LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

JUSTINA ARMALYTĖ

Fenolinių junginių bei antioksidacinio aktyvumo palyginamoji

analizė šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) ţaliavose

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas
Lekt. dr. Audronė Dagilytė

Kaunas, 2017
 2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

Fenolinių junginių bei antioksidacinio aktyvumo palyginamoji

analizė šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis) ţaliavose
Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Darbą atliko

Lekt. dr. Audronė Dagilytė Magistrantė
Justina Armalytė

Recenzentas

Kaunas, 2017
 3

TURINYS

SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5

SUMMARY ............................................................................................................................................. 6

1. SANTRUMPOS ................................................................................................................................... 7

2. ĮVADAS ............................................................................................................................................... 8

3. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ............................................................................................... 10

4. LITERATŪROS APŢVALGA .......................................................................................................... 11

4.1. Pupinių (Fabaceae L.) šeimos augalai ........................................................................................11

4.2. Šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.) ........................................................................................11
4.3. Panaudojimas medicinoje ............................................................................................................13
4.4. Oksidacinis stresas .......................................................................................................................13
4.4.1. Oksidacinio streso sukeliamos ligos ....................................................................................14
4.4.2. Antioksidantai ......................................................................................................................15
4.5. Fenolinių junginių charakteristika ...............................................................................................16
4.5.1. Fenolinių junginių naudojimas medicinoje..........................................................................17
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI ............................................................................................. 19

5.1. Tiriamasis objektas ......................................................................................................................19

5.2. Naudota aparatūra ........................................................................................................................19
5.3. Naudotos tyrimui medţiagos ir reagentai ....................................................................................19
5.4. Suminis fenolinių junginių nustatymas spektrofotometriniu metodu .........................................20
5.5. Suminis flavonoidų nustatymas spektroskopiniu metodu ...........................................................21
5.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas fotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu..............22
5.7. Chelatinio aktyvumo nustatymas fotometriniu Fe2+ surišimo metodu ........................................23
5.8. Duomenų analizė .........................................................................................................................23
6. REZULTATAI ................................................................................................................................... 24

6.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ...................................................................................................24

6.2. Suminis fenolinių junginių nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje
sprektrofotometriniu metodu ...................................................................................................................26
6.3. Suminis flavonoidų kiekio nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje
sprektrofotometriniu metodu ...................................................................................................................28
 4

6.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje fotometriniu

DPPH radikalų surišimo metodu .............................................................................................................31
6.5. Chelatinio aktyvumo nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje fotometriniu Fe2+
surišimo metodu ......................................................................................................................................32
6.6. Suminio fenolinių junginiu, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo koreliacijos įvertinimas
šlaitinio dirvenio (Ononis Arvensis L.) ţaliavose ...................................................................................34
7. REZULTATŲ APTARIMAS ............................................................................................................ 36

7.1. Bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio aptarimas ..........................................................36

7.2. Antioksidacinio ir chelatinio aktyvumo aptarimas ......................................................................36
7.3 Duomenų koreliacijos aptarimas ..................................................................................................37
8. IŠVADOS........................................................................................................................................... 38

9. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ................................................................................................. 39

10. LITERATŪROS SĄRAŠAS............................................................................................................ 40

 5

SANTRAUKA

Justinos Armalytės magistro baigiamasis darbas/mokslinė vadovė lekt. dr. Audronė Dagilytė;
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra, Kaunas.
Fenolinių junginių bei antioksidacinio aktyvumo palyginamoji analizė šlaitinio dirvenio
(Ononis arvensis L.) ţaliavose.
Darbo tikslas: Ištirti skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L) augalų dalių ţaliavų
fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidacinį ir antichelatinį aktyvumą.
Uţdaviniai: 1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis
arvensis L.) augalų dalių ţaliavose. 2. Nustatyti flavonoidų kiekį skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis
arvensis L.) augalų dalių ţaliavose. 3. Įvertinti antioksidacinį ir antichelatinį aktyvumą skirtingų
šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.) augalų dalių ţaliavose. 4. Atlikti skirtingų augalų dalių,
biologiškai aktyvių junginių palyginamąją analizę ir identifikuoti optimalią šlaitinio dirvenio (Ononis
arvensis L.) vaistinės augalinės ţaliavos sudėtį.
Tyrimo metodika: Šis tyrimas atliktas naudojant Kauno rajono ir Kėdainių rajono 2014-
2015m., šlaitinio dirvenio augalines ţaliavas. Ekstrakcija buvo atliekama vandens vonelėje veikiant
ultragarsu. Suminis fenolinių junginių kiekis buvo nustatomas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu
metodu, rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentais (mg/g). Flavonoidų kiekis buvo nustatomas
spektrofotometriškai vykdant reakciją su AlCl3, rezultatai išreikšti rutino ekvivalentais (mg/g).
Antioksidacinis aktyvumas vertinamas DPPH radikalų surišimo metodu (%) ir antichelatiniu Fe(II)
surišimo metodu (%).
Rezultatai ir išvados: Gauti rezultatai parodė, kad šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.)
augalinėse ţaliavose bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis buvo pasiskirstęs plačiose ribose
pagal morfologines augalo dalis. Didţiausias bendras fenolinių junginių kiekis sukauptas 2015m.
Kauno rajone ţieduose (22,82 ± 2,8 mg/g), o maţiausias 2015m. Kėdainių rajone stiebuose.
Nustatinėjant flavonoidų kiekį didţiausias – 2015m. Kauno rajone ţieduose (70 ± 0,002 mg/g),
maţiausias 2015m. Kėdainių rajone stiebuose. Vertinant antioksidacines Ononis arvensis L. augalinių
ţaliavų savybes DPPH metodu didţiausias aktyvumas 2015m. Kauno rajone (34,97 – 89%),
maţiausias 2015m. Kėdainių rajone. Tyrimas parodė stiprų chelatų susidarymą ekstraktuose su Fe(II)
jonais (39,53 - 62,11%). Atlikus statistinę rezultatų analizę pastebėta stipri koreliacija tarp fenolinių
junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo (0,99, p<0,05). Nustatyta, kad didėjantis fenolinių
junginių kiekis ţaliavoje tiesiogiai didina ir antioksidacinį aktyvumą.
 6

SUMMARY

The supervisor of the final master‘s thesis/research prepared by Justina Armalytė is assoc.
lect. Dr. Audronė Dagilytė; Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian
University of Health Sciences, Kaunas.
The comparative analysis of the phenolic compounds and antioxidant activity in the herbal
materials of Pitched Restharrow (Ononis arvensis L.)
Research aim: To investigate different parts of plant Pitched Restharrow (Ononis arvensis
L.) phenolic compounds, flavonoids and antioxidant, antichelating activity.

Objectives: 1. To determine the total phenolic compounds in different parts of pitched

restharrow (Ononis arvensis L.) of the herbal materials. 2. To determine the amount of flavonoids in
different parts of Pitched Restharrow (Ononis arvensis L.) of the herbal materials. 3. To evaluate the
antioxidant ant antichelating activity in different parts of Pitched Restharrow (Ononis arvensis L.) of
the herbal materials. 4. To carry out a comparative analysis of biologically active compounds for
different parts of plants and to identify the optimal medicinal herbal material composition of Pitched
Restharrow (Ononis arvensis L.)
Research methodology: This research was carried out using Kaunas and Kėdainiai district
2014-2015m. herbal materials of Pitched Restharrow (Ononis arvensis L.). Extraction method –
ultrasound extraction. The total phenolics content was determined spectrophotometrically by the Folin-
Ciocalteu method, the results are expressed as gallic acid equivalents (mg/g). Flavonoids were
determined spectrophotometrically by reaction with AlCl3, the results are expressed as rutin
equivalents (mg/g). Antioxidant activity measured DPPH radical binding assay (%) and antichelating
FIC binding assay (%).

Results and conclusions: The experiment results has showed that in the herbal materials of
the Pitched Restharrow the total amount of phenolics and flavonoids had spread over a wide range by
the morphological parts of the plant. The largest amount of common phenolic compounds was
accumulated in 2015m. in the flowers around Kaunas district (22,82 ± 2,8 mg/g) and the least in stem
around Kėdainiai district in 2015m. In the research of flavonoids the highest amount was also found in
the extract of flowers around Kaunas district in 2015m (70 ± 0,002 mg/g) and the lowest in stems
around Kėdainiai district. Evaluating antioxidant herbal materials properties by DPPH method, the
highest activity was detected around Kaunas district in 2015m. (34,97 – 89%), the lowest around
Kėdainiai district in 2015m. The study showed a strong chelating with Fe (II) ions (39,53-62,11%).
The statistical analysis of results was observed a strong correlation between phenolics and antioxidant
activity (0.99, p <0.05). Determined that the increasing amount of phenolic compounds directly
increase antioxidative activity in the herbal materials.
 7

1. SANTRUMPOS

IR – infraraudonieji spinduliai
UV – ultravioletiniai spinduliai
HPLS – aukšto slėgio skysčių chromatografija
ROS – reaktyvios deguonies formos (angl. reactive oxygen species)
DNR – deoksiribonukleorūgštis
TRP – trumpalaikis receptorių potencialas (angl. transient receptor potential)
CAT – katalazė
GPx – glutationo peroksidazė
GRx – glutationo reduktazė
SOD – superoksido dismutazė
V/V – tūrio procentai (išreikšti etanolio koncentracija)
F-C – Folin-Ciocalteu analizės metodas
FIC - geleţies (II) jonų surišimo metodas (angl. ferrous ion chelating assay)
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
 8

2. ĮVADAS

Vis daţniau kalbama apie antioksidantus, jų reikšmę ir svarbą organizmui. Pastaruoju metu,
tyrimai vis daţniau įrodo, kad didelė dalis struktūrinių ląstelių bei audinių paţeidimų ar kitokių
organizmo sutrikimų priklauso būtent nuo oksidacinio streso poveikio. Oksidacinis stresas
apibrėţiamas kaip disbalansas tarp ţemo aktyvumo antioksidantų ir padidėjusių reaktyvių deguonies
formų (ROS), laisvųjų radikalų kiekio[25]. Tam, kad organizme tinkamai vyktų visos fiziologinės
funkcijos yra būtina pusiausvyra tarp laisvųjų radikalų ir antioksidantų. Kitu atveju, laisvieji radikalai
gali neigiamai paveikti lipidų, baltymų ir DNR struktūras, padidinti ţmogui gręsiančių ligų skaičių
[16,18].
Oksidaciniui stresui atkreipus dėmesį ir sukėlus didelį susidomėjimą bei norą natūraliai jį
maţinti, buvo aktyviai nagrinėjamos biologiškai aktyvios medţiagos ir tiriamos jų antioksidacinės
savybės. Bene geriausiomis antioksidacinėmis savybėmis pasiţymi fenoliniai junginiai, iš jų
daugiausia flavonoidai. Be antioksidacinio poveikio jie dar maţina kapiliarų pralaidumą ir laikomi
kaip kraujagysles apsaugantys vaistai [14].
Šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.) – tai daugiametis, krūminis augalas, ţydintis birţelio –
rugpjūčio mėnesiais [31]. Dirvenis ţinomas jau tūkstančius metų. Jo šaknų ekstraktų poveikis pasiţymi
diuretinėmis savybėmis. Savo diureziniu poveikiu, palyginus su kitais tokio paties poveikio augalais,
pasiţymi vidutiniškai stipriai [9,38]. Dirvenis kaupia nemaţą kiekį fenolinių junginių bei kitų
biologiškai aktyvių medţiagų, kurios pasiţymi antioksidacinėmis, antiuţdegiminėmis,
antimikrobinėmis savybėmis, ekstraktus, tinktūras ar nuovirus galima naudoti esant kepenų ar
skrandţio nedidelėms problemoms [4]. Ţinomas panaudojimas norint pagerinti ţaizdų gijimą, egzemų,
podagros, reumatinių būklių, įvairių odos paţeidimų, odos vėţio gydymui, kaip pagalbinė priemonė.
Naudojama taip pat lokaliai kaip antiseptinė, antimikrobinė priemonė [28, 35]. Literatūroje kaip tyrimų
ţaliava nurodomi dygusis dirvenis (Ononis spinosa L.) ir šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.), deja
šlaitinio dirvenio nėra registruoto valstybėse narėse kaip vaistinės ţaliavos. Europos rinkoje dirvenio
šaknų galima rasti tik keliose šalyse, kur jis yra kaip komponentas augalinėse arbatose: tai Belgijoje,
Čekijos Respublikoje, Vokietijoje, Italijoje ir Lenkijoje [9]. Pagal gautų tyrimų duomenis, šlaitinis
dirvenis galėtų būti įtrauktas į augalinių arbatų ar ekstraktų sudėtį.
Darbo aktualumas: Lietuvoje šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) augalinių ţaliavų
cheminė sudėtis tirta pirmą kartą. Aktualu tai, kad norima gauti daugiau išsamių duomenų apie maţiau
ţinomą šios rūšies augalą, jo kokybines savybes. Tyrimo metu buvo tirtos skirtingų morfologinių
augalo dalių augalinės ţaliavos (ţiedai, lapai, stiebai, ţolė), optimizuoti augalinių ţaliavų ekstraktai,
 9

nustatytas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis, įvertintos antioksidacinės ir antichelatinės

augalinių ţaliavų savybės naudojantis spektrofotometriniais metodais.
Darbo tikslas: Ištirti skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.) augalų dalių ţaliavų
fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą.
 10

3. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Darbo tikslas:
Ištirti skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L) augalų dalių ţaliavų fenolinių junginių
ir flavonoidų kiekį bei antioksidacinį ir antichelatinį aktyvumą.

Uţdaviniai:
1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.)
augalų dalių ţaliavose.
2. Nustatyti flavonoidų kiekį skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.) augalų dalių
ţaliavose.
3. Įvertinti antioksidacinį ir chelatinį aktyvumą skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis
L.) augalų dalių ţaliavose.
4. Atlikti skirtingų augalų dalių, biologiškai aktyvių junginių palyginamąją analizę ir
identifikuoti optimalią šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) vaistinės augalinės ţaliavos sudėtį.
 11

4. LITERATŪROS APŢVALGA

4.1. Pupinių (Fabaceae L.) šeimos augalai

Pupinių (Fabaceae L.) šeima yra trečia pagal dydį pasaulyje iš ţydinčių augalų, po
orchidėjinių (Orchidaceae) ir astrinių (Asteraceae) šeimų. Pupinių šeimoje yra priskaičiuojama 730
genčių ir daugiau kaip 19400 rūšių [10,31]. Dauguma šių augalų auga nerūgščiuose (pH 6,0-6,5)
dirvoţemiuose. Šios šeimos augalai geba gyventi simbiozėje kartu su atmosferos azotą fiksuojančiomis
bakterijomis Rhizobium [1]. Pupinių šeimos augalai plačiai paplitę ne vien Lietuvoje, bet ir
Vidurţemio jūros srityse, Europoje [23,31].

4.2. Šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.)

1 pav. Šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.) [7]

 12

Morfologiniai poţymiai. Šlaitinis dirvenis (Ononis arvesis L.) pupinių šeimos atstovas
(1pav.). Daugiametis, krūminis augalas, uţaugantis 30-80 cm aukščio, padengtas paprastaisiais
mechaniniais ir liaukiniais plaukeliais. Šaknis liemeninė, ilga, maţai šakota. Stiebas tiesus, išilgai
briaunotas, gausiai išsišakojęs, be dyglių. Lapai praţanginiai, apatiniai ir viduriniai - trilapiai,
viršūninėje dalyje paprasti, ovalios ar pailgai elipsiškos formos, dantyti, iš abiejų pusių apaugę
liaukiniais plaukeliais. Lapo dydţiai vyrauja 15-30*5-15 mm, dideli prielapiai kurie suaugę į lapkočius
6-10mm ilgio. Lapų paţastyse yra po du ţiedus, o stiebo viršūnėje ir šoninėse šakelėse jie susitelkę į
varpiškas kekes. Ţiedą sudaro 5 vainiklapiai 10-20mm ilgio, raudonos, roţinės, labai retai – baltos
spalvos. Subrandina plačias kiaušinio formos ankštis 7*5-6mm kuriose būna 2-4 sėklos. Ţydi birţelio
– rugpjūčio mėnesiais [32].
Cheminė sudėtis. Šlaitiniui dirveniui atlikus cheminius tyrimus, buvo nustatyta, kad jis savo
sudėtyje kaupia triterpeninį alkoholį α-onoceriną, izoflavonus, oksikumarinus – skopoletiną ir
skopoliną [34]. Atlikus instrumentinės analizės metodus, tokius kaip IR, UV, HPLC spektroskopijas, iš
izoflavonoidų, visais atvejais yra aptinkamas onogeninas [15]. Taip pat formononetinas, ononinas,
biochaninas A, genisteinas, trifolirizinas, rotinidinas. Iš triterpenų aptinkami α-onocerinas, daţniausiai
ţinomas kaip onokolis [9]. Toliau nagrinėjant dirvenį, pasirinkus UHPLC-ESI-Q-TOF-MS (angl.)
metodą (atvirkštinių fazių ultra-efektyvioji skysčių chromatografija, sujungtas su elektropurkštuvine
jonizuota kvadrupoline laiko-skrydţio masės spektrometrija), jo cheminė sudėtis ištirta itin smulkiai.
Rastuose polifenoliniuose junginiuose labiausiai dominavo eriodiciolis. Fenolinės rūgštys rastos –
galo, kofeino, vanilino, cinamono, chlorogeninė, ferulinė, p-kumarino ir salicilo rūgštys [4,9]. Iš
flavononų aptikti naringeninas ir eriodiktolis, flavonolių – dihidro-kvercetinas, rutinas, kvercetinas ir
kemferolis, flavonai – apigeninas ir liuteolinas, flavan-3-oliai – katechinas ir epikatechinas, dilaktonai
– elago rūgštis, dihidrochalkonas florizinas, taip pat stilbenoido produktai – piceidas ir trans-
resveratrolis [4]. Nagrinėjant sterolius dirvenio sudėtyje, buvo aptikta jų keletas. Iš sterolių didţiausią
koncentraciją sudarė β-sitosterolis, tačiau taip pat aptikti ir stigmasterolis, kampesterolis, cholesterolis
ir α-spinasterolis, jų koncentracija maţesnė lyginant su sitoteroliu [9, 28]. Kaip manoma, dirvenio
poveikį nulemia bendras aktyviųjų sudedamųjų dalių kiekis, tai izoflavonoidai, flavonoidai ir fenolinės
rūgštys. Šlaitinio dirvenio ţolėje izoflavonoidų randama apie 2,54 %, flavonoidų apie 2,32% ir
fenolinių rūgščių apie 2,41% [30].
Šlaitinis dirvenis turi ir antioksidacinių savybių. Dėl kaupiamų polifenolinių junginių
eteriniuose aliejuose šios savybės pasireiškia vidutiniškai, priklausomai nuo koncentracijos. Eterinio
aliejaus kiekis ţaliavoje svyruoja nuo 0,02 – 0,2% [9]. Esant didesnei koncentracijai antioksidacinės
savybės pasireiškia stipriau. Eterinių aliejų mišinyje buvo išskirta net septyniasdešimt septyni
komponentai, tai sudarė 95,6% - 97,11% viso eterinio aliejaus masės. Didţiausia koncentracija
 13

deguonį turinčių seksviterpenų 66,29% ir seksviterpeninių angliavandenilių 20,1%. Likusiame kiekyje

randami maţesni kitų komponentų pėdsakai: selin-11-en-4-α-olis, α-selinenas, dodekanas ir 2-fenil
etilo tiglatas [3].

4.3. Panaudojimas medicinoje

Dirvenis ţinomas jau tūkstančius metų. Jo šaknų ekstraktų poveikis pasiţymi diuretinėmis
savybėmis ir kaip vaistaţolinis augalas, dygusis dirvenis (Ononis spinosa L.) yra įtrauktas į daugelį
farmakopėjų [10]. Literatūroje kaip ţaliava nurodoma ne tik dygusis dirvenis (Ononis spinosa L.), bet
ir šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.), deja šlaitinio dirvenio nėra registruoto kaip vaistinės ţaliavos
valstybėse narėse. Medicinoje ir tyrimuose naudojamas dygusis dirvenis (Ononis spinosa L.). Europos
rinkoje dirvenio šaknų galima rasti tik keliose šalyse, kur jis yra kaip komponentas augalinėse
arbatose: tai Belgijoje, Čekijos Respublikoje, Vokietijoje, Italijoje ir Lenkijoje [9].
Šiomis dienomis produktai, kurių sudėtyje yra dirvenio šaknų ar vien tik dirvenis, vartojami
diurezės skatinimui, esant šlapimo takų infekcijoms, apatinių šlapimo takų ir inkstų sutrikimams,
tokiems kaip susidariusiam smėliui ar maţiems akmenukams inkstuose. Šios indikacijos jau yra
įrodytos atliekant tyrimus su gyvūnais, tačiau dar nėra klinikinių studijų [10,11,22]. Savo diureziniu
poveikiu, palyginus su kitais tokio paties poveikio augalais, pasiţymi vidutiniškai stipriai [39].
Dėl savo sudėtyje turimų biologiškai aktyvių medţiagų, kurios pasireiškia antiuţdegiminėmis,
antimikrobinėmis savybėmis, yra naudojami dirvenio uţpilai, nuovirai, ekstraktai, tinktūros. Taip pat
dirvenis dar yra naudojamas esant kepenų ar skrandţio nedidelėms problemoms [4]. Ţinomas
panaudojimas norint pagerinti ţaizdų gijimą, gydyti chroniškoms odos ligoms, egzemų, podagros,
reumatinių būklių, įvairių odos paţeidimų, odos vėţio gydymui, kaip pagalbinė priemonė. Naudojama
taip pat lokaliai kaip antiseptinė, antimikrobinė priemonė [29,36].

4.4. Oksidacinis stresas

Oksidacinis stresas apibrėţiamas kaip disbalansas tarp ţemo aktyvumo antioksidantų ir

padidėjusių reaktyvių deguonies formų (ROS), laisvųjų radikalų. Padidėjęs oksidacinis stresas gali
skatinti ląstelių struktūros paţeidimus ir net sunaikinti audinius [16]. Nesuporuoti elektronai, laisvieji
radikalai yra nestabilūs, tačiau labai reaktyvūs junginiai [17]. Tam, kad organizme tinkamai vyktų
 14

visos fiziologinės funkcijos yra būtina pusiausvyra tarp laisvųjų radikalų ir antioksidantų. Kitu atveju,
laisvieji radikalai gali neigiamai paveikti lipidų, baltymų ir DNR struktūras, padidinti ţmogui
gręsiančių ligų skaičių [16,18]. Įvairūs tyrimai rodo, kad organizme, kuris patiria oksidacinį stresą yra
ţenkliai padidėjęs malondialdehido, superoksiddismutazės, glutationo peroksidazės ir katalazės kiekis
[13].
Visos šios reakcijos sukeltos dėl naujų laisvųjų radikalų susidarymo vyksta grandininės
reakcijos principu, kuris vyksta tol, kol yra nutraukiamos dėl bi-radikalų malšinimo. Bi-radikalų
malšinimas yra stipresnis nei laisvųjų radikalų reakcijos su kitais ląstelės komponentais. Tačiau nors ir
nusistovėjus koncentracijai ir esant maţam laisvųjų radikalų kiekiui, jų reakcijų greitis yra gana didelis
ir gaunami produktai gali sukelti oksidacinę paţaidą [17].
Labiausiai reaktyvūs ir didţiausią biologinę ţalą DNR, baltymų, angliavandenių ir lipidų
membranoms gali padaryti: hidroksilo radikalas, superoksido anijono radikalas, vandenilio peroksidas,
hipochloritas, ozonas, azoto oksido radikalas ir peroksinitrito radikalas [16,18].
Pagrindiniai vidiniai laisvųjų radikalų šaltiniai yra mitochondrijos, ksantino oksidazė,
peroksisomos, fagocitozė, uţdegimas, mankšta, išemija/reperfuzija [18].
Pagrindiniai išoriniai laisvųjų radikalų šaltiniai yra cigarečių dūmai, alkoholis, radiacija,
aplinkos teršalai, kai kurie vaistai, pesticidai, pramoniniai tirpikliai, ozonas [18, 35].

4.4.1. Oksidacinio streso sukeliamos ligos

Reaktyviosios deguonies formos (ROS), manoma, kad sukelia uţdegimus ir virusines

infekcijas, įvairius virškinamojo trakto sutrikimus, jo opas, taip pat vėţinius susirgimus ir
neurodegeneracines ligas tokias kaip: Parkinsono liga, Alzheimerio liga ir Dauno sindromas
[13,16,17].
Tokios patologinės būklės kaip uţdegimas ir reperfuzinė išemija susidaro dėl deguoniui
jautrių trumpalaikio receptorių potencialo (TRP) kanalų, kurie skirstomas į šešis pošeimius (C, V, M,
P, ML, A). TRP kanalai identifikuojami susidarius jautriems ryšiams tarp reaktyvaus deguonies ir
kalcio jonams pralaidţių kanalų. Esant kuriai nors iš šių patologijų ląstelėse pasigamina dideli kiekiai
aktyvių deguonies formų. Vykstant kalcio jonų antplūdţiui per deguoniui jautrius TRP kanalus –
įrodytas šių ligų pablogėjimas. TRPA1 kanalo tipas laikomas kaip „deguonies jutiklis“ kuris vaidina
svarbų vaidmenį palaikydamas deguonies homeostazę. TRPA1 išreikštas sensoriniuose neuronuose,
tarpininkauja neuropeptido atpalaidavime ir chemokino gamyboje kvėpavimo takuose, nuo ko
 15

priklauso astmos pablogėjimas. TRPM2 kanalo tipai reaguodami į aktyvųjį deguonį sukelia kalcio jonų
antplūdţius per TRPM2 monocituose/makrofaguose ir alveolinio epitelio ląstelėse kur ima gamintis
citokinai ir inflamasomos, dėl kurių taip pat pablogėja uţdegiminiai procesai. Taip pat, yra įrodyta, kad
TRPM2 prisideda prie acetaminofeno sukelto kepenų paţeidimo, radiacijos sukelto audinių paţeidimo
bei Alzheimerio ligos, ką ir nulemia oksidacinio streso vystymasis [38].
Oksidacinis stresas vaidina svarbų vaidmenį Alzheimerio ligos patogenezėje. Smegenys yra
labiau paţeidţiamos oksidacinio streso dėl aktyvesnės medţiagų apykaitos nei kiti organai. Neuronų
komponentai (lipidai, baltymai, nukleorūgštys) gali būti oksiduojami Alzheimerio ligos metus dėl
mitochondrijų funkcijos sutrikimo, padidėjusio metalų kiekio, uţdegimo ir β-amiloid (Aβ) peptidų.
Mitochondrijų funkcijos sutrikimas ir vėlesnis metabolinis sutrikimas buvo nustatytas hipokampo
neuronuose pasireiškus citochromo oksidazės trūkumui, kuri atsakinga uţ ROS gamybos padidėjimą ir
energijos sandėliavimą. Aβ peptidas sutrikdo elektronų transporto grandinę, todėl silpnėja pagrindinių
fermentų veikla ir sutrikdoma mitochondrijų dinamika [6]. Aβ peptidams sąveikaujant su metalais
(variu, cinku, geleţimi) vyksta elektronų perkėlimo procesas, jo metu susidaro ROS, indukuoti
amiloid-peptido radikalai ir chelatai, kurie ir sukelia oksidacinį stresą [6, 12].
Genetiniai pakitimai genuose, kurie turi įtakos vėţinių ląstelių susidarymui neretai susidaro
dėl laisvųjų radikalų, kurie sukelia oksidacinį stresą pakitus ląstelės metabolizmui [34]. Vėţinėse
ląstelėse susidaręs redokso disbalansas, lyginant su normaliomis ląstelėmis, gali stimuliuoti
onkogeniškų ląstelių susidarymą. Dėl oksidacinio paţeidimo vykstantis nuolatinis genetinės
medţiagos keitimas dalyvauja mutageniniame, kancerogeniniame ir senėjimo procesuose. DNR
mutacija yra svarbus aspektas kancerogenezei bei įvairių auglių susidarymui. ROS sukelti DNR
paţeidimai apima viengrandės ir dvigradės DNR lūţius, purino, pirimidino, deoksiribozės ar
skersinių jungčių modifikacijas [37].
Pagal PSO XXI amţiaus sindromu laikomas diabetas. Manoma, kad didţiausios diabeto
komplikacijos įvyksta dėl oksidacinio streso. Hiperglikemijos organizme metu iš įvairių šaltinių yra
stimuliuojamas reaktyvių deguonies formų susidarymas. Šie šaltiniai yra – lipooksigenazė, citochromo
450 monooksigenazė, azoto oksido sintazė, gliukozės autooksidacija [37].

4.4.2. Antioksidantai

Vis daţniau yra kalbama apie antioksidantų svarbą ir reikalingumą. Antioksidantų veikimo
principai yra - neutralizuoja susidariusius laisvuosius radikalus, dezaktyvuoja molekulinį deguonį,
 16

pašalina oksiduotus metalų jonus, prisijungia vandenilį ir sugeria UV spindulius. Taip pat gali būti
naudojami kaip konservantai norint išvengti lipidų oksidacijos [2,25].
Endogeniniai antioksidantai gali būti skirstomi i fermentinius ir nefermentinius. Fermentiniai
yra tokie, kaip superoksido dismutazė (SOD), katalazė (CAT), gliutationo peroksidazė (GPx) ir
gliutationo reduktazė (GRx). Nefermentiniai antioksidantai susidaro metabolizmo organizme metu, tai
melatoninas, bilirubinas, lipolinė rūgštis, gliutationas, L-argininas, kofermentas Q10 ir kt.
Antioksidantai kurie nesusidaro organizme, bet gaunami su maistu ar papildais vadinami
egzogeniniais. Daţniausiai tai yra vitaminas E, vitaminas C, karotinoidai, selenas, manganas, cinkas,
flavonoidai, omega-3 ir omega-6 riebiosios rūgštys [25].
Natūralūs antioksidantai randami augaluose daugiausia yra fenoliniai junginiai kurių didţiąją
dalį sudaro flavan-3-oliai (>50%), flavonolglikozidai ir dihidrochalkonai. Antioksidantų komponentai
pasiţymi hidrofilinėmis ir lipofilinėmis savybėmis, kurių dauguma yra hidrolifiliai flavonoidai kurie
pasiţymi vidutiniu ar stipriu poliariškumu tokie kaip, katechinai, (+)-katechinas ir (-)-epikatechinas bei
kvercetino glikozidai. Teigiama, kad oligomeriniai procianidinai kurie pasiţymi vidutiniu ir ţemu
poliškumu taip pat gali prisidėti prie bendrojo antioksidacinio veikimo kaip lipofiliniai komponentai
[20].

4.5. Fenolinių junginių charakteristika

Fenoliniai junginiai – sudaryti iš vieno ar kelių aromatinių ţiedų ir turi vieną ar daugiau
hidroksilo grupių. Jie vadinami fenoliniais junginais dėl savo struktūros, nes šiuo metu yra ţinoma
daugiau nei 8000 junginių, ir visi savo struktūroje turi fenolį. Didţiausios grupės fenolinių junginių yra
fenolinės rūgštys, flavonoidai, taninai, stilbenai ir lignanai [8].
Fenolinės rūgštys skirstomos į dvi klases: benzoinės rūgšties dariniai, pavyzdţiui, galo rūgštis
ir cinamono rūgšties dariniai, pavyzdţiui, kavos rūgštis (2pav.) [7].

Benzoinė rūgštis R1=R2=R3=H Cinamono rūgštis R1=R2=H

Galo rūgštis R1=R2=R3=OH Kavos rūgštis R1=R2=OH
 17

Vanilino rūgštis R1=OH, R2=CH3O, R3=H [5]

2pav. Pagrindinės fenolinės rūgštys

Flavonoidai, tai didţiulė antrinių metabolitų augaluose grupė, kurios struktūros pagrindas yra
2-fenilbenzopiranas (3pav.) [19]. Jie skirstomi į šešis pogrupius, tai flavonai, flavonoliai, flavanoliai,
flavanonai, izoflavonai ir antocianinai. Trečia didelė polifenolių grupė yra taninai, kurie skirstomi į dvi
klases, tai hidrolizuoti taninai ir kondensuoti taninai. Hidrolizuoti taninai savo sudėtyje turi gliukozės
ar kito monosacharido esterį su galo rūgštimi, kurie kitaip vadinami galotaninais ar esterį su
heksahidroksidifenilo rūgštimi – elagitaninais. Kondensuoti taninai yra oligomerai ar polimerai iš
flavan-3-olių sujungtų anglies jungtimi [7].

3pav. Flavonoidų struktūros pagrindas [19]

4.5.1. Fenolinių junginių naudojimas medicinoje

Augaluose kaupiami fenoliniai junginiai, jie plačiai paplitę visoje augalų karalystėje.
Labiausiai paplitę augaluose antriniai jų metabolitai, kurių kiekis varijuoja plačiame intervale
priklausomai nuo morfologinės augalo dalies ar sąlygų, kuriose augalas auga [8,14]. Polifenoliai, tai
junginių grupė varijuojanti plačiame fiziologinio aktyvumo spektre, naudojami tradicinėje ir
moderniojoje medicinoje. Jie yra prekursoriai chalkonams, katechinams, flavonams, antocianams [14].
Pastaruoju metu polifenoliniai junginiai atkreipia daugiau dėmesio dėl savo stiprių
antioksidacinių savybių, ir jų poveikis pasiţymi kaip prevencija ligoms, kurios susijusios su
oksidaciniu stresu, pavyzdţiui, vėţys, širdies ir kraujagyslių bei neurodegeneracinės ligos [7,8].
Fenoliniai junginiai, daugiausia flavonoidai, pasiţymi antioksidacinėmis savybėmis, maţina kapiliarų
pralaidumą ir laikomi kaip kraujagysles apsaugantys vaistai. Flavonoidų 3‘4‘-dihidroksi grupės
 18

(kvercetinas, miricetinas, liuteolinas, ir kiti glikozidai) junginiai pasiţymi ir P-vitamininiu poveikiu

[14].
Antioksidaciniu poveikiu, flavonoidai yra daug efektyvesni nei vitaminai C ir E, ir laisvųjų
radikalų ţalą gali uţkirsti šiais mechanizmais: tiesioginis reaktyviųjų deguonies formų (ROS)
inaktyvavimas, antioksidacinių fermentų aktyvavimas, metalų kompleksų sudarymas, α-tokoferolio
radikalų sumaţinimas, oksidazės slopinimas, azoto oksido sukelto oksidacinio streso sušvelninimas,
šlapimo rūgšties kiekio padidinimas, padidina maţų molekulių antioksidantų antioksidacines savybes
[27].
Greitai ir paprastai vykstanti reakcija, kurios metu flavonoidai inaktyvuoja laisvuosius
radikalus ·R atpalaiduodami vandenilio atomą kaip donorą (4pav.) [27].

4 pav. Laisvojo radikalo inaktyvavimas [27]

 19

5. TYRIMO METODIKA IR METODAI

5.1. Tiriamasis objektas

Tyrime buvo tirtos šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) morfologinės dalys: stiebai, lapai,
ţiedai, ţolė. Tiriamieji objektai buvo renkami 2014 – 2015metais.
Nustačius ekstrakcines sąlygas, buvo pasirinkta ekstrakciją vykdyti ultragarso vonelėje
(Elmasonic S40H (U=230V, V=40 Hz), Elma, Vokietija), 50 C temperatūroje, veikiant ultragarsu
10min. Ekstrahentas pasirinktas 70% (V/V) etanolio vandens mišinys.
0,1 g išdţiovintos ir susmulkintos augalinės ţaliavos dedame į stiklinį buteliuką ir uţpilame
20ml 70% etanoliu, buteliukas uţsukamas kamščiu.
Gauti ekstraktai atvėsinami, filtruojami pro popierinius, 70% etanoliu sudrėkintus filtrus.
Nufiltruoti ekstraktai laikomi tamsaus stiklo buteliukuose, tamsioje nuo saulės spindulių apsaugotoje
vietoje, kambario temperatūroje.

5.2. Naudota aparatūra

Tiriamųjų ekstraktų gamybai buvo naudota ultragarso vonelė – „ElmaSonic S40H“ (U=230V) iš Elma
Schmidbauer (Vokietija) ir orbitalinė kratyklė „IKA®KS 130 basic“ iš IKA-WERKE (Vokietija).
Spektroskopinei bandinių analizei naudotas spektrofotometras „Cary 8454 UV-Vis“ iš Agilent
Technologies (JAV).

5.3. Naudotos tyrimui medţiagos ir reagentai

Išgrynintas vanduo;
Maistinis rektifikuotas etilo alkoholis 96proc. (UAB „Sumbras“, Kaunas, Lietuva);
Folin&Ciocalteu fenolinis reagentas 2N (Sigma-Aldrich, Šveicarija);
Acto rūgštis 100 proc. (Carl Roth, Vokietija);
Bevandenės geleţies (II) chloridas 99,5proc. (Alfa Aesar, Vokietija);
Aliuminio chlorido heksahidratas ≥95proc. (Carl Roth, Vokietija);
Natrio karbonatas 99,5-100,5proc. (Sidma-Aldrich, Prancūzija);
 20

Galo rūgšties monohidratas ≥98proc. (Sigma-Aldrich, Kinija);

Rutino trihidratas ≥95proc. (Carl Roth, Vokietija)
Heksametilentetraminas ≥99proc. (Carl Roth, Vokietija)
DPPH (2,2difenil-1-pikrilhidrazilas) 95proc, (Carl Roth, Vokietija);
Ferozino mononatrio druska ≥97proc. (Sigma-Aldrich, JAV)

5.4. Suminis fenolinių junginių nustatymas spektrofotometriniu metodu

Fenolinių junginių kiekis buvo nustatomas naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Gaminant

tiriamąjį tirpalą buvo imamas 1ml tiriamojo etanolinio ekstrakto, 5ml 0,2N Folin-Ciocalteu reagento ir
pridedami 4ml 7,5% Na2CO3 tirpalo. Optinis tankis matuojamas spektrofotometru (Cary 8454 UV-Vis,
Agilent Technologies, JAV), esant 765nm šviesos bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas – išgrynintas
vanduo. Suminis fenolinių junginių kiekis tiriamojoje augalinėje ţaliavoje apskaičiuojamas iš gauto
rezultato. Fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (mg galo rūgšties/ 100g
bandinio) pagal kalibracinę kreivę.
Kalibracinė kreivė sudaryta ruošiant etaloninius galo rūgšties tirpalus 96% etanolyje.
Ruošiami 0,35; 0,175; 0,0875; 0,0475; 0,021875; 0,010938 mg/ml koncentracijų tirpalai. 1ml
atitinkamos koncentracijos galo rūgšties tirpalas maišomas su 5ml Folin-Ciocalteu reagentu ir 4ml
Na2CO3 tirpalais. Optinis tankis matuojamas po 30min, 60min ir 90min esant 765nm bangos ilgiui ir
naudojant palyginamąjį tirpalą išgrynintą vandenį (5pav.).

5pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė (n=3)

 21

Suminis fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas naudojantis galo rūgšties kalibracine

kreive.
Apskaičiuojama reikšmė x pagal formulę:
y = 9.3076x + 0.1377
y – etanolinio ekstrakto optinis tankis

C – fenolinių junginių kiekis, išreikštas galo rūgšties ekvivalentais mg/g;

c – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo kreivę, mg/ml
V – tiriamojo ekstrakto tūris, ml;
m – augalinės ţaliavos masė paimta ekstrakto gamybai, g.

Eksperimentiškai buvo nustatyta, kad didţiausia absorbcija 765nm šviesos bangos ilgyje,
buvo pasiekiama po 30min nuo reagentų sumaišymo. Šis absorbcijos rezultatas buvo naudojamas
fenolinių junginių kiekio nustatymui. Palyginamasis tirpalas- išgrynintas vanduo.

5.5. Suminis flavonoidų nustatymas spektroskopiniu metodu

Suminis flavonoidų kiekis nustatomas gaminant tiriamąjį tirpalą iš paruošto augalinio

ekstrakto, aliuminio chlorido, heksametilentetramino, parūgštinant terpę acto rūgštimi.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas 25ml matavimo kolboje. Į kolbą pilame 1ml 70% etanolinio
ekstrakto, 10ml 96% etanolio, 1,5ml 10% aliuminio chlorido tirpalo, 2ml 5% heksametilentetramino
tirpalo ir parūgštiname 0,5ml 33% acto rūgšties tirpalu. Gautas tirpalas skiedţiamas išgrynintuoju
vandeniu iki ţymės, sumaišoma. Eksperimentiškai nustačius absorbcija matuojama po 30min esant
šviesos bangos ilgiui 407nm. Gautas absorbcijos dydis lyginamas su palyginamuoju tirpalu.
Palyginamasis tirpalas ruošiamas 25ml matavimo kolboje. Į kolbą pilame 1 ml 70% etanolinio
ektrakto, 10ml 96%etanolio ir parūgtiname 0,5ml 33% acto rūgšties tirpalu. Gautas tirpalas
skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki ţymės, sumaišoma.
Gaminant etaloninį, tiriamąjį ir palyginamąjį rutino tirpalą gamyba vyksta analogiškai, tik
vietoj 1ml augalinės ţaliavos ekstrakto, pilame 1ml rutino tirpalo. Etanolinis rutino tirpalas ruošiamas
0,05g rutino tirpinant 100ml etanolio.
 22

Flavonoidų suminis kiekis perskaičiuojamas rutinu ir išreiškiamas mg/g:

mR – rutino masė gramais, panaudota etanoliniams rutino tirpalui ruošti;

A – augalinio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis;
V – augalinio ekstrakto tūris, ml;
m – augalinės ţaliavos masė g, paimta ektrakto ruošimui;
AR – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis;
VR – etaloninio rutino tirpalo tūris, ml.

5.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas fotometriniu DPPH radikalų surišimo

metodu

Antioksidacinio aktyvumo įvertinimui taikomas elektronų perdavimo reakcijomis pagrįstas

DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodas. Kiekvieną dieną ruošiamas švieţias
DPPH 6×10-5 M DPPH tirpalas ir laikomas tamsaus stiklo butelyje apsaugančiame nuo saulės
spindulių.
Tirpalas ruošiamas 1cm kvarco kiuvetėje. 50 µl tiriamojo etanolinio ekstrakto sumaišoma su
2ml 6×10-5 M DPPH tirpalu 96% etanolyje. Tuščias bandinys paruošiamas su 50 µl 70% etanoliu,
vietoj etanolinio ekstrakto. Absorbcijos maţėjimas išmatuojamas spektrofotometru 515 nm bangos
ilgyje, iki kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra, t.y. po 30min. Laikas buvo nustatytas
eksperimentiškai matuojant ekstraktus pas 1min.

Antiradikalinis augalinių ekstraktų aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procentais:

DPPH = [(AB – Aa/AB] * 100%

AA – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis (t = 30min)

AB – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min)
 23

5.7. Chelatinio aktyvumo nustatymas fotometriniu Fe2+ surišimo metodu

Chelatinis aktyvumas nustatomas remiantis fotometriniu Fe2+ surišimo metodu, jį

pakoregavus ir pritaikius savo tyrimui. Fenolinių junginių antioksidacinės savybės priklauso nuo jiems
2+ 2+
būdingos savybės surišti pereinamųjų metalų (Fe , Cu ) jonus. Chelatinės savybės tiriamuosiuose
ekstraktuose įvertinamos matuojant Fe (II) ir ferozino komplekso absorbcijos sumaţėjimą esant šviesos
bangos ilgiui 562 nm.
Tirpalas ruošiamas 1cm kvarco kiuvetėje. 1ml tiriamojo ekstrakto sumaišome su 50 µl 2mM
FeCl2 tirpalo. Reakcijai inicijuoti pridedame 0,2ml 5mM ferozino tirpalo. Sumaišius absorbcija
matuojama po 10min esant 562nm šviesos bangos ilgiui. Tuščias bandinys paruošiamas identiškai,
vietoj tiriamojo ekstrakto pilant 70% etanolį.

Fe2+ jonų surišimas išreiškiamas procentais:

Fe2+ = [(AB – Aa/AB] * 100%

AA – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis (t = 10min)

AB – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min)

5.8. Duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė ir grafinis vaizdavimas atlikti „MS Exel 2010“ (Microsift, JAV) ir
„IBN SPSS Statistics 19“ (IBM Corporation, JAV). Gauti tyrimų duomenys statistiškai įvertinti
apskaičiuojant matematinį vidurkį, standartinę paklaidą, standartinį nuokrypį, Pirsono koreliacijos
koeficientą. Statistiniam patikimumui įvertinti buvo pasirinkta 0,05 reikšmė, todėl gauti rezultatai
kurių p<0,05 laikomi statistiškai reikšmingais.
 24

6. REZULTATAI

6.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas

Prieš atliekant tyrimą, buvo eksperimentiškai nustatomos tinkamiausios ekstrakcinės sąlygos

tiriamųjų ekstraktų ruošimui.
Ekstrahento koncentracijos parinkimas. Pirmiausia, parenkama etanolio koncentracija, kuri
geriausiai išekstrahuoja ţaliavas. Etanolio koncentracija nustatoma maceracijos būdu. Etanolio
koncentracijos imamos 40%, 50%, 60%, 70% ir 80%. Ekstrakto gamybai imama 0,1g išdţiovintos ir
susmulkintos augalinės ţaliavos ir 20ml ekstrahento, tiriamos koncentracijos etanolio ir vandens
mišinio.
Uţpylus ţaliavą ekstrahentu ją purtome 1val., purtytuvo greitis 320 apsisukimų per minutę.
Paliekame ekstraktą maceruotis 24h ir po jų purtome dar 1val. 320 apsisukimų per minutę greičiu.
Pagamintą ekstraktą filtruojame pro popierinį etanoliu sudrėkintą filtrą. Nustatome bendrą fenolinių
junginių kiekį pagal GRE – galo rūgšties ekvivalentą (6pav.).

6pav. Suminis fenolinių junginių kiekis pagal GRE, nustatant optimalią etanolio koncentraciją

Nustatant eksperimentiškai fenolinius junginius tiriamuosiuose ekstraktuose, pagal gautus

rezultatus tinkamiausia etanolio koncentracija - 70 proc., gautas suminis fenolinių junginių kiekis yra
didţiausias (16,12 ± 0,74mg/g).
 25

Ekstrahavimo laiko nustatymas ultragarso vonelėje. Tiriamųjų ekstraktų ruošimui imame 0,1g
išdţiovintos ir susmulkintos augalinės ţaliavos ir 20ml 70% etanolio ir vandens mišinio. Ektraktus
veikiame ultragarsu kambario temperatūroje ir suminį fenolinių junginių kiekį matuojame po 5, 10, 15,
20 min. (7pav.)

7pav. Fenolinių junginių kiekis nustatant tinkamiausią ektrahavimo laiką

Eksperimentiškai nustatant suminį fenolinių junginių kiekį tiriamuosiuose ekstraktuose, pagal

gautus rezultatus (13,62 ± 0,22 mg/g), geriausias laikas ekstrahavimui yra 10min.

Ekstrahavimo temperatūros parinkimas ultragarso vonelėje. Tiriamųjų ekstraktų ruošimui

imame 0,1g išdţiovintos ir susmulkintos augalinės ţaliavos ir 20ml 70% etanolio. Ekstrahuojame
30˚C, 40 ˚C, 50 ˚C, 60 ˚C ir 70˚C temperatūroje. Atvėsinus ekstraktus filtruojame per popierinį,
etanoliu sudrėkintą filtrą. (8pav.)
 26

8pav. Fenolinių junginių kiekis nustatant tinkamiausią ektrahavimo temperatūrą

Eksperimentiškai nustatant suminį fenolinių junginių kiekį tiriamuosiuose ekstraktuose, pagal

gautus rezultatus (12,31 ± 0,33 mg/g), tinkamiausia ekstrahavimui temperatūra yra 50˚C.

Atlikus sąlygų parinkimą eksperimentiškai pagal gautus duomenis, geriausios sąlygos

ekstraktų gamybai yra: 1:200 arba 0,1g išdţiovintos ir susmulkintos augalinės ţaliavos ir 20ml 70%
etanolio ir vandens mišinio. Ekstrahuojama ultragarsu vandens vonioje 10min, 50˚C temperatūroje.

6.2. Suminis fenolinių junginių nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje

sprektrofotometriniu metodu

Tiriamojoje augalinėje ţaliavoje buvo nustatytas suminis fenolinių junginių kiekis naudojantis
spektroftometriniu metodu. Augalinės ţaliavos surinktos Kauno ir Kėdainių rajonuose. Iš kiekvienos
morfologinės augalo dalies buvo gaminama po 3 ekstraktus iš kurių atliekama po 3 pakartojimus.
Eksperimentui atlikti naudojama F-C metodika, gauti rezultatai pateikti diagramoje. (9,10pav.)
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2014m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 11,73 – 21,66 mg/g
Kauno rajone, ir nuo 13,27 - 19,58 mg/g Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas aiškus
fenolinių junginių pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Eksperimentiškai nustačius
maţiausias kiekis fenolinių junginių sukaupiamas stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 11,73 ±
0,44 mg/g , Kėdainių rajono ţaliavose 13,27 ± 0,19 mg/g. Didţiausi kiekiai randami ţieduose 21,66 ±
0,5 mg/g Kauno rajono ţaliavose ir 19,58 ± 0,31 mg/g Kėdainių rajono ţaliavose.
 27

Lyginant suminį fenolinių junginių kiekį nuo daugiausiai sukaupiančių iki maţiausiai, pagal
morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 21,66 ± 0,5 mg/g (Kauno raj.), 19,58 ± 0,31 mg/g
(Kėdainių raj.); lapai 18,57 ± 0,04 mg/g (Kauno raj.), 19,12 ± 0,14 mg/g (Kėdainių raj.); ţolė 17 ± 0,56
mg/g (Kauno raj.), 14,4 ± 0,72 mg/g (Kėdainių raj.); stiebai 11,73 ± 0,48 mg/g (Kauno raj.), 13,27 ±
0,19 mg/g (Kėdainių raj.)
Vidutiniškai tarp visų augalo dalių rajone, didesnį fenolinių junginių kiekį sukaupė augalai
rinkti Kauno rajone 17,16 ± 4,18 mg/g nei Kėdainių rajone 15,86 ± 2,84 mg/g.

9pav. Suminis fenolinių junginių kiekis (vidurkis ± standartinė paklaida) 2014m. Ononis
arvensis L. augalinėje žaliavoje Kauno ir Kėdainių rajonuose. GRE – galo rūgšties ekvivalentai
(n=3)

Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2015m. ţaliavų rezultatai įvairuoja 12,05 – 22,82 mg/g
Kauno rajone, ir nuo 5,4 – 19,4 mg/g Kėdainių rajone.
Eksperimentiškai nustačius maţiausias fenolinių junginių kiekis taip pat sukaupiamas
stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 12,05 ± 1,62 mg/g, Kėdainių rajono ţaliavose 5,4 ± 0,84
mg/g. Didţiausi kiekiai randami lapuose 22,82 ± 2,8 mg/g Kauno rajono ţaliavose ir Kėdainių rajono
ţaliavų ţieduose 19,4 ± 0,28 mg/g.
Lyginant suminį fenolinių junginių kiekį nuo daugiausiai sukaupiančių iki maţiausiai, pagal
morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: lapai 22,82 ± 2,8 mg/g (Kauno raj.) ir ţiedai 19,4 ± 0,28
mg/g (Kėdainių raj.); ţiedai 21,4 ± 0,28 mg/g (Kauno raj.) ir lapai 18,26 ± 0,08 mg/g (Kėdainių raj.);
ţolė 16 ± 3,39 mg/g (Kauno raj.), 10,2 ± 0,56 mg/g (Kėdainių raj.); stiebai 12,05 ± 1,62 mg/g (Kauno
raj.), 5,4 ± 0,89 mg/g (Kėdainių raj.)
 28

Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesnį fenolinių junginių kiekį sukaupė
augalai rinkti Kauno rajone 16,67 ± 5,44 mg/g nei Kėdainių rajone 12,32 ± 6,16 mg/g.

10pav. Suminis fenolinių junginių kiekis (vidurkis ± standartinė paklaida) 2015m. Ononis
arvensis L. augalinėje žaliavoje Kauno ir Kėdainių rajonuose. GRE – galo rūgšties ekvivalentai
(n=3)

Apţvelgus gautus rezultatus, galima daryt išvadą, kad fenoliniai junginiai daugiausiai
kaupiami yra ţieduose (2014m. 21,66 ± 0,5 mg/g. 2015m. 22,82 ± 2,8 mg/g) ir lapuose (2014m. 19,58
± 0,3 mg/g, 2015m. 19,4 ± 0,28 mg/g), jų kiekiai yra sąlyginai panašūs. Maţiausi kiekis randami
stiebuose.

6.3. Suminis flavonoidų kiekio nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje

sprektrofotometriniu metodu

Tiriamojoje augalinėje ţaliavoje buvo nustatytas suminis flavonoidų kiekis naudojantis

spektroftometriniu metodu. Augalinės ţaliavos buvo renkamos Kauno ir Kėdainių rajonuose. Iš
kiekvienos morfologinės augalo dalies buvo gaminama po 3 ekstraktus iš kurių atliekama po 3
pakartojimus. Eksperimentui atlikti naudojamas aliuminio chlorido tirpalas dėl savybės sudaryti
kompleksus su flavonoidais ir taip juos nustatyti. Gauti rezultatai pateikti diagramoje (11,12pav.).
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2014m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 11,14 – 34,15 mg/g
Kauno rajone, ir nuo 11,92 – 36,65 mg/g Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas aiškus
 29

flavonoidų pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Eksperimentiškai nustačius

maţiausias kiekis flavonoidų sukaupiamas stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 11,14 ± 0,22
mg/g , Kėdainių rajono ţaliavose 11,92 ± 0,11 mg/g. Didţiausi kiekiai randami ţieduose 34,15 ± 1,06
mg/g Kauno rajono ţaliavose ir 36,65 ± 0,64 mg/g Kėdainių rajono ţaliavose.
Lyginant suminį flavonoidų kiekį nuo daugiausiai sukaupiančių iki maţiausiai, pagal
morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 34,15 ± 1,06 mg/g (Kauno raj.), 36,65 ± 0,64 mg/g
(Kėdainių raj.); lapai 28,55 ± 0,77 mg/g (Kauno raj.), 31,6 ± 1,55 mg/g (Kėdainių raj.); ţolė 14,35 ±
0,21 mg/g (Kauno raj.), 16,33 ± 1,52 mg/g (Kėdainių raj.); stiebai 11,14 ± 0,22 mg/g (Kauno raj.),
11,92 ± 0,11 mg/g (Kėdainių raj.).
Staičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesnį flavonoidų kiekį sukaupė augalai
rinkti Kauno rajone 20,03 ± 12,98 mg/g nei Kėdainių rajone 19,62 ± 10 mg/g. Tačiau nagrinėjant
rezultatus tik tarp lapų ir ţiedų kur sukaupiamas pagrindas visų flavonoidų, daugiau flavonoidų buvo
sukaupta Kėdainių rajono ţaliavose.

11pav. Suminis flavonoidų kiekis (vidurkis ± standartinė paklaida) 2014m. Ononis arvensis
L. augalinėje žaliavoje Kauno ir Kėdainių rajonuose. RE – rutino ekvivalentai (n=3)

Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2015m. ţaliavų rezultatai svyravo 10 - 70 mg/g Kauno
rajone, ir nuo 8,2 – 52,7 mg/g Kėdainių rajone.
Eksperimentiškai nustačius maţiausias flavonoidų kiekis taip pat sukaupiamas stiebuose.
Kauno rajono ţaliavose vidurkis 10 ± 0,002 mg/g, Kėdainių rajono ţaliavose 8,2 ± 0,28 mg/g.
 30

Didţiausi kiekiai randami ţieduose 70 ± 0,002 mg/g Kauno rajono ţaliavose ir Kėdainių rajono
ţaliavų ţieduose 52,7 ± 0,84 mg/g.
Lyginant suminį flavonoidų kiekį nuo daugiausiai sukaupiančių iki maţiausiai, pagal
morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 70 ± 0,002 mg/g (Kauno raj.) ir 52,7 ± 0,84 mg/g
(Kėdainių raj.); lapai 25 ± 7,07 mg/g (Kauno raj.) ir lapai 26,85 ± 1,2 mg/g (Kėdainių raj.); ţolė 15 ±
7,07 mg/g (Kauno raj.), 7,15 ± 0,21 mg/g (Kėdainių raj.); stiebai 10,00 ± 0,002 mg/g (Kauno raj.), 8,2
± 0,28 mg/g (Kėdainių raj.)
Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesnį flavonoidų kiekį sukaupė augalai
rinkti Kauno rajone 30 ± 25,63 mg/g nei Kėdainių rajone 23,663 ± 19,74 mg/g. Tačiau nagrinėjant
rezultatus tik tarp lapų ir ţiedų kur sukaupiamas pagrindas visų flavonoidų, jų kiekis buvo lapai
panašus Kauno rajono (43 ± 24,89 mg/g) ir Kėdainių rajone (42,36 ± 14,17 mg/g)

12pav. Suminis flavonoidų kiekis (vidurkis ± standartinė paklaida) 2015m. Ononis arvensis
L. augalinėje žaliavoje Kauno ir Kėdainių rajonuose. RE – rutino ekvivalentai (n=3)

Apţvelgus gautus rezultatus, galima daryt išvadą, kad didţiausias kiekis flavonoidų yra
kaupiamas ţieduose (2014m 36,65 ± 0,64 mg/g. 2015m. 70 ± 0,002 mg/g) ir lapuose (2014m. 31,6 ±
1,55 mg/g. 2015m. 26,85 ± 1,20 mg/g). Jų kiekiai ţenklai didesni uţ maţiausią aptinkamą kiekį
stiebuose.
 31

6.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje

fotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu

Atlikus antioksidacinio aktyvumo tyrimą buvo nustatytas ţaliavoje jo kiekis procentais

atskirai kiekvienoje morfologinėje augalo dalyje. Iš kiekvienos morfologinės augalo dalies buvo
gaminama po 3 ekstraktus iš kurių atliekama po 3 pakartojimus. Fotometriniu DPPH radikalų surišimo
metodu galime vertinti teigiamą fenolinių junginių poveikį ląstelėms maţinant jų paţeidimą bei paties
oksidacinio streso maţinimą (13,14pav.).
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2014m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 35,19 – 49,62 %
Kauno rajone, ir nuo 37,17 – 54,66 % Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas
pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Eksperimentiškai nustačius maţiausias
antioksidacinis akytvumas stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 35,19 ± 0,3 % , Kėdainių rajono
ţaliavose 37,17 ± 0,23 %. Didţiausi kiekiai randami ţieduose 49,62 ± 1,73 % Kauno rajono ţaliavose
ir 54,66 ± 1,76 % Kėdainių rajono ţaliavose.
Lyginant antioksidacinį aktyvumą nuo labiausiai pasireiškiančio iki maţiausiai, pagal
morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 49,62 ± 1,73 % (Kauno raj.), 54,66 ± 1,76 %
(Kėdainių raj.); lapai 42,94 ± 4,77 % (Kauno raj.), 43,35 ± 1,48 % (Kėdainių raj.); ţolė 37,96 ± 1,06 %
(Kauno raj.), 44,54 ± 3,64 % (Kėdainių raj.); stiebai 35,19 ± 0,3 % (Kauno raj.), 37,17 ± 0,23 %
(Kėdainių raj.)
Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesniu antioksidaciniu aktyvumu pasiţymi augalai
rinkti Kėdainių rajone 44,89 ± 6,58 % nei Kauno rajone 41,42 ± 6,18 %.

13pav. DPPH radikalų surišimo įvertinimas (vidurkis ± standartinė paklaida) 2014m.

Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje (n=3)
 32

Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2015m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 34,97 – 89,0 %
Kauno rajone, ir nuo 20,68 – 58,33 % Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas
pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Eksperimentiškai nustačius maţiausias
antioksidacinis aktyvumas stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 34,97 ± 0,04 % , Kėdainių
rajono ţaliavose 20,68 ± 0,31 %. Didţiausi kiekiai randami ţieduose 89,0 ± 0,14 % Kauno rajono
ţaliavose ir 58,33 ± 0,96 % Kėdainių rajono ţaliavose.
Lyginant antioksidacinį aktyvumą nuo labiausiai pasireiškiančio iki maţiausiai, pagal
morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 89,0 ± 0,14 % (Kauno raj.), 58,33 ± 0,96 %
(Kėdainių raj.); lapai 45,07 ± 0,33 % (Kauno raj.), 36,05 ± 1,49 % (Kėdainių raj.); ţolė 35,7 ± 0,55 %
(Kauno raj.), 30,02 ± 0,76 % (Kėdainių raj.); stiebai 34,97 ± 0,04 % (Kauno raj.), 20,68 ± 0,31 %
(Kėdainių raj.)
Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesniu antioksidaciniu aktyvumu pasiţymi augalai
rinkti Kauno rajone 51,19 ± 23,73 % nei Kėdainių rajone 36,27 ± 14,84 %.

14 pav. DPPH radikalų surišimo įvertinimas (vidurkis ± standartinė paklaida) 2015m. Ononis
arvensis L. augalinėje žaliavoje (n=3)

6.5. Chelatinio aktyvumo nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje

fotometriniu Fe2+ surišimo metodu
 33

Šiuo tyrimu nustatomas gebėjimas surišti pereinamųjų (Fe2+ ir Cu2+) metalų jonus. Nuo šio
gebėjimo priklauso fenolinių junginių antioksidacinės savybės, tiriamas Fe(II) ir ferozino komplekso
absorbcijos maţėjimas. Gauti rezultatai pateikti diagramoje (15,16pav.).
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2014m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 34,17 – 47,52 %
Kauno rajone, ir nuo 35,03 – 50,76 % Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas
pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Visose augalo dalyse chelatinis aktyvumas
vyravo panašus, didelio reikšmių skirtumo nėra kaip kituose tyrimuose. Maţiausias kiekis stiebuose,
Kauno rajono ţaliavose vidurkis 34,17 ± 4,29 % , Kėdainių rajono ţaliavose 35,03 ± 1,35 %.
Didţiausias chelatinis aktyvumas ţieduose 47,52 ± 2,37 % Kauno rajono ţaliavose ir 50,76 ± 0,81 %
Kėdainių rajono ţaliavose.
Lyginant chelatinį aktyvumą nuo labiausiai pasireiškiančio iki maţiausiai, pagal morfologinę
augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 47,52 ± 2,37 % (Kauno raj.), 50,76 ± 0,81 % (Kėdainių raj.);
lapai 41,86 ± 5,4 % (Kauno raj.), 47,82 ± 2,53 % (Kėdainių raj.); ţolė 40,86 ± 7,32 % (Kauno raj.),
37,61 ± 7,57 % (Kėdainių raj.); stiebai 34,17 ± 4,29 % (Kauno raj.), 35,03 ± 1,35 % (Kėdainių raj.)
Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesniu chelatiniu aktyvumu pasiţymi augalai
rinkti Kėdainių rajone 42,23 ± 7,9 % nei Kauno rajone 40,98 ± 6,39 %.

15pav. Chelatinio aktyvumo įvertinimas (vidurkis ± standartinė paklaida) Fe2+ jonų surišimo
metodu 2014m. Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje (n=3)

Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2015m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 39,53 – 62,11 %
Kauno rajone, ir nuo 19,31 – 56,04 % Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas
pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Maţiausias kiekis stiebuose, Kauno rajono
 34

ţaliavose vidurkis 39,53 ± 12,22 % , Kėdainių rajono ţaliavose 19,31 ± 1,81 %. Didţiausias chelatinis
aktyvumas ţieduose 62,11 ± 2,12 % Kauno rajono ţaliavose ir 56,04 ± 4,12 % Kėdainių rajono
ţaliavose.
Lyginant chelatinį aktyvumą nuo labiausiai pasireiškiančio iki maţiausiai, pagal morfologinę
augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 62,11 ± 2,12 % (Kauno raj.), 56,04 ± 4,12 % (Kėdainių raj.);
lapai 48,06 ± 2,77 % (Kauno raj.), 42,04 ± 2,21 % (Kėdainių raj.); ţolė 43,1 ± 15,35 % (Kauno raj.),
32,1 ± 1,13 % (Kėdainių raj.); stiebai 39,53 ± 12,22 % (Kauno raj.), 19,31 ± 1,81 % (Kėdainių raj.)
Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesniu chelatiniu aktyvumu pasiţymi augalai
rinkti Kauno rajone 48,2 ± 11,87 % nei Kėdainių rajone 37,37 ± 14,51 %.

16pav. Chelatinio aktyvumo įvertinimas (vidurkis ± standartinė paklaida) Fe2+ jonų surišimo
metodu 2015m. Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje (n=3)

6.6. Suminio fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo

koreliacijos įvertinimas šlaitinio dirvenio (Ononis Arvensis L.) ţaliavose

Atlikus tyrimą pastebėta, kad didţiausias kiekis, biologiškai aktyvių medţiagų sukaupiama
tose pačiose morfologinėse augalo dalyse (ţiedai, lapai). Iš gautų rezultatų svarbu nustatyti koreliaciją
tarp kintamųjų ir statistiškai įvertinti gautų duomenų statistinį reikšmingumą. Koreliacijai įvertinti
buvo pasirinkta skaičiuoti Pirsono koeficientą, kuris įvertina tiesioginę priklausomybę tarp dviejų
atsitiktinių kintamųjų. Kuo gauta reikšmė yra arčiau 1 (-1), tuo stipresnis ryšys tarp kintamųjų ir
 35

atvirkščiai – kuo gauta reikšmė arčiau 0, tuo koreliacija yra silpnesnė ( <0,3 – ryšys silpnas, 0,3-0,7 –
ryšys vidutinis, >0,7 – ryšys stiprus) [22].
Atlikus statistinę šlaitinio dirvenio ekstraktų analizę, pastebėta labai stipri koreliacija tarp
fenolinių junginių kiekio ir flavonoidų abiejų metų ţaliavų ekstraktuose. Tai 2014m. Kauno rajono
(0,894, p<0,05), Kėdainių rajono (0,99, p<0,05) ir 2015m. Kauno rajono (0,784, p<0,05), Kėdainių
rajono (0,856, p<0,05). Lyginant fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą, matomas stiprus
ryšys abiejų metų ţaliavų ekstraktuose 2014m. Kauno rajono (0,877, p<0,05), Kėdainių rajono (0,913,
p<0,05) ir 2015m. Kauno rajono (0,749, p<0,05), Kėdainių rajono (0,859, p<0,05). Taip pat statistiškai
reikšmingi rezultatai ir stipri koreliacija matoma tarp flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo abiejų
metų ţaliavų ekstraktuose. 2014m. Kauno rajono (0,93, p<0,05), Kėdainių rajono (0,731, p<0,05) bei
2015m. Kauno rajono (0,988, p<0,05) ir Kėdainių rajono (0,959, p<0,05). Nustatyta labai silpna
koreliacija tarp bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio augalinėse ţaliavose ir antichelatinio
aktyvumo duomenų.
Apibendrinus statistinius duomenis gautus iš Ononis arvensis L. ţaliavų ekstraktų, galima
daryti išvadą, kad fenolinių junginių (0,913, p<0,05) ir flavonoidų (0,988, p<0,05) kiekiai stipriai
koreliuoja su antioksidaciniu aktyvumu. Gauti rezultatai leidţia spręsti, kad ţaliavoje sukaupti didesni
kiekiai fenolinių junginių ir flavonoidų nulemia didėjantį antioksidacinį aktyvumą.
 36

7. REZULTATŲ APTARIMAS

7.1. Bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio aptarimas

Šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) augalinių ţaliavų veikimas nėra tiksliai ţinomas ir
nustatytas, tačiau manoma, kad jo diurezinį ir antiuţdegiminį poveikį nulemia bendras aktyviųjų
ingredientų kiekis, tai izoflavonoidai, flavonoidai ir fenolinės rūgštys. Šlaitinio dirvenio ţolėje
izoflavonoidų randama apie 2,54 %, flavonoidų apie 2,32% ir fenolinių rūgščių apie 2,41% [30].
Tyrimo metu buvo nustatomas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis atskirose
morfologinėse augalo dalyse (ţieduose, lapuose, ţolėje, stiebuose). Gauti rezultatai parodė, kad
augalinėje ţaliavoje procentinis fenolinių junginių kiekis 2014metais Kauno rajone buvo: ţieduose
2,17%, lapuose 1,86%, ţolėje 1,7%, stiebuose 1,17%, Kėdainių rajone 2014metais – ţieduose 1,96%,
lapuose 1,91%, ţolėje 1,44%, stiebuose 1,33%. 2015metų rezultatai parodė Kauno rajone ţieduose
2,14%, lapuose 2,28%, ţolėje 1,6%, stiebuose 1,25%, o Kėdainių rajone ţieduose 1,94%, lapuose
1,83%, ţolėje 1,02% ir stiebuose 0,54%. Flavonoidų kiekis augalinėje ţaliavoje taip pat tirtas atskirose
morfologinėse augalo dalyse. 2014metais Kauno rajone flavonoidų kiekis ţieduose siekė 3,42%,
lapuose 2,86%, ţolėje 1,44%, stiebuose 1,11%, Kėdainių rajone ţieduose 3,67%, lapuose 3,16%,
ţolėje 1,63%, stiebuose 1,19%. 2015metų Kauno rajono ţaliavose flavonoidų kiekis ţieduose siekė
7%, lapuose 2,5%, ţolėje 1,5%, stiebuose 1%, o Kėdainių rajone ţieduose 5,27%, lapuose 2,69%,
ţolėje 0,72% ir stiebuose 0,82%.
Pagal gautus tyrimų rezultatus vidutinis fenolinių junginių kiekis ţaliavose įvairuoja nuo 0,54
– 2,17% ir didţiausi kiekiai kaupiami ţieduose (2,17%) ir lapuose (1.91%), o maţiausi stiebuose.
Flavonoidų kiekis ţieduose ir lapuose yra ţenkliai didesnis, svyruoja nuo 2,86 – 3,67%, maţiausias
kiekis stiebuose. Lyginant gautus rezultatus su atliktais tyrimai matomas didesnis bendras fenolinių
junginių ir flavonoidų kiekis ţiedų ir lapų augalinėse ţaliavose.

7.2. Antioksidacinio ir chelatinio aktyvumo aptarimas

Atlikus DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodą buvo nustatytas

skirtingų morfologinių augalo dalių antioksidacinis aktyvumas. Gauti rezultatai parodė vidutiniškas
antioksidacines savybes, kurių rezultatai panašūs su rastais literatūroje [21]. Gauti 2014m. įvairavo
nuo 35,19 – 54,66% ir 2015m. nuo 20,68 – 89%. Stipriausiai antioksidacinis aktyvumas pasireiškė
 37

ţiedų ir lapų morfologinėse dalyse, tai 2014m. ţieduose – 49,62%, lapuose 43,35%, 2015m. ţieduose
89,00% ir lapuose 36,05%. Šie kiekiai parodo, kad O. arvensis augalinės ţaliavos gali būti potencialūs
antioksidantų šaltiniai.
Taip pat tirtas chelatinis Fe(II) jonų surišimas. Šis tyrimas taip pat parodo antioksidacinio
aktyvumo gebą surišti pereinamuosius metalus sudarant kompleksus. Tyrimo rezultatai parodė, kad
chelatinis aktyvumas įvairavo 2014m. nuo 34,17 – 47,52 % Kauno rajone, ir nuo 35,03 – 50,76 %
Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas neţymiai didesnis aktyvumas ţiedų (47,52 ± 2,37
% Kauno raj., 50,76 ± 0,81 % (Kėdainių raj.) ir lapų (41,86 ± 5,4 % Kauno raj., 47,82 ± 2,53 %
Kėdainių raj.) morfologinėse augalo dalyse. 2015m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 39,53 – 62,11 %
Kauno rajone, ir nuo 19,31 – 56,04 % Kėdainių rajone. Ţenkliai didesnis chelatinis aktyvumas
pastebėtas ţieduose (62,11 ± 2,12 % Kauno raj., 56,04 ± 4,12 % Kėdainių raj.) ir lapuose (48,06 ±
2,77 % Kauno raj., 42,04 ± 2,21 % Kėdainių raj.), o maţiausi kiekiai stiebuose. Chelatinis aktyvumas
parodo gebėjimą surišti pereinamuosius metalus, ši savybė apsaugo nuo DNR paţeidimų, oksidacinio
streso ir jo sukeliamų ligų [24].

7.3 Duomenų koreliacijos aptarimas

Vertinant duomenų tarpusavio ryšį pastebėta labai stipri koreliacija tarp fenolinių junginių
kiekio ir flavonoidų abiejų metų ţaliavų ekstraktuose. Tai 2014m. (0,99, p<0,05) ir 2015m. (0,856,
p<0,05). Lyginant fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą, stiprus ryšys abiejų metų
ţaliavų ekstraktuose 2014m. (0,913, p<0,05) ir 2015m. (0,859, p<0,05). Taip pat statistiškai reikšmingi
rezultatai ir stipri koreliacija matoma tarp flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo abiejų metų ţaliavų
ekstraktuose. 2014m. (0,93, p<0,05), bei 2015m. (0,988, p<0,05). Nustatytas labai silpnas ryšys tarp
bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio augalinėse ţaliavose ir antichelatinio aktyvumo
duomenų.

Apibendrinant gautus rezultatus, galima daryti prielaidą, kad 2014 -2015 metų tirtos augalinės
ţaliavos ţymiu biologiškai aktyvių medţiagų kiekiu nesiskyrė. Gauti reikšmingi fenolinių junginių
kiekiai bei stiprus antioksidacinis aktyvumas. Didţiausi kiekiai nustatyti ţiedų ir lapų augalinėse
ţaliavose, maţiausi – stiebuose.
 38

8. IŠVADOS

1. Didţiausias bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis stebimas ţiedų ekstraktuose,

maţiausias – stiebuose. Suminis fenolinių junginių kiekis šlaitinio dirvenio ţaliavose įvairavo 2014m.
11,73-21,66 mg/g, ir 2015m. 5,4-22,82mg/g. Flavonoidų kiekis įvairuoja 2014m. 11,4- 36,65 mg/g,
2015m. 8,2-70 mg/g.
2. Stipriausias antioksidacinis aktyvumas stebimas ţiedų ekstraktuose, maţiausias -
stiebuose. Nustačius antioksidacinį aktyvumą Ononis arvensis L. ţaliavų ekstraktuose rezultatai
įvairavo 2014m. 35,19 – 54,66 %, 2015m. 20,68 – 89.9%.
3. Stipriausias gebėjimas chelatuoti Fe(II) jonus nustatytas ţiedų ekstraktuose, silpniausias

- stiebuose. Gauti rezultatai šlaitinio dirvenio ţaliavose įvairavo 2014m. 34.14 – 50,76%, 2015m.

19,31 – 62,11 %.
4. Įvertinus rezultatus statistiškai, nustatyta stipri koreliacija tarp bendro fenolinių junginių
kiekio ir flavonoidų kiekio 2014m 0,99, p<0,05; 2015m. 0,86, p<0,05. Antioksidacinis aktyvumas
ekstraktuose tiesiogiai priklauso nuo fenolinių junginių kiekio 2014m. 0,91, p<0,05; 2015m. 0,86,
p<0,05 ir flavonoidų kiekio 2014m 0,93, p<0,05, 2015m (0,99, p<0,05).
 39

9. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Atlikus šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) augalinių ţaliavų tyrimus buvo nustatyta, kad
yra sukaupiamas ţenklus polifenolinių junginių kiekis. Dirvenio augaliniai ekstraktai pasiţymi
stipriomis antioksidacinėmis savybėmis. Pagal gautus rezultatus, galima teigti, kad šlaitinio dirvenio
ţiedus bei lapus būtų galima naudoti kaip vaistinę augalinę ţaliavą ekstraktų ar vaistaţolių arbatų
gamybai dėl reikšmingo fenolinių junginių, flavonoidų kiekio bei antioksidacinio aktyvumo.
Detaliau ištyrus šlaitinio dirvenio ţiedų bei lapų ţaliavas, jas būtų galima naudoti kaip
pagalbinę priemonę šlapimo takų sutrikimams, antioksidantus kosmetikos ar maisto pramonėje, taip
pat įtraukti į organizmą detoksikuojančių arbatų sudėtį.
 40

10. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Arlauskienė A., Šlepetys J., Šarūnaitė L., Inovatyvios pupinių augalų auginimo
technologijos praturtinančios pašarą vietiniais baltymais bei dirvoţemį biologiniu azotu. Lietuvos
agrarinių ir miškų mokslų centro filialas ţemdirbystės institutas, 2015
2. Aguiar J., Costa R., Rocha F., Estevinho B. N., Santos L., Design of microparticles
containing natural antioxidants: Preparation, characterization and controlled release studies, Power
technology 313, 2017, p. 287-292
3. Al-Qudaha M. A., Al-Ghoula A. M., Trawenhb I. N., Al-Jaberc H. I., Al Shbould T. M.,
Zargae M. H. A., Abu orabia A. T., Antioxidant Activity and Chemical Composition of Essential Oils
from Jordanian Ononis Natrix L. and Ononis Sicula Guss. Journal of Biologically Active Products
from Nature, 2014, Vol. 4, Issue 1, p. 52-61
4. Borbala B., Tunde D., Felinger A., Kaszas A., Marton K., Papp N., Varga E.,
Polyphenol Content of Ononis arvensis L. and Rhinanthus serotinus (Schönh. Ex Halácsy &
Heinr.Braun) Oborny Used in the Transylvanian Ethnomedicine. International Journal of
Pharmacognosy and Phytochemistry, 2015, Vol.30, Issue.1 p.1301-1307
5. Bravo H. R., Copaja S. V., Lamborot M., Phytotoxicity of Phenolic Acids From Cereals
[online]. Chile
6. Chen Z., Zhong C., Oxidative stress in Alzheimer’s disease. Neurosciense Bulletin
2014, Vol, 30, p. 271-281
7. D’Archivio M., Filesi C., Di Benedetto R., Gargiulo R., Giovannini C., Masella R.,
Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann Ist Super Sanita, 2007, Vol. 43, No. 4, p. 348 –
361
8. Dai J., Mumper R. J., Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and
Anticancer Properties. Molecules, 2010, No. 15, p. 7313-7351
9. EMEA. Assessment report on Ononis spinosa L., radix. Prieiga per internet:
http://www.ema.europa.eu
10. Gampe N., Darcsi A., Lohner S., Beni S., Kursinszki L. Characterization and
identification of isoflavonoid glycosides in the root of Spiny restharrow (Ononis spinosa L.) by HPLC-
QTOF-MS, HPLC–MS/MS and NMR. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2016, Vol.
23, p. 74–81
11. Ghribia L., Waffo-Téguob P., Cluzetb S., Marchalc A., Marquesb J., Mérillonb J. M.,
Janneta H. B., Isolation and structure elucidation of bioactive compounds from the roots of the
 41

Tunisian Ononis angustissima L. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2015, Vol. 25, Issue 18,
p. 3825-3830
12. Greenough M. A., Camakaris J., Bush A I., Metal dyshomeostasis and oxidative stress
in Alzheimer’s disease. Neurochemistry International, 2013, p. 540-555
13. Kar S. K., Choudhury I. An empirical review on oxidative stress markers and their
relevance in obsessive--compulsive disorder. International Journal of Nutrition, Pharmacology,
Neurological Diseases. 2016, Vol. 6, p. 139-145.
14. Kolesnikov M. P., Gins V. K., Phenolic Substances in Medicinal Plants, Biochemistry
and Microbiology, 2001, Vol 37, No. 4, p. 392-399
15. Kovalev V. N., Spiridonov V. N., Borisov M. I., Kovalev I. P., Gordienko V. G.,
Kolesnikov D. D., Phenolic compounds of Ononis arvensis the structure of onogenin. Chemistry of
Natural Compounds 1975.05, Vol. 11, Issue 3, p. 367-369
16. Kumar V, Lemos M, Sharma M, Shriram V. Antioxidant and DNA damage protecting
activities of Eulophia nuda Lindl. Free Radicals and Antioxidants 2013, Vol. 3, p. 55-60
17. Lichtenberg D., Pinchuk I. Oxidative stress, the term and the concept. Biochemical and
Biophysical Research Communications 2015; p. 441-444
18. Lobo V, Patil A, Phatak A, Chandra N. Free radicals, antioxidants and functional foods:
Impact on human health. Pharmacognosy Review. 2010; Vol 4, Issue 8, p. 118-27.
19. Lunte S. M., Structural classification of flavonoids in beverages by liquid
chromatography with ultraviolet-visible and electrochemical detection. Journal of Chromatography.
1987, No. 384, p. 371-382
20. Massini L., Rico D., Martin-Diana A. B., Barry-Ryan C., Apple peel plavonoids as
natural antioxidants for vegetable juice application, European Food Research and Technology 2016,
Vol. 242, p. 1459-1469
21. Mhamdi B., Abbassi F., Abdelly C., Chemical composition, antioxidant and
antimicrobial activities of the edible medicinal Ononis natrix growing wild in Tunisia. Journal Natural
Product Research, 2014, p. 1-4
22. Ononis arvensis [elektroninis išteklius] [ţiūrėta 2017 m. kovo 20 d.]. Prieiga per
internet:
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ononis_arvensis_%E2%80%94_Flora_Batava_%E2%80%9
4_Volume_v3.jpg
23. Papanastasis V. P., Yiakoulaki M. D., Decandai M., Dini-Papanastasi O., Integrating
woody species into livestock feeding in the Mediterranean areas of Europe. Animal Feed Science and
Technology, 2008, Vol. 140, p. 1-17
 42

24. Perron N. R., Brumaghim J. L., A Review of the Antioxidant Mechanisms of

Polyphenol Compounds Related to Iron Binding. Cell Biochem Biophys, 2009, p. 75-100
25. Pham-Huy L. A., He H., Pham-Huy C., Free Radicals, Antioxidants in Disease and
Health. International Journal of Biomedical Science, 2008, Vol. 14. No. 4, p. 89-96
26. Preiser J. C. Oxidative Stress. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 2012, Vol.
36, p. 147-154
27. Prochazkova D., Boušova I., Wilhelmova N., Antioxidant and prooxidant properties of
flavonoids. Fitoterapia, 2011, No. 82, p. 513-523
28. Rowan M. G., Dean P. D. G., Properties of squalene-2(3),22(23)-diepoxide-α-onocerin
cyclase from ononis spinosa root, Phytochemistry 1972, Vol. 11, Issue 11, p. 3263-3265
29. Süntara I., Baldemirb A., Coşkunb M., Keleşc H., Akkola E. K.. Wound healing
acceleration effect of endemic Ononis species growing in Turkey. Journal of Ethnopharmacology
2011, Vol. 135, Issue 1, p 63-70
30. Sampiev A. M., Davitavyan N. A. Assay of flavonoids, isoflavonoids, and
phenolcarboxylic acids in the field restharrow. Pharmaceutical Chemistry Journal, 2009, Vol. 43, No.
7, p. 25 – 31
31. Sayyah M., Khodaparast A., Yazdi A., Sardari S., Screening of the anticonvulsant
activity of some plants from Fabaceae family in experimental seizure models in mice. DARU, 2011,
Vol., No. 4, p. 301 – 305
32. Shu M. B. H., ONONIS Linnaeus, Sp. Pl. 2: 716. 1753. Flora of China 10; 547-548.
2010 http://flora.huh.harvard.edu/china/PDF/PDF10/Ononis.pdf (2016.01.18)
33. Shulz V., Hansel R., Blumenthal M., Tyler V. E.,Urinary Tract. Rational Phitotherapy,
2004, p. 291-316
34. Sichinava M.B., Mchelidze K. Z., Churadze M.V., Alaniia M.D., Aneli D.N., Chemical
composition and microstructural peculiarities of overground and underground vegetative organs of
field restharrow (Ononis arvensis L.). Georgian Med News, 2014.06, Vol. 231, p. 88-94
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25020180
35. Sosa V., Moline T., Somoza R., Paciucci R., Kondoh H., LLeonart M. E., Oxidative
stress and cancer: An overwie, Ageing Research Reviews, 2013, p. 376 – 390
36. Tumova L., Tuma J., Dolezal M., Pyrazinecarboxamides as Potential Elicitors of
Flavonolignan and Flavonoid Production in Silybum marianum and Ononis arvensis Cultures In Vitro,
Molecules, 2011, Vol. 16, p. 9142-9152
 43

37. Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M. T. D., Mazur M., Telser J., Free radicals
and antioxidants in normal physiological function ant human disease. The International Journal of
Biochemistry and Cell Biology, 2007, Vol. 39, p. 44 – 84
38. Yamamoto S., Shimizu S., Significance of TRP channels in oxidative stress. European
Journal of Pharmacology, 2016, p. 109-111
39. Yarnell E., Botanical medicines for the urinary tract. World Journal of Urology 2002,
Vol. 20, p. 285-293
40. Zhou H., Deng Z., Xia Y., Fu M., A new sampling method in particle filter based on
Pearson correlation coefficient. Neurocomputing, 2016, Vol. 216, p. 208-215