CÔNG NGHỆ LÊN MEN

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU QUÁ TRÌNH LÊN MEN

Lên men là:
1. Sự hư hỏng của thực phẩm do vsv gây ra
2. Quá trình sản xuất thức ăn có cồn hoặc sp làm từ sữa
3. Những qtsx lớn có sd vsv và trong qt có hoặc không có không khí
4. Qt trao đổi chất giải phóng năng lượng xảy ra trong mt kị khí
5. Những qt trao đổi chất giải phóng năng lượng sd cơ chất là đường, phân tử hữu cơ,
không cần thiết phải có oxi hoặc thiết bị điện tử, sử dụng các chất hữu cơ như là chất
nhận điện tử cuối cùng.
Phạm vi nguồn CNLM
Có 5 nhóm công nghệ lên men ở qui mô thương mại:
1. Tạo ra tb vsv (microbial cells) (or tb sinh khối) như là 1 sản phẩm
2. Sx enzyme có nguồn gốc vsv
3. Sản phẩm trao đổi chất do vsv tạo thành
4. Sản phẩm tái tổ hợp
5. Những hợp chất được biến đổi nhờ quá trình lên men (các sp chuyển hóa sinh học)
Microbial Biomass
- Có 2 nhóm:
o Nấm men dùng trong cnsx bánh
o Sản phẩm của vsv sd cho thức ăn con người và động vật
- Microbial enzymes
- Được sản xuất thương mại từ thực vật, động vật và nguồn vsv
- Microbial enzyme
o Được sx với số lượng lơn bằng cách thiết lập kĩ thuật lên men
o Dễ dàng cải thiện khả năng sx so với thực vật hoặc động vật
o Sử dụng công nghệ tái tổ hợp DNA để sản xuất enzyme có nguồn gốc từ VSV
Microbial metabolites (sp trao đổi chất của vsv)
 - Lag phase: Các tính chất hóa lí ở trạng thái cân bằng, sự phát triển vsv hầu như rất ít.
- Log phase = Exponential phase: Cuối gđ lag phase, các tb đã thích nghi với các đk mới của
sự phát triển. Sự phát triển của khối tb có thể được mô tả 1 cách định lượng là số lượng
tb tăng gấp đôi trên 1 đơn vị thời gian đối với vk và nấm men. Mặc dù các tb thay đổi mt
thông qua việc hấp thụ các chất nền và bài tiết các sp tđc, tốc độ tăng trưởng vẫn ko đổi
trong pha log. Tốc độ tăng trưởng ko phụ thuộc vào nồng độ cơ chất miễn là còn thừa cơ
chất.
- Stationary phase: Ngay sau khi cơ chất đc chuyển hóa hoặc các chất độc hại đã được hình
thành, sự tăng trưởng chậm lại hoặc bị ngừng hoàn toàn. Sinh khối chỉ tăng dần hoặc
không đổi trong gđ này, mặc dù tp của tb thay đổi. Do qt phân giải, chất nền được giải
phóng sau đó có thể đóng vai là nguồn năng lượng cho sự phát triển chậm của các vsv
còn sống. Các chất chuyển hóa khác nhau đc hình thành trong pha này thường rất được
quan tâm về mặt CNSH.
- Death phase: Chất dinh dưỡng hầu như cạn kiệt. sp trao đổi chất và các chất độc sinh ra
nhiều.

Sp trao đổi chất ngoại bào (extracellular metabolites)

- Gồm 2 nhóm:
o Primary: sp tđc bậc 1: ethanol, acid citric, acid glutamic, lysin, vit n
polysaccharides
là những hợp chất được tạo ra trong quá trình trao đổi chất thông thường của sinh vật trong giai
đoạn tăng trưởng. Một ví dụ phổ biến là ethanol hoặc axit lactic, được tạo ra trong quá trình
đường phân. Axit citric được sản xuất bởi một số chủng Aspergillus niger như một phần của chu
trình axit citric để axit hóa môi trường của chúng và ngăn chặn đối thủ cạnh tranh chiếm lấy.
Glutamate được sản xuất bởi một số loài Micrococcus, và một số loài Corynebacterium sản xuất
lysine, threonine, tryptophan và các axit amin khác. Tất cả những sản phẩm trao đổi chất bậc 1
này có thể được thu hồi mà không cần thiết phải phá hủy tế bào do chúng được tiết ra bên ngoài
môi trường trong suốt quá trình trao dổi chất
 o Secondary: sp tđc bậc 2: penicillin, cyclosporin A, gibberellin, lovastation
là những hợp chất được tạo ra ở pha tĩnh, ví dụ như penicillin, ngăn chặn sự phát triển của vi
khuẩn cạnh tranh với nấm mốc Penicillium để lấy nguồn dinh dưỡng. Một số vi khuẩn, chẳng
hạn như các loài Lactobacillus, có thể tạo ra các vi khuẩn ngăn chặn sự phát triển của các đối
thủ cạnh tranh của vi khuẩn. Những hợp chất này có giá trị rõ ràng đối với con người muốn
ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, dùng làm thuốc kháng sinh hoặc thuốc sát trùng (chẳng
hạn như gramicidin S). Thuốc diệt nấm, chẳng hạn như griseofulvin cũng được sản xuất dưới
dạng chất chuyển hóa thứ cấp. Thông thường, các chất chuyển hóa thứ cấp không được tạo ra
khi có glucose hoặc các nguồn cacbon khác (chất cần thiết cho sự phát triển), và tương tự các
sp tdc b1, b2 được giải phóng vào môi trường xung quanh mà không bị vỡ màng tế bào
Sản xuất các thành phần nội bào
Các thành phần nội bào đáng quan tâm là các enzym vi sinh vật catalase, amylase, protease,
pectinase, glucose isomerase, cellulase, hemicellulase, lipase, lactase, streptokinase và nhiều
loại khác. Protein tái tổ hợp, chẳng hạn như insulin, vắc xin viêm gan B, interferon, granulocyte
colony-stimulating factor, streptokinase và những chất khác cũng được thực hiện theo cách
này. Sự khác biệt lớn nhất giữa quy trình này và các quy trình khác là các tế bào phải bị vỡ (ly
giải) khi kết thúc quá trình lên men và môi trường phải được xử lý để tối đa hóa số lượng sản
phẩm. Hơn nữa, sản phẩm (thường là protein) phải được tách khỏi tất cả các protein tế bào
khác trong dịch lọc để được tinh sạch
Sự biến đổi cơ chất
Sự biến đổi cơ chất bao gồm việc biến đổi một hợp chất cụ thể thành một hợp chất khác, chẳng
hạn như phenylacetylcarbinol, và steroid biotransformation, hoặc biến đổi nguyên liệu thành
sản phẩm hoàn chỉnh, trong trường hợp lên men thực phẩm và xử lý nước thải.
Quá trình biến đổi
Tế bào vi sinh vật có thể được sử dụng để chuyển đổi một hợp chất thành một hợp chất có liên
quan về cấu trúc, có giá trị hơn. Vì các vi sinh vật có thể hoạt động như chất xúc tác bất đối
xứng với tính đặc hiệu cao và lập thể, các quá trình của vi sinh vật cụ thể hơn các quá trình hóa
học thuần túy và cho phép bổ sung, loại bỏ hoặc sửa đổi các nhóm chức tại các vị trí cụ thể trên
một phân tử phức tạp mà không cần sử dụng hóa chất.
Quá trình tđc của vsv
Log phase = exponential phase = trophophase
- Trong giai đoạn phát triển ở pha log, các sản phẩm được tạo ra rất cần thiết cho sự phát
triển của tế bào và bao gồm các axit amin, nucleotide, protein, axit nucleic, lipid,
carbohydrate, v.v.
- Quá trình tổng hợp các sp tđc b1 của các vi sinh vật hoang dại mà sản lượng của chúng
đủ cho nhu cầu của vi sinh vật.
 - Vì vậy, nhiệm vụ của nhà vi sinh vật học công nghiệp là biến đổi các sinh vật hoang dại
và cung cấp các điều kiện nuôi cấy để nâng cao năng suất của các hợp chất này.
Bảng 1.2. Một số sản phẩm trao đổi chất bậc 1 của vi sinh vật và ý nghĩa thương mại của
chúng
Chất trao đổi chính Ý nghĩa thương mại
Ethanol  Thành phần hoạt tính trong đồ uống có cồn
 Được sử dụng như một nhiên liệu động cơ khi trộn lẫn
với xăng dầu
Citric acid Sử dụng đa dạng trong ngành công nghiệp thực phẩm
Glutamic acid Tăng hương vị
Lysine Bổ sung thức ăn
Nucleotides Tăng hương vị
Phenylalanine Tiền thân của aspartame, chất làm ngọt
Polysaccharides ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tăng cường thu hổi
dầu
Vitamins Bổ sung thức ăn

Idiophase = pha log + pha ổn định (chủ yếu là pha ổn định)

-
Các hợp chất dường như không có bất kỳ chức năng rõ ràng nào trong tế bào trao đổi
chất (sp b2 của quá trình trao đổi chất)
- Sp tđc b2 có thể xảy ra trong môi trường nuôi cấy liên tục với tốc độ tăng trưởng thấp và
là đặc tính của các tế bào phát triển chậm, cũng như không phát triển.
 Tầm quan trọng của các chất chuyển hóa này đối với ngành công nghiệp lên men là những
ảnh hưởng của chúng đối với các sinh vật khác hơn là sản xuất chúng.
 Nhiều sp tđc b2 có hoạt tính kháng khuẩn, những chất khác là chất ức chế enzym cụ thể,
một số là động cơ tăng trưởng và nhiều có đặc tính dược lý
Sản phẩm tái tổ hợp
Công nghệ tái tổ hợp DNA
- Gen của VSV bậc cao được chuyển vào tế bào VSV --> tổng hợp protein ngoại lai
- Tê bào chủ thường sử dụng
+ Escherichia coli
 + Saccharomyces cerevisiae
+ Nấm sợi/ nấm mốc
- Sản phẩm: Interferon, insulin, human serum albumin, chymosin...
Quá trình chuyển hóa
Quá trình chuyển hóa có thể được xúc tác bao gồm sự
khử hydro, sự oxi hóa, sự hydroxyl hóa, khử nước và
ngưng tụ, sự khử decarboxyl hóa, amine hóa, deamine
hóa và sự đồng phân hóa
Sự bất thường của quá trình chuyển hóa lên men là một
sinh khối lớn phải được tạo ra để xúc tác cho một phản
ứng đơn lẻ. Vì vậy, nhiều quá trình đã được sắp xếp hợp
lý bằng cách cố định toàn bộ tế bào, hoặc các cô lập
enzyme xúc tác các phản ứng. Các tế bào cố định hoặc các enzym có thể được coi là chất xúc tác

Nội dung của quá trình lên men

Bất kể loại quá trình lên men nào (có thể có ngoại lệ của một số quá trình chuyển hóa), một quy
trình được thiết lập có thể được chia thành sáu phần cơ bản:
- Có công thức pha chế môi trường
- Tiệt trùng môi trường và tiệt trùng hệ thống
- Nhân giống để có chủng giống tinh sạch không tạp nhiễm, có 1 lượng đủ nhiều và có hoạt
lực mạnh
- Nuối dưỡng VSV trong bồn lên men ở quy mô công nghiệp trong 1 điều kiện hoàn hảo
nhất để tạo thành sản phẩm
- Thu nhận tinh sạch sản phẩm
- Xử lý chất thải của quá trình lên men
 CHƯƠNG 2: ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG VI SINH VẬT

Tấm kính đậy, lamen

Bản kính mang vật với lỗ

cạn và lưới nội tiếp

Huyền phù vi khuẩn

được đặt trên khe
trượt và thấm bên
dưới lamen. Huyền
phù lấp đầy chỗ
trống nông đã biết
thể tích qua lưới

Hình 5.1. Ước tính tổng số tế bào bằng phép đo kính hiển vi trực tiếp. Buồng đếm Petroff-Hauser
là một bản kính mang vật chuyên dụng với lưới khắc của vùng đã biết. Một giọt huyền phù của
tế bào được đặt ở phía trên, tiếp theo sau là một lamen. Vì độ sâu của chất lỏng bị giữ được biết
đến, thể tích phủ qua lưới có thể được tính. Số lượng tế bào hiện diện trong một số ô vuông ngẫu
nhiên được tính, và giá trị trung bình tìm được. Phương pháp này không phân biệt giữa các tế
bào sống và chết.
how to use hemocytometer
Phải chắc chắn rằng dd mẫu đã đồng nhất. Ta cần sd thuốc nhuộm methylene blue 0.03% cho
mẫu với tỉ lệ 1:1, khi nhỏ mẫu lên bản kính hemocytometer, cần 1 lượng rất nhỏ (nhỏ hơn 1 giọt).
Sau đó đặt lên kính hiển vi. Nếu ta không nhuộm mẫu, ta sẽ không thấy nó trên bản kính. Chúng
ta sẽ bắt đầu với tụ quang (diaphragm) đóng kín và điều chỉnh chúng, ta sẽ chỉnh từ mục tiêu với
tầm nhìn kém cho đến khi thấy được hemocytometer, đặt nó vào vị trí trung tâm. Cũng với tụ
quang này, ta sẽ điều chỉnh nguồn sáng và điều chỉnh mục tiêu của nguồn sáng. Điều chỉnh qua
lại lên xuống cho đến khi có thể thấy, sau đó ta cần mở tụ quang (mở nhỏ) và bạn sẽ thấy các tế
bào chết màu xanh rất rõ ràng, không mờ nhạt.
Hemocymeter calculation
Tính mật độ tế bào sau khi đã đếm tế bào bằng hemocytometer, tùy thuộc vào kích thước tế bào,
ta có thể đếm được bốn hoặc năm hình vuông lớn hoặc năm hình vuông nhỏ hơn trong hình
vuông trung tâm. Bắt đầu với các ô vuông lớn sau đó đến các ô nhỏ ở trung tâm, hãy giả sử chúng
tôi đã đếm được 4 ô vuông lớn và bạn có số lượng các tế bào sống và chết, bây giờ bạn lấy trung
bình của các ô sống dựa trên cộng tất cả các số đếm và chia cho số ô vuông bạn đã đếm được
vậy ta được 23 ta làm tương tự với các ô chết và ta được 3.
chúng ta có các chỉ số tế bào sống trung bình để tính toán khả năng sống sót. Khả năng tồn tại là
phần trăm tế bào sống trên tổng số tế bào, vì vậy nó được tính bằng cách chia số lượng tế bào
sống cho tổng số tế bào sống và chết, chúng ta nhận được khả năng sống là 89%.

Bước thứ hai là tính toán mật độ tế bào, mật độ tế bào đại diện cho số lượng tế bào trên thể tích

giả sử chúng ta có độ pha loãng 1:1 vì chúng ta đã sử dụng cùng một khối lượng mong muốn so
với các tb, vì vậy trong trường hợp của chúng ta, chúng ta có 23 tế bào sống trên mỗi hình vuông
vì chúng ta pha loãng chúng ta phải nhân với 2 và thể tích của 1 hình vuông là 10-4ml, chúng ta
nhận được 460 nghìn tế bào trên mỗi ml điều cuối cùng là tính tổng số tế bào sống. lấy mật độ
tế bào nhân với thể tích ban đầu của mẫu nuôi cấy mà bạn đã lấy , giả sử chúng tôi có 5 ml trong
trường hợp, đây sẽ là 2,3 triệu tế bào

nếu bạn muốn đạt được mật độ theo mong muốn, bạn lấy tổng số tế bào sống của mình sau đó
bạn chia cho mật độ mục tiêu mà bạn muốn đạt được.
Viable count: calculation
Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi như một phương pháp để ước tính số lượng vi sinh vật sống
sót trong một mẫu và nó được thực hiện bằng cách pha loãng nối tiếp và sau đó trải mẫu khi các
đĩa được ủ, ta sẽ thấy rằng bạn có một số đĩa có quá nhiều khuẩn lạc để đếm và có một số đĩa
không có khuẩn lạc nào cả, vì vậy cần chọn độ pha loãng cho một đĩa có từ 20 đến 200 khuẩn lạc
và điều đó giúp đếm chính xác hơn.

Box 5.1: Ước tính số lượng tế bào có thể sống được

Để mẫu được trải đĩa mà có chứa số lượng tế bào thích hợp, thì mẫu ban đầu phải được pha
loãng nối tiếp. Trong ví dụ dưới đây, nó được pha loãng bởi hệ số mười ở mỗi giai đoạn để đưa
ra độ pha loãng cuối cùng là 10-5 (một phần một trăm nghìn).
Các mẫu 0.1 ml của từng dung dịch pha loãng được trải đĩa trên một môi trường rắn thích hợp
và các khuẩn lạc được phép phát triển.
TNTC = quá nhiều để đếm
Trong các ống trước đó, huyền phù của tế bào là quá đậm đặc,
dẫn đến quá nhiều khuẩn lạc để đếm. Trong ống cuối, huyền phù
là quá loãng nên không có tế bào nào trong mẫu được lấy. Độ
pha loãng 10-3 được sử để tính nồng độ của tế bào trong môi
trường ban đầu, vì nó nằm trong khoảng 30-300 khuẩn lạc được
xem là đáng tin cậy về mặt thống kê.

Số lượng khuẩn lạc (độ pha loãng 10-3) = 65

Số lượng cfu trên mỗi ml (cfu/ml) huyền phù được pha loãng = 65 x 10 =650
Số lượng cfu trên mỗi ml (cfu/ml) ban đầu = 650 x 103 = 6.5 x 105

Box 5.2: Phương pháp số có xác suất cao nhất (MPN method)
Trong ví dụ dưới đây, ba bộ năm ống nghiệm canh trường đã
được cấy 10 ml, 1 ml và 0.1 ml mẫu nước. Các ống được ủ để
cho phép bất kì vi khuẩn nào hiện diện (trong mẫu) nhân lên
với số lượng, và được ghi là “tăng trưởng” (sự tạo bóng đen)
hoặc “không tăng trưởng” (không tạo bóng). Mật độ tế bào
thống kê rất có khả năng làm tăng kết quả thu được (5-3-1)
sau đó được tra cứu trên một tập hợp các bảng MPN. Bảng
(bất kì phần nào được hiển thị) chỉ ra rằng có xác suất 95% mà
mẫu nằm trong khoảng 40-300 tế bào/ml, với 110 tế bào/ml là giá trị có khả năng.
Hình 5.2. Ước tính số lượng tế bào bằng màng lọc. Các tế bào vi sinh vật hiện diện trong một mẫu
nước được giữ lại trên màng, mà sau đó được đặt trên môi trường thạch để cho phép khuẩn lạc
phát triển. Kỹ thuật này được sử dụng để tập trung các tế bào hiện diện ở mật độ thấp trong một
thể tích lớn.
Hiển thị số của
giá trị độ hấp thụ

Bước sóng cụ thể

của tia sáng
Một số tia sáng bị tán xạ bởi
dịch huyền phù tế bào

Ánh sáng
không bị
tán xạ

Mối quan hệ không còn tuyến

tính ở mật độ tế bào cao

Hình 5.3: Phép đo gián tiếp số lượng tế bào bằng phép đo độ đục
a) Phép đo độ đục cung cấp số lượng ước tính ngay lập tức của mật độ vi khuẩn bằng cách đo
mức độ mà một môi trường tán xạ ánh sáng chiếu qua nó trong một quang phổ kế. Độ hấp thụ
là một thước đo lượng ánh sáng bị tán xạ bởi dịch huyền phù tế bào.
b) Trong giới hạn nhất định, có mối quan hệ tuyến tính giữa số lượng tế bào và mật độ quang
học. Bằng cách xác định số lượng tế bào hoặc khối lượng tế bào cho các mẫu mật độ quang học
đã biết, một biểu đồ hiệu chuẩn có thể được tạo ra.
 Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu

Giảm tốc độ tăng

trưởng do sự giảm độ
bão hòa nhiệt của
protein.

Nhiệt độ tăng trưởng tối Nhiệt độ tăng trưởng tối đa

thiểu

Hình 5.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật. Các yếu tố điều chỉnh
nhiệt độ tối thiểu, tối ưu và tối đa cho một sinh vật cụ thể được chỉ định. Đường cong không đối
xứng, với nhiệt độ tối ưu ở gần mức tối đa hơn so với mức tối thiểu.

Thermophile: VSV ưa nhiệt

Mesophile: VSV ưa nhiệt độ trung bình

Psychrophile: VSV ưa lạnh
Extreme thermophile: VSV ưa nhiệt cực
đoan

Hình 5.5: Vi sinh vật có thể được phân loại theo phạm vi nhiệt độ mà tại đó chúng phát triển.
 Acidophile: VSV ưa axit
Neutrophile: VSV ưa trung tính

Alkalophile: VSV ưa kiềm

Hình 5.6: Ảnh hưởng của pH đến tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật. Các loài vi sinh vật riêng lẻ
thường có một phạm vi pH tương đối hẹp. Mặc dù đối với hầu hết các loài này là xung quanh tính
trung tính, thì cả hai dạng ưa axit và ưa kiềm có tồn tại. Hình dạng của đường cong phản ánh các
đặc tính của các enzyme và các protein khác của một sinh vật cụ thể.
Acidophilic = ưa acid; một thuật ngữ được áp dụng cho các sinh vật cho thấy sự tăng trưởng tối
ưu trong điều kiện axit (pH < 5.5).

a) Vi khuẩn hiếu khí bắt buộc

b) Vi khuẩn kị khí tùy ý
c) Vi khuẩn kị khí bắt buộc
d) Vi khuẩn kị khí không bắt buộc
e) Microaerophiles: vi khuẩn vi hiếu khí

Hình 5.7: Vi sinh vật có các yêu cầu oxy khác nhau. Trong nuôi cấy tĩnh, các vi sinh vật chiếm giữ
ở các vùng khác nhau của môi trường, phản ánh kiểu sử dụng oxy của chúng. a) Vi khuẩn hiếu khí
bắt buộc phải phát triển ở hoặc gần bề mặt, nơi ôxy có thể khuếch tán. b) Vi khuẩn kị khí tùy ý có
thể điều chỉnh sự trao đổi chất của chúng với các điều kiện oxy nhiều. c) Ngược lại, các vi khuẩn
kị khí bắt buộc chiếm các khu vực không có oxy. d) Các vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc không sử
dụng oxy, nhưng chúng không bị ức chế bởi nó. e) Vi khuẩn vi hiếu khí có yêu cầu oxy cụ thể, và
chỉ có thể phát triển trong phạm vi hẹp của áp lực oxy.
Điều kiện tiên quyết của một vi sinh vật công nghiệp
Một vi sinh vật phù hợp để sử dụng trong công nghiệp, tất nhiên là tạo ra cơ chất đáng quan tâm,
và ngoài ra:
1. Có khả năng tăng trưởng nhanh (thiết bị đắt tiền, ít ô nhiễm, kiểm soát dễ dàng hơn các yếu
tố môi trường của thùng lên men)
2. Không gây bệnh và không có độc tố (hoặc, nếu được sản xuất, dễ dàng bất hoạt).

3. Các tế bào lớn hơn được ưu tiên (dễ dàng tách riêng biệt khỏi môi trường nuôi cấy)
4. Hình thức tăng trưởng: tăng trưởng dạng hạt được ưa thích hơn tăng trưởng dạng sợi (độ
nhớt!)
5. Dễ thực hiện các thao tác di truyền: cải thiện dòng bằng đột biến và chọn lọc. (Các đột biến
có hiệu quả trong các tế bào đơn bội > các tế bào lưỡng bội và trong các tế bào đơn nhân > các
tế bào đa nhân, với các sinh vật lưỡng bội hoặc đa nhân, đột biến của một bộ gen sẽ không dẫn
đến đột biến mà có thể dễ dàng bị cô lập. Với nấm, bào tử dạng sợi có thể được thao tác di truyền
nhưng không phải là sợi nấm.
Nguồn của bộ sưu tập môi trường

Bộ sưu tập môi trường mà cung cấp các môi trường cho các loại vi sinh vật công nghiệp
 Hình 5.8 a) Trong điều kiện lý hóa lý tưởng, số lượng tế bào trong một quần thể sinh vật đơn
bào tăng theo cấp số nhân. b) Một sơ đồ của logarit của số lượng tế bào dựa theo thời gian
trong quá trình tăng theo cấp số mũ cho một đường thẳng
Box 5.5 Tăng trưởng diauxic
Khi E.coli phát triển trong một môi trường chứa
glucose và lactose, nó ưu tiên chuyển hóa
glucose vì nó tiết kiệm năng lượng hơn để làm
như vậy. Tế bào có một cơ chế điều tiết ngăn
chặn sự tổng hợp các enzyme chuyển hóa lactose
cho đến khi tất cả glucose được sử dụng hết (xem
chương 11). Tại thời điểm này phase lag thứ 2 được nhập vào, trong khi các enzym chuyển hóa
lactose được tổng hợp. Sự tăng trưởng như vậy được gọi là diauxic, và đường cong tăng trưởng
kết quả là nhị pha.

Hệ thống nuôi cấy

1. Batch culture
2. Semi-continuous culture, trong đó một phần mẫu cấy được thu nhận trong khoảng thời
gian đều đặn và được thay thế bằng một thể tích môi trường tương đương.
3. Fed batch culture, chất dinh dưỡng được đưa vào môi trường nuôi cấy dẫn đến tăng thể
tích
4. Continuous perfusion trong đó quần thể tế bào bất động được tưới bằng môi trường
mới và tương đương với phản hồi nội bộ liên tục hệ thống.
5. Continuous culture

Kỹ thuật nuôi theo mẻ

 còn được gọi là hệ thống nuôi khép kín.
 Trong kỹ thuật này, đầu tiên dung dịch dinh dưỡng được chuẩn bị và sinh vật nuôi cấy
được cho vào và sau đó không có gì được thêm vào thùng lên men ngoại trừ sục khí.
  Trong nuôi cấy theo mẻ, môi trường mới được thêm vào hoặc không sử dụng hết môi
trường sẽ bị loại bỏ khỏi bình nuôi cấy. Do đó khối lượng nuôi cấy không đổi.
 Vì môi trường mới không được bổ sung trong quá trình ủ nên nồng độ dinh dưỡng giảm
liên tục. Hơn nữa các chất chuyển hóa độc hại khác nhau cũng tích tụ trong bình nuôi
cấy. Do đó kỹ thuật nuôi cấy theo mẻ cho đặc điểm đường cong sinh trưởng với pha
lag, pha log. pha tĩnh và pha suy vong.
Ưu điểm: Kỹ thuật nuôi cấy theo mẻ ít có khả năng bị nhiễm bẩn vì đây là hệ thống nuôi trồng
khép kín.

Nhược điểm: nó cho năng suất sản phẩm thấp và nó không phải là thủ tục kinh tế

Kỹ thuật nuôi cấy bổ sung cơ chất gián đoạn (fed batch)

 Nuôi cấy theo đợt còn được gọi là hệ thống nuôi cấy nửa kín nửa hở
 Trong kỹ thuật này, lúc đầu môi trường dinh dưỡng được chuẩn bị và nó được cấy vào
sinh vật nuôi cấy và sau đó được ủ trong thời gian dạng hạt.
 Trong quá trình ủ, một chất dinh dưỡng cụ thể được thêm vào các khoảng thời gian mà
không cần loại bỏ môi trường đã sử dụng hết. Do đó thể tích nuôi cấy tăng liên tục.
 Kỹ thuật nuôi cấy fed batch được áp dụng trong nhiều loại quy trình lên men.
 Trong quá trình lên men, một số chất dinh dưỡng rất cần thiết cho quá trình nhưng khi
các chất dinh dưỡng này được cung cấp ở nồng độ cao hơn trong môi trường nuôi cấy,
chúng sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn, cuối cùng thì quá trình lên men sẽ ngừng lại.
Do đó các chất dinh dưỡng như vậy được giữ ở nồng độ thấp hơn ban đầu và nó được
bổ sung từ từ và liên tục trong quá trình lên men.
Ưu điểm: • Nuôi cấy theo lô Fed cho ra sản phẩm lớn hơn so với kỹ thuật nuôi theo lô.
Nhược điểm: • nguy cơ ngoại nhiễm cao hơn batch culture

Kỹ thuật nuôi cấy liên tục

 Kỹ thuật nuôi cấy liên tục còn được gọi là hệ thống mở
 Trong kỹ thuật này, chất dd được thêm vào liên tục trong bình và sản phẩm liên tục
được lấy ra. Vì vậy thể tích không đổi
 Trong kỹ thuật này, vi khuẩn phát triển liên tục trong giai đoạn log của chúng. Loại tăng
trưởng này được gọi là tăng trưởng ở trạng thái ổn định.
 Mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy liên tục không đổi và nó đạt được bằng cách
duy trì tốc độ pha loãng và dòng chảy không đổi.
 Các hình thức tiếp cận nuôi cấy liên tục:
1. Chemostat
 Đây là kiểu tiếp cận phổ biến nhất nhằm kiểm soát mật độ tb và tốc độ tăng trưởng.
  Hai yếu tố được sử dụng trong chemostat, tỷ lệ pha loãng và
nồng độ của chất dinh dưỡng giới hạn.
 Trong nuôi cấy liên tục, các sản phẩm cuối cùng không tích lũy
và các chất dinh dưỡng không bị cạn kiệt hoàn toàn. do đó vi
khuẩn không bao giờ đạt được ở pha tĩnh vì các chất dinh dưỡng
tươi được cung cấp liên tục và các sản phẩm cuối cùng được loại
bỏ liên tục.
 Trong chernostat, môi trường lỏng chứa một số chất dinh
dưỡng ở nồng độ giới hạn sinh trưởng và nồng độ chất dinh
dưỡng giới hạn xác định tốc độ phát triển của vi khuẩn.
 Trong quá trình chemostat ở trạng thái ổn định, nồng độ của
chất dinh dưỡng giới hạn không đổi vì tốc độ bổ sung chất dinh dưỡng bằng tốc độ mà
sinh vật sử dụng cộng với dòng chảy qua đầu ra.
 Để kiểm tra xem có mật độ tế bào không đổi hay không, hãy kiểm tra nồng độ của chất
dinh dưỡng tinh túy đó trong túi. . nếu nồng độ của chất dinh dưỡng đó bị thay đổi thì
nó Cho biết mật độ vi khuẩn đang thay đổi. Do đó trong trường hợp này tốc độ dòng chảy
được điều chỉnh để duy trì mật độ tế bào không đổi.
2. Turbidostat
 Trong turbidostat, một thiết bị quang điện được sử dụng để theo dõi mật độ tế bào
trong bình nuôi cấy.
 Thiết bị cảm biến quang học đo độ đục (độ hấp thụ) của dịch cấy trong bình.
 nếu nồng độ bị thay đổi, nó được thiết bị quang điện nhận thấy và tốc độ dòng chảy
được điều chỉnh để Duy trì mật độ tế bào không đổi trong lớp biểu bì.

Batch culture (nuôi cấy mẻ)

- Nuôi cấy trong một hệ thống kín với một lượng cơ chất (chất dinh dưỡng) giới hạn ban
đầu.
- Sự nuôi cấy sẽ trải qua một số pha
1. Lag phase
 Không có sự sinh trưởng của vsv
 Là thời gian để vsv thích nghi với điều kiện nuôi cấy.
 Trong một quy trình thương mại, chiều dài của lag phase phải được giảm càng
nhiều càng tốt và điều này có thể đạt được bằng cách sử dụng một loại chất cấy thích
hợp.
2. Pha log

Khi vi khuẩn đa thích nghi với điều kiện môi trường mới và tổng hợp ezyme cần thiết cho việc
sử dụng cơ chất có sẵn, chúng có khả năng bắt đầu phân chia bằng cách nhân đôi . điều này dẫn
tới tăng trưởng bằng cấp số mũ. Dưới điều kiện tối ưu số lượng tế bào có thể tăng gấp đôi
trong khoảng thời gian cố định và có thể được dự đoán trước. thời gian này còn được gọi là
thời gian thế hệ. đối với vi khuẩn E. Coli là 20ph và đối với hầu hết VSV là nhỏ hơn 1h. một vài
loại vi khuẩn có thời gian thể hệ khoảng vài giờ. Vì vậy trong suốt quá trình phát triển cấp số
mũ, số lượng tế bào trong pha log có thể được xác định bằng công thức:
NT=N0 x 2n
Với:
- NT là số tế bào tại thời điểm T
- N0 là số lược tế bào tại thời điểm 0 ( số lượng tế bào ở thời điểm bắt đầu phát triển
theo cấp số mũ)
- L là chiều dài pha lag
- n là số lượng lần nhân đôi tại thời điểm T-> n=T/Td
- Td là thời gian thế hệ
- T là thời gian tại thời điểm đang xét
Lấy logarithm cơ số 2 cả 2 vế:

Trong đó
- µ là hằng số tốc độ sinh trưởng đặc trưng
- với pha ổn định thì µ=0, pha log µ= max, pha suy vong µ<0
- dx/dt: sự thay đổi số lượng sinh khối trong một đơn vị thời gian = tốc độ sinh trưởng x
sinh khối
 - Xt là sinh khối ở thời điểm t
- X0 là sinh khối từ điểm bắt đầu
- t: là khoảng thừi gian từ X0-> Xt

Dễ dàng quan sát phag log nhờ sự nhân đôi của tế bào vsv, động vật, và thực vật
Vi sinh vật dạng sợi cũng phát triểm phase log theo cấp sô mũ

Trong đó :
- Dx/dt là để tính đơn bào
- dH/dt và dA/dt là tính dạng sợ
- H là tổng chiều dài hyphal và A là số đầu nút phát triển

Đây là phương trình cách xác đinh µ bằng thực nghiệm

Với : đồ thị của pha log với thời gian là đường thẳng, µ là độ dốc của đường thẳng đó, càng dốc
thì càng nhanh.
- Giai đoạn này chất dinh dưỡng còn thừa
- Vi sinh vật phát triển ở tốc độ sinh trưởng đặc trưng tối đa của chúng
Bản chất của giới hạn tăng trưởng có thể được chứng minh bằng cách nuôi cấy sinh vật trong
điều kiện có nhiều nồng độ cơ chất và vẽ biểu đồ nồng độ khối lượng sinh học ở pha tĩnh so với
nồng độ cơ chất ban đầu, như trong Hình 2.2. Từ Hình 2.2, có thể thấy rằng trên vùng A đến B,
sự gia tăng nồng độ cơ chất ban đầu làm tăng tỷ lệ sinh khối được tạo ra ở giai đoạn trạm. Tình
huống có thể được mô tả bằng phương trình:
trong đó

 x là nồng độ sinh khối được tạo ra,

 Y là hệ số năng suất (g sinh khối được tạo ra g
"chất nền tiêu thụ),
 SR là nồng độ chất nền ban đầu và
 s là nồng độ chất nền còn lại.

vùng A đến B trong Hình 2.2, s =0 tại điểm ngừng tăng

trưởng. Vì vậy, phương trình (2.4) có thể được sử dụng để
dự đoán sinh khối có thể được tạo ra từ một lượng nhất
định của chất nền

Môi trường giới hạn sự phát triển có thể được

khảo sát bằng sự phát triển của VSV khi có mặt
các khoảng nồng độ cơ chất khác nhau và
đường cong nồng độ sinh khối trong pha ổn
định theo nồng độ cơ chất ban đầu được biểu
diễn ở hình trên

Dựa vào đồ thị ta thấy:

 Cơ chất thiếu sinh khối tối đa giảm

 Cơ chất dư  sinh khối tối đa không đổi
 Khoảng A-B: lượng cơ chất trong môi trường thiếu- cho thêm thì cơ chất thì sinh khối nhiều
hơn,
 Đoạn B-C: đoạn phù hợp nhất về nồng độ cơ chất, lượng cơ chất không quá nhiều cũng không quá
dư, đủ để thu được lượng sinh khối lớn nhất.
 Đoạn C-D: lượng cơ chất trong môi trường cao, cho thêm cơ chất vào  sinh khối tích lũy cũng
không tăng thêm cơ chất thừa dẫn đến hiệu suất giảm. Nếu nồng độ cao thì ức chế ngược lên
bản thân VSV, tại áp suất thẩm thấu lớn  thiết kế môi trường lên men sao cho nồng độ lớn hơn
C. tại đây còn bị ảnh hưởng bởi các sản phẩm phụ không có lợi tích tụ.

o Hệ số năng suất (Y) là thước đo hiệu quả của việc chuyển đổi bất kỳ một cơ chất nào thành
sinh khối và nó có thể được sử dụng để dự đoán nồng độ cơ chất cần thiết để tạo ra một
nồng độ sinh khối nhất định.
o Tuy nhiên, điều quan trọng cần lưu ý là Y không phải là hằng số, nó sẽ thay đổi theo tốc độ
phát triển, pH, nhiệt độ, chất nền giới hạn và nồng độ chất nền

Sự giảm tốc độ tăng trưởng và ngừng tăng trưởng do chất nền cạn kiệt, có thể được mô tả bằng
mối quan hệ giữa u và chất nền hạn chế tăng trưởng tồn tại, được biểu diễn trong phương trình
(2.5) và trong Hình 2.3 (Monod, 1942):

s là nồng độ cơ chất còn lại,

K, là hằng số sử dụng cơ chất, về

số bằng nồng độ cơ chất khi u
bằng một nửa umax và là thước đo
ái lực của sinh vật đối với cơ chất
của nó.

-
Cách xác định Ks và µmax trong thực
nghiệm
-
 Hình: Ảnh hưởng của nồng độ cơ
chất giới hạn còn lại đối với tốc độ
sinh trưởng đặc trưng của một vi
khuẩn hypothetical (giả định)
- Specific growth rate: hằng số tốc
độ sinh trưởng
- Redundancy of substrate: cơ chất
còn dư

 Vùng AB

o Tương đương với pha lũy thừa trong nuôi cấy theo mẻ nơi nồng độ cơ chất vượt quá và tăng
trưởng ở umax

o u = umax

 Vùng CA

o Tương đương với giai đoạn giảm tốc trong nuôi cấy theo mẻ, nơi sự phát triển của sinh vật
dẫn đến sự cạn kiệt cơ chất để tăng trưởng- giới hạn nồng độ sẽ không hỗ trợ umax

o u<umax

 Nếu sinh vật có ái lực rất cao với chất nền giới hạn
(chất dd có ảnh hưởng quan trọng nhất, thường ám chỉ
nguồn cacbon)(giá trị Ks thấp) thì tốc độ tăng trưởng sẽ
không bị ảnh hưởng cho đến khi nồng độ chất nền giảm
xuống mức rất thấp. Do đó, giai đoạn giảm tốc của quá
trình nuôi cấy như vậy sẽ ngắn
 Nếu sinh vật có ái lực thấp với cơ chất (giá trị K cao)
thì tốc độ tăng trưởng sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng ở
nồng độ cơ chất tương đối cao. Do đó, giai đoạn giảm tốc
đối với qt nuôi cấy như vậy sẽ tương đối dài

3. Pha ổn định
 Pha tĩnh trong nuôi cấy theo mẻ là thời điểm mà tốc độ tăng trưởng giảm xuống 0
 Tuy nhiên, pha tĩnh là một thuật ngữ sai lầm về sinh lý của sinh vật, vì quần thể vẫn hoạt
động trao đổi chất trong pha này và có thể tạo ra các sản phẩm được gọi là sp b2,
không được tạo ra trong giai đoạn tăng trưởng cấp số mũ.
 Pha này được gọi là pha quần thể tối đa (Nmax, Xmax). Hoạt động trao đổi chất của pha
tĩnh đã được ghi nhận trong các mô tả sinh lý về sự phát triển của vi sinh vật
 Growth-linked product = primary metabolite (Sản phẩm liên quan đến sự sinh trưởng =
Sản phẩm trao đổi chất bậc 1)
o Biểu thức động lực học phụ thuộc vào sự tạo thành growth-associated và
maintenance-associated.
dp/dt= qpx = rp
- p: nồng độ của sản phẩm
- qp: tốc độ đặc trưng tạo thành sản phẩm (mg product g-1 biomass h-1: mg sản phẩm g-1
sinh khối h-1)
rp = (Yp/xµ + mp)x
qp = (Yp/xµ + mp)
- mp: tốc độ tạo thành sản phẩm (the specific rate of product formation due to
maintenance);
- rp: the volumetric rate of product formation (kg m-3s-1) (tỷ lệ thể tích tạo thành sản phẩm)
- rx: the volumetric rate of biomass formation (kg m-3s-1) (tỷ lệ thể tích tạo thành sinh khối)
- Yp/x: the theoretical yield of product from biomass (hiệu suất lý thuyết tạo thành sản phẩm
từ sinh khối)
Sản phẩm trao đổi chất bậc 1: qp = Yp/xµ
Sản phẩm trao đổi chất bậc 2: qp = mp
Sản phẩm trao đổi chất hỗn hợp: qp = (Yp/xµ + mp)
o Growth-associated (Sản phẩm trao đổi chất bậc 1)
o Được tạo thành cùng thời điểm với sự phát triển của tế bào
 Các enzyme cấu thành: glucose isomerase
 Chất trao đổi trung gian: pyruvate, citrate, acetate
o Non-growth-associated (Sản phẩm trao đổi chất bậc 2)
o Xảy ra trong pha ổn định (µ =0)
 Sản phẩm trao đổi chất bậc 2: kháng sinh
 o Mixed-growth associated (Sản phẩm trao đổi chất hỗn hợp)
o Xảy ra trong giai đoạn sinh trưởng và ổn định
 Phụ phẩm chuyển hóa: lactate, ethanol
 Các sản phẩm trao đổi chất bậc 2.

1. tế bào lấy chất dinh dưỡng để sinh trưởng

và sinh sp trao đổi chất bậc 1. Tế bào và sp trao
đổi chất cùng đồng thời nhiều hoặc ít
2. Sau khi tế bào và sp trao đổi chất thứ cấp
được sản xuất, tế bào sẽ chuyển sp trao đổi
chất bậc 1 thành sp tđc bậc 2
3. Sau khi tế bào được sản xuất thì chất dinh
dưỡng được chuyển thành sp tđc bậc 2

Glucose + ethanol  cells + acetic acid + co2 (Nếu chỉ có ethanol,vk sẽ lấy ethanol chuyển thành sinh khối)
 CHƯƠNG 3. PHÂN LẬP CHỦNG GIỐNG VSV
Isolation (phân lập)
Phân lập là quá trình thu nhận chủng vi sinh vật thuần khiết có khả năng thực hiện những
phản ứng hay tạo thành các sản phẩm mong muốn.
 Một số tiêu chí quan trọng trong lựa chọn chủng vi sinh vật:
1. Đặc tính về dinh dưỡng của vi sinh vật: vi sinh vật phải sử dụng môi trường rẻ tiền
hoặc sử dụng một loại chất dinh dưỡng đã được xác định trước ( ví dụ: sử dụng
methanol làm nguồn năng lượng).
2. Nhiệt độ tối thích của vi sinh vật: khi nhiệt độ tối thích của một chủng vi sinh vật trên
40oC sẽ làm giảm chi phí trong việc làm mát bình lên men.
3. Chủng giống phải phù hợp với hệ thống lên men có sẵn *
4. Chủng giống có tính ổn định cao và có thể thực hiện được thao tác về gen dễ dàng*
5. Sản lượng và hiệu suất tạo thành sản phẩm cao thể hiện qua khả năng chuyển hóa cơ
chất tạo thành sản phẩm
6. Sản phẩm dễ tách khỏi môi trường nuôi cấy*
Điểm 3,4 và 6 sẽ được đánh giá bằng các kiểm tra chi tiết sau đó phân lập và vi sinh vật phù hợp
nhất để sản xuất kinh tế được lựa chọn trên cơ sở của các kết quả này
Một số kĩ thuật cơ bản trong quá trình phân lập
 Nuôi cấy làm giàu sinh khối trong môi trường lỏng
o Thực hiện trong các bình tam giác
o Trong môi trường có yếu tố chọn lọc
o Tiến hành lặp đi lặp lại sau đó chuyển sang làm giàu trong môi trường rắn
 Nuôi cấy làm giàu sinh khối trên môi trường rắn
o Sử dụng mt rắn
o Trên mt agar có 2 thứ: yếu tố chọn lọc và yếu tố phát hiện (preliminary diagnosis test)

Ví dụ: phân lập chủng Bacillus sinh alkaline proteases. Các loại đất với nhiều loại pH khác nhau
được sử dụng như chất cấy ban đầu và đến một mức độ nhất định, số lượng các chủng phân lập
được tương quan với độ kiềm của mẫu đất. Các mẫu đất được thanh trùng để loại bỏ các vsv
không sinh bào tử và sau đó cấy ria lên môi trường rắn ở pH 9-10 có chứa protein không hòa tan.
Khuẩn lạc tạo vòng tan do sự phân giải protein không hòa tan từ alkaline protease được tạo
thành. Đường kính vòng tan không chắc chắn tương ứng với khả năng tạo protease trong môi
trường lỏng. Tuy nhiên, ví dụ này đã chứng minh sự quan trọng của việc lựa chọn nguyên liệu
ban đầu, việc sử dụng một tác động có chọn lọc trong sự phân lập và sự hợp nhất của một thí
nghiệm phát hiện sơ bộ mặc dù việc sử dụng thì bị giới hạn.

 Kĩ thuật sàn
o Trước kia đòi hỏi phải có kinh nghiệm, tốn nhiều thời gian, công sức, xác xuất thành công
thấp
 o Hiện nay có nhiều hợp chất thương mại quan trọng được dùng trong sàng lọc để
phân lập, tăng khả năng thành công.
o Sự phát triển của kháng sinh được dùng để phát hiện các chủng vsv kháng.

Môi trường chọn lọc (Selective medium)

Các loại được bào chế để hỗ trợ sự phát triển của một nhóm sinh vật, nhưng ức chế sự phát triển của
nhóm sinh vật khác. Các mt này chứa chất kháng khuẩn, thuốc nhuộm hoặc cồn để ngăn chặn sự phát
triển của các sinh vật không trong mục tiêu nghiên cứu. Các loại môi trường chọn lọc bao gồm thạch
EM3, thạch Mannitol Salt, thạch MacConkey, và thạch Phenylethyl Alcohol (PEA).

Môi trường phân biệt (Differential medium)

phân biệt vi sinh vật này với khác dựa trên các đặc điểm sinh trưởng rõ ràng khi phát triển trên các loại
môi trường cụ thể. Các sinh vật có các đặc điểm tăng trưởng khác nhau thường cho thấy sự khác biệt rõ
ràng về tốc độ tăng trưởng khi được đặt trên các môi trường khác nhau. Ví dụ bao gồm blood agar,
thạch Eosin Methylene Blue (EMB), thạch Mannitol Salt và thạch MacConkey.

Bảo quản chủng giống VSV

- Trong qt bảo quản phải còn nguyên
- Trong suốt qt giữ giống phải đảm bảo nó không bị nhiễm VSV khác

Bảo quản ở nhiệt độ mát

 Bảo quản trên ống thạch nghiêng

o Giữ ở toC>0o bảo quản được vài tuần – 2 tháng hoặc <-40oC bảo quản nửa năm
o Sau khi cấy và để VSV phát triển trên thạch nghiêng thì sử dụng dầu khoáng tinh khiết
để tiệt trùng, sau đó đổ ngập mt agar và giữ lạnh ở <-40oC  giữ được 1 năm
 Bảo quản dưới ni tơ lỏng (<-150oC)
o Nuôi VSV để đạt được pha ổn định  thu sinh khối  cho vào mt chứa chất đông lạnh
 cho hỗn hợp VSV vào ống bằng nhựa chuyên biệt  nhúng ống vào ni tơ lỏng  giữ
được vài chục năm
o Trước khi đem ra sd  làm rã đông  -40oC  0oC (rã đông từ từ)
 Giữ ở trạng thái khô
o Bảo quản ở mt khô
o Thường dùng cho nấm mốc, dùng đất sấy khô, tiệt trùng  trộn huyền phù vsv  sấy ở
dk nhiệt độ phòng  đưa vào bao bì kín
 Đông khô (lyophylization)
o Phổ biến dùng để vận chuyển, giữ lâu, không lấy ra thường xuyên
o Đầu tiên nuôi VSV đạt pha ổn định --. Cho chất bảo vệ vào (sữa, huyết thanh,..)  lạnh
đông <-40oC  sấy thăng hoa. Lạnh đông trong bao bì (ống chuyên biệt)  đậy nắp giữ
được hàng chục năm (dùng trong thương mại chủng giống vsv)
o Để bảo quản VSV phải qua qt rất phức tạp nhưng giữ raastc dễ
 CHƯƠNG 3. MÔI TRƯỜNG LÊN MEN TRONG CÔNG NGHIỆP

 VSV đòi hỏi nước, nguồn năng lượng, nguồn C, N (C, N chiếm lượng lớn), khoáng chất, vitamin và
O2 ( đối với vi khuẩn hiếu khí)
 Trên quy mô nhỏ, tương đối đơn giản để sử dụng các môi trường tinh khiết, thỏa mãn như cầu
của VSV. Nhưng có thể không phù hợp để sử dụng trong các quy mô lớn.

Môi trường nuôi cấy ở quy mô lớn cần đáp ứng các tiêu chí sau đây:

- Đem lại hiệu suất tạo sản phẩm cao

- Nồng độ sp tích lũy cao
- Tốc độ tạo sp phải cao nhất
- Hiệu suất tạo thành sp không mong muốn nhỏ nhất
- Chất lượng nguồn nguyên liệu ổn định qua năm
- Trong suốt qt pha mt và tiệt trùng ít gây rắc rối
- Hạn chế trục trặc liên quan đến vấn đề khác: tinh chế, tách chiết,….

Thành phần môi trường: là một thành phần quan trọng của các thí nghiệm về lên men ở qui mô phòng
thí nghiệm, qui mô pilot, qui mô sản xuất. Các thành phần của môi trường phải đáp ứng như cầu để tạo
sinh khối và các phản ứng sản xuất chất chuyển hóa. Phải đáp ứng được nhu cầu cung cấp năng lượng cho
các quá trình sinh tổng hợp và nuôi dưỡng tế bào. Bước đầu tiên để xem xét là phương trình dựa trên
stoichiometry cho sự tăng trưởng và hình thành sản phẩm.

Phương trình dành cho quá trình lên men hiếu khí:

Môi trường từ nguồn carbon có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp và sinh năng lượng. sự yêu cầu về
nguồn carbon đối với sản xuất tạo sinh khối trong điều kiện hiếu khí có thể được ước tính từ hệ số năng
suất tế bào (Y) được định nghĩa là:

Lượng tế bào khô được tạo ra

Lượng carbon được sử dụng

 Mt lựa chọn ảnh hưởng đến hệ thống lên men được sd

 Môi trường phòng thí nghiệm có thể không phù hợp cho một bình lên men ở quy mô công nghiệp
bởi vì mô hình truyền khí ở 2 nơi khác nhau.
 Một môi trường có độ nhớt cao đòi hỏi tốn năng lượng cho việc phối trộn
 Đáp ứng các yêu cầu về tăng trưởng và tạo sản phẩm, môi trường cũng đòi hỏi có pH, tạo bọt, thế
oxi hóa khử phù hợp , khả năng hình thành bột cho phép. Và hình thái học của vi sinh vật.

Thành phần trong môi trường

- Là một phần quan trọng trong các quy mô nhỏ / lớn về lên men đặc biệt là trong sản xuất công
nghiệp
- Các thành phần môi trường phải đáp ứng nhu cầu để tạo sinh khối và chất chuyển hóa
- Đáp ứng được nhu cầu cung cấp năng lượng cho các quá trình sinh tổng hợp của quá trình lên
men.

Nguồn carbon (quan trọng nhất)

- ảnh hưởng rất lớn đối với tốc độ sinh trưởng của vsv
- yếu tố phải chọn: rẻ, sẵn có, chất lượng ổn định
- Việc lựa chọn nguồn cơ chất có thể bị ảnh hưởng bởi các quy định của chính phủ (pháp luật)
(chọn các chất mà chính phủ cho phép sử dụng).
- Tốt nhất là nên tiệt trùng nguồn cơ chất đường ở bồn riêng biệt (sterilize sugars separately) vì
chúng có thể phản ứng (react) với ion ammoni và các acid amin để hình thành các hợp chất chứa
nitơ màu đen mà sẽ ức chế 1 phần sự sinh trưởng của nhiều vi sinh vật.
- nguồn carbon: mật rỉ mía, củ cải đường, ngũ cốc, tinh bôt, glucose, sucrose và lactose

Nguồn nitơ

- 2 nguồn: nguồn hữu cơ và vô cơ

- Nitơ vô cơ có thể được cung cấp dưới dạng khí amoniac, muối amoni hoặc nitrat. Vì lý do này,
amoniac hoặc ion amoni là nguồn nitơ ưa thích.
- Muối ammonium như ammonium sulphate (NH4)2SO4 sẽ tạo ra điều kiện môi trường acid khi
ion ammonium được sử dụng và acid tự do được giải phóng (liberated).
- Ở 1 góc độ khác nitrates sẽ gây ra sự chuyển dịch kiềm khi mà chúng được trao đổi. Đầu tiên
muối ammonium nitrate (NH4NO3) sẽ tạo ra môi trường acid khi mà ion ammonium được sử
dụng (is utilized), và sự đồng hóa nitrate bị kiềm chế (nitrate assimilation is repressed).
- Khi ion ammonium đã bị cạn kiệt, thì sẽ xảy ra sự chuyển dịch từ acid qua kiềm (tạo ra môi
trường kiềm) khi nitrate được sử dụng như là nguồn nitơ thay thế.
- Nitơ hữu cơ tốt nhưng giá thành đắt. Nitơ vô cơ rẻ nhưng hiệu suất và sản lượng sản phẩm thấp
 Kết hợp giữa nguồn Nitơ hữu cơ và Nitơ vô cơ.

Khoáng (minerals)

- Tất cả các vi sinh vật đều cần các nguyên tố khoáng cho sự sinh trưởng và trao đổi chất.
- Trong nhiều môi trường, các nguyên tố khoáng như Magie, Phospho, Kali, Lưu huỳnh, Calci và
Clo là những thành phần thiết yếu, và bởi vì chúng có các nồng độ theo nhu cầu, chúng phải
được thêm vào như là các thành phần riêng biệt.
- Các nguyên tố khoáng như Cobalt, Đồng (Copper), Sắt, Mangan, Molypden và Kẽm cũng là các
nguyên tố thiết yếu nhưng thường tồn tại dưới dạng không tinh khiết (tức là trong thành phần
của các thành phần chính khác).
Yếu tố sinh trưởng
Chiếm 1 phần rất nhỏ trong mt nuôi cấy nhưng rất quan trọng
- Các yếu tố sinh trưởng chính là các chất dinh dưỡng có hàm lượng thấp, vi sinh vật không thể tự
tổng hợp được. Nếu thiếu các chất này thì vi sinh vật không thể sinh trưởng và phát triển.
- Một vài vi sinh vật không thể tổng hợp được các thành phần của tế bào và vì thế chúng cần các
tiền chất gọi là yếu tố sinh trưởng.
- Yếu tố sinh trưởng thường là các vitamin, nhưng cũng có thể là các acid amin, acid béo hoặc
sterol đặc trưng.
- Nhiều nguồn carbon và nitrogen tự nhiên sử dụng trong việc tạo môi trường lên men chứa tất
cả hoặc 1 vài yếu tố sinh trưởng cần thiết.

Nhu cầu oxy (cho lên men hiếu khí)

- Nếu thiếu oxy thì khả năng sinh trưởng giảm rất nhanh.
- Môi trường lên men có thể ảnh hưởng đến sự hiện diện của oxy theo nhiều cách khác nhau:

1) Sự trao đổi chất nhanh (Fast metabolism): Môi trường nuôi cấy có thể trở nên thiếu oxy vì bồn lên
men có thể bị thiếu oxy nếu các cơ chất như đường được sử dụng để trao đổi nhanh chóng và cần
lượng oxy lớn. ko có oxi  hiệu suất sản lượng càng ngày càng giảm

2) Tính lưu biến (Rheology): Các thành phần riêng biệt của môi trường có thể gây ảnh hưởng đến độ
nhớt của môi trường thành phẩm và có liên quan đến quá trình thổi khí và khuấy trộn (aeration and
agitation).

3) Chất phá bọt (Antifoams): Nhiều chất phá bọt đóng vai trò như các chất hoạt động bề mặt
(surface active agents) và làm giảm tốc độ vận chuyển oxy (reduce the oxygen transfer rate).  Nếu
có quá trình thổi khí (bổ sung oxy).

Chất phá bọt (antifoam)

- Bọt được kiểm soát trong 1 giới hạn phù hợp

- Nguyên nhân gây bọt: protein trong mt, mt có nồng độ nhớt cao  bọt dễ hình thành  mt bị
mất đi
- Sự hình thành bọt: trong mt lên men, thổi kk vào  khuấy trộn  tạo bọt  tăng thể tích 
(quá mức) bọt tràn ra ngoài  mang dd lên men ra ngoài. Bọt hình thành ảnh hưởng truyền
khối, truyền nhiệt.
- Nếu ko đc kiểm soát  ảnh hưởng đến vấn đề vật lí và sinh học
o Giảm thể tích làm việc của thiết bị lên men vì sự cạn kiệt oxy do các bọt khí.
o Có sự thay đổi kích thước của bọt khí.
o Giảm tốc độ truyền khối và tốc độ truyền nhiệt.
o Gây sai số dữ liệu do sự ảnh hưởng của bọt khí khi sử dụng điện cực cảm biến (sensing
electrodes).
o Quá trình kiểm tra và điều khiển không chính xác.

- Các chất phá bọt là các chất hoạt động bề mặt, có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt (surface
tension) của hệ bọt và làm giảm độ bền (destabilizing) của màng protein (protein films) bằng
cách:
o (a) Hình thành cầu liên kết kỵ nước giữa 2 bề mặt.
o (b) Dịch chuyển vị trí của protein hấp thu.
 o (c) Nhanh chóng lan ra trên bề mặt của màng.

Có 5 hình thức tạo bọt trong quá trình lên men:

1) Sự hình thành bọt duy trì ổn định trong suốt quá trình lên men (through-out – nghĩa là từ đầu đến
cuối). Tại thời điểm ban đầu, nguyên nhân tạo bọt là do môi trường lên men, thời điểm về sau là do hoạt
động của vi sinh vật (microbial activity).

2) Sự tạo bọt giảm đều (a steady fall in foaming) trong suốt giai đoạn đầu của quá trình lên men, sau đó
nó được giữ ổn định. Tại thời điểm ban đầu nguyên nhân là do môi trường nhưng về sau không hề có sự
ảnh hưởng nào bởi vi sinh vật (there are no later effects).

3) Sự tạo bọt giảm nhẹ ở giai đoạn đầu của quá trình lên men, sau đó lại tăng lên. Có rất ít ảnh hưởng
gây ra bởi môi trường lên men, các ảnh hưởng chủ yếu đến từ hoạt động của vi sinh vật.

4) Quá trình lên men có khả năng tạo bọt thấp tại thời điểm ban đầu. Những ảnh hưởng này chủ yếu là
do hoạt động của vi sinh vật.

5) Một hình thức tạo bọt phức tạp hơn trong suốt quá trình lên men có thể có sự kết hợp giữa 2 hoặc
nhiều hình thức đã mô tả bên trên.

Nếu như có sự tạo bọt quá mức thì có 3 cách để xử lý vấn đề này:

1) sử dụng các môi trường xác định (tức là mỗi 1 vi sinh vật có môi trường quy định khác nhau) và có sự
thay đổi 1 vài thông số vật lý (pH, nhiệt độ, quá trình thổi khí và khuấy trộn). Điều này cho thấy rằng bọt
là do các thành phần trong môi trường và không phải là 1 sản phẩm trao đổi chất.

2) sử dụng chất phá bọt. Đây là cách được sử dụng phổ biến.

3) Sử dụng thiết bị phá bọt cơ khí (a mechanical foam breaker).

Tiêu chuẩn lựa chọn chất phá bọt

1) Có thể phân tán nhanh và có tác dụng nhanh với hệ bọt.

2) Hoạt động kể cả khi ở nồng độ thấp.

3) Có khả năng hoạt động lâu dài trong việc chống hệ bọt mới hình thành (phá được cái này thì phải có
khả năng phá cái tiếp theo nếu có hình thành).

4) Không bị chuyển hóa bởi vi sinh vật.

5) Không độc đối với vi sinh vật.

6) Không độc đối với con người và động vật.

7) Không gây ra bất kỳ vấn đề nào trong quá trình trích ly và tinh sạch sản phẩm.

8) Không gây ra bất kỳ mối nguy nào khi thao tác.

9) Giá thành rẻ.

10) Không gây ảnh hưởng đến sự vận chuyển oxy.

11) Nên được tiệt trùng bởi nhiệt.

Một số chất phá bọt thường dùng

1) Alcohols; stearyl và octyl decanol

2) Ester

3) Acid béo và các dẫn xuất (derivatives), đặc biệt là glyceride, chứa dầu hạt bông (cottonseed), dầu hạt
lanh (linseed), dầu đậu nành (soy bean), dầu ô liu (olive), dầu gan cá tuyết (cod liver).

4) Silicones

5) Muối sulphonates

6) Hỗn hợp: Alkaterge C, oxazaline, poly-propylene glycol

 Các chất phá bọt này thường được bổ sung khi có sự tạo bọt trong suốt quá trình lên men.
 Vì nhiều chất phá bọt có khả năng hòa tan kém vì vậy chúng cần các chất mang như mỡ heo
(lard oil), paraffin lỏng hoặc dầu castor, những chất này có thể bị chuyển hóa và ảnh hưởng đến
quá trình lên men.
 Tuy nhiên, nồng độ của nhiều chất phá bọt (cần thiết để điều khiển quá trình lên men) sẽ làm
giảm tốc độ vận chuyển oxy tới 50%; vì vậy việc bổ sung chất phá bọt phải được giữ ở giá trị
tuyệt đối tối thiểu. Bên cạnh đó có nhiều chất phá bọt làm tăng tốc độ vận chuyển oxy.

CHƯƠNG 5. TIỆT TRÙNG

- Tiệt trùng khác thanh trùng

- Nếu quá trình lên men bị tạp nhiễm bởi vi sinh vật ngoại lai thì các hậu quả sau có thể xảy ra:
1. Bị nhiễm vsv ngoại lai
2. trong qt lên men liên tục, nếu ngoại nhiễm  vsv ngoại lai lấn át
3. nếu vsv ngoại lai phát triển  sinh ra nhiều vsv lẫn vào mt  lẫn vào sp cuối cùng  khó
tách chiết  khó thu nhận sp chính
4. làm sp chính bị phân hủy, vsv ngoại lai có thể sd sp chính của mình như 1 cơ chất
5. Các vi sinh vật ngoại lai có thể phân giải các sản phẩm mong muốn (desired product), điều
này thường xảy ra trong quá trình lên men tạo ra các kháng sinh (antibiotic), khi mà các vi
sinh vật ngoại lai có khả năng kháng lại tính ức chế của kháng sinh. Phân giải các kháng sinh
là 1 cơ chế kháng cự thường thấy
6. Sự nhiễm thể thực khuẩn có thể dẫn đến kết quả là sự phân giải môi trường lên men.

Có 2 dạng nhiễm: Nhiễm vi khuẩn và nhiễm thể thực khuẩn (phage – kí sinh trên vi khuẩn, không kí sinh
trên sinh vật đa bào).

Để tránh sự nhiễm thì có thể thực hiện các bước sau:

1) Sử dụng chủng vi sinh vật tinh khiết (pure inoculum) để thực hiện lên men.
2) Tiệt trùng môi trường lên men

3) Tiệt trùng bồn lên men (fermenter vessel)

4) Tiệt trùng tất cả các nguyên liệu thêm vào trong quá trình lên men.

5) Duy trì điều kiện vô trùng (aseptic condition) trong suốt quá trình lên men (điều này rất khó).