Priešišeminis Antocianinų Poveikis Žiurkės Širdies Mitochondrijoms

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS
BIOCHEMIJOS LABORATORIJA
Gintarė Rakauskaitė
PRIEŠIŠEMINIS ANTOCIANINŲ POVEIKIS ŽIURKĖS ŠIRDIES

MITOCHONDRIJOMS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Julius Liobikas
Konsultantai
Dr. Sonata Trumbeckaitė
Prof. dr. Vilmantė Borutaitė
Kaunas, 2012
2
TURINYS
SANTRAUKA................................................................................................................................................4
SUMMARY....................................................................................................................................................5
SANTRUMPOS .............................................................................................................................................6
ĮVADAS .........................................................................................................................................................7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...........................................................................................................8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ..................................................................................................................9
1.1. Antocianinai .........................................................................................................................................9
1.1.1. Struktūra, paplitimas .....................................................................................................................9
1.1.2. Antocianinų veikimas ir biologinės savybės ...............................................................................12
1.1.3. Antocianinų absorbcija ir metabolizmas .....................................................................................14
1.2. Mitochondrijų struktūra ir jų funkcijos ..............................................................................................16
1.3. Išemija ir jos įtaka mitochondrijų funkcijai ir struktūrai ...................................................................19
1.4 Apoptozė ir mitochondrijos ................................................................................................................21
2. METODIKA .............................................................................................................................................24
2.1. Eksperimentiniai gyvūnai ..................................................................................................................24
2.2. Reagentai............................................................................................................................................24
2.3. Mitochondrijų išskyrimas ..................................................................................................................24
2.4. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu ...............................................................24
2.5. Širdies perfuzija bei išemijos sukėlimas ............................................................................................25
2.6. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas ...............................................................................25
2.7. Citochromo c redukcijos nustatymas .................................................................................................26
2.8. Kaspazės 3 aktyvumo matavimas .....................................................................................................26

3
2.9. Mitochondrinio ir citozolinio citochromo c kiekio matavimas..........................................................26
2.10. Statistinė duomenų analizė ..............................................................................................................27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS .......................................................................................................27
3.1. Antocianinų poveikis mitochondrijų funkcijoms...............................................................................29
3.1.1. Antocianinų poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams........................................................29
3.1.2. Citochromo c efektas ...................................................................................................................30
3.2. Citochromo c redukcija antocianinais ................................................................................................32
3.2.1. Antocianinų efektas citochromo c redukcijos būsenai ................................................................32
3.3. Perfuzija ir išemija .............................................................................................................................34
3.3.1. Antocianinų poveikis išemijos sukeltiems širdies mitochondrijų pažeidimams po perfuzijos ...34
3.3.2. Citochromo c kiekio kitimas išeminėse mitochondrijose ...............................................................36
3.3.3. Kaspazės 3 aktyvumo kitimas citozolinėse frakcijose ................................................................37
4. IŠVADOS .................................................................................................................................................40
5. LITERATŪRA .........................................................................................................................................42
4
SANTRAUKA
G.Rakauskaitė. Magistro baigiamasis darbas - Priešišeminis antocianinų poveikis žiurkės širdies

mitochondrijoms/ Mokslinis vadovas dr. Julius Liobikas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,
Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas; Neuromokslų institutas. - Kaunas 2012.
Darbo tikslas yra ištirti antocianinų įtaką širdies ląstelių energijos apykaitai ir nustatyti šių
biologiškai aktyvių junginių galimo apsauginio poveikio ląstelėms mechanizmą. Darbo uždaviniai: ištirti
skirtingų antocianinų poveikį žiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms; nustatyti ir palyginti penkių
skirtingų antocianinų gebėjimą redukuoti egzogeninį citochromą c in vitro; nustatyti skirtingų antocianinų
priešišeminį poveikį ir jo apsauginį mechanizmą ląstelėse.
Tyrimo metodika: Eksperimentams atlikti buvo naudojama 2 - 4 mėnesių, suaugę Wistar žiurkių
patelės. Mitochondrijos buvo išskirtos diferencinio centrifugavimo metodu. Širdies perfuzija buvo
atliekama naudojant Langendorfo tipo širdies perfuzijos sistemą. Mitochondrijų kvėpavimo greitis
registruotas naudojant oksigrafinę sistemą Oxygraph-2k (Oroboros, Austrija). Citochromo c redukcija
buvo matuota spektrofotometriškai, naudojant Helios spektrofotometrą. Kaspazės 3 aktyvumas matuotas
fluorimetiškai, naudojant “Thermo Scientific platereader” fluorimetrą. Statistinė analizė atlikta naudojant
SigmaPlot 11.0.
Rezultatai: 20 µM Dp-3-G ir Cy-3-G patikimai padinina mitochondrijų kvėpavimo greitį
ketvirtoje metabolinėje būsenoje (esant 140µM atraktilozido ir pridėjus 32 µM egzogeninio citochromo c),
71% ir 30% atitinkamai. Delfinidino-3-O-gliukozidas (Dp-3-G) ir cianidino-3-O-gliukozidas (Cy-3-G)
sukelia stiprią citochromo c redukciją in vitro (78% ir 54% atitinkamai), kiti tirtieji – pelargonidino-3-O-
gliukozidas (Pg-3-G), malvinidino-3-O-gliukozidas (Mv-3-G), peonidino-3-O-gliukozidas (Pn-3-G) – turi
silpnesnį gebėjimą redukuoti citochromą c. Širdies perfuzija su 20 µM Cy-3-G apsaugojo nuo išemijos
sukeltos kaspazės 3 aktyvacijos, o Pg-3-G šio poveikio neturėjo.
Išvados: 20 µM Dp-3-G bei 20 µM ir 40 µM Cy-3-G ir Pg-3-G kocentracijų tirpalai neturėjo
poveikio mitochondrijų kvėpavimo greičiams antroje ir trečioje metabolinėse būsenose. 20 µM Dp-3-G ir
Cy-3-G 71% ir 30% atitinkamai stimuliuoja kvėpavimo greitį ketvirtoje metabolinėje būsenoje esant
egzogeniniam citochromui c. Dp-3-G ir Cy-3-G yra stiprūs citochromo c reduktoriai, sukeliantys greitą ir
tiesioginę redukciją - 78% ir 54% po 6 min inkubacijos, atitinkamai. Silpniausias redukcines savybes turi
Pg-3-G – po 6min inkubacijos redukavo 12%. 15 min širdies perfuzija 20 µM Cy-3-G apsaugojo nuo
išemijos sukeltos kaspazių aktyvacijos, sumažindama kaspazės 3 aktyvumą iki kontrolinio lygio.
5
SUMMARY
G.Rakauskaite. Master thesis – Anti-Ischaemic effect of anthocyanins on rat heart mitochondria/

Academic supervisor dr. Julius Liobikas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy,
Faculty of Pharmacy, Institute of Neurosciences. - Kaunas 2012.
The aim of the study is to investigate the influence of anthocyanins on the energy system of heart
cells and to determine the possible protective mechanism of action of these biologically active
compounds. The objectives of the study are: to investigate the direct effect of anthocyanins on
mitochondrial functions; to assess and compare the effect of different anthocyanins on the redox state of
extramitochondrial cytochrome c in vitro; to assess anti-ishaemic effect of different anthocyanins and its
protective mechanism in cells.
The methods of the study: All experiments were performed on hearts 2-4 months old female
Wistar rats. Mitochondrias were isolated by differential centrifugation method. The hearts were perfused
on a Langedorff perfusion system. Mitochondria respiration rate was measured using an Oxygraph-2k
(Oroboros, Austria). The cytochrome c reduction level was recorded spectrophotometerally, with a Helios
spectrophotometer. Measurement of caspase 3-like activity was recorded flourimetrically, with a
“Thermo Scientific platereader” fluorimeter. Statistical analysis was done by using Sigma Plot 11.0.
The Results of the study: Dp-3-G and Cy-3-G were able to reduce cytochrome c directly and
rapidly in vitro (78% and 54% respectively), whereas three other investigated anthocyanins –Pg-3-G, Mv-
3-G, Pn-3-G - had lower ability to reduce cytochrome c. In the presence of 140 µM atractilozide and 32
µM exogenous cytochrome c (4 metabolic state), Dp-3-G and Cy-3-G increased the mitochondrial
respiration rate (71% and 30% respectively), while Pg-3-G had no effect. Perfusion of hearts with 20 µM
Cy-3-G prevented from ischaemia-induced caspase 3-like activation, whereas Pg-3-G had no effect.
The Conclusions of the study: 20µM Dp-3-G, 20µM and 40µM Cy-3-G and Pg-3-G had neither
effect on routine mitochondrial respiration rate , nor phosphorilation rate, but it was determined that Dp-3-
G and Cy-3-G caused powerful respiration rate stimulation 71% and 30% respectively in the presence of
140 µM atractilozide and 32 µM exogenous cytochrome c (4 metabolic state). Dp-3-G and Cy-3-G were
potent cytochrome c reductants, which were able to cause rapid and direct reduction (78 % and 50 %
respectively) over 6 minutes. Other investigated anthocyanins (Pg-3-G, Pn-3-G, Mv-3-G) had less ability
to reduce exogenous cytochrome c in vitro. Cy-3-G was assessed to have suppressive effect on caspase 3-
like activation after 15 minutes perfusion of heart with 20 µM Cy-3-G.
6
SANTRUMPOS
ADP – adenozino 5’ - difosfatas

AMP – adenozino 5’ - monofosfatas
ATP – adenozino 5’ - trifosfatas
ATR – atraktilozidas
Cy – cianidinas
Cy-3-G – cianidino-3-O-gliukozidas
Cy-3-R – cianidino-3-O-rutinozidas
Cyt c – citochromas c
CP – kreatino fosfatas
DNR – deoksiribonukleininė rūgštis
Dp – delfinidinas
Dp-3-G – delfinidino-3-O-gliukozidas
Dp-3-R – delfinidino-3-O-rutinozidas
EGTA – etilenglikolio-bis-(β-amino-etileterio)-N,N,N’,N’- tetraacto rūgštis
FADH2 – flavino adenino dinukleotidas, redukuota forma
HEPES – 4-(2-hidroksietil)-1-piperazino etano sulfoninė rūgštis
Mv - malvinidinas
Mv-3-G – malvinidino-3-O-gliukozidas
NADH – nikotinamido adenino dinukleotidas, redukuota forma
NO – azoto monoksidas
Pg – pelargonidinas
Pg-3-G – pelargonidino-3-O-gliukozidas
Pn – peonidinas
Pn-3-G – peonidino-3-O-gliukozidas
Pt – petunidinas
ROS – reaktyvūs deguonies junginiai
TMPD – N, N, N’, N’ – tetrametilo-p-fenildiaminas
7
ĮVADAS
Širdies ir kraujagyslių ligos yra viena pagrindinių komplikacijų ir padidėjusio mirtingumo

priežasčių ekonomiškai išsivysčiose šalyse (Middleton et al., 2000; Mukamal et al., 2002 ), todėl yra labai
svarbu ieškoti vis naujų būdų šių ligų prevencijai arba simptomatikai palengvinti, norint padidinti
išgyvenamumą ir pagerinti žmonių gyvenimo kokybę. Esant tam tikroms širdies kraujagyslių ligoms, kaip
pavyzdžiui, hipertenzija, išemija ar aterosklerozė labai dažnai sutrinka ląstelių energijos apykaita, t.y šios
ligos dažnai susijusios su funkciniais ir struktūriniais mitochondrijų pakitimais, be to yra aktyvinami ir
ląsteliniai keliai, skatinantys ląstelių apoptozę arba kitaip vadinamą programuotą ląstelių mirtį, kuri yra
labai svarbi homeostazės užtikrinimui gyvuose organizmuose (Suto et al., 2005; Borutaite & Brown,
2007). Kai sutrinka apoptozės reguliacinis mechanizmas (pvz., išemijos metu) - ji yra arba labai stipriai
suaktyvinama, arba slopinama, tuomet sutrinka ir homeostazės palaikymas, kas dažniausiai sąlygoja
daugelio ligų (vėžio, Alzheimerio, Parkinsono, imuninių ligų ir kt.) pradžią arba spartesnį vystymąsi
(Meier, 2000; Zuzarte-luis, 2002). Todėl yra labai svarbu gerai ištirti mitochondrijų vaidmenį
fiziologinėse būsenose, suprasti išemijos sukeltos apoptozės mechanizmus, ypač jos reguliacijos būdus,
kad būtų galima atrasti naujų kelių, veikiančių programuotą ląstelių mirtį ir užtikrinančių jos kontrolę, o
taip pat ir išvengti įvairių patologinių sutrikimų.
Paskutiniais metais farmacijos pramonėje vis didesnis dėmesys yra kreipiamas į natūralius
preparatus, pagamintus iš vaistinės augalinės žaliavos bei į juose įeinančius biologiškai aktyvius junginius
ir jų veikimo mechanizmus. Pastebima, kad intensyvėjant farmacijos pramonei, didėja ir natūralių
augalinių preparatų suvartojimas. Lygiai taip pat ir maisto pramonėje, vis didėja susidomėjimas
ekologiškais, natūraliais maisto produktais. Domintis atliktomis epidemiologinėmis studijomis (Martin et
al., 2003; Estruch et al., 2006; de Lorgeril & Salen, 2007; Kuriyama, 2008), pastebėta, kad reguliarus
vaisių ir daržovių vartojimas reikšmingai sumažina širdies ir kraujagyslių ligų riziką, nes juose gausu
maistinių antioksidantų (Kris-Etherton et al., 2002). Vieni iš tokių antioksidantų yra antocianinai –
vandenyje gerai tirpūs augaliniai pigmentai, priskiriami flavonoidų klasei ir randami įvairiuose augaluose,
kuriems suteikia mėlyną, raudoną, violetinę ir purpurinę spalvas. Antocianinai pasižymi stipriomis
antioksidacinėmis savybėmis ir paskutiniais metais jų biologinis poveikis yra labai aktyviai tyrinėjamas.
Manoma, kad skirtingas antocianinų nei kitų flavonoidų veikimas priklauso nuo jų struktūroje
prisijungusių radikalų ir dėl teigiamo molekulės krūvio. Ir nors jau daug tyrimų yra atlikta tyrinėjant šių
biologiškai aktyvių junginių biologinio veikimo ypatumus, vis dar nėra pakankamai duomenų apie
8
antocianinų poveikį mitochondrijų funkcijoms, o ypač apie jų galimą vaidmenį apoptozės reguliavime ir
apsauginiame širdies mechanizme. Remiantis, ankstesniais Neuromokslų institute atliktais tyrimais
(Liobikas et al., 2009), buvo pastebėta, kad antocianinai turi stiprų stimuliacinį efektą mitochondrijų
kvėpavimo greičiui ketvirtoje metabolinėje būsenoje (esant atraktilozido ir pridėjus egzogeninio
citochromo c), todėl buvo susidomėta šių pigmentų poveikiu citochromui c. Citochromas c yra nedidelis
baltymas, silpna elektrostatine jungtimi susirišęs su mitochondrijų kvėpavimo grandine, dalyvaujantis
elektronų pernešime tarp citochromo c reduktazės ir citochromo c oksidazės, o taip pat ir specifinis
apoptozės aktyvatorius (Garrido et al., 2006; Ow et al., 2008). Iš pradžių buvo manoma, kad šis
mitochondrijų kvėpavimo greičio stimuliavimas antocianinais gali būti susijęs su išorinės mitochondrijų
membranos pažeidimu (Liobikas et al., 2009), tačiau vėliau buvo iškelta prielaida, kad tai susiję su
antocianinų gebėjimu redukuoti citochromą c (Skemiene et al., 2010 a, b). Taigi, buvo nuspręsta ištirti
skirtingų antocianinų standartų citochromą c redukuojančius efektus, o tuo pačiu išsiaiškinti, ar
citochromo c redokso būsenos pakeitimas gali apsaugoti ląsteles nuo išeminių pažeidimų bei apoptozės
kaskados aktyvacijos.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Šio darbo tikslas yra ištirti antocianinų įtaką širdies ląstelių energijos apykaitai ir nustatyti šių
biologiškai aktyvių junginių galimo apsauginio poveikio ląstelėms mechanizmą.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti skirtingų antocianinų poveikį žiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms;
2. Nustatyti ir palyginti penkių skirtingų antocianinų gebėjimą redukuoti egzogeninį citochromą c in
vitro;
3. Nustatyti skirtingų antocianinų priešišeminį poveikį ir jo apsauginį mechanizmą ląstelėse.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Antocianinai
1.1.1. Struktūra, paplitimas
Antocianinai – tai augalų pigmentai, priskiriami plačiai paplitusiai fenolinių junginių klasei –
flavonoidams (Gould, 2002; Kong et al., 2003; Hou et al., 2003). Jie randami įvairiose uogose, daržovėse
ir vaisiuose, kuriems suteikia raudoną, violetinę ar mėlyną spalvą (Kong et al., 2003; Fleschuhut et al.,
2006). Žodis antocianinas yra kilęs iš graikų kalbos žodžių anthos (gėlė) ir kyanos (mėlyna), kurie buvo
naudojami apibūdinti mėlynus pigmentus, randamus rugiagėlėje. Susidomėjimas antocianinais per
paskutinius kelerius metus ypatingai išaugo, nes manoma, kad jie pasižymi stipriomis antioksidacinėmis
savybėmis ir yra svarbūs gydant oksidacinio streso sukeltas ligas, pvz., vainikinių širdies kraujagyslių,
Parkinsono ligas, uždegiminius procesus, vėžį (Kong et al., 2003; Zafra-stone et al., 2007). Ir nors įvairūs
antocianinų biologinio poveikio tyrimai atliekami jau seniai, tačiau dar nėra užtektinai tikslių duomenų
apie šių pigmentų tiesioginį poveikį mitochondrijų funkcijoms.
Cheminė struktūra. Antocianinai susideda iš aglikono (antocianidino) ir angliavandenių
molekulių, kurios gali būti prisijungusios acilo grupių (Andersen & Jordheim, 2006). Antocianinai, kaip
cheminiai junginiai, yra 2 - fenilbenzopirilio (flavilio) druskų darinių glikozidai. Jie vieni nuo kitų skiriasi
hidroksi- ir/arba metoksi- grupių, taip pat ir angliavandenių molekulių skaičiumi, prisijungimo būdu bei
padėtimi (Bloor & Abrahams, 2002; Kong et al., 2003; Fleschuhut et al., 2006). Antocianinų, kaip ir kitų
flavonoidų grupių, pagrindą sudaro C6-C3-C6 struktūra, susidedanti iš dviejų aromatinių benzeno žiedų
(A ir B), sujungtų trijų anglies atomų grandine, kuri, besijungdama su hidroksilo grupe, suformuoja
heterociklinį (C) žiedą (1 pav.) (Jeremy Spencer, 2009; van Beek & Montoro, 2009). Pagrindinė
antocianinų struktūros ypatybė yra laisvas deguonies atomo valentingumas (C) žiede. Dėl teigiamo
molekulės krūvio, antocianinai rūgščiame tirpale veikia kaip katijonai ir sudaro druskas reaguodami su
rūgštimis. Antocianinai yra gerai tirpūs vandenyje ir kuo daugiau angliavandenių molekulių prisijungusių
prie jų aglikono, tuo jie labiau poliški. Šiuo metu yra žinoma daugiau nei 600 skirtingų antocianinų, tačiau
90% iš antocianinų sutinkamų gamtoje yra šešių pagrindinių antocianidinų (aglikonų) – pelargonidino
(Pg), peonidino (Pn), cianidino (Cy), malvinidino (Mv), petunidino (Pt) ir delfinidino (Dp) – dariniai (1
pav.) (Kong et al., 2003; Fleschuhut et al., 2006; Prior & Wu, 2006). Visi šie šeši antocianidinai skiriasi
10
tik B žiedo 3’ ir 5’ padėtyse esančiomis hidroksilo ir metilo grupėmis, todėl manoma, kad būtent šie
radikalai lemia antocianinų biologinio poveikio skirtumus, o ypač jų oksidacines-redukcines savybes.
Antocianidinas R1 R2
Pelargonidinas (Pg) H H
Cianidinas (Cy) OH H
Delfinidinas (Dp) OH OH
7
Peonidinas (Pn) OCH3 H
3 Petunidinas (Pt) OCH3 OH
5
Malvidinas (Mv) OCH3 OCH3
1. pav. Pagrindinė cheminė antocianidinų struktūra

Angliavandenių molekulės antocianinų struktūroje dažniausiai yra (C) žiedo 3 - padėtyje arba (A)
žiedo 5 ir 7 – padėtyse. Angliavandenių molekulės prie antocianidinų dažniausiai jungiasi per O-
glikozidines jungtis (Williams & Grayer, 2004; Bjoroy et al., 2007). Gliukozė (dažniausiai sutinkamas
monosacharidas, ~90%), galaktozė, arabinozė, ramnozė ir ksilozė yra pagrindinės angliavandenių
molekulės (2 pav.), kurios prisijungusia prie antocianidinų ir sudaro mono-, di- arba tri- sacharidų formas.
Labiausiai paplitę yra antocianidinų 3–O-glikozidai, kurie sutinkami gamtoje apie du kartus dažniau nei 3,
5–O-diglikozidai (Andersen & Jordheim, 2006; Prior & Wu, 2006). Daugiau nei 65% antocianinų savo
stuktūroje turi ir riebalų rūgščių liekanų. Angliavandenių molekulės gali būti prisijungusios alifatines
ir/arba aromatines riebalų rūgščių grupes, pvz., malato, oksalo, acetato, sukcinato, galo, hidroksibenzoine
ar kitas rūgštis.
β – D – gliukopiranozė β – D – galaktopiranozė – L – ramnopiranozė
β – D – ksilopiranozė – L – arabinopiranozė
2 pav. Pagrindinės angliavandenių molekulės randamos antocianinų struktūrose

11
Paplitimas. Kalbant apie žmogaus mitybą, antocianinai yra randami raudonajame vyne, tam
tikrose javų rūšyse, lapinėse ir šakninėse daržovėse (baklažanuose, kopūstuose, pupelėse, svogūnuose,
ridikėliuose), bet daugiausia jų gausu vaisiuose, ypač uogose (mėlynėse, spanguolėse, serbentuose,
avietėse, šeivamedžio uogose ir t.t.). Vakarų šalyse ypač paplitę įvairių uogų produktai, kaip uogienės,
sultys, koncentratai, vynai ir netgi maistiniai dažai, kuriuose taip pat yra randami nemaži antocianinų
kiekiai. Dažniausiai maiste aptinkamas antocianinas yra cianidinas (Manach et al., 2004). Antocianinų
kiekis maisto produktuose (vaisiuose, uogose ir t.t.) yra paprastai proporcingas jų spalvos intensyvumui,
pvz., jų būna iki 2 - 4 g/kg sunokusiose šviežiai nuskintose juodųjų serbentų ir mėlynių uogose. Vaisiams,
uogoms nokstant antocianinų kiekis padidėja. Raudonasis vynas turi 200 - 350 mg antocianinų/L ir vynui
senstant antocianinai transformuojasi į įvairias sudėtingas kompleksines struktūras (Clifford & Brown,
2006; Chun et al. 2007; Heinonen 2007; Zamora-Ros et al., 2010).
Vienas iš daugybės augalų, turtingų antocianinų ir auginamas Lietuvoje yra juodasis serbentas
(Ribes nigrum L., Grossulariaceae). Jo vaisiai kaupia labai didelius kiekius šių veikliųjų medžiagų, t.y.
apie 250 mg/100 g šviežio vaisiaus (Slimestad et al., 2002). Beje, antocianinų kiekis, pasiskirstymas ir
įvairovė labai priklauso nuo augalo, kuris juos kaupia, rūšies, augimo sąlygų, uogų sunokimo laipsnio,
apdirbimo ir kitų savybių. Kaip pavyzdys, pateikiamas antocianinų kiekis 2007 metais surinktų juodojo
serbento veislės „Ben Lomond“ sunokusių (techninės brandos) uogų ekstrakte (3 pav).
3pav. Antocianinų kiekis (%) juodojo serbento veislės „Ben Lomond“ sunokusių uogų ekstrakte
(Liobikas et al., 2009)
Nustatyta, kad, nepriklausomai nuo juodojo serbento uogų sunokimo laipsnio, jų uogų
ekstraktuose vyrauja keturi pagrindiniai antocianinai: Cy-3-R, Dp-3-R, Dp-3-G ir Cy-3-G. Taip pat yra
aptinkami nedideli kiekiai Mv-3-G, Pn-3-G ir Pel-3-G (Liobikas et al., 2009). Tiriant juodojo serbento
12
ekstraktų kiekybinę sudėtį buvo susidomėta ir jų biologiniu poveikiu, nes jie, veikdami kaip antioksidantai
galėtų būti pritaikomi gydant įvairias oksidacinio streso sukeltas ligas. Buvo nustatyti juodojo serbento
uogų ekstraktų poveikiai žiurkės širdies (Liobikas et al., 2009; Skemiene et al., 2010 a, b), kepenų
mitochondrijų funkcijoms (Rakauskaitė ir Liobikas, 2011), tačiau kiekybiniai antocianinų sudėties
skirtumai ir esamos priemaišos serbentų uogų ekstraktuose, matyt, sąlygojo nevienodą poveikį
mitochondrijų funkcijoms in vitro. Tolimesniems tyrimams atlikti buvo nuspręsta pasirinkti antocianinų
standartus, taip siekiant gauti tikslesnius rezultatus ir išsiaiškinti šių medžiagų tiesioginį poveikį,
išvengiant šalutinių medžiagų efektų.
1.1.2. Antocianinų veikimas ir biologinės savybės
Paskutiniu metu iššaugo susidomėjimais antocianinais, nes jie turi potencialių farmokologinių ir
biologinių savybių, dėl to gali būti naudojami terapiniams tikslams. Pavyzdžiui, buvo įrodyta, kad
antocianinų ekstraktai, išskirti iš paprastosios mėlynės efektyviau sumažina kapiliarų pralaidumą ir
trapumą nei rutinas bei turi stipresnį priešuždegiminį ir priešedeminį poveikį (Kong et al., 2003).
Antocianinai taip pat pasižymi stipriu imunomoduliaciniu, antimikrobiniu veikimu (Puupponen-Pimia et
al., 2001). Yra manoma, kad labiausiai antocianinų svarba žmogaus sveikatai susijusi su jų oksidacinėmis-
redukcinėmis savybėmis arba, kitaip tariant, antioksidaciniu veikimu: jie suriša laisvuosius radikalus,
lipoproteinų oksidacijos produktus, veikia kaip uždegimą slopinanti priemonė, saugo nuo navikų
susidarymo, stabdo lipidų ir baltymų oksidaciją organizme ir maisto produktuose (Gould, 2004; Glinska et
al., 2007; Posmyk & Janas, 2008). Vis daugiau ir daugiau publikacijų skelbia, kad vartojant antocianinų
turtingus produktus galima sumažinti širdies ir kraujagyslių ligų riziką (Zern et al., 2005; Falchi et al.,
2006; Lazze et al., 2006; Akhlaghi and Bandy, 2009; de Pascual-Teresa et al., 2010). Paremiant šį teiginį,
Suomijoje buvo vykdytas projektas, kurio metu žmonėms buvo skiriama kasdieninė maisto dieta su
padidintu uogų kiekiu ir tai sumažino sergamumą širdies ir kraujagyslių ligomis bei insultų tikimybę apie
60% ir privertė kitas Vakarų Europos šalis pradėti rimčiau domėtis uogose esančiomis naudingomis
medžiagomis (Jordheim et al., 2007). Lyginti antocianinų turtingų braškių, raudonųjų slyvų, vyšnių,
aviečių ekstraktų ir Cy-3-G standarto antioksidaciniai poveikiai su Vitaminu C, geležimi, -tokoferoliu.
(Proteggente et al., 2002). Buvo pateikti duomenys, kad antocianinai turi daug stipresnį reaktyvių
deguonies junginių (ROS) surišimo laipsnį nei kiti tirtieji junginiai. Taip pat antocianinai geriau apsaugo
13
nuo lipidų peroksidacijos bei yra stipresni redukuojantys veiksniai nei geležis, padedantys išvengti ir
metalų jonų oksidacijos, pvz., Cu2+ (Proteggente et al., 2002; Wang H et al., 1999). Manoma, kad vienas iš
antocianinų, kaip ir kitų flavonoidų, anktioksidacinių mechanizmų yra tiesioginis laisvųjų radikalų
surišimas, atiduodant laisvos hidroksilo grupės vandenilio atomą. Antocianinų aglikonai, turintys savo
struktūros žieduose daugiau –OH grupių (pvz., delfinidinas, cianidinas) turi didesnį giminingumą
laisviesiems radikalams bei yra aktyvesni radikalų surišėjai nei tie, kurie turi metilintas –OH grupes (Silva
et al., 2002; Dorta et al., 2008).
Antocianinai pasižymi ir priešvėžiniu veikimu, kuris buvo įrodytas, kai žmogaus gaubtinės
žarnos ir skrandžio vėžio ląstelės buvo paveiktos antocianinų frakcijomis ir ląstelių augimas buvo
nuslopintas daug reikšmingiau nei veikiant kitų flavonoidų frakcijomis (pvz., kvercetino, rutino) (Kamei
et at., 1995). Literatūroje yra keletas darbų, kuriuose aprašomas antocianinų aglikonų poveikis žmogaus
vėžinių ląstelių mitochondrijoms ir pateikiami duomenys, jog Dp sukelia hepatomos HepG2, gimdos
karcinomos HeLa S3 bei gaubtinės žarnos adenokarcinomos CaCo-2 ląstelių apoptozę (Lazze et al., 2004;
Yeh & Yen, 2005). Kitu tyrimu buvo įrodytas efektyvus saldžiosios bulvės antocianinų priešmutageninis
poveikis (Yosihimoto et al., 1999). Taip pat antocianinai apsaugo nuo ūminio pankreatito, nes sumažina
kasos padidėjimą, lipidų peroksidaciją, slopina adenozino deaminazės aktyvumą (Jankowski et al., 2000).
Tikrosios kinrožės antocianinai buvo tirti in vivo ir nustatyta, kad duodant juos žiurkėms prieš vieną tetra-
butilo hidroperoksidazės gydymo dozę, yra žymiai sumažinamas kepenų fermentų žymenų (alanino ir
aspartato aminotransferazių) lygis serume ir oksidacinė kepenų žala (Wang et al., 2000). Atlikus
histopatologinę žiurkės kepenų analizę paaiškėjo, kad kinrožės pigmentai sumažino tetra-butilo
hidroperoksidazės sukeltus kepenų pažeidimus, įskaitant uždegimą, leukocitų inflirtaciją ir nekrozę (Wang
et al., 2000). Antocianinai turi ir priešdiabetinį poveikį, kaip pvz., skiriant šilkmedžio lapų ekstrakto
dietą, ji apsaugojo nuo streptozotocino sukelto diabeto žiurkėse (Andallu et al., 2003; Heo et al., 2007).
Be to, antocianinų turtingi vaisiai pasirodė esantys efektyvūs atminties gerinimo procese, tai tiriant
eksperimentiniuose gyvūnėliuose (Andres - Lacueva et al., 2005). Šilkmedžio lapų ekstraktai apsaugo ir
nuo amiloido fibrilių formavimosi bei turi neuroprotekcinį veikimą, todėl manoma, kad gali būti
panaudojami Alzheimerio ligos prevencijai (Niidome et al., 2007; Shih et al., 2009).
Šiame darbe pagrindinis dėmesys yra skiriamas antocianinų poveikiui širdžiai. Epidemiologinėse
studijose įrodyta, kad raudonojo vyno vartojimas yra naudingas apsaugai nuo širdies ir kraujagyslių ligų,
šis efektas įgavo terminą „Prancūziškas parodoksas“ (Belleville, 2002). Manoma, kad pagrindinė
apsauginio poveikio priežastis yra polifenoliniai junginiai, įskaitant ir antocianinus, kurių yra gausu
14
raudonajame vyne, ir kurie pasižymi stipriu antioksidaciniu veikimu (Belleville, 2002; Sun et al., 2002).
Nustatyta, kad polifenoliniai junginiai tiesiogiai suriša laisvuosius radikalus ir sumažina mažo tankio
lipoproteinių kiekį plazmoje, o tai yra svarbu širdies ir kraujagyslių ligų patogenezėje. Kitose
epidemiologinėse studijose teigiama (Kuriyama, 2008; Hsieh et al., 2009), kad žaliosios arbatos
vartojimas yra taip pat susijęs su sumažėjusia mirčių nuo širdies ir kraujagyslių ligų rizika. Atliktos
eksperimentinės studijos įrodė, kad žaliojoje arbatoje esantys polifenoliniai junginiai turi kardioprotekcinį
veikimą, nes pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, taip pat padidina vazodiliatatoriaus NO
produkciją ir turi teigiamą inotropinį veikimą, kuris pasiekiamas per Na+/H+ ir Na+/Ca2+ nešiklių
aktyvaciją (Hsieh et al.,2009; Lorenz et al., 2008). In vivo tyrimuose, kuriuose dalyvavo pre- ir
pomenopauzinio laikotarpio moterys buvo įrodyta, kad vynuogėse esantys polifenoliniai junginiai turi
kardioprotekcinį poveikį, nes efektyviai sumažina lipidų kiekį plazmoje ir oksidacinį stresą (Zern et al.,
2005). Viename tyrime įrodyta, kad ilgalaikė antocianinų dieta žiurkėms sąlygojo mažesnį miokardo
jautrumą išemijai-reperfuzijai tiek in-vivo, tiek ex-vivo bandymuose. Yra manoma, kad šis apsauginis
mechanizmas susijęs su širdies endogeninių antioksidantų moduliacija (Berthonneche et al., 2007;
Toufektsian et al., 2008). Polifenolinių junginių teigiamas terapinis efektas gydant širdies ir kraujagyslių
ligas yra siejamas ne tik tai su jų oksidacinėmis-redukcinėmis savybėmis, bet ir su gebėjimu mažinti
trombocitų hiper-reaktyvumą bei jų agregaciją, arterijų pažaidą, uždegimo mediatorių ir mažo tankio
lipoproteinų gamybą, taip pat su gebėjimu padidinti kraujagysles plečiančių faktorių gamybą ir taip
sumažinti sistolinį kraujo spaudimą (de Pascual-Teresa et al., 2000; Urpi-Sarda et al., 2009).
1.1.3. Antocianinų absorbcija ir metabolizmas
Pastaruoju metu vis daugiau ir daugiau straipsnių yra publikuojama apie antocianinų
metabolizmą ir absorbciją organizme, tačiau šie keliai vis dar išlieka pakankamai painūs. Vis dėl to, norint
suprasti antocianinų biologines savybes ir jų vaidmenį ligų gydyme ar prevencijoje, pirmiausia reikia
išsiaiškinti jų pasiskirtymo organizme kelius. Daugelis tyrimų, kuriuose minima antocianinų absorbcija ir
metabolizmas žmogaus ir eksperimentinių gyvūnėlių organizmuose, buvo atlikti naudojant vaisių
ekstraktus, kaip antocianinų šaltinį.
Pradžioje buvo manoma, kad tik antocianinų aglikonai yra absorbuojami plonojo žarnyno ląstelių
ir taip patenka į kraujo plazmą, tačiau keletas studijų pateikė duomenis apie antocianinų ir antocianidinų
buvimą žmogaus ir žiurkės plazmoje po suvartojimo per os, todėl buvo susidomėta ir kitais galimais jų
15
absorbcijos mechanizmais (Tsuda et al., 1999; Cao et al., 2001; Galvano et al., 2003). Matuojant
antocianinų koncentracijos lygį žiurkės kraujo plazmoje, po to, kai žiurkėms buvo sugirdyta vaivoro uogų
ekstrakto per os, nustatyta, kad Cy glikozidai patenka į kraujo plazmą iš virškinamojo trakto visai
nepakitę (Talavera et al., 2004, 2006). Antocianinų absorbcija įvyksta labai greitai po jų suvartojimo. Jų
biopraeinamumas tirtas keliose skirtingose eksperimentinių gyvūnėlių ir žmonių farmokokinetinėse
studijose, parodant, kad antocianinų maksimali koncentracija kraujo plazmoje yra pasiekiama po 15 – 60
min nuo jų suvartojimo. Tačiau, kada antocianinai yra vartojami su kitais maisto produktais, ypač su
produktais, turinčiais daug riebalų, kurie stabdo skrandžio išsituštinimą, antocianinų pikas gali būti
pasiekiamas ir po 4 - 6 valandų (Mazza et al., 2002; Norton et al., 2005; Mullen et al., 2008; Kalea et al.,
2009). Manoma, kad greita jų absorbcija gali priklausyti nuo specifinių fermentų, tokių kaip
bilitranslokazė. O taip pat absorbcija priklauso ir nuo maisto terpės (Passamonti et al., 2003). Lyginant
antocianinus su kitais flavonoidais, jų absorbcijos ir ekskrecijos į šlapimą proporcijas, pastebima, kad
antocianinų procentas šlapime yra labai mažas, apie <0,1% nuo suvartotos dozės. Maksimali antocianinų
plazmos koncentracija žmogaus organizme svyruoja nuo 1 iki 100 nmol/l suvartojus 0,7-10,9 mg/kg dozės
(Prior RL., 2003; Kurilich et al., 2005). Jų pasišalinimas iš kraujo plazmos yra taip pat labai greitas ir jau
po 4 – 6 h plazmoje nerandama antocianinų arba jų kiekiai labai minimalūs (Cao et al., 2001). Tyrimuose,
kuriuose naudoti antocianinų standartai, buvo palygintos antocianinų absorbcijos savybės ir nustatyta, kad
greičiausiai absorbuojamas buvo Dp, o toliau sekė: Cy > Pt = Pn > Mv. Tai įrodo, kad antocianinų
absorbcija ir metabolizmas skiriasi priklausomai nuo B žiedo struktūros, t.y. prie B žiedo prisijungusių
radikalų (Ichiyanagi et al., 2006).
Manoma, kad yra keli pagrindiniai antocianinų absorbcijos mechanizmai. Visų pirma, jie gali
būti absorbuojami plonajame žarnyne kaip glikozidai aktyviosios pernašos būdu, dalyvaujant nuo natrio
jonų priklausomam gliukozės nešikliui, bet absorbciją šiuo būdu lemia cheminė struktūra (prie B žiedo
prisijungusių hidroksilo ir metilo grupių skaičius bei prie aglikono prisijungusių angliavandenių molekulių
rūšis bei skaičius). Kadangi kraujyje aptinkama nemaži kiekiai nepakitusių antocianinų glikozidų,
manoma, kad jie į plazmą patenka ir organinių anijonų nešiklio – bilitranslokazės pagalba (Passamonti et
al., 2003). Antocianinai yra stabilūs rūgščioje skrandžio aplinkoje, o tai paaiškina jų tiesioginę absorbciją
per skrandžio gleivinę į kraują ir greitą, bet trumpalaikį jų koncentracijos padidėjimą serume. Ilgai buvo
manoma, kad tiktai antocianidinai gali būti absorbuojami žarnų ląstelėse (nes jie sugeba pereiti per žarnų
sienelę) ir taip patenka į kraujotaką, kur nėra aptinkama jų cukrinės dalies. Anksčiau nebuvo žinoma jokių
fermentų, kurie galėtų specifiškai hidrolizuoti glikozidines jungtis, todėl buvo manoma, kad antocianinai
16
yra prastai absorbuojami. Ši nuomonė pakito, kai daugelio tyrimų rezultatai įrodė, jog glikozidiniai
flavonoidai, ypatingai Cy-3-G ir kiti cianidino glikozidai, buvo absorbuoti in vivo (Passamonti et al.,
2002; Ichiyanagi et al., 2006). Todėl dar vienas iš galimų mechanizmų yra pasyvus aglikonų perėjimas per
membranas žarnyne, po cukrinės dalies atskilimo. Nepakitę antocianinai yra per daug hidrofiliški
absorbcijai per plonajį žarnyną (Holman, 2004), todėl jie yra hidrolizuojami fermentų (pvz., laktazės
floridzino hidrolazės, LPH) arba žarnyno mikrofloros prieš absorbciją (Wu et al., 2002; Passamonti et al.,
2002). Dviejuose tyrimuose, atliktuose su žiurkėmis, taip pat pateikta, kad Cy-3-G yra dalinai
hidrolizuojamas (hidrolizės reakcijoje dalyvaujant žarnyno bakterijų β-glikozidazei) plonajame žarnyne ir
tai galėtų paaiškinti, kodėl dalis aglikonų yra randama ir tuščiojoje žarnoje (Tsuda et al., 1999).
Tiriant antocianinų pasiskirstymą po jų suvartojimo praėjus 4 h jie aptinkami dvylikapirštėje,
klubinėje, gaubtinėje ir aklojoje žarnose (Wu et al., 2006). O įvedus juos per skrandį jau per kelias
minutes vynuogių antocianinai pasiekia smegenis (Passamonti et al., 2005). Randami gliukuronil-, metil-,
ir sulfokonjungatai kepenyse, inkstuose, žarnyne yra siejami su antocianinų metabolizmu (Tsuda et al.,
1999; He et al., 2006). Žarnyno mikroflora metabolizuoja antocianinus į fenolines rūgštis ir aldehidus
(Forester & Waterhouse, 2010). Manoma, kad antocianinai, kurie nebuvo absorbuoti, gali būti skaidomi
gaubtinėje žarnoje. O absorbuoti antocianinai su tulžimi taip pat gali būti išskiriami į gaubtinę žarną, kur
jie metabolizuojami žarnyno mikrofloros iki fenolinių junginių, hidrolizės ir demetilinimo reakcijų
pagalba. Pagrindiniai antocianinų metabolitai randami šlapime yra gliukuronil- ir metil- konjungatai bei
antocianidinai (aglikonai). Sulfokonjungatų randami labai maži kiekiai. Teigiama, kad kepenys yra
pagrindinis organas, kur vyksta gliukuronizacija ir metilinimas. Metilintos antocianinų formos
didžiausiomis koncentracijomis yra aptinkamos kepenyse. Vėliau metilinti antocianinai gali būti
sekretuojami į tulžį, nes kraujo plazmoje randama labai maži jų kiekiai. Inkstuose irgi aptinkami metil- ir
glukuronil- kojungatai, todėl manoma, kad konjungacija yra vienas pagrindinių antocianinų metabolizmo
kelių (Wu et al., 2002).
1.2. Mitochondrijų struktūra ir jų funkcijos
Mitochondrijos yra ląstelės organelės, kurios turi savo DNR ir yra atskirtos nuo citozolio
dviguba membrana (Chen & Butow, 2005). Mitochondrijų kiekis įvairiose ląstelėse skiriasi, kaip ir jų
išvaizda, išsidėstymas bei pasiskirstymas. Buvo nustatyta, kad mitochondrijų daugiausia yra tose audinių
ląstelėse, kur intensyviausiai vyksta fiziologiniai ir biocheminiai procesai. Pavyzdžiui, širdies raumens
17
ląstelėse, kur vyksta intensyvus nepertraukiamas mechaninis darbas, mitochondrijos sudaro 30-38% viso
miocito tūrio (Moncada, 2010). Širdies raumens mitochondrijos skiriasi nuo kitų organų mitochondrijų,
nes turi labai didelį vidinės membranos paviršių. Tai susiję su dideliu šių organelių aktyvumu aprūpinant
širdies raumenį dideliu energijos kiekiu, kuris būtinas jo susitraukimui atlikti.
Išorinė mitochondrijų membrana yra pralaidi tik mažoms, neigiamai įkrautoms molekulėms,
kaip nukleotidams ir fosforilintiems junginiams, nes membranos sudėtyje, be lipidų yra ir baltymo porino,
kuris suformuoja kanalus. Vidinė mitchondrijų membrana yra nelaidi jonams, kaip H+, OH-, K+ ir kitiems
hidrofiliniams metabolitams, tačiau joje yra išsidėščiusios specifinės nešiklių sistemos, pvz., adenino
nukleotidų nešiklis, kurios dalyvauja pernešant įvairius junginius į mitochondriją (Chan, 2006; McBride et
al., 2006). Mitochondrijų užpildas yra vadinimas matriksu, kuriame yra riebalų rūgščių oksidacijos
fermentai, Krebso ciklo fermentai, piruvato dehidrogenazė ir kitos svarbios sistemos.
4 pav. Mitochondrijos pagrindinė struktūra. Mitochondrija turi dvi membranas – išorinę ir vidinę
(vidinės membranos paviršius labai didelis ir ji sudaro vadonamąsias kristas (užlinkimus)), tarp
membranų yra tarpmembraninė erdvė, o vidinis mitochondrijos užpildas vadinamas matriksu.
Labiausiai mitochondrijos yra žinomos dėl pagrindinės funkcijos žinduolių ląstelėse - ATP
(energijos) sintezės, kuri vyksta oksidacinio fosforilinimo metu. Oksidacinis fosforilinimas – tai eilė
cheminių reakcijų, kurių metu vyksta įvairių substratų oksidacija ir atsipalaiduoja energija, kuri
transformuojama į ATP. Vidinėje mitochondrijų membranoje be nešiklių yra išsidėščiusi ir mitochondrijų
kvėpavimo grandinė, kurią sudaro keturi kompleksai (I – NADH dehidrogenazė, II - sukcinato
dehidrogenazė, III - kofermento Q-citochormo c oksireduktazė, IV - citochromo c oksidazė) ir ATP
sintazė, kuri kartais vadinama penktu kompleksu (5 pav.) (Moncada, 2010; Lenaz, 2012). Kiekvienas
18
kompleksas susideda iš kelių baltyminių komponentų, kurie asocijuoti prostetinėmis grupėmis ir turi
didėjantį standartinį redukcijos potencialą. Tai sudaro sąlygas elektronų perdavimui iš trikarboninių
rūgščių ciklo donorų per atitinkamus kvėpavimo grandinės kompleksus iki galutinio elektronų
akceptoriaus - deguonies. Vykstant elektronų perdavimui tuo pat metu iš I, III ir IV kompleksų yra
išmetami protonai į tarpmembraninę erdvę. Vidinės membranos nelaidumas protonams lemia
elektrocheminio protonų gradiento susidarymą, kuris naudojama ADP fosforilinimui iki ATP.
Tarpmembraninė erdvė ATP sintazė
Matriksas
I kompleksas II kompleksas III kompleksas IV kompleksas
5 pav. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės struktūra. Kvėpavimo grandinė sudaryta iš 4

pagrindinių kompleksų (I – NADH dehidrogenazė, II - sukcinato dehidrogenazė, III - kofermento
Q-citochormo c oksiredutkazė, IV - citochromo c oksidazė) ir ATP sintazės (dar vadinamos 5
kompleksu)
Oksidacinis fosforilinimas yra dviejų procesų – substratų oksidacijos ir ADP fosforilinimo

junginys. Kad šie procesai vyktų yra reikalingi kvėpavimo substratai, kuriais gali būti piruvatas, malatas,
gliutamatas, sukcinatas ar kitas Krebso ciklo tarpinis metabolitas, kurio oksidacijos metu susidaro
redukuoti kofermentai (NADH ir FADH2) ir ADP. Registruojant mitochondrijų kvėpavimą in vitro šiuos
procesus galima vertinti ir atskirai. Kai į mitochondrijų kvėpavimo terpę pridedami kvėpavimo substratai,
jie yra oksiduojami susidarant redukuotiems kofermentams NADH ir FADH2, tai vadinama antrąja
mitochondrijų kvėpavimo būsena, kai yra registruojamas pradinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (V0).
Vėliau į terpę pridėjus ATP sintazės substrato ADP, panaudojant elektrocheminio protonų gradiento
energiją, ATP sintazė sintetina ATP ir ši būsena vadinama trečiąja metaboline būsena ir jos metu
mitochondrijos kvėpuoja didžiausiu greičiu (VADP, V3). Kai yra sunaudojamos visos ADP atsargos arba
19
adenino nukleotidų nešiklis nuslopinamas atraktilozidu, susidaro ketvirtoji metabolinė būsena, kartais dar
vadinama ramybės. Mitochondrijos išorinės membranos intaktiškumui įvertinti yra atliekamas citochromo
c testas: mitochondrijoms perėjus į ketvirtą metabolinę būseną, į matavimo terpę yra pridedama
egzogeninio citochromo c (Toleikis et al., 2005).
Kitos svarbios mitochondrijų funkcijos yra termogenezė, hemo biosintezė, lipidų katabolizmas, kalcio
jonų homeostazė. Pastaraisiais metais vėl išaugo susidomėjimas mitochondrijų funkcijomis ir jau žinoma,
kad šios organelės dalyvauja ląstelės mirties reguliaciniuose procesuose (pvz., programuota ląstelių mirtis
– apoptozė) skirtingais lygiais: citozolinio kalcio jonų homeostazėje, reaktyvių deguonies ir azotų formų
generacijoje, mitochondrinės membranos pralaidumo padidinime ir pro-apoptotinių baltymų paleidime,
apoptosomos formavimosi reguliavime ir kaspazių aktyvavime, redukuojant citozolinį citochromą c
(Brown, 2007; Pinton et al., 2008; Borutaite, 2010).
1.3. Išemija ir jos įtaka mitochondrijų funkcijai ir struktūrai
Miokardo išemija – tai kraujo sumažėjimas organe arba jo dalyje dėl nepakankamo pritekėjimo
arterijomis, dėl ko ima trūkti deguonies, substratų bei nepašalinami ląstelės metabolizmo produktai
(Jennings et al., 1969). Išemija gali atsirasti sumažėjus arteriniam kraujospūdžiui ar dėl deguonies
nepakankamumo kraujyje (santykinė išemija), taip pat dėl arterijų spindžio susiaurėjimo, dėl dalinio arba
visiško jų užsikimšimo: susidarius krešuliui (trombui) ar kraujo srovės atneštam dujų burbului,
stambesnėms dalelėms (embolija). Priklausomai nuo pažeistos organo dalies dydžio išemija gali būti
totalinė, globalinė ir regioninė.
Širdies ląstelėse vykstant išemijai vystosi įvairūs struktūriniai ir funkciniai pakitimai, pvz., ilgą
laiką negaunant deguonies ir reikalingų maisto medžiagų, prasideda ląstelių nekrozė. Manoma, kad vienas
iš svarbiausių faktorių, kuris lemia miocitų pažaidos lygį, yra ATP kiekis ląstelėje (Pollard, 2002).
Kadangi didžiausias kiekis ATP (apie 80-90%) susidaro mitochondrijose oksidacinio forforilinimo metu,
o ATP kiekis priklauso nuo arteriniame kraujyje esančio deguonies kiekio, tai sumažėjus deguonies
kiekiui, lygiagrečiai mažėja ir ATP koncentracija. Sumažėjus oksidacinio forforilinimo greičiui yra
stebimas sistemos pažeidimas, kuris apima išorinės membranos pažeidimus, padidėjusį vidinės
membranos pralaidumą jonams, sumažėjusį dehidrogenazių aktyvumą, kvėpavimo grandinės ir ATP-
sintazių pažeidimą. Jau po 5 min nuo miokardo išemijos pradžios, ATP kiekis širdies ląstelėse sumažėja
25%, po 15 min – 35%, o po 60 min – 94%. Nustatyta, kad išemijos metu padidėja vidinės mitochondrijų
20
membranos pralaidumas, dėl to sumažėja membraninis potencialas ir lėtėja substratų oksidacijos greitis
bei ATP-sintazės aktyvumas. Oksidacinio fosforilinimo nuslopinimą gali sąlygoti ir mitochondrijų
kvėpavimo grandinės bei Krebso ciklo fermentų aktyvumo ir kiekio sumažėjimas, adenino nukleotidų
nešiklio pažeidimai (Toleikis et al., 1989; Di Lisa & Bernardi, 2006).
15 min. Glikolizė ↑ 60 min. Glikolizė lėtėja ir sustoja ↓

Laktatas ↑ ADP ↓
Glikogenas ↓ AMP ↑
IŠEMIJA ATP ↓ ATP ↓
ADP ↓ mitochondriju brinkimas
CP ↓ Bendras adeninnukleotidų kiekis ↓
AMP ↑
Bendras adenino nukleotidų kiekis ↓
GRĮŽTAMI PAŽEIDIMAI NEGRĮŽTAMI PAŽEIDIMAI
6 pav. Išemijos pažaidos šuns miokarde po 15 ir 60 min (adaptuota iš Jennings et al., 1981)
Glikolizės procesas ląstelėje prasideda pirmosiomis išemijos minutėmis. Dėl to, audinyje mažėja
glikogeno kiekis, ima kauptis laktatas, kaupiasi adenozino 5‘- monofosfatas (AMP) (6 pav.). Terpės
parūgštėjimas bei laktato koncentracijos išaugimas greitai nuslopina glikolizės fermentus. Po 15 min
išemijos bendras nukleotidų kiekis sumažėja 55 %. Kreatino fosfato kiekis (CP) po 10 min išemijos
sumažėja 10 % (6 pav.). Po 60 min išemijos netenkama apie 69 % bendro nukleotidų kiekio, pastebimi
mitochondrijų membranos pažeidimai, žymiai mažėja DNR bei baltymų sintezės greitis (Di Lisa &
Bernardi, 2006).
Išemijos sąlygomis kinta oksidacinio fosforilinimo aktyvumas. Jį galima įvertinti matuojant
mitochondrijų kvėpavimo greitį. Eksperimentiniai duomenys rodo, kad mitochondrijose jautriausias
išemijai funkcinis parametras yra oksidacinio fosforilinimo greitis (Toleikis et al., 1989). Šio greičio
sumažėjimas rodo oksidacinio fosforilinimo sistemos pažeidimą, apimant išorinės membranos
pažeidimus, padidėjusį vidinės membranos pralaidumą jonams, sumažėjusį dehidrogenazių aktyvumą,
kvėpavimo grandinės bei ATP-sintazių pažeidimą. Parodyta, kad ilgėjant išemijos laikui, didėja piridino
nukleotidų, flavino nukleotidų netekimas. Taip pat stebimas adenino nukleotidų nešiklio aktyvumo
sumažėjimas. Nustatyti ir mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų pažeidimai: mitochondrijų
kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, esant substratui glutamatui + malatui ar piruvatui +
malatui, išemijos metu mažėja (Toleikis et al., 1989).
21
Vertinant išemijos įtaką mitochondrijų kvėpavimo grandinės fermentų aktyvumui, manoma, kad
mitochondrijų kvėpavimo grandinės I kompleksas (NADH dehidrogenazė) yra labiausiai pažeidžiamas
esant deguonies trūkumo sąlygoms. Priežastys, dėl ko mažėja I komplekso aktyvumas – tai gali būti dėl
nekovalentiškai prijungto flavino mononukleotido disociacijos, užpildo (matrikso) pH sumažėjimo ar
vidinės mitochondrijų membranos pažeidimų, specifinio vidinės mitochondrijų membranos fosfolipido -
kardiolipino kiekio sumažėjimo dėl ROS. Dar kiti mokslininkai mano, kad NO gali būti tas veiksnys, kuris
sumažina I komplekso aktyvumą (Jakabsone et al., 2003). Mažesniu laipsniu išemija veikia kitus
kvėpavimo grandinės kompleksus: 24% sumažėja II komplekso aktyvumas, 9–14% III komplekso, ir 9–
13% IV komplekso aktyvumai (Toleikis et al., 1989; Lebuffe et al., 2003). Citochromo oksidazės
aktyvumo sumažėjimas siejamas su tiesioginiu komplekso pažeidimu arba su citochromo c netekimu.
Spektrofotometriškai buvo nustatyta, kad po 30 min totalinės išemijos citochromo c kiekis širdies
mitochondrijose sumažėja 25%, o po 60 min - apie 60% (Toleikis et al., 1989; Wang et al., 2006).
Intaktiška išorinė mitochondrijų membrana yra nepralaidi citochromui c, todėl citochromo c išėjimas iš
mitochondrijų išemijos metu siejamas su išorinės membranos pažaidomis. Miokardo išemijos metu dėl
suaktyvėjusių mitochondrinių fosfolipazių intensyviai vyksta hidrolizė, tuomet susidaro fosfolipidų
skilimo produktai, kurie veikia kaip skyrikliai ir padidina mitochondrijų membranos laidumą bei
citochromo c išėjimą.
Jau yra atlikta nemažai mokslinių tyrimų, kur tyrinėtas polifenolinių junginių apsauginis poveikis
nuo išemijos sukeliamų funkcinių ir struktūrinių pažeidimų. Manoma, kad šis poveikis yra susijęs su
antioksidacinėmis, kraujagysles atpalaiduojančiomis ir prieuždeginėmis savybėmis bei antiagregaciniu
efektu (Sener et al., 2005; Alhlaghi & Bandy, 2009). Yra ir duomenų, kad flavonoidiniams junginiams
patekus į organizmą per os, jie taip pat apsaugo širdį nuo išeminių pažeidimų (Modum et al., 2003; Ikilzer
et al., 2007). Vis dėl to, tikslaus apsauginio antocianinų mechanizmo vis dar nėra nustatyta, yra tik keli
straipsniai kur tirtas Dp ir kitų flavonoidų kardioprotekcinis poveikis, esant širdies išemijos/reperfuzijos
pažeidimams, bet tirtas apsauginis mechanizmas nesusijęs su jų antioksidacinėmis savybėmis (Alhlaghi &
Bandy, 2009).
1.4 Apoptozė ir mitochondrijos
Išemijos poveikyje vystosi ląstelių pažaidos, sukeliančios ląstelių žūtį. Išeminiame miokarde
ląstelės žūsta nekrozės ir apoptozės keliais. Nekrozės metu aktyvuojasi degradacinius procesus
22
sąlygojantys fermentai, ląstelės brinksta, sutrūkinėja jų membranos, o išsiliejęs turinys pažeidžia gretimas
ląsteles. Apoptozė, arba programuota ląstelių mirtis, yra ląstelės savęs sunaikinimo mechanizmas, kuris
yra svarbus keletai biologinių procesų, tokių, kaip augimo reguliacija, audinių homeostazė ir nereikalingų
ląstelių pašalinimas. Sutrikus apoptozei, gali pasireikšti keletas ligų: nepakankama apoptozė gali būti
susijusi su vėžio, imuninių ligų vystimusi, o per intesyvi apoptozė gali lemti neurodegeneracines, širdies ir
kraujagyslių sistemos bei kitas ligas (Meier, 2000; Zuzarte-luis, 2002). Daugelio šių ir kitų ligų gydymas
galėtų būti grindžiamas apoptozės aktyvinimu arba slopinimu, todėl racionalių gydymo metodų paieškos
skatina toliau tyrinėti apoptozės mechanizmus. Yra žinoma, kad mitochondrijos vaidina svarbų vaidmenį
apoptotinių procesų kaskadoje, o kardiomiocitai pasižymi tuo, kad mitochondrijų kiekis juose pats
didžiausias lyginant su kitų tipų ląstelėmis (Cerveny et al., 2007; Jeong & Seol, 2008). Mitochondrijų
tarpmembraninėje erdvėje ir išorinėje membranoje atrasta baltymų, kurie gali aktyvuoti arba slopinti
apoptozę. Citochromas c, gerai žinomas kaip nedidelis baltymas silpna elektrostatine jungtimi susirišęs su
mitochondrijų kvėpavimo gradine, dalyvaujantis elektronų pernešime tarp citochromo c reduktazės ir
citochromo c oksidazės, yra taip pat ir specifinis apoptozės aktyvatorius (Garrido et al., 2006; Ow et al.,
2008). Citochromas c iš mitochondrijų tarpmembraninės erdvės patekęs į citoplazmą jungiasi su baltymu
Apaf-1 (angl. Apoptosis protease-activating factor 1), ir sukelia oligomerizaciją, šiam procesui yra
reikalinga energija. Susidarę oligomerai yra gimingi prokaspazei 9, todėl su ja sudaro apoptosomą ir
susidaro sudėtingas, daugiamolekulinis kompleksas. Apoptosoma aktyvuoja kaspazę 3, kuri paleidžia
tolimesnę kaspazių kaskadą (Michael, 2000; Jeong & Seol, 2008). Kaspazės yra dar vadinamos aspartatui
specifinėmis cisteino proteazėmis, o tai reiškia, kad kaspazės yra proteazės, turinčios cisteino aktyviajame
centre ir ardančios baltymuose esančias peptidines jungtis, kurias sudaro aspartato karboksilo grupė.
Kuomet kaspazės pradeda veikti, atsiranda ląstelių struktūros pokyčių, būdingų apoptozei, todėl jos ir
vadinamos pagrindinėmis apoptozės vykdytojomis.
Citochromo c išėjimas iš mitochondrijų yra laikomas vienu iš ankstyviausiųjų negrįžtamų
procesų apoptozėje. Citochromas c gali egzistuoti redukuotoje arba oksiduotoje formoje. Ilgą laiką buvo
manoma, kad citochromo c redokso būsena nėra svarbi apoptosomos funkcionavimui. Sveikose ląstelėse
citozolinis citochromas c yra greitai redukuojamas įvairių fermentų arba reduktorių ir taip gali blokuoti
apoptozę. Tačiau apoptotinėse ląstelėse citozolinis citochromas c yra staigiai oksiduojamas citochromo
oksidazės, kuomet mitochondrijų išorinė membrana yra pažeista. Taigi, yra žinoma, kad apoptosomos
susidaryme labiau linkęs dalyvauti oksiduotos formos citochromas c (Borutaite, 2010; Borutaite & Brown,
2007; Hancock et al., 2001). Paremiant šį teiginį, yra atlikta keletas tyrimų, įrodančių, kad oksiduotas
23
citochromas c greitai aktyvuoja kaspazę 9 ir kaspazę 3 citozolyje, o tuo tarpu ditiotreitoliu, N- acetil-
cisteinu arba gliutationu redukuotas citochromas c buvo visiškai neaktyvūs (Hancock et al., 2001; Suto et
al., 2005). Todėl vienas iš mūsų tyrimų tikslų buvo ištirti, antocianinų standartų gebėjimą redukuoti
citochromą c ir jų galimą priešapoptozinį veikimą (7 pav.). Buvo iškelta hipotezė, kad antocianinai gali
redukuoti iš išorės pridedamą arba po išemijos pažeidimo iš mitochondrijų į citozolį patenkantį
citochromą c. O redukuotas citochromas c gali blokuoti apoptozės kaskados aktyvaciją.
7 pav. Antocianinų vaidmuo apoptozės kelyje (adaptuota iš Borutaite, 2010). COX – citrochromo
oksidazė; Cyt.cox – citochromas c oksiduota forma; Cyt.cred – citochromas c redukuota forma
24
2. METODIKA
2.1. Eksperimentiniai gyvūnai
Eksperimentams atlikti buvo naudojamos 2 - 4 mėnesių, suaugę Wistar žiurkių patelės. Žiurkės
buvo užmigdomos anglies dioksido dujomis ir nutraukiamas stuburo kanalas kaklo srityje (leidimo, atlikti
laboratorinius bandymus su gyvūnais, Nr. 0217).
2.2. Reagentai
Delfinidino-3-O-, cianidino-3-O-, pelargonidino-3-O-, peonidino-3-O- ir malvidino-3-O-

gliukozidai buvo iš Extrasynthese firmos (Prancūzija). Visi kiti darbe naudoti reagentai, jeigu nenurodyta
kitaip, buvo iš Sigma-Aldrich firmos.
2.3. Mitochondrijų išskyrimas
Širdies mitochondrijų išskyrimas. Mitochondrijos buvo izoliuotos diferencinio centrifugavimo

metodu (Scholte et al., 1973). Širdis, kontrolinė arba po išemijos, buvo praplaunama 0,9% 1-2ºC
temperatūros KCl tirpalu, audinys susmulkinamas žirklutėmis ant ledų padėtoje Petri lėkštelėje ir
homogenizuojama mechaniniu homogenizatoriumi (stiklas/teflonas) užpilant 10 ml/g homogenizavimo
terpės (250 mM sacharozės, 5 mM HEPES, 2 mM EGTA, pH 7,3 4ºC). Centrifuguojama 750xg 5 min, po
to supernatantas buvo perpilamas per dvigubą marlinį filtrą, nenupilant nuosėdų ir paskutinių supernatanto
lašų, ir vėl centrifuguojamas 6800xg 10 min. Širdies mitochondrijos buvo suspenduojamos suspendavimo
terpėje (180 mM KCl, 20 mM Tris/HCl, 7,3 2ºC). Mitochondrijų suspensija (~50 mg/ml baltymo) buvo
laikoma leduose viso eksperimento metu.
2.4. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu
Baltymo kiekis mitochondrijų suspensijoje nustatytas modifikuotu biureto metodu (Gornal et al.,
1949). Į 0,05 ml mitochondrijų suspensijos įpilama 0,95 ml 0,33% dezoksicholato tirpalo, gerai
sumaišoma ir 5 min inkubuojama vandens termostate 37ºC temperatūroje. Po to įpilama 4 ml biureto
reagento, sumaišoma ir inkubuojama vandens termostate 37ºC, 15 min. Gauto tirpalo optinis tankis
matuojamas spektrofotometru Helios α (Thermo Electron, Anglija) 536 nm ilgio bangoje. Baltymo kiekis
25
nustatomas pagal kalibracinę kreivę, kuriai sudaryti naudojamas standartinis jaučio serumo albumino
tirpalas.
2.5. Širdies perfuzija bei išemijos sukėlimas
Atvėrus žiurkės krūtinės ląstą, kraujo krešėjimui sustabdyti, į kairįjį širdies skilvelį buvo
suleidžiamas 1 ml (5000 aktyvumo vienetų/ml, 37ºC) injekcijoms skirto heparino tirpalo. Tuomet buvo
nukerpamos širdies kraujagyslės bei pasaitai ir širdis perkeliama į termostatuojamą (37ºC), pusiau uždarą
kamerą. Į aortą buvo įstatoma plastikinė kaniulė, prijungta prie Langendorfo tipo širdies perfuzijos
sistemos. Perfuzijai buvo naudojamas Krebs-Henseleit tirpalas, kurio sudėtis: 11 mM gliukozės, 118 mM
NaCl, 25 mM NaHCO3, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM CaCl2, 1,6 mM MgSO4, ir 0,7 mM Na-
piruvato (prisotintas 95 proc. O2 ir 5 proc. CO2, pH 7,4 37ºC), esant 80 cm H2O spaudimui. Po 10 min
nusistovėjimo periodo, papildomai pridedant tyrimui naudojamų 20 µM ar 40 µM antocianinų (Cy-3-G
arba Pg-3-G) buvo perfuzuojama dar 15 min. Srauto tekėjimo greitis – 20-25 ml/min. Tais atvejais, kai po
širdies perfuzijos buvo sukeliama išemija (autolizė), tirpalo tekėjimas buvo sustabdomas ir širdis laikoma
uždaroje drėgnoje termostatuojamoje kameroje 45 min. Kontrolinės širdys buvo perfuzuojamos tokį patį
laiko tarpą į terpę nepridedant antocianinų. Prieš izoliuojant mitochondrijas širdis kelias minutes buvo
palaikoma 0,9 % 2 - 4 ºC KCl tirpale, kad nustotų susitraukinėti, sulėtėtų metabolizmas bei nevyktų
autolizės procesai.
2.6. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas
Mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo registruojamas, naudojant oksigrafinę sistemą Oxygraph-

2k (OROBOROS Instruments, Innsbruck, Austria). Mitochondrijų kvėpavimo matavimai buvo atliekami
inkubacinėje terpėje (0,5 mM EGTA,3 mM MgCl2, 60 mM kalio laktobionato, 20 mM taurino, 10 mM
KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacharozės (pH 7,1 37ºC), pridedant 1 mM piruvato ir 1 mM malato,
kaip kvėpavimo substratų. Matavimai atlikti 37ºC temperatūroje. Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje
metabolinėje būsenoje buvo pasiekiamas į kiuvetę pridedant 1 mM ADP (V3). Citochromo c efektas
(gebėjimas aktyvuoti 140 µM atraktilozido nuslopintą mitochondrijų kvėpavimą) buvo nustatytas į kiuvetę
įdedant 32 µM citochromo c. Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreiškiamas pmol O/s-1/mg-1
mitochondrijų baltymo. Galutinė mitochondrijų baltymo koncentracija buvo 0,125 mg/ml.
26
2.7. Citochromo c redukcijos nustatymas
Citochromo c redukcija buvo matuojama spektrofotometriškai, naudojant Helios (Thermo

Electron, Anglija) spektrofotometrą. Absorbcijos spektrai buvo gaunami, matuojant 500 nm – 600 nm
bangos ilgių ribose, o citochromo c redukcijos maksimumas buvo stebimas 550 nm bangos ilgyje.
Skirtingų antocianinų spektrai buvo registruojami 1 ml terpėje, kuri susideda iš 0,5 mM EGTA, 3 mM
MgCl2, 60 mM kalio laktobionato, 20 mM taurino, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacharozės
(pH 7,1). Citochromo c redukcijos spektrai matuoti pirmąją minutę, po 3 ir 6 min. Matavimai atlikti 25ºC
temperatūroje. Palyginimui buvo matuota egzogeninio citochromo c redukcija. 32 µM citochromo c buvo
pridedama į tą patį buferinį tirpalą ir citochromo c spektras matuotas kas minutę 500 - 600 nm bangos
ilgių ribose. Citochromo c redukcijos lygis nustatytas pagal absorbcijos padidėjimą 550 nm (redukuoto
citochromo c maksimumas) bangoje lyginant su visiškai redukuoto citochromo c absorbcijos lygiu 550 nm
pridėjus kelis kristalus ditionito. Ditionitu redukuoto citochromo c absorbcijos maksimumas buvo
prilygintas 100% redukuoto citochromo c.
2.8. Kaspazės 3 aktyvumo matavimas
Mitchondrijų išskyrimo metu (3.2. skr.) po antro centrifugavimo surinkta citozolinė frakcija ir
įvertintas kaspazės 3 aktyvumas. Naudota 1 mg/ml citozolinio baltymo, kuris 60 min inkubuotas
buferiniame tirpale, susidedančiame iš 250 mM sacharozės, 5 mM HEPES, 2 mM EGTA (pH 7,3, 37ºC) ir
0,1 mM substrato Acetil–Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-metilkumarino (DEVD). Kaspazės hidrolizė buvo
matuojama fluorimetriškai naudojant “Thermo Scientific platereader” fluoritmetrą (Anglija); sužadinimas
vyko prie 380 nm bangos ilgio, emisija – 460 nm. Substrato skilimo aktyvumas buvo visiškai nuslopintas
naudojant grįžtamąjį kaspazės 3 slopiklį: 0,02 mM N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-aldehido.
2.9. Mitochondrinio ir citozolinio citochromo c kiekio matavimas
Citochromo c kiekis mitochondrijose ir citozolinėje frakcijoje buvo nustatomas naudojant

Quantikine žiurkės/pelės imunotyrimo ELISA rinkinį (R&D System). Citochromo c kiekio matavimui
mitochondrijos buvo ištirpinamos 1 % Tritono X-100 tirpale ir kitos procedūros buvo atliekamos, kaip
nurodyta gamintojo instrukcijose.
27
2.10. Statistinė duomenų analizė
Eksperimentinių duomenų, mažiausiai trijų nepriklausomų atvejų, vidurkiai pateikti su

vidutinėmis standartinėmis paklaidomis, statistiškai palyginti tarp eksperimentinių grupių naudojant
grupinį Stjudento t-testą. Skirtumai tarp vidurkių laikomi statistiškai patikimi, jei reikšmė p <0,05.
Statistinė analizė atlikta naudojant SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc.).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Anksčiau LSMU Neuromokslų institute atliktuose eksperimentiniuose tyrimuose (Liobikas et al.,

2009), tiriant izoliuotų žiurkės širdies mitochondrijų funkcijas buvo pastebėta, kad kai kurie antocianinai
(pvz., Dp-3-G) apie 60% padidina išoriniu citochromu c aktyvuotą mitochondrijų kvėpavimo greitį
ketvirtoje metabolinėje būsenoje (esant atraktilozidui ir pridėjus egzogeninio citochromo c) (8 pav.).
Intaktiška išorinė mitochondrijų membrana nepralaidi citochromui c, todėl citochromo c išėjimas iš
mitochondrijų gali būti susijęs su išorinės membranos pažaida. Tačiau buvo iškelta prielaida, kad šis
padidėjimas gali būtų susijęs ne su išorinės mitochondrijų membranos pažeidimu, o su antocianinų
sugebėjimu redukuoti citochromą c (Skemiene et al., 2010a).
Šiame darbe buvo siekiama nustatyti, ar įvairių antocianinų standartų tirpalai in vitro geba
redukuoti egzogeninį citochromą c ir kokiu laipsniu. Spektrofotometriškai vertinta skirtingų koncentracijų
antocianinų standartų tirpalų sugebėjimas redukuoti citochromą c laike. Taip pat buvo tiriamas
antocianinų poveikis mitochondrijų funkcijoms, vertinant šių junginių efektus skirtingiems mitochondrijų
kvėpavimų greičiams (V0, V3).
28
Dp-3-G
8 pav. Dp-3-G (20 µM kocentracijos) sukeltas 60% mitochondrijų kvėpavimo greičio padidėjimas
ketvirtoje metabolinėje būsenoje (esant atraktilozido ir pridėjus egzogeninio citochromo c)
Kadangi antocianinai pasižymi stipriomis oksidacinėmis - redukcinės savybės, iškėlėme hipotezę,

kad šie junginiai, keisdami citozolinio citochromo c redokso būseną, taip pat gali apsaugoti ląsteles ir nuo
išeminių širdies pažeidimų. Širdies išemijos metu, sutrinka širdies aprūpinimas maisto medžiagomis,
deguonimi, o tai labai stipriai paveikia jautrias širdies ląsteles, ypač ląstelių energijos apykaitą. Už
energijos gamybą ląstelėse atsakingos mitochondrijos, kurios ir yra pažeidžiamos išemijos metu, t.y.
dažniausiai pažeidžiama mitochondrijų išorinė membrana ir tuomet baltymas citochromas c lengvai išeina
iš mitochondrijų į ląstelės citozolį, sukeldamas apoptozės kaskados aktyvaciją. Antocianinai gali būti
natūralūs ir efektyvūs agentai, redukuojantys citochromą c ir taip apsaugantys nuo apoptozės kaskados
aktyvacijos, t.y. apoptosomos susidarymo. Kaip jau minėta anksčiau, apoptosomos susidarymas
inicijuojamas tada, kai oksiduotos formos citochromas c jungiasi su apaf-1 faktoriumi ir prokaspaze 9. Dėl
šios priežasties tęsėme tyrimus ir siekėme nustatyti antocianinų biologinį aktyvumą, įvertinant jų poveikį
mitochondrijų funkcijoms bei mitochondrijų tarpmembraninės ertmės baltymo citochromo c oksidacinei
būsenai. Taip pat bandėme išsiaiškinti, ar antocianinai sugebėtų apsaugoti širdies miocitus nuo išemijos
metu sukeltų mitochondrijų struktūrinių ir funkcinių pažeidimų, taip bandydami suprasti šių pigmentų
kardiopotekcinį veikimą.
29
3.1. Antocianinų poveikis mitochondrijų funkcijoms
3.1.1. Antocianinų poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams
Norint ištirti tiesioginį antocianinų poveikį mitochondrijų funkcijoms, t.y. oksidacinio

fosforilinimo sistemai, mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo matuojamas esant kelioms skirtingoms
mitochondrijų metabolinėms būsenoms.
Remiantis 9 paveikslėlyje pateiktu mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimo pavyzdžiu,
pradinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (V0) buvo matuojamas į terpę be mitochondrijų pridedant ir
kvėpavimo substratų (piruvato ir malato). Tada į mitochondrijų kvėpavimo terpę pridedant antocianinų
standartų (Dp-3-G, Cy-3-G, Pg-3-G) buvo matuojamas jų poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams.
Trečiosios metabolinės būsenos metu, mitochondrijų kvėpavimo greitis (V3) buvo pasiekimas pridedant
ADP. Vėliau, pridedant adenino nukleotidų nešiklio slopiklio atraktilozido, kvėpavimo greitis
sumažėdavo beveik iki pradinio mitochondrijų kvėpavimo greičio (V0). Galiausiai, į terpę pridėjus
citochromo c buvo vertinamas citochromo c efektas.
B
1
9 pav. Izoliuotų širdies mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimo pavyzdys. A linija – mitochondrijų
kvėpavimo greitis; B linija – deguonies koncentracijos kitimo išvestinė, leidžianti įvertinti kvėpavimo
efektyvumą. Pradinis (V0) mitochodrijų kvėpavimo greitis (1) gaunamas į kiuvetę pridėjus 0,125mg
mitochondrijų ir 6 mM piruvato+6 mM malato. Vėliau pridedant priedus, užrašomas mitochondrijų
kvėpavimo greitis skirtingose metabolinėse būsenose ( Cy3G – 40 µM Cy-3-G; ADP- 1 mM ADP; ATR –
140 µM atraktilozido; Cyt c – 32 µM citochromo ).
Kaip matome 10 paveikslėlyje, visi tirtieji antocianinai (Dp-3-G, Cy-3-G ir Pg-3-G), esant 20 µM
koncentracijai, neturėjo poveikio nei mitochondrijų kvėpavimo greičiui (V0) antroje metabolinėje
30
būsenoje, nei mitochondrijų kvėpavimo greičiui (V3) (trečios metabolinės būsenos metu). Priešingai, 40
µM Dp-3-G padidino pradinį mitochondrijų kvėpavimo greitį (V0) net 53%±3%. Šis poveikis gali būti ir
dėl to, kad didesnės Dp-3-G koncentracijos pasižymi oksidacinį fosforilinimą atskiriančiuoju poveikiu
(Pav.10B). 40 µM koncentracijos Cy-3-G ir Pg-3-G tirpalai neturėjo jokio efekto kvėpavimo greičiui (V0)
antroje metabolinėje būsenoje. Įdomu tai, kad kvėpavimo greičiai (V3) trečioje metabolinėje būsenoje
nepakito nei pridėjus 20 µM, nei 40 µM antocianinų koncentracijas (10 pav. A ir B).
Deguonies sunaudojimo greitis, pmol O 2/s/mg baltymo

400
A B
V3 400 V3
300 300
200 200 V0
V0
*
100 100
0 0
G
0
3
-G
-G
G
V
-G
-G
-G
-G
-G
V
-G
0
3
3-
V
V
3-
3-
3-
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
-3
p-
p-
p-
p-
Cy
Cy
Cy
Cy
Pg
Pg
Pg
Pg
D
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10 pav. Antocianinų (Dp-3-G, Cy-3-G, Pg-3-G) poveikis širdies mitochondrijų kvėpavimo greičiams
antroje ir trečioje metabolinėse būsenose. Pradinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (V0) užrašytas
terpėje esant subratatams – 6 mM piruvato ir 6 mM malato. Kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje
būsenoje (V3) pasiekiamas, pridedant 1 mM ADP, po to pridedant 20 µM (A) arba 40 µM (B) Dp-3-G, Cy-
3-G, Pg-3-G. *- statistiškai patikimas efektas lyginant su kontroliniu V0 (be antocianinų).
3.1.2. Citochromo c efektas
Tiriant antocianų poveikį izoliuotų žiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms buvo pastebėta, kad
kai kurie antocianinai padidina išoriniu citochromu c aktyvuotą mitochondrijų kvėpavimo greitį ketvirtoje
metabolinėje būsenoje. Ketvirtosios metabolinės būsenos metu, mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo
matuojamas, esant adenino nukleotidų nešiklio slopikliui atraktilozidui ir pridedant egzogeninio
citochromo c tam, kad patikrinti mitochondrijų išorinės membranos intaktiškumą. Iškėlus prielaidą, kad
šis padidėjimas susijęs ne su išorinės mitochondrijų membranos pažeidimu, o su antocianinų sugebėjimu
redukuoti citochromą c (Škėmienė et al.,2012 a), buvo tirta, kaip skirtingi antocianinų standartai geba
paveikti mitochondrijų kvėpavimo greitį ketvirtos metabolinės būsenos metu.
31

250
71%
200
30%
150
-7%
100
50
0
ATR + Cyt c + Dp-3-G + Cy-3-G + Pg-3-G
11 pav. Antocianinų (20µM Dp-3-G, Cy-3-G, Pg-3-G) poveikis širdies mitochondrijų kvėpavimo
greičiui ketvirtoje metabolinėje būsenoje. Kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje užrašytas
po ADP priedo, pridedant 140µM atraktilozido (ATR) ir 32µM egzogeninio citochromo c (Cyt c). Skaičiai
virš stulpelių rodo procentais (%) išreikštą antocianinų stimuliuojantį efektą kvėpavimo greičiui.
Nustatyta, kad skirtingi antocianinai nepaveikė mitochondrijų kvėpavimo greičio ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, esant tik adenino nukleotidų nešiklio slopikliui atraktilozidui (duomenys
nepateikti). Pastebėta, kad pridėjus 20 µM Dp-3-G ir Cy-3-G į mitochondrijų kvėpavimo terpę, esant
egzogeniniam citochromui c ir matuojant kvėpavimo greitį ketvirtoje metabolinėje būsenoje, vyksta labai
stipri kvėpavimo greičio stimuliacija (71% ir 30% atitinkamai) lyginant su kontroliniu citochromo c
stimuliuotu greičiu, terpėje nesant antocianinų (11 pav.). Ir priešingai, Pg-3-G šio stimuliuojančio efekto
neturėjo. Manoma, kad šis skirtingas kvėpavimo greičio stimuliavimas yra susijęs su antocianinų
struktūriniais skirtumais, o ypač, su B žiede prisijungusiais hidroksilo radikalais (1 pav.), kas lemia ir
skirtingą jų oksidacinių-redukcinių savybių stiprumą. Taip pat buvo matuotas ir 40 µM koncentracijos
antocianinų tirpalų poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui ketvirtoje metabolinėje būsenoje, tačiau
poveikio nebuvo (duomenys nepateikti).
32
3.2. Citochromo c redukcija antocianinais
3.2.1. Antocianinų efektas citochromo c redukcijos būsenai
Norint ištirti antocianinų gebėjimą redukuoti citochromą c buvo matuota ir vertinta skirtingų
antocianinų standartų egzogeninio citochromo c redukcija laike in vitro. Redukcija vertinta pridėjus
antocianinų tiesiogiai į tirpalą ir registruojamas citochromo c absorbcijos spektro kitimas 500 - 600 nm
bangos ilgiuose per 6 min pridėjus skirtingų antocianinų standartų – citochromo c redukcijos antocianinais
maksimumas buvo pasiekiamas šeštą minutę (šešių minučių metavimo trukmė buvo pasirinkta
eksperimentiškai) (12 pav). Citochromo c redukcijos maksimumas buvo stebimas 550 nm bangos ilgyje.
550nm
1
2
3
4
12 pav. Citochromo c absorbcijos spektro kitimo pavyzdys. Citochromo c redukcijos kitimas matuotas 6
min laikotarpyje ir 550 nm bangos ilgyje. 1- redukuoto citochromo c maksimumas, pridėjus ditionito, ši
kreivė buvo imama, kaip citochromo c redukcijos 100%. 2 – citochromo c redukcijos kreivė po 6 min, 3-
citochromo c redukcijos kreivė po 3 min, 1 – citochromo c redukcijos kreivė po 1 min po antocianinų
pridėjimo.
Iš pradžių į matavimo terpę pridėjus 32 µM citochromo c jis buvo oksiduotoje formoje
(oksiduoto citochromo c maksimumas stebimas prie 540 nm bangos ilgio) ir ji nekito per visą
eksperimento laiką. Vėliau į terpę buvo dedama penkių skirtingų 40 µM koncentracijų antocianinų tirpalų
ir buvo vertinama jų sukelta citochromo c redukcija laike. Tirti tik antocianinų gliukozidai, nes gliukozė
yra dažniausiai sutinkamas angliavandenis, prisijungęs prie antocianinų aglikonų. Pridėjus Dp-3-G iš
karto, buvo sukeliama labai greita ir beveik visiška citochromo c redukcija: esant 40 µM Dp-3-G
koncentracijai citochromas c redukuojamas 67±1%, o per 6 min pasiekama 78±1% redukcija (13 pav). 40
33
µM Cy-3-G taip pat geba pakankamai greitai redukuoti citochromą c, tik jo redukcinės savybės yra šiek
tiek silpnesnės lyginant su Dp-3-G: per pirmąją minutę Cy-3-G redukavo 19±2% citochromo c, o vėliau
pasiekė 42±4% ir 50±4% redukciją po 3 min ir po 6 min atitinkamai. Manoma, kad silpnesnės šio
pigmento redukcinės savybės yra dėl B žiedo struktūroje esančių dviejų hidroksilo grupių, lyginant su
Dp-3-G atveju esančiais trim hidroksilo radikalais (1 pav.). Tačiau tai tik prielaida, kadangi vis dar nėra
aišku, kuri antocianinų cheminėje struktūroje esanti funkcinė grupė yra atsakinga už skirtingas redukcines
savybes.
100
R edukuoto citochromo c kiekis, %
80
Dp-3-G
60
Cy-3-G
40
Mv-3-G
20
Pn-3-G
Pg-3-G
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Laikas, min
13 pav. Citochromo c redukcijos kitimas laike, veikiant skirtingiems antocianinų standartų tirpalams.
Citochromo c redukcijos lygis buvo matuojamas spektrofotometriškai laike, kaip yra aprašyta metodinėje
dalyje. Į matavimo terpę buvo pridedama 40 µM antocianų (Dp-3-G, Cy-3-G, Mv-3-G, Pn-3-G ar Pg-3-
G) ir 32µM citochromo c. Redukcijos maksimumas registruotas esant 550 nm bangos ilgiui.
Mv-3-G ir Pn-3-G dar silpniau redukuoja citochromą c ir sukelia tik 11-21% ir 5-14% redukciją
per 1 – 6 min intervalą, atitinkamai. Pg-3-G turėjo mažiausią redukuojantį poveikį tarp visų tirtų
antocianinų, nes tik 3,4±0,6%, 9,2±0,4% ir 12±0,7% citochromo c buvo redukuojama, esant terpėje 40
µM Pg-3-G po 1, 3 ir 6 min atitinkamai. Nustatyta, kad visi tirtieji antocianinų standartai redukuoja
citochromą c skirtingu laipsniu, priklausomai nuo aglikono struktūros. Šie rezultatai rodo, kad Dp-3-G ir
Cy-3-G yra potencialūs in vitro citochromą c redukuojantys antocianinai ir dėl to gali būti naudojami
tolimesniems tyrimams, o tuo tarpu iš visų tirtųjų Pg-3-G yra silpniausiai redukuojantis citochromą c.
34
Toks redukcinio poveikio skirtumas gali būti susijęs su antocianinų cheminėje struktūroje esančiu
skirtingu –OH grupių skaičiumi (1 pav.). Tad toliminesniems tyrimams šį antocianiną pasirinkome tirti
todėl, kad būtų galima efektyviau palyginti skirtingas antocianinų oksidacines-redukcines savybes ir jų
efektyvumą apsaugant nuo išemijos sukeltų pažeidimų bei poveikį apoptoziniam mechanizmui.
Taip pat anksčiau LSMU NI buvo nustatyta (Škėmienė ir kt., 2010 b), kad antocianinai redukuoja
citochromą c grįžtamai, nes po redukcijos antocianinais, įdėjus į terpę vandenilio peroksido, jis oksidavo
citochromą c iki pradinio oksidacijos lygio.
3.3. Perfuzija ir išemija
3.3.1. Antocianinų poveikis išemijos sukeltiems širdies mitochondrijų pažeidimams po

perfuzijos
Pastaruoju metu širdies ir kraujagyslių ligos yra viena pagrindinių hospitalizacijos ir mirštamumo
priežasčių ekonomiškai išsivysčiose šalyse, todėl išemijos poveikis gyvūnų ir žmogaus miokardui yra
intensyviai tiriamas, norint atrasti naujas apsaugos priemones, ištirti jų mechanizmus ir sumažinti širdies
raumens pažeidimus bei pagerinti gyvenimo kokybę (Bagchi et al., 2003). Eksperimentiniai duomenys
rodo, kad jautriausias išemijai mitochondrijų funkcinis parametras yra oksidacinis fosforilinimo greitis
(Toleikis et al., 1989). Šio greičio sumažėjimai rodo oksidacinio fosforilinimo sistemos pažeidimą, kuris
apima išorinės membranos pažeidimus, padidėjusį vidinės membranos pralaidumą jonams, kvėpavimo
grandinės kompleksų pažeidimus ir kitus funkcinius mitochondrijų pažeidimus. Todėl šiame darbe buvo
tirtas antocianinų poveikis širdies mitochondrijų funkcijoms, o taip pat antocianinų efektai citozolinio ir
mitochondrinio citochromo c kiekio kitimui išeminiame miokarde po širdies perfuzijos jais, kad būtų
galima išsiaiškinti, ar antocianinai gali apsaugoti miokardą nuo išeminių pažeidimų.
Nustatyta, kad kontrolinėse širdyse (14 pav.) 45 min išemija sukėlė statistiškai reikšmingą
mitochondrinio kvėpavimo greičio (V3) trečioje metabolinėje būsenoje sumažėjimą (net 52±2%) ir
neturėjo jokio poveikio pradiniam mitochondrijų kvėpavimo greičiui (V0). Po perfuzijos su 20 µM
antocianinų tirpalais (Cy-3-G ir Pg-3-G) nebuvo pastebėta jokio mitochondrijas apsaugančio nuo išemijos
sukeltos pažaidos efekto: tirtose eksperimentinėse grupėse, mitochondrijų kvėpavimo greitis V3 sumažėjo
panašiu laipsniu, kaip ir išeminėje kontrolinėje grupėje. O tiriant poveikį pradiniam mitochondrijų
kvėpavimo greičiui (V0) nebuvo patikimo kvėpavimo greičio skirtumo lyginant su kontroline grupe.
35
Tačiau eksperimentuose, kai širdys buvo perfuzuotos su 40 µM koncentracijos antocianinų tirpalais (Cy-
3-G ir Pg-3-G) buvo pastebėta, kad Cy-3-G padidino trečios metabolinės būsenos kvėpavimo greitį (V3)
net 57±1% lyginant su kontroline išemine grupe ir jis buvo artimas kontrolinės neišeminės grupės
mitochondrijų kvėpavimo greičiui V3. Palyginus perfuzijos su 40 µM kocentracijos Pg-3-G rezultatus su
kontroline neišemine grupe pastebėta, kad mitochondrijų kvėpavimo greitis V3 sumažėjo panašiai kaip ir
išeminėje grupėje, o poveikio pradiniam mitochondrijų greičiui V0 nebuvo. Taigi, apibendrinant, nei 20
µM, nei 40 µM koncentracijos Cy-3-G ir Pg-3-G standartų tirpalai neturėjo poveikio mitochondrijų
pradiniam kvėpavimo greičiui V0, tačiau 40 µM Cy-3-G parodė patikimą trečios metabolinės būsenos
kvėpavimo greičio padidinimą. Dėl to, manoma, kad perfuzija 40 µM kocentracijos antocianinų tirpalais
galėtų apsaugoti širdies mitochondrijas nuo išemijos sukeltų oksidacinio fosforilinimo sistemos pažaidų.
Deguonies sunaudojimo greitis, nmol O 2/min/mg baltymo

600
600
20µM B V3
A
500
500 #
400
400
V0 V3
300 *
300 *
* *
* V0
200
200
100
100
0
0 Kontrolë Cy-3-G Pg-3-G Kontrolë Cy-3-G Pg-3-G
Kontrolë Cy-3-G Pg-3-G Kontrolë Cy-3-G Pg-3-G
Iðemija Iðemija
Iðemija Iðemija
14 pav. Širdies perfuzija 20 µM (A) ir 40 µM (B) Cy-3-G ir Pg-3-G neapsaugoja nuo išemijos sukeltų
mitochondrijų pažeidimų. Širdys buvo 15min perfuzuojamos su skirtingomis Cy-3-G ir Pg-3-G
koncetracijomis, poto buvo sukeliama 45min visiška širdies išemija (autolizė). Mitochondrijų kvėpavimo
greitis buvo matuojamas taip, kaip yra aprašyta metodinėje dalyje. Pradiniam mitochondrijų kvėpavimo
greičiui (V0) įvertinti, į terpę buvo dedama kvėpavimo substratų: 6mM malato ir 6mM piruvato. Trečios
metabolinės būsenos kvėpavimo greitis (V3) buvo pasiekiama, pridedant 1mM ADP. * - statistiškai
patikimi rezultatai, lyginant su kontroline neišemine grupe. # - statistiškai patikimas Cy-3-G efektas,
lyginant su kontroline išemine grupe.
36
3.3.2. Citochromo c kiekio kitimas išeminėse mitochondrijose
Kaip matoma 15 paveikslėlyje, po 45 min visiškos širdies išemijos mitochondrinio citochromo c

kiekis reikšmingai sumažėjo 12±1% (15 A pav.), o citozolinės frakcijos citochromo c kiekis išeminėse
širdyse reikšmingai padidėjo net 47±2% lyginant su kontroline grupe (15 B pav.). Mitochondrinio
citochromo c kiekio sumažėjimas išeminiame audinyje rodo, kad yra pažeista išorinė mitochondrijų
membrana ir, kad citochromas c yra išėjęs iš tarpmembraninės ertmės, todėl vertinant citochromo c kiekį
mitochondrijose ir citozolinėje frakcijoje, galima įvertinti pažaidos dydį, lygiai taip pat ir apsauginį efektą.
Matuojant citozolinės frakcijos ir mitochondrinio citochromo c kiekius išeminėse širdyse, kurios prieš tai
buvo perfuzuotos su 20 µM Cy-3-G, nebuvo pastebėta jokio skirtumo lyginant su kontroline išemine
grupe (15 pav.). Perfuzuojant su 20 µM Pg-3-G taip pat nepastebėta jokio reikšmingo efekto citochromo c
kiekio kitimams. Tai parodo, kad nei Cy-3-G, nei Pg-3-G neapsaugo širdies mitochondrijų nuo išemijos
sukelto citochromo c išėjimo iš mitochondrijų į citozolį.
Citochromo c kiekis, nmol/mg mitochondrinio baltymo
Citochromo c kiekis, nmol/mg citozolinio baltymo
2,3 1,0
A
A B
*
2,2 0,8
*
*
2,1 0,6
*
2,0 * * 0,4
1,9 0,2
Kontrolë Cy-3-G Pg-3-G Kontrolë Cy-3-G Pg-3-G
Iðemija Iðemija
15 pav. Širdies perfuzija su 20 µM Cy-3-G ir Pg-3-G neapsaugo nuo išemijos sukelto citochromo c
išejimo iš mitochondrijų į citozolį. A – mitochondrinio citochromo c koncentracija kontrolinėse ir
išeminėse širdies mitochondrijose. B – citozolinės frakcijos citochromo c koncentracija kontrolinėse ir
išeminėse širdies mitochondrijose. Širdys buvo perfuzuojamos 15min su Cy-3-G ar Pg-3-G, po to buvo
sukeliama 45min visiška išemija. Citochromo c koncentracija mitochondrijose ir citozolinėje frakcijoje
buvo matuojama naudojant ELISA rinkinį. * - statistiškai patikimas efektas, lyginant su kontroline grupe.
37
3.3.3. Kaspazės 3 aktyvumo kitimas citozolinėse frakcijose
Apoptozė yra genetiškai kontroliuojama ląstelių mirtis, kuri yra labai svarbi palaikant organizmo
ląstelių homeostazę. Esant tam tikroms širdies ir kraujagyslių ligoms, tokioms kaip širdies išeminė liga,
širdies nepakankamumas, aterosklerozė, hipertenzija (Kockx & Knaapen, 2000) yra aktyvuojami ląstelių
mirties keliai, vedantys į ląstelių apoptozę. Kadangi antocianinai yra stiprūs antioksidantai, jie kartu yra
labai reikšmingi kaip reduktoriai, todėl buvo tirtas galimas jų kaspazių aktyvaciją slopinantis poveikis, o
tuo pačiu ir išemijos sukeltos apoptozės blokuojantis efektas.
Neseniai publikuoti darbai parodė, kad citochromo c redokso būsena yra svarbi reguliuojant
kaspazių aktyvaciją ir, kad mitochondrijos gali reguliuoti į citoplazmą išėjusio citochromo c redukcijos
laipsnį (Borutaite & Brown, 2007). Atliktuose eksperimetuose su ląstelės mirties modeliu, paskelbta, kad
citochromą c redukuojantys cheminiai preparatai, tokie, kaip TMPD gali apsaugoti kardiomiocitus nuo
išemijos sukeltos kaspazių aktyvacijos perfuzuotose širdyse (Borutaite et al., 2007; Barauskaite et al.,
2011). Dėl to šiame tyrime susidomėta, ar panašų apsauginį efektą gali turėti ir kitos klasės citochromą c
redukuojantys komponentai – augaliniai pigmentai - antocianinai. Šiuo tikslu buvo pasirinkta tirti Cy-3-G
efektus, nes Cy-3-G turi didžiausią gebą redukuoti citochromą c in vitro iš mūsų tirtųjų antocianinų, bet
tuo pačiu ir neturi oksidacinį fosforilinimą atskirinčio efekto, kaip Dp-3-G . Cy-3-G efektai buvo palyginti
su Pg-3-G, kuris, kaip žinome, turi labai nedidelį citochromą c redukuojantį aktyvumą, poveikiu išemijos
sukeltų kaspazių aktyvacijai. Eksperimentų metu širdys buvo perfuzuojamos su 20 µM Cy-3-G arba 20
µM Pg-3-G 15 minučių, o tada buvo sukeliama 45 min visiška širdies išemija. Tam, kad įvertinti širdies
išemijos sukeltą apoptozę, fluorimetriškai buvo matuojamas kaspazės 3 substrato skilimo greitis.
Nustatyta, kad po širdies išemijos kaspazės 3 substrato skilimo greitis padidėja dvigubai lyginant su
neišemine kontroline grupe. (16 pav.)
Kada širdis buvo perfuzuojama su 20 µM Cy-3-G, išemijos sukelta kaspazių aktyvacija buvo
beveik visiškai slopinama: kaspazės 3 susbrato skilimo greitis išeminėje su Cy-3-G grupėje buvo
reikšmingai sumažėjęs ir praktiškai nebuvo jokio skirtumo nuo kontrolinės neišeminės grupės. Tuo tarpu,
širdies perfuzija su 20 µM Pg-3-G neapsaugojo nuo išemijos sukeltos kaspazių aktyvacijos, kadangi
kaspazės 3 substrato skilimo greitis išeminėje su Pg-3-G grupėje nesiskyrė nuo kontrolinės išeminės
grupės. Perfuzuojant sveikas širdis su 20 µM Cy-3-G ar Pg-3-G , jokių efektų kaspazės 3 aktyvumui
nepastebėta. Tai leidžia teigti, kad Cy-3-G apsaugojo nuo išemijos sukeltos kaspazių aktyvacijos
perfuzuotose širdyse ir priešingai, Pg-3-G - neapsaugojo. Manoma, kad Cy-3-G kaspazės 3 aktyvumą
38
slopinantis poveikis ir priešapoptozinis efektas pasireiškia dėl šio pigmento gebėjimo redukuoti
citochromą c. Tačiau negalime atmesti ir galimybės, jog Cy-3-G priešišeminis veikimas gali būti susijęs ir
su kitais mechanizmais, kaip, pavyzdžiui, tiesioginiu apoptosomos funkcijų slopinimu arba mitochondrijų
kvėpavimo greičio palaikymo po citochromo c išėjimo iš mitochondrijų į citozolį. Kitose studijose,
kuriose buvo atliekama ilgalaikė širdies perfuzija antocianinais, kaip pvz., 1 valandos laiko perfuzija Dp ir
taip pat flavonoidu miricetinu, parodė, kad apsauginis nuo išemijos/reperfuzijos sukeltų pažeidimų efektas
gali būti susijęs ir su mechanizmu, kuomet yra slopinamas signalo perdavimas ir transkripcijos faktoriaus
1 aktyvavimas (Scarabelli et al., 2009). Apsauginis veikimas, pateiktas anksčiau minėtoje studijoje, kaip ir
dar keliose kituose tyrimuose (Shin et al., 2006; de Pascual-Teresa et al., 2010) yra stebimas po ilgalaikio
gydymo antocianinais, o tuo tarpu mūsų atliktame tyrime 15 min perfuzija antocianinais buvo efektyvi,
apsaugant nuo širdies išemijos. Žinoma, skirtingi atocianinai gali turėti įvairius kardioprotekcinius
veikimus, priklausomai nuo jų stuktūrinių savybių, koncentracijos, gydymo trukmės, ląstelių rūšies ir
daugybės kitų aspektų.
Kaspazës-3 substrato skëlimo greitis, nmol/mg baltymo
18
16
* *
14
12
10 #
0
Kontrolë + Cy-3-G + Pg-3-G
Iðemija
16 pav. Širdies perfuzija Cy-3-G apsaugo nuo išemijos sukeltos kaspazės 3 aktyvacijos, bet perfuzija Pg-
3-G neapsaugo. Širdys buvo perfuzuojamos 15min su 20 µM Cy-3-G arba 20 µM Pg-3-G prieš sukeliant
45 min visišką širdies išemiją. Citozolinės širdies frakcijos buvo naudojamos kaspazės 3 aktyvumo
nustatymui, naudojant Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-Amido-4-metilkumariną, kaip kaspazės 3 substratą.*-
statistiškai patikimas efektas lyginant su kontroline grupe; # - statistiškai patikimas Cy-3-G efektas
lyginant su kontroline išemine grupe.
39
Apibendrinant visus gautus rezultatus yra nustatyta, kad Dp-3-G ir Cy-3-G yra greičiausią ir
tiesioginę citochromo c redukciją sukeliantys antocianinai, kita vertus kiti trys tirtieji – Pg-3-G, Mv-3-G ir
Pn-3-G – taip pat turi gebėjimą redukuoti citochromą c, tik jis yra žymiai silpnesnis nei pirmųjų dviejų
minėtų antocianinų. Tolimesniems tyrimams buvo pasirinkti trys antocianinai (Dp-3-G, Cy-3-G ir Pn-3-
G), tam, kad būtų galima palyginti skirtingų antioksidacinių savybių ir struktūrų antocianinų poveikius
mitochondrijų funkcijoms. Tiriant šių pigmentų poveikį mitochondrijų kvėpavimo greičiui ketvirtoje
metabolinėje būsenoje (esant atraktilozidui ir pridėjus egzogeninio citochromo c) įrodyta, kad Dp-3-G ir
Cy-3-G patikimai padidina šį greitį, o Pg-3-G tokio poveikio neturi. Manoma, kad šis efektas yra susijęs
su antocianinų redukcinės savybėmis bei jų cheminių struktūrų skirtumais. Širdies perfuzija su 20 µM Cy-
3-G apsaugojo nuo išemijos sukeltos kaspazės 3 aktyvacijos, o perfuzija su tokios pačios Pg-3-G
koncentracijos tirpalu buvo neefektyvi. Nustatytas Cy-3-G apsauginis poveikis yra labai svarbus veiksnys
ląstelių apoptozėje. Tad galime daryti prielaidą, kad antocianinų citochromą c redukuojantis aktyvumas
gali sietis su jų gebėjimu apsaugoti nuo kaspazių aktyvacijos. Nors nei Cy-3-G, nei Pg-3-G neturėjo jokio
poveikio išemijos sukeltam citochromo c išėjimui iš mitochondrijų, vis dėl to Cy-3-G sukeltas kaspazių
aktyvumo slopinimas įrodo, kad Cy-3-G gali būti labai svarbus veiksnys apoptosomos susidaryme ir
apoptozės kaskados reguliavime. Juk jau ne viename anksčiau minėtame straipsnyje įrodyta, kad
redukuotas citochromas c mažiau geba aktyvuoti kaspazes, nei jo oksiduota forma (Suto et al., 2005;
Borutaite et al., 2007). Taigi, šie rezultatai leidžia manyti, kad naturalūs augaliniai pigmentai taip pat gali
būti panaudojami prevencijai ar net gydymui nuo širdies ir kraujagyslių ligų, o taip pat ir gyvenimo
kokybės gerinimui. Tačiau norint būti tikriems dėl antocianinų veikimo mechanizmo ir jų sukeliamų
efektų, reikia toliau tyrinėti šiuos biologiškai aktyvius junginius ir išsiaiškinti, kuri cheminės struktūros
dalis yra atsakinga už polifenolinių junginių stipriausias citochromą c redukuojančias savybes ir, kurie
komponentai gali turėti praktinį pritaikymą slopinant žalingą apoptozinę ląstelių mirtį, esant įvairiems
patologiniems sutrikimams.
40
4. IŠVADOS
Šiame darbe buvo tirtas antocianinų, kaip biologiškai aktyvių junginių poveikis izoliuotų žiurkės
širdies mitochondrijų funkcijoms ir jų apsauginis mechanizmas išemijos sukeltiems pažeidimams bei šių
pigmentų antioksidacinių savybių stiprumas ir gebėjimas redukuoti egzogeninį citochromą c. Gautos
tokios išvados:
1. 20 µM Dp-3-G bei 20 µM ir 40 µM Cy-3-G ir Pg-3-G kocentracijų tirpalai neturėjo poveikio
mitochondrijų kvėpavimo greičiams antroje (V0) ir trečioje (V3) metabolinėse būsenose. 40 µM
Dp-3-G 53 % padidino mitochondrijų kvėpavimo greitį (V0) antroje metabolinėje būsenoje. 20 µM
Dp-3-G ir Cy-3-G 71% ir 30% atitinkamai stimuliuoja kvėpavimo greitį ketvirtoje metabolinėje
būsenoje esant egzogeniniam citochromui c. Pg-3-G neturėjo šio stimuliuojančio poveikio.
2. Dp-3-G ir Cy-3-G yra stiprūs citochromo c reduktoriai, sukeliantys greitą ir tiesioginę redukciją -
78% ir 54% po 6 min inkubacijos, atitinkamai. Kiti tirtieji antocianinai (Pg-3-G, Pn-3-G, Mv-3-G)
turi daug silpnesnį gebėjimą redukuoti egzogeninį citochromą c in vitro. Iš jų silpniausias
redukcines savybes turi Pg-3-G – po 6min inkubacijos redukavo 12%.
3. Tiriant skirtingų antocianinų poveikį širdies išemijos sukeltiems pažeidimams ir galimą apsauginį
mechanizmą, nustatyta, kad:
a. 45 min totalinė miokardo išemija 52% sumažino mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje
metabolinėje būsenoje (V3). 15 min širdies perfuzija su 20 µM Cy-3-G arba Pg-3-G
neapsaugojo nuo išemijos sukelto mitochondrijų kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje
būsenoje sumažėjimo. Tačiau 15 min perfuzija su 40 µM Cy-3-G atstatė trečios
metabolinės būsenos mitochondrijų kvėpavimo greitį iki kontrolinio lygio. 40 µM Pg-3-G
šio efekto neturėjo. 15 min perfuzija abiejų tirtųjų koncentracijų antocianinų tirpalais
neturėjo poveikio mitochondrijų kvėpavimo greičiui antroje metabolinėje būsenoje (V0).
b. Miokardo išemijos metu mitochondrijose esančio citochromo c kiekis reikšmingai
sumažėjo (12%), o citozolinės frakcijos citochromo c kiekis padidėjo net 47%. Širdies
perfuzija 20 µM Cy-3-G arba Pg-3-G neturėjo jokio reikšmingo poveikio citochromo c
kiekio kitimams mitochondrijose ir citozolinėse frakcijose.
c. Miokardo išemija du kartus padidino kaspazių aktyvaciją lyginant su kontroline grupe. 15
min širdies perfuzija 20 µM Cy-3-G apsaugojo nuo išemijos sukeltos kaspazių aktyvacijos,
41
sumažindama kaspazės 3 aktyvumą iki kontrolinio lygio. Priešingai, širdies perfuzija 20

µM Pg-3-G šio efekto neturėjo.
42
5. LITERATŪRA
1. Akhlaghi M, Bandy B. Mechanisms of flavonoid protection against myocardial ischemia–

reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 2009; 46(3):309-317. doi:10.1016/j.yjmcc.2008.12.003
2. Andallu B, Varadacharyulu NC. Antioxidant role of mulberry (Morus indica L.cv. Anantha) leaves
in streptozotocin-diabetic rats. Chin Chim acta 2003; 383:3-10.
3. Andersen ØM, Jordheim M. The Anthocyanins. In Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and
Applications, Andersen ØM, Markham KR, Eds., CRC Press: Boca Raton, 2006; pp 471–553.
4. Andres-Lacueva C, Shukitt-Hale B, Galli RL, Jauregui O, Lamuela-Raventos RM, Joseph JA.
Antocyanins in aged blueberry-fed rats are found centrally and mau enchance memory. Nutr
Neurosci 2005; 8:111-20.
5. Bagchi S, Goyal SP, Sarkar K. Niche relationships of an ungulate assemblage in a dry tropical
forest. Journal of Mammalogy, 2003; 84: 981-988.
6. Barauskaite J, Grybauskiene R, Morkuniene R, Borutaite V, Brown CG.
Tetramethylphenylenediamine protects the isolated heart against ischaemia-induced apoptosis and
reperfusion-induced necrosis. Br J Pharmacol 2011; 162:1136-1142.
7. Belleville J. The French Paradox: possible involvement of ethanol in the protective effect against
cardiovascular diseases, Nutrition 18. 2002; 173-177.
8. Berthonneche C, Toufektsian MC, Tanguy S, Ghezzi C, de Leiris J, Boucher F. Does nitric oxide
contribute to progressive cardiac tissue damage and dysfunction after infarction? Antioxidants &
Redox Signaling. 2007; 9(6):757-763.
9. Bjorøy Ø, Fossen T, Andersen ØM. Anthocyanin 3-galactosides from Cornus alba ‘Sibirica’ with
glucosidation of the B-ring. Phytochemistry. 2007; 68, 640–645.
10. Bloor SJ, Abrahams S. The structure of the major anthocyanin in Arabidopsis thaliana.
Phytochemistry, 2002; 59, 343–346.
11. Borutaite V, Brown GC. Mitochondrial regulation of caspase activation cytochrome oxidase and
tetramethylphenylenediamine via cytosolic cytochrome c redox state. J Biol Chem, 2007;
282:31124–31130.
12. Borutaite V, Morkuniene R, Arandarcikaite O, Jekabsone A, Barauskaite J, Brown GC. Nitric
oxide protects the heart from ischemia-induced apoptosis and mitochondrial damage via protein
43
kinase G mediated blockage of permeability transition and cytochrome c release. J Biomed Sci.
2009 Aug 11;16:70.
13. Borutaite V. Mitochondria as decision-makers in cell death. Environ Mol Mutagen 2010;
51(5):406-416. doi:10.1002/em.20564
14. Brown GC. Nitric oxide and mitochondria. Front Biosci. 2007. 12:1024–1033.
15. Cao G, Muccitelli HU, Sanchez-Moreneo C, Prior RL. Anthocyanins are absorbed in glycated
forms in elderly women: a pharmacokinetic study. Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73, 920–926.
16. Cerveny KL, Tamura Y, Zhang Z, Jensen RE, Sesaki H. Regulation of mitochondrial fusion and
division. Trends Cell Biol. 2007; 17: 563–569
17. Chan DC. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2006; 22, 79-
99.
18. Chen XJ, Butow RA. The organization and inheritance of the mitochondrial genome. Nat Rev
Genet. 2005; 6: 815-825.
19. Chun OK, Chung SJ, Song WO. Estimated Dietary Flavonoid Intake and Major Food Sources of
U.S. Adults. J Nutr. 2007; 137(5):1244-1252.
20. Clifford MN, Brown JE. Dietary Flavonoids and Health – Broadening the Perspective. In
Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications; Andersen ØM, Markham KR, Eds., CRC
Press: Boca Raton, 2006; pp 319–370.
21. De Lorgeril M, Salen P. Modified Cretan Mediterranean diet in the prevention of coronary heart
disease and cancer: an update. World Rev Nutr Diet. 2007; 97:1-32
22. De Pascual-Teresa S, Moreno DA and Garcia-Viguera C. Flavanols and anthocyanins in
cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 2010; 11(4):1679-1703.
doi:10.3390/ijms11041679
23. De Pascual-Teresa S, Santos-Buelga C, Rivas-Gonzalo JC. Quantitative analysis of flavan-3-ols in
Spanish foodstuffs and beverages. J. Agric. Food Chem. 2000; 48, 5331–5337.
24. Di Lisa F, Bernardini P. Mitochondria and ischemia – reperfusion injury of the heart: fixing a hole.
Cardiovascular research, 2006; 70, p.191-199
25. Dorta DJ, Pigoso AA, Mingatto FE, Rodrigues T, Prado IM, Helena AF, Uyemura SA, Santos AC,
Curti C. Antioxidant activity of flavonoids in isolated mitochondria. Phytother Res. 2008 Sep;
22(9): 1213-8.
44
26. Estruch R, Amrtinez-Gonzalez MA, Corella D, Salas-Salvado J, Ruiz-Gutierrez V, Covas MI, Fiol
M, Gomez-Gracia E, Lopez-Sabater MC et al. PREMIMED study Investigators. Effects of a
Mediterranean-style diet on cardiovascular risk factors: a randomized trial. Ann Intern Med.
2006;145:1-11.
27. Falchi M, Bertelli A, Lo Scalzo R, Morassut M, Morelli R, Das S, Cui J, Das DK. Comparison of
Cardioprotective Abilities between the Flesh and Skin of Grapes. J Agric Food Chem. 2006;
54:6613-6622. doi:10.1021/jf061048k
28. Fleschhut J, Kratzer F, Rechkemmer G, Kulling SE. Stability and biotransformation of various
dietary anthocyanins in vitro. Eur J Nutr, 2006; 45(1):7-18. doi: 10.1007/s00394-005-0557-8
29. Forester SC, Waterhouse AL. Gut metabolites of anthocyanins, gallic acid, 3-O-methylgallic acid,
and 2,4,6-trihydroxybenzaldehyde, inhibit cell proliferation of Caco-2 cells. J Agric Food Chem.
2012; 58 (9):5320-7
30. Galvano F, La Fauci L, Lazzarino G, Fogliano V, Ritieni A, Ciappellano S, Battistini NC, Tavazzi
B, Galvano G. Cyanidins: metabolism and biological properties. J Nutr Biochem. 2004; 15:2-11.
doi:10.1016/j.jnutbio.2003.07.004
31. Garrido C, Galluzi L, Brunet M, Puiq PE, Didelot C, Kroemer G. Mechanisms of cytochrom c
release from mitochondria. Cell Death Differ, 2006 Sep; 13(9): 1423-33.
32. Garrido C, Galluzzi L, Brunet M, Puig PE, Didelot C, Kroemer G. Mechanisms of cytochrome c
release from mitochondria. Cell Death and Differentiation. 2006; 13, 1423–1433.
doi:10.1038/sj.cdd.4401950;
33. Glinska S, Bartczak M, Oleksiak S, Wolska A, Gabara B, Posmyk M, Janas K. Effects of
anthocyanin-rich extract from red cabbage leaves on meristematic cells of Allium cepa L. roots
treated with heavy metals. Ecotoxicol. Environment. Safety, 2007; 68(3): 343–350.
34. Gornal AG, Bardavill GJ, David MM. (1949). J Biol Chem. 177, 751-766.
35. Gould KS, Lee DW. Anthocyanins in leaves. In Advances in Botanical Research, 37, Callow, J.
A., Ed., Academic Press: Amsterdam, 2002.
36. Gould KS. Nature‘s Swiss army knife: the diverse protective roles of anthocyanins in leaves.
J.Biomed. Biotechnol. 2004; 5, 314-320.
37. Hancock JT, Desikan R, Neill SJ. Does the redox status of cytochrome C act as a fail-safe
mechanism in the regulation of programmed cell death? Free Radic Biol Med. 2001; 31:697–703.
45
38. He J, Magnuson BA, Lala G, Tian Q, Schwartz SJ, Giusti MM. Intact anthocyanins and
metabolites in rat urine and plasma after 3 months of anthocyanin supplementation. Nutr. Cancer
2006, 54, 3–12.
39. Heinonen M. Antioxidant activity and antimicrobial effect of berry phenolics-a Finnish
perspective. Mol Nutr Food Res. 2007; 51(6):684-691. doi:10.1002/mnfr.200700006
40. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000 Oct 12;407(6805):770-6.
41. Heo SI, Jin YS, Jung MJ, Wang MH. Antidiabetic properties of 2,5-dihydroxy-4,3’-di(beta-D-
glucopyranosyloxy)-trans-stilbene from mulberry (morus bombycis koidzumi) root in
streptozotocin-indueced diabetic rats. J Med Food 2007; 10:602-7
42. Hollman PC, Katan MB. Dietary flavonoids: intake, health effects and bioavailability. Food &
Chemical Toxicology, 2004; 37, 937–942.
43. Hou DX, Ose T, Lin S, Harazoro K, Imamura I, Kubo M, Uto T, Terahara N, Yoshimoto M, Fujii
M. Antocyanidins induce apoptosis in human prolyelocytic leukemia cells: Structure-activity
relationship and mechanisms involved. Int. J. Oncol. 2003; 23, 705-712.
44. Hsieh SR, Tsai DC, Chen JY, Tsai SW, Liou YM. Green teat extract protects rats against
myocardial infarction associated with left anterior descending coronory artery ligation. Pflugers
Arch. Eur J Physiol. 2009; 458:631-642
45. Ichiyanagi T, Terahara N, Rahman MM, Konishi T. Gastrointestinal uptake of nasunin, acylated
anthocyanin in eggplant. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 5306–5312.
46. Ikizler M, Erkasap N, Dernek S, Kural T, Kaygisiz Z. Dietary polyphenol quercetin protects rat
hearts during reperfusion: enhanced antioxidant capacity with chronic treatment. Anadolu
Kardiyol Derg. 2007 Dec;7(4):404-10.
47. Jankowski A, Jankowska B, Niedworok J. The effect of anthocyanin dye from grapes on
experimental diabetes. Folioa Med Cracov. 2000; 41(304):5-15.
48. Jekabsone A, Ivanoviene L, Brown GC, Borutaite V. 2003. Nitric oxide and calcium together
inactivate mitochondrial complex l and induce cytochrome c release. J Mol Cell Cardiol 35:803–
809.
49. Jennings PH, Brannaman BL, Zoheille FP. Peroxidase and polyphenoloxidase activity associated
with Helminthosporium leaf spot of maize. Phytopathology 1969; 59:963-967.
50. Jeong SY, Seol DW. The role of mitochondria in apoptosis. BMB Rep. 2008 Jan 31;41(1):11-22.
Review.
46
51. Jeremy P E Spencer. The impact of flavonoids on memory: physiological and molecular
considerations. Chemical Society reviews, 2009; 38(4):1152-61.
52. Jordeim M, Mage F, Andersen ØM. Anthocyanins in Berries of Ribes Including Gooseberry
Cultivars with a High Content of Acylated Pigments. J. agric. Food Chem., 2007, 55 (14), pp
5529-5535
53. Kalea AZ, Reiniger N, Yang H, Arriero M. Alternative splicing of the murine receptor for
advanced glycation end-products (RAGE) gene. FASEB j 2009; 23: 1766-1774
54. Kamei H, Kojima T, Hasegawa M, Koide T, Umeda T, Yukawa T, Terabe K. Suppression of
tumor cell growth by anthocyanins in vitro. Cancer Invest. 1995, 13, 590-594.
55. Kockx MM, Knaapen MW. The role of apoptosis in vascular disease. J Pathol. 2000 Feb;
190(3):267-80
56. Kong JM, Chia LS, Goh NK, Chia TF, Brouillard R. Analysis and biological activities of
anthocyanins. Phytochemistry, 2003; 64:923-933. doi:10.1016/S0031-9422(03)00438-2
57. Kris-Etherton PM, Etherton TD, Carlson J, Gardner C. Recent discoveries in inclusive food-based
approaches and dietary patterns for reduction in risk for cardiovascular disease. Curr Opin Lipidol.
2002;13:397-407.
58. Kurilich AC, Clevidence BA, Britz SJ, Simon PW, Novotny JA. Plasma and urine responses are
lower for acylated vs nonacylated anthocyanins from raw and cooked purple carrots. J. Agric.
Food Chem. 2005, 53, 6537–6542.
59. Kuriyma S. The relation between green tea consumption and cardiovascular disease as evidenced
by epidemiological studies. J Nutr. 2008; 138:1548S-1553S
60. Lazze MC, Pizzala R, Perucca P, Cazzalini O, Savio M, Forti L, Vannini V, Bianchi L.
Anthocyanidins decrease endothelin-1 production and increase endothelial nitric oxide synthase in
human endothelial cells. Mol Nutr Food Res. 2006; 50:44-51. doi:10.1002/mnfr.200500134
61. Lazze MC, Savio M, Pizzala R, Cazzalini O, Perucca P, Scovassi AI, Stivala LA, Bianchi L.
Anthocyanins induce cell cycle perturbations and apoptosis in different human cell lines.
Carcinogenesis. 2004; 25(8):1427-1433. doi:10.1093/carcin/bgh138
62. Lebuffe G, Schumacker PT, Shao ZH, Anderson T, Iwase H, Vanden Hoek TL. ROS and NO
trigger early preconditioning: relationship to mitochondrial KATP channel. Am. J. Physiol. Heart
Circ. Physiol. 284, 2003; H299-H308.
47
63. Lenaz G. Mitochondria and reactive oxygen species. Which role in physiology and pathology?
Adv Exp Med Biol. 2012; 942:93-136.
64. Liobikas J, Trumbeckaite S, Bendokas V, Baniulis D, Majiene D, Kopustinskiene DM, Siksnianas
T, Anisimoviene N. Pro-apoptotic effect of black currant (Ribes nigrum L.) berry extracts on rat
heart mitochondria (in Lithuanian). Zemdirbyste-Agriculture. 2009; 96(3):149-157.
65. Lorenz M, Hellige N, Rieder P. Positive inotropic effects of epigallocatechin-3-gallate (EGCG)
involve activation of Na/H and Na/Ca exchanges. Eur J Heart Fail. 2008; 10:439-445
66. Manach C, Scalbert A, Morand C, Rémésy C, Jiménez L. Polyphenols: food sources and
bioavailability. Am. J. Clin. Nutr. 2004; 79, 727–747.
67. Martin S, Giannone G, Andriantsitohaina R, Martinez CM. Delphinidin, an active compound of
red wine, inhibits endothelial cell apoptosis via nitric oxide pathway and regulaton of calcium
homeostasis. Brit J of Pharm. 2003; 139, 1095-1102. Doi:10.1038/sj.bjp.0705347
68. Mazza G, Kay CD, Cottrell T, Holub BJ. Absorption of anthocyanins from blueberries and serum
antioxidant status in human subjects. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 7731-7737.
69. McBridge HM, Neuspiel M, Wasiak S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Curr. Biol.
2006; 16, 551-560.
70. Meier P, Finch A, Evan, G. Apoptosis in development. Nature. 2000; 407(6805): 796-801.
71. Modun D, Music I, Katalinic V, Salamunic I, Boban M. Comparison of protective effects of
catechin applied in vitro and in vivo on ischemia-reperfusion injury in the isolated rat hearts. Croat
Med J. 2003 Dec;44(6):690-6.
72. Moncada S. Mitochondria as pharmacological targets. British journal of pharmacology, 2012; 160,
217-219.
73. Mukamal KJ, Maclure M, Muller JE, Sherwood JB, Mittleman MA. Tea consumption and
mortality after acute myocardial infarction. Circulation. 2002; 105:2476-2481
74. Mullen W, Edwards CA, Serafani M, Crozier A. Bioavailability of pelargonidin-3-O-glucoside
and its metabolites in humans following the ingestion of strawberries with and without cream. J.
Agric, Food Chem. 2008, 56, 713-719.
75. Niidome T, Takahashi K, Goto Y, Goh S, Tanaka N, Kamei K. Mulberry leaf extract prevents
amyloid beta-peptide fibril formation and neurotoxicity. Neurureport 2007; 18:813-6.
48
76. Norton C, Kalea AZ, Harris PD, Klimis-Zacas DJ. Wild blueberry-rich diets affect the contractile
machinery of the vascular smooth muscle in the Sprague-dawley rat. Journal of Medicinal Food,
2005; 8(1): 8-13. doi: 10.1089/jmf.2005.8.8.
77. Ow YL, Green DR, Hao Z, Mak TW. Cytochrome c: functions beyond respiration. Nature
Reviews Molecular cell Biology 9, 532-542. Doi: 10.1038/nrm2434
78. Passamonti S, Vrhovsek U, Mattivi F. The interaction of anthocyanins with bilitranslocase.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 296, 631–636.
79. Passamonti S, Vrhovsek U, Vanzo A, Mattivi F. Fast access of some grape pigments to the brain.
J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 7029–7034.
80. Passamonti S, Vrhovsek U, Vanzo A, Mattivi F. The stomach as a site for anthocyanins absorption
from food. FEBS Lett. 2003, 544, 210–213.
81. Pinton P, Giorgi C, Siviero R, Zecchini E, Rizzuto R.. Calcium and apoptosis: ER-mitochondrial
Ca21 transfer in the control of apoptosis. Oncogene. 2009; 27:6407–6418.
82. Pollard TD, Blanchoin L. Hydrolysis of ATP by Polymerized Actin Depends on the Bound
Divalent Cation but Not Profilin. Biochemistry, 2002; 41(2), 597-602. Doi: 10.1021/bi0112114b
83. Posmyk M, Janas K. Red cabbage anthocyanin extract alleviates copper-induced cytological
disturbances in plant meristematic tissue and human lymphocytes. Biometals. 2009; 22:479-490.
doi 10.1007/s10534-009-9205-8
84. Prior RL and Wu X. Anthocyanins: Structural characteristics that result in unique metabolic
patterns and biological activities. Free Radic Res, 2006; 40(10):1014-1028.
doi:10.1080/10715760600758522
85. Prior RL, Wu X, Schaich K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity
and phenolics in foods and dietary supplements. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 4290–4302.
86. Proteggente AR, Pannala AS, Paganga G, Buren L, Wagner E, Wiseman S, Put F, Dacombe C,
Rice-Evans CA. The antioxidant activity of regularly consumed fruit and vegetables reflects their
phenolic and vitamin c composition. Free radical research, 2002, Vol. 36, No.2: p. 217-233. doi:
10.1080/10715760290006484
87. Puupponen-Pimia R, Nohynek L, Meier C, Kahkonen M, Heinonen M, Hopia A, Oskman-
Caldentey KM. Antimicrobial properties of phenolic compouns frm berries. Journal of applied
Microbiology, 2001; 90, 494-507.
49
88. Rakauskaitė G, Liobikas J. “Ben Lomond” juodųjų serbentų veislės skirtingo sunokimo uogų
antocianinų turtingų ekstraktų poveikis žiurkės kepenų mitochondrijų funkcijoms. Konferencijos,
skirtos „Studentų mokslinės veiklos skatinimo“ projekto rezultatų pristatymui, pranešimų tezės,
Vilnius, 2011m. kovo 18-19d. p. 246
89. Scarabelli TM, Marotto S., Abdel-Azeim S, Shoji K, Darra E, Stephanou A, chen-Scarabelli,
Marechal JD, Knight R, Ciampa A, Saravolatz L, Carcereri de Prati A, Yuan Z, Cavalieri E,
Menegazzi M, Latchman D, Pizza C, Perahia D, Suzuki H. Targeting STAT1 by myricetin and
delphinidin provides effcicient protection of the heart from ischemia/reperfusion-induced injury.
FEBS Lett 2009; 583:531-541.
90. Sener G, Sener E, Sehirli O, Oğünç AV, Cetinel S, Gedik N, Sakarcan A. Ginkgo biloba extract
ameliorates ischemia reperfusion-induced renal injury in rats. Pharmacol Res. 2005 Sep;
52(3):216-22.
91. Shin WH, Park SJ, Kim EJ. Protective effect of anthocyanins in middle cerebral artery occulusion
and reperfusion model of cerebral ischemia in rats. Life Sci 2006; 79:130-7.
92. Silva MM, Santos MR, Caroco G, Rocha R, Justino G, Mira L. Stucture-antioxidant activity
relationships of flavoniods: a reexamination. Free Radic Res. 2002 Nov; 36(11):1219-27.
93. Skemiene K, Liobikas J, Trumbeckaite S, Bendokas V, Siksnianas T, Anisimoniene N, Majiene D.
The effect of anthocyanin-rich extracts from b;ack currant berries and of pure standart
anthocyanins on mitochondrial functions. Thesis of XI International meeting of Lithuanian
Biochemical society „LBD 50”, 15-17 June, 2010a Tolieja, Moletai region; p.56
94. Škėmienė K, Liobikas J, Trumbeckaitė S, Borutaitė V. Antocianinai kaip citochromo c reduktoriai.
3-iosios nacionalinės mokslinės konferencijos „Mokslas-žmonių sveikatai“ pranešimų tezės,
Kauno medicinos universitetas; mokslinis organizacinis komitetas; 2010b; p.41.
95. Slimestad R, Solheim H. Anthocyanins from Black currants (Ribes nigrum L.). Journal of
Agricultural and Food Chemistry. - 2002, vol.50, No.11, p.3228-3231
96. Sun AY, Simonyi A, Sun GY. The “French Paradox” and beyond: neuroprotective effects of
polyphenols(1,2), Free Radic. Biol.Med. 15. 2002; 314-318.
97. Suto D, Sato K, Ohba Y, Yoshimura T, Fuji J. Suppression of the proapoptotic function of
cytochrome c by singlet oxygen via a heme redox state-independent mechanism. Biochem J. 2005;
392:399–406.
50
98. Suto D, Sato K, Ohba Y, Yoshimura T, Fuji J. Suppression of the proapoptotic function of
cytochrome c by singlet oxygen via a heme redox state-independent mechanism. Biochem J, 2005;
392:399–406.
99. Talavera S, Felgines C, Texier O, Besson C, Manach C, Lamaison JL, Remesy C. Anthocyanins
are efficiently absorbed from the small intestine in rats. J. Nutr. 2004, 134,2275–2279.
100. Talavera S, Felgines C, Texier O, Besson C, Mazur A, Lamaison JL, Remesy C.
Bioavailability of a bilberry anthocyanin extract and its impact on plasma antioxidant capacity in
rats. J. Sci. Food Agic. 2006, 86, 90–97.
101. Toleikis A, Trumbeckaite S, Majiene D. Cytochrome c effect on respiration of heart
mitochondria: influence of various factors. Bioscience Reports, 2005; vol.25, No. 5-6, p.387-397
102. Toleikis AI, Dzeja PP, Prashkyavicius AK, Yanushkevicius Z. Functional state and the
mechanisms of mitochondrial injury of ischemic heart. Sov. Med. Rev. A. Cardiol. 1989. V. 2. P.:
95-132.
103. Toufektsian MC, de Lorgeril M, Nagy N, Salen P, Donati MB, Giordano L, Mock HP,
Peterek S, Matros A, Petroni K, Pilu R, Rotilio D, Tonelli C, de Leiris J, Boucher F, Martin C.
Chronic dietary intake of plant-derived anthocyanins protects the rat heart against ischemia-
reperfusion injury. J Nutr. 2008 Apr; 138(4):747-52.
104. Tsuda T, Horio F, Osawa T. Absorption and metabolism of cyanidin 3-O-beta-D-glucoside
in rats. FEBS Lett. 1999, 449, 179–182.
105. Tsuda T, Horio F, Osawa T. Absorption and metabolism of cyanidin 3-O-beta-D-glucoside
in rats. FEBS Lett. 1999, 449, 179–182.
106. Urpi-Sarda M, Monagas M, Khan N, Lamuela-Raventos RM, SantosBuelga C, Sacanella
E, Castell M, Permanyer J, Andres-Lacueva C. Effect of cocoa powder in the prevention of
cardiovascular disease: biological, consumption and inflammatory biomarkes. Anal. Bioanal.
Chem. 2009; 394, 1545.
107. Van Beek TA, Montoro P. Chemical analysis and quality control of Ginko biloba leaves,
extracts, and phytopharmaceuticals. J Chromatogr A, 2009 Mar 13; 1216(11):2002-32. Epub 2009
Jan 15.
108. Wang L, Zhang ZG, Zhang RL, Jiao ZX, Wang Y, Pourabdollah-Nejad DS, Letourneau Y,
Gregg SR, Chopp M. Neurogenin 1 mediates erythropoietin enhanced differentiation of adult
neural progenitor cells. J Cereb Blood Flow Metab. 2006;26:556–564
51
109. Wang LS, Sun XD, Cao Y, Wang L, Li FJ, Wang YF. Antioxidant and pro-oxidant
properties of acylated pelargonidin derivatives extracted from red radish (Raphanus sativus
var.niger, Brassicaceae). Food Chem Toxicol. 2010; 48(10):2712-2718.
doi:10.1016/j.fct.2010.06.045
110. Wang SY, Feng R, Bowman L, Penhallegon R, Ding M, Lu Y. Antioxidant Activity in
Lingonberries (Vaccinium vitis-idaea L.) and Its Inhibitory Effect on Activator Protein-1, Nuclear
Factor-kappaB, and Mitogen-Activated Protein Kinases Activation. J Agric Food Chem. 2005;
53(8):3156-3166. doi:10.1021/jf048379m
111. Williams CA, Grayer RJ. Anthocyanins and other flavonoids. Nat. Prod. Rep., 2004; 21,
539–573.
112. Wu X, Beecher GR, Holden JM, Haytowitz DB, Gebhardt SE, Prior RL. Concentrations of
anthocyanins in common foods in the United States and estimation of normal consumption. J.
Agric. Food Chem. 2006, 54, 4069–4075.
113. Yeh CT and Yen GC. Induction of Apoptosis by the Anthocyanidins through Regulation
ofBcl-2 Gene and Activation of c-Jun N-Terminal Kinase Cascade in Hepatoma Cells. J Agric
Food Chem. 2005; 53:1740-1749. doi:10.1021/jf048955e
114. Yoshimoto M, Okuno S, Yoshinaga M, Yamakawa O, Yamaguchi M, Yamada J.
Antimutagenicity of sweetpotato (Ipomoea batatas) roots. Biosci Biotechnol Biochem. 1999;
63(3):536–41.
115. Zafra-Stone S, Yasmin T, Bagchi M, Chatterjee A, Vinson JA, Bagchi D. Berry
anthocyanins as novel antioxidants in human health and disease prevention. Mol Nutr Food Res,
2007; 51(6):675-683. doi:10.1002/mnfr.200700002
116. Zamora-Ros R, Andres-Lacueva C, Lamuela-Raventos RM, Berenguer T, Jaksyn P,
Barricarte A, Ardanaz E, Amiano P, Dorronsoro M, Larranaga N, Martinez C, Sanchez MJ,
Navarro C, Chirlaque MD, Tormo MJ, Quiros JR, Gonzalez CA. Estimation of dietary sources and
flavonoid intake in a Spanish adult population (EPIC-Spain). J Am Diet Assoc. 2007; 110(3):390-
398. doi:10.1016/j.jada.2009.11.024
117. Zern TL, Wood RJ, Greene C, West KL, Liu Y, Aggarwal D, Schachter NS, Fernandez
ML. Grape Polyphenols Exert a Cardioprotective Effect in Pre- and Postmenopausal Women by
Lowering Plasma Lipids and Reducing Oxidative Stress. J Nutr. 2005; 135(8):1911-1917.
52
118. Zern TL, Wood RJ, Greene C, West KL, Liu Y, Aggarwal D, Schachter NS, Fernandez
ML. Grape Polyphenols Exert a Cardioprotective Effect in Pre- and Postmenopausal Women by
Lowering Plasma Lipids and Reducing Oxidative Stress. J Nutr. 2005; 135(8):1911-1917.
119. Zuzarte-Luis V, Hurle JM. Programmed cell death in the developing limb. Int J Dev Biol,
2002; 46(7): 871-6.
53
PADĖKA
Norėčiau padėkoti visiems padėjusiems ir prisidėjusiems, ruošiant šį magistrinį darbą. Ačiū Jums,
mieli draugai, kolegos!
Pirmiausia, esu dėkinga savo darbo vadovui dr. Juliui Liobikui už patarimus, pastabas ir išugdytą
savarankiškumą. Dėkoju doktorantei Kristinai Škėmienei už kantrybę, perteikiant mokslinę ir
ekperimentinę patirtį, visokeriopą pagalbą renkat, apdorojant duomenis bei padrąsinimus eiti pirmyn.
Dėkoju dr. Giedrei Baliūtytei už nuoširdžius patarimus ir pagalbą eksperimentų metu. Taip pat esu
dėkinga visam Neuromokslų Instituto, Biochemijos laboratorijos kolektyvui, ypač vedėjai prof. dr.
Vilmantei Borutaitei, už tai, kad suteikė man galimybę atlikti mokslinį - magistrinį darbą, kad kolektyvas
visada draugiškai priėmė, dalinosi gera nuotaika, meile mokslui ir savo patirtimi.
Esu dėkinga savo Mamai už suteiktą galimybę studijuoti, nuoširdų palaikymą ir supratimą.

Priešišeminis Antocianinų Poveikis Žiurkės Širdies Mitochondrijoms

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Priešišeminis Antocianinų Poveikis Žiurkės Širdies Mitochondrijoms

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

PRIEŠIŠEMINIS ANTOCIANINŲ POVEIKIS ŽIURKĖS ŠIRDIES

Magistro baigiamasis darbas

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...........................................................................................................8

1. LITERATŪROS APŽVALGA ..................................................................................................................9

1.1. Antocianinai .........................................................................................................................................9

1.1.1. Struktūra, paplitimas .....................................................................................................................9

1.1.2. Antocianinų veikimas ir biologinės savybės ...............................................................................12

1.1.3. Antocianinų absorbcija ir metabolizmas .....................................................................................14

1.2. Mitochondrijų struktūra ir jų funkcijos ..............................................................................................16

1.3. Išemija ir jos įtaka mitochondrijų funkcijai ir struktūrai ...................................................................19

1.4 Apoptozė ir mitochondrijos ................................................................................................................21

2.1. Eksperimentiniai gyvūnai ..................................................................................................................24

2.3. Mitochondrijų išskyrimas ..................................................................................................................24

2.4. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu ...............................................................24

2.5. Širdies perfuzija bei išemijos sukėlimas ............................................................................................25

2.6. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas ...............................................................................25

2.7. Citochromo c redukcijos nustatymas .................................................................................................26

2.8. Kaspazės 3 aktyvumo matavimas .....................................................................................................26

2.9. Mitochondrinio ir citozolinio citochromo c kiekio matavimas..........................................................26

2.10. Statistinė duomenų analizė ..............................................................................................................27

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS .......................................................................................................27

3.1. Antocianinų poveikis mitochondrijų funkcijoms...............................................................................29

3.1.1. Antocianinų poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams........................................................29

3.1.2. Citochromo c efektas ...................................................................................................................30

3.2. Citochromo c redukcija antocianinais ................................................................................................32

3.2.1. Antocianinų efektas citochromo c redukcijos būsenai ................................................................32

3.3. Perfuzija ir išemija .............................................................................................................................34

3.3.2. Citochromo c kiekio kitimas išeminėse mitochondrijose ...............................................................36

3.3.3. Kaspazės 3 aktyvumo kitimas citozolinėse frakcijose ................................................................37

G.Rakauskaitė. Magistro baigiamasis darbas - Priešišeminis antocianinų poveikis žiurkės širdies

G.Rakauskaite. Master thesis – Anti-Ischaemic effect of anthocyanins on rat heart mitochondria/

ADP – adenozino 5’ - difosfatas

Širdies ir kraujagyslių ligos yra viena pagrindinių komplikacijų ir padidėjusio mirtingumo

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

1.1.1. Struktūra, paplitimas

1. pav. Pagrindinė cheminė antocianidinų struktūra

β – D – gliukopiranozė β – D – galaktopiranozė – L – ramnopiranozė

2 pav. Pagrindinės angliavandenių molekulės randamos antocianinų struktūrose

1.1.2. Antocianinų veikimas ir biologinės savybės

1.1.3. Antocianinų absorbcija ir metabolizmas

1.2. Mitochondrijų struktūra ir jų funkcijos

Tarpmembraninė erdvė ATP sintazė

I kompleksas II kompleksas III kompleksas IV kompleksas

5 pav. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės struktūra. Kvėpavimo grandinė sudaryta iš 4

Oksidacinis fosforilinimas yra dviejų procesų – substratų oksidacijos ir ADP fosforilinimo

1.3. Išemija ir jos įtaka mitochondrijų funkcijai ir struktūrai

15 min. Glikolizė ↑ 60 min. Glikolizė lėtėja ir sustoja ↓

GRĮŽTAMI PAŽEIDIMAI NEGRĮŽTAMI PAŽEIDIMAI

1.4 Apoptozė ir mitochondrijos

2.1. Eksperimentiniai gyvūnai

Delfinidino-3-O-, cianidino-3-O-, pelargonidino-3-O-, peonidino-3-O- ir malvidino-3-O-

2.3. Mitochondrijų išskyrimas

Širdies mitochondrijų išskyrimas. Mitochondrijos buvo izoliuotos diferencinio centrifugavimo

2.4. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu

2.5. Širdies perfuzija bei išemijos sukėlimas

2.6. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas

Mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo registruojamas, naudojant oksigrafinę sistemą Oxygraph-

2.7. Citochromo c redukcijos nustatymas

Citochromo c redukcija buvo matuojama spektrofotometriškai, naudojant Helios (Thermo

2.8. Kaspazės 3 aktyvumo matavimas

2.9. Mitochondrinio ir citozolinio citochromo c kiekio matavimas

Citochromo c kiekis mitochondrijose ir citozolinėje frakcijoje buvo nustatomas naudojant