct analysis of artemisinin in
plasma and saliva using coupled-column high performance liquid chromatography with a
restricted-access material pre-column”, J. Chromatogr.B, 742 (2000) 155-162.
62. Ceccato A., Boulanger B., Chiap P., Hubert P., Crommen J., “Simultaneous determination of
methylphenobarbital enantiomers and phenobarbital in human plasma by on-line coupling of
an achiral precolumn to a chiral liquid chromatographic column”, J. Chromatogr. A, 819
(1998) 143-153.
63. Mullet W.M., Pawliszyn J., “Direct LC analysis of five benzodiazepines in human urine and
plasma using an ADS restricted access extraction column”, J. Pharm. Biomed. Anal., 26 (2001)
899-908.
64. Brunetto M.R., Obando M.A., Fernandez A., Gallignani M., Burguera J.L., Burguera M.,
“Column-switching high-performance liquid chromatographic analysis of carbamazepine and
its principal metabolite in human plasma with direct sample injection using an alkyl-diol silica
(ADS) precolumn”, Talanta, 58 (2002) 535-542.
65. Brunetto R., Gutierrez L., Delgado Y., Gallignani M., Burguera J.L., Burguera M., “High-
performance liquid chromatographic determination of cocaine and benzoylecgonine by direct
injection of human blood plasma sample into an alkyl-diol-silica (ADS) precolumn”, Anal.
Bioanal. Chem., 375 (2003) 534-538.
66. Heinig K., Bucheli F., “Application of column-switching liquid chromatography-tandem mass
spectrometry for the determination of pharmaceutical compounds in tissue samples”, J.
Chromatogr. B, 769 (2002) 9-26.
67. El Mahjoub A., Staub C., “High-performance liquid chromatography determination of
flunitrazepam and its metabolites in plasma by use column switching technique: comparison of
two extraction columns”, J. Chromatogr. B, 754 (2001) 271-283.
68. Yu Z., Westerlund D., J. Chromatogr. A, “Direct injection of large volumes of plasma in a
column-switching system for the analysis of local anaesthetics. II. Determination of
bupivacaine in human plasma with an alkyl-diol silica precolumn”, 725 (1996) 149-155.
69. Hogeendoorn E.A., Van Zoonen P., “The potential of restricted access media columns as
applied in coupled-column LC/LC-TSP/MS/MS for the high-speed determination of target
compounds in serum. Application to the direct and trace analysis of salbutamol and
clenbuterol”, Anal. Chem., 70 (1998) 1362-1368.

54
70. Kubalec P., Brandsteterova E., “Determination of propafenone and its main metabolite 5-
hydroxypropafenone in human serum with direct injection into a column-switching
chromatographic system”, J. Chromatogr. B, 726 (1999) 211-218.
71. Van Des Hoeven R.A.M., Hofte A.J.P., Frenay M., Irth H., Tjaden U.R., Van Der Greef J.,
Rudolphi A., Boos K.S., Varga G.M., Edholm L.E., “Liquid chromatography-mass
spectrometry with on-line solid-phase extraction by a restricted-access C18 precolumn for
direct plasma and urine injection”, J. Chromatogr. A, 762 (1997) 193-200.
72. Mislanova C., Stefancova A., Oravcova J., Horecky J., Trnovec T., Lindner W., “Direct high-
performance liquid chromatographic determination of (R)- and (S)-propranolol in rat
microdialysate using on-line column switching procedures”, J. Chromatogr. B, 739 (2000)
151-161.
73. Blahova E., Bovanova L., Brandsteterova E., J. “Direct HPLC analysis of trimethoprim in
milk”, Liq. Chrom. Rel. Technol., 24 (2001) 3027-3035.
74. Račaitytė K., Lutz E. S. M., Unger K. K., Lubda D., Boos K.-S., “Analysis of neuropeptide Y
and its metabolites by high-performance liquid chromatographyelectrospray ionization mass
spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid
cation exchanger”, J. Chromatogr. A, 890 (2000) 135–144.
75. Chiap P., Rbeida O., Christiaens B., Hubert Ph., Lubda D., Boos K.-S., Crommen J., “The use
of novel cation exchange restricted access material for automated sample celan-up of basic
drugs in plasma by liquid chromatography”, J. Chromatogr. A, 975 (2002) 145–155.
76. El Mahjoub A., Staub C., J. Chromatogr. B, 742 (2000) 381-390.
77. Friedrich G., Rose T., Rissler K., “High-performance liquid chromatographic method for the
determination of benzodiazepines in plasma or serum using the column-switching technique”,
J. Chromatogr. B, 784 (2003) 49-61.
78. Hermansson J., Grahn A., Hermansson I., “Direct injection of large volumes of plasma/serum
on a new biocompatible extraction column for the determination of atenolol, propranolol and
ibuprofen: Mechanisms for the improvement of chromatographic performance”, J.
Chromatogr. A, 797 (1998) 251-263.
79. Gunaratna C., Curr. Sep., 17 (1998) 83-96.
80. Gurley B.J., Zermatten S., Skelton D., “Determination of antipyrine in human serum by direct
injection restricted access media liquid chromatography”, J. Pharm. Biomed. Anal., 12 (1994)
1591-1595.
81. Perry J.A., Glunz L.J., Szczerba T.J., Rateike J.D., LC GC, 8 (1990) 832-846.
82. Furuta I., Kitahashi T., Kuroda T., Nishio H., Oka C., Morishima Y., “Rapid serum
vancomycin assay by high-performance liquid chromatography using a semipermeable surface
packing material column”, Clin. Chim. Acta, 301 (2000) 31-44.
83. Brandsteterova E., Wainer I.W., “Achiral and chiral high-performance liquid chromatography
of verapamil and its metabolites in serum samples”, J. Chromatogr. B, 732 (1999) 395-362.
84. Yu Z., Westerlund D., “Direct injection of large volumes of plasma in a column-switching
system for the analysis of local anaesthetics I. Optimization of semi-permeable surface
precolumns in the system and characterization of some interference peaks”, J. Chromatogr. A,
725 (1996) 137-147.
85. Van Zijtveld J., Van Hoogdalem E.J., “Application of a semipermeable surface column for the
determination of amoxicillin in human blood serum”, J. Chromatogr. B, 726 (1999) 169-174.
86. Haque A., Stewart J.T., “Direct Injection Analysis of Chlorzoxazone and its Major Metabolite
6-Hydroxychlorzoxazone in Human Serum using a Semipermeable Surface (SPS) HPLC”
ColumnBiomed, Chromatogr., 11 (1998) 236-239.

55
87. He J., Shibukawa A., Nakagawa T., J. “Direct injection analysis of carbamazepine and its
active 10,11-epoxide metabolite in plasma by use of a semipermeable surface (SPS) silica
column in LC”, Pharm. Biomed. Anal., 10 (1992) 289-294.
88. Peng S.X., Strojnowski M.J., Bornes D.M., J. “Direct determination of stability of protease
inhibitors in plasma by HPLC with automated column-switching”, Pharm. Biomed. Anal., 19
(1999) 343-349.
89. Yu Z., Abdel-Rehim M., Westerlund D., “Determination of amide-type local anaesthetics by
direct injection of plasma in a column-switching high-performance liquid chromatographic
system using a pre-column with a semipermeable surface”, J. Chromatogr. B, 654 (1994) 221-
230.
90. Rainbow S.J., Dawson C.M., Tickner T.R., “Direct serum injection high-performance liquid
chromatographic method for the simultaneous determination of phenobarbital, carbamazepine
and phenytoin”, J. Chromatogr., 527 (1990) 389-396.
91. Mizobe M., Kondo F., Toyoshima C., Kumamoto K., Terada T., Nasu H., “Rapid analysis of
four bilirubins in domestic animal sera using high-performance liquid chromatography”, J. Vet.
Med. Sci., 58 (1996) 495-499.
92. Puhlmann A., Dulffer T., Kobold U., “Multidimensional high-performance liquid
chromatography on Pinkerton ISRP and RP18 columns: direct serum injection to quantify
creatinine”, J. Chromatogr., 581 (1992) 129-133.
93. Dawson C.M., Belcher H.J.C.R., Rainbow S.J., Tickner T.R., "Measurement of 4-
Hydroxyanisole in Serum by Direct Injection High-Performance Liquid Chromatography", J.
Chromatogr., 534 (1990) 267-270.
94. Takeda N., Niwa T., Maeda K., Shibata M., Tatematsu A., “Accumulation of indoxyl sulfate,
an inhibitor of drug-binding, in uremic serum as demonstrated by internal-surface reversed-
phase liquid chromatography”, J. Chromatogr., 431 (1988) 418-423.
95. Croci D., Salmaggi A., De Gracia U., Bernardi G., “New High-Performance Liquid
Chromatographic Method for Plasma/Serum Analysis of Lamotrigine”, Ther. Drug Monit., 23
(2001) 665-668.
96. Ohshima T., Johno I., Hasegawa T., Kitazawa S., “Determination of Cefpiramide in Plasma by
High-Performance Liquid Chromatographic with Internal Surface Reversed-Phase Silica
Column", J. Liq. Chromatogr., 11 (1988) 3457-3470.
97. Ruckmick S.C., Hench B.D., “Direct analysis of the dopamine agonist (−)-2-(N-propyl-N-2-
thienylethylamino)-5-hydroxytetralin hydrochloride in plasma by high-performance liquid
chromatography using two-dimensional column switching”, J. Chromatogr., 565 (1991) 277-
295.
98. Pinkerton T.C., Perry J.A., Rateike J.D., "Separation of Furosemide, Phenylbutazone, and
Oxyphenbutazone in Plasma by Direct Injection onto Internal Surface Reversed-Phase
Columns with Systematic Optimization of Selectivity", J. Chromatogr., 367 (1986) 412-418.
99. Pullen R.H., Kennedy C.M., Curtis M.A., "Direct Plasma Injection using Internal Surface
Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography: Feasibility Study using Propofol
as a Model Compound", J. Chromatogr., 434 (1988) 271-277.
100. Gurley B.J., Marx M., Olsen K., “Phenytoin free fraction determination: comparison of an
improved direct serum injection high-performance liquid chromatographic method to ultrafiltration
coupled with fluorescence polarization immunoassay”, J. Chromatogr. B, 670 (1995) 358-364.
101. Martinez Fernandez J., Martinez Vidal J.L., Parrilla Vazquez P., Garrido Frenich A.,
“Application of restricted-access media column in coupled-column RPLC with UV detection
and electrospray mass spectrometry for determination of azole pesticides in urine”,
Chromatographia, 53 (2001) 503-509.

56
102. Boppana V.K., Miller-Stein C., Schaefer W.H., “Direct plasma liquid chromatographic-
tandem mass spectrometric analysis of granisetron and its 7-hydroxy metabolite utilizing
internal surface reversed-phase guard columns and automated column switching devices”, J.
Chromatogr. B, 678 (1996) 227-236.
103. Ma J., Liu C.L., Zhu P.L., Jia Z.P., Xu L.T., Wang R., “SIMULTANEOUS DETERMINATION
OF THE CARBOXYLATE AND LACTONE FORMS OF 10-HYDROXYCAMPTOTHECIN IN
HUMAN SERUM BY RESTRICTED-ACCESS MEDIA HIGH-PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY”, J. Chromatogr. B, 772 (2002) 197-204.
104. Ueno R., Uno K., Aoki T., “Determination of oxytetracycline in blood serum by high-
performance liquid chromatography with direct injection”, J. Chromatogr., 573 (1992) 333-
335.
105. Djurdjevic P., Jelikic-Stankov M., Laban A., “High-performance liquid chromatographic
assay of fleroxacin in human serum using fluorescence detection”, Talanta, 55 (2001) 631-638.
106. Kuroda N., Hamachi Y., Aoki N., Mitsuhiro W., Tanigawa M., Nakashima K., Biomed.
Chromatogr., 13 (1999) 340-343.
107. Ueno R., Aoki T., “High-performance liquid chromatographic method for the rapid and
simultaneous determination of sulfamonomethoxine, miloxacin and oxolinic acid in serum and
muscle of cultured fish”, J. Chromatogr. B, 682 (1996) 179-181.
108. Wang D.J., Qu Y., Hu P., Zhu P.L., “Determination of free catecholamine in human urine by
direct injection onto a shielded hydrophobic phase column”, Chromatographia, 31 (1991) 137-
141.
109. Lockemeyer M.R., Smith C.V., “Analysis of pentoxifylline in rabbit plasma using a Hisep
high-performance liquid chromatography column”, J. Chromatogr., 532 (1990) 162-167.
110. Riva E., Merati R., Cavenaghi L., “High-performance liquid chromatographic determination
of rifapentine and its metabolite in human plasma by direct injection into a shielded
hydrophobic phase column”, J. Chromatogr., 553 (1991) 35-40.
111. Baek M., Jeong J.H., Kim D.H., “Determination of aloesin in rat plasma using a column-
switching high-performance liquid chromatographic assay”, J. Chromatogr. B, 754 (2001) 121-
126.
112. Baek M., Rho Y.S., Kim D.H., “Column-switching high-performance liquid
chromatographic assay for determination of asiaticoside in rat plasma and bile with ultraviolet
absorbance detection”, J. Chromatogr. B, 732 (1999) 357-363.
113. Shirota O., Suzuki A., Kanda T., Ohtsu Y., Yamaguchi M., J. Microcol, “Low concentration
drug analysis by semi-microcolumn liquid chromatography with a polymer-coated mixed-
function precolumn”, Sep., 7 (1995) 29-34.
114. Jeong C.K., Kim S.B., Choi S.J., Sohn D.H., Ko G.I., Lee H.S., “Rapid microbore liquid
chromatographic analysis of biphenyldimethyl dicarboxylate in human plasma with on-line
column switching”, J. Chromatogr. B, 738 (2000) 175-179.
115. Lee H.M., Choi S.J., Jeong C.K., Kim Y.S., Lee K.C., Lee H.S., “Microbore high-
performance liquid chromatographic determination of cisapride in rat serum samples using
column switching”, J. Chromatogr. B, 727 (1999) 213-217.
116. Lee H.M., Jeong C.K., Choi S.J., Yoon B.M., Na D.H., Lee K.C., Lee H.S., “Direct analysis
of clomipramine in human plasma by microbore high performance liquid chromatography with
column-switching”, Chromatographia, 51 (2000) 353-356.
117. Yim D.S., Jeong J.E., Park J.Y., J. Chromatogr. B, 754 (2001) 487-493.
118. Song D., Wientjes M.G., Au J.L.S., “Bladder tissue pharmacokinetics of intravesical taxol”,
J. Chromatogr. B, 690 (1997) 289-299.

57
119. Teshima D., Kitagawa N., Otsubo K., Makino K., Itoh Y., Oishi R., “Simple determination
of mycophenolic acid in human serum by column-switching high-performance liquid
chromatography”, J. Chromatogr. B, 780 (2002) 21-26.
120. Katagi M., Nishikawa M., Tatsuno M., Miki A., Tsuchihashi H., “Column-switching high-
performance liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry for
identification of heroin metabolites in human urine”, J. Chromatogr. B, 751 (2001) 177-185.
121. Song D., Au J.L.S., “Direct injection isocratic high-performance liquid chromatographic
analysis of mitomycin C in plasma”, J. Chromatogr. B, 676 (1996) 165-168.
122. Jeong C.K., Lee H.Y., Jang M.S., Kim W.B., Lee H.S., “Narrowbore high-performance
liquid chromatography for the simultaneous determination of sildenafil and its metabolite UK-
103,320 in human plasma using column switching”, J. Chromatogr. B, 752 (2001) 141-147.
123. Van Warde A., Anthonio R.L., Visser T.J., Elsinga P.H., Posthumus H., Weemaes A.M.A.,
Blanksma P.K., Visser G.M., Paans A.M.J., Vaalburg W., J. Chromatogr. B, 663 (1995) 361-
369.
124. Weimann A., Bojesen G., “Analysis of tetracyclines in raw urine by column-switching high-
performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry”, J. Chromatogr. B, 721
(1999) 47-54.
125. A. Maruška, Kapiliarinė elektroforezė:mokomoji knyga, VDU, 2003.
126. Bavanova L., Brandšteterova E., “Direct analysis of food samples by high-performance
liquid chromatography”, J. Chromatogr. A 880 (2000) 149.
127. Onnerfjord P., Barcelo D., Emneus J., Gorton., Marko-Varga G., “On-line solid-phase
extraction in liquid chromatography using restricted access pre-columns for the analysis of s-
triazines in humic-containing waters”, J. Chromatogr. A 737 (1996) 35.
128. Hogendoorn E.A., Dijkman E., Baumann B., Hidalgo C., Sancho J.V., Hernandez F.,
“Strategies in Using Analytical Restricted Access Media Columns for the Removal of Humic
Acid Interferences in the Trace Analysis of Acidic Herbicides in Water Samples by Coupled
Column Liquid Chromatography with UV Detection”, Anal. Chem. 71 (1999) 1111.
129. Gerald, G.S. Martin, “New particle-loaded monoliths for chiral CEC separation”,
Electrophoresis 25 (2004) 3981.
130. Ahmad, “Recent developments in chiral capillary electrophoresis and applications of
this technique to pharmaceutical and biomedical analysis (p 3107-3130)”, Electrophoresis 22
(2001) 3107.
131. R.G. Belardi, J. Pawliszyn, „The application of chemically modified fused silica fibers
in the extraction of organics from water matrix samples and their rapid transfer to capillary
columns”, Water Pollut. Res. J. Can. 24 (1989) 179.
132. C.L. Arthur, J. Pawliszyn, “Solid phase microextraction with thermal desorption using
fused silica optical fibers”, Anal. Chem. 62 (1990) 2145.
133. Prosen H., Zupančič-Kralj L., “Solid-phase microextraction“, Trends in Analytical
Chemistry, 1999,18(4), p. 272.
134. Majors R. E., 2003. LC GC 2001 survey, Agilent Technologies.
135. Puig P., Borrull F., Calull M., Aguilar C., “Sorbent preconcentration procedures coupled to
capillary electrophoresis for environmental and biological applications”, Analytica Chimica
Acta, 616 (2008) 1-18.
136. Locke S.J., Thibault P., “Improvement in detection limits for the determination of paralytic
shellfish poisoning toxins in shellfish tissues using capillary electrophoresis/electrospray mass
spectrometry and discontinuous buffer systems”, Anal. Chem., 66 (1994) 3436–3446.
137. Chen S.H., Qian M.X., Brennan J.M., Gallo J.M., J. Chromatogr. B, 692 (1997) 43–51.
138. Fujinami A., Miyazawa T., Tagawa N., Kobayashi Y., “Simultaneous analysis of
benzphetamine and its metabolites, and quantitation of urinary p-hydroxy-N-

58
 benzylamphetamine by micellar electrokinetic chromatography”, Biol. Pharm. Bull., 21 (1998)
1207–1210.
139. Bogan D.P., Deasy B., O’Kennedy R., Smyth M.R., Fuhr U., “DETERMINATION OF
FREE AND TOTAL 7-HYDROXYCOUMARIN IN URINE AND SERUM BY CAPILLARY
ELECTROPHORESIS”, J. Chromatogr. B, 663 (1995) 371–378.
140. Veraart J.R., Gooijer C., Lingeman H., Velthorst N.H., Brinkman U.A.Th., "At-line solid-
phase extraction for capillary electrophoresis: application to negatively charged solutes", J.
Chromatogr. B, 719 (1998) 199–208.
141. Veraart J.R., Gooijer C., Lingeman H., Velthorst N.H., Brinkman U.A.Th., “At-Line Solid-
Phase Extraction Coupled to Capillary Electrophoresis: Determination of Amphoteric
Compounds in Biological Samples”, J. High Resolut. Chromatogr., 22 (1999) 183–187.
142. Debets A.J.J., Hupe K.-P., Brinkman U.A.Th., Kok W.Th., “A new valve for zone-
electrophoretic sample treatment coupled on-line with high performance liquid
chromatography”, Chromatographia, 29 (1990) 217–222.
143. Morita I., Sawada J.I., “Capillary electrophoresis with on-line sample pretreatment for the
analysis of biological samples with direct injection”, J. Chromatogr., 641 (1993) 375–381.
144. Zhou X., Li X., Zeng Z., J. Chromatogr. A, 1104 (2006) 359-365.
145. Benson L.M., Tomlinson A.J., Mayeno A.N., Gleich G.J., Wells D., Naylor S., „Membrane
preconcentration capillary electrophoresis mass spectrometry (mPC-CE-MS) analysis of 3-
phenylamino-1,2-propanediol (PAP) metabolites”, J. High Resolut. Chromatogr., 19 (1996)
291–294.
146. Breadmore M.C., Boyce M.C., Macka M., Avdalovic N., Haddad P.R., “On-capillary ion-
exchange preconcentration of inorganic anions using open-tubular capillaries followed by
elution with a transient isotachophoretic gradient”, Analyst, 125 (2000) 799–802.
147. Zhang S.S., Macka M., Haddad P.R., “Preparation and characterisation of dual-layer latex-
coated columns for open-tubular capillary electrochromatographic preconcentration of cations
combined in-line with their separation by capillary electrophoresis”, Electrophoresis, 27 (2006)
1069–1077.
148. Veraart J.R., Lingeman H., Brinkman U.A.Th., “Coupling of biological sample handling and
capillary electrophoresis”, J. Chromatogr. A, 856 (1999) 483–514.
149. Reyes D.R., Iossifidis D., Auroux P.A., Manz A., “Micro total analysis systems. 1.
Introduction, theory, and technology (review)”, Anal. Chem., 74 (2002) 2623-2636.
150. Auroux P. A., Lossifidis D., Reyes D. R., Manz A., “Micro total analysis system. 2.
Analytical standard operations and applications”, Anal. Chem., 74 (2002) 2637-2652.
151. Vilkner T., Janasek D., Manz A., “Micro total analysis systems. Recent developments”,
Anal. Chem., 76 (2004) 3373-3386.
152. Slentz B.E., Penner N.A., Regnier F.E., J. Sep. Sci., 25 (2002) 1011-1018.
153. A. Oriňák, G. Vering, H. F. Arlinghaus, J. T. Andersson, L. Halas, R. Oriňáková, L.
Turčániová, ”New Approaches to Coupling TLC with ToF-SIMS”, Journal of Planar
Chromatogr., 18 (2005) 44-50
154. Gusev I., Huang X., Horváth C., Capillary columns with in situ formed porous monolithic
packing for micro high-performance liquid chromatography and capillary
electrochromatography, J. Chromatogr. A, 855 (1999) 237-242.
155. Majors, R.E., Carr, P.W., Glossary of HPLC and LC separation terms IN: Column Watch,
Majors, R.E. (ed.), LC GC North America, 2008, 168 p.
156. M.Poitevin, A.Morin, J.M.Busnel, S.Descroix, M.C.Hennion, G.Peltre, Comparison of
different capillary isoelectric focusing methods—use of“narrow pH cuts” of carrier ampholytes
as original tools to improve resolution J. Chromatogr. A, 1155 (2007) 230-236.

59
157. R. Jarmalavičienė, Ištisinės ribotai pasiekiamos fazės kapiliarinei chromatografijai, daktaro
disertacija, (2008) 101 p.

60
 Publikacijos

1. R. Jarmalavičienė, J. Puskunigytė, O. Kornyšova, D. Westerlund, A. Maruška, SYNTHESIS,

CHARACTERIZATION AND APPLICATION OF RESTRICTED-ACCESS MEDIA FOR
CAPILLARY LIQUID CHROMATOGRAPHY, Proceedings of International Young Scientist
Conference „The Vital Nature Sign“. Kaunas, 2007, p. 60-63.
2. R Jarmalavičienė., J Puskunigytė., O Kornyšova., D Westerlund., B Buszewski., A Maruška.,
IN-LINE NON-PARTICULATE RESTRICTED ACCESS MEDIA PRECONCENTRATOR –
CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS SYSTEM FOR DIRECT ANALYSIS OF
BROMHEXINE AND AMBROXOL IN PLASMA, VIII Konferencja chromatograficzna, Lodz,
Lenkija, 2008, p. 51.
3. R. Jarmalavičienė, J. Puskunigytė, O. Kornyšova, D. Westerlund, B.Buszewski, A. Maruška A
COUPLED SOLID PHASE MICROEXTRACTION WITH CAPILLARY ZONE
ELECTROPHORESIS FOR DIRECT ANALYSIS OF AMBROXOL AND BROMHEXINE IN
PLASMA SAMPLES, Proceedings of 2nd International Young Scientist Conference „The Vital
Nature Sign“. Kaunas, 2008, p.77-80.
4. J. Grendienė, R. Jarmalavičienė, D. Westerlund, B.Buszewski, A. Maruška CAPILLARY
FORMAT RESTRICTED ACCESS MEDIA: SYNTHESIS, CHARACTERIZATION AND
APPLICATION FOR DIRECT ANALYSIS OF BIOLOGICAL FLUIDS, Proceedings of 4th
International Young Scientist Conference „The Vital Nature Sign“. Kaunas, 2010 (priimta
spausdinti).

61
 Padėka
Už pagalbą atliekant darbą, suteiktas žinias bei praktinius įgūdžius, nuoširdžiai dėkoju darbo
vadovei Redai Jarmalavičienei.
Taip pat nuoširdžiai dėkoju už pagalbą ir patarimus Vytauto Didžiojo Universiteto habil. dr.
Audriui Maruškai, Kauno Medicinos Universiteto studentui Tomui Drevinskui ir grupės draugams.

62