PREPARATION OF

HISTOLOGICAL SPECIMENS #‫تحضير العينات الهيستولوجية‬

• Histology is the study of tissues and how these

tissues are arranged into organs
• Histo in Greek means tissue or web
• Tissues consist of cells and extra cellular
matrix
• The function of the tissue depends on the
interaction between cells and extracellular
matrix.
• The small size of cells and matrix content make
the study of tissues dependent on microscope
 ‫‪and other advances in biological techniques‬‬ ‫علم األنسجة‬
‫هو دراسة األنسجة وكيفية ترتيب هذه األنسجة في األعضاء‬

‫•‬ ‫• هيستو في اليونانية وتعني النسيج أو الويب‬

‫•‬ ‫• تتكون األنسجة من خاليا ومصفوفة خلوية إضافية‬

‫•‬ ‫• وظيفة النسيج تعتمد على التفاعل بين الخاليا والمصفوفة خارج الخلية‪.‬‬

‫•‬ ‫• إن صغر حجم الخاليا ومحتوى المصفوفة يجعل دراسة األنسجة تعتمد على المجهر والتطورات األخرى في التقنيات البيولوجية‬

‫‪TISSUE PREPARATION‬‬ ‫تحضير األنسجة‬

‫‪• The most widely used method of studying‬‬

‫‪tissues is using histological slides.‬‬
‫‪• The tissue in the slide must reflect the actual‬‬
‫‪nature of the tissue in the body‬‬
‫‪• To insure that, tissues to be studied must pass‬‬
‫‪through a series of steps before examination‬‬
 ‫‪• These steps are in sequential order‬‬
‫‪• Fixation is a complex series of chemical events‬‬
‫‪that differ for the different groups of substance‬‬
‫‪found in tissues.‬‬ ‫الطريقة األكثر استخدا ًما لدراسة األنسجة هي استخدام الشرائح النسيجية‪.‬‬

‫•‬ ‫• يجب أن يعكس النسيج الموجود في الشريحة الطبيعة الفعلية لألنسجة في الجسم‬

‫•‬ ‫• للتأك د من أن األنسجة المراد دراستها يجب أن تمر بسلسلة من الخطوات قبل الفحص‬

‫•‬ ‫• هذه الخطوات بالترتيب التسلسلي‬

‫•‬ ‫• التثبيت هو سلسلة معقدة من األحداث الكيميائية التي تختلف باختالف مجموعات المواد الموجودة في األنسجة‪.‬‬

‫‪TISSUE FIXATION‬‬ ‫تثبيت األنسجة‬

‫‪Aim of Fixation:‬‬ ‫الهدف من التثبيت‪:‬‬

‫‪1- To prevent autolysis and bacterial attack.‬‬ ‫منع التحلل الذاتي والهجوم‬
‫البكتيري‬
2- To fix the tissues so they will not change their
volume and shape during processing. ‫تثبيت األنسجة حتى ال تغير حجمها وشكلها‬
.‫أثناء المعالجة‬

3- To prepare tissue and leave it in a condition

which allow clear staining of sections. ‫لتحضير األنسجة وتركها في حالة تسمح‬
.‫بتلوين األجزاء بشكل واضح‬

4- To leave tissue as close as their living state as

possible, and no small molecules should be
lost. .‫ ويجب عدم فقد أي جزيئات صغيرة‬، ‫ترك األنسجة أقرب ما يمكن إلى حالتها المعيشية‬

•Fixation is a reaction between the fixative and

proteins in the specimen which form a gel, so
keeping every thing as their in vivo relation to each
‫ لذلك الحفاظ على كل شيء مثل عالقته في الجسم الحي مع كل‬، ‫التثبيت هو تفاعل بين المثبت والبروتينات في العينة التي تشكل مادة هالمية‬
 ‫‪Types of Fixative‬‬ ‫أنواع المثبت‬

‫‪• Acetic acid‬‬ ‫حمض االسيتيك‬

‫‪• Formaldehyde 10%‬‬ ‫الفورمالديهايد‬

‫‪• Ethanol‬‬ ‫اإليثانول‬

‫‪• Glutaraldehyde‬‬ ‫الجلوتارالدهيد‬

‫‪• Methanol‬‬ ‫الميثانول‬

‫‪• Picric acid‬‬ ‫حمض البكريك‬

‫)‪• Osmic acid (Osmium tetroxide‬‬ ‫حمض األوزميك (رباعي أكسيد األوزميوم)‬

‫‪TISSUE PROCESSING‬‬ ‫معالجة األنسجة‬

‫‪• Aim:‬‬ ‫هدف‬

 Is to embed the tissue in a solid medium firm
enough to support the tissue and give it
sufficient rigidity to enable thin sections to
be cut , and yet soft enough not to damage
the knife or tissue. ‫يتم تضمين األنسجة في وسط صلب قوي بما يكفي لدعم األنسجة وإعطائها صالبة كافية لتمكين قطع األجزاء‬
.‫ ومع ذلك فهي ناعمة بدرجة كافية حتى ال تتلف السكين أو األنسجة‬، ‫الرقيقة‬

• Stages of processing:
1.Dehydration.
2- Clearing.
3- Embedding. :‫مراحل المعالجة‬

1- .‫ المقاصة‬-2 .‫الجفاف‬
2- .‫التضمين‬
 Dehydration ‫تجفيف‬

• To remove fixative and water from the tissue

and replace them with dehydrating fluid.
• Delicate specimens are dehydrated in a
graded ethanol series from water through
10%-20%-50%-95%-100% ethanol to minimize
tissue distortion from diffusion currents.
• In the paraffin method, dehydration from
aqueous fixatives is usually initiated in
60%70% ethanol, progressing through 90%-
95% ethanol, absolute ethanol before
proceeding to the clearing stage. ‫إزالة المثبت والماء من األنسجة واستبدالها بسائل‬
.‫التجفيف‬

• .‫ إيثانول لتقليل تشوه األنسجة الناتج عن تيارات االنتشار‬٪100- ٪95- ٪50- ٪20- ٪10 ‫• يتم تجفيف العينات الدقيقة في سلسلة متدرجة من اإليثانول من الماء من خالل‬
Types of dehydrating agents ‫أنواع عوامل التجفيف‬

• Ethanol
• Methanol
• Acetone ‫• • الميثانول اإليثانول‬ ‫األسيتون‬

• Tissues may be held and stored indefinitely

in 70% ethanol without harm ٪70 ‫يمكن االحتفاظ بالمناديل وتخزينها إلى أجل غير مسمى في‬
‫من اإليثانول دون ضرر‬

Clearing ‫المقاصة‬

• Replacing the dehydrating fluid with a fluid

that is totally miscible with both the
 dehydrating fluid and the embedding
medium.
• Choice of a clearing agent depends upon
many factors .‫استبدال سائل التجفيف بسائل قابل لالمتزاج تما ًما مع كل من سائل التجفيف ووسط الدمج‬

•‫• يعتمد اختيار وكيل المقاصة على العديد من العوامل‬

Types of Clearing Agents

• Xylene.
• Toluene.
• Chloroform.
• Benzene.
• Propylene oxide ‫أنواع وكالء المقاصة‬

• .‫• زيلين‬

• .‫• التولوين‬

• .‫• الكلوروفورم‬

• .‫• البنزين‬

• • ‫أكسيد البروبيلين‬

Embedding ‫التضمين‬

• Is the process by which tissues are

surrounded by a medium such as agar,
gelatin, or wax which when solidified will
provide sufficient external support during
sectioning.
 ‫‪• A substances added alone or in combination‬‬
‫‪to the wax to:‬‬
‫‪Improve ribboning.‬‬
‫‪Increase hardness.‬‬
‫‪Decrease melting point‬‬
‫‪Improve adhesion between specimen and‬‬
‫‪wax‬‬
‫هي العملية التي يتم من خاللها إحاطة األنسجة بوسائط مثل األجار أو الجيالتين أو الشمع والتي عند تصلبها ستوفر دع ًما خارجيًا كافيًا أثناء التقسيم‪.‬‬
‫• مادة مضافة منفردة أو مجتمعة إلى الشمع من أجل‪:‬‬
‫تحسين الشريط‪.‬‬
‫زيادة الصالبة‪.‬‬
‫تقليل نقطة االنصهار‬
‫تحسين االلتصاق بين العينة والشمع‬

‫‪Embedding Moulds‬‬ ‫قوالب التضمين‬

‫‪A. paper boat mould‬‬ ‫قالب القارب الورقي‬

‫‪B. metal boat mould‬‬ ‫قالب قارب معدني‬

C. Dimmock embedding
mould
D. Peel-a-way disposable
mould
E. Base mould used with
embedding ring ( F) or
cassette bases (G)
F. ‫جيم تضمين القالب‬Dimmock

G.D. Peel-a-way ‫العفن القابل للتصرف‬

H.( ‫ قالب القاعدة المستخدم مع حلقة التضمين‬-‫هـ‬F) ( ‫أو قواعد الكاسيت‬G

CUTTING

• using the microtome

• A microtome is a mechanical instrument
used to cut biological specimens into very
thin sections for microscopic examination.
• Most microtomes use a steel blade and are
used to prepare sections of animal or plant
tissues for histology.
‫القطع‬
‫•‬ ‫• استخدام المشراح‬

‫•‬
‫•‬ ‫• الميكروتوم هو أداة ميكانيكية تستخدم لتقطيع العينات البيولوجية إلى أقسام رفيعة جدًا للفحص المجهري‪.‬‬

‫•‬ ‫ً‬
‫نصال فوالذيًا وتستخدم لتحضير أقسام من األنسجة الحيوانية أو النباتية من أجل علم األنسجة‪.‬‬ ‫• تستخدم معظم الميكروتومات‬

‫‪Microtome knives‬‬
‫‪• STEEL KNIVES‬‬
‫‪• NON-CORROSIVE KNIVES FOR CRYOSTATS‬‬
‫‪• DISPOSABLE METAL BLADES‬‬
‫‪• GLASS KNIVES‬‬
‫‪• DIAMOND KNIVES‬‬ ‫• شفرات معدنية يمكن • سكاكين غير قابلة للتآكل للكريوستات • سكاكين من الصلب سكاكين مشراح‬
‫• سكاكين الماس • سكاكين زجاجية التخلص منها‬
 STAINING ‫تلطيخ‬

Hematoxylin and Eosin (H & E)

• H & E is a charge-based, general purpose stain.
‫‪• Hematoxylin stains acidic molecules shades of‬‬
‫‪blue.‬‬
‫‪• Eosin stains basic materials shades of red, pink‬‬
‫‪and orange.‬‬
‫‪• H & E stains are universally used for routine‬‬
‫‪histological examination of tissue sections.‬‬

‫الهيماتوكسيلين ويوزين (‬ ‫)‪H & E‬‬

‫عبارة عن صبغة لألغراض العامة قائمة على الشحن‪• H & E .‬‬
‫• الهيماتوكسيلين يصبغ الجزيئات الحمضية بظالل زرقاء‪.‬‬
‫• بقع يوزين المواد األساسية بظالل من األحمر والوردي والبرتقالي‪.‬‬
‫بشكل عام للفحص النسيجي الروتيني ألقسام األنسجة‪ •H & E .‬تستخدم بقع‬
 Staining Procedure
• Deparaffinize and hydrate to water
• If sections are Zenker-fixed, remove the mercuric
chloride crystals with iodine and clear with sodium
thiosulphate (hypo)
• Mayer's hematoxylin for 15 minutes
• Counterstain with eosin from 15 seconds to 2 minutes
depending on the age of the eosin, and the depth of the
counterstain desired
• Dehydrate in 95% and absolute alcohols, two changes of
2 minutes each or until excess eosin is removed
• Clear in xylene, two changes of 2 minutes each
• Mount in Permount or Histoclad
• ‫إجراء تلطيخ‬
‫•‬ ‫وترطيب في الماء ‪• Deparaffinize‬‬
‫•‬ ‫فقم بإزالة بلورات كلوريد الزئبق باستخدام اليود وتنظيفها باستخدام ثيوكبريتات الصوديوم (هيبو) ‪ •Zenker ،‬إذا كانت المقاطع مثبتة من قبل‬

‫•‬ ‫• ماير الهيماتوكسيلين لمدة ‪ 15‬دقيقة‬

‫•‬ ‫• مضاد لإليوزين من ‪ 15‬ثانية إلى دقيقتين حسب عمر اإليوزين ‪ ،‬وعمق البقعة المضادة المرغوبة‬

‫•‬ ‫• الجفاف في ‪ ٪95‬والكحول المطلق ‪ ،‬تغييران من‬

‫•‬ ‫دقيقتان لكل منهما أو حتى يتم إزالة يوزين الزائد‬

‫•‬ ‫• واضح في زيلين ‪ ،‬تغييرين لمدة دقيقتين لكل منهما‬

‫•‬ ‫• جبل في‬ ‫‪Histoclad‬أو ‪Permount‬‬

 Staining machine ‫آلة تلطيخ‬

• Basic dyes stain:

 ‫‪Heterochromatin‬‬
‫‪Nucleic acids‬‬
‫‪Ribosomes‬‬
‫‪Cartilage‬‬
‫بقع األصباغ األساسية‪:‬‬
‫الهيتروكروماتين‬
‫احماض نووية‬
‫الريبوسومات‬
‫غضروف‬

‫‪• Acidic dyes stain:‬‬

‫‪Filaments‬‬
‫‪Mitochondria‬‬
‫‪Collagen‬‬
‫‪Muscle‬‬ ‫‪fibers‬‬
‫بقع األصباغ الحمضية‪:‬‬
‫شعيرات‬
‫الميتوكوندريا‬
‫الكوالجين‬
‫ألياف عضلية‬
 Additional Dyes
• Many tissue components can not be stained
with (Hematoxylene and Eosin).
• Other dyes are used to specifically stain
certain tissue components Resorcin-Fuchsin
for elastic fibers
Silver stain for reticular fibers and
basement membrane
Periodic-Acid Schiff (PAS) Reaction for
CHO
‫أصباغ إضافية‬
‫• ال يمكن تلطيخ العديد من مكونات األنسجة بـ (الهيماتوكسيلين واأليوزين)‪.‬‬
‫لأللياف المرنة ‪ •Resorcin-Fuchsin‬تستخدم أصباغ أخرى لتلطيخ بعض مكونات األنسجة على وجه التحديد‬
‫صبغة فضية لأللياف الشبكية و‬
‫الغشاء القاعدي‬