Professional Documents
Culture Documents
FARMACEUTSKI FAKULTET
KATEDRA ZA FARMAKOGNOZIJU
I
6. Diskusija ............................................................................................................................................ 89
7. Zaključci: ........................................................................................................................................... 98
8.Literatura .......................................................................................................................................... 100
II
SAŽETAK
U ovom radu smo se bavili istraživanjem terapijske primjene eteričnih ulja porodice Pinaceae.
Cilj rada bio je da se na osnovu dostupne literature utvrdi farmakološka aktivnost eteričnih
ulja pojedinih biljaka porodice Pinaceae te efikasnost njihove primjene u liječenju oboljenja
različitih organskih sistema. Kao najvažnija farmakološka djelovanja analizirana je njihova
antimikrobna, ekspektorantna, antidijabetična, antiinflamatorna, hipolipemijska,
antioksidativna, antikancerogena aktivnost kao i aktivnost u zarastanju rana. Pored ovoga
ovim radom se htjelo ukazati na prednosti liječanja različitih bolesti i stanja ljekovitim biljem
u odnosu na sintetske preparate. Za pisanje ovog rada korištena je stručna i naučna literatura
kao i internet i baze podataka. Dokazana je uspješna primjena eteričnih ulja pojedinih biljaka
porodice Pinaceae u terapiji određenih bolesti i stanja, ali je također ustanovljeno da će biti
potrebna dodatna ispitivanja kako bi se otkrio mehanizam njihovog djelovanja te ispitali
putevi primjene. Na kraju možemo zaključiti da eterična ulja porodice Pinaceae predstavljaju
obečavajući izvor u terapiji različitih oboljenja, te da u skorijoj budućnosti možemo očekivati
njihovu češću upotrebu.
III
ABSTRACT
In this paper, we have investigated the therapeutic application of Pinaceae's essential oils. The
aim of the study was to analyse the pharmacological activity of essential oils of certain
Pinaceae family herbs and the efficacy of their application in the treatment of diseases of
various organic systems. Among others, their antimicrobial, expectorant, anti-diabetic,
antiinflammatory, hypolipemic, antioxidative, anticancerogenic, and wound healing activities
were investigated. In addition to this, the aim of this paper was also to highlight the benefits
of the treatment of various diseases and conditions of healing herbs in comparison to synthetic
preparations. For writing this paper, professional and scientific literature as well as internet
and databases were used. Successful application of Pinaceae 's essential oils to certain herbs
and conditions has been demonstrated, but it has also been found that additional tests will be
required to detect the mechanism of their action and examine the pathways of application. In
the end we can conclude that Pinaceae's essential oils are a promising source in the therapy of
various diseases, and that in the near future we can expect their frequent use.
IV
1. Uvod
Upotreba biljaka kao lijekova seže još od vremena pračovjeka. Civilizacije antičke Kine,
Indije te civilizacije sa područja Sjeverne Afrike ostavile su pisane dokaze čovjekove
genijalnosti i njihove upotrebe biljaka za liječenje različitih bolesti (1). Tijekom godina, ljudi
su se oslonjali na prirodu kao izvor za svoje osnovne potrebe kao što su proizvodnja hrane,
skloništa, odjeće, prijevoznih sredstava, gnojiva, mirisa, i ništa manje važno, lijekova. Biljke
su postale osnova sofisticiranog tradicionalnog sistema liječenja koji je postojao hiljadama
godina te i danas nastavljaju snadbjevati čovječanstvo novim lijekovima. Prvi zapisi,
napisani na glinenim pločicama, potječu iz Mezopotamije i datiraju od 2600. godine prije
Krista; među sredstvima koja su korištena bila su ulja Cedrus vrste (Cedar) i Cupressus
sempervirens (Cypress), Glycyrrhiza glabra (sladić), Commiphora vrsta (Mirh) i Papaver
somniferum (sok od maka), te su svi još uvijek u upotrebi za liječenje bolesti, počevši od
kašlja i prehlade do parazitskih infekcija i upala. U drevnom Egiptu koristio se Korov (Ammi
majus) za liječenje vitiliga, stanje kože karakterizirano gubitkom pigmenata. Nedavno je na
osnovu tog saznanja proizveden lijek (b-metoksipsoralen) za liječenje psorijaze i drugih
poremećaja kože, kao i limfoma T-ćelija (2). U antičkoj Grčkoj, naučnici su klasificirali biljke
i dali njihove opise i na taj način olakšali njihovo prepoznavanje. Teofrat (Slika1), kojeg neki
smatraju ocem botanike, pohvalio je karakteristike ljekovitog bilja te prognozirao moguće
otkrivanje flavonoida (1).
1
On se u svom djelu "Historija biljaka " bavio ljekovitim kvalitetama bilja, te primjetio
mogućnost mjenjanja njihovih karakteristika kultivacijom. Galen (130–200 AD) koji se bavio
i podučavao farmaciju i medicinu u Rimu, objavio je ne manje od 30 knjiga na temu
ljekovitog bilja, te je bio poznat po svojim složenim receptima i formulama korištenim za
pripravljanje lijekova, koje su ponekad sadržavale desetine sastojaka ("galenski
lijekovi").Jedan od najsnažnijih uticaja je imala poznata knjiga "De Materia Medica ",
napisana od strane grčkog fizičara Dioscoridesa (1). Afrička tradicionalna medicina je
najstarija i vjerovatno najraznolikija od svih. Njihovo tradicionalno liječenje je holistično i
uključuje i tijelo i um. Iscjeljitelj obično uspostavlja dijagnozu te tretira psihološku osnovu
bolesti prije nego što pređena propisivanje lijekova za liječenje simptoma. Za Dioscoridesa se
vjeruje da je mnoge ideje preuzeo iz Indije. Naime antički Hindu zapisi o medicini ne
posjeduju reference koje se tiču strane medicine, doksu se zapisi iz Grčke i Srednjeg Istoka
odnosili na ideje i lijekove indijskog porijekla. Legendarni car Shen Nung je pisao o
ljekovitom bilju u svojim radovima koji su vjerovatno napisani 2500 godina p.n.e. Najstariji
pisani podaci o arapskoj tradiciji potiču od sumeraca i akadžana iz Mezopotamije, odnosno iz
istog područja kao i arheološki zapisi Shanidara IV. Najraniji pisani zapis, koji se vjerovatno
odnosi na ljekovito bilje, datira od 60,000 p.n.e. iz groblja neandertalaca u Shanidar IV,
arheološkom mjestu u Iraku. Nekoliko vrsta biljaka, koje su se koristile kao lijekovi, su
otkrivene među kojima su: Centaurea solstitialis (Asteraceae), Ephedra altissima
(Ephedraceae), Althea sp. (Malvaceae). Egipćani su svoje znanje dokumentovali u obliku
slika na zidovima grobnica koje potiču još iz vremna starog kraljevstva, te na papirusu, koji se
poslije pravio od Cyperus aquaticusa. Najznačajni od ovih zapisa je Ebers Papyrus, koji
potiče iz 1500. godine prije Krista te se smatra da sadrži medicinska saznanja koja datiraju još
iz 3000. godine prije Krista. Ebers Papyrus je medicinska knjiga koja pokriva sve vrste bolesti
i uključuje empirijski i simbolični način liječenja. Arapi su prvi osnovali apoteke u 8.st dok je
perzijski farmaceut, fizičar, filozof i pjesnik, Avicenna, mnogo doprinjeo nauci odnosno
farmaciji i medicini kroz svoje radove kao što je Canon medicinae koji se smatra "konačnom
kodifikacijom sve grčko-rimske medicine" (2). Tek u 19.st. čovjek je počeo da izolira aktivne
supstance iz ljekovitog bilja , te je poseban značaj imalo otkriće kinina iz kore kininovca od
strane francuskih naučnika Caventoua i Pelletiera (Slika 2). Takva otkrića su uzrokovala
interesovanje "Novog svijeta" za biljke te su slali ekspedicije u džungle i šume u potrazi za
novim lijekovima. Takve ekspedicije su znale da traju i godinama, i tek kad bi biljke stigle do
dobro opremljenih fitohemijskih laboratorija bi se znalo da li je otkriće zapravo uspjelo.
Laboratorije poput one profesora J.B. de Harbonneya su postale centar za izolaciju aktivnih
2
supstanci iz ljekovitog bilja. Godine truda su nagrađene otkrivanjem flavonoida te su se
farmaceutske kompanije počele brzo širiti. Prije Drugog svjetskog rata, serija prirodnih
produkata izoliranih iz viših biljaka se počinju koristiti kao klinički agensi, a veliki broj njih i
danas je u upotrebi. Kinin izoliran iz kore kininovca, morfin i kodein iz opijuma, digoksin iz
lišća digitalisa, atropin i hioscin iz vrsta porodice Solanaceae i dalje imaju kliničku upotrebu.
Era antibiotika, koja se pojavila za vrijeme Drugog svjetskog rata, desila se zbog otkrića
antibakterijskog učinka čitavog niza prirodnih produkata izoliranih od vrsta Penicillium,
Cephalosporium, i Streptomyces.
3
anksiolitičke napade su proizašli iz multidisciplinarnih istraživanja u kojima su učestvovali
farmakolozi i sintetički hemičari zajedno. Tijekom posljednih godina pozornost farmaceutske
industrije ponovo se vraća ka prirodnom svijetu i to se može potvrditi razvojem tri nova
klinička lijeka: taksol, etopozid i artemisinin. Taksol se dobiva iz kore Taxus brevifolia.
Izolacija i strukturna determinacija taksola su pokazale u laboratorijskim testovima da je
sirovi ekstrakt efikasan protiv ćelija karcinoma. Iako se ova aktivnost otkrila u ranim 1960-
im, sve do 1971.godine struktura ovog kompleksnog diterpena nije bila razjašnjena. Godine
1979. je otkriveno da se mehanizam djelovanja ovog spoja zasniva na promociji nakupina
tubulina u mikrotubulima.Klinička istraživanja nisu vođena sve do ranih 1980-ih, a sve do
1990-ih se nije znalo da su taksol i njegov polusintetički derivat taksoter efikasni u borbi
protiv karcinoma dojke i ovarija. Dug period razvoja taksola kao kliničkog angensa,
poteškoće u njegovoj nabavki kao prirodnog produkta, kompleksnost njegove hemijske
strukture svjedoče problemima sa kojima se farmaceutska industrija susreće u nastojanju da
razvije kliničke agense iz prirodnih izvora. Podophyllin smola dobivena iz korijena
Podophyllum peltatum, je toksična i koristi se za uklanjanje bradavica. Glavni sastojak smole
je lignan podofilitoksin koji inhibira diobu ćelija. Zbog njegovih toksičnih karakteristika
izgledalo je kao da ne vrijedi provoditi bilo kakve medicinska istraživanja bezobzira što
njegov efekat na ćelijsku diobu ukazuje na mogućnost njegove upotrebe u hemoterapiji
karcinoma. Međutim, polusintetski modificirani glukozid, etopozid, koji ima drugačiji način
djelovanja i koji inhibira topoizomerazu II, je pronašao kliničku upotrebu u tretmanu
karcinoma pluća i testisa. Da li će se pokazati kao efikasni klinički agensi ili će voditi ka
novim kliničkim lijekovima je stvar budućih istraživanja (1).
Proces dobivanja lijeka iz ljekovitog bilja obično započinje sa botaničarom, etnobotaničarom,
etnofarmakologom ili biljnim ekologom koji prikuplja i identifikuje biljke od interesa. Zbirka
može uključivati biljke sa poznatom biološkom aktivnošću čiji aktivni sastojci nisu izolirani
(npr.tradicionalno korišteni biljni lijekovi) ili mogu uključivati vrste koje su sakupljene
slučajno za veliki screening program. Fitohemičari pripremaju ekstrakte od biljnog materijala,
podvrgavaju ove ekstrakte biološkom pregledu i započinju proces izolacije i karakterizacije
aktivnih supstanci frakcioniranjem vođenim biološkim testom. Molekularna biologija je
postala neophodna za otkrivanje lijekova iz ljekovitog bilja kroz determinaciju i
implementaciju odgovarajućih screening eseja koji su usmjereni na fiziološki relevantne
molekularne ciljeve. Farmakognozija obuhvata sva ova područja u interdisciplinarnu nauku.
Definicija farmakognozije se mijenjala od trenutka kada se ovaj izraz prvi put upotrijebio
prije otprilike 200 godina. Američko društvo za farmakognoziju je definira kao: "nauka koja
4
proučava fizičke, hemijske, biohemijske, i biološke karakteristike lijekova, njihovih sastojaka
ili potencijalnih lijekova i njihovih sastojaka prirodnog porijekla kao i traganje za novim
lijekovima iz prirodnih izvora". Danas farmakognozija podrazumijeva i istraživanje prirodnih
produkata dobivenih iz različitih izvora kao što su biljke, bakterije, gljivice i morski
organizmi. Farmakognozija obuhvata i studije botaničkih dodataka prehrani, koje uključuju
biljne lijekove, kao i potragu za jedinstvenim ljekovitim sastojkom koji može proći dalji
razvoj do lijeka odobrenog od strane Agencije za hranu i lijekove.
Veliki broj metoda je korišten za dobivanje spojeva upotrebljenih za otkrivanje lijekova,
uključujući izolaciju iz biljaka i drugih prirodnih izvora, sintetičku hemiju, kombinatornu
hemiju te molekularno modeliranje. Unatoč interesu za molekularno modeliranje,
kombinatornu hemiju i druge sintetičke hemijske tehnike od strane farmaceutski kompanija,
prirodni proizvodi, prije svega ljekovito bilje, ostaju važan izvor novih lijekova (3).
Ljekovito bilje sadrži neke organske spojeve koji pružaju određenu farmakološku aktivnost u
ljudskom tijelu i te bioaktivne supstance uključuju tanine, alkaloide, karbohidrate, terpene,
steroide i flavonoide(4). Ljekovito bilje još uvijek predstavlja primarni način liječenja i
očuvanja zdravlja za oko 75-80% svjetske populacije, uglavnom u zemljama u razvoju zbog
kulturne prihvatljivosti, bolje kompatibilnosti sa ljudskim tijelom i manje neželjenih efekata.
Međutim, u posljednih nekoliko godina, primječen je rast njihove upotrebe i u razvijenim
zemljama (5).
Poslednjih decenija, vrše se intenzivna biološka i fitohemijska ispitivanja sekundarnih
metabolita biljaka(6). Postoje brojni podaci in vitro i in vivo studija koje idu u prilog upotrebi
eteričnih ulja pri liječenju brojnih infekcija i oboljenja(7). Upotreba biljaka u medicini i
farmaciji se direktno povezuje sa sekundarnim metabolitima koje biosintetišu određene biljne
vrste i njihovo specifično farmakološko djelovanje. Za razliku od primarnih metabolita
(ugljeni hidrati, lipidi, protein, hlorofil, nukleinske kiseline), koji su neophodni za rast i razvoj
biljne ćelije, sekundarni metaboliti, među koje spadaju i biljni produkti kao što su eterična
ulja, imaju brojna farmakološka dejstva (antiinflamatorno, antibakterijsko, antioksidantno,
antidepresivno, anestetsko itd.). Uloga sekundarnih metabolita je višestruka i veoma značajna.
Naime, pošto su biljke sesilni organizmi koji ne posjeduju imuni sistem, one su morale da
razviju izvjestan mehanizam odbrane protiv patogena, kao i mehanizam koji će privući
insekte i ostale životinje, važne za njihovo oplođenje i distribuciju sjemena (8). Mnogi
produkti sekundarnog metabolizma su baktericidi, repelentne supstance, ili su čak otrovni za
štetočine i biljojede. Neki od sekundarnih metabolita biljaka imaju funkciju hormona i
učestvuju u regulaciji procesa bitnih za metabolizam same biljne vrste. Sekundarni metaboliti
5
biljaka su, hiljadama godina unazad, bili poznati i korišteni od strane ljudi, a posebno su to
bila eterična ulja. U današnje vrijeme metaboliti biljaka se koriste direktno ili nakon izvjesnih
hemijskih modifikacija. Procjenjeno je da oko 40% lijekova vodi porijeklo od sekundarnih
metabolita biljaka. Njihova farmakološka vrijednost ne prestaje da dobija na značaju
zahvaljujući stalnim otkrićima i potvrdama njihove stvarne potencijalne uloge u liječenju (9).
6
2. Literaturni pregled
Pinaceae ili porodica borova obuhvata drveće ili grmove, uključujući i moge poznate četinare
kao što su jela, kedar, ariši, borovi i smreke. Porodica pripada redu Pinales, nekada poznatom
kao Coniferales (10,11,12,13). Pretpostavka o monofiletskoj evoluciji porodice Pinaceae je
potvrđena analizom proteina u hloroplastima te na osnovu nedostatka bioflavonoida. Današnji
predstavnici su široko raznoliki, sa oko 220-250 vrsta (ovisno o taksonomskom pristupu) u 11
rodova(14), a druga je najveća (nakon Cupressaceae) što se tiče geografskog
rasprostranjenja. Područje koje zauzimaju se prostire na Sjevernoj hemisferi, uglavnom u
umjerenim klimatskim zonama, ali ih ima od subarktičkih do tropskih područja. Često
predstavljaju dominantnu komponentu borealnih, obalskih i planinskih šuma. Jedna
vrsta, Pinus merkusii, raste odmah ispod ekvatora, u Jugoistočnoj Aziji (15). Fosilni nalazi
ove porodice postoje još od krede.
Izuzev ariša i zlatnog pseudoariša (Pseudolarix amabilis), svi drugi članovi porodice su
zimzeleno, igličasto drveće ili grmovi.
Porodica Pinaceae se dijeli na četiri potporodice i obuhvata jedanaest rodova sa oko 230
vrsta:
Potporodica Abietoideae:
Jele (Abies): 51 vrsta.
Kedrovi (Cedrus): četiri vrste.
Ketelerije Keteleeria: tri vrste.
Nothotsuga: monotipski rod.
Čuga (Tsuga): osam vrsta.
Zlatni lažni ariš (Pseudolarix): monotipski rod.
Potporodica Piceoideae:
Smrče (Picea): 33 vrste.
Potporodica Pineoideae
Borovi (Pinus): 112 vrsta.
Potporodica Laricoideae
7
Ariš (Larix): oko 11 vrsta.
Cathaya: monotipski rod.
Duglazije (Pseudotsuga): oko 22 vrste (11).
Porodica Pinaceae obuhvata oko 250 vrsta, od kojih rod Pinus ima največi značaj. To je
največi rod četinara , koji obično pronalazimo na svjevernoj hemisfer, naročito na području
Mediterana, Kariba, Azije, Evrope te Sjeverne i Centralne Amerike. Ljekovite i aromatične
karakteristike hemijskih sastojaka (npr. terpeni, smola, eterično ulje...) bora, ćine ga jednom
od najpopularnijih biljaka u svim civilizacijama. Bor se također još uvijek široko upotrebljava
u tradicionalnom liječenju i ima veliki ekonomski značaj (16). Biljne vrste roda Pinus su
prema biomasi među najzastupljenijim biljnim vrstama na planeti. O iskoristivosti ovih vrsta
govori činjenica da postoji jedanaest droga od biljnih vrsta roda Pinus koje su pronašle svoje
mjesto u farmakopejama. Najviše kliničkih studija je provedeno sa ekstraktom kore
primorskog bora, Pinus maritima. Fitopreparati ovog ekstrakta su među 30 najkorištenijih
fitopreparata u Sjedinjenim Američkim Državama 2008.godine. Provedena je dvostruko
slijepa kontrolisana klinička studija u kojoj je procjenjivan uticaj ekstrakta kore Pinus
densiflora na kognitivne sposobnosti pacijenata. Ekstrakt je primjenjivan pet sedmica, nakon
čega je donesen zaključak da se ekstrakt kore može primjenjivati za prevenciju gubitka
kognitivnih funkcija povezanih sa starošću. Pored ove, još jedna studija u grupi od 100 starijih
8
pacijenata pokazala je da primjena ekstrakta kore Pinus pinaster poboljšava radnu memoriju i
ostale kognitivne varijable vezane za memoriju (17). Kora Pinus pinaster, koja je veoma
bogata katehinskim taninima, koristi se u obliku ekstrakta, a gotovi preparati kore se
promovišu kao antioksidansi (18). Nekoliko droga roda Pinus koristi se ili se koristilo u
tretmanu oboljenja metabolizma. Nekada se koristio „ozonizirani“ terpentin kod trovanja
fosforom. Njegovo djelovanje kod trovanja se tumači oksidacijom fosfora, čime ga čini
nedjelotvornim u organizmu. Davao se odraslima u obliku sirupa i kapsula do 15g dnevno
(19). Ekstrakt kore Pinus pinaster, sam ili u kombinovanim preparatima, proučavan je kod
endometrioza, klimakteričnog sindroma i dismenoreje u žena gdje se pokazao kao efikasna
terapija (17). U oboljenjima kože već dugo vremena se koristi katran bora. Katran bora sadrži
različita fenolna jedinjenja, zbog čega djeluje antiseptički. U kozmetologiji se primjenjuje u
različitim oboljenjima kože u obliku 10% masti. Djeluje kao antipruritik sa antibakterijskim
učinkom. Propisuje se i zbog protuupalnog, antiproliferativnog, antiekcematoznog i
keratoplastičnog djelovanja. U liječenju psorijaze koriste se aniinflamatorne,
antiproliferatorne i droge sa keratolitičkim djelovanjem, pa Britanska farmakopeja propisuje
upotrebu katrana u proizvodima protiv psorijaze (20)
Od značajnijih grupa spojeva vrste roda Pinus sadržavaju alkaloide, flavonoide, katehinske
tanine, stilbene i lignane, kao i eterična ulja. Vrste su bogate i vitaminima C i B.
Osim u tretmanu navedenih oboljenja, droge roda Pinus koriste se u različite industrijske,
nefarmaceutske svrhe. Kolofonijum se upotrebljava za izradu flastera, a najveće količine se
9
utroše u industriji sapuna, lakova, boja, papira, za premazivanje gudala gudačkih
instrumenata. Terpentinsko ulje koristi se u industriji za pripravljanje dezinficijenasa,
insekticida, boje, bjelila i ulja od bora. Eterično ulje klekovine se koristi kao deodorant i u
industriji mirisa. Neka od eteričnih ulja sadrže više od 60% 1,8-cineola i mogu poslužiti za
njegovu ekstrakciju. Monoterpeni eteričnih ulja bora služe za sintetsko dobivanje drugih
terpenoida. Tako npr. pinen služi i za sintetsko dobivanje racematnog kamfora (22).
10
Rasprostranjenost: Prirodno je rasprostranjen na širem području oko Sredozemlja u
nizinskom, ponegdje i u brdskom području. U Južnoj Africi smatra se invazivnom vrstom.
Uzgaja se radi proizvodnje smole. Osjetljiv je na hladne temperature, traži kontinuiranu vlagu
zraka. U početku raste vrlo brzo (23).
Djelovanje i primjena: Sjemenke ovog bora su jestive (kuhane ili sirove). Daje dobru drvnu
građu, veže tlo (štiti od erozije, posebno uz more jer odlično podnosi posolicu), služi za
dobivanje papira. Uzgajao se i zbog visoko kvalitetne smole od koje se dobiva terpentin. Kada
pada kiša, voda koja se cijedi s iglica sadrži u sebi supstance koje inhibiraju klijanje
nekih žitarica.
Primorski bor ima ljekovito djelovanje jer jača zid krvnih žila i kapilara, antioksidans je i ima
protuupalno djelovanje (antiseptik, diuretik). Izvor je flavonoida, katehina, proantocijana i
fenolne kiseline (24).
11
ljuske. Mlade grančice su gole, zelenkaste, kasnije posive. Pupoljci su usko jajasti, ušiljeni,
dugi oko 1 cm, smolasti, prekriveni ljuskama koje su tanko bjelkastog ruba. Listovi su
igličasti, plavkastozeleni, skupljeni po 5 u rukavcu, dugi 7-10 cm, jako tanki, kruti, ostaju na
granama 2-3 godine. Muški cvjetovi su žutocrveni, cilindrični, veliki oko 1 cm, gusto
skupljeni po 10-15. Ženski cvjetovi su jajasti, u početku zeleni i s bijelom smolom, zreli
češeri su svijetlosmeđi,cilindrični, prekriveni s široko zaobljenim ljuskama, vise na kratkoj
dršci dugi 8-20 cm. Rastu pojedinačno ili po 3-4 u skupinama. Sjemenke su okriljene, ovalne,
duge i široke 4-6 mm. krilca su im duga 15 mm (23).
Narodna imena: obični bor, šumski bor, divlji bor, luč, čamić, hojka, lučevina, smrč,
smrok.
Taksonomija biljke Bijeli bor (P.sylvestris, Pinaceae):
Regnum (carstvo): Plantae
Divisio ( razred): Pinophyta
Clasis (klasa): Pinopsida
12
Ordio (red): Pinales
Familia ( porodica): Pinacea
Genus ( rod): Pinus
Species ( vrsta): Pinus sylvestris
13
Rasprostranjenost: Prirodno je široko rasprostranjen na području većeg dijela Evrope i
sjeverne Azije, negdje tvori čiste sastojine. Stabla traže sunčano stanište, ne podnose sjenu,
otporna su na mraz, uspijevaju i na siromašnijim i suhim tlima. Rastu uobičajno 150-300
godina iako postoje zabilježeni primjerci na području Švedske i Norveške koji su stariji od
700 godina (29).
Djelovanje i primjena: Često se koristi u narodnoj medicini jer gotovo svi njegovi dijelovi
imaju ljekovita svojstva. Iglice bora obiluju vitaminom C i karotenom. Napici od njih
preporučuju se za jačanje imuniteta, za prehlade i u liječenju skorbuta. Koriste se svježe, po
mogućnosti odmah po branju, jer se dužim čuvanjem gube njihova ljekovita svojstva. Iglice
koje se čuvaju više od godinu dana potpuno izgube svoja ljekovita svojstva. Pupoljci bora su
u stvari njegove šišarke, ali potpuno sazrele i "drvenaste", one nemaju fitoterapeutsku
vrijednost, pa se koriste samo svježi, mladi, tek iznikli pupoljci. Oni sadrže gorke i
aromatične materije. Pupoljci se koriste za liječenje upale grla, kašlja, bronhitisa i katara
ždrijela. Kupke od mladih borovih pupoljaka preporučuju se oboljelima od reumatizma i
artritisa. Smola borova, koja se nalazi po kori, obiluje gorkim materijama i eteričnim uljem
koje sadrži ljekovitu materiju terpentin. U narodnoj medicini preparati od borove smole
upotrebljavaju se za liječenje kožnih bolesti. Pri njenoj upotrebi neophodan je oprez i tačno
pridržavanje propisanih doza. Kora bora, zbog ljekovitih taninskih i flavonskih materija,
koristi se u zarastanju otvorenih rana jer brzo zaustavlja krvarenje, a ima i antiseptično
djelovanje. Preporučuje se upotreba kore zrelog bora, po mogućnosti sa gornjeg dijela stabla.
Eterično ulje se tradicionalno koristi u Skandinaviji, za tople kupke i inhalaciju. Dobija se
destilacijom iglica bora ili iz unutrašnjeg dijela stabla. Djeluje antiseptično, stimulativno i
povećava prokrvljenost kože. Koristi se kod prehlade, bronhitisa, artritisa, loše cirkulacije,
reume, upale sinusa i kašlja, otežanog disanja zbog astme ili gripe, kod peludne groznice, te
za ublažavanje bolova u mišićima (25).
14
Genus(rod): Pinus
-Pinus nigra subsp. salzmannii- Raste u zapadnoj Evropi i sjeverozapadnoj Africi (30).
Na našem području se ističe dalmatinski crni bor koja je u Hrvatskoj autohtona i endemična
vrsta, može ga se naći na Braču, Hvaru i Korčuli. Vodi se kao gotovo ugrožena i strogo je
zaštićena vrsta (31).
15
Djelovanje i primjena: Mlade iglice su bogate vitaminom C te se od njih može praviti čaj.
Kao droga se koristi terpentin koji predstavlja gustu i ljepljivu masu, žute boje, oštrog mirisa i
gorkog okusa. Terpentin sadrži oko 30 % etraskog ulja i 70 % smole. Najviše se koristi za
dobivanje eteričnog ulja destilacijom vodene pare. Glavni sastojci ulja su alfa i beta pinen. Za
farmaceutske potrebe je važno da ima što više pinenina. Koristi se za ublažavanje bolova, kod
lumbaga, reume, neuralgičnih bolova, u obliku masti ili flastera. Djeluje i kao ekspektorans,
protiv bronhitisa. Borovi pupoljci kuhani u vodi, vinu ili pivi, uspješno se koriste za liječenje
kožnih bolesti, katara bronhija, protiv promuklosti, kašlja i reume. Terpentin predstavlja
balzam koji curi iz ozlijeđenih stabala, a dobiva se tkz. smolarenjem od maja pa do oktobra
(25).
Ordio (red):Pinales
Osobine i svojstva: Balzamna ili balzamasta jela je crnogorično stablo iz porodice borovki
(Pinaceae). Naraste do 25 m visine tvoreći pravilnu, konusnu krošnju sve do zemlje.
Korijenov sistem je površinski. Kora je sivosmeđa, u početku glatka, kasnije ispucana, ima
16
velike mjehure koji su puni ljepljivom smolom. Pupoljci su crvenkasti, jajasti i smolasti.
17
2.1.3.6. Obična jela (Abies alba, Pinaceae)
Osobine i svojstva:
18
odozdo imaju 2 bijele pruge puči; na postranim izbojcima i zasjenjenim granama, raščešljane
su i ušiljena vrha. Iglice (četine) su plosnate, na licu tamnozelene, sjajne, a na naličju sa 2
paralelne bijele pruge stoma. Duge su do 30 mm, široke do 3 mm, većinom su češljasto
raspoređene, na vrhu izrubljene, a rijetko zaobljene i ušiljene. Pri osnovi su sužene, te prelaze
u okruglasti završetak koji su vezane za grančicu. Ostaju na granama do 8 i više godina, a
dosta se dugo zadrže i na odsječenim stablima. Grane su u pršljenovima i ne vise. Muški se
cvatovi nalaze u pazušcu najgornjih iglica, a ženski na vrhu izbojka. Češeri su uspravni,
valjkasti, do 15 cm dugi i 3-5 cm debeli, smeđi, dozrijevaju iste godine, raspadaju se
ostavljajući samo češerno vreteno. Pokrovne ljuske su uske, kožaste, raznih dužina. Plodne
ljuske su široko zaobljene. Na njima su po 2 sjemenke. Sjeme je trokutasto, s
obiljem smolnih mjehurića; krilce ga ovija s jedne, a obuhvaća s druge strane. Klije s 4-8,
većinom 5-6 zvjezdasto raspoređenih, linealnih i tamnozelenih supaka. Sjeme
ima embrij i endosperm.
U 100 kg češera ima 10-16 kg sjemenaka s krilcima. Jedan češer ima 260-290 sjemenaka. U
prirodi sjemenke jele obično iskliju idućeg proljeća, nakon otpadanja. Klijanje je sporo i
nadzemno. Rijetko isklije više od 50 % sjemenaka. Počinje plodonositi oko 25-30 godine.
Dobar urod je svake 2-3 godine (23).
19
Divisio (razred): Pinophyta
20
Djelovanje i primjena: Eterično ulje himalajskog cedra sličnog je djelovanja kao i atlantskog
cedra, prije svega jaki je limfotonik, pa je eterično ulja izbor za tretiranje celulita, retencije
vode, umornih i otečenih nogu. U tu svrhu se često kombinira s drugim uljima sličnog
djelovanja, poput borovice, no i sa uljima koja djeluju na cirkulaciju, poput ružmarina, cineola
i čempresa. Zbog seboregulirajućeg djelovanja nalaze svoju primjenu u tretiranju akni, čireva,
dermatitisa, seboreje, masne kože i kože s proširenim porama. Dodaje se u preparate za njegu
vlasišta sa prhuti kao i za poticanje rasta kose (26).
Osobine i svojstva: Visoka ili obična smreka (Picea abies) je zimzeleno stablo iz porodice
borovki (Pinaceae). Stablo je uspravno, pravilno razgranato, naraste do 55 m visine. Grane su
smještene pršljenasto i malo su povijene. Krošnja je uska, piramidalna, pravilno razgranata i s
ušiljenim vrhom. Korijen je plitak i bez glavne žile, stvara brojne bočne izboje. Kora je tanka,
u mladosti glatka i siva, u starijoj dobi tamnocrvena i ljušti se u okruglastim ljuskama. Pupovi
su tamnonarandžaste boje, jajasti i zašiljeni, nisu smolasti. Iglice su oko grančica ravnomjerno
spiralno raspoređene, šiljaste, plosnate, četverobridne, duge 10-25 mm, široke oko 1 mm,
imaju kratku peteljku, na stablu se zadržavaju 5-7 godina, a nakon što otpadno ostavljaju
hrapavu grančicu. Cvjetovi su jednodomni ( muški i ženski cvjetovi nalaze se na istom
stablu), cvatu od aprila do juna. Sjemenke su jajaste i tamnosmeđe, duge oko 4 mm, sa
krilcem dugim oko 13 mm (23).
21
Rasprostranjenost:
Rasprostranjena je u
sjevernoj Evropi, te na
brdskim i planinskim
područjima srednje i
južne Evrope. Odgovara
joj svježe, rahlo,
humusno i kiselo tlo
(25).
Djelovanje i primjena:
22
2.1.3.9. Evropski ariš ( Larix decidua, Pinaceae)
Osobine i svojstva: Evropski ariš ili macesen (Larix decidua) je listopadno crnogorično
stablo iz porodice borovki (Pinaceae).
23
(četine) su nježne, tanke, mekane i ušiljene. Svijetlozelene su boje, a u jesen poprimaju
zlatnožutu boju te opadaju. Na poprečnom presjeku su plosnato-trokutaste, duge 1 do 4 cm, te
0.6 do 1.6 mm široke. Na dugim su izbojcima pojedinačno i spiralno poredane, a na
kratkorastima su u čupercima od 20 do 50 iglica. Muški cvjetovi su sumpornožuti, jajoliki, a
ženski purpurnocrveni, jajastookruglasti. Cvjeta u travnju i svibnju, uporedo s listanjem.
Češeri su duguljasti, s oko 20 - 40 mm duljine i oko 20 mm širine. Sivosmeđe su boje, na
kratkoj dršci. Dozrijevaju u kasnu jesen, već prve godine, a ostaju na granama nekoliko
sljedećih godina. Razmnožava se sjemenom. Sjeme je trokutasto i okriljeno, sivosmeđe, dugo
3-4 mm, dok je krilce svijetložuto, dugo 6-8 mm (23).
Djelovanje i primjena: Ljekoviti dio biljke ariša su zeleni češeri koji se sakupljaju u proljeće
i početkom ljeta. Ljekovite su i iglice biljke koje se sakupljaju tijekom cijele godine, a smola i
kora u jesen. Ljekovito djelovanje biljke ariš je višestruko. Često se od ariša koriste iglice i
mladi češeri za pripremanje uvarka, za kupku u liječenju psihički rastrojenih bolesnika,
rekonvalescenata i jako slabih osoba. Također, iglice i kora ariša se koriste za pripremanje
obloga za liječenje rana koje su upaljene, te prignječenosti i čireva. Čaj pripremljen od kore
ariša izaziva diurezu, liječi vodenu bolest u početku, žuticu, reumu u zglobovima, osip i
čireve. Smola od ariša pripremljena s vinom i medom čisti začepljenu jetru, drobi i lagano
odvaja pijesak i kamenje iz žuči, bubrega i mokraćnog mjehura, a kod upale grla koristi se za
grgljanje (26).
24
ove karakteristike se nisu mnogo izmijenile osim što se sada dosta više zna o njihovom
mehanizmu djelovanja, konkretno na antimikrobnom nivou. U prirodi eterična ulja igraju
važnu ulogu u zaštiti biljaka od bakterija, virusa, gljivica i insekata kao i od biljojeda
smanjujući im apetit za takve biljke. Oni također mogu privuči neke kukce koji prenose polen
i sjemena. Eterična ulja se ekstrahuju iz različitih aromatičnih biljaka uglavnom u zemljama
sa umjerenom do toplom klimom što je slučaj sa zemljama Mediterana kao i u tropskim
zemljama gdje predstavlaju važan dio tradicionalnih farmakopeja. Sintetiziraju se iz svih
biljnih organa tj. pupoljaka, cvjetova, listova, sjemena,plodova, grančica, korijena, kore ili
drveta, pohranjeni su u sekretorne ćelije, šupljine, kanale, epidermalne ćelije ili u žljezdanim
trihomima. Postoji nekoliko metoda za ekstrkciju eteričnog ulja. To može uključivati upotrebu
tekučeg ugljenog dioksida ili mikrovalova, te uglavnom destilaciju niskim ili visokim
pritiskom primjenom kipuće vode ili vruće pare (34).Vjeruje se da termin ,,eterično ulje"
potiče od imena koje je u 16. stoljeću švicarac Paracelsus von Hohenheim, reformator
medicine korsitio; on je aktivnu susptancu lijeka nazvao "Quinta essential (35)." Iako su se
začini koristili zbog njihovog mirisa, okusa i konzervacijskih karakteristika (36), od poznatih
eteričnih ulja, jedino se ulje terpentina spominje od strane grčkih i rimskih historičara (35).
Destilacija kao jedan od metoda dobivanja eteričnih ulja, prvi put se koristila na istoku
(Egipat, Indija i Perzija) prije više od 2000 godina te je unaprijeđena u 9.stoljeću od strane
arapa (36). Prvi autentični pisani dokaz destilacije eteričnih ulja se pripisuje katalonskom
liječniku Villanovi (35). Do 13. stoljeća eterična ulja su se pripremala u apotekama, a njihovi
farmakološki učinci su se zapisivali u faramkopejama, ali njihova upotreba nije bila naročito
proširena Evropom do 16. stoljeća, od kada počinje da se sa njima trguje u Londonu (37). Dva
fizičara iz Strazbura, Brunschwig i Reiff, u tom periodu su odvojeno objavljivali o destilaciji i
upotrebi eteričnog ulja te spominju samo nekoliko danas poznatih kao što su terpentinsko ulje,
ulje borovica, ruzmarina, lavande, anisa i cimeta (35). Prema francuskom liječniku Du
Chesne, proizvodnja eteričnih ulja u 17. stoljeću je bila dobro poznata i apoteke su uglavnom
bile opskrbljene sa po 15-20 različitih ulja (38). Upotreba ulja koje se dobiva od drveta čaja,
dokumentovana je za vrijeme kolonizacije Australije krajem 18. stoljeća, iako se vjeruje da je
bilo korišteno od strane izvornih australaca i prije toga (39). Prva eksperimentalna mjerenja
baktericidnih karakteristika eteričnih ulja su izvedena 1881. godine od strane De la Croixa
(40). Kakogod, za vrijeme 19. i 20. stoljeće upotreba eteričnih ulja u medicinske svrhe postaje
sekundarna u odnosu na njihovu upotrebu kao aroma i okusa (35). Eterična ulja u Evropskoj
Uniji se najviše koriste u prehranbenoj industriji (kao okusi), parfemima i lijekovima (36).
Dobro poznata upotreba eteričnih ulja u aromaterapiji čini svega 2% njihovog ukupnog tržišta
25
(41). Antibakterijske karakteristike eteričnih ulja i njihovih sastojaka se iskorištavaju u
različitim proizvodima kao što su preparati za pročiščavanje zubnih korijenskih kanala,
antiseptici, te dodaci prehrani za krmače dojilje i odvojeno prasadi (42). Nekoliko
konzervanasa koji sadrže eterična ulja su također dostupni. Konzervans za hranu ,,DMC Base
Natural" koji se proizvodi od strane DOMCA S.A. Alhendin u Granadi u Španiji, sadrži 50%
eteričnog ulja ruzmarina, kadulje i citrusa te 50% glicerola (43).
Eterična ulja su veoma složene prirodne mješavine koje mogu sadržavati oko 20-60
komponenti u različitim koncentracijama. Karakteriziraju ih dvije ili tri glavne komponente
koje su prisutne u relativno velikim koncentracijama (20-70 %) u poređenju sa drugim
komponentama koje su prisutne u tragovima (34). Fenolni sastojci su uglavnom odgovorni za
antibakterijske karakteristeike eteričnih ulja (44). Postoje neki dokazi o tome da sastojci koji
su prisutni u manjim količinama imaju kritičnu ulogu u antibakterijskoj aktivnosti, tako što
djeluju sinergistički sa drugim sastojcima. Ovo je primjećeno kod kadulje, nekim vrstama
Thymusa i origana (45). Sastav eteričnog ulja nekih vrsta biljke se može razlikovati u
zavisnosti od sezone berbe i geografskih izvora (46). Generalno, eterična ulja koja se dobivaju
od biljaka koje se sakuplaju u toku ili odmah nakon cvjetanja sadrže najjače antimikrobno
svojstvo (47). Dokazano je da enantiomeri sastojaka eteričnih ulja pokazuju antimikrobnu
aktivnost u različitim stepenima (48). Sastav eteričnih ulja iz različitih dijelova jedne biljke se
također može značajno razlikovati. Na primjer, eterično ulje dobiveno iz sjemenki
korijandera (Coriandrum sativum) ima različit sastav u odnosu na eterično ulje koje se dobiva
od nezrelih listova iste biljke (38).
2.2.2.1. Terpeni
26
različitih terpena. Osnovni terpeni su monoterpeni (C10) i seskviterpeni (C15), ali hemiterpeni
(C5), diterpeni (C20), triterpeni (C30) i tetraterpeni (C40) također postoje. Terpen koji sadrži
kisik se naziva terpenoidom. Monoterpeni nastaju udruživanjem dva izoprena (C10). Oni su
najreprezentativnije molekule koje ulaze u sastav 90% eteričnih ulja i omogučavaju veliku
raznolikost strukture. Sastoje se od nekoliko grupa jedinjenja:
1. Ugljeni hidrati:
aciklični: micren, ocimen itd.
monociklični: terpinen, p-cimen, felandren itd.
biciklični: pinen,kamfen, sabinen itd.
2. Alkoholi:
aciklični: geraniol, linalol, citronelol, lavandulol, nerol itd.
monociklični: mentol, karveol itd.
biciklični: borneol, fenol, krisantenol, itd.
3. Aldehidi:
aciklični: geranial, neral, citronelal itd.
4. Ketoni:
aciklični: tegeton itd.
monociklični: menton, karvon, pulegon, piperiton itd.
biciklični: kamfor, fenon, tujon, ombelulon, pinokamfon, pinokarvon itd.
5. Esteri:
aciklični: linalilacetat ili propionat, citronelil acetat itd.
monociklični: mentil ili terpinil acetat itd.
biciklični: izobornil acetat itd.
6. Eteri:
1,8- cineol, mentofuran itd.
7. Peroksidi:
askaridol itd.
8. Fenoli:
timol, karvakrol itd.
Kada je molekula optički aktivna, dva enantiomera su obično prisutna u različitim biljkama:
(+)-α-pinen u Pinus palustris, (-)β pinen u Pinus caribaea i u Pinus pinasteru, (-) linalol u
korijandru, (+) linalol u nekim kamfornim drvećima itd. U nekim slučajevima najčešće se
susrećemo sa racemskim oblikom: citronelol je široko rasprostranjen, (+) oblik je
27
karakterističan za Eucalyptus citriodora, dok je (-) oblik uglavnom prisutan u eteričnim
uljima ruže i geranijuma. Seskviterpeni su sačinjeni od tri izoprenske jedinice (C15).
Produživanje lanca povećava broj ciklizacija što omogućava veliku raznolikost strukture.
Struktura i funkcija seskviterpena su slične kao kod monoterpena:
1. Ugljeni hidrati:
azulen, β-bisabolen, kadinen, β-kariofilen, logifolen, kurkumen, elemen, farnezin,
zingiberin itd.
2. Alkoholi:
bisabol, cedrol, β-nerolidol, farnezol, kartol, patuhoilol, viridiflorol itd.
3. Ketoni:
germakron, nootkaton, β- vetinon, turmeron itd.
4. Epoksidi:
karipfilen oksid, humulen epoksid itd.
Primjeri biljaka koje sadrže ove sastojke su: anđelika, bergamot, kim, celer, citronela,
korijander, eukaliptus, geranijum ,smreka, lavanda, limon, lemongras, manadrina, menta,
narandža, pepermint, ruzmarin, bor, kadulja, timjan (34).
Aromatični spojevi, derivati fenilpropana su prisutni mnogo rjeđe u odnosu na terpene. Putevi
biosinteze u pogledu terpena i fenilpropanskih derivata obično su odvojeni u biljkama ali
mogu koegzistirati, gdje jedan glavni put preovladava (npr. ulje cimeta gdje je cinamaldehid
glavni, a eugenol sporedni sastojak itd.). Aromatični spojevi uključuju:
1. Aldehide: cinamaldehid
2. Alkohole: cinamol
3. Fenole: kavikol, eugenol
4. Metoksi derivate: anetol, elemicin, estragol, metileugenol
5. Metilen dioksi supstance: apiol, miristicin, safrol
Glavni biljni izvori za ove spojeve su : anis, cimet, klinčić, komorač, oraščić, peršin, draguno
i neke botaničke porodice (Apiaceae, Lamiaceae, Myrtaceae, Rutaceae). Dušikove ili
sulfurirane komponente kao što su glukozinolati ili derivati izotiocijanata (češnjak i ulja
28
senfa) također su karakteristični kao sekundarni metaboliti raznovrsnih biljaka ili torenih,
prženih ili pečenih proizvoda (34).
Eterična ulja u žlijezdama biljke su smjese spojeva. Mnoge od njih imaju tačku ključanja
između 150 i 200°C, a da bi se odvojili od ostatka biljnog materijala koji ne hlapi, potrebno je
zagrijati biljke na tu temperaturu. Pri toj temperaturi biljke bi počele oksidirati, uključujući i
eterično ulje. Zbog toga, umjesto da se biljka destilira na tako visokim temperaturama, kroz
biljnu se masu propušta vruća vodena para. Zahvaljujući velikom pritisku vodene pare,
zajedno s njom destiliraju se tvari koje imaju tačku ključanja veću od 100°C. Relativno mali
broj spojeva može se destilirati vodenom parom. Uz pomoć vodene pare destiliraju se tvari
koje se ne otapaju u vodi, koje imaju do 15 ili maksimalno 20 ugljikovih atoma, koje su
dovoljno stabilne da izdrže procese zagrijavanja pri toj temperaturi te one koje hemijski ne
reagiraju s vodom. Dva glavna načina dobivanja eteričnih ulja su destilacija vodenom parom i
tiještenje (49).
Pri industrijskom dobivanju eteričnih ulja postoje tri destilacijska postupka: - detilacija
pomoću vodene pare - vodeno-parna destilacija - parna destilacija (50)
Vodena destilacija
Najstariji način destilacije izvodi se stavljanjem biljnog materijala u kotao zajedno s dva do
pet puta većom količinom vode koja se zagrijava do vrenja. Zagrijavanje je izravno
plamenom ispod destilacijskog kotla ili unutarnjim grijanjem sa spiralno oblikovanom cijevi.
Postupak se često primjenjuje u malim pogonima (49,50).
Vodeno-parna destilacija
Biljni se materijal odvaja na mrežicu i ne dolazi u dodir s vodom već samo sa zasićenom
vodenom parom. Para se stvara grijanjem izravnim plamenom, dok se u velikim pogonima
stvara izravnim ili neizravnim grijanjem pomoću pare (49). Vodena para odnosi čestice
eteričnog ulja sa sobom, prolazi kroz cijev koja je hlađena vodom prilikom čega dolazi do
kondenzacije vode i eteričnog ulja. Zajedno se skupljaju u posebnu posudu, a obzirom da se
eterično ulje ne otapa u vodi, slojevi se odvajaju. Eterična ulja su obično lakša od vode te se
29
skupljaju na površinu. Voda ispod eteričnog ulja također se skuplja te se naziva se hidrolat ili
cvjetna vodica(50).
Parna destilacija
U modernijem načinu proizvodnje, kotao u kojem se stvara vodena para odvaja se od kotla
koji sadrži biljni materijal. Na taj način se smanjuje doticaj vode s biljnim materijalom i
hidrolitičko djelovanje vode na pojedine spojeve kao što su esteri. Time se postiže bolja
kvaliteta i stabilnost ulja. Ostatak procesa, koji uključuje hlađenje i separaciju eteričnog ulja i
hidrolata, identičan je u oba postupka . Destilacija vodenom parom složen je proces koji
zahtijeva puno znanja, umijeća i iskustva. Potrebno je voditi računa o kvaliteti biljnog
materijala, vrsti vode koja se koristi, aparaturi, trajanju destilacije, pritisku vodene pare,
temperaturi, odvajanju i tretiranju eteričnog ulja i hidrolata (36).
2.2.3.2. Tiještenje
Prilikom procesa tiještenja, biljka ili dio biljke buši se sitnim iglama ili se preša kako bi se
oslobodio sadržaj iz žlijezda. Materijal se miješa s vodom, a ulje odvaja od ostatka biljne
smjese metodama kao što je centrifugiranje. Taj ekstrakt u biti je nepromijenjen sadržaj
žlijezde. Ovakav način dobivanja uglavnom se primjenjuje za usplođa plodova roda Citrus,
kod kojih se žlijezde nalaze u usplođu ploda. Tako dobiveno eterično ulje sastoji se iz hlapive
i nehlapive frakcije. Hlapiva (dominantna) frakcija sadrži spojeve kao što su esteri,
monoterpeni i aldehidi, dok nehlapiva frakcija sadrži flavonoide, neke furanokumarine, masne
kiseline, di-, tri- i tetraterpene kao što je ß- karoten (49).
Ovim načinom proizvodnje eteričnog ulja dobiva se gotovo netaknuti sadržaj žlijezda koji se
naziva apsolut. Plin pod visokim pritiskom (oko 400 bara) razbija žlijezde i odnosi njihov
sadržaj, a padom pritiska kompletan plin isparava ostavljajući eterično ulje bez primjese plina.
Najčešće korišteni plin je ugljikov dioksid. Ovaj postupak je skuplji i tehnološki zahtjevniji.
Moguće je da prilikom ekstrakcije ugljični dioksid u dodiru s vlagom stvori kiselinu koja
može oštetiti neke osjetljive sastojke, pogotovo estere. Apsoluti koji nastaju nazivaju se CO2
apsoluti i vrlo su skupi. To su jedini apsoluti koji bi se smjeli koristiti u aromaterapiji (49).
30
Ekstrakcija organskim otapalima
Organska otapala kao što su n-heksan i benzen koriste se prilikom ekstrakcije za dobivanje
konkreta i apsoluta. Ekstrahirana ulja nisu eterična ulja i ne mogu se upotrebljavati u
aromaterapiji. Konkreti nastaju prvom ekstrakcijom (npr. n-heksanom) i osim sadržaja
žlijezda sastoje se i od tvari kao što su voskovi. Mirisne tvari se u drugom koraku iz n-
heksana ekstrahiraju uz alkohol koji se pažljivo ukloni destilacijom, a mirisna tvar koja ostane
zove se apsolut. Apsoluti su popularni u kozmetici i parfumeriji. Glavni je nedostatak što su
sasvim drugačijeg sastava od onih dobivenih vodenom destilacijom, a uz to organska otapala
onečišćuju konačni produkt te su nepoželjni u aromaterapiji (49).
Postupak se temelji na svojstvu masti i masnih ulja da adsorbiraju i zadrže eterično ulje koje
hlapi iz cvjetova. Izvodi se na staklenim pločama koje su s obje strane premazane slojem
masti debelim 3 cm. Ploča se nalazi u sredini pravougaonog ili kvadratičnog drvenog okvira.
Kako bi se povećala masna površina, povlače se brazde po masnom sloju. Oko 35- 40 drvenih
okvira naslažu se jedan na drugi te eterično ulje hlapi i adsorbira se na masnu podlogu. Kada
se ekstrahirani cvjetovi uklone, na ploče se stavlja novi cvjetni materijal, a proces se ponavlja
5 puta dok se masna podloga ne zasiti eteričnim uljem. Danas se neutralne masti (svinjska
mast i goveđi loj) zamjenjuju drugim adsorptivnim sredstvima, kao što su silikagel, ugljen te
esteri polialkohola (50).
Za ovaj se postupak kao ekstrakcijska sredstva koriste tekuće ili taljene pročišćene životinjske
i biljne masti, odnosno ulja. Cvjetovi se stavljaju u ulje ili rastaljenu mast temperature 50-80
°C. Vrijeme ekstrakcije ovisi o vrsti eteričnog ulja. Ekstrakcija se vrši s istom masti ili uljem
10-15 puta uz nove količine cvjetova . Ekstrakcija eteričnog ulja dobivenog bez primjene i uz
primjenu topline provodi se s 96%- tnim etanolom. Jakim hlađenjem ili dodavanjem vode,
31
etanol se oslobađa teže topivih primjesa. Etanolna se otopina koncentrira obzirom na veću ili
manju osjetljivost sastojaka eteričnpg ulja putem destilacije, često u vakumu ili se topivost
ulja smanji dodavanjem zasićene otopine soli. Eterično ulje se potom ekstrahira petroleterom
(50).
Hromatografija na tankom sloju. U analizi eteričnih ulja ova metoda se primjenjuje kao
bazna hromatografska analiza. Posjeduje mnogobrojne prednosti kao što su: cijena, veoma
jednostavna identifikacija komponenata i jeftina oprema. Glavni nedostaci su slaba
osjetljivost i preciznost. Kao stacionarna faza se najčešće upotrebljavaju silica gel i
aluminijum oksid. Kada je u pitanju mobilna faza ona zavisi od hemijskih komponenti
prisutnih u ispitivaanom eteričnom ulju. Najčešće se koriste višekomponentnii sistemi za
razdvajanje, ali postoje i monokomponentni sistemi. Najčešće korišteni višekomponentni
sistemi su: toluene-etilacetat (95:5), hloroform-toluen (75:25), benzen-etilacetat (95:5).
Komponente se identifikuju korištenjem UV lampi na UV 254 ili UV 366, kao in a vidljivoj
svjetlosti. Ploče se po potrebi mogu i prskati odgovarajućim reagensima kao što su vanilin-
sumporna kiselina ili anisaldehid-sumporna kiselina (51).
33
2.2.5 Terapijska primjena eteričnih ulja
Jedno odlično istraživanje o upotrebi aroma i eteričnih ulja kao lijekova je objavljeno od
strane Buchbauera i Jirovetza (1994). Predpostavljali su da isparljiva ulja, bilo da su
inhalirana ili nanesena na kožu, djeluju pomoću njihove lipofilne frakcije koja reaguje sa
lipidnim dijelom ćelijskih membrana, i kao rezultat toga, mjenjaju aktivnost kalcijumovih
kanala. Pri određenoj dozi, isparljiva ulja zasićuju membrane i pokazuju učinke slične
lokalnim anesteticima. Oni mogu reagovati sa ćelijskom membranom na osnovu svojih
fizičko-hemijskih karakteristika i molekulskih oblika, te mogu uticati na njihove enzime,
nosače, jonske kanale i receptore (52).
Najznačajnija polja primjene eteričnih ulja su u urologiji, dermatologiji, kod poremećaja sna,
kao lasativi, kod erozivnog gastritisa, za kardiovaskularni sistem, imunomodulirajući lijekovi,
34
te kod prehlade i gripe. Ulja se testiraju u farmakološkim eksperimentima, te se njihovi učinci
prate radi upotrebe kod velikog broja različitih stanja kao i zbog bilo kakvih mogućih znakova
toksičnosti. Ova stanja uključuju bolesti koje se povezane sa stresom, stomačne čireve i rast
tumora. Njihovi učinci na cirkulaciju, rast živaca, nukleinske kiseline, jetru, proteine, lipide,
ugljikohidrate, i metabolizam holesterola se također prati, kao i bilo kakvi drugi učinci na
aktivnost nadbubrežne žlijezde i imunog sistema. Antivirusna aktivnost eteričnih ulja
Houtttuyina cordata-e je testirana protiv herpes simplex virusa, gripe i HIV-a (56). Sugerira
se da antivirusna aktivnost ulja može biti posljedica uplitanja sa virusnom ovojnicom. U
drugom eksperimentu eterično ulje nekoliko vrsta roda Heracleum je pokazalo obečavajuću
aktivnost protiv virusa gripe (57). Dodatni eksperimenti su potrebni kako bi se potvrdile
tvrdnje o antivirusnoj aktivnosti te razjasnio način njihovog djelovanja (58).
35
eterično ulje Pinus koraiensis) značajno je smanjio aktivnost α-amilaze i nivo glukoze u krvi
te povečao ekspresiju inzulina na razini RNK u STZ tretiranim HIT-T15 ćelijama, ukazujući
na hipoglikemični potencijal EOPK-a (61). Hijaluronska kiselina, glikozaminoglikan, jedna je
od glavnih komponenti ekstracelularnog matriksa. Ona igra značajnu ulogu u zarastanju rana s
obzirom da pridonosi proliferaciji i migraciji ćelija. Stoga, sredstva koja djeluju protiv
hijaluronidaze bi mogla pridonijeti izliječivanju rana. Pokazalo se da eterična ulja Pinus pinea
i Pinus halepensis imaju antihijaluronidaznu aktivnost. Za brzo zarastanje ključno je
antiinflamatorno djelovanje. U istoj studiji je pokazano da eterična ulja Pinus nigra i Pinus
pinea imaju značajnu antiinflamatornu aktivnost (62). Alzheimerva bolest (AB) je najčešći
oblik demencije koji je karakteriziran gubitkom memorije i razmišljanja te abnormalnog
ponašanja. Iako patologija bolesti nije upotpunosti razjašnjena, inhibitori enzimske familije
holinesteraza su najpropisivaniji lijekovi trenutno. S druge strane, oksidativni stres koji
nastaje oštećenjem neurona ili akumulacijom metala je također jako povezan za patogenezom
AB, veoma je važno da lijek posjeduje i antiholinergička i antioksidativna svojstva da bi bio
kandidat za liječenje Alzheimerove bolesti (63). U jednoj od studija koja je rađena na turskim
ljekovitim biljkama ispitivane su antiinflamatorna i antioksidativna aktivnost pet vrsta Pinusa
zajedno sa piknogenolom. Upalni i oksidativni poremećji vode mnogim bolestima uključujući
i rak. Rak je druga najzastupljenija bolest, uzrokujuči više od 10% smrti širom svijeta.
Nekoliko lijekova je dostupna kao antinflamatorna i antikancerogena sredstva. Nedavne
studije su pokazale da eterična ulja nekih biljaka smanjuju i inhibiraju proizvodnju upalnih
medijatora različitim mehanizmima te djeluju antiproliferativno i citotoksično na ćelije raka.
Kao primjer je eterično ulje Abies koreana (Pinaceae) koje je pokazalo značajnu inhibiciju
proinflamatornih medijatora IL-1b, IL-6, TNF-a, NO i PGE2 u LPS stimuliranim makrofagima
(64).
Upala je, generalno govoreći, odgovor imunog sistema na stimulus. To može biti bakterija
koja je kolonizirala ranu na primjer. Upala se javlja kada se naš imuni sistem bori protiv
nečeg što može biti štetno. Upala može imati različite uzroke. Najčešći su:
36
Bolesti ili stanja koja uzrokuju upalu obično imaju naziv koji se završava na "-itis."Na
primjer:
Crvenilo
Toplina
Oteklina
Bol
Gubitak funkcija
Gubitak funkcije postoji, na primjer, kada se upaljeni ekstremitet ne može više pravilno
pomjerati ili kada se čulo mirisa pogorša za vrijeme prehlade, ili kada teže dišemo dok
imamo bronhitis. Ovo znači da upala ne započinje kada se rana inficira bakterijom, ugnoji se
ili sporo zacjeljuje, nego već onda kada tijelo pokušava da se bori protiv štetnog stimulusa ili
virusne infekcije. Ne pojavljuju se svih pet znakova kod svake upale. Neke upale se javljaju
"tiho" i ne uzrokuju simptome (65).
Ukoliko je upala teška, ona može uzrokovati generalne reakcije u tijelu.To uključuje sljedeće
znakove i simptome:
Veoma rijetka ali opasna komplikacija upale se naziva sepsa. Sepsa se može javiti ukoliko se
bakterija brzo razmnožava u određenom dijelu tijela i odjednom uđe u krvotok u velikoj
količini. Ovo se može desiti ukoliko tijelo ne uspije u borbi protiv lokalne upale, ukoliko su
patogeni veoma agresivni ili ukoliko je imuni sistem jako oslabljen. Zeb, osjećaj bolesti ili
37
veoma visoka temperatura mogu također biti znakovi trovanja krvi. Ukoliko se sumnja na
trovanje krvi, medicinska pomoć je hitno potrebna.
Mnogo različitih imunih ćelija mogu učestvovati u upali. One oslobođaju različite supstance,
medijatore upale. Oni podrazumijevaju tkivne horomone, bradikinin i histamin. Njihovo
djelovanje uzrokuje to da se uske krvne žile u tkivu šire , omogučavajući tako da više krvi
dođe do ozljeđenog tkiva. Zbog toga upaljeno područje postaje crveno i vruće. Također se i
više odbranbenih ćelija prenese zajedno sa krvlju do ozljeđenog tkiva, da pomognu u procesu
oporavka. Oba hormona mogu nadražiti živce i uzrokovati slanje bolnih signala do mozga.
Medijatori upale imaju još jednu ulogu: oni povečavaju propustljivost krvnih žila, kako bi
više odbranbenih ćelija dospjelo do afektiranog tkiva. Odbranbene ćelije također nose više
tečnoti do upaljenog tkiva, zbog čega ono često nabubri. Nakon toga tekućina se transportira
izvan tkiva još jednom, a oteklina polako nestaje. Mukozna membrana također otpušta više
tekućine za vrijeme upale. To se dešava na primjer kada imamo začepljen nos ili upalu
sluznice nosa. Tada nazalni sekret može pomoći u bržem uklanjanju virusa iz tijea (66).
Upala nije uvijek korisna reakcija tijela. U određenim bolestima imunološki sistem se
greškom bori protiv vlastitih ćelija, uzrokujući štetne upalne reakcije. To uključuje, na
primjer:
Reumatoidni artritis, gdje su mnogi zglobovi u cijelom tijelu trajno upaljeni
Psorijaza, hronična bolest kože
upale crijeva poput Crohnove bolesti ili ulceroznog kolitisa
Ove se bolesti nazivaju hronične upalne bolesti, a mogu trajati godinama ili čak tijekom
cijelog života u različitim stepenima težine i aktivnosti (67).
38
alternativa za NSAIL i opijate. Vjeruje se da je ljekovito bilje važan izvor novih hemijskih
supstanci sa potencijalnim terapijskim efektom.U jednom od ispitivanja eterično ulje Pinus
pumilio pokazalo je blagi antiinflamatroni efekat, jači od kamilice (46).
39
Dva najznačajnija poremećaja respiratornog trakta su bronhijalna astma i kašalj. Ostali, manje
osjetljivi na lijekove su: hronični bronhitis sa posljedičnom hroničnom opstruktivnom bolešću
disajnih puteva i respiratorni distres sindrom odraslih .
40
respiratornog trakta, akutni laringitis, faringitis i traheitis, akutni rinofaringitis i tonzilitis.
Osobe sa bronhijalnom astmom i hripavcem ne bi smijele koristiti ova eterična ulja (74).
Eterično ulje bora se smatra odličnim lijekom za sve vrste respiratornih problema, naročito
kao inhalant za liječenje bronhijalne kongestije, prehlade, sinusitisa. Ono također može
pomoći u liječenju mnogo ozbiljnijih stanja kao što su infekcije pluća, emfizima pneumonija.
Zbog njegovih snažnih antiseptičnih i ekspektorantnih karakteristika, ulje bora suzbija efekte
teškog pušenja, dok istodobno povečava oksigenaciju tkiva (75,76,77). Njemački naučnici su
proveli opsežno istraživanje, testirajući ekspektorantnu kvalitetu brojnih eteričnih ulja.
Povećanje sekrecije i povećanje koncentracije mukusa bi bili znakovi odnosno dokazi
ekspektorantnog djelovanja. Od svih testiranih eteričnih ulja, eterična ulja bora, limuna i
timjana su pokazala ekspektorantnu aktivnost uspješno ublažavajući suhi, nervozni kašalj.
Nadalje, istraživači su utvrdili da su se pozitvini rezultati postizali samo pri inhalaciji ulja, čak
i u vrlo malim dozama. Zapravo, ekspektorantni učinci su bili najbolji kada se minimalna
doza koristila za inhaliranje, proizvodeći vrlo slab miris u zraku, previsoka doza bi umjesto
stimulacije sekrecije uzrokovala inhibirajuće efekte sekrecije. Još jedna prednost inhaliranja
isparljivih eteričnih ulja jeste da se u mnogim slučajevima, infekcije zadržavaju u sinusima
između napada. Ulje Pinus sylvestris-a se smatra čak i djelotvornijim kada je u pitanju
tuberkuloza (78,79).
Mikrobi su sičušni oblici života koji nas okružuju, premali da bi se vidjeli golim okom.
Nalaze se u vodi, tlu i zraku. Ljudsko tijelo je također stanište za milione takivih mikroba,
koji se nazivaju mikroorganizmima. Od nekih smo bolesni dok su drugi bitni za naše zdravlje.
Najčešći mikrobi su bakterije, virusi i gljivice. Također postoje i protozoe. One su odgovorne
za bolesti kao što su toksoplazma i malarija. Bakterije su jednoćelijski organizmi. Nekim
bakterijama je potreban kisik da bi preživjele dok drugima nije. Nekima odgovara toplota, dok
drugima više odgovara hladnije okruženje. Većina bakterija nisu opasne po ljude. Mnoge od
njih žive u ili na našem tijelu i pomažu nam da ostanemo zdravi. Za primjer se može uzeti
bakterija mliječne kiseline koja u crijevima pospješuje probavu. Druge bakterije pomažu
imunom sistemu u borbi protiv klica. Neke su potrebne za proizvodnju određene vrste hrane,
na primjer jogurta, kiselog kupusa ili sireva. Manje od 1% bakterija je odgovorno za bolesti,
ali ovo je samo gruba pretpostavka jer nije poznat tačan broj. Neke bolesti, poput tuberkuloze
41
su uzrokovane isključivo bakterijama. Bakterijske infekcije se mogu liječiti antibioticima. To
su lijekvi koji uništavaju bakterije ili sprečavaju njihovo dalje razmnožavanje. Mnoge druge
infekcije kao što su dijareja, gripa ili tonzilitis također mogu biti uzrokovane bakterijama, ali
u većini slučajeva uzročnici su virusi. Antibiotici nisu učinkoviti protiv virusa. Tako da se
njihova upotreba ne preporučuje odmah ukoliko se samo sumnja na bakterije kao uzročnike
infekcije (80). Za razliku od baktetrija, virusi ne posjeduju vlastite ćelije. To bi značilo da oni
nisu živući organizmi u strožijem smislu. Oni su sačinjeni od jedne ili više molekula, unutar
proteinske ljuske. Gentička informacija koja se nalazi unutar ove ljuske je neophodna
virusima da bi se razmnožavali. Mnogi virusi su uzročni bolesti. Neki ne uzrokuju štetu i
izazivaju manje prehlade, dok drugi mogu uzrokovati ozbiljne bolesti poput AIDS-a. Druge
bolesti uzrokovane virusima su gripa,ospice ili upala jetre odnosno virusni hepatitis. Virusi
napadaju zdrave ćelije te se počinju umnožvati u tim ćelijama. Bez tih ćelija domaćina, virusi
se ne mogu razmnožavati. Ne uzrokuju svi virusi simptome i u mnogim slučajevima tijelo se
uspješno bori protiv napadača. Ovo je slučaj sa herpesima, sa kojima se ljudi povremeno
susreću. Oni su uzrokovani virusima koji se nalaze u nervnim ćelijama i mogu dovesti do
pojave ranica na usnama kod nekih ljudi ukoliko je imuni sistem već okupiran drugim
stvarima. Relativno je teško boriti se sa virusom lijekovima. Da bi se zaštitili od nekih virusa
imuni sistem se može " trenirati" vakcinama kako bi tijelo učinili manje osjetljivim na viruse
(81). Baš kao i bakterije neke gljivice se nalaze na našoj koži ili u našem tijelu. Ali gljivice
također mogu uzrokovati i bolesti. Bolesti uzrokovane gljivicama se nazivaju mikoze. To
uključuje poznato sportsko stopalo ili gljivičnu infekciju noktiju, na primjer. Gljivične
infekcije mogu ponekad uzrokovati upalu pluća ili mukozne membrane usta ili reproduktivnih
organa, te postati opasna po život za ljude sa oslabljenim imunim sistemom. Ljudi su
međutim i profitirali zbog nekih djelotvornih osobina gljivica. Plijesni dugujemo otkriće
penicilina koji se koristi za proizvodnju antibiotika (82).
42
kao što je izbjeljivač), koji ubijaju različite vrste mikroba na neživim površinama kako bi
spriječili širenje bolesti; antiseptici( koji se nanose na živa tkiva i pomažu smanjivanje
infekcija za vrijeme operacija) i antibiotici (koji uništavaju mikroorganizme koji se nalaze u
tijelu) (83).
Otkriće, razvoj i upotreba antibiotika u toku 20. stoljeća je smanjila broj smrtnih slučajeva od
bakterijskih infekcija. Era antibiotika je počela sa pneumatskom primjenom nitroglicerina,
koja je praćena "zlatnim" periodom otkrića od 1945-1970, kada je veliki broj strukturno
različitih i veoma efikasnih agenasa otkriveno i razvijeno. Od 1980. uvođenje antimkrobnih
lijekova u kliničku upotrebu je smanjena, dijelom zbog velikih troškova koji su potrebni za
razvoj i testiranje novih lijekova (86). Paralelno sa tim javio se alarmantno velik rast
antimikrobne rezistencije bakterija, gljivica, parazita i nekih virusa na postojeće agense (87).
Antibiotici spadaju u jedne od najčešće korištenih lijekova kao i među lijekove koje liječnici
najčešće pogrešno koriste, na primjer, kod infekcija respiratornog trakta koje su uzrokovane
virusima. Kao posljedica široko rasprostranje i nepromisšljene upotrebe antibiotika, javlja se
zabrinjavajuća pojava patogena koji su rezistentni na antibiotike, što je rezultiralo velikom
prijetnjom po zdravlje svjetske populacije.
Antifungalni agensi se koriste za uništavanje ili prevenciju daljeg rasta gljivica. U medicini se
koriste za liječenje infekcija poput atletskog stopala,lišajeva i drozda, i djeluju tako što
iskorištavaju razlike između ćelija sisara i gljivica. Ubijaju gljivične organizme bez da čine
štetu domaćinu. Za razliku od bakterija, i gljivice su kao i čovjek eukarioti. Što znači da su
gljivične i ljudske ćelije slične na molekularnom nivou, te to otežava antifungalnom lijeku da
pronađe metu napada koja također nije prisutna u inficiranom organizmu. Kao posljedica se
javljaju neka neželjena dejstva ovih lijekova. Neka od njih mogu biti opasna po život ukoliko
se ti lijekovi ne koriste pravilno (89).
43
2.3.3.1. Antimikrobna aktivnost eteričnih ulja poodice Pinaceae
Proizvodi gljivica i bakterijske ćelije su veoma značajni zarazni agensi koji uzrokuju bolesti
kao što su alergijski rinitis, astma i hipersenzitivni pneumonitis. Astma je jedna od najčešćih
dječijih respiratornih bolesti ,te njena prevalenca u svijetu nastavlja rasti. Drugi problem je taj
da je njihovih rasadnika mnogo te prisustvo gljivica na kosi i noktima djece im pruža priliku
da napadnu kožu. Mnoge studije su zabilježile da su gljivice Aspergillus, Penicillium vrste te
kvasci Candida glavni uzročnici oboljenja kod ljudi. Tako lista opasnih gljivica po život ljudi
( Alternaria, Acremonium, Fusarium, Absidia, Phoma vrsta) raste svake godine.
Antimikrobna aktivnost eteričnih ulja porodice Pinaceae je istraživana od strane mnogih
autora. Smatralo se da je eterično ulje bora veoma aktivno samo protiv bakterija. Poslije su
Kraueze Baranowska i ostali (2002) otkrili da eterično ulje bora iz Sjeverne
Amerike(koncentracija od 2%) inhibira rast dvaju gljivica: Fusarium culmorum i F.solani.
Fungicidnu aktivnost prema F.poae pokazuje pri koncentraciji od 5% (60). U jednoj od
studija je utvrđeno da eterična ulja P.halepensis pokazuju dobar inhibitorni efekat prema
mikroorganizmima. To se pripisuje njihovim oksidiranim monoterpenskim komponentama
koje čine više od 16.2 % ulja. Antibakterijska aktivnost eteričnog ulja P.halepensis iz
Ghazaouet( Sjevero-zapadni Alžir) je ispitivana protiv četiri soja bakterija: S.aureus,
P.aeruginosa, E.coli i B.cereus. Eterično ulje je pokazalo snažnu aktivnost protiv S.aureus i
B.cereus. Nasuprot tome, eterično ulje je bilo neefikasno protiv P.aeruginosa i E.coli (16).
44
tipa i stadija razvoja tumora. Hemoterapija može da se koriti samostalno ili kao dodatak
nekom drugom obliku liječenja. Drugi pristupi liječenju karcinoma, na primjer pristupi
bazirani na znanju o patobiologiji karcinoma, tek su u razvoju i počinju da daju prve rezultate
(68).
Karcinom predstavlja drugu najveću bolest, uzrokujući više od 10% smrti u svijetu. Liječenje
karcinoma hemoterapijom i/ili zračenjem povezano je sa velikom toksičnosti i razvojem
rezistencije na lijekove, što rezultira neefikasnim tretmanom. Ovo je dovelo do povečanog
interesa u istraživanju biljanih ekstrakta kao potencijalnih izvora za razvoj novih alternativnih
antikancerogenih agenasa (26). Do sada, antikacerogenu aktivnost od ekstrakta borovog
drveta su pokazale one vrste koje su rasprostranjene širom Azije. U jednoj od naših studija
bavili smo se karcinomom dojke. Karcinom dojke pogađa više od 1.3 miliona žena širom
svijeta svake godine i čini oko 14% smrt koje su povezane sa karcinomom. U zapadnim
zemljama, rizik da se kod žene razvije ova bolest u toku njenog života iznosi 10%. Incidenca
je porasla u posljednim desetljećima i očekuje se da raste u nadolazećim godinama. Karcinom
dojke je heterogena skupina patoloških entiteta koji se sastoje od nekoliko molekularnih
podtipova, od kojih svaki ima različito porijeklo i biološko ponašanje te tako zahtijevaju i
različit pristup. Većina novih dijagnosticiranih karcinoma (oko 70%) dojke su
estrogen-receptor (ER) pozitivni te se klasificiraju kao luminalni podtipovi. Određivanje ER
statusa na tumorskim uzorcima je standardna praksa u kliničkoj onkologiji, tako što pacijenti
koji imaju ER pozitivne tumore imaju i korist od endokrine terapije, i generalno imaju bolju
prognozu od onih koji imaju ER negativan karcinom dojke te je terapija za njih mnogo
komplikovanija, a prognoza dosta lošija. Postoje dokazi da borove iglice mogu pokazati i
antioksidativno, antimutageno te antiproliferativno djelovanje na ćelije karcinoma. U ovoj
studiji je pokazano da ekstrat borovih iglica suprimira održivost ćelija raka pokazujući nešto
selektivnosti prema estrogen-receptor negativnim ćelijama raka dojke, MDA-MB-231
(polovina maksimalne inhibitorne koncentracije [IC50] 35 μg/ml) u poređenju sa estrogen-
receptor pozitivnim ćelijama karcinoma dojke ( IC50 86 μg/ml). To je najjači citotoksični
efekat u svim mjerenjima, do sada za ekstrakte iglica i lišća izolovanih iz različitih vrst bora,
te je također i prva studija koja je poredila efekte ekstrakta borovog drveta na molekularno
različite humane ćelije karcinoma dojke. Eterično ulje je pokazalo jaču citotoksičnu aktivnost
45
i na negativne i na pozitivne ćelije karcinoma dojke ( za oboje IC50 29 μg/ml) u odnosu na
ekstrakt bora (33).
Kod dijabetesa tipa 1 postoji apsolutni deficit insulina usljed autoimune destrukcije β ćelija.
Bez primjene insulina takvi pacijenti umiru u dijabetičnoj ketoacidozi. Dijabetes tipa 2 je
udružen sa rezistencijom na insulin (koja prethodi bolesti) i smanjenom sekrecijom insulina,
značajnim poremećajima u patogenezi ove bolesti. Takvi bolesnici često su gojazni i obično
obole u odraslom dobu; incidenca ovog tipa raste sa starošću, dok funkcija β ćelija opada. U
početku se primjenjuje dijeta, zatim se uključuju oralni antidijabetici, dok bi na kraju trećina
bolesnika morala preći na insulin (68).
46
2.3.5.1. Antidijabetična aktivnost eteričnih ulja porodice Pinaceae
Metabilički sindrom stvara faktore rizika za koronarnu srčanu bolest, diabetes, masnu jetru,
pretilost i nekoliko vrsta raka. Diabetes mellitus je metabolički poremećaj koji uključuje
veliki nivo glukoze u krvi koji može da pogodi mnoge organe, uključujući srce, krvne žile,
živce, oči i bubrege. Konkretno, diabetes mellitus tipa 2 (T2DM), najčešći oblik dijabetesa
koji je posljedica inzulinske rezistencije, vodi do dijabetičnih komplikacija kao što su srčani
udar, moždani udar, amputacija, dijabetična retinopatija, te zatajenje bubrega , dok tip 1
diabetesa mellitusa (T1DM) je autoimuna bolest koja je posljedica uništavanja β ćelija
pankreasnih otočića. Iako je razvijeno mnogo antidijabetičnih lijekova za snižavanje nivoa
glukoze u krvi, kao što su bigvanidini (metformin, fenformin i buformin) i tiazolidindioni
(rosiglitazon, pioglitazon i troglitazon), neki njihovi štetni učinci kao što su gastrointestinalni
simptomi, laktatna acidoza i hepatotoksičnost uzrokuju veliku zabrinutost prilikom liječenja
dijabetesa. U posljednje vrijeme biljni hipoglikemični lijekovi su sve više atraktivniji zbog
njihove sposobnosti da kontroliraju dijabetes duže vrijeme, a pritom pokazuju i manju
toksičnost. U studiji, antidijabetični efekat EOPK (eterično ulje Pinus korainensis) na mišu sa
streptozocin(STZ) inducirani m diabetesom tipa 1i na HIT-T15 pankreatičnim β ćelijama.
EOPK je značajno zaštitio HIT-T15 ćelije od STZ- inducirane citotoksičnosti i smanjio nivo
glukoze u STZ induciranom diabetičnom mišu kad se poredio sa netretiranom kontrolom.
EOPK je značajno smanjio aktivnost α-amilaze i nivo glukoze u krvi te povečao ekspresiju
inzulina na razini RNK u STZ tretiranim HIT-T15 ćelijama, dok je ekspresija inzulina bila
umanjena (61).
47
degeneraciji neurona, te na primjer faktori kao što su ekscitotoksičnost i oksidativni stres
mogu biti dovoljne jačine da direktno iazazovu smrt ćelije nekrozom, ili ukoliko su slabijeg
intenziteta da izazovu apoptozu. Stoga oba procesa mogu predstavljati potencijalni cilj za
eventualnu neuroprotektivnu terapiju (68).
Alzheimerova bolest (AB)- prvobitno je definisana kao presenilna demencija, dok se danas
smatra da isti patološki procesi izazivaju demnciju bez obzira na starosnu dob u vrijeme
pojave simptoma bolesti. AB je demencija koja nije posljedica ishemije, traume mozga ili
dejstva alkohola. Učestalost ove bolesti značajno raste sa godinama starosti, od 5% u dobu od
65 godina do 90% i više u dobu od 95 godina. Donedavno, smatralo se da demencija vezana
za starije životno doba nastaje zbog permanentnog gubitka neurona tokom života, koji se
vjerovatno ubrzava sa otežanim sndbjevanjem krvlju vezanim za arteriosklerozu. Međutim
studije od sredine 1980. godina pokazale su da u procesu nastanka AB važnu ulogu imaju
specifični genetski i molekularni mehanizmi, što je otvorilo novo poglavlje u terpiji ove
bolesti (68). Bezobzira na multifaktorijalnu prirodu Alzheimerove bolesti, samo jedan
terapijski pristup se trenutačno koristi. Ta strategija se zaniva na tzv. holinergijskoj hipotezi
kognitivne disfunkcije. Ova hipoteza govori da su bar neki od kognitivnih padova koji dožive
pacijenti sa AB posljedica nedostatka transmitera acetilholina (ACh) i time i u holinergijskoj
neurotransmisiji u moždanom kortikalnom ili hipokampalnom području, što se čini da igra
ključnu ulogu u pamćenju. Štoviše, u kasnijoj fazi AB, nivo acetilholinesteraze(AChE) je
smanjena do 85%, a butirilholinesterazea (BChE) predstavlja predominantnu holinesterazu u
48
mozgu. BChE, prvenstveno je povezana sa glijalnim ćelijama ali također i sa specifičnim
neuronskim putevima, cijepa ACh na sličan način kao i AChE da bi prekinuo njegovu
fiziološku aktivnost. Neke studije BChE karakteriziraju kao novi pristup posredovanja
progresije AB. Dakle, obnavljanje nivoa ACh inhibiranjem obje forme holinesteraze, AChE i
BChE , nastavlja da bude terapijski koristan pristup za liječenje ne samo Alzheimerove bolesti
ali i druge oblike demencije. Potencijalna upotreba prirodnih proizvoda se pokazala
uspješnom u polju AB. Eterična ulja privlače posebnu pažnju među prirodnim izvorima.
Zapravo, rezultati različitih nedavnih studija ukazuju na to da nekoliko eteričnih ulja iz usjeva
hrane, ljekovitog bilja, te ulja iz stabla čaja značajno inhibiraju aktivnost holinesteraza (92).
49
Turskoj zajedno sa piknogenolom. U ovu svrhu su se ispitivale antioksdativna i inhibitorna
aktivnost prema holinesterazi sljedećeg: acetatnog, etilacetatnog i etanolnog ekstrakta i
eteričnog ulja dobivenih iz grančica i iglica 4 vrste (P.brutia, P. halepensis, P.nigra i P.
silvestris),te samo eterično ulje grančica i iglica P.pinea. Također je ispitivan i ukupni sadržaj
fenola i flavonoida u ekstraktima i eteričnom ulju izoliranih iz grančica i iglica ispitivanih
vrsta. Rezultati su pokazali da je piknogenol bio najaktivniji ekstrakt, koji inhibira i AChe
(63.33± 0.22%) i BChe (83.67 ± 0.22%) na značajnom nivou. Etanolni ekstrakt iglica Pinus
halepensisa je također pokazao značajan učinak na inhibiciju AChe (60.15± 3.22 %) i BChe
(82.47 ±5.57%), što je slično rezultatima piknogenola. Među eteričnim uljima, ono iz grančica
P. halepensisa pokazalo je največu inhibitorno aktivnost prema AChe (83.91 ±3.95%) i BChe
(80.62 ± 2.95 %) (63). Eterična ulja iz tri Pinus vrste, poznate kao Pinus nigra, Pinus
calabrica i Pinus heldreichii, su ispitivane zbog njihovog hemijskog sastava i
acetilholinesterazne i butirilholinesterazne inhibitorne aktivnosti. Rezutati su pokazali da
eterična ulja Pinusa imaju karakteristike značajne za liječenje Alzheimerove bolesti i time
dale nove podatke koje ukazuju na značaj kliničkih istraživanja na ovim vrstama (92).
50
Dislipoproteinemija je pojam koji označava poremećen odnos lipoproteina u serumu, a
uključuje i hiperlipoproteinemiju i hipolipoproteinemiju. Hiperlipoproteinemija može biti
primarna i sekundarna (93). Primarni oblici se mogu gentski utvrditi. Klasifikovani su
uzavisnosti od toga koja je lipoproteinska frakcija povećana, u šest fenotipova
(Fredricksonova klasifikacija, tabela). Ona ima prognostičke i terapijske implikacije, ali nije
dijagnostička klasifikacija. Izuzetno veliki rizik od ishemijski oboljenja srca naročito se
ispoljava u podgrupi primarne 2a hiperlipoproteinemije uzrokovane monogenskim defektom
LDL receptora poznate kao porodična hiperholesterolemija. Sekundarne forme
hiperholesterolemija su posljedice drugih poremećaja, kao što su dijabetes melitus,
alkoholizam, nefrotski sindrom, hronično oboljenje bubrega, hipertireoidizam, oboljenja jetre
i primjena lijekova npr. izotreotina ( izomer vitamina A koji se peroralno i lokalno daje u
terapiji teških oblika akni) i inhibitora proteaze koji se koriste u terapiji infekcija humanim
imunodeficijentnim virusom.
Nekoliko preparata se koristi u cilju smanjenja LDL holesterola u plazmi. Lijekovi za sniženje
lipida u plazmi predstavljaju samo jedan pristup u tretmanu i primjenjuju se zajedno sa
dijetom i uz korekciju ostalih primjenjivih kardiovaskularnih faktora rizika. Najčešće
korištene grupe lijekova su (68) :
Sastav masnih kiselina u prehrani je ključna odrednica u regulaciji nivoa lipida i lipoproteina
kod ljudi. Trenutni vodiči preporučuju da unos lipida bude limitiran do 30% energetskih
potreba od čega su 7% zasićene, 14% mononezasićene i 9% polinezasićene masne kiseline u
dijeti ( Nacionalni Program Edukacije o Holesterolu 1994). Mnogobrojne studije na
eksperimentalnim životinjama jasno su pokazale da ulja koja se razlikuju po masnim
kiselinama koje ulaze u njihov sastav imaju nejednake karakteristike u smanjivanju nivoa
lipida. Pronalazak novih izvora za ulja sa korisnim potencijalom za zdravlje bi mogla pomoći
u promoviranju i unapređenju dijeta za smanjenje nivoa lipida kod ljudi. Sjemenke Konifera
kao što su Pinus koraiensisi, Pinus cembra, Pinus cembroides, Pinus edulis, Pinus pinea,
51
Pinus sibirica i Pinus monphylla se trenutno konzumiraju kao začani u hrani. Nedavne studije
ukazuju na to da ulja ekstrahirana iz nekih od ovih sjemena imaju značajan potencijal za
smanjivanje nivoa lipida kod glodavaca. Prijašnje studije na štakorima su pokazale da ulje
sjemena P.pinaster smanjuje nivo triglicerida, VLDL-triglicerida VLDL-holesterola u
poređenju sa prehranom obogaćenom oleinskom kiselinom. Kasnija saznanja su ukazala na to
da se ulje sjemenki P.pinastera može koristiti u dijetama za smanjenje nivoa lipida (71).
52
3. Ciljevi rada
Cilj ovog rada jeste da prikaže značaj primjene ljekovitog bilja odnosno njihovih
metabolita u terapiji različitih oboljenja, sa naglaskom na biljke koje pripadaju
porodici Pinaceae
Prikazati sastav i farmakološko djelovanje pojedinačnih eteričnih ulja porodice
Pinaceae
Pregled farmakoloških aktivnosti eteričnih ulja porodice Pinaceae koja ostvaruju na
različitim organskim sistemima, za tretiranje nekih stanja i bolesti
Na osnovu različitih studija ukazati na neke od prednosti liječenja oboljenja prirodnim
pripravcima u odnosu na sintetske proizvode
Preporučiti primjenu eteričnih ulja porodice Pinaceae u terapiji na osnovu
farmakoloških aktivnosti koje pokazuju
53
4. Materijal i metode
54
5. Rezultati
Autori: Nadia Fekih, Hocine Allali, Salima Merghache, Faïza Chaïb, Djamila
Merghache, Mohamed El Amine, Nassim Djabou, Alain Muselli, Boufeldja Tabti, Jean
Costa, 2014.godina
Cilj ove studije je bio da se pronađu novi biokativni prirodni proizvodi, da se ispita hemijski
sastav i antimikrobna aktivnost sastojaka eteričnog ulja ekstrahovanog iz posebnih dijelova
alžirske aromatične biljke Pinus halepensis Miller (iglice, grančice i pupoljci). Eterično ulje
koje se koristilo u ovoj studiji je izolirano vodenom destilacijom uz korištenje aparature
Clevenger tipa, prema evropskoj Farmakopeji. Hemijski sastav je ispitivan pomoću GC-
indeksa retencije i GC-MS-a. Identificirano je 49 supstanci koje čine 97.9% ukupnog sastava
ulja. Ugljikohidrati su bili dominantni sastojci eteričnog ulja (80.6%), naročito monoterpeni
(65.5%). Najzastupljenije supstance u 10 ispitivanih ulja bile su: micren (15.2-32.0%), α-
pinen (12.2-24.5%), β-kariofilen (7.0-17.1%), terpinolen (1.8-13.3%),2-fenil,etilizovalerat
(4.8-10.9%), terpinen-4-ol (1.0-8.2%), sabinen (1.5-6.3%). Varijacije u hemijskom sastavu
eteričnih ulja iz različitih dijelova 10 uzoraka alžirskog P.halepensisisa su ispitivane
statističkom analizom. Eterična ulja su hijerarhijskom analizom grupisana u dvije grupe na
osnovu njihovog hemijskog sastava. Eterična ulja su pokazala interesantan antimikrobni
efekat prema Lysteria monocytogenes, Eneterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginisa,
Acinetobacter baumanii, Citrobacter freundi i Klebsiella pneumoniae. Ovi rezultati su
upučivali na mogučnost da eterično ulje P.halepensisa može biti novi izvor prirodnih
antimikrobika koji će se primjenjivati u farmaceutskoj i prehrambenoj industriji. Dakle prvi
cilj ove studije je bio da se razjasni hemijski sastav eteričnog ulja Pinus halepensisa koristeći
kombinaciju GC i GC/MS. Drugi cilje je bio da se okarakteriziraju razlike u sastavu eteričnih
ulja između vrsta koristeći 10 uzoraka ulja sa različitih lokacija u Alžiru te da se procjeni
antibakterijska aktivnost eteričnog ulja.
U tabeli 1 smo grupisali najzastupljenije komponente eteričnog ulja P.halepensis na osnovu
literaturnih podataka. Različiti sastavi su regristrovani, i za sve je bilo karakteristično
prisustvo monoterpenskih, seskviterpenskih i fenilpropanskih supstanci.
55
Tabela 1. Glavni sastojci eteričnog ulja Pinus halepensisa sa različitih područja
U ovoj studiji različiti dijelovi Pinus halepensisa su sakupljani sa deset različitih mjesta u
sjeverozapadnom Alžiru. Neke informacije o tih deset mjesta sa kojih su sakupljani uzorci
(porijeklo, geografska širina, dužina, prinosi eteričnog ulja) su prikazani u tabeli 2.
Lokacije uoraka su bile rasprostranjene u dvije zone. Zonom 1 se smatrala primorska zona u
blizini Mediteranskog mora, dok je zona 2 bila planinska zona na visini od 700 m. Udio
56
eteričnih ulja u svježim uzorcima sa 10 različitih lokacija se kretala od 0.13-0.63 %, da
budemo precizniji, primjetno je da je veći udio ulja pronađen u uzorcima iz zone 1 (0.20-0.63
%), dok su manji udjeli pronađeni u zoni 2 (0.13-0.35 %).
Hemijski sastav ulja iz 10 uzoraka P.halepensis je ispitivan uz korištenje GC i GC/MS
(Tabela3). Četrdesetdevet supstanci, koje su činile 97.9% ulja, su izolirane.
57
Antibakterijska aktivnost eteričnog ulja P.halepensis sa područja sjeverozapadnog Alžira je
ispitivana papir- disk difuzijskom metodom protiv 11 bakterija. U tabeli 3 možemo vidjeti da
ulje ima promjenjivu antibakterijsku aktivnost (8-10 mm) protiv testiranih sojeva.
Maksimalna zona inhibicije je postignuta protiv L.monocytogenes (10mm), K. pneumoniae
(10mm), E.faecalis (9mm) i Acinetobacter baumanii (9.5 mm). Za razliku od toga, eterično
ulje nije bilo efikasno protiv S.aureus, B.cereus, E.coli, Salmonella typhimurium i Proteus
mirabilis. Prema Sheng-Hsien-u eterično ulje P.halepensis je pokazalo dobru inhibitornu
aktivnost protiv nekih testiranih mikroorganizama (16).
Autori: Hye-Eun Joo, Hyo-Jung Lee, Eun Jung Sohn, Min-Ho Lee, Hyun-Suk Ko, Soo-
Jin Jeong, Hyo-Jeong Lee i Sung-Hoon Kim, 2014.godina
58
Metabolički sindrom uzrokuje rizične faktore za koronarnu srčanu bolest, dijabetes, masnu
jetru, gojaznost i neke karcinome. Grupa ljudi, koja je radila ovu studiju, već je obavještavala
o tome da eterično ulje iz listova Pinus koraiensis (EUPK) pokazuje antihiperlipidemične
učinke tako što reguliraju receptore lipoproteina niske gustoće i inhibiraju acil-koenzim A,
holesterol aciltransferaze. U ovoj studiji je procjenjivan antidijabetični efekat EOPK-a na
mišu sa streptozotocinom (STZ) induciranim dijabetesom tipa 1, te na pa HIT-T15
pankreatičnim β ćelijama. EOPK je značajno zaštitilo HIT-T15 ćelije od STZ-inducirane
citotoksičnosti te je smanjio nivo glukoze u krvi kod miševa sa STZ induciranim dijabetesom
kada se poredio sa netretiranom kontrolom. Značajno i dosljedno je suprimirialo aktivnost α-
amilaze na dozno ovisan način te je povećalo djelovanje inzulina na nivou mRNK u STZ
tretiranim HIT-T15 ćelijama dok je uticaj inzulina bio umanjen. Eterično ulje P.koraiensis je
također značajno smanjilo i populaciju kisikovih reaktivnih vrsta kada se poredilo sa
netretiranom kontrolom u STZ-tretiranim HIT-T15 ćelijama. Nadalje, EOPK je značajno
smanjilo produkciju azotnog oksida, suzbilo fosforilaciju endotelne NO(azotni oksid)
sintetaze te suprimiralo produkciju vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) u STZ-
tretiranim HIT-T15 ćelijama, što upućuje na njegovu potencijalnu primjenu kod dijabetične
retinopatije. Sveukupno gledano, naši rezultati ukazuju na to da EOPK ima hipoglikemični
potencijal tako što inhibira reaktivne kisikove spojeve (ROS), endotelijalnu NO sintazu
(eNOS) i VEGF u STZ-tretiranim miševima i HIT-T15 pankreatičnim β ćelijama kao
potencijani antidijabetični agens.
STZ je značajno smanjio održivost HIT-T15 ćelija na način ovisan o dozi (Slika 13.A), dok je
EOPK pokazalo slabu citotoksičnost naspram HIT-T15 pankreatičnim β ćelijama (Slika
13.B). Kako god, kotretman sa EOPK i STZ-om značajno je smanjio citotoksičnost STZ u
HIT-T15 pankreatičnim β ćelijama (Slika13.C). STZ se koristio da bi inducirao
eksperimentalni oblik dijabetesa tipa 1. U ovoj studiji, ICR mužijacima se intraperitonealno
(i.p.) injicirao STZ u dozi od 200 mg/kg da bi se inducirao dijabetes. Zatim se apliciralo
eterično ulje P.koraiensisa u dozi od 150 mg/kg 4 dana nakon STZ injekcije. Slika 14.A
pokazuje da tjelesna težina u normalnoj skupini nije značajno promjenjena nakon 4 dana, dok
je STZ tretman smanjio tjelesnu težinu sa 22.35 ± 2.10g do 20.38 ± 3.27 g kada se poredilo sa
normalnom grupom. Nasuprot tome, eterično ulje je održalo tjelesnu težinu na razini od 35.89
± 5.65 g u poređenju sa STZ kontrolnom skupinom, također i tretman sa akarbozom u dozi od
20 mg/kg nije uzrokovao gubitak tjelesne težine kod dijabetičnih miševa.
59
Slika 13. Citotoksični efekat EOPK, Streptozotocina (STZ), i njihove kombinacije prema HIT-
T15 ćelijama.
A.Održivost HIT-T15 ćelija je procjenjivana u MTT eseju. Ćelije su tretirane različitim
koncentracijama STZ-a (0, 1.25, 2.5,5 ili 10mM) u toku 24 sata.
B. Ćelije tretirane različitim koncentracijama EOPK (0, 3.125 6.25, ILI 12.5 mg/ml) u toku 24
sata.
C. Ćelije tretirane STZ-om (10mM) u prisustvu ili odsustvu EOPK-a(3 ili 6 mg/ml) u toku 24
sata. Vrijednosti su prikazane kao ± SD, p< 0.05 vs. STZ tretiranom skupinom.
60
Slika 14. Uticaj EOPK-a na tjelesnu težinu i nivo glukoze u krvi u STZ induciranim
dijabetičnim miševima
Eterično ulje P.koraiensisa (150 mg/kg) je oralno primjenjeno STZ induciranim dijabetičnim
miševima u toku 4 dana.
A.Promjena tjelesne težine je mjerena 4 dana nakon tretmana sa eteričnim uljem. B. Nivo
glukoze u krvi je određivan sa CareSens N glukometrom. Vrijednosti su prikazane kao ± SD,
p< 0.001 u poređenju sa normalnom skupinom i, p<0.001 u poređenju sa STZ kontrolnom
skupinom.
61
Slika 15. Uticaj EOPK-a na in vitro inhibiciju alfa amilaze.
Četiri dana nakon primjene STZ-a, koncentracija glukoze u krvi je značajno porasla sa 548 ±
27.35 mg/dL kada se poredilo sa normalnom skupinom (216.50 ± 7.50 mg/dL). Nasuprot
tome, značajan pad nivoa glukoze u krvi je primjećen u skupini koja je tretirana EOPK-om
(200.12 ± 23.72 mg/dL) kada se poredi sa STZ kontrolnom skupinom, skoro slično učinku
akarboze kao pozitivnog antidijabetičnog agensa (Slika 14.B).
Inhibitorni efekat EOPK protiv α-amilaze je ispitivan u in vitro α-amilaznom enzimatskom
eseju. Slika 15 pokazuje da je eterično ulje P.koraiensisa značajno inhibiralo aktivnost α-
amilaze na način koji je ovisan o dozi.
RT-PCR se koristio prilikom ispitivanja efekta EOPK-a na nivo inzulin mRNK u STZ
tretiranim pankreatičnim β ćelijama. Slika 16 A pokazuje da je STZ suzbio mRNK ekspresiju
inzulina u HIT-T15 ćelijama. Nasuprot tome, tretman sa EOPK-om je regulirao ekspresiju
inzulina na dozno ovisan način u STZ- tretiranim HIT-T15 ćelijama.
U ovoj studiji je pronađeno da se generacija aktivnih kisikovih spojeva (ROS) jasno proširila
do 38.84% STZ tretmanom kada se poredi sa netretiranom kontrolom (Slika 16B). Eterično
ulje je efikasno smanjilo produkciju ROS-a do 26.98% i 23.95% pri koncentraciji od 3
mg/mL i 6 mg/mL kada se poredi sa STZ tretiranom kontrolom. Slika 17 nam pokazuje
učinak EOPK-a na neke markere angiogeneze kao što su NO, eNOS i VEGF u STZ tretiranim
62
HIT-T15 pankreatičnim β ćelijama. EOPK je smanjilo produkciju NO i VEGF-a i prekinulo
ekspresiju eNOS u STZ tretiranim HIT-T15 ćelijama (Slika 17) (61).
Slika 16. Uticaj EOPK-a na ekspresiju gena za inzulin i ROS u STZ induciranim HIT-T15
ćelijama
63
Slika 17. Uticaj EOPK-a na produkciju nitrita i VEGF sekreciju u STZ tretiranim HIT-T15
ćelijama.
Autori: Marco Bonesi, Federica Menichini, Rosa Tundis, Monica R. Loizzo, Filomena
Conforti, Nicodemo G. Passalacqua, Giancarlo A. Statti, i Francesco Menichini,
2010.godina
Cilj ove studije je bio da se ispita inhibitorna aktivnost eteričnih ulja Pinus nigra subsp. nigra,
P. nigra var. calabrica, i P. heledreichii subsp. leucodermis naspram
acetilholinesteraze(AChE) i butirilholinesteraze (BChE). Ovo djelovanje je povezano sa
liječenjem Alzheimerove bolesti (AB), sobzirom da su holinesterazni lijekovi trenutno jedini
dostupni lijekovi u liječenju AB. P. heldreichii subsp. leucodermis je pokazao najobečavajuču
aktivnost, njegova IC50 za AChE i BChE je iznosila 51.1 i 80.6 µg/mL. Još jedna
interesantna aktivnost naspram AChE je primjećena kod eteričnog ulja P.nigra subsp. nigra,
čija je IC50 iznosila 94.4 µg/mL. Eterična ulja su analizirana metodoma GC i GC-MS sa
namjerom da se ispita njihova veza sa zabilježenim aktivnostima. Terpinolen, β-felandren,
linalil acetat, trans-kariofilen, i terpinen-4-ol su bili ispitivani među supstancama koje su bile
registrovne. Trans-kariofilen i terpinen-4-ol su inhibirali BChE sa IC50 od 78.6 µg/mL. β-
64
felandren je djelovao selektivno, protiv AChE ( IC50 120.2 µg/mL). Kao dio nastojanja u
pronalaženju novih aktivnih supstanci sa antiholinesteraznom aktivnošću, ova studija je za cilj
imala da procjeni AChE i BChE inhibitornu aktivnost eteričnih ulja tri Pinus vrste,a to su bili
Pinus nigra subsp. nigra, P. nigra var. calabrica i P. heldreichii subsp leucodermis, te nekih
od identificiranih komponenti tako što su ih ispitivali metodom mikrotitarske analize. Sastavi
eteričnih ulja su određivani GC-MS analizom, te je veza između hemijskih sastojaka i AChE i
BChE inhibitorne aktivnosti utvrđena.
Tabela 5. Hemijski sastav eteričnih ulja P. nigra var. calabrica (P1), P. heldreichii subsp.
leucodermis (P2), i P. nigra subsp. nigra (P3).
65
Gasna hromatografija se koristila kako bi se identificirale navodne aktivne supstance prisutne
u eteričnom ulju. Hemijski sastav eteričnih ulja je prikazan u tabeli 5. Eterično ulje P. nigra
var. calabrica je okarakterizirano sa 53 sastojka (93.4% od ukupnog sadržaja ulja) u kojem su
dominantne supstance, α-pinen (24.6%), β-pinen (10.9%), γ-kadinen (9.9%), β-felandren
(6.3%), manoil oksid (6.2%), te trans-kariofilen (4.2%). Kod eteričnog ulja P. nigra subsp.
nigra identificiran je 41 sastojak , čineći 95.7% ukupnog sadržaja ulja. Glavni sastojci su bili
α-pinen (25.3%), limonen (22.6%), sabinen (12.8%), α-terpineol (8.3%), β-pinen (4.8%), i
terpinolen (4.5%). Mnoge terpenske susptance su tipični sastojci u smolama porodice
Pinaceae. Bezobzira na to kako je postupano sa grančicama bora, α-pinen, β-pinen, β-micren,
limonen, i β-felandren su i dalje bili najzastupljeniji monoterpeni.Germakren te β-kariofilen
su bili predominantni seskviterpeni, čime su se potvrdile i tvrdnje prethodnih studija.
Macchioni et al. su anlizirali eterična ulja iz iglica, zatim grančica bez iglica, te šišarika P.
nigra odvojeno. Supstance 1,8-cineol, pinokamfon, i mirtenal su bile pronađene u grančicama
i šišarikama, ali ne i u iglicama. U eteričnom ulju P. heldreichii subsp. leucodermis je
identificirano 50 sastojaka (91.3% od ukupnog sadržaja ulja), Glavni sastojci su bili α- pinen
(24.2%), β-pinen (8.4%), limonen (7.8%), α-kubeben (7.6%), terpinolen (5.9%) i trans-
kariofilen (4.5%). Nedavna studija se bavila sastavom eteričnog ulja P. heldreichii iz Crne
Gore i Srbije. Što se tiče terpena prisutnih u iglicama bora iz tri populacije u Crnoj Gori i
jedne u Srbiji, dominantni sastojci su bili limonen (26.3%), α-pinen (17.5), germakren D
(13.5%), i β-kariofilen (10.4%9, čineći < 67.7% eteričnog ulja. Supstance sa srednjim do
visokim sadržajem (0.5-10%) su bile: β-pinen, β-micren, α-humulen, δ-kadinen, α-murolen,
(E)-heks-2-enal, β-gurjunen, γ-murolen, izopimarol, kamfen, γ-kadinen, aromadendren, β-
bisabolen, trans-β-famesen, α-kadinen, te (Z)-heks-3-en-1-ol. Analizirana eterična ulja su
pokazala značajne razlike, posebno sa kvantitavne tačke gledišta najobimnijiih sastojaka.
Kada ga poredimo sa drugim eteričnim uljima, eterično ulje P. nigra subsp. nigra je
okarakterisano sa visokim sadržajem sabinena (12.8%), limonena (22.6%), i α-terpineola
(8.3%). Manoil oksid (6.2%) i γ-kadinen (9.9%) su u visokim koncentracijama bili prisutni
jedino u eteričnom ulju P. nigra var. calabrica. Interesantno je to da su β-felandren (6.3%), i
α-bergamoten (1.0%) pronađeni jedino u eteričnom ulju P. nigra var. calabrica, a linalil
acetat (3.6%) jedino u eteričnom ulju P. heldreichii subsp. leucodermis. Unatoč
multifaktorijalnoj prirodi Alzheimerove bolesti, većina trenutačnih agenasa slijede jedan
terapijski pristup, koji je baziran na takozvanoj holinergijskoj hipotezi kognitivne disfunkcije.
Trenutačno, holinesterazna inhibicija je glavni princip liječenja simptoma AB, te je inhibicija
66
AChE i BChE terapijska meta za unaprijeđenje holinergijskog deficita. In vitro holinesterazna
inhibitorna aktivnost eteričnih ulja i nekih identificiranih sastojaka tri Pinus vrste u Kalabriji
(Italija) je procjenjivana Ellmanovom spektrofotometrijskom metodom koristeći
imunoenzimatski test (ELISA). Sva ispitivana eterična ulja su bila u stanju da inhibiraju
enzime in vitro na način koji je ovisan o dozi (Slika18). Vrijednosti IC50 su mjerene i
prikazane u Tabeli 6. P. heldreichii subsp. leucodermis je pokazao najviše obečavajuću
aktivnost, vrijednost njegove IC50 iznosila je 51.1 i 80 µg/mL, protiv AChE i BChE.
Interesantna aktivnost protiv AChE je zabilježena također i kod eteričnih ulja P. nigra var.
calabrica i P. nigra subsp. nigra (vrijednost IC50 od 128.0 i 162.5 µg/mL). AChE igra
značajnu ulogu u CNS-u, jedan je od najbržih poznatih enzima, koji katalizira cjepanje
acetilholina u sinaptičkoj pukotini nakon depolarizacije. Inhibitori AChE, kao što je
galantamin, se koriste često u farmakoterapiji AB. Manje specifičan BChE u posljednje
vrijeme je bio u središtu istraživanja, iz razloga što koncentracija BChE ostaje ista ili čak
raste, dok AChE dramatično opada u mozgu pacijenata koji boluju od Alzheimerove bolesti.
Prethodno je saopćeno da eterična ulja koja su bogata terpenima pokazuju jaku inhibitornu
aktivnost naspram oba enzima. Među sastojcima eteričnih ulja Pinus vrste, pet njih (β-
felandren, terpinolen, terpinen-4-ol, linalil acetat, i trans-kariofilen), je testirano po prvi put u
ovoj studiji kako bi se procijenila njihova aktivnost (Tabela 6). Dozno ovisna inhibitorna
aktivnost terpinolena i β-felandrena protiv AChE je prikazana na Slici 2. β-Felandren je
pokazao selektivnu aktivnost naspram AChE, sa IC50 koja je iznosila 120.2 µg/mL, dok je
terpinolen inhibirao i AChE i BChE sa IC50 koja je iznosila 156.4 µg/mL, odnosno 147.1
µg/mL. Svi testirani terpeni izuzev β-felandrena su pokazali inhibitornu aktivnost naspram
BChE (Tabela 6, Slika 20), sa vrijednostima IC50 od 78..6 µg/mL do 168.7 µg/mL za trans-
kariofilen i linalil acetat, redom.
67
Slika 18. Dozno ovisna inhibitorna aktivnost eteričnih ulja Pinus protiv AChE (a) i BChE (b).
Tabela 6. Holinesterazna inhibitorna aktivnost eteričnih ulja i identificiranih sastojaka Pinus
vrsta (IC50 µg/mL)
68
Slika 19. Dozno ovisna inhibitorna aktivnost terpinolena i β-felandrena protiv AChE.
Pregledom raznih literatura otkriveno je obećavajuće slaganje rezultata ove studije sa već
utvrđenim aktivnostima velikog broja terpena. Mnogi radovi su bili usmjereni na aktivnost
supstanci identificiranih u eteričnim uljima Pinus vrste te na sinergistički učinak mješavine
nekih terpena. Perry et al. su izvještavali o AChE inhibitornoj aktivnosti α-pinena sa IC50 od
0.63 mM. AChE inhibitorna karaktersitika je primjećena također i kod nekih
ugljikovodoničnih monoterpena kao što su α-terpinen i limonen, nasuprot tome, slaba AChE
inhibitorna aktivnost je pronađena kod linalil acetata koji je inhibirao enzim u procentu od
38% pri 82 µg/mL. β-Pinen je inhibirao AChE sa procentom od 48.5% pri 1mM.
69
.
Slika 20. Dozno ovisna inhibitorna aktivnost terpinolena, β-felandrena, terpinen-4-ola, linalil
acetata i trans-kariofilena protiv BChE.
Holinesterazna inhibitorna aktivnost je također pronađena kod 3-karena koja je dosegla 50%
inhibicije BChE pri konačnoj koncentraciji od 2mM u toku 5 minutnog perioda
preinkubacije. Period inkubaciji je uticao na inhibitornu aktivnost, zapravo vrijednosti za IC50
su značajno smanjene sa 2.0 mM nakon 5 minuta na 0.7 mM nakon 60 minuta. Za razliku od
inhibicije BChE, anti-AChE aktivnost kod ljudi β-kariofilena, 3-karena, α-pinena i β-pinena je
bila očigledna. β-Kariofilen, pri konačnoj koncentraciji od 0.06 mM, je ostvario inhibiciju
AChE u procentu od 32%, dok je 3-karen, pri konačnoj koncentraciji od 0.08 mM, inhibirao
AChE u procentu od 33%. Limonen i sabinen su nedavno testirani da bi se procjenila njihova
potencijalna antiholinesterazna aktivnost. Sabinen je pokazao najveću aktivnost protiv AChE i
BChE, pri čemu je vrijednost za njegovu IC50 iznosila 176.5 µg/mL odnosno 218.6 µg/mL.
Sinergistički efekat različitih mješavina terpena je također ispitivan. Generalno, otkrića su
pokazala da je inhibitorna aktivnost eteričnih ulja rezultat složenih interakcija između
sastojaka, koji proizvode i sinergistički ali i antagonistički odgovor između terpenskih
supstanci. Nekoliko prethodnih studija su prikazale biološku aktivnost eteričnih ulja i njihovih
sastojaka nakon oralne primjene. Štaviše, Perry i dr. su prikazali farmakološku aktivnost
eteričnog ulja lista lavande za liječenje Alzheimerove bolesti u studiji koja je uključivala
oralnu primjenu. Nakon šest sedmica liječenja značajna redukcija neuropsihijatrijskih
simptoma te poboljšanje u pažnji su primjećeni. U posljednje vrijeme, središte se stavlja i na
70
nazalni put primjene. Veliki broj lijekova uključujući i lipofilne supstance se primjenju
intranazalno, te se mogu brzo apsorbovati u mozgu. Dakle, oralna ili nazalna primjena,
eteričnih ulja Pinus vrste i/ ili njihovih identificiranih supstanci bi se mogla testirati in vivo da
bi se procjenili njihovi potencijalni djelotvorni terapijski doprinosi u liječenju Alzheimerove
bolesti (92).
Upala i diferencijacija ćelija vode ka velikom broju ozbiljnih oboljenja. Posljednih nekoliko
godina, brojne studije su se bavile antiinflamatornom i antikancerogenom aktivnošću eteričnih
ulja velikog broja biljaka, uključujući i različite Pinus vrste. Cilj ove studije jeste bio da se
ispita fitohemijski sastav, antiinflamatorna i citotoksična aktivnost eteričnih ulja iz iglica i
grančica Pinus heldreichii Christ (Pinaceae) i P. peuce Griseb., te iz iglica, grančica i šišarika
P. mugo Turra. Za separaciju i identifikaciju eteričnih ulja, koristili su se gasna
hromatografija/plamenojonski detektor (GC/FID) i GC/masena spektrometrija. Količina
sekretovanog IL-6 u makrofagima stimuliranim lipopolisaharidima (LPS) je kvantificirana
(koncentracija ulja: 0.0001-0.2%, 3h inkubacije). Citotoksičnost prema ćelijskoj liniji
karcinoma HeLa,CaCo-2 i MCF-7 su određivane korištenjem MTT (Tiazolil Plavo
Tetrazolijum Bromid) eseja (koncentracija ulja: 0.001-0.1%, 24 h inkubacije). Najistaknutiji
sastojci ulja bili su: 3-karen, α-pinen,linalil acetat (P. mugo); α-pinen, β-felandren i β-pinen
(P.peuce); limonen,α-pinen i (E)-kariofilen (P. heldreichii). Eterična ulja su pokazala
značajan citotoksični učinak prema ćelijskim linijama karcinoma (IC50 0.007 do >0.1%), sa
smanjenjem ćelijskog života do 90% pri koncentraciji od 0.1%, te antiinflamatornu aktivnost
(IC50 0.0008-0.02%) sa smanjenjem sekrecije IL-6 do 60% pri koncentraciji od 0.01%.
Eterična ulja iglica i grančica P. peuce i P. heldreichii kao i eterična ulja iglica, grančica i
šišarika P. mugo se mogu smatrati obećavajučim agensima za antikarcinogene i
antiinflamatorne lijekove.
Udio i hemijski sastav ulja tri Pinus vrste su predstavljeni u Tabeli 7. Ukupno, 58 supstanci u
eteričnim uljima iglica, grančica i šišarika P. mugo je opisano, čineći 97.2, 96.1 i 72.1% svih
identificiranih sastojaka. Glavni sastojci pronađeni u ulju iglica, grančica i šišarika su: 3-karen
(19.3, 28.1 i 15.8%); α-pinen (21.3, 8.2 i 4.1%); (E)-karifilen (6.7,4.1 i 20.2%); limonen (3.7,
71
19.5 i 2.2%); β-pinen (3.7,11 i 1.6%), linalil acetat (0.1, 7.2 i 1.2%), germakren D (6.1, 0.4 i
1.2%), linalol (0.2, 0.1 i 4.6%). U eteričnom ulju iglica i grančica P. peuce je opisano 45
supstanci, čineći 98.6% i 97.3% ukupno pronađenih sastojaka. Najzastupljeniji sastojci
pronađeni u ulju iglica i grančica redom su : α-pinen(36.8 i 16%); β-felandren (6.1 i 35.8%);
β-pinen (13 i 21.5%); germakren D (10 i 4.7 %); α-terpinol (9.3 i 2.4%); kamfen (8 i 2%);
bornil acetat (4.2 i 3.3%). Najzastupljenije supstance od 47 koliko ih je pronađeno u
eteričnom ulju iglica i grančica P. heldreichii su: limonen (43.9 i 64.2%), germakren D(17.2 i
2%); α-pinen (10.6 i 14.3%); (E)-kariofilen (4.4 i 0.3%); kariofilen oksid (3.1 i 2.1%); α-
humulen (2.1 i 1%). Identificirani sastojci čine 95.1% i 96.8% ukupnog ulja u iglicama i
grančicama.
72
Tabela 7. Sastav (%) eteričnih ulja P. mugo, P. peuce i P. heldreichii.
73
pri koncentraciji od 0.01% za ulja dobivena iz grančica i 0.05% za ulje iz šišarika (Slika 21).
Vrijednosti za IC50 su određivane za eterična ulja iz iglica P. heldreichii i P. mugo, koji su
pokazali najmanju IC50 (0.0002), koja je praćena uljem iz grančica i iglica P. peuce
(>0.0005). Eterična ulja dobivena iz iglica P. heldreichii i P. mugo su pokazala IC50 >0.004
te ulje iz šišarika P. mugo IC50 od 0.02 (Tabela 8).
Slika 21. Redukcija sekrecije IL-6 ovisna o koncentraciji u LPS stimuliranim makrofagima,
određivano ELISA-om, nakon tretmana sa uljem iz (A) iglica i (B) grančica P. heldreichii, P.
peuce i P. mugo, uljem iz (C) šišarika P. mugo i 5 µM deksametazonom (dex).
74
Sva eterična ulja su pokazala značajan citotoksični učinak na ćelijskim linijama karcinoma
HeLa, CaCo- 2 i MCF-7 (Slika 22). Eterična ulja dobivena iz iglica P. heldreichii, iglica i
grančica P. peuce, i iglica i grančica P. mugo pri koncentraciji od 0.1% smanjili su ćelijski
život HeLa za najmanje 90%, dok su ulja dobivena iz grančica P. heldreichii smanjili njihov
životni vijek za skoro 60%.
Slika 22. Citotoksični efekat ovisan o koncentraciji eteričnih ulja (A) grančica P. heldreichii,
(B) iglica P. heldreichii, (C) grančica P. peuce, (D) iglica P. peuce, (E) grančica P. mugo,
(F) iglica P. mugo, (G) šišarika P. mugo protiv tri ćelijske linije karcinoma HeLa, CaCo-2,
MCF-7, koristeći MTT esej.
Eterična ulja šišarika P. mugo imaju malu citotoksičnu aktivnost od oko 25%. Vrijednosti
IC50 su određivane , ulje iz iglica P. peuce je imalo najnižu vrijednost (0.007), praćeno uljima
iz iglica P. heldreichii i uljima iz grančica P. peuce (0.02). Ulja dobivena iz grančica P.
heldreichii i P. mugo su pokazala IC50 od 0.06, zatim šišarika P. mugo (>0.1) i iglica P. mugo
(0.3) (Tabela 8). Eterična ulja dobivena od iglica P. peuce te iglica i grančica P. mugo dovela
75
su do redukcije metaboličke aktivnosti CaCo-2 od 80-90%, praćeno uljima iz grančica P.
heldreichii i šišarika P. mugo sa redukcijom metaboličke aktivnosti od oko 50-65%.
Vrijednosti za IC50 su se kretale od 0.02 za ulja iglica P. heldreichii, P. peuce i P. mugo do
0.04 za ulja grančica P. peuce i 0.06 za ulje grančica P. mugo. Eterična ulja grančica P.
heldreichii i šišarika P. mugo su pokazala najveću IC50 >0.1 (Tabela 8). Eterična ulja
grančica P. peuce, iglica P. peuce i iglica P. mugo su smanjila ćelijski život MCF-7 za
najmanje 85%. Metabolička aktivnost MCF-7 je smanjena za 45-60% djelovanjem eteričnih
ulja grančica P. heldreichii, iglica P. heldreichii i grančica P. mugo, dok su eterična ulja
šišarika P. mugo pokazala najmanju citotoksičnost prema MCF-7 od samo 15%. Vrijednosti
za IC50 su se kretale od 0.06 za ulja P. peuce (iglice i grančice), >0.1 za P. heldreichii (iglice
i grančice) i P. mugo (grančice i šišarike). Eterično ulje iglica P. mugo je pokazalo najveću
IC50 od 0.3 (Tabela 8) (64).
Autori: Hyun-Suk Ko, Hyo-Jeong Lee, Hyo-Jung Lee, Eun Jung Sohn, Miyong Yun,
Min-Ho Lee, i Sung-Hoon Kim, 2013.godina
76
dozno ovisan način. Imunohistohemijom se otkrilo da je tretman EOPK-om zaustavio
ekspresiju PPARγ u dijelovima tkiva jetre kod štakora tretiranih EOPK-om. Kada se sve uzme
u obzir, ova saznanja upućuju na to da eterično ulje P. koraiensis ima hipolipemijski
potencijal kao i potencijalno djelovanje protiv gojaznosti tako što inhibira PPARγ.
Citotoksičnost EOPK-a je određivana putem MTT eseja u 3T3-L1 preadipocitima. Ćelije su
bile tretirane sa različitim koncentracijama EOPK-a (0, 12.5, 25, ili 50 µg/mL) u toku 24 h.
Kao što je prikazano u Slici 23(a), eterično ulje P. koraiensisa nije imalo značajan uticaj na
pokretljivost 3T3-L1 ćelija. Kako bi se ispitalo da li EOPK može uticati na ćelijsku
diferencijaciju adipocita, boja Oil-Red O se primjenjivala na 3T3-L1 ćelijama tretiranih sa
EOPK-om u toku 8 dana. Diferencirani 3T3-L1 adipociti su značajno povećali nakupljanje
masti te serumske trigliceride (Slike 23(b), 23(c), i 23(d)), kada ih se poredi sa
preadipocitima. Depoi masti su bili samanjeni za 57 i 78% u tretmanu sa različitim
koncentracijama EOPK (25 ili 50 µg/mL), u poređenju sa netretiranim adipocitima kao
kontrolom. Rezultati ukazuju na to da je doza od 50 µg/mL EOPK bila najučinkovitija u
inhibiranju diferencijacije adipocita (Slike 23(b) i 23(c)). Tretman eteričnim uljem P.
koraiensisa je smanjio nivo triglicerida u ćeliji na način ovisan o dozi (37 i 60% pri
koncentracijama od 25 i 50 µg/mL) u poređenju sa preadipocitima (80.04%) (Slika 23(d)).
77
PPARγ, C/EBPα, GPDH, i FABP su ključni faktori uključeni u adipogenezu. Zapravo,
PPARγ kontrolira adipozne faktore kao ključni faktor transkripcije u toku diferencijacije
adipocita. Nivoi mRNK i proteina u PPARγ, C/EBPα, i GPDH su bili sniženi nakon
djelovanja EOPK na dozno ovisan način (Slike 24(a) i 24(b)). GW9662 koji je antagonist
PPARγ se koristio u 3T3-L1 adipocitima kako bi se razjasnio mehanizam djelovanja EOPK-a.
GW9662 je povećao ekspresiju FABP-a i PPARγ koja je bila smanjena pod uticajem EOPK-a
(Slika 24(c)). Nakupljanje lipida u 3T3-L1 adipocitima tretiranih sa EOPK-om i GW9662,
kao što je prikazano na Slikama 24 (d) i 24(e), je bilo značajno smanjeno u poređenju sa
netretiranom kontrolom. Imunohistohemijom je otkriveno da je tretman EOPK-om umanjio
ekspresiju PPARγ u dijelovima tkiva jetre u grupi tretiranoj EOPK (100 i 200 mg/kg) u
poređenju sa netretiranom kontrolnom grupom (Slika 25(c)). Uzimajući sve u obzir, ovi
rezultati ukazuju na to da EOPK inhibira diferencijaciju adipocita tako što suprimira
aktivaciju PPARγ.
78
Tjelesne težine normalne (grupa 1), kontrolne (grupa 2), i EOPK-om tretiranih grupa (grupe 3
i 4), te grupe tretirane sa atrovastatinom (grupa 5) su praćene jednom sedmično u toku 6
sedmica. Kao što je prikazano na slici 25(a), tjelesna težina kontrolne grupe štakora koji su
hranjeni hranom sa viskim udjelom masti, je bila značajno povećana 2 sedmice nakon
hranjenja u poređenju sa normalnom niskomasnom grupom. Za razliku od toga, dobivanje na
težini kod grupa tretiranih EOPK-om se smanjivalo ovisno o dozi, nakon 3 sedmice tretmana
sa EOPK-om. Šest sedmica nakon tretmana, tjelesna težina kontrolne grupe hranjene sa
visokim udjelom masti je značajno povećana 331.4 ± 2.8 g u poređenju sa normalnom
grupom (281.6 ± 1.7 g).
Slika 25. Uticaj EOPK-a na tjelesnu i abdominalnu težinu masnoća kod štakora hranjenih
dijetom sa visokim udjelom masti
Kako bilo, EOPK je značajno smanjio tjelesne težine do 309.5 ± 1.8 g i 303.7 ± 2.0 g, pri
dozama od 100 mg/kg i 200 mg/kg, približno atrovastatinu kao pozitivnom kontrolom (296.5
79
± 1.9 g).
Slika 26. Uticaj EOPK-a na nivo lipida i holesterola u serumu kod štakora hranjenih dijetom
sa visokim udjelom masti
80
ateroskleroznog indeksa na način ovisan o dozi u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika
26(d)).
Slika 27. Uticaj EOPK-a na hepatične trigliceride i holesterol kod štakora hranjenih dijetom
sa visokim udjelom masti.
Autori: Ipek Suntar,Ibrahim Tumen, Osman Ustun, Hikmet Keles, Esra Kupeli Akkol,
2011.godina
81
ulja je ispitivana pomoću linearnog i kružnog reza eksperimentalnih modela rane te je zatim
rađena histopatološka analiza i ispitivan je sadržaj hidroksiprolina. Eterična ulja su praćena i
zbog antihijaluronidazne aktivnosti. Naknadno je antiinflamatorna aktivnost procjenjivana
upotrebom Whittle metode, koja se bazira na inhibiciji rasta kapilarne permebilnosti
inducirane acetatnom kiselinom. Eterična ulja dobivena iz šišarika Pinus pinea i Pinus
halepensis su pokazala najjače djelovanje na zarastanje rana. Ostala eterična ulja nisu
pokazala značajaniju antiinflamatornu aktivnost ili aktivnost u zarastanju rana. Dakle, u ovoj
studiji je ispitivana antiinflamatorna aktivnost te aktivnost u zrastanju rana eteričnih ulja
dobivenih iz iglica i šišarika Pinus brutia, Pinus halepensis, Pinus nigra, Pinus pinea i Pinus
sylvestris. Rezultati eksperimenta su prikazani u Tabelama. Za procjenu aktivnosti koristili su
se in vivo modeli rana linearnog i kružnog reza. U modelu rane sa linearnim rezom, ispitivana
je vlačna čvrstoća tretiranog tkiva. Vlačna čvrstoća predstavlja otpornost na lomljenje pod
naponom, što pokazuje koliko obnovljeno tkivo može da se odupre lomovima. U ovu svrhu je
uklonjeno novo obnovljeno tkivo te je ispitivana vlačna čvrstoća. Kao što je prikazano u
Tabeli 9, topikalna primjena masti pripremljenih od eteričnih ulja šišarika Pinus halepensisa i
Pinus pinea na zarezane rane su pokazala najbolju vlačnu čvrstoću sa najvećim vrijednostima
od 23.8% i 38.9% u toku 10-og dana. Za razliku od toga, ostala eterična ulja nisu pokazala
značajnu aktivnost u ovom modelu.
Tabela 9. Uticaj eteričnih ulja Pinus brutia, Pinus halepensis, Pinus nigra, Pinus pinea i
Pinus sylvestris na linearno izrezane modele rana
Model izrezanih rana je korišten kako bi se pratila kontrakcija rane, koja se računala kao
postotak redukcije u području rane. Prema rezultatima eksperimenta sa kružno izrezanim
82
modelom rane, eterična ulja iz šišraika Pinus halepensis i Pinus pinea su pokazala značajan
efekat u zarastanju rana sa vrijednošću kontrakcije od 40.07% i 54.61% (Tabela 10).
Tabela 10. Uticaj eteričnih ulja Pinus brutia, Pinus halepensis, Pinus nigra, Pinus pinea,
Pinus sylvestris na kružno izrezane modele rana
Rezultati su bili u skladu sa ishodom modela sa linearnim zarezom rane. Tretirani uzorci
kože su također ispitivani zbog njihovog sadržaja hidroksiprolina, što daje ideju o ispitivanju
koncentacije kolagena. Kolagen je najzastupljenija komponenta ekstracelularnog tkiva.
Sastoji se od amino kiseline, hidroksiprolina, koja je korištena kao biohemijski marker za
tkivni kolagen. Kao što je prikazano u Tabeli 11, visok sadržaj hidroksiprolina je uočen kod
tkiva tretiranog mastima eteričnih ulja iz šišarika Pinus halepenisis i Pinus pinea. Dalje,
uzorci kože su ispitivani i histopatološki. Histoplatološke analize su također bile u skladu sa
incizijskim i ekscizijskim eksperimentalnim metodama (Tabela 12).
Tabela 11. Uticaj topikalne primjene testiranih masti u toku sedam dana na sastav
hidroksiprolina
83
Tabela 12. Procesi izlječivanja rana i faze u liječenju kod životinja tretiranih vehikulima,
negativnom kontrolom, uljima i Madecassolom
U cilju pokazivanja procesa zarastanja rana, reprezentativne figure (Slika 28), obojene sa HE i
VG, su također dodane. Faze u procesima zarastanja rana sa različitim stepenima su
posmatrane unutar eksperimentalnih grupa. Remodeliranje, naročito reepitelizacija su
primječene kod grupa tretiranih sa mastima Pinus pinea, Pinus halepensis i Pinus nigra.
Limitirani procesi zarastanja rana su uočeni kod Pinus brutia i Pinus sylvestris (62).
84
5.7. Studija: Ispitivanje hemijskog sastava, antiholinesterazne i
antioksidativne aktivnosti eteričnih ulja turskih Pinus vrsta i piknogenola
Autori: Osman Ustun, Fatma Sezer Senol, Mine Kurkcuogl, Ilkay Erdogan Orhan, Murat
Kartal, Kemal Husnu Can Baser, 2012.godina.
U ovoj studiji su ispitivani acetatni, etilacetatni i etanolni ekstrakti te eterična ulja iz grančica
i iglica 5 turskih Pinus vrsta: Pinus brutia, Pinus halepensis, Pinus nigra, Pinus pinea i Pinus
sylvestris zajedno sa piknogenolom (ekstrakt kore Pinus pinaster) zbog njihovg inhibitornog
efekta protiv acetilholinesteraze i butirilholinesteraze. Njihova antioksidativna aktivnost je
testirana korištenjem 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) i N,N-dimetil-p-fenilendiamin
(DMPD) metodoma uklanjanja radikala, heliranja metala te metodom smanjenja
antioksidativne snage željezom (FRAP). Ukupan sadržaj flavonoida i fenolnih komponenti
ekstrakta je određivan pomoću Folin-Ciocalteau i AlCl3 reagenasa. GC-MS tehnika je
primjenjivana prilikom određivanja sastava eteričnih ulja testiranih vrsta. Najbolju inhibitornu
aktivnost prema AChE i BChE su pokazali eterično ulje iz grančica (83.91 ± 3.95%) te
etanolni ekstrakt iz iglica (82.47 ± 5.57%) P. halepenisisa. Piknogenol je također uzrokovao
značajnu inhibiciju AChE (63.33 ± 0.22%) i BChE (83.67 ± 0.22%). Ekstrakti kao i eterična
ulja su obično pokazivala jaku aktivnost u antioksidativnim esejima. Piknogenol je pokazao
potencijalnu antioksidativnu aktivnost te je bio najbogatiji u sadržaju ukupnih fenolnih
supstanci. U eteričnim uljima α- i β- pinen su identificirani kao najzastupljenije supstance.
Ovi rezultati otkrivaju da su Pinus vrste i piknogenol potencijalni izvori aktivnih metabolita
sa holinesteraznom i antioksidativnom aktivnošću. Inhibitorna aktivnost ekstrakta i eteričnih
uja Pinus vrsta kao i piknogenola je testirana pri dozi od 200 µg/mL i prikazana na Slikama
29 i 30.
85
Slika 29. AChE (A) i BChE (B) inhibitorna aktivnost acetonskog (Ace), etil acetatnog
(EtOAc), i metanolnog (MeOH) ekstrakta Pinus vrsta, piknogenola i galantamina pri dozi od
200 µg/mL
Rezultati su pokazali da je piknogenol imao najveću inhibitornu aktivnost prema AChE
(63.33 ± 0.22%) ali i prema BChE ( 83.67 ± 0.22%). Etanolni ekstrakt iglica P. helepensis je
također pokazao inhibitornu aktivnost vrijednu pažnje prema AChE (60.15 ± 3.22%) i BChE
(82.47 ± 5.57%), koje su približne onima kod piknogenola. Među eteričnim uljima, ono iz
grančica P. halepensis je pokazalo najveću inhibitornu aktivnost prema AChE (83.91 ±
3.95%) i BChE (80.62 ± 2.95%). Drugo najefikasnije eterično ulje prema ovim enzimima je
bilo ono iz iglica P. halepensisa (Slika 30).
Slika 30. AChE (A) i BChE (B) inhibitorna aktivnost eteričnih ulja i galantamina pri dozi 200
µg/mL
86
Uzorci su testirani u četiri in vitro eseja kako bi se procjenio njihov antioksidativni potencijal
pri koncentracijama od 250, 500, i 1000 µg/mL. Ekstrakti bora su pokazali slab do umjerenu
aktivnost uklanjanja prema DPPH te nikakvu ili slabu aktivnost prema DMPD radikalu
(Tabele 13 i 14), dok je piknogenol bio jako aktivan prema DPPH radikalu (88.27 ± 0.13%).
Acetatni ekstrakt grančica P. halepensisa je pokazao jaču sposobnost uklanjanja DMPD
radikala (40.22 ± 0.38%) u odnosu na ostale uzorke, dok su sva eterična ulja bila inaktivna
protiv ovog radikala. U drugu ruku, eterična ulja su pokazala aktivnost uklanjanja DPPH
radikala u vrijednosti preko 10%. Što se tiče eseja metalne helacije, eterično ulje dobiveno iz
grančica Pinus sylvestrisa je pokazalo najveću aktivnost ( 72.46 ± 3.72%).
Tabela 13. Ukupni fenolni i flavonoidni sastav i sposobnost uklanjanja DPPH radikala od
strane ekstrakta Pinus vrsta i piknogenola.
Za analizu eteričnih ulja iz grančica i iglica Pinus vrsta korištene su metode GC i GC-MS.
Kao što je prikazano u Tabeli 4 α- i β- pinen su identificirani kao najzastupljenije komponente
u skoro svim eteričnim uljima. α-Pinen je bio najzastupljeniji u eteričnom ulju iz grančica P.
nigra (69.5%), dok su eterična ulja iz iglica P. brutia (47.5%) i iglica P. halepensisa (46.8%)
sadržavala najviše β-pinena (63).
87
Tabela 14. Aktivnost uklanjanja DMPD radikala ekstrakta Pinus vrsta i piknogenola.
88
6. Diskusija
U ovom radu korišten je veliki broj relevantnih baza podataka u cilju predstavljanja
najznačajnijih eteričnih ulja porodice Pinaceae, te utvrđivanja njihovog farmakološkog i
biološkog djelovanja, gdje među najznačajnijima spadaju, antimikrobno, ekspektorantno i
antiinflamatorno djelovanje. Pored navedinih djelovanja, u mnogobrojnim studijama su
istraživane i druge aktivnosti eteričnih ulja porodice Pinaceae kao što su antidijabetično,
diuretični, rubenfacijentno, hipolipemijska, citotoksična, antioksidativna kao i njihovo
djelovanje na CNS, te je potvrđena moguća primjena za liječenje velikog broja drugih bolesti
i stanja. Biljke se nastavljaju koristi za liječenje bolesti te se novi lijekovi i dalje razvijaju na
osnovu istraživanja aktivnih supstanci pronađenih u biljkama. Uzimajući u obzir da biljke
mogu produkovati stotine, čak i hiljade metabolita, unazad nekoliko decenija se vrše
intenzivna biološka i fitohemijska ispitivanja sekundarnih metabolita biljaka, gdje spadaju i
eterična ulja (95). Postoje brojni podaci in vitro i in vivo studija koji idu u prilog mogićnosti
upotrebe eteričnih ulja u preveniranju i liječenju velikog broja bolesti (7). Sobzirom da
eterična ulja imaju veliku prednost u odnosu na sintetičke agense kao što je netoksičnost,
posjeduju više hemijski aktivnih komponenti, a itime i više mehanizama djelovanja, smanjena
je mogućnost za pojavu rezistencije, te njihovo ispitivanje nije samo interes, već i potreba.
Sintetički lijekovi dizajnirani su tako da djeluju (inhibiraju ili stimulišu) samo jednim od
mehanizama koji daje konačno farmakološko dejstvo, dok prirodni produkti poput eteričnih
ulja, sobzirom da sadrže kompleks različitih hemijskih komponenti u sebi mogu djelovati više
od jednog mehanizma pri tome imajući vrlo male ili nepostojeće nus pojave ili negativne
efekte (8). Rijetko je primjećeno da eterična ulja ispoljavaju hroničnu toksičnost, i postoji
jako malo podataka o mutagenim, teratogenim i karcinogenim djelovanjima eteričnih ulja ili
pojedinačnih sastojaka. Eterično ulje ruzmarina, žalfije, bosiljka, majorana i timjana nisu
preporučljiva tokom trudnoće (96). Također eterična ulja mogu lokalno dovesti do oštećenja
sluznice, a tujon, pinokamfon i slični sastojci mogu dovesti do epileptičnih i tetaničkih napada
(grčeva) i mogu da izazovu psihičke poremećaje. U teoriji mentol i kamfor mogu dovesti do
spazma jednjaka (97). Svakako da se ne preporučuje samostalna primjena eteričnih ulja u
liječenju.
Otkriće antibiotika i njihovo uvođenje u široku kliničku praksu 1940-ih godina je značajno
izmijenilo terapiju zaraznih bolesti. Omogućen je razvoj invazivnih hiruških zahvata i
radikalnih imunosupresivnih terapija (98). Međutim sa sve češćom upotrebom antibiotika
89
počela se javljati rezistencija na iste (99). Do rezistencije dolazi zbog genetske promjene na
bakteriji, gdje ona sintetiše protein koji može da inaktivira antibiotik. A još veći problem su
multiplo rezistentne bakterije, odnosno one koje su otporne na više različitih antibiotika.
Bolesti uzrokovane mikroorganizmima predstavljaju jedan od glavnih uzročnika smrtnosti u
svijetu, naročito u zemljama u razvoju (100). Brojna znavstvena istraživanja su pokazala da
biljke imaju visoki potencijal za sintezom raznih antimikrobnih spojeva, koji im koriste kao
odbrambeni mehanizmi protiv raznih abiotičkih (UV zračenja, suša, visoke ili niske
temperature, previsoka slanost) i biotičkih stresova (mikroorganizmi, isekti, herbivore). Za
antimikrobnu aktivnost eteričnih ulja važna je hemijska struktura pojedinih komponenata, a
od najvećeg značaja je lipofilni karakter ugljikovodoničnog skeleta i hidrofilni karakter
funkcionalnih grupa.Veliki broj studija se bavi antimikrobnim određivanjem eteričnih ulja, a
jedno od najvećih istraživanja uradili su Morris i dr., koji su ispitali 521 eterično ulje i njihove
komponente i otkrili da 44% ispitivanih ulja inhibira rast najmanje jednog testiranog
mikroorganizma (101). Pored eteričnih ulja terpeni pokazuju dobru antimikrobnu aktivnost
(citral, eugenol, mentol, karvakol, geraniol). Fenolna jedinjenja koja su uglavnom
najzastupljenija komponenta eteričnog ulja, pokazuju najveću antimikrobnu aktivnost (102), a
kada je u pitanju jačina antibakterijskog djelovanja fenolnih jedinjenja položaj hidroksilne
grupe ne igra bitnu ulogu kao što se moglo očekivati. Mehanizam djelovanja još uvijek nije
tačno poznat, ali se smatra da eterična ulja zahvaljujući lipofilnoj prirodi se rastvaraju dobro u
lipidni dvosloj memrane bakterije, dovode do povećane permeabilnosti memrane, izlaska
jona, lize i smrti ćelije (103). Eterična ulja P. halepensisa su pokazala dobru inhibitornu
aktivnost prema nekim testiranim mikroorganizmima. To se povezuje sa njihovim
oksidiranim monoterpenskim sastojcima, koji čine 16.2% ulja. Antibakterijska aktivnost
eteričnog ulja P. halepensis sa područja Ghazaouet (Sjeverozapadni Alžir) je ispitivana protiv
sljedećih bakterijskih sojeva; S. aureus, P. aeruginosa, E. coli i B cereus, pomoću disk
difuzijske metode. Eterično ulje je pokazalo jaku aktivnost protiv S. aureus i B. cereus.
Nasuprot tome, ulje je bilo neefikasno protiv P. aeruginosa i E.coli(104). Kako god, teško je
pripisati djelovanje složene mješavine jednoj ili određenim sastojcima. Također postoje i
dokazi koji pokazaju da supstance koje su prisutne u manjim količinama igraju kritičnu ulogu
u antibakterijskoj aktivnosti, vjerovatno tako što uzrokuju sinergistički efekat među ostalim
sastojcima (105,106). Razlika u hemijskom sastavu eteričnih ulja mogla bi biti odgovorna za
različitu antibakterijsku aktivnost (8).
90
Dijabetes sa oslabljenim β ćelijama, bezobzira na tip diabetesa mellitusa, vodi ka nedostatku
ili redukciji funkcije inzulina koja uzrokuje hiperglikemiju, ili abnormalan nivo šečera u krvi.
Postoji mnogo dokaza koji govore o tome kako su biljni ekstrakti uspješni u kontroli
dijabetesa uz malu toksičnost. U studiji koju smo obradili u ovom radu se nastojala dokazati
hipoteza o antidijabetičnom potencijalu eteričnog ulja Pinus koraiensisa, baziranu na
prethodnim izvještajima o hipolipemijskom djelovanju EOPK, sobzirom da metabolički
sindrom uključuje gojaznost, dijabetes i hiperlipidemiju. Postoje dvije vrste Pinus koraiensisa
u Koreji, Pinus calorpreferans i Pinus glomerata (107), a Yang i dr. su identificirali prisustvo
8 suspstanci, 8(14)-podokrpen-13-on-18-oična kiselina, 15 hidroksidehidroabijetična kiselina,
12-hidroksiabijetična kiselina, lambertijanična kiselina, dehidroabijatična kiselina,
sandarokopimarična kiselina, β-sitosterol te daukosterol (108). EOPK sadrži D- limonen ili
kamfen (109). Prethodna saznanja pokazuju da d-lomonen posjeduje antiinflamatornu i
antikancerogenu aktivnost, kao i antidijabetično djelovanje. Za kamfen se također pokazalo da
posjeduje hipolipemijsku aktivnost u jednom in vivo modelu. Međutim, do sada nisu
postojali nikakvi dokazi o antidijabetičnoj aktivnosti, osim in vivo antioksidativne aktivnosti
Pinus koraiensisa (110). Tretman sa EOPK je štitio od STZ inducirane citotoksičnosti u HIT-
T15 pankretičnim β ćelijama, sobzirom da je dobro poznato da tretman STZ-om uzrokuje
smrt ćelije u kultiviranim pankretaičnim β ćelijama, ukazujući na zaštitni učinak EOPK prema
STZ induciranoj smrti ćelija. Dalje, gubitak težine nije bio vidljiv u grupi tretiranoj sa EOPK,
dok je u grupi tretiranoj sa STZ-om primjećen određeni gubitak težine kod miševa. β-Ćelije
su odgovorne za stvaranje i otpuštanje inzulina i amilina koji reguliraju nivo glukoze u krvi
(28). Amilin, zvani IAPP ( islet amyloid polypeptide), također radi zajedno sa inzulinom te
smanjuje nivo glukoze u krvi na monogo kratkoročniji način (111). U ovoj studiji je pokazano
da EOPK značajno suprimira aktivnost α-amilaze te smanjuje nivo glukoze na način ovisan o
dozi te povečava ekspresiju inzulina na nivou mRNK u STZ tretiranim HIT-T15 ćelijama,
ukazujući na hipoglikemični potencijal EOPK. Za citotoksičnost STZ-a prema pankreatičnim
β-ćelijama je poznato da je posredovana produkcijom slobodnih radikala (112). Dobro je
poznato da slobodni radikali izvedeni iz različitih izvora imaju uzročnu ulogu u različitim
oblicima inzulinske rezistencije te pridonose disfunkciji β-ćelija, i tako ubrzvaju razvijanje i
progresiju DM tipa 2 (113). Kao što smo i očekivali, EOPK je dijelom umanjilo populaciju
slobodnih radikala kada se poredi sa netretiranom kontrolom u STZ tretiranim HIT-T15
ćelijama, ukazujući na inhibitorni potencijal EOPK prema slobodnim radikalima koji su
medijatori inzulinske rezistencije. Dijabetična retinopatija je jedna od važnijih komplikacija
povezanih sa hiperangiogenezom. Azotni oksid proizveden od strane eNOS-a je važan
91
medijator funkcije VEGF koji olakšava rast i sazrijevanje krvnožilnog sistema. VEGF
također igra važnu ulogu u vaskulogenezi i angiogenezi koje su povezane sa dijabetičnom
retinopatijom. U ovoj studiji je pronađeno da EOPK redukuje produkciju NO te suprimira
fosforilaciju eNOS i produkciju VEGF u STZ tretiranim HIT-T15 ćelijama,i tako ukazuje da
se EOPK može uspješno primjenjivati kod dijabetične retinopatije. Bezobzira na
antidijabetični potencijal EOPK, dodatne studije su potrebne u bliskoj budućnosti za
ispitivanje molekularnog mehanizma te studije na životinjama kako bi se identificirale aktivne
supstance u EOPK. Uzimajući sve u obzir, ova saznanja po prvi put potvrđuju naučna
saznanja o antidijabetičnom potencijalu EOPK putem inhibicije ROS, eNOS i VEGF.
92
P. radiata u dvostruko slijepoj, kontroliranoj kliničkoj studiji koja je provođena 5 sedmica te
je utvrđeno da se ekstrakt može koristiti u preventivne svrhe u slučaju kognitivnog pada
povezanog sa godinama. Osim ovog, postoji samo još jedna prethodno spomenuta studija koja
je ispitivala holinesteraznu inhibitornu aktivnost eteričnih ulja Pinus vrsta (P. nigra subsp.
nigra, P. nigra var. calabrica, i P. heldreichii subsp. leucodermis) iz Italije. Iako su sve ove
vrste inhibirale AChE i BChE na način ovisan o dozi, najefikasniji je bio P. heldreichii subsp.
leucodermis. Autori su također testirali i holinesterazne inhibitorne karakteristike i nekih
terpenskih supstanci (terpinolen, β-felandren, linalil acetat, trans-kariofilen, i terpinen-4-ol,
koji su bili najzastupljeniji u ovim eteričnim uljima te je otkriveno da je β-felandren aktivan
protiv AChE, dok su trans-kariofilen i terpinen-4-ol jako inhibirali BChE. Iako se dosada
mnogo studija bavilo učinkom eteričnih ulja prema acetilholinesterazi (115), samo je mali
broj studija govorio o antiholinesteraznoj aktivnosti pojedinih sastojaka eteričnih ulja.
Zapravo, to je kritična tačka sobzirom da je otkrivanje supstanci odgovornih za aktivnost
eteričnog ulja važna. U studiji koju smo prethodno spomenuli, ispitivano je mnogo supstanci
prisutnih u eteričnom ulju (γ-terpinen, 4-alilanisol, karvon, dihidrokarvon, fenon, kuminil
alkohol, kumol, 4-izoprpilbenzaldehid, trans-anetol, kamfen, izoborneol, borneol, l-bornil
acetat, 2-dekanol, 2-heptanol, metilheptanol, farnezol, nerol, izo-pulegol, 1,8-cineol, citral,
citronelal, citronelol, geraniol, linalol, α-pinen, β-pinen, piperiton, izomenton, mentofuran,
linalil oksid, linalil ester, geranil ester, karvakrol, timol, mentol, vanilin, i eugenol) zbog
njihovog holinesteraznog inhibitornog potencijala pri koncentraciji od 100 g/mL te je
pronađeno da je α-pinen bio najaktivniji prema AChE, što je bilo dosljedno prethodnim
otkrićima (116). Kako god, terebalo bi uzeti u obzir da holinesterazna inhibitorna aktivnost
eteričnih ulja testiranih Pinus vrsta ne ovisi samo od sadržaja α-pinena. Iz naših podataka se
jasno vidi da eterično ulje sa največim udjelom α-pinena nije pokazalo najveću holinesteraznu
inhibiciju. Prema rezultatima iz ove studije, glavni sastojci eteričnog ulja iz grančica P.
heldreichii, koje je najefikasnije protiv obje holinesteraze, bili su α- pinen (18.7%), limonen
(18.7%) i β-pinen (16.4%). Stoga, srazmjeran odnos između α- i β-pinena, te limonena bi
mogao da bude glavni razlog jake inhibicije AChE i BChE od strane eteričnog ulja iz grančica
P. heldreichii. U toku pretraživanja literature nismo naišli ni na jednu studiju koja govori o
holinesteraznoj inhibitornoj aktivnosti piknogenola. Izvještaji u kojima se spominje
neuroprotektivno djelovanje piknogenola su se uglavnom odnosila na njegovu antioksidativnu
aktivnost. Kao dodatak na njegovu snažnu antioksidativnu aktivnost, u ovoj studiji je
dokazana i značajna holinesterazna inhibitorna aktivnost piknogenola. Sobzirom da se radi o
barskom ekstraktu bora sačinjenog od mješavine koja sadrži najviše procijanidine (85%),
93
flavonoide, kao i neke fenolne kiseline u manjoj količini, ove supstance bi mogle pridonijeti
njegovom jakom inhibitornom efektu u različitom omjeru. Veliki broj tehnika je dostupno za
procjenjivanje antioksidativne aktivnosti biljnih ekstrakta. Bezobzira na raznolikost tih
metoda, samo jednim postupkom se ne mogu identificirati svi mogući mehanizmi
karakteristični za jednog antioksidansa. Dosljedno tome, u ovoj studiji, hijerarhija promatrane
antioksidativne aktivnosti ekstrakta bora je ovisila o tipu upotrebljenog eseja. Promatrane
antioksidativne karakteristike nisu u potpunosti povezana sa ukupnim fenolskim sastojcima
ekstrakta ni u jednom od eseja.
Pretilost ( (lat. obesites), je hronična bolest koja nastaje prekomjernim nakupljanjem masti u
organizmu i povećanjem tjelesne težine. Svako povećanje 10% više od idealne težine smatra
se gojaznošću. Epidemija ove bolesti u porastu je, te se ubraja u vodeće bolesti savremene
civilizacije. Ova bolest djeluje na mnoge organe i organske sisteme, a povećava rizik
oboljenja kardiovaskularnog sistema. Smanjuje i kvalitetu života. Česta je u svakoj dobi.
U pubertetu je podjednaka među spolovima, a poslije njega češća u žena nego u muškaraca.
Koreanski bor (P. koraiensis) je bitno drvo u pošumljavanju u Koreji, te je također
rasprostranjeno i na području Kine, Rusije, Japana, i Evrope (123). U studiji koja je obrađena
u ovom radu je dokazano da EOPK pokazuje aktivnost protiv pretilosti u 3T3-L1 adipocitima
i štakorima koji su hranjeni dijetom s visokim udjelom masti. Adipogeneza je proces
diferencijacije u kojem se nediferencirani preadipociti prevode u diferencirane adipocite te
zatim posreduju u sintezi i nakupljanju lipida (124). 3T3-L1 ćelije su najbolje opisani model
za ispitivanje adipogeneze in vitro (125). Bojenje sa Oil Red O je pokazalo da EOPK
značajno suprimira nakupljanje masti i nivo intracelularnih triglicerida te umanjuje ekspresiju
PPARγ, CEBPα, FABP, i GPDH u diferenciranim 3T3-L1 adipocitima bez citotoksičnosti,
ukazujući na inhibitorni učinak EOPK na diferencijciju adipocita. Slično tome, mnogo
prirodnih supstanci, uključujući EGCG, berberin, i kurkumin, suprimirali su PPARγ, budući
da je zabilježeno da antagonisti PPARγ efikasnom inhibiraju adipogenezu i povećavaju
osjetljivost inzulina in vivo i in vitro (126). Dalje, u ovoj studiji je potvrđen uticaj P.
koraiensisa protiv pretilosti na štakorima tretiranim dijetom sa visokim udjelom masti, tako
95
što je spriječio debljanje, a primjenjivan je u dozi od 100 i 200 mg/kg. Kako se gubitak težine
uglavnom dovodi u vezu sa smanjenjem mase masnog tkiva kao posljedice redukcije veličine
adipocita ili akumulacije triglicerida, naši podaci da je EOPK značajno smanjio
retroperitonealnu i epididimalnu težinu masti te također nivo triglicerida u serumu kada se
poredilo sa štakorima tretiranih dijetom sa visokim udjelom masti ukuzaju na to da EOPK
može spriječiti pretilost tako što će inhibirati metabolizam lipida uključujući i trigliceride.
Holesterol je također značajan sastojak kompleksa masti. Nizak nivo HDL holesterola u
serumu je usko povezan sa pojavom pretilosti (127). U ovoj studiji, primjena EOPK je
značajno smanjila udio ukupnog holesterola u serumu. Kao dodatak tome, EOPK je značajno
povećao nivo HDL holesterola na način ovisan o dozi. Lipidni parametri u krvi mogu biti
pogođeni hepatičkim metabolizmom. Kao što je bilo i očekivano, primjećeno je da je udio
triglicerida i holesterola u jetri bio značajno povećan kod štakora tretiranih dijetom sa visokim
udjelom masti u poređenju sa normalnom kontrolom. Na suprot tome, tretman sa EOPK je
značajno smanjio sadržaj triglicerida i ukupnog holesterola u jetri, ukazujući na to da EOPK
regulira metabolizam lipida uključujući trigliceride i holesterol u borbi protiv pretilosti.
96
visok sadržaj limonena u Pinus pinea mogao da promovira njegovu aktivnost u zarastanju
rana. Eterična ulja dobivena iz iglica Pinus vrsta nisu pokazala značajan efekat u zarastanju
rana. Gasnom hromatografijom je pokazano da je sadržaj limonena u eteričnim uljima
dobivenih iz iglica Pinus pinea bio visok ali ne toliko kao kod eteričnog ulja dobivenog iz
šišarika Pinus pinea. Za terpenke komponente je utvrđeno da imaju baktericidne, fungicidne,
insekticidne, antikarcinogene, pesticidne, antioksidativne, antiinflamatorne, analgetičke i
sedativne učinke. Za aktivnost zarastanja rana antibakterijski agensi imaju značajnu ulogu.
Oni stvaraju barijeru protiv mikrobnih napada i štite ozljeđeno područje od infekcija.
Aktivnost u zarastanju rana eteričnih ulja Pinus vrsta bi se mogla vezati za njihove
antimikrobne učinke. Prema eksperimentalnim rezultatima, eterična ulja dobivena iz Pinus
pinea i Pinus halepensis su imala bolju aktivnost u zarsatanju rana kada se poredilo sa ostalim
uljima i kontrolnim grupama. Ova studija pružila dokaze koji su opravdali dosadašnju
upotrebu roda Pinus kod zarastanja rana u narodnoj medicini (62).
97
7. Zaključci:
2. Na osnovu analize dostupnih podataka, možemo zaključiti da eterična ulja Pinus pinea
i Pinus halepensis pokazuju dobru aktivnost u zarastanju rana, mnogo bolju u odnosu
na ostala ispitivana ulja te se njihova upotreba u narodnoj medicini u ove svrhe sa
razlogom može opravdati.
3. Rezultati studija obrađenih u ovom radu su pkazali da eterična ulja porodice Pinacea
te njihove komponente pokazuju dobru acetilholinesteraznu i butirilholinesteraznu
inhibitornu aktivnost koje su ključne u tretmanu neurodegenerativnih oboljenja poput
Alzheimerove bolesti:
o eterična ulja P. brutia, P. halepensis, P. nigra, P. pinea i P. sylvestris zajedno
sa piknogenolom su pokazala acetilholinesterazni inhibitorni potencijal. Među
njima kao najobečavajuću vrstu izdvajamo P. halepensis, koji je pokazao
značajnu inhibitornu aktivnost te zaslužuje dodatna ispitivanja. Piknogenol se
također smatra obečavajućim prirodnim neuroprotektivnim agensom zbog
svojih antioksidativnih aktivnosti te sposobnosti inhibicije enzima.
o eterična ulja Pinus nigra subsp. nigra, Pinus nigra var. calabrica te Pinus
heldreichii subsp. leucodermis su pokazala karakteristike koje su značajne u
liječenju Alzheimerove bolesti te su potrebna dodatna istraživanja kako bi se
ispitao mehanizam njihovog djelovanja, farmakokinetika, te putevi primjene.
98
6. Predstavljeni su rezultati koji govore o antikancerogenom i antiinflamatornom
djelovanju eteričnih ulja porodice Pinaceae. Eterična ulja dobivena iz grančica P.
mugo, P. peuce i P. heldreichii te eterično ulje iz šišarika P. mugo su pokazala
najznačajniju antiinflamatornu aktivnost u LPS stimuliranim makrofagima. Eterična
ulja iz iglica i grančica P. peuce i P. mugo, kao i ono iz iglica P. heldreichii su
pokazala jaku citotoksičnu aktivnost prema HeLa i CaCo-2 ćelijskim linijama. Najjaču
aktivnost prema MCF-7 ćelijskim linijama su pokazala eterična ulja dobivena iz iglica
i grančica P. peuce te iglica P. mugo. Ova eterična ulja bi se trebala smatrati
potencijalnim agensima za razvoj novih fitoterapijskih antikarcinomskih lijekova.
99
8.Literatura
3. Drug discovery from medicinal plants. Balaunas, Marcy J. i Kinghorn, Douglas A..
2005, Elsevier, Journal of Life sciences, str. 431-432.
4. Phytochemical analysis of some medicinal plants. RNS, Yadav i Agarwala, Munin. 2011,
Journal of Phytology, str 10.
5. Efficacy of Aqueous and Menthol Extracts of Some Medicinal Plants for Potential
Antibacterial Activity. Parekh, Jinga i Jadeja, Darshana i Chanda, Sumitra. 2005,
Tubitak, str.203-206.
6. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods- a review.
Burt, Sara. 2004, Elsevier, International journal of food microbiology, str. 223-253.
7. The antimicrobial efficacy of plant essential oil combinations and interactions with food
ingrediets. Gutierrez, Jorge i Barry-Ryan, Catherine i Bourke, Paula. 2008, Elsevier,
International journal of food microbiology, str. 91-97.
8. In vitro and in vivo antimicrobial efficacy of essential oils and individual compunds against
Phytophthora parasitica var. nicotianae. Lu, M i Han, Z i Yao, L. 2013, Wiley Online
Library, Journal of applied microbiology, str. 187-198.
9. Antibacterial and antifungal effects of essential oils from coniferous trees. Hong, Eui-Ju i
Na, Ki-Jeung i Choi, In-Gyu i Choi, Kyung-Chul i Jeung, Eui-Bae. 2004. The
Pharmaceutical Society of Japan, Biological and Pharmaceutical Bulletin, str. 863-866.
10. Campbell N.A. et al. (2008). Biology. 8th Ed. Person International Edition, San
Francisco.
11. Sofradžija A., Šoljan D., Hadžiselimović R. (2004). Biologija 1. Svjetlost, Sarajevo.
100
12. Judd, Walter S.; Campbell, Christopher S.; Kellogg, Elizabeth A.; Stevens, Peter F.;
Donoghue, Michael J. (2007). Plant systematics: a phylogenetic approach. (1st ed. 1999,
2nd 2002) (3 iz.). Sinauer Associates.
14. Aljos Farjon (1998). World Checklist and Bibliography of Conifers. Royal Botanic
Gardens, Kew.
15. Christopher J. Earle (ur.). "Pinus merkusii Junghuhn et de Vries ex de Vries 1845 ". The
Gymnosperm Database.
16. Chemical composition and antibacterial activity of Pinus halepensis Miller grown in West
Northern of Algeria. Fekih, Nadia i Allali, Hocine i Merghache, Salima i Chaib, Faiza i
Merghache, Djamila i El Amine, Mohamed i Djabou, Nassim i Muselli, Alain i Tabti,
Boufeldja i Costa, Jean. 2014. Asian Pacif Journal of Tropical Disease, str. 97-101.
17. A review on biological, nutraceutical and clinical aspects of French maritime pine bark
extract. Maimoona, Alya i Naeem, Ismat i Saddiqe, Zeb i Jameel, Khalid. 2011, Journal of
Ethnopharmacology, str. 262-264.
18. Sweetman SC, ed (2009). Martindale, the complete drug reference. 26th edition. London:
Pharmaceutical press.
19. Tucakov, Jovan. (1964). Farmakognozija, drugo izdanje. Beograd: Zavod za izdavanje
udžbenika SR Srbije.
22. Kovačević, Nada. (2004). Osnove farmakognozije, Srpska Školska Knjiga, Beograd.
24. Paola, Lanzara i Mariella Pizzetti. (1984). Drveće, Mladinska knjiga, Ljubljana.
101
26. Emilija, Vukičević. (1987). Dekorativna dendrologija, Naučna knjiga, Beograd.
29. Grlić, Ljubiša. (1990). Enciklopedija samoniklog jestivog bilja, August Cesarec, Zagreb.
30. Forenbacher, Sergej. (2001). Velebit i njegov biljni svijet, Školska knjiga, Zagreb.
31. Nikolić, Toni i Kovačić, Sanja i Ruščić, Mirko i Milović, Milenko i Stamenković,
Vanja i Minjel, Darko i Jasprica, Nenad i Bogdanović, Sandro i Topić, Jasenka. (2008).
Flora jadranske obale i otoka- 250 najčešćih vrsta, Školska knjiga, Zagreb.
33. Umeljić, Vjeroljub. (2004). U svijetu cvijeća i pčela: atlas medonosnog bilja, Ilija
Bošković, Split.
35. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods- a review.
Burt, Sara. 2004. Elsevier, International journal of food microbiology, str. 224-227.
36. Bauer, K. i Garbe, D. 1985. Common Fragrance and Flavor Materials. Preparation,
Properties and Uses. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, str. 213.
37. Crosthwaite, D. 1998. UK trade within the flavour and fragrance industry. International
Federation of Essential Oils and Aroma Trades- 21st International Conference on Essential
Oils and Aroma's. IFEAT, London, str. 6-12.
38. Guenther, E. 1948. The Essential Oils. D. Van Nostrand, New York.
39. Carson, C.F. i Riley T.V. 2001. Safety, efficacy and provenance of tea tree (Melaleuca
alternifolia) oil. Contact Dermatitis 45, str. 65-67.
102
40. Boyle, W. 1955. Spices and essential oils as preservatives. The American Perfumer and
Essential Oil Review 66, str. 25-28.
41. Van de Braak, S.A.A.J. i Leijten, G.C.J.J. 1999. Essential Oils and Oleoresins: A
Survey in Netherlands and other Major Markets in the European Union. CBI, Centre for the
Promotion of Imports from Developing Countries, Rotterdam, str.116.
43. Inhibition of Listeria monocytogenes and other bacteria by a plant essential oil (DMC) en
Spanish soft cheese. Mendoza-Yepes, M.J. i Sanchez-Hidalgo, L.E. i Maertens, G. i
Marin-Iniesta, F. 1997. Journal of Food Safety, str. 47-55.
44. In vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinian Thymus essential
oils. Cosentino, S. i Tuberoso, C.I.G. i Pisano, B. i Satta, M. i Mascia, V. i Arzedi, E. i
Palmas, F. 1999. Leters in Applied Microbiology 29, str.130-135.
45. Inhibitory effect of oregano and thyme essential oils on moulds and foodborne bacteria.
Paster, N. i Juven, B.J. i Shaaya, E. i Menasherov, M. i Nitzan, R. i Weisslowicz, H. i
Ravid, U. 1990. Letters in Applied Microbiology 11, str. 33-37.
46. Wild thyme, Thymus capitatus, essential oil seasonal changes and antimycotic activity.
Arras, G. i Grella, G.E. 1992. Journal of Horticultural Science 67, str.197-202.
47. Seasonal variation in essential oil yield and compostion from naturalized Thymus vulgaris
L. in New Zealand. McGimpsey, J.A. i Douglas, M.H. i Van Klink, J.L. i Beauregard,
D.A. i Perry, N.B. 1994. Flavour anf Fragrance Journal 9, str. 347-352.
50. Shah B, Seth AK (2010). Textbook of pharmacognosy and phytochemistry. New Delhi:
Elsevier India.
103
51. Branko Nikolin, Miroslav Šober. Analitika lijekova. Sarajevo: Sarajevo Publishing,
2003. str. 193-228.
52. Pharmaceutical and Therapeutic Potentials of Essential Oils and Their Individual
Volatile Constituents: A Review. Edris, Amr E. 2007. Wiley InterScience, str. 1002-1004.
53. Toxicity of the essential oil of Melaleuca alternifolia or tae tree oil. Carson, C. i Riley, T.
1995. J Toxicol Clin Toxicol 33, str. 193-195.
54. Antibacterial properties of plant essential oils. Deans, S. i Ritchie, G. 1987. International
Journal of Food Microbiology, str. 165-180.
55. Handwashing and hand disinfection. Reybrouck, G. 1986. Journal of Hospital Infection
8, str. 5-23.
56. Effect of aromatics on lung mucociliary clearance in patients with chronic airways
obstruction. Hasani, A. i Pavia, D. i Toms, N. i Dilworth, P. i Agnew, E. 2003. Journal of
Alternative Complementary Medicine, str. 243-249.
57. Antioxidative effect of Citrus essential oil components on human low-density lipoprotein
in vitro. Takahashi, Y. i Inaba, N. i Kuwahara, S. i Kuki, W. 2003. Bioscience,
Biotechnology and Biochemistry, str. 195-197.
59. Essential Oil Composition of Pinus peuce Griseb. Needles and Twigs from Two National
Parks of Kosovo. Avni, Hajdari i Behxhet, Mustafa i Dashnor, Nebija i Hyrmete, Selimi i
Zeqiri, Veselaj i Pranvera, Breznica i Leah Quave, Cassandra i Johannes, Novak. 2016,
The Scientific World Journal, str. 1-2.
60. Fungicidal properties of Pinus sylvestris L. for improvement of air quality. Motiejūnaitė,
Ona i Pečiulytė, Dalia. 2004, Medicina, str. 287-288.
61. Anti-Diabetic Potential of the Essential Oil of Pinus koraiensis Leaves toward
Streptozotocin Treated Mice and HIT-T15 Pancreatic βCells. Joo, Hye-Eun i Lee, Hyo-Jung
104
i Sohn, Eun Jung i Lee, Min-Ho i Ko, Hyun-Suk i Jeong, Jin i Lee, Hyo-Jeong i Kim,
Sung-Hoon. 2013. Journal of Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, str. 1997-2001.
62. Appraisal on the wound healing and anti-inflamatory activities of the essential oils
obtained from the cones and needles of Pinus species by in vivo and in vitro experimental
models. Suntar, Ipek i Tumen, Ibrahim i Ustun, Osman i Keles, Hikmet i Kupeli Akkor,
Esra. 2013. Journal of Ethnopharmacology, str. 533-537.
64. Phytochemical compostion, anti-inflamatory activity and cytotoxic effects of essential oils
from three Pinus spp. Basholli-Salihu, Mimoza i Schuster, Rowitha i Hajdari, Avni i
Mulla, Dafina i Viernstein, Helmut i Behxhet, Mustafa i Mueller, Monika. 2017.
Pharmaceutical Biology, str. 1553-1557.
65. Andreae, S. Lexikon der Krankheiten und Untersuchungen. Sttutgart: Thieme; 2008.
66. Longo, D.L. i Fauci, A.S. i Kasper, D.L. i Hauser, S.L. i Jameson, J.L. i Loscanzo, J.
(2011). Principles of internal medicine. McGrow-Hill Companies, New York.
69. Commision E (1990). Pine needle oil (Pini aetheroleum). Dostupno na:
http://buecher.heilpflanzen-welt.de/BGA-Commission-E-Monographs/0298.html
70. Baser KHC i Buchbauer G (2010). Handbook of essential oils. Boca Raton: Taylor and
Francis group.
105
73. Kar, A. (2007). Pharmacognosy and pharmacobiotechnology, second edition. New Delhi:
New age International.
74. Kraft, K. i Hobbs,C. (2004). Pocket guide to herbal medicine. Stuttgard: Georg Thieme
Verlag.
75. Damian, P. i Damian, K. Aromatherapy: Scent and Psyche. Rochester, VT: Healing Arts
Press, 1995.
76. Wildwood,C. (1996). The Encyclopedia of Aromatherapy. Rochester, VT: Healing Arts
Press.
77. Schiler,C. i Schiller, D. (1996). Aromatherapy Oils: A Complete Guide: NY, Sterling
Publishing Co., New York, NY.
78. Schnaubeit, K. (1996). Advanced Aromatherapy. Healing Arts Press, Rochester, VT.
79. Buchle RGN, J. (1997). Clinical Aromatherapy in Nursing. Singler Publishing, San
Diego, CA.
81. Cann, Alan. (2011). Principles of Molecular Virology. Academic Press, London.
84. Intestinal microbiota and the role of fecal microbiota transplant (FMT) in treatment of C.
difficile infection. Brandt, L.J. 2013. American Journal of Gastroeneterology, str. 85-108.
85. Prospects and challenges for intestinal microbiome therapy in pediatric gastrointestinal
disorders. Kellermayer, R. 2013. World Journal of Gastrointestinal Pathophisiology, str. 3-4.
86. The Antibiotic Resistance Crisis, Part 1: Causes and Threats. Ventola, C.L. 2015.
Pharmacy and Therapeutics, str. 277-283.
106
88. Committee on New Directions in the Study of Antimicrobial Therapeutics. (2006).
Challengs for the Development of New Antibiotics-Rethinking the Approaches. National
Academies Press.
89. The antifungal activity of Sarcococca saligna ethanol extract and its combination effect
with fluconazole against different resistant Aspergillus species. Mollazadeh-Moghaddam,
K. i Arfan, M. i Rafique, J. i Rezaee, S. i Jafari Fesharaki, P. i Gohari, A.R. i Shahverdi,
A.R. (2010). Applied Biochemistry and Biotechnology, str. 33-35.
90. Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders. Coyle, J.T. i Puttfarken,
P. 1993. Science, str. 689-695.
91. Cytokines and their receptors in the central nervous system: physiology, pharmacology
and pathology. Rothwell, N.J. i Lusheshi, G. i Toulmond, S. 1996. Pharmacol Thera, str.
85-95.
94. Essential Oil of Pinus koraiensis Exerts Antiobesic and Hypolipidemic Activity via
Inhibition of Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Gamma Signaling. Ko, Hyun-Suk
i Lee, Hyo-Jeong i Lee, Hyo-Jung i Sohn, Eun Jung i Yun, Miyong i Lee, Min-Ho i Kim,
Sung-Hoon. 2013. Hindawi Publishing Corporation Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine, str. 3-5.
95. Medicinal plants and antimicrobial activity. Rios, J.L. i Recio, M.C. 2005. Elsevier,
Journal of ethnopharmacology, str. 80-84.
96. Herbals: the connection between horticulture and medicine. Janick, Jules. 2003.
American Society for Horticultural Science, str. 229-238.
107
98. Kontrola rezistencije bakterija na antibiotike u Hrvatskoj. Tambić-Andrašević, Arjana.
2009. Infektološki glasnik, str. 145-150.
99. The value of plants used in traditional medicine for drug discovery. Fabricant, Daniel S.
i Farnsworth, Norman R. 2001. Environmental health perspectives: National institute of
environmental health science, str. 109-111.
100. Antimicrobial properties of selected essential oils in vapour phase against foodborne
bacteria. Nedorostova, Lenka i Kloucek, Pavel i Kokoska, Ladislav i Stolcova, Miluse i
Pulkrabek, Josef. 2009. Elsevier, Food control, str. 157-160.
101. Antimicrobial activity of aroma chemicals and essential oil. Morris, J.A. i Khettry, A i
Seitz, E.W.M. 1979. Springer, Journal of the American Oil Chemists' Society, str. 595-603.
102. In-vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinian Thymus essential
oils. Cosentino, S. i Tuberoso, C. i Ignazio,G. i Pisano, B. i Satta,M.L. i Mascia, V. I
Arzedi, E. i Palmas, F. 1999. Wiley Online Library, Letters in applied microbiology, str.
130-135.
103. The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the food-born
pathogene Bacillus cereus. Ultee, A i Bennik, MHJ i Moezelaar, R. 2002. Applied and
environmental microbiology, str. 1561-1568.
105. The mode of antimicrobial action of essential oil of Melaleuca alternifoilia (tea tree oil).
Cox, SD i Mann, CM i Markham, JL i Bell, HC i Gustafson, JE i Warmington, JR i dr.
2000. Journal of Applied Microbiology, str.170-175.
106. Chemical composition and biological activities of new essential oil chemotype of
Tunisian Artemisia herba alba Asso. Zouari, S i Zouari, N i Fakhfakh, N i Bougatef, A i
Ayadi, MA i Neffati, M. 2010. Journal of Medicinal Plant Resources, str. 871-880.
107. Bai, XJ i Li, BH i Zhang, J i Wang, LW i Yuan, ZQ i Lin, F i Hao, ZQ. (2010). Ying
Yong Sheng Tai Xue Bao, str. 1899-1906.
108. Yang, X i Zhang, YC i Zhang, H i Wang, J. (2008). Zhong Yao Cai, str. 53-55.
108
109. Kim, JH i Lee, HJ i Jeong, SJ i Lee, MH i Kim, SH. (2012). Phytoherapy Resources,
str.1314-1319.
110. Chen, X i Zhang, Y i Wang, Z i Zu, Y. (2011). Natural Product Resources, str.1807-
1816.
113. Wang, X i Hai, CX. (2011). Mini Rev. Med. Chem., str.1082-1092.
114. Neuroprotective effects of several Korean medicinal plants traditionally used for stroke
remedy. Chun, HS i Kim, JM i Choi, EH i Chang, N. (2008). Journal of Medicine and
Food, str. 246-251.
117. Abies koreana essential oil inhibits drug-resistant skin pathogen growth and LPS-
induced inflamatory effects of murine macrophage. Yoon, WJ i Kim, SS i Oh, TH i Lee, NH
i Hyun, CG. 2009. Lipids, str.471-476.
118. Suffness, M i Pezzuto JM. 1990. Assay related to cancer drug discovery. Meth Plant
Biochem. str.71-133.
119. Chemical composition and cytotoxic activity of the leaf essential oil of Eugenia
zuchowskiae from Monteverde, Costa Rica. Cole, RA i Bansal, A i Moriarity, DM i Haber,
WA i Setzer, WN. 2007. J Nat Med, str.414-417.
109
120. Composition and cytotoxic activity of essential oils from Xylopia aethiopica (Dunal) A.
Rich, Xylopia parviflora (A. Rich) and Monodora myristica (Gaertn) growing in Chad and
Cameroon. Bakarnga-Via, I i Hzounda, JB i Fokou, PV i Tchokouaha, LR i Gary-Bobo,
M i Gallud, A i Garcia, M i Walbadet, L i Secka, Y i Dongmo, PM. 2014. BMC
Complement Altern Med, str.125.
121. Anti-inflamatory activity of extracts from fruits, herbs and spices. Mueller, M i
Hobiger, S i Jungbauer, A. 2010. Food Chem, str.660-667.
122. Anticancer activity of essential oils and their chemical components- a review. Byala, B i
Bassole, I i Scifo, R i Gnoula, C i Morel, L i Lobaccaro, JM i Simpore, J. 2014. Am J
Cancer Res, str. 591.
123. Adipose development: from stem to adipocyte. Otto, TC i Lane, MD. 2005. Critical
Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, str. 229-242.
124. Growth and photosynthetic responses of two pine species (Pinus koraiensis and Pinus
rigida) in polluted industrial region in Korea. Choi, DS i Kayama, M i Jin, OH i Lee, CH i
Izuta, T i Koike, T. 2006. Environmental Pollution, str. 421-432.
125. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting
the adipose conversion. Green, H i Kehinde, O. 1975. Cell, str. 19-27.
127. Signals that regulate food intake and energy homeostasis. Woods, SC i Seeley, RJ i
Porte, D i Schwartz, MW. 1998. Science, str.1378-1383.
128. Hyaluronan catabolism: a new metabolic pathway. Stern, R. 2004. European Journal of
Cell Biology, str.317-325.
129. Functions of hyaluronan in wound repair. Chen, WYJ i Abatangelo, G. 1999. Wound
Repair and Regeneration, str.79-89.
130. Cutaneous Wound Repair. Clark, RAF. 1991. Oxford University, New York, str.576-
579.
110
131. Yields and constituents of essential oil from cones of Pinaceae spp. natively grown in
Turkey. Tumen, I i Hafizoglu, H i Kilic, A i Donmez, IE i Sivrikaya, H i Reunanen, M.
2010. Molecules, str.5797-5806.
111