Cách xác định tương tác

Tương tác giữa các thành phần polyphenol của cacao và protein sữa đã được nghiên cứu bằng cách
sử dụng một mô hình đơn giản thu được bằng cách ủ các casein riêng lẻ trong sữa và WP với chiết
xuất polyphenol ca cao và với các tiêu chuẩn polyphenol. Protein được hòa tan trong 5 mM ammo
nium bicarbonate (AMBIC) ở pH 6,8 (gần với pH của sữa), ở nồng độ lần lượt là 5,4 mg / mL, 5,7 mg /
mL và 2,9 mg / mL đối với casein, whey protein và β-Lg. Chiết xuất polyphenol ca cao và các
polyphenol riêng lẻ được hòa tan trong metanol và được thêm vào với lượng dư gấp 10 lần số mol
so với protein. Hỗn hợp protein - polyphenol được ủ ở 37 ° C và sự tương tác được theo dõi trong 0-
48 giờ bằng các xét nghiệm hoạt tính chống oxy hóa và phân tích khối phổ.

Bước đầu để nghiên cứu sự tương tác của polyphenol với protein sữa, thành phần polyphenol của
các mẫu ca cao thương mại được sử dụng trong nghiên cứu này được xác định bằng LC – MS / MS
(không được hiển thị). Sắc ký đồ TIC của chiết xuất polyphenol ca cao cho thấy tất cả các hợp chất dự
kiến được mô tả trước đây trong ca cao (Cooper và cộng sự, 2007; Hammerstone, Lazarus, Mitchell,
Rucker, & Schmitz, 1999), bao gồm catechin và epicatechin và procyanidins oligomeric.

Một lượng nhỏ axit protocatechuic, axit chlorogenic và các este glucoside của apigenin, naringenin,
kampferol, luteolin và quercetin cũng được phát hiện. Do sự phức tạp của hỗn hợp sữa / ca cao, một
nghiên cứu mô phỏng mô phỏng đã được thiết lập sơ bộ để trộn các hợp chất polyphenol đơn lẻ
(catechin, epicatechin, và proanthocyanidins oligomeric) cũng như với các hợp chất chiết xuất từ bột
ca cao với các phân đoạn protein sữa bò cô lập (casein , whey protein và β-Lg). Các hỗn hợp được ủ
ở 37 ° C trong khoảng thời gian từ 0 đến 24 giờ và các phần nhỏ được lấy trong các khoảng thời gian
để phân tích MS và xét nghiệm antioxi dant.

Tổng hoạt tính chống oxy hóa

Để đo lường những thay đổi của tổng khả năng chống oxy hóa được xác định bằng tương tác
polyphenol / protein, các xét nghiệm ABTS được thực hiện sau khi ủ casein, whey protein hoặc β-Lg
với các polyphenol riêng lẻ và tổng số polyphenol chiết xuất từ ca cao.

Hình 2 cho thấy hoạt động chống oxy hóa bằng xét nghiệm ABTS đối với polyphenol được ủ với các
phân đoạn protein sữa tinh khiết. Trong hỗn hợp casein / polyphenol (Hình 2a), hoạt tính chống oxy
hóa giảm đáng kể (pb 0,05) sau 24 giờ ủ, do đó cho thấy ảnh hưởng đáng kể của casein đối với hoạt
động của polyphenol. Sự giảm này rõ ràng hơn trong trường hợp casein được ủ với catechin hoặc
epicatechin.

Hình 2b – c cho thấy kết quả của xét nghiệm ABTS sau khi ủ các phenol riêng lẻ với whey protein và
với β-Lg tinh khiết, tương ứng. Trong cả hai trường hợp, xu hướng hoạt động chống oxy hóa sau 24
giờ ủ tương tự như xu hướng quan sát được đối với casein, cũng cho thấy trong trường hợp này là
sự tương tác giữa protein / polyphenol làm giảm hoạt động chống oxy hóa của hệ polyphenol bằng
cách trừ đi các polyphenol tự do. Điều thú vị là mức giảm này rõ ràng hơn trong trường hợp chỉ có β-
Lg. Những dữ liệu này phù hợp tốt với các báo cáo trước đây (Stojadinovic và cộng sự, 2013)

Đặc điểm của tương tác pro-poly

Các hỗn hợp được phân tích trước đây về hoạt tính chống oxy hóa được đặc trưng bởi khối phổ. Sự
hình thành phức hợp protein-polyphenol cộng hóa trị phụ thuộc vào thời gian lần đầu tiên được
nghiên cứu bởi MALDI-TOF-MS trên cơ sở sự gia tăng khối lượng protein.
Phổ khối lượng MALDI-TOF của các ca cao được ủ đã cho thấy bất kỳ ống quảng cáo ổn định nào
giữa các cazein riêng lẻ không với catechin / epicatechin cũng như với các polyphenol ca cao chiết
xuất.

Trong hệ thống whey protein / polyphenol, khối phổ cho thấy không có phản ứng của α-La với chiết
xuất từ polyphenol ca cao, catechin hoặc epicatechin trong thời gian ủ 24-48 giờ (Hình 3). Thay vào
đó, cùng một phổ cho thấy phản ứng đáng kể đối với β-Lg (cả hai biến thể A và B, khối lượng phân tử
lần lượt là 18.367 Da và 18.281 Da) đối với catechin hoặc epicatechin, tinh khiết hoặc có trong dịch
chiết ca cao

Trên thực tế, sau khi ủ với polyphenol ca cao (Hình 4), khối lượng tăng 288 Da (18,655 Da cho biến
thể A và 18,569 Da cho biến thể B) đã được quan sát thấy trong khối lượng phân tử protein, tương
ứng với việc bổ sung một epicatechin hoặc phân tử catechin.

Ngoài ra, phổ được thực hiện ở các thời gian ủ khác nhau cho thấy sự tương tác giữa β-Lg và
polyphenol có thể phát hiện được bắt đầu từ 4 giờ ủ. Vào thời điểm đó, sự phong phú tương đối của
các sản phẩm bổ sung β-Lg / polyphenol vẫn thấp hơn nhiều so với các protein tự nhiên. Sự phong
phú của các sản phẩm trong nhàu theo thời gian ủ. Những phát hiện này cũng loại trừ rằng các ion
quan sát được là do các hiện vật tạo tác cụm của phân tích MALDI.