SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

AGRONOMSKI FAKULTET

EKOLOŠKO PČELARENJE I PČELE U EKOSUSTAVU

HIGIJENSKO PONAŠANJE KOD MEDONOSNIH PČELA I

MODULIRAJUĆA ULOGA OKTOPAMINA

Akademska godina: 2021./22. Knezić, Ivankić, Gudan

Sažetak.............................................................................................................................................3

1
Uvod.................................................................................................................................................3
Metoda............................................................................................................................................4
Uzgoj i selekcija pčela..............................................................................................................................4
Provođenje imunocitokemijske analize...................................................................................................4
Electroantennogram Recordings.............................................................................................................4
Rezultati...........................................................................................................................................5
Raspodijela Oktopamina u neuronima mozga medonosne pčele............................................................5
Razlike u ponašanju temeljene na intenzitetu obojenja..........................................................................6
EAG rezultati: Oktopaminskog tretmana.................................................................................................6
EAG Rezultati: Epinastinskog tretmana...................................................................................................7
Rasprava...........................................................................................................................................7
Popis literature................................................................................................................................8

2
Sažetak
Medonosne pčele Apis mellifera dijele se na higijenske i nehigijenske zajednice po brzini
otvaranja i uklanjanja mrtvog ili zaraženog legla. Nagon na saniranje takvog legla najvjerojatnije
potiču olfaktivni podražaji, koji su povezani s neuromodulatorom oktopaminom. Istraživanje
provedeno u Americi usporedilo je aktivnost tog oktopamina u higijenskim i nehigijenskim
pčelama (gledano genotipski i fenotipski). Uspoređena je imunocitokemijska obojenost neurona
koji sadrže oktopamin među te dvije skupine pčela. Također se ispitao utjecaj oktopamina i
epinastina (modulatora konkurentnog oktopaminu) na prag osjeta njuha tih dvaju kategorija
pčela. Rezultati su pokazali da je obojanost oktopamina i sukladnih neurona bila značajnija u
pčela koje su pokazivale higijenske sklonosti, odnosno koje su zatečene u čišćenju, od onih koje
nisu, i to neovisno o zajednici iz koje su uzete. Nadalje, hranjenje oktopaminom snizilo je osjetni
prag pčelama koje su uzete iz nehigijenskih zajednica dok ga je s druge strane hranjenje
epinastinom povisilo pčelama uzetima iz higijenskih zajednica.

Uvod
Istraživanje provedeno u Americi fokusiralo se na proučavanje higijenskog ponašanja
medonosne pčele Apis mellifera. Pčele dobi od 15 do 20 dana pokazuju sposobnost obavljanja
specifičnih zadataka čišćenja košnice uklanjajući leglo zaraženo bakterijskim i gljivičnim
patogenima te leglo napadnuto parazitom Varroa destructor. Prije se smatralo da tu sposobnost
pčela nasljeđuje dvama recesivnim genima no danas se smatra da je tim svojstvom upravlja
najmanje 7 gena što dovodi do velike raznolikosti među genotipovima i fenotipovima. Usto,
ispoljavanje higijenskog ponašanja mijenja se u zajednici i jedinki promjenom vanjskih
čimbenika kao što je dostupnost hrane i sl.
Higijensko je ponašanje bitno u održavanju zdravlja pčelinje zajednice i stoga je uvelike korisno
pčelarima. Pretpostavlja se da nagon za čišćenje potiču olfaktivni podražaji, mirisi mrtvog ili
zaraženog legla te bi ono moglo ovisiti o sposobnosti pčele da osjeti te mirise, odnosno
osjetnom pragu. U prethodnim se pokusima dokazalo da su pčele selekcionirane za higijensko
ponšanje osjetljivije na slabije olfaktivne podražaje koji dolaze od zaraženog legla i da pri nižim
koncentracijama mirisa mogu raspoznati zdravo od bolesnog legla. Budući da je se
neuromodulator oktopamin pokazao značajnim u određivanju osjetnog praga u pčelama, cilj
ovog istraživanja bio je ispitati razliku aktivnosti oktopamina u higijenskim i nehigijenskim
pčelama. Usporedio se intenzitet obojenja oktopamina u neuronima higijenskih i nehigijenskih
pčela te se usporedio utjecaj oktopamina i epistamina na osjetni prag pčela. Rezultati su
pokazali da su pčele zatečene u čišćenju legla postigle puno više rezultate u imunocitokemijskoj
analizi mozga, odnosno da je obojenje njihovih neurona bilo značajno intenzivnije. Higijenskim
je pčelama epinastin značajno smanjio osjetni prag dok ga je nehigijenskim pčelama oktopamin
značajno povisio. Takve razlike među higijenskim i nehigijenskim pčelama bi mogle indicirati da
okotpamin igra značajnu ulogu u oblikovanju higijenskog ponašanja pčela, utječući na njihov
osjetni prag i nagon za čišćenje.

3
Metoda
Uzgoj i selekcija pčela
Higijenske i nehigijenske zajednice pčela na kojima se provodilo istraživanje uzgojene su iz
zajednica A. mellifera talijanskog porijekla. U roditeljske su kolonije stavljeni dijelovi usmrćenog
legla po kojem se ustvrdilo koje su zajednice higijenskog ponašanja, a koje nehgijenskog
ponašanja. One zajednice u kojima su se ta usmrćena legla sanirala (otklopila i odstranila)
unutar 48 sati smatrale su se higijenskima, a one kojima je za isti zadatak bilo potrebno više od
6 dana smatrale su se nehigijenskima. Matice su se uzgojile iz onih zajednica kojima je trebalo
najmanje i onih kojima je trebalo najviše vremena da uklone mrtvo leglo te su se oplodile
mješavinom sperme trutova iz zajednica odgovarajućeg ponašanja.
Provođenje imunocitokemijske analize
Iz novonastalih su se roditeljskih zajednica izdvajali okviri s položenim jajima i stavljali u zasebne
košnice uzgojnih zajednica iznad matične rešetke. Jedan dan prije nego što je bilo predviđeno
izlaženje odraslih jedinki iz stanica u tim okvirima, leglo se stavljalo u inkubator. Svaka bi se
jedinka po izlasku iz inkubirane stanice označila bojom na prsima i zajedno sa svojim sestrama
stavila u košnicu za promatranje u kojoj je bilo približno tisuću neoznačenih pčela različitih dobi,
s okvirom peludi i nektara, s praznim plodištem i s prirodno oplođenom maticom. Leglo koje bi
matica zanijela u toj košnici za promatranje bi se uklanjalo netom prije izlaska odraslih jedinki iz
svojih stanica i zamijenilo bi se s mladim leglom. Na taj su način sve odrasle jedinke u košnici za
promatranje bile ili originalne jedinke prvobitne zajednice u toj košnici ili nove označene jedinke
iz higijenskih ili nehigijenskih zajednica.
Nakon 28 dana od introduciranja prvih jedinki u košnicu za promatranje, u košnicu se stavilo
usmrćeno leglo te se provelo izdvajanje jedinki. Izdvajale su se, nasumično odabrane, kontrolne
jedinke, kao i jedinke zatečene u čišćenju mrtvog legla. Izdvojene su se pčele zatim pothladile
na 4°C i mozak im se secirao. Moždane stanice su potom fiksirane, obojene OA antiserumom,
ispirane izotoničnim otopinama i inkubirane kako bi se pripremile za sufokusnu lasersku
mikroskopiju.
Slike obojenih neurona, u čijim se sinapsama nalazio oktopamin, dobivene sufokusnim laserom
rangirane su po intenzitetu obojenja kao „svijetle“ i „tamne“. Svijetlija boja indicirala je višu
koncentraciju neuromodulatora oktopamina, a tamnija obojenost nižu koncentraciju. Rezultati
mikroskopiranja obrađeni su statistički.
Electroantennogram Recordings
Pčele stare 15-18 dana nasumično su odabrane i izdvojene iz tri higijenske i tri nehigijenske
zajednice. Nakon što su imobilizirane pothlađivanjem, pčele su se stavile u plastične cjevčice iz
kojih im je virila samo glava. Elektroda s uzemljenjem stavljena im je iznad okcipitalnog otvora,
a elektroda pod naponom na ticalo kojem je prethodno odstranjen vrh. Tako učvršćene izlagane
su olfaktivnim podražajima. Heksan je bio kontrolni podražaj, a ispitivao se prag osjeta na miris

4
kukuljica zaraženih Ascosphaera apis izlaganjem pčela različitim koncentracijama (0.1, 0.5, 1)
otopine zaraženih kukuljica u heksanu. Svako izlaganje nadražujućoj tvari trajalo je 2 sekunde
razdvojeno pauzama od 2 minute.
Ispitivanje se ponovilo nakon što su pčele su bile napojene vodenom otopinom oktopamina ili
epistamina kako bi se ispitao utjecaj tih neuromodulatora na osjetni prag. Rezultati su se
statistički obradili.

Rezultati
Raspodijela Oktopamina u neuronima mozga medonosne pčele
Proučavanjem mozga, utvrđivalo se prisustvo nakupina stanica oktopamina u određenim
regijama mozga. Nakupine stanica oktopamina utvrđene su kod svih proučavanih pčela starosti
od 1 do 28 dana. Fotografija 1(A) povećanja (3.6X) prikazuje mirisni režanj, te druge dijelove
mozga gdje se nalaze nakupine oktopaminskih stanica. Fotografija 1(B) prikazuje veće
povećanje protocerebruma i dva mirisna režnja deutocerebruma. Strelica pokazuje relativno
veću nakupinu oktopaminskih stanica čije je obojenje izražajnije u usporedi sa nekoliko ostalih
prikazanih nakupina. Stoga je ta skupina stanica izabrana kao grupa oktopaminskih stanica za
proučavanje razlike u intenzitetu obojenja između higijenskih i ne higijenskih pčela. Fotografija
1(C) i (D) prikazuje stražnji frontalni pogled na mozak i podjednjački ganglij te skupinu
oktopaminskih stanica (gornja strelica), također dvije lateralne nakupine oktopaminskih stanica
te donju strelicu ventralnih središnjih stanica. Na fotografijama 1(E)-(G) je prikazana cijela
projekcija mirisnog režnja pčele. Fotografija 1(E) prikazuje mirisni režanj mlade pčele starosti 9
dana gdje je uočeno slabo obojenje oktopaminskih stanica. Nasuprot tome, fotografija 1(F)
prikazuje prilično izraženo obojenje oktopaminskih stanica kod pčele starosti 26 dana.
Fotografija 1(G) prikazuje veće uvećanje pojedinog djela koji otkriva oktopaminska vlakna
povezana sa mirisnim glomerulijem.

Slika 1. Lasersko skeniranje

5
Fotografija 2(A)-(D) prikazuje 6-7 oktopaminskh stanica nakupljenih u jednom području što se
uspostavilo kao uobičajeni slučaj. Različiti uzorci su prezentirani u fotografiji 2(A)-(D) gdje je
prikazan tipičan intenzitet obojenja oktopaminskih stanica između pčela koje obavljaju
higijensko ponašanje; fotografija 2(C)-(D) i onih koje ga ne obavljaju; fotografija 2(A)-(C).
Intenziteti obojenja su iznosili prosjek 234-245 u slučaju higijenskih te 102-172 u slučaju ne
higijenskih pčela.

Slika 2. Laserko skeniranje

Razlike u ponašanju temeljene na intenzitetu obojenja

U periodu od 4 godine trajanja pripadajućeg istraživanja utvrđeni su određeni brojčani izgledi
koji koreliraju sa obojenjem stanica oktopamina te obavljanja higijenskog ponašanja u pčela.
Utvrđeno je da bez obzira dali pčela dolazi iz higijenske ili nehigigijenske kolonije njezino
obavljanje poslova higijene isključivo kolerira sa stupnjem obojenja oktopaminskih stanica. U
slučaju kada pčela obavlja higijensko ponašanje 13 puta je veća vjerovatnost da ima svijetlo
obojenje stanica neovisno iz koje kolonije dolazi.

EAG rezultati: Oktopaminskog tretmana

Proučavane su 4 različite grupe pčela,
nehigijenske, nehigijenske tretirane
oktopaminom, higijenske i higijenske tretirane
oktopaminom. Promatrala se reakcija odnosno
ponašanje pčela uslijed izlaganju na tri
koncentracije mirisa bolesnog legla. Pri najnižoj
koncentraciji netretirane nehigijenske pčele
imale su značajno nižu EAG reakciju od ostale tri
skupine koje se međusobno nisu značajno
razlikovale svojom reakcijom. Isti rezultati su primjećeni kod srednje koncentracije mirisa
mrtvog legla. Pri izlaganju pčela najvećoj koncentraciji mirisa bolesnog legla uobičajeno

6
netretirane nehigijenske pčele su imale najmanju reakciju no nehigijenske hranjene
oktopaminom nisu više bile u razini dviju higijenskih skupina.

EAG Rezultati: Epinastinskog tretmana

Suprotan efekt od prijašnjeg je promatran kada su pčele hranjene epinastinom, koji je blokator
oktopamina.U prvom slučaju netretirane higijenske pčele imale su značajno veću EAG reakciju
od ostalih skupina na miris mrtvog legla. Pri srednjoj
koncentraciji mirisa mrtvog legla netretirane pčele imale su
još značajnije višu reakciju od ostalih skupina koje se nisu
pretjerano razlikovale. Pri najvećoj koncentraciji nije bilo
značajnih razlika između bilo koje grupe pčela.

Rasprava
Iz rezultata istraživanja došlo se do zaključka da obojanost
oktopamin neurona, kod 15-20 dana starih pčela, više ovisi o tome jeli pčela imala higijenske
sklonosti odnosno čistila leglo ili nije, nego o samom genotipu. Tako su 68% genetski higijenskih
i 67% genetski nehigijenskih pčela, koje su uzete u istraživanje, a izvodile su higijenske radnje,
imale jaku obojanost neurona dok su samo 36% genetski higijenskih i 25% genetski
nehigijenskih pčela koje nisu obavljale higijenske radnje imale primjetno obojenost oktopamin
neurona. Važno je napomenuti da i genetski nehigijenske pčele obavljaju higijenske zadatke, ali
u puno manjoj mjeri što ukazuje na prisustvo drugih utjecaja na njihovo higijensko ponašanje.
Razlikovanje genetski higijenski i genetski nehigijenskih pčela bazira se na EAG razlikama, ali
pojedinačno obavljanje higijenskih zadataka očituje se jačom obojanošću oktopamin neurona. Iz
tog razloga pčelama se oktopamin davao oralno i došlo se do zaključka da se kod genetski
nehigijenskih pčela povećala olfaktorna osjetljivost na miris mrtvog legla dok na higijenske
pčele nije imao utjecaj. S druge strane davanjem epinastina nehigijenskim pčelama nije dao
nikakve rezultate, a higijenskim pčelama je smanjio olfaktornu osjetljivost.
Kao što je već rečeno sve pčele mogu obavljati higijenske zadatke samo je razlika kolika količina
podražaja odnosno mirisa je potrebna za pokretanje pčele na rad. Karakteristika higijenskih
pčela je da im je potrebna vrlo niska razina podražaja kako bi krenule iskazivati higijenske
karakteristike dok je nehigijenskim pčelama potrebno puno više. U istraživanju se pokazalo da
je obojenost oktopamin neurona intenzivnije kod pčela koje iskazuju higijensko ponašanje, ali
nije dokazano jesu li te dvije pojave nužno povezane. Saznalo se da je povećana razina
oktopamina povećala osjetljivost na mirise mrtvog legla, ali drugi mirisi, nevezani uz higijensko
ponašanje, nisu isključeni što nam ne daje konkretne i specifične odgovore. Osim toga nije

7
ispitano kako su se genetski nehigijenske pčele nakon dobivanja oktopamina oralnim putem
nastavile ponašati u pogledu obavljanja higijenskih zadataka.
Provedeno istraživanje ostavlja puno prostora za nadogradnju, ali postavlja vrlo snažnu osnovu
za shvaćanje, kontroliranje i potencijalno modificiranje ponašanja pčele odnosno pčelinje
zajednice u pogledu održavanja higijene legla i košnice.

Popis literature
Marla Spivak, Rebecca Masterman, Rocco Ross, Karen A. Mesce; Department of Entomology, University
of Minnesota, 219 Hodson Hall, 1980 Folwell Ave., St. Paul, Minnesota 55108; Department of
Entomology and Graduate Program in Neuroscience, University of Minnesota, St. Paul, Minnesota
55108; Hygienic Behavior in the Honey Bee (Apis mellifera L.) and the Modulatory Role of Octopamine