Embedding of Tissue in Histopathology

Lecture 5 Embedding of Tissue in Histopathology Assistant Lecturer: Ameer S.
Alkhayyat
Embedding of Tissue in Histopathology

After processing the tissue, the next step is embedding of the tissue to make the
block. In the embedding process, the tissue is surrounded in a molten medium by
using a mould.
‫ يُحاط النسيج‬، ‫ في عملية التضمين‬.‫ فإن الخطوة التالية هي دمج النسيج لصنع الكتلة‬، ‫بعد معالجة األنسجة‬
.‫وسط منصهر باستخدام قالب‬
Aims of embedding:
1. To give support of the tissue
2. To prevent distortion of the tissue during cutting
3. To preserve the tissue for archival use
‫ لدعم األنسجة‬.1
‫ لمنع تشويه األنسجة أثناء القطع‬.2
‫ للحفاظ على األنسجة الستخدامها في األرشيف‬.3
Embedding Medium
Paraffin wax: is sold in the market with different melting point. Paraffin wax with
melting points ranging from 56 to 62 °C is used in our laboratory. Paraffin wax is
cheaper and easy to use.
‫ يستخدم شمع البارافين بنقاط انصهار‬.‫ يباع في األسواق بدرجة انصهار مختلفة‬:‫شمع البرافين‬
.‫ شمع البرافين أرخص وسهل االستخدام‬.‫ درجة مئوية في مختبرنا‬62 ‫ إلى‬56 ‫تتراوح من‬
3.2 Different Types of Mould , Used for Block
1. Leuckhard Embedding Moulds
2. Stainless Still Mould
3. Plastic Mould
‫ قوالب ليكارت للتضمين‬.1
‫ قالب من الفوالذ المقاوم للصدأ‬.2

Lecture 5 Embedding of Tissue in Histopathology Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat
‫ قوالب بالستيكية‬.3
Tissue Embedding Method

The following things are needed for tissue embedding:
1. Molten paraffin wax
2. Mould with cover
3. Metal plate (cold plate) to work
:‫األشياء التالية ضرورية لتضمين األنسجة‬
‫ شمع البارافين المنصهر‬.1
‫ قالب مع غطاء‬.2
‫ لوحة معدنية (صفيحة باردة) للعمل‬.3
Tissue-Tek system is the combination of
1. Dispenser of liquid paraffin in a constant temperature

2. A metal plate to make the tissue block
3. Cold plate
‫ هو مزيج من‬Tissue-Tek ‫نظام‬
‫ موزع البارافين السائل في درجة حرارة ثابتة‬.1
‫ لوحة معدنية لصنع كتلة األنسجة‬.2
‫ صفيحة باردة‬.3
Tissue-Tek system I: The steps of this system are
• Liquid paraffin is kept at a constant temperature in the dispenser of the system.
• The tissue is put on the lower surface of the mould by forceps.
.‫• يحفظ البارافين السائل عند درجة حرارة ثابتة في موزع النظام‬
.‫• يتم وضع األنسجة على السطح السفلي للقالب بواسطة ملقط‬
The cutting surface should be faced down.

• Molten paraffin is poured on the metallic mould.
• The mould is covered with peripheral plastic ring on the upper surface.
• Unique tissue number is put in one corner.
• The whole mould is put on the cold plate.
• The metallic mould is detached from the plastic ring, and the block is used for
cutting tissue. w
.‫• يُسكب البارافين المصهور على القالب المعدني‬

.‫• القالب مغطى بحلقة بالستيكية محيطية على السطح العلوي‬
.‫• يتم وضع رقم فريد للنسيج في زاوية واحدة‬
.‫• يتم وضع القالب بالكامل على اللوحة الباردة‬
‫ ث‬.‫ ويتم استخدام الكتلة لقطع األنسجة‬، ‫• يتم فصل القالب المعدني عن الحلقة البالستيكية‬
Tissue Orientation and Embedding
1. The tubular tissue (fallopian tube, vas difference, artery, etc.) should be placed in
such a manner so that we get a transverse section with all the layers.
2. Tissue with epithelial surface should be placed vertically and right angle to the
surface so that we can get all the layers.
3. Multiple section of tissue such as endometrial curetting should be placed all in
central position.
4. Linear long tissue should be placed diagonally.
5. Muscle biopsy should be placed both in longitudinal and transverse plane.
6. Long membranous tissue such as amniotic membrane should make as Swiss roll.
‫ إلخ) بهذه‬، ‫ الشريان‬، ‫ فرق األسهر‬، ‫ يجب وضع النسيج األنبوبي (قناة فالوب‬.1
.‫الطريقة بحيث نحصل على مقطع عرضي مع جميع الطبقات‬
‫‪Lecture 5 Embedding of Tissue in Histopathology‬‬ ‫‪Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat‬‬
‫‪ .2‬يجب وضع األنسجة ذات السطح الظهاري عموديًا وبزاوية قائمة على السطح‬
‫حتى نتمكن من الحصول على جميع الطبقات‪.‬‬
‫‪ .3‬يجب وضع أقسام متعددة من األنسجة مثل كحت بطانة الرحم كلها في موضع‬
‫مركزي‪.‬‬
‫‪ .4‬يجب وضع األنسجة الطويلة الخطية بشكل مائل‪.‬‬
‫‪ .5‬يجب وضع خزعة العضالت في المستويين الطولي والعرضي‪.‬‬
‫‪ .6‬يجب أن تكون األنسجة الغشائية الطويلة مثل الغشاء األمنيوسي مثل لفة‬
‫سويسرية‪.‬‬
Molds
Open one cassette
Tissue Orientation
Troubleshooting Embedding
• Soft mushy tissue:
• Not adequately processed.
• The tissue should be sectioned thinner, replaced in the cassette, and then
treated using the following protocol:
:‫• األنسجة اللينة الطرية‬

. ٍ‫• لم تتم معالجتها بشكل كاف‬
‫ ثم معالجتها باستخدام‬، ‫ واستبدالها في الكاسيت‬، ‫• يجب تقطيع األنسجة بشكل أرق‬
:‫البروتوكول التالي‬
1- Soak tissue in xylene for 20 to 30 min
2- Place cassettes in tetrahydrofuran for 30 to 90 min to allow the

dehydration/clearing
3- Place sections in xylene for 10 min to ensure adequate clearing.
4- Place on tissue processor and re-infiltrate with 2 to 3 change of fresh paraffin for
30 t0 45 min.
5- Re-embed
‫ دقيقة‬30 ‫ إلى‬20 ‫ نقع األنسجة في زيلين لمدة‬-1

/ ‫ دقيقة للسماح بالجفاف‬90 ‫ إلى‬30 ‫ ضع الكاسيت في رباعي هيدرو الفوران لمدة‬-2
‫المقاصة‬
.‫ دقائق لضمان المقاصة الكافية‬10 ‫ ضع المقاطع في زيلين لمدة‬-3
30 ‫ تغيير من البارافين الطازج لمدة‬3 ‫ إلى‬2 ‫ ضعها على معالج األنسجة وأعد التسلل مع‬-4
‫ دقيقة‬T0 45
‫ إعادة التضمين‬-5
Incorrect Orientation:
Sections may be incorrectly oriented at the embedding station. The Can be

prevented by:
:‫ يمكن منعه عن طريق‬.‫قد تكون األقسام موجهة بشكل غير صحيح في محطة التضمين‬
Marking the side of the tissue to be embedded facing up with ink at the
grossing station .
.‫تعليم جانب النسيج المراد تضمينه مواج ًها للحبر في محطة الحصاد‬
• Tissue carryover ‫ترحيل األنسجة‬
• Small pieces or fragments of tissue may be carried from 1 tissue to the

next at the embedding table, resulting in cross-contamination. This can
be prevented by
‫ مما يؤدي‬، ‫• قد يتم نقل قطع صغيرة أو شظايا من األنسجة من نسيج إلى آخر على طاولة التضمين‬
‫ يمكن منع هذا عن طريق‬.‫إلى انتقال التلوث‬
• Carefully cleaning forceps between specimens
‫• تنظيف الملقط بعناية بين العينات‬

• Opening only the cassette with the tissue to be embedded.
.‫• فتح الكاسيت فقط مع األنسجة المراد دمجها‬

• Tissue not embedded at the same level
‫• األنسجة غير مدمجة في نفس المستوى‬

• Often tissue is not properly flattened by pressing it down uniformly when
it is placed in the embedding mold, or multiple tissues to be placed in the
same mold are embedded at different level, this should be prevented by:
‫• في كثير من األحيان ال يتم تسطيح األنسجة بشكل صحيح عن طريق الضغط عليها‬
‫ أو يتم تضمين العديد من األنسجة المراد‬، ‫بشكل موحد عند وضعها في قالب التضمين‬
:‫ يجب منع ذلك من خالل‬، ‫وضعها في نفس القالب على مستوى مختلف‬
• Pressing the tissue down uniformly.
.‫• الضغط على األنسجة ألسفل بشكل موحد‬

• Keep the paraffin molten enough to get all pieces embedded at the same level
‫منصهرا بدرجة كافية لتضمين جميع القطع في نفس المستوى‬

ً ‫• حافظ على البارافين‬
• Work very fast when embedding multiple pieces
‫• العمل بسرعة كبيرة عند تضمين عدة قطع‬

• Pieces of tissue missing from the block
‫• قطع من األنسجة مفقودة من الكتلة‬

• Can be prevented by:
:‫• يمكن منعه من خالل‬

• Recording the number of pieces to be embedded.
• Carefully checking the lid of the cassette before discarding.
• Carefully opening any lens paper or tea bags ,and checking for all pieces.
.‫• تسجيل عدد القطع المراد تضمينها‬

.‫• افحص غطاء الكاسيت بعناية قبل التخلص منه‬
.‫ والتحقق من كل القطع‬، ‫• فتح بعناية ورق العدسة أو أكياس الشاي‬
Lecture 6 Processing of Tissue in Histopathology Laboratory Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat
Tissue Microtome: Principle and procedure

It is the main instrument by which we cut the embedded tissue in the paraffin block as
thin section.
The different types of microtomes in the traditional histology laboratory are:

1. Rotary microtome
2. Sliding microtome
3. Cryomicrotome
4. Ultramicrotome
.‫إنها األداة الرئيسية التي نقطع بها األنسجة المدمجة في كتلة البارافين كقسم رفيع‬
:‫األنواع المختلفة من الميكروتومات في مختبر األنسجة التقليدي هي‬
‫ مشراح دوار‬.1
‫ انزالق مشراح‬.2
‫كريوميكروتومي‬-3
Ultramicrotome .4
Rotary microtome
This is the most commonly used microtome in routine laboratory. The cutting blade is kept
in horizontal position, and the block containing tissue moves up and down with the help
of rotatory handle attached with the microtome.
‫ وتتحرك الكتلة التي‬، ‫ يتم االحتفاظ بشفرة القطع في وضع أفقي‬.‫هذا هو المشراح األكثر استخدا ًما في المختبر الر وتيني‬
.‫تحتوي على األنسجة ألعلى وألسفل بمساعدة مقبض دوار متصل بالمشرع‬
Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat / Molecular and Medical Microbiology / College of

Medicine / Wasit University ameers226@uowasit.edu.iq
In each 360° rotation of the wheel handle, the block moves down followed by up,
and the tissue is cut as thin ribbon.
‫ ويتم قطع النسيج‬، ‫ تتحرك الكتلة ألسفل متبوعة ألعلى‬، ‫ درجة لمقبض العجلة‬360 ‫في كل دوران بزاوية‬
.‫كشريط رفيع‬
This microtome has the option to be semiautomated or automated with the adjustment
and control of the movement of the block and angle of the knife Types of
microtome
‫هذا المشراح لديه خيار أن يكون شبه آلي أو آلي مع ضبط والتحكم في حركة كتلة وزاوية السكين أنواع مشراح‬
1- Rotary microtome: Most commonly used microtome for routine histopathology.

The basic mechanism requires the rotation of a fine advance hand-wheel.
Advantages include:
1- The ability to cut thin 2–3 μm sections .
2- Easy adaption to all type of tissue (hard, fragile or fatty) sectioning.

.‫ المشراح األكثر استخدا ًما في علم التشريح المرضي الروتيني‬:‫ مشراح الروتاري‬-1
.‫تتطلب اآللية األساسية دوران عجلة يدوية متطورة بشكل جيد‬
:‫المزايا تشمل‬
.‫ ميكرومتر‬3-2 ‫ القدرة على قص مقاطع رقيقة‬-1
.)‫ الدهنية‬، ‫ الهشة‬، ‫ سهولة التكيف مع جميع أنواع األنسجة (الصلبة‬-2
2-Base sledge microtome: Used primarily for large blocks, hard tissues or whole
mounts, it is especially useful in neurological and ophthalmic pathology but 3 μm
sections are difficult to produce.
‫ يستخدم بشكل أساسي للكتل الكبيرة واألنسجة الصلبة أو الحوامل‬:‫مشراح الزالجة القاعدية‬-2
.‫ ميكرومتر‬3 ‫ وهو مفيد بشكل خاص في أمراض األعصاب والعيون ولكن يصعب إنتاج‬، ‫الكاملة‬

3-Rotary rocking microtome: Commonly used in cryostats.
.‫ يشيع استخدامه في كريوستات‬:‫مشراح هزاز دوار‬-3
4-Sliding microtome: This microtome was developed for use with

celloidinembedded tissue blocks used primarily for research.
‫ تم تطوير هذا المبضع لالستخدام مع كتل األنسجة المضمنة في السيلويد‬:‫ مشراح منزلق‬-4
.‫المستخدمة في المقام األول للبحث‬
5- Ultra-microtome: Used exclusively for electron microscopy.
.‫ يستخدم حصريًا في الفحص المجهري اإللكتروني‬:‫ ميكروتوم فائق‬-5
Microtome Knife
The microtome knife is important to cut uniform and thin section of tissue These are
made of steel. Various types of knife profiles are available for different types of
microtomes.
‫ تتوفر أنواع‬.‫سكين مبضع مهم لقطع جزء موحد ورقيق من األنسجة هذه مصنوعة من الفوالذ‬
.‫مختلفة من ملفات تعريف السكين ألنواع مختلفة من الميكروتومات‬
Disposable Knife
Nowadays disposable blade is used in many laboratories to save time to sharpen. Two
types of disposable blades are available:
‫ تُستخدم الشفرة التي تستخدم لمرة واحدة في العديد من المختبرات لتوفير الوقت‬، ‫في الوقت الحاضر‬
:‫ يتوفر نوعان من الشفرات التي تستخدم لمرة واحدة‬.‫للشحذ‬

1.Low-profile blade: These blades are used to cut small biopsy or soft large tissue.
2. High-profile blade: These are used to cut firm to relatively hard tissue such as the
uterus, heart, etc.
‫ تستخدم هذه الشفرات لقطع الخزعة الصغيرة أو األنسجة الرخوة‬:‫ الشفرة ذات المظهر المنخفض‬-1
.‫الكبيرة‬
.‫ تستخدم لقطع األنسجة الصلبة نسبيًا مثل الرحم والقلب وما إلى ذلك‬:‫ شفرة عالية المستوى‬.2
Factors Involved in Cutting
1. Temperature: Lowering the temperature facilitates section cutting.

2. Angle of rake: Higher rake angle helps in smooth flow of ribbons. Lower
rake angle is used for hard tissue.
3. Consistency of tissue: Soft tissue is cut at a slow rate than the hard tissue.
.‫ خفض درجة الحرارة يسهل عملية القطع المقطعي‬:‫درجة الحرارة‬.1
‫ تستخدم‬.‫ زاوية أشعل النار األعلى تساعد في التدفق السلس للشرائط‬:‫ زاوية أشعل النار‬. 2
.‫زاوية أشعل النار السفلية لألنسجة الصلبة‬
.‫ يتم قطع األنسجة الرخوة بمعدل بطيء عن األنسجة الصلبة‬:‫ تناسق األنسجة‬-3
The following instruments are essential for section cutting:
1. Microtome with blade

2. Water bath
3. Paraffin block with embedded tissue to cut
4. Ice tray

5. A blunt forceps or camel brush

6. Slide rack with slides
:‫األدوات التالية ضرورية لقص المقطع‬
‫ مشراح بشفرة‬.1
‫ حمام مائي‬.2
‫ كتلة البارافين مع األنسجة المدمجة لقطع‬.3
‫ علبة ثلج‬.4
‫ ملقط حاد أو فرشاة جمل‬.5
‫ انزالق الرف مع الشرائح‬.6
Water Bath (Floatation Chamber) Water bath is used to float the tissue after cutting
The temperature of the water bath is usually controlled automatically by a thermostat.
The temperature of water in the water bath should be 10 °C below the melting point
of the embedded paraffin wax and is usually kept in 40–50 °C. For adequate floating
of the tissue, one can add a few drops of alcohol
‫حمام مائي (غرفة الطفو) حمام مائي يستخدم لتعويم األنسجة بعد القطع‬
‫ يجب أن تكون درجة حرارة‬.‫عادة ما يتم التحكم في درجة حرارة الحمام المائي تلقائيًا بواسطة منظم حرارة‬
‫ وعادة ما يتم حفظها في‬، ‫ درجات مئوية تحت درجة انصهار شمع البارافين المضمن‬10 ‫الماء في الحمام المائي‬
‫ يمكن إضافة بضع قطرات من الكحول‬، ٍ‫ لتعويم األنسجة بشكل كاف‬.‫ درجة مئوية‬50-40
Slide Rack with Clean Glass Slides The clean slides are kept in the slide rack. The
slides can be already labelled by diamond pencil or on the frosted side by lead pencil.
Alternatively, this can be marked after lifting the tissue section.

‫ يمكن بالفعل تسمية الشرائح‬.‫رف منزلق مع شرائح زجاجية نظيفة يتم االحتفاظ بالشرائح النظيفة في رف الشرائح‬
.‫بقلم رصاص ماسي أو على الجانب المصنفر بقلم رصاص‬
ً ‫بد‬
.‫ يمكن وضع عالمة على ذلك بعد رفع قسم األنسجة‬، ‫ال من ذلك‬
Steps of Tissue Sectioning
1. Trimming the tissue: Trimming of the tissue is needed to expose the tissue piece
within the paraffin wax for cutting.
.‫داخل شمع البارافين للتقطيع‬ ‫ هناك حاجة إلى تقليم األنسجة لكشف قطعة األنسجة‬:‫ تقليم األنسجة‬. 1
2. Cooling the block: After the initial trimming, the blocks are kept for cooling for 15–
20 min.
.‫ دقيقة‬٢٠-١٥ ‫ تبقى الكتل للتبريد لمدة‬، ‫ بعد التشذيب األولي‬:‫ تبريد البلوك‬-٢
3. Cutting proper: The angle of clearance should be only 2–5° to have good section.
.‫ فقط للحصول على مقطع جيد‬° 5-2 ‫ يجب أن تكون زاوية الخلوص‬:‫ القص الصحيح‬-٣
4. Floating the ribbon: The ribbon of the tissue is floated in the water bath, and this
makes the tissue flat and removes any wrinkling of the tissue. With the help of the
forceps, the individual sections are separated from each other.
‫ وهذا يجعل النسيج مسطح ويزيل أي‬، ‫ يطفو شريط المنديل في الحمام المائي‬:‫ طفو الشريط‬-٤
.‫ يتم فصل األقسام الفردية عن بعضها البعض‬، ‫ بمساعدة الملقط‬.‫تجعد من النسيج‬
5. Picking up the tissue: The slide is placed vertically within the water bath in front of
the tissue,
، ‫النسيج‬ ‫ توضع الشريحة عموديًا داخل حمام مائي أمام‬:‫ التقاط األنسجة‬-٥

6. Drying the section: The slide containing the picked-up section is kept in slide rack.
.‫منزلق‬ ‫ يتم االحتفاظ بالشريحة التي تحتوي على القسم الذي تم التقاطه في رف‬:‫ تجفيف القسم‬.٦
The slides are now kept in hot oven to get dry. The temperature of the oven should be
slightly more than the melting point of the paraffin.
‫ يجب أن تكون درجة حرارة الفرن أكثر بقليل من‬.‫يتم اآلن حفظ الشرائح في فرن ساخن حتى تجف‬
.‫درجة انصهار البارافين‬
Section adhesives
Provided clean slides are used and sections are adequately dried, the problem of
sections detaching from the slide during staining should not occur.
There are occasions when sections may detach from the slide:
1. Exposure to strong alkali solutions during staining
2. Cryostat sections for immunofluorescence, immunohistochemistry
3. Central nervous system (CNS) tissues
4. Sections that are submitted to extreme temperatures
5. Tissues containing blood and mucous
6. Decalcified tissues
‫ يجب أال تحدث مشكلة فصل‬، ٍ‫شريطة استخدام الشرائح النظيفة وتجفيف األقسام بشكل كاف‬
.‫المقاطع عن الشريحة أثناء التلوين‬
:‫هناك مناسبات قد تنفصل فيها األقسام عن الشريحة‬
‫ التعرض لمحاليل قلوية قوية أثناء التلوين‬.1
‫ الكيمياء الهيستولوجية المناعية‬، ‫ أقسام التبريد للتألق المناعي‬. 2
‫ أنسجة الجهاز العصبي المركزي‬-3

‫ المقاطع التي تتعرض لدرجات حرارة قصوى‬-4

‫ األنسجة التي تحتوي على الدم واألغشية المخاطية‬.5
‫ األنسجة منزوعة الكالسيوم‬.6
Adhesives may alleviate the problem of tissue loss. Protein adhesives such as
albumen, gelatin and starch may be prone to bacterial growth or heavy staining;
Adhesives that may be used:
‫ قد تكون المواد الالصقة البروتينية مثل‬.‫قد تخفف المواد الالصقة من مشكلة فقدان األنسجة‬
‫الزالل والجيالتين والنشا عرضة لنمو البكتيريا أو تلطيخها الشديد ؛ المواد الالصقة التي يمكن‬
:‫استخدامها‬
Poly-L-lysine (PLL)
Poly-L-lysine is bought as a 0.1% solution, which is further diluted for use, 1
in 10 with distilled water. Slides are coated with the diluted solution and allowed to
dry. The effectiveness of the coating to adhere the tissue to the slide will diminish
within a few days.
‫ من‬1 ، ‫ والذي يتم تخفيفه أيضًا لالستخدام‬، ٪0.1 ‫ كمحلول‬Poly-L-lysine ‫يتم شراء‬
‫ ستقل فعالية الطالء‬.‫ الشرائح مغلفة بالمحلول المخفف وتترك لتجف‬.‫ بالماء المقطر‬10 ‫كل‬
.‫لاللتصاق باألنسجة بالشريحة في غضون أيام قليلة‬
Problems and solutions

These are the most common problems encountered during microtomy and possible
solutions.
‫المشاكل والحلول‬
‫هذه هي المشاكل األكثر شيوعًا التي يتم مواجهتها أثناء عملية الفحص الدقيق والحلول الممكنة‬
Table.1 Problems and solutions for paraffin sectioning
No. Problem and cause Remedy

1 Ribbon/consecutive sections curved

1. Block edges not parallel 1. Trim block until parallel
2. Dull blade edge 2. Replace blade or move to a different area
3. Excessive paraffin 3. Trim away excess paraffin
4. Tissue varying in consistency 4. Re-orient block
2 Thick and thin sections
1. Paraffin too soft for tissue or conditions 1. Cool block with ice or re-embed in higher
2. Insufficient clearance angle melting point (MP) wax 2. Increase
3. Faulty microtome mechanisms clearance angle
4. Blade or block loose in holders 3. Maintain microtome – lubricate
and calibrate. Check for obvious faults
with microtome, parts may be worn
4. Tighten block and blade
3 Chatter – thick and thin zones parallel to blade
edge
1. Blade or block loose in their holders
2. Excessively steep clearance angle or 1. Tighten blade and block holders
knife tilt 2. Reduce angle
3. Tissue or paraffin too hard for 3. Use softening fluid
sectioning 4. Rehydrate and surface decalcify
4. Calcified areas in tissue 5. Re-embed in fresh paraffin
5. Over-dehydration of the tissue 6. Replace or use new area of blade;
6. Dull blade also clean blade edge to remove excess
paraffin
4 Splitting of sections at right angles to knife 1. Use different part of blade or replace
edge 2. If calcium deposit – surface decalcify
1. Nicks in blade
2. Hard particles in tissue 3. If mineral or other particle, remove with
3. Hard particles in paraffin fine sharp pointed scalpel
5 Sections will not form ribbons
1. Paraffin too hard for sectioning conditions 1. Re-embed in lower melting point paraffin
2. Debris on knife edge 2. Clean with xylene moist cloth
3. Clearance angle incorrect 3. Adjust to optimal angle
6 Sections attach to block on return stroke 1. Increase clearance angle
1. Insufficient clearance angle 2. Clean with xylene moist cloth
2. Debris on blade edge 3. Trim edges of block
3. Debris on block edge 4. Humidify the air around the
4. Static electricity on ribbon microtome; place
static guard or dryer sheets near microtome
7 Incomplete section 1. Re-process tissue block
1. Incomplete impregnation of the tissue 2. Re-embed tissue; make sure
with paraffin orientation is correct and tissue is flat in mold
2. Tissue incorrectly embedded 3. Re-face block, cut deeper into the
3. Sections superficially cut tissue

8 Excessive compression
1. Dull blade 1. Replace blade
2. Paraffin too soft for the tissue 2. Cool block face and re-cut
9 Sections expand or disintegrate on water bath
1. Poor impregnation of tissue 1. Re-process tissue
2. Water temperature too high in flotation bath 2. Turn down the temperature of the
flotation bath
10 Sections roll into a coil instead of remaining 1. Use a new blade
flat on knife edge 2. Reduce blade tilt if clearance angle is
1. Blade dull excessive
2. Rake angle too small 3. Reduce section thickness
3. Section too thick
Frozen and related sections

This section provides a discussion of the methods used to produce sections without
the use of dehydrating and clearing solutions, and in the case of frozen sections,
without embedding media.
Frozen sections have important clinical and research applications. Clinically the use
of frozen sections for intra-operative consultation, Mohs procedures for surgical
margins and sentinel node evaluation has great significance in patient care and
maintenance.

‫‪Lecture 6 Processing of Tissue in Histopathology Laboratory‬‬ ‫‪Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat‬‬
‫يقدم هذا القسم مناقشة للطرق المستخدمة إلنتاج المقاطع دون استخدام محاليل التجفيف والتصفية‬
‫‪ ،‬وفي حالة األقسام المجمدة ‪ ،‬دون تضمين وسائط‪.‬‬
‫تحتوي األقسام المجمدة على تطبيقات سريرية وبحثية مهمة‪ .‬من الناحية السريرية ‪ ،‬فإن استخدام‬
‫األقسام المجمدة لالستشارة أثناء الجراحة ‪ ،‬وإلجراءات موس للهوامش الجراحية وتقييم العقدة‬
‫الخافرة أهمية كبيرة في رعاية المرضى وصيانتهم‪.‬‬
‫‪Uses of frozen sections‬‬

‫‪The production of frozen sections has many applications in routine histology‬‬
‫‪laboratories:‬‬
‫‪• rapid production of sections for intra-operative diagnosis‬‬
‫‪• diagnostic and research enzyme histochemistry for labile enzymes‬‬
‫‪• immunohistochemistry techniques when heat and fixation may inactivate or destroy‬‬
‫‪the antigens‬‬
‫‪• diagnostic and research non-enzyme histochemistry, e.g. lipids and some‬‬
‫‪carbohydrates.‬‬
‫‪• silver demonstration methods, particularly in neuropathology.‬‬
‫إنتاج المقاطع المجمدة له العديد من التطبيقات في مختبرات األنسجة الروتينية‪:‬‬
‫• سرعة إنتاج أقسام للتشخيص أثناء العملية‬
‫• الكيمياء النسيجية التشخيصية والبحثية لإلنزيمات القابلة للتغير‬
‫• تقنيات الكيمياء الهيستولوجية المناعية عندما تؤدي الحرارة والتثبيت إلى تعطيل أو تدمير‬
‫المستضدات‬
‫• الكيمياء النسيجية التشخيصية والبحثية غير اإلنزيمية ‪ ،‬على سبيل المثال الدهون وبعض‬
‫الكربوهيدرات‪.‬‬
‫• طرق إظهار الفضة وخاصة في أمراض األعصاب‪.‬‬
‫‪Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat / Molecular and Medical Microbiology / College of‬‬
‫‪Medicine / Wasit University ameers226@uowasit.edu.iq‬‬
Lecture 7 Staining in Histopathology Laboratory Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat
Staining
Hematoxylin and eosin staining technique functions to recognize different types
of tissues and their morphological changes, especially in cancer diagnosis.
Hematoxylin has a deep blue-purple color and stains nucleic acids by a complex,
incompletely understood reaction. Eosin is pink and stains proteins nonspecifically.
In a typical tissue, nuclei are stained blue, whereas the cytoplasm and extracellular
matrix have varying degrees of pink staining.
‫تعمل تقنية تلطيخ الهيماتوكسيلين واأليوزين على التعرف على األنواع المختلفة من األنسجة وتغيراتها‬
‫ يحتوي الهيماتوكسيلين على لون أزرق أرجواني غامق ويلطخ‬.‫ خاصة في تشخيص السرطان‬، ‫المورفولوجية‬
.‫ يوزين هو بروتينات وردية اللون وبقع غير محدد‬.‫األحماض النووية بتفاعل معقد غير مفهوم بشكل كامل‬
‫ في حين أن السيتوبالزم والمصفوفة خارج الخلية‬، ‫ تكون النوى مصبوغة باللون األزرق‬، ‫في نسيج نموذجي‬
.‫لها درجات متفاوتة من التلوين الوردي‬
Hematoxylin and Eosin stain is the primary diagnostic stain used in histology and
Histopathology including application in the Fine-needle Aspiration Biopsies,
Paraffin Fixed embedded tissue. Hematoxylin is used to demonstrate the nuclear of
the cell and its content, by observing the depth of the color of dye and the time of
sample suspension in the dye.
‫صبغة الهيماتوكسيلين واأليوزين هي البقعة التشخيصية األولية المستخدمة في علم األنسجة والتشريح المرضي‬
‫ يستخدم الهيماتوكسيلين إلظهار‬.‫بما في ذلك التطبيق في خزعات اإلبرة الدقيقة ونسيج البارافين الثابت المدمج‬
.‫نواة الخلية ومحتواها من خالل مالحظة عمق لون الصبغة ووقت تعليق العينة في الصبغة‬
Hematoxylin and eosin are both dyes, and naturally, dyes have a high affinity for
tissues, depending on the Acidity and/or alkalinity of the dyes.
‫ اعتمادًا‬، ‫ فإن األصباغ لها انجذاب كبير لألنسجة‬، ‫ وبطبيعة الحال‬، ‫الهيماتوكسيلين واأليوزين كالهما صبغات‬
.‫ أو قلوية األصباغ‬/ ‫على حموضة و‬
Aim of staining: to identify different tissue components by their color reaction

‫ التعرف على مكونات األنسجة المختلفة من خالل تفاعلها اللوني‬:‫الهدف من التلوين‬
Theory of staining
The staining of tissue elements and pathological products in different colors depend
on a variety of conditions, which are not fully understood.
‫نظرية التلوين‬
‫يعتمد تلطيخ عناصر األنسجة والمنتجات المرضية بألوان مختلفة على مجموعة متنوعة من الحاالت غير‬
.‫المفهومة تما ًما‬
1.The physical theory: held that the dye penetrates the tissue by osmosis, capillary
force, adsorption, absorption, diffusion or by precipitation by acid bases.
‫ أو‬، ‫ أو القوة الشعرية‬، ‫ تنص على أن الصبغة تخترق األنسجة عن طريق التناضح‬:‫ النظرية الفيزيائية‬-1
.‫ أو عن طريق الترسيب بالقواعد الحمضية‬، ‫ أو االنتشار‬، ‫ أو االمتصاص‬، ‫االمتزاز‬
2.The chemical theory: the dye had certain affinities for some portions of the
protoplasm. It was assumed that:
:‫ كان من المفترض أن‬.‫ كانت للصبغة صالت معينة لبعض أجزاء البروتوبالزم‬:‫ النظرية الكيميائية‬-2
a. Certain parts of the cell such as the nuclei were acid and had an affinity for basic
dyes
. b-The cytoplasm was basic and had the affinity for acid dyes.
‫كانت أجزاء معينة من الخلية مثل النوى حمضية ولها انجذاب لألصباغ األساسية‬ .‫أ‬
.‫ كان السيتوبالزم أساسيًا وله صلة باألصباغ الحمضية‬-‫ ب‬.
Staining reactions
1.Direct stain
A. The dye attaches its directly to some tissue components.
B. No mordant is required.
C. The dye is withdrawn from the solution by the tissue.
D. The depth of the color depend on the strength of the solution and the affinity of
the tissue to the dye.
‫ وصمة عار مباشرة‬.1
.‫ تلتصق الصبغة مباشرة ببعض مكونات األنسجة‬-‫أ‬
.‫ ال يلزم الذع‬.‫ب‬
.‫ يتم سحب الصبغة من المحلول بواسطة األنسجة‬-‫ج‬
.‫ عمق اللون يعتمد على قوة المحلول وانجذاب النسيج للصبغة‬-‫د‬
2.Indirect stain
a. Many dyes do not have direct affinity for tissue elements
b. Mordant act as binders between dye and tissue elements.
c. Operating on the principle that the tissue is first impregnated with a chemical
capable of attaching itself to the tissue and subsequently to the dye, the structure
compound is called a lack, which is usually insoluble in neutral solutions used in
micro technique, allowing many complex staining procedures to be carried out.
‫ وصمة عار غير مباشرة‬.2
‫ العديد من األصباغ ليس لها صلة مباشرة بعناصر األنسجة‬.‫أ‬
.‫ تعمل المادة الالصقة كعناصر رابطة بين الصبغة وعناصر األنسجة‬.‫ب‬
ً ‫ تعمل على مبدأ أن األنسجة يتم تشريبها أو‬.‫ج‬
‫ال بمادة كيميائية قادرة على ربط نفسها باألنسجة وبالتالي‬
‫ والذي عادة ما يكون غير قابل للذوبان في المحاليل‬، ‫ يُطلق على مركب التركيب اسم نقص‬، ‫بالصبغة‬
.‫ مما يسمح بالتلوين المعقد اإلجراءات التي يتعين القيام بها‬، ‫المحايدة المستخدمة في التقنية الدقيقة‬
Mordant:
Mordant are salts of heavy metals such as aluminum and ammonium sulfate,
aluminum and potassium sulfate, and ferric and ammonium sulfate.
‫ هي أمالح المعادن الثقيلة مثل األلومنيوم وكبريتات األمونيوم واأللمنيوم‬Mordant ‫مادة‬
.‫وكبريتات البوتاسيوم والحديد وكبريتات األمونيوم‬
• The mordant links the dye more strongly to the tissue.

.‫• يربط الالذع الصبغة بقوة أكبر باألنسجة‬
a. The mordant may be used before staining ( in the fixing fluid ) as in chromate
, mercurial or picric acid fixatives.
b. May be include as a part of the staining technique or in the dye solution itself
( mercury , aluminum , and iron).
‫ يمكن استخدام الماد ة الالصقة قبل التلوين (في سائل التثبيت) كما هو الحال في مثبتات الكرومات أو الزئبق‬.‫أ‬
.‫أو حمض البيكريك‬
.)‫ قد يتم تضمينه كجزء من تقنية التلوين أو في محلول الصبغة نفسه (الزئبق واأللمنيوم والحديد‬.‫ب‬
tissue dye
Direct stain
mordant dye Indirect stain

tissue
Factors influencing staining reactions

1. The components of the fixative used (reaction is intensified with formulas
containing picric acid and potassium dichromate, as in Bouine , Hellys and
Zenkers fluids )
2. pH of the fixative
3. pH of solutions
4. mordant
5. chemical or reagents which produce oxidation or reduction.
‫ مكونات المثبت المستخدم (يتم تكثيف التفاعل مع الصيغ التي تحتوي على حمض البيكريك وثاني‬.1
‫ و‬Hellys ‫ و‬Bouine ‫ كما هو الحال في‬، ‫كرومات البوتاسيوم‬
)Zenkers ‫سوائل‬
‫ الرقم الهيدروجيني للمثبت‬.2
‫ األس الهيدروجيني للحلول‬.3
‫ الذع‬.4
.‫ المواد الكيميائية أو الكواشف التي تنتج األكسدة أو االختزال‬-5
Methods of staining:
Staining methods may be grouped as follows:
1. Vital staining
2. Routine staining
3. Special staining
:‫يمكن تجميع طرق التلوين على النحو التالي‬
‫ تلطيخ حيوية‬.1
‫ تلطيخ الروتيني‬.2
‫ تلطيخ خاص‬.3
Vital staining: vital stain are stains applied to living tissue by injection of staining
solution into some parts of an animal body or by mixing the stain with living cells.
‫ البقعة الحيوية هي البقع التي توضع على األنسجة الحية عن طريق حقن محلول التلوين في‬:‫التلوين الحيوي‬
.‫بعض أجزاء جسم الحيوان أو عن طريق خلط البقعة مع الخاليا الحية‬
Routine staining: A routine stain is one that stains the various tissue elements with
little differentiation between nuclei and cytoplasm, e.g. Hematoxylin and Eosin
stain.
‫ اللطخة الروتينية هي تلك التي تلطخ عناصر األنسجة المختلفة مع القليل من التمايز بين‬:‫التلوين الروتيني‬
.‫ على سبيل المثال صبغة الهيماتوكسيلين واأليوزين‬، ‫النوى والسيتوبالزم‬
Special staining: special or selective staining demonstrate special features of the
tissue, such as bacteria, fungi, or particular cell products. e.g. Fulgen stain for
DNA.
‫ مثل البكتيريا أو الفطريات أو منتجات‬، ‫ تلطيخ خاص أو انتقائي يوضح سمات خاصة لألنسجة‬:‫تلطيخ خاص‬
‫ على سبيل المثال صبغة فولجين لـ‬.‫خلوية معينة‬
.‫الحمض النووي‬
Removal of fixation pigments from slides during staining procedures:

Formalin pigment
1. Dewax the sections, rinse in 100% alcohol, rinse in 70% alcohol, rinse in distilled
water.
2. Treat in saturated alcoholic picric acid for 30 minutes to 2 hours.
3. Wash well in running tap water.
4. If yellow staining of the section persists rinse in dilute lithium carbonate.
5. Rinse in tap water.
6. Continue with method.
:‫إزالة أصباغ التثبيت من الشرائح أثناء إجراءات التلوين‬
‫صبغة الفورمالين‬
‫ اشطفي بالماء‬، ‫ كحول‬٪70 ‫ اشطفي في‬، ٪100 ‫ اشطفي بالكحول‬، ‫ أزيلي شمع المقاطع‬.1
.‫المقطر‬
.‫ دقيقة إلى ساعتين‬30 ‫ عالج بحمض البكريك الكحولي المشبع لمدة‬.2
.‫ يغسل جيدا في ماء الصنبور الجاري‬.3

.‫ اشطفه في كربونات الليثيوم المخفف‬، ‫ إذا استمر تلطيخ القسم باللون األصفر‬. 4
.‫ شطف في ماء الصنبور‬.5
.‫ تواصل مع الطريقة‬.6
Mercury pigment
water.
2. Treat in Lugol's iodine for 2 minutes.
3. Decolourise in 5% sodium thiosulphate for 5 minutes.
4. Wash well in running tap water.
‫صبغة الزئبق‬
.‫المقطر‬
.‫ لمدة دقيقتين‬Lugol ‫ عالج بيود‬.2
.‫ دقائق‬5 ‫ ثيوكبريتات الصوديوم لمدة‬٪5 ‫ قم بإزالة اللون في‬.3
.‫ يغسل جيدا في ماء الصنبور الجاري‬.4
.‫ تواصل مع الطريقة‬.5
Dichromate pigment
water.
2. Treat in 2% HCl in 70% alcohol 16-24 hours.
3. Rinse in tap water.
‫صبغة ثنائي كرومات‬
.‫المقطر‬
.‫ ساعة‬24-16 ‫ كحول‬٪70 ‫ حمض الهيدروكلوريك في‬٪2 ‫ عالج في‬.2
.‫ شطف في ماء الصنبور‬.3
.‫ تواصل مع األسلوب‬.4
Hematoxylin and Eosin (H&E) staining

•Place slides containing paraffin sections in a slide holder (glass or metal)
)‫• ضع الشرائح التي تحتوي على مقاطع البارافين في حامل شرائح (زجاجي أو معدني‬
•Deparaffinize and rehydrate sections:
Xylene I 5 minutes (blot excess xylene before going into ethanol)
Xylene II 5 minutes
100% ethanol 2 minutes
70% ethanol 2 minutes 50%
ethanol 2 minutes deionized
H2O 5 minutes
‫وأقسام‬ Deparaffinize •
:‫ترطيب‬
‫ دقائق (لطخة الزيلين‬5 ‫زيلين أنا‬
)‫الزائد قبل الدخول في اإليثانول‬
‫ دقائق‬5 ‫زيلين الثاني‬
‫ دقيقة‬2 ‫ إيثانول‬٪100
٪50 ‫ دقيقة‬2 ‫ إيثانول‬٪70
‫ دقيقة منزوع األيونات‬2 ‫إيثانول‬
‫ دقائق‬H2O 5
•While sections are in water, skim surface of hematoxylin with a Kim wipe to
remove oxidized particles. Blot excess water from slide holder before going into
hematoxylin.
‫ قم بإزالة سطح الهيماتوكسيلين باستخدام منديل كيم إلزالة‬، ‫• أثناء وجود المقاطع في الماء‬
.‫ امسح الماء الزائد من حامل الشرائح قبل الدخول في الهيماتوكسيلين‬.‫الجسيمات المؤكسدة‬
•Hematoxylin staining:
Hematoxylin 3 minutes
Tap water 5 minutes (to allow stain to develop)
Acid ethanol8-12x (fast Dip) (to de-stain)
Tap water Rinse 2 x 1´
Note :Blot excess water from slide holder before going into eosin.
:‫• تلطيخ الهيماتوكسيلين‬
‫ دقائق‬3 ‫الهيماتوكسيلين‬
)‫ دقائق (للسماح للبقع بالظهور‬5 ‫ماء الصنبور‬
)‫ (تراجع سريع) (إلزالة البقع‬x12-8 ‫حمض اإليثانول‬
´1 × 2 ‫شطف ماء الصنبور‬
.‫ امسح المياه الزائدة من حامل الشرائح قبل الذهاب إلى يوزين‬:‫مالحظة‬
•Eosin staining and dehydration:
Eosin 1 minutes

100% ethanol 2 minutes (blot excess ethanol before going into xylene)
Xylene 2 minutes
Xylene 2 minutes
Dry
:‫• تلطيخ اليوزين والجفاف‬
‫ دقيقة‬1 ‫يوزين‬
)‫ دقيقة (لطخة اإليثانول الزائد قبل االنتقال إلى الزيلين‬2 ‫ إيثانول‬٪100
‫ دقائق‬5 ‫ إيثانول‬٪100
‫ دقيقة‬2 ‫زيلين‬
‫ دقيقة‬2 ‫زيلين‬
‫جاف‬
Types of stains prepared from Hematoxylin:

1-Heidenhains' iron Hematoxylin
2. Harris Hematoxylin
3. Mayer's Hematoxylin
4. Lillies' variant of Mayer's hemalum
5. Ehrlich's Hematoxylin
:‫أنواع البقع المحضرة من الهيماتوكسيلين‬
Heidenhains ‫هيماتوكسيلين الحديد في‬-1
‫ هاريس هيماتوكسيلين‬.2
‫ ماير الهيماتوكسيلين‬.3
hemalum ‫ 'البديل من ماير‬Lillies .4
‫ هيماتوكسيلين إيرليش‬.5
Q/ Troubleshooting of Hematoxylin?
Q/ Troubleshooting of Eosin?
Lecture 8 Special stains in Histopathology Laboratory Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat
Special stains
Objectives
1- Identify different methods used to detect carbohydrates and

mucopolysaccharides (PAS, Microwave alcian blue, microwave alcian blue with
hyaluronidase digestion and Modified Putchler Congo Red Amyloid Method
with/without sodium permanganate oxidation)
، PAS( ‫ تحديد الطرق المختلفة المستخدمة للكشف عن الكربوهيدرات وعديدات السكاريد المخاطية‬-1
Putchler Congo ‫ ميكروويف ألكيان أزرق مع هضم هيالورونيداز وطريقة‬، ‫ميكروويف ألكيان أزرق‬
)‫ بدون أكسدة برمنجنات الصوديوم‬/ ‫ المعدلة مع‬Red Amyloid
2- Describe different methods to detect connective tissue (Masson‘s Trichrome

stain and Verhoeff‘s elastic stain)
)‫المرنة‬ ‫ وصف طرق مختلفة الكتشاف النسيج الضام (بقعة ماسون ثالثية الكروم وبقعة فيرهوف‬-2
3- Identify different methods to detect cytoplasmic and nuclear elements

(Microwave orcein method for hepatitis b surface antigen and Toluidine blue
method for mast cells)
‫ تحديد طرق مختلفة للكشف عن العناصر السيتوبالزمية والنووية (طريقة الميكروويف أورسين لمستضد‬. ٣
)‫التهاب الكبد ب السطحي وطريقة تولويدين الزرقاء للخاليا البدينة‬
4- Describe different methods to detect pigments and metals (Microwave

Rhodanine copper method and Perl‘s method for ferric iron).
‫ وصف طرق مختلفة للكشف عن األصباغ والمعادن (طريقة الميكروويف رودانين النحاس وطريقة بيرل‬. ٤
)‫للحديد الحديدي‬
5- Identify different methods to detect nerve cells and fibers (Thioflavin S

method for amyloid in neurofibrillary plaques)
‫ لألميلويد في لويحات‬Thioflavin S ‫ تحديد طرق مختلفة للكشف عن الخاليا العصبية واأللياف (طريقة‬-5
)‫الليف العصبي‬
Special stains (histochemical methods) are used to help visualize and/or identify
structures and substances in sections.
.‫ أو تحديد الهياكل والمواد في األقسام‬/ ‫تُستخدم البقع الخاصة (طرق الكيمياء النسيجية) للمساعدة في تصور و‬
Classification of stain Trichrome stains
Special stains are only done in order to obtain the additional or more detailed
information of the tissues.
Classification of stain:
.‫يتم عمل البقع الخاصة فقط من أجل الحصول على معلومات إضافية أو أكثر تفصيالً عن األنسجة‬
:‫تصنيف البقعة‬
1. Stain for Carbohydrates:
a) Acid blue
b) Periodic Acid-Schiff (PAS).
:‫ وصمة عار للكربوهيدرات‬.1
‫أ) األزرق الحمضي‬

.)PAS( ‫ب) حمض شيف الدوري‬
2. Stain for Connective Tissue:
a) Collagen fibers (Masson's trichrome, Mallory trichrome, Gomeri's

trichrome.
b) Elastic fibers (Verhoef-Van Gieson, Weigert's Resorcin-
Fuchsin, Orcein (O).
c) Reticular fibers (Silver impregnation: Wilder, Gordon and Sweet).
:‫ وصمة عار لألنسجة الضامة‬.2
.‫ ثالثي ألوان جوميري‬، ‫ ثالثي األلوان مالوري‬، ‫أ) ألياف الكوالجين (ثالثي ألوان ماسون‬
-Weigert's Resorcin ‫ و‬Verhoef-Van Gieson( ‫ب) األلياف المرنة‬
.)O( ‫ أورسين‬، ‫فوشسين‬
.)‫ وايلدر وجوردون وسويت‬:‫ج) ألياف شبكية (التشريب الفضي‬
3. Lipids (Sudan III,IV, black, Oil red O).
.)O ‫ الزيت األحمر‬، ‫ األسود‬، ‫ الرابع‬، ‫ (السودان الثالث‬-٣
4. Minerals:
a) (Ca: von Kossa, Alizarin red S,
b) Cu: p- Dimethylaminobenzidine, rhodamine (DMABR).
:‫المعادن‬ -٤
، Ca: von Kossa ، Alizarin red S( )‫أ‬
.)DMABR( ‫ رودامين‬، ‫ ثنائي ميثيل أمينوبنزيدين‬-‫ ف‬:‫ب) النحاس‬
5. Nucleic acids (Hematoxilin, Feulgen stain, Ethyl green-Pyronin-Y, nuclear fast
red, crystal violet, cresyl violet acetat).
، ‫ األحمر السريع النووي‬، Y -‫ بيرونين‬- ‫ الميثيل األخضر‬، ‫ صبغة فولجن‬، ‫ األحماض النووية (الهيماتوكسيلين‬-5
.)‫ الكريسيل البنفسجي أسيتات‬، ‫البنفسجي الكريستالي‬
6. Pigments:
a) Iron (Prussian Blue)
b) Melanine (Masson-Fontana silver, Schmorl's ferricyanide)
:‫ أصباغ‬.٦
)‫أ) الحديد (األزرق البروسي‬
)‫ فيري سيانيد شمورل‬، ‫ب) الميالنين (فضية ماسون فونتانا‬
Trichrome stains
The trichrome stain is one of the most utilized special stains in the Histopathology
laboratory. The trichrome stain is utilized as the stain of choice of distinguishing
histologic changes in tumors, connective tissue diseases, muscle and fibroblast
tumors, renal diseases and dermatology cases. Trichrome stains be used to contrast
skeletal, cardiac or smooth muscle. Trichrome stains are particularly useful for
‫‪Lecture 8 Special stains in Histopathology Laboratory‬‬ ‫‪Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat‬‬
‫‪endocrine organs in which cells that produce different secretions can be stained‬‬
‫‪different colors. Widely utilized techniques are the:‬‬
‫استخداما في مختبر التشريح المرضي‪ .‬يتم استخدام‬

‫ً‬ ‫تعد بقعة الترايكروم واحدة من أكثر البقع الخاصة‬
‫صبغة الترايكروم كصمة مفضلة للتمييز بين التغيرات النسيجية في األورام وأمراض النسيج الضام وأورام‬
‫العضالت واألرومة الليفية وأمراض الكلى وحاالت األمراض الجلدية‪ .‬تستخدم بقع الترايكروم لمق ارنة‬
‫العضالت الهيكلية أو الق لبية أو الملساء‪ .‬تعتبر بقع الترايكروم مفيدة بشكل خاص ألعضاء الغدد الصماء‬
‫حيث يمكن تلوين الخاليا التي تنتج إفرازات مختلفة بألوان مختلفة‪ .‬التقنيات المستخدمة على نطاق‬
‫واسع هي‪:‬‬
‫‪1.‬‬ ‫‪Masson‬‬
‫‪2.‬‬ ‫‪Gomori‬‬
‫‪3.‬‬ ‫‪Martius scarlet Blue‬‬
‫‪4.‬‬ ‫‪Mallory.‬‬
‫‪ .1‬ماسون‬
‫‪ .2‬جوموري‬
‫‪ .3‬مارتيوس القرمزي األزرق‬
‫‪ .4‬مالوري‪.‬‬
The Gomori Trichrome is a simplification of the more elaborate Masson stain and
combines the plasma stain (chromotrope 2R) with the connective tissue stain to
provide a brilliant contrasting picture.
)R2 ‫ األكثر تفصيالً ويجمع بين بقعة البالزما (كروموتروب‬Masson ‫ هو تبسيط لصبغة‬Gomori Trichrome
.‫وصبغة النسيج الضام لتوفير صورة متناقضة رائعة‬
Stain Cell components color Uses
Collagen blue
red, early - yellow, old - blue

Martiu Fibrin
s Stain for
scarlet connective tissue
Muscle red
Blue and fibrin
nuclei blue/black
Red blood yellow

cells
keratin and red
muscle fibers Used to
Masson's collagen and blue or green differentiate
trichrom bone between
cytoplasm light red or pink collagen and
e smooth muscle
cell nuclei dark brown to black in tumor
connective blue
Mallory tissue
collagen Stain for
trichrom nuclei and red Collagen fibers
cytoplasm
e blood cells
(erythrocytes)
yellow
nucleus blue
Gomori' collagen Used to
s blue muscle, red distinguish
keratin & collagen
cytoplasm from
nuclei grey/blue/black muscle
tissue
Stains Nuclei Blue
Collagen Green Stain for diseases

Gomori' of
Muscle Fiber Green
s C.T &
Green muscle
characterized
by
fibrotic and
dystrophic
changes and to
differentiate
between
collagen and
smooth
muscle in tumors
Figure . Muscle and collagen demonstrated by Masson
Trichrome in gastrointestinal tract. 20X

Figure 16: Gomori Trichrome (green) (submucosa).
Figure 15: Gomori Trichrome (blue) (submucosa)

Figure Masson's Trichrome (skin). This stain is intended for use

in histological observation of collagenous connective tissue
fibers in tissue specimens. It is used to assist in differentiating
collagen and smooth muscle in tumors and assists in the
detection of diseases or changes in connective/muscle tissue.

Embedding of Tissue in Histopathology

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Embedding of Tissue in Histopathology

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Lecture 5 Embedding of Tissue in Histopathology Assistant Lecturer: Ameer S.

Embedding of Tissue in Histopathology

2. Stainless Still Mould

‫ قوالب ليكارت للتضمين‬.1

‫ قالب من الفوالذ المقاوم للصدأ‬.2

Tissue Embedding Method

1. Dispenser of liquid paraffin in a constant temperature

The cutting surface should be faced down.

.‫• يُسكب البارافين المصهور على القالب المعدني‬

‫‪ .4‬يجب وضع األنسجة الطويلة الخطية بشكل مائل‪.‬‬

‫‪ .5‬يجب وضع خزعة العضالت في المستويين الطولي والعرضي‪.‬‬

Open one cassette

• Soft mushy tissue:

• Not adequately processed.

:‫• األنسجة اللينة الطرية‬

2- Place cassettes in tetrahydrofuran for 30 to 90 min to allow the

3- Place sections in xylene for 10 min to ensure adequate clearing.

‫ دقيقة‬30 ‫ إلى‬20 ‫ نقع األنسجة في زيلين لمدة‬-1

Sections may be incorrectly oriented at the embedding station. The Can be

• Small pieces or fragments of tissue may be carried from 1 tissue to the

• Carefully cleaning forceps between specimens

‫• تنظيف الملقط بعناية بين العينات‬

.‫• فتح الكاسيت فقط مع األنسجة المراد دمجها‬

‫• األنسجة غير مدمجة في نفس المستوى‬

.‫• الضغط على األنسجة ألسفل بشكل موحد‬

‫منصهرا بدرجة كافية لتضمين جميع القطع في نفس المستوى‬

‫• العمل بسرعة كبيرة عند تضمين عدة قطع‬

‫• قطع من األنسجة مفقودة من الكتلة‬

:‫• يمكن منعه من خالل‬

• Carefully checking the lid of the cassette before discarding.

.‫• تسجيل عدد القطع المراد تضمينها‬

Tissue Microtome: Principle and procedure

The different types of microtomes in the traditional histology laboratory are:

:‫األنواع المختلفة من الميكروتومات في مختبر األنسجة التقليدي هي‬

Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat / Molecular and Medical Microbiology / College of

1- Rotary microtome: Most commonly used microtome for routine histopathology.

1- The ability to cut thin 2–3 μm sections .

2- Easy adaption to all type of tissue (hard, fragile or fatty) sectioning.

Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat / Molecular and Medical Microbiology / College of

3-Rotary rocking microtome: Commonly used in cryostats.

.‫ يشيع استخدامه في كريوستات‬:‫مشراح هزاز دوار‬-3

4-Sliding microtome: This microtome was developed for use with

5- Ultra-microtome: Used exclusively for electron microscopy.

.‫ يستخدم حصريًا في الفحص المجهري اإللكتروني‬:‫ ميكروتوم فائق‬-5

Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat / Molecular and Medical Microbiology / College of

Factors Involved in Cutting

1. Temperature: Lowering the temperature facilitates section cutting.

.‫ خفض درجة الحرارة يسهل عملية القطع المقطعي‬:‫درجة الحرارة‬.1

The following instruments are essential for section cutting:

1. Microtome with blade

Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat / Molecular and Medical Microbiology / College of

5. A blunt forceps or camel brush

:‫األدوات التالية ضرورية لقص المقطع‬

‫ كتلة البارافين مع األنسجة المدمجة لقطع‬.3

‫ ملقط حاد أو فرشاة جمل‬.5

‫ انزالق الرف مع الشرائح‬.6

Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat / Molecular and Medical Microbiology / College of

Steps of Tissue Sectioning

Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat / Molecular and Medical Microbiology / College of

Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat / Molecular and Medical Microbiology / College of

‫ المقاطع التي تتعرض لدرجات حرارة قصوى‬-4

Problems and solutions

Assistant Lecturer: Ameer S. Alkhayyat / Molecular and Medical Microbiology / College of