Chương 5

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

5.1 Phương pháp truyền thống
Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác
nhau như đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, định lượng gián tiếp thông qua
mức độ cản ánh sáng (độ đục), đếm số khuẩn lạc mọc trên một môi trường xác định, định
lượng một cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (phương pháp MPN)...
5.1.1 Phương pháp đếm tế bào qua kính hiển vi
Có hai cách đếm trực tiếp qua kính hiển vi, hoặc mẫu được làm khô (cố định) trên
lam kính trước khi đếm, hoặc sử dụng các buồng đếm đặc biệt dùng cho các mẫu dạng
lỏng. Về bản chất buồng đếm là những lam kính trên có khắc rãnh phân thành mạng lưới
các ô vuông cực nhỏ có kích thước xác định. Trên mỗi ô vuông giữa lam kính và lamel là
một thể tích xác định, tuy nhỏ nhưng rất chính xác. Đếm số tế bào trên các ô dưới kính hiển
vi và nhân với thể tích tương ứng có thể qui ra số tế bào vi sinh vật trong 1 ml mẫu.
Phương pháp đơn giản này cho phép đánh giá nhanh số tế bào vi sinh vật có trong
mẫu thử, song nó có một số hạn chế sau:
- Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết.
- Những tế bào nhỏ khó nhìn dưới kính hiển vi và có thể bị sót khi đếm.
- Khó đạt độ chính xác cao.
- Cần có kính hiển vi phản pha khi mẫu không được nhuộm.
- Phương pháp không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật với mật độ thấp. Dùng
buồng đếm Retroff Hausser chẳng hạn nếu huyền phù vi sinh vật có mật độ 1,5 triệu/ml thì
trung bình trên một ô vuông chỉ có 1,25 tế bào, nghĩa là với mật độ tế bào dưới 1 triệu/ml
sẽ có rất ít tế bào được nhìn thấy dưới kính hiển vi.
5.1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc (phương pháp đếm đĩa)
Khác với phương pháp đếm trực tiếp, phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định
số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu.
Tế bào sống được xác định như một tế bào có khả năng phân chia, sinh sản. Cách
thường dùng để tính tế bào sống là xác định số tế bào trong mẫu có khả năng tạo khuẩn lạc
trên môi trường thạch thích hợp. Vì lẽ này phương pháp xác định số tế bào sống như trên
được gọi là phương pháp đếm đĩa hay đếm khuẩn lạc.
Có hai phương pháp đếm đĩa là phương pháp cấy trang và phương pháp đổ đĩa.
Theo phương pháp cấy trang một lượng dịch mẫu không quá 0,1ml được dàn đều trên
bề mặt đĩa thạch bằng que cấy trải vô trùng, sau đó ủ đĩa cho khuẩn lạc xuất hiện và đếm
số khuẩn lạc tạo thành. Cần chú ý là mặt thạch phải khô để dịch mẫu dính xuống. Không
cấy quá 0,1ml mẫu bởi lượng chất lỏng dư dính xuống có thể làm cho các khuẩn lạc mọc
lan khó đếm.
Theo phương pháp đổ đĩa dùng pipet phân độ nhỏ một lượng mẫu xác định từ 0,1-1
ml vào đĩa petri vô trùng, sau đó thêm môi trường thạch đã nóng chảy, lắc tròn trên mặt
bàn theo hai chiều ngược nhau để trộn đều. Do mẫu được trộn đều với môi trường thạch
nóng chảy, cần dùng một lượng môi trường lớn hơn so với khi dùng phương pháp cấy
trang. Ngoài ra vi sinh vật được đếm theo cách này phải chịu được nhiệt độ của thạch nóng
chảy, vào khoảng 450C.
Với cả hai phương pháp cấy trang và đổ đĩa, điều quan trọng là số khuẩn lạc mọc trên
mỗi đĩa không quá lớn, bởi trên những đĩa cấy quá dày một số tế bào có thể không tạo
khuẩn lạc và gây sai số khi đếm. Cũng cần thiết để số khuẩn lạc trên đĩa không quá nhỏ
(khiến giá trị thống kê không có hoặc quá thấp).
Để có số khuẩn lạc trên đĩa phù hợp, mẫu thường được pha loãng. Do hiếm khi biết
trước được nồng độ vi sinh vật trong mẫu, người ta thường dùng vài nồng độ khác nhau,
thường là các nồng độ pha loãng thập phân (1/10, 1/100, 1/1000...). Để pha loãng 10 lần
có thể dùng 1ml mẫu + 9ml dung dịch pha loãng (hoặc 0,5ml mẫu + 4,5ml dung dịch pha
loãng). Để pha loãng 100 lần có thể pha loãng 2 đợt 10 lần, hoặc pha theo tỷ lệ 0,05 + 4,95
ml hay 0,1 + 9,9 ml. Trong nhiều trường hợp những dãy pha loãng như vậy cần để đạt được
nồng độ pha loãng phù hợp.
Để pha loãng mẫu, tốt nhất là dùng môi trường nuôi cấy lỏng. Cần chú ý dùng mỗi
pipet vô trùng riêng cho một nồng độ pha loãng bởi mẫu sơ khởi chứa một lượng lớn vi
sinh vật, những vi isnh vật này nếu bị dính lại trên thành pipet khi dùng lại sẽ làm tăng
nồng độ vi sinh vật ở những nồng độ pha loãng kế tiếp.
Số khuẩn lạc đếm được trên đĩa sẽ phụ thuộc không chỉ vào lượng mẫu cấy mà cả
vào sự thích hợp của môi trường cũng như điều kiện và thời gian ủ. Những tế bào có trên
đĩa không phát triển thành khuẩn lạc với tốc độ như nhau, và nếu dùng thời gian ủ ngắn,
số khuẩn lạc đếm được sẽ dưới mức cực đại. Ngoài ra kích thước của khuẩn lạc cũng
thường biến động, vài khuẩn lạc quá nhỏ có thể bị bỏ qua khi đếm. Thông thường người ta
xác định các điều kiện ủ (môi trường, nhiệt độ, thời gian) sẽ cho số khuẩn lạc tối đa, sau
đó áp dụng các điều kiện trên. 1 ml 1 ml
1 ml

9ml 9ml 9ml

SPW SPW SPW
Dung dịch 10-1 ...
10-2 10-3 10-4
Hình 5.1 Kỹ thuật pha loãng
 5.1.3 Phương pháp màng lọc
Phương pháp màng lọc (Membrane Filter Method) thường được dùng để định lượng
vi sinh vật (đặc biệt là vi sinh vật chỉ thị) trong mẫu nước khi tiến hành các xét nghiệm môi
trường (nơi có mật độ vi sinh vật nói chung và vi sinh vật chỉ thị nói riêng tương đối thấp).
Bản chất của phương pháp này là tập trung số vi sinh vật ít ỏi trong một mẫu nước có khối
lượng khá lớn trên màng lọc khuẩn và định lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm được sau
khi đặt màng lọc lên một môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi
sinh vật cần kiểm. Dựa trên mẫu nước ban đầu và qui ước coi mỗi khuẩn lạc được hình
thành từ một vi khuẩn người ta qui ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích
nước.
Về thực chất đây là sự kết hợp của hai phương pháp vốn được sử dụng rộng rãi trong
công tác kiểm nghiệm vi sinh vật. Đó là phương pháp lọc vô khuẩn (thường dùng để lọc
thanh trùng một số dung dịch kém chịu nhiệt, dễ bị biến chất hoặc phân hủy khi khử trùng
ở nhiệt độ cao) và phương phướng đếm khuẩn lạc trên đĩa.
Hiện nay người ta đã chế tạo được nhiều loại màng lọc khuẩn khác nhau với kích
thước lỗ vào khoảng 0,2-1µm. Những vật liệu thường được dùng để chế tạo màng lọc khuẩn
là sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi amiante, sợi polypropylene... là những vật liệu có khả năng
chịu được nhiệt độ và áp suất cao của nồi hấp tiệt trùng. Màng lọc loại này thường được
cung cấp trong trạng thái vô trùng.
Phương pháp màng lọc hiện vẫn không ngừng được cải tiến theo nhiều hướng khác
nhau tùy theo yêu cầu sử dụng. Một trong những ví dụ điển hình cho các hướng cải tiến đó
là phương pháp lọc qua màng lưới kỵ nước. Ở đây người ta dùng những màng lọc đã được
in thành các ô vuông bằng một loại vật liệu kỵ nước. Những đường kẻ kỵ nước này có tác
dụng ngăn cản sự mọc lan của các khuẩn lạc và như vậy chia bề mặt màng lọc thành những
ô đều nhau có kích thước xác định. Số ô vuông có khuẩn lạc mọc được đếm và qui về số
có xác suất lớn nhất (MPN) của lượng vi sinh vật có trong một thể tích mẫu theo công thức:
MPN = N.ln (N/N-x)
Trong đó N là tổng số các ô vuông, x là số ô có khuẩn lạc mọc.
5.1.4 Phương pháp đo độ đục
Mật độ vi sinh vật có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục. Khi
một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có
độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm
ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng
làm môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới
hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính
giữa mật độ tế bào và độ đục. Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp
thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550-610nm. Trong trường hợp
này, trước tiên cần phải thiết lập được đường quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế
bào bằng cách sử dụng một hệ số huyền phù có độ đục xác định và mật độ tế bào của mỗi
huyền phù được xác định bằng một phương pháp trực tiếp khác, ví dụ như phương pháp
đếm khuẩn lạc, phương pháp đếm trực tiếp,...
Quy trình xác định mật độ tế bào bằng độ đục gồm các bước như sau:
a)- Pha loãng một huyền phù chứa loài vi sinh vật cần kiểm nghiệm có mật độ bất kỳ
thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD610nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3;
0,4 và 0,5. Đo OD610nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế.
- Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi hoặc phương pháp đếm khuẩn
lạc, xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này.
- Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ đục. Vẽ
đường biểu diễn của log (N/ml) (trục tung) theo OD610nm (trục hoành). Xác định khoảng
tuyến tính giữa log (N/ml) và OD610nm.
b) Xác định lượng tế bào theo độ đục:
- Đo độ đục của huyền phù tế bào vi sinh vật cần xác định.
- Từ trị số OD đo được đối chiếu trên đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và OD để
xác định lượng tế bào có trong mẫu nghiên cứu. Lưu ý N/ml = 10a với a = log (N/ml).
Phương pháp định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ
tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng. Trong trường hợp
không cần biết giá trị tuyệt đối của mật độ tế bào thì không cần phải xây dựng đường
tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ. Phương pháp này cho kết quả nhanh thường
được ứng dụng trong theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vi sinh
vật trong phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuất tuy nhiên không thích hợp cho ứng dụng
trong kiểm nghiệm vi sinh vật.
5.1.5 Phương pháp MPN
Phương pháp MPN (Most Possible Number) dùng để đánh giá lượng vi sinh vật theo
số có xác suất lớn nhất của lượng vi sinh vật có thể có trong một đơn vị thể tích mẫu với
độ chính xác tương đối cao tuy dựa trên những thao tác và trang thiết bị khá đơn giản.
Phương pháp này (còn gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ)
dựa trên kỹ thuật nuôi ủ vi sinh vật cần định lượng trong một môi trường lỏng thích hợp.
Nội dung của phương pháp như sau: cho vào một số ống nghiệm xác định (có chứa
sẵn loại môi trường thích hợp cho sự phát triển dạng vi sinh vật cần định lượng) một thể
tích chính xác dung dịch mẫu với các nồng độ pha loãng khác nhau (1/10; 1/100; 1/1000...).
Sau khi ủ trong những điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp, dựa trên những tính chất
như sinh hơi, đổi màu, chuyển đục,...) xác định số ống nghiệm có vi sinh vật phát triển
(ống dương tính) ở từng nồng độ pha loãng. Lập một chỉ số gồm các ống nghiệm dương
tính ở mỗi loại nồng độ pha loãng (theo thứ tự giảm dần của nồng độ. Tra chỉ số trên theo
bảng MPN của Mac Crady (từng được xây dựng trên cơ sở xử lý xác suất thống kê một
khối lượng lớn các kết quả thử nghiệm) để xác định số có xác suất lớn nhất của lượng vi
sinh vật trong một đơn vị thể tích.
 Phương pháp MPN có thể thực hiện theo hai cách:
- Với một nồng độ pha loãng
- Với vài nồng độ pha loãng
Phương pháp dùng một loạt ống nghiệm với một nồng độ pha loãng duy nhất phù hợp
hơn khi mật độ vi khuẩn ước định giữa mức thấp nhất và mức cao nhất rõ ràng là không
chênh nhau đến 100 lần và khi mật độ vi khuẩn ước định rất thấp, chẳng hạn khi kiểm tra
mẫu nước đã thanh trùng. Trong những trường hợp khác người ta thường dùng vài nồng
độ pha loãng khác nhau. Phương pháp ba nồng độ thường được dùng phổ biến nhất.
Cần lưu ý rằng phương pháp MPN có thể dùng để định lượng bất kỳ loại vi sinh vật
nào với điều kiện phải dùng môi trường tăng sinh chọn lọc (môi trường lỏng) cho kết quả
dự kiến phù hợp, chẳng hạn BGBL kết hợp với chế độ nhiệt 370C cho coliforms, 440C cho
coliforms phân,...
5.2 Phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử
Phát hiện vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy được xây dựng và phát triển trong
thời gian dài, được nhiều nước công nhận và chúng đã trở thành những phương pháp tiêu
chuẩn. Tuy vậy, nhược điểm lớn nhất của phương pháp nuôi cấy là tốn nhiều thời gian, cho
kết quả chậm, mất nhiều công sức, cồng kềnh và ngày càng tỏ ra không đáp ứng được các
yêu cầu phân tích phục vụ nhu cầu thực tế hiện nay. Để khắc phục những nhược điểm trên
của phương pháp nuôi cấy, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được xây dựng và phát
triển dựa trên nhiều nguyên tắc sinh học và vi sinh vật học khác nhau. Các phương pháp
mới này nhằm mục đích rút ngắn thời gian phân tích, giảm thiểu sự phức tạp trong thao
tác, dễ dàng thực hiện và có độ nhạy và độ chính xác cao.
Các phương pháp nhanh và tự động hoá trong phân tích vi sinh vật thực phẩm đều
dựa trên nguyên tắc của vi sinh học, sinh hoá học, hoá lý, miễn dịch học, sinh học phân tử
học để phát hiện và định lượng vi sinh vật mục tiêu hay sản phẩm độc hại của chúng trong
thực phẩm, môi trường. Tất cả các yêu cầu kỹ thuật liên quan đến việc thu và chuẩn bị mẫu,
phân tích… đều được nghiên cứu cải tiến theo hướng tự động hoá, đơn giản hoá cho kết
quả nhanh và chính xác.
5.2.1 Phương pháp Elisa (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
Những tiến bộ của khoa học trong những năm gần đây đã thúc đẩy sự phát triển của
các kỹ thuật chẩn đoán bằng huyết thanh. Các phương pháp này tỏ ra rất hiệu quả trong
việc chẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh. Ngày nay phương pháp này
còn được phát triển để xác định các chất độc hại trong môi trường như độc tố, dư lượng
kháng sinh… Nguyên tắc của phương pháp ELISA dựa trên phản ứng kết hợp giữa kháng
nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Phản ứng miễn dịch xảy ra được phát hiện bằng cách
sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị
phóng xạ, hay enzyme).
Phương pháp ELISA là phương pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-
linked immunosorbent assay). Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng
(kháng thể sơ cấy) phủ bên ngoài những giếng (well) nhỏ nhằm mục đích thu giữ những
kháng nguyên mục tiêu. Những kháng nguyên thu giữ được phát hiện bằng cách sử dụng
kháng thể thứ hai có gắn với enzyme phát tính hiệu (thường là horseradish peroxidase hay
alkaline phosphatase). Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặc hiệu của enzyme,
phản ứng xảy ra và tạo ra các sản phẩm làm đổi màu phản ứng. Như vậy, chúng ta có thể
phát hiện được sự hiện diện của kháng nguyên.

Kháng thể Cơ chất

Kháng nguyên Kháng thể mang Phát quang

“Sandwich”
enzyme đánh dấu

Hình 5.2 Nguyên tắc phản ứng ELISA với S:cơ chất, E: enzyme, P: phát
quang
Hiện nay ELISA đã được sử dụng rộng rãi để phân tích Salmonella, E. coli gây bệnh
(các dòng EHEC, STEC, IEHEC…), Listeria, độc tố Staphylococus, thuốc trừ sâu, dư lượng
kháng sinh… đối với vi sinh vật, phương pháp ELISA có thể sử dụng phát hiện và định
lượng vi sinh trong thực phẩm sau vài giờ tăng sinh nhằm tăng độ nhạy của phương pháp.
5.2.2 Phương pháp LAMP
"LAMP” (Loop-mediated Isothermal Amplification) là phương pháp khuếch đại
nucleic acid đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm. Sử dụng 4 mồi (primer) khác nhau được
thiết kế đặc biệt nhận ra 6 đoạn riêng biệt trên gen đích (target gene) và quá trình phản ứng
xảy ra ở nhiệt độ cố định dùng phản ứng thay thế mạch. Khuếch đại và phát hiện gene có
thể được hoàn thành chỉ trong 1 bước bằng cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, DNA polymerase
có hoạt tính thay thế mạch và chất nền ở nhiệt độ cố định (khoảng 65°C). Phương pháp này
cho hiệu quả khuếch đại cao với lượng DNA được khuếch đại đến 109-1010 lần trong vòng
15-60 phút. Bởi vì tính đặc hiệu cao, Sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại có thể chứng
tỏ sự có mặt của đoạn gene quan tâm.
Nguyên tắc của phản ứng dựa trên đoạn gene quan tâm và hoá chất được ủ ở nhiệt độ
cố định khoảng 60-65°C trong vòng 45-60 phút và kết thúc phản ứng bằng cách ủ ở nhiệt
độ 80oC trong 2-10 phút.
5.2.3 Phương pháp phát quang sinh học ATP
Phân tử Adenosine triphosphate (ATP) có mặt trong tất cả các tế bào sống, nên sự
phát hiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật chất sống đang tồn tại. ATP có thể được phát
hiện và định lượng thông qua cường độ ánh sáng phát ra do sự kết hợp với enzyme
Luciferase. Kĩ thuật này có thể phát hiện được 1pg ATP, tương ứng với khoảng 1000 tế
bào vi khuẩn (10-15g ATP/ tế bào). Quá trình phân tích chỉ diễn ra trong vài phút và vì thế
phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi hơn so với phương pháp đếm khuẩn
lạc.
Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác định rõ số vi sinh vật đang hiện
diện đã được biết đến vào năm 1960. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều sự cải tiến
trong việc thiết kế thiết bị đo cường độ ánh sáng phát ra và những hóa chất để ổn định sự
phát sáng. Ngày nay phương pháp này được ứng dụng trong 3 lĩnh vực: giám sát vệ sinh,
kiểm tra những loại chất lỏng như nước rửa làm sạch hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh
của thực phẩm. Để đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm thì lượng ATP của vi sinh
vật phải được đo và điều này đòi hỏi những quy trình tách chiết ATP ra khỏi tế bào vi sinh
vật.
Phản ứng phát sáng sinh học trải qua hai giai đoạn :

Mg2+
E + LH2 + ATP E – LH2 AMP + PPi (1)

E – LH2 AMP +O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (2)

Phản ứng phát sáng sinh học ở đom đóm có thể viết lại như sau:

Mg2+
E + LH2 + ATP +O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv +PPi
E : luciferase
LH2 :luciferin
Ánh sáng phát ra có bước sóng 562nm, có màu vàng.
Mẫu được lấy bằng cách quét những vi sinh vật ở trên bề mặt dụng cụ và thiết bị, sau
đó đo lượng ATP thông qua một loạt quá trình ly trích. Những thiết bị được chế tạo đầu
tiên đòi hỏi người thực hiện quét mẫu trên một vị trí (thường là 10cm2), sau đó nhúng hoàn
toàn que quét mẫu vào trong dung dịch chứa những tác nhân làm phóng thích ATP, trộn
với dung dịch luciferase – luciferin và đặt vào trong một cuvette để đọc trị số ánh sáng.
 Hình 5.3 Các bước định lượng nhanh vi sinh vật hiện diện trên bề mặt bằng
phản ứng phát sáng
5.2.4 Phương pháp lai phân tử (Gene probes)
Vào những năm 1980, có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học vào lĩnh vực
thực phẩm, đặc biệt là trong chẩn đoán vi sinh. Phương pháp sử dụng mẫu dò (probe) trong
việc phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm thông qua sự phát hiện một trình tự DNA đặc
trưng. Các mẫu dò thường sử dụng RNA ribosome (rRNA) làm mục tiêu, do trong cơ thể
số lượng bản sao rRNA lớn, đủ để làm tăng độ nhạy của phương pháp phân tích. Nguyên
tắc của phương pháp mẫu dò là lai phân tử, đó là bắt cặp giữa hai trình tự DNA tương đồng.
Một trong hai trình tự (thường là trình tự đích, tức là trình tự DNA của tế bào vi sinh vật)
được cố định trên một giá thể rắn hoặc trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử xảy ra khi các
trình tự bổ sung gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít
nhất vài độ. Sự lai phân tử còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá trình lai phân tử chịu
ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian
phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường.
Một ví dụ về hệ thống phát hiện bằng mẫu dò là hệ thống Gentrak (Framingham,
USA). Phương pháp phân tích này sử dụng mẫu dò để phát hiện Listeria trong mẫu bơ sữa
và mẫu môi trường. Mẫu dò là những đoạn oligomer DNA đánh dấu bằng hoá chất phát
quang. Quy trình phân tích có thể được chia thành 6 bước: (1) Phá vỡ tế bào thu nhận
rRNA; (2) mẫu dò DNA thu giữ có đuôi deoxyadenylic nucleotide (dA) và mẫu dò phát
hiện (reporter probe) chứa fluorescein isothiocyanate (F) ở đầu 5’ và 3’ của phân tử; (3)
Que thử được bao bọc bởi polydeoxythymidine (dT) được đặt vào với mục đích gắn những
mẫu dò với với que thử; (4) que thử được đạt vào ống chứa enzyme liên kết với mẫu dò
phát hiện; (5) Sau khi rửa loại phần enzyme thừa, que thử được đặt vào ống chứa cơ chất
tạo màu; (6) Sau khi ủ để hiện
màu, màu được phát hiện ở
bước sóng 450nm.
Maãu doø
RNA muïc tieâu Maãu doø
phaùt hieän
thu giöõ

Que thöû

Cô chaát phaùt
quang
 Hình 5.4 Quy trình phát hiện Listeria với mẫu dò phát quang
5.2.5 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp in vitro để tổng
hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng
bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym polymerase và
một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này được Karl Mullis (Mỹ) phát minh
vào 1985.
Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng
biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của
một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA
polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước
nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở nhiệt độ thấp,
DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần
lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt
o
độ rất cao, có thể lên đến 100 C. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính.
5.2.5.1 Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR
a. DNA mẫu (DNA template)
Ðây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại. Phản ứng PCR tối ưu
xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận
trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynh hướng giảm khi sử dụng
các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao (<100ng).
Lượng DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra. PCR còn cho phép
khuyếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị phân hủy
từng phần như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, tóc, móng tay của người chết....
b. Mồi (primer)
Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây
chuyền tổng hợp DNA . Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ sung với
một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều ngược nhau,
bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer).
Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu quả của phản ứng.
Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định:
+ Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm) gần như
nhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ.
+ Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base (thông thường là 18-24 base) để quá trình
lai xảy ra tốt hơn.
+ Mồi phải đặc hiệu có nghĩa là nó phải đặc trưng cho trình tự DNA cần được
khuyếch đại, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.
+ Không có nút cài tóc (hairpin loop): trong mỗi một mồi cần tránh trình tự đối xứng
bậc hai (palindromic sequences) có thể làm tăng cấu trúc sợi bên trong ổn định do đó hạn
chế việc mồi bám vào DNA mẫu.
+ Tránh sự bổ sung giữa hai mồi: sự bổ sung giữa hai mồi sẽ làm tăng sản phẩm
primer dimer (Hình 3.7).
+ Trật tự các base cũng ảnh hưởng đến sự ổn định việc bám của mồi dưới nhiệt độ
cao. Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, vì G và C có 3 liên kết hydro do
đó sự polymer hoá sẽ tốt hơn.
+ Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưng đối
với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đoán, tốt nhất khoảng cách giữa hai mồi khi đã
bám vào DNA khuôn là 150-500 base.
c. Enzyme polymerase chịu nhiệt
Enzyme ssử dụng trong phản ứng PCR là enzyme DNA polymerase từ Thermus
aquaticus (Tag-polymerase) không biến tính sau mỗi chu kỳ. DNA polymerase chịu nhiệt
sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường là Tag-polymerase. Hiện
nay có nhiều enzyme chịu nhiệt khác được sử dụng là: Vent- polymerase (Tli-polymerase),
Pfu- polymerase, rTth...Các hoạt tính của chúng được trình bày ở bảng:
Enzyme Hiệu suất Tần số lỗi Tần số Exo Exo
tương đối (Error mở rộng 3’-5’ 5’-3’
(Relative rate) (Extention
efficiency) rate)
Taq-polymerase 88 2x10-4 75 Không Có
Vent- 70 4x10-5 67 Có Không
polymerase 60 7x10-7 Không XĐ Có Không
Pfu- polymerase Không XĐ Không XĐ 60 Không Có
rTth
d. Các loại nucleotid
Trong phản ứng PCR, bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở dạng
deoxynucleotid: dATP, dCTP, dGTP, dTTP với nồng độ cân bằng trong một phản ứng
(200μM/loại nucleotid).
e. Nước
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không
chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt hạn chế... Nói cách khác là không chứa bất kỳ một
thành phần nào khác.
f. Dung dịch đệm
Dung dịch đệm 10X (100mM KCl, 100mM (NH4)2SO4, 200mM Tris-Cl
pH 8.8, 20mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100)
 2+
g. Ion Mg
2+
Nồng độ ion Mg cũng là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR và nó
tuỳ thuộc vào từng phản ứng. Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150-200 μM. Người ta thấy rằng
nếu nồng độ DNA quá cao thì enzyme polymerase sẽ gây ra nhiều lỗi hơn.
5.2.5.2 Ba giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR
Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần
(chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ).
a. Giai đoạn biến tính (denaturation)
Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-
o
95 C, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các
liên kết hydro giưã hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn.
b. Giai đoạn lai (hybridization)
Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-70oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi
được sử dụng khoảng từ 3-5oC) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh
dấu phần DNA cần được khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn
được gọi là giai đoạn ủ).
Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả là sẽ tạo nên nhiều
sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả.
Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm) một cách tương đối là:
Tm=4(G+C) + 2(A+T)
c. Giai đoạn kéo dài (elongation)
Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA
tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng
nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần
đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của
DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian được tăng thêm vài phút để các sợi
DNA chưa được sao chép xong hoàn thành qúa trình tổng hợp.Sau mỗi chu kỳ, số bản sao
của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Ðây là sự nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy 1 phân
tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.
 Hình 5.5 Ba giai đoạn của của phản ứng PCR
Chu kỳ ba bước lặp lại nhiều lần, sau 30-40 chu kỳ sẽ tạo ra 106 bản sao. Sau phản
ứng PCR, ADN được nhuộm bởi ethidium bromide và được quan sát qua điện di sản phẩm
PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV

Hình 5.6 Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ
của phản ứng PCR
Bảng 5.1 Số bản sao của phân tử DNA mẫu tạo thành qua các chu kỳ của phản ứng PCR

Chu kỳ Số bản sao

1 21=2
2 22=4
4 24=16
10 210=1.024
15 215=32.768
20 220=1.048.576
25 225=33.554.432
30 230=1.073.741.824
 ... ...
n 2n

Hình 5.7 Phản ứng PCR với lượng sản phẩm tăng theo cấp số nhân

Ưu điểm của phương pháp PCR

- Thời gian cho kết quả nhanh
- Có thể nhận diện những vi sinh vật khó nuôi cấy. Việc nuôi cấy tăng sinh là đơn
giản hơn và có khi không cần thiết.
- Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp
huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện
ở hiện trường.
- Ít tốn kém về mặt nhân sự. Có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện
các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
 Hình 5.8 Mô hình máy PCR (Polymerase chain reaction) và máy PCR realtime của Bio-Rad

 Nhược điểm
+ Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase
+ Mật độ vsv trong mẫu thấp, đôi khi cần tăng sinh
+ Không phân biệt được tế bào sống và chết, có thể dẫn đến dương tính giả (tuy vậy,
có thể phát hiện bào tử, tế bào đã chết của vsv gây độc)
+ Ngày càng được quan tâm nhiều hơn đặc biệt phát hiện virus
5.2.6 Một số phương pháp thử nhanh khác
5.2.6.1 Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ
Trong quá trình đồng nhất mẫu, mẫu thường được pha loãng bậc 10 tạo một thể tích
lớn nguyên liệu ban đầu (250ml). Nhưng có thể chỉ dùng vài mililite cho những bước tiếp
theo trong quy trình phát hiện. Như vậy chúng ta có thể dùng bước tăng mật độ các vi sinh
vật mục tiêu trong mẫu để rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả phát hiện.
Một kỹ thuật phân tách được sử dụng rộng rãi là miễn dịch phân tách
(Immunomagnetic separation - IMS). Với phương pháp này, giai đoạn phân lập có thể được
rút ngắn bằng cách thay thế môi trường tăng sinh chọn lọc bằng quy trình tương tự không
cần nuôi cấy. IMS sử dụng những hạt siêu thuận từ được bao bọc bên ngoài bởi những
kháng thể của vi sinh vật mục tiêu. Các hạt này có chức năng phân tách chọn lọc vi sinh
vật mục tiêu này ra khỏi một hỗn hợp quần thể. Các vi sinh vật mục tiêu này có thể được
phát hiện bằng các quy trình vi sinh truyền thống. Tính siêu thuận từ của các hạt chỉ được
thể hiện khi chịu sự tác động của một lực từ tính bên ngoài tác động.
Dynabeads® (Dynal A/S, Oslo, Norway) là một sản phẩm dựa trên kỹ thuật IMS. Quy
trình này sử dụng những hạt polystyren siêu thuật từ có đường kính 2,8µm (Dynabeads®
M-280) và 4.5µm (Dynabeads® M-450). Cả hai loại M-280 và M-450 đều có thể được bao
bên ngoài bởi lớp kháng thể do người dùng lựa chọn. Một ví dụ về chất hấp thụ từ tính
khác có thể được lựa chọn là BioMag (Metachem Diagnostics Ltd, Northampton). Các hạt
từ tính oxide sắt (đường kính 0.5 - 1.5µm) được bao phủ bên ngoài bởi các nhóm amino-,
carboxy- hoặc thiol-. Ngoài ra một số hệ thống khác còn có khả năng tạo từ tính cho các tế
bào vi sinh vật bằng cách cho chúng hấp thu trực tiếp những hạt siêu hiển vi oxide sắt mang
từ tính lên bề mặt tế bào (Safarík và cộng sự, 1995).
5.2.6.2 Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (Direct Epifluorscent
Technique – DEFT) và màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid Membrane)
Cơ sở của việc sử dụng phương pháp màng lọc là thu nhận tế bào từ một lượng lớn
thể tích được lọc. Sau đó có thể kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc bằng cách đếm khuẩn lạc.
Phương pháp này thích hợp đối với mẫu có mật độ tế bào thấp.
Màng lọc có thể được làm bằng nitrocellulose, cellulose acetate ester, nylon,
polyvinyl chloride và polyester (Sharpe, 1994). Kích thước lổ sử dụng là 0,45µm (hoặc
0,22µm) đường kính 13mm đến 150mm. Tạo lực đẩy qua lọc bằng hút chân không hoặc
lực ép. Màng lọc được sử dụng như một biến thể của kỹ thuật truyền thống với nhiều mục
đích: tăng mật độ vi sinh vật mục tiêu trong một thể tích lớn nhằm tận dụng giới hạn phát
hiện; loại bỏ tác nhân ức chế sự tăng trưởng.
Độ nhạy của kỹ thuật phát huỳnh quang trực tiếp (DEFT) phụ thuộc vào mật độ tế
bào trước khi nhuộm được lọc bởi màng lọc. Có thể phân biệt tế bào sống và tế bào chết
bằng cách nhuộm nhân với fluorochrome acridine orange. Màu sắc phát quang trong tế
bào thay đổi trong suốt các quá trình tăng trưởng. Thuốc nhuộm phát màu đỏ với RNA và
màu xanh với DNA. Thông thường thì tế bào sống cho màu đỏ da cam trong khi các tế bào
chết cho màu cho màu xanh lục. Năm 1991, phương pháp ISO-GRID® ứng dụng trên đối
tượng Salmonella đã dược AOAC công nhận áp dụng cho mọi loại thực phẩm.

A B

Hình 5.9 Hệ thống ISO-GRID®

5.2.6.3 Kỹ thuật màng petri (Petrifilm)
Môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định vào các màng mỏng gọi là
Petrifilm. Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ vào một 1ml dịch
mẫu rồi đậy lại. Một đĩa petri nhựa được đặt lên màng bào vệ để tạo một khuôn tròn. Môi
trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian ủ. Có thể đếm
trực tiếp số khuẩn lạc trên Petrifilm.
Petrifilm đã được dùng để kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, số coliform, coliform
phân, nấm mốc, nấm men. Ưu điểm của kỹ thuật Petrifilm là dễ thao tác, tiết kiệm không
gian ủ và bảo quản. Thời hạn sử dụng lâu do dùng môi trường đông khô và không cần xử
lý nhiệt như phương pháp thông thường. Có thể dùng nước cất vô trùng để làm ướt lại môi
trường đông khô. Sau khi môi trường đông lại, có thể dùng trực tiếp Petrifilm để đếm tạp
khuẩn bề mặt.
 Đặt mẫu lên màng Petrifilm

Dàn đều mẫu trên màng

Ủ Petrifilm, đếm trực tiếp hoặc phân lập

Hình 5.10 Cách sử dụng hệ thống Petrifilm của 3M Microbiology