Phần lõi của cấu trúc DNA sẽ được đưa vào sinh vật chủ được chọn rõ ràng

là phần
chứa thông tin cho phân tử chymosin. Điều này có thể thu được bằng cách phân lập và
làm giàu RNA thông tin (mRNA) của sản phẩm mong muốn, sau đó chuyển đổi thành
DNA sợi kép. Điều này có thể đạt được bằng cách sử dụng enzyme sao chép ngược và
DNA polymerase. Để tiết ra enzyme vào môi trường lên men, một trình tự DNA mã
hóa trình tự thủ lĩnh được đặt trước gen chymosin. Cùng với trình tự trình tự trình tự
xúc tiến và trình tự kết thúc thích hợp, điều này sẽ tạo thành 'băng' cho sự biểu hiện
của chymosin. Một băng như vậy có thể được kết hợp vào một plasmid của sinh vật
chủ. Hệ thống biểu hiện dựa trên plasmid có thể rất không ổn định. Sẽ tốt hơn nếu gen
bắt buộc được tích hợp vào nhiễm sắc thể của vật chủ. Một hệ thống như vậy sẽ ổn
định hơn và sẽ mang lại một lợi thế quan trọng. Để tích hợp trong nhiễm sắc thể K.
lactis, vị trí của gen lactase đã được chọn. Để có thể chọn các tế bào K. lactis riêng lẻ
mà cấu trúc đã được tích hợp, một điểm đánh dấu lựa chọn đã được kết hợp. Ví dụ
điển hình của một trong những vectơ này được thể hiện trong Hình 5.5 Đối với các
phần chức năng khác nhau của vector biểu thức, có một số tùy chọn cho cấu trúc thực
tế. Hãy để chúng tôi xem xét bốn trong số này: Nên sử dụng gen nào - gen đó cho
chymosin hoặc pro-chymosin? Sự lựa chọn phải được thực hiện là liệu trình tự cho
enzym hoạt động hoặc cho pro-chymosin sẽ được sử dụng. Chymosin thúc đẩy quá
trình phân giải protein, có thể (trong quá trình lên men, thu hồi và bảo quản) gây ra
những xáo trộn đối với sinh vật sản xuất và sự phân hủy tự xúc tác của chính enzym.
Pro-chymosin không hoạt động, và do đó không có những nhược điểm này. Một khía
cạnh khác liên quan đến việc lựa chọn gen là tính không đồng nhất của chymosin. Hãy
nhớ rằng có hai dạng (A và B) được tìm thấy ở bê. Trong pho mát, có rất ít sự khác
biệt giữa hai hình thức. Trên thực tế, các sản phẩm thương mại đã được phát triển dựa
trên cả hai dạng A và B.

Trình tự dẫn đầu của protein nào cho quá trình tiết tốt nhất?

Một số trình tự dẫn đầu của protein đã được thử nghiệm để chỉ đạo sự bài tiết pro-
chymosin của K. lactis. Trước hết, trình tự tín hiệu tương đồng của chymosin đã được
thử. Pro-chymosin được tiết một cách hiệu quả vào môi trường nuôi cấy.
Thứ hai, trình tự thủ lĩnh từ protein nấm men được sử dụng, đặc biệt là vùng tiền pro
của gen yếu tố α từ S. cerevisiae và K. lactis. Hơn 95% pro-chymosin được tạo ra được
tìm thấy trong môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, các trình tự thủ lĩnh khác từ protein nấm
men cũng được sử dụng thành công ở K. lactis để tiết ra enzym mong muốn.

Promoter and terminator nào được chọn?

Một lần nữa có rất nhiều lựa chọn. Vì K. lactis được sử dụng trên quy mô thương mại
để sản xuất lactase, nên việc điều hòa sản xuất lactase ở sinh vật này đã được hiểu khá
rõ. Do đó, gen pro-chymosin cộng với trình tự thủ lĩnh được đặt dưới sự kiểm soát của
trình tự khởi động và kết thúc lactase. Hóa ra là quy định sản xuất enzyme dị loại có
thể so sánh với quy định của lactase.

Làm thế nào để băng biểu hiện được tích hợp vào nhiễm sắc thể nấm men?

Bằng cách sử dụng promoter K. lactis lactase trong cấu trúc, một trình tự chung có sẵn
trong cả cấu trúc và nhiễm sắc thể của sinh vật chủ. Vectơ biểu hiện được nhắm mục
tiêu đến gen lactase của tế bào chủ bằng cách tạo dòng cấu trúc tại vị trí duy nhất trong
promoter lactase. Vectơ được tích hợp vào nhiễm sắc thể vật chủ bằng cách tái tổ hợp
trong quá trình sao chép DNA.

Đặc điểm của dòng sản xuất

Việc một sinh vật cụ thể có phù hợp để sản xuất enzyme ở quy mô thương mại hay
không sẽ phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau. Chúng bao gồm các yêu cầu về môi
trường, các điều kiện của quá trình lên men và hành vi trong quá trình xử lý xuống
dòng của môi trường lên men.

Các đặc tính của dòng sản xuất tất nhiên có thể so sánh một phần với các đặc tính của
dòng ký chủ. Tuy nhiên, trong những năm đầu của quá trình phát triển sinh vật DNA
tái tổ hợp cho các quy trình công nghiệp, người ta ít biết về ảnh hưởng của việc đưa
DNA dị hợp vào các đặc điểm chung của sinh vật. Do đó, các thử nghiệm mở rộng đã
phải được thực hiện để kiểm tra tất cả các thay đổi có thể tưởng tượng được. Như
chúng ta sẽ thấy ở phần sau, đối với chủng K. lactis sản xuất chymosin, không có thay
đổi nào khác với những thay đổi được giới thiệu bởi cấu trúc DNA.
Một yếu tố quan trọng trong việc đánh giá chủng là sự ổn định của sản xuất chymosin.
Điều này đã được kiểm tra bằng cách nuôi cấy chủng này trong bảy lần nuôi cấy bình
lắc liên tiếp và xác định hàm lượng chymosin trong các mẫu cấy này. Nó cho thấy rằng
không có sự suy giảm đáng kể nào về năng lực sản xuất trong ít nhất 45 thế hệ, đủ cho
sản xuất quy mô lớn. Với Southern Blotting (kỹ thuật xác định những thay đổi trong
trình tự nucleotide), người ta đã xác nhận rằng không có sự sắp xếp lại nào xảy ra
trong băng biểu thức tích hợp và số lượng bản sao của nó là ổn định. Một phương pháp
khác để kiểm tra tính ổn định của khả năng sản xuất chymosin của một chủng công
nghiệp sẽ là phân lập một tế bào đơn lẻ từ nước dùng vào cuối quá trình lên men và sử
dụng nó làm chất cấy cho một quá trình lên men mới. Lượng sản phẩm tạo thành phải
bằng nhau trong cả hai trường hợp.

Quy trình thu nhận

Trong phần trước liên quan đến sự phát triển của một sinh vật DNA tái tổ hợp có
khả năng sản xuất chymosin, quy trình sản xuất thực tế không được nêu rõ. Trong giai
đoạn đầu của quá trình công nghệ gen, điều này thực sự không quan trọng, vì mục tiêu
chính là chỉ đơn giản là thu được một chủng có thể tạo ra sản phẩm mong muốn. Bước
tiếp theo là phát triển quy trình sản xuất. Trong thực tế, chủng và quy trình sản xuất
được phát triển như các hoạt động song song.

Việc lựa chọn K. lactis làm sinh vật chủ, ngoài việc tuân thủ các tiêu chí về phụ
gia thực phẩm, còn dựa trên quy trình sẵn có sử dụng sinh vật này để sản xuất lactase.
Như đã thảo luận trước đó, trong việc thiết kế plasmid, trình tự trình tự promoter và
trình tự terminator lactase cũng được chọn.

Quy trình sản xuất lactase hiện có được sử dụng cho sự phát triển quy trình sản
xuất chymosin. Mặc dù có một số thay đổi thích nghi được đưa ra để tối ưu hóa quy
trình, quy trình chung vẫn giống như đối với sản xuất lactase.

Khái niệm sử dụng sinh vật chủ nổi tiếng trong đó các gen đặc biệt dễ dàng được
'cắm' vào đã được đặt tên là khái niệm PLUG-BUGTM. Chúng ta hãy xem xét bốn
khía cạnh quan trọng của quá trình phát triển.

Môi trường lên men

 Môi trường công nghiệp có chứa tất cả các hợp chất cần thiết cho sự phát triển
của chủng và sản xuất enzyme, có sẵn từ quá trình sản xuất lactase. Vì thành phần của
môi trường ảnh hưởng đến các bước tiếp theo trong quá trình sản xuất, một số lựa
chọn thay thế đã được thử nghiệm liên quan đến việc thu hồi và xây dựng sản phẩm.
Vì chymosin được tiết vào môi trường trong quá trình lên men, nên phải kiểm tra tính
ổn định của enzyme trong canh trường lên men.

Quá trình lên men

Việc tối ưu hóa quy trình lên men về cơ bản không khác với quy trình với vi sinh
vật không tái tổ hợp. Bắt đầu từ quy trình cho quá trình sản xuất lactase, các thông số
lên men đã được tinh chỉnh. Đặc biệt là pH, nhiệt độ và tốc độ sục khí đã được chỉnh
sửa để tối ưu hóa năng suất. Quá trình lên men fed – batch thường là quy trình được sử
dụng trong công nghiệp. Tốc độ bổ sung cơ chất, thường là nguồn carbon, quyết định
tốc độ phát triển của sinh vật. Tuy nhiên, có một số khác biệt đáng chú ý giữa sản xuất
lactase và chymosin. Trong quá trình sản xuất enzyme lactase nội bào, năng suất trên
trọng lượng sinh khối giảm vào cuối quá trình lên men. Trong quá trình sản xuất
chymosin tái tổ hợp ngoại bào, điều này không xảy ra.

Các yếu tố khác ảnh hưởng đến thiết kế quy trình bao gồm quy mô công suất nhà
máy hiện có. Trong trường hợp công suất nhà máy hiện có là đủ, mục tiêu quan trọng
nhất sẽ là chi phí sản xuất tối thiểu trên một đơn vị sản phẩm (nói cách khác là làm cho
sản phẩm càng rẻ càng tốt). Điều này đạt được bằng cách đạt được sự thỏa hiệp giữa
năng suất cao trên nguyên liệu và thời gian lên men ngắn: khi thời gian lên men ngắn,
các thành phần trung bình sẽ không được sử dụng, trong khi thời gian lên men dài hơn
(với chi phí vận hành cao hơn) thì các thành phần trung bình sẽ nhiều hơn được sử
dụng đầy đủ. Khi công suất của nhà máy bị hạn chế, 'sản lượng' (khối lượng sản phẩm
được sản xuất trên một đơn vị thời gian) có thể trở thành một mục tiêu quan trọng. Sản
lượng có thể được tối đa hóa (đối với nuôi cấy theo mẻ hoặc nuôi theo mẻ) bằng cách
rút ngắn thời gian lên men. Điều này có thể cần thiết, ngay cả khi chi phí cho mỗi đơn
vị sản phẩm tăng lên do lãng phí các thành phần trung bình. Thành phần trung bình
đóng góp đáng kể vào chi phí sản xuất.

Bất hoạt nấm men

 Sinh vật sản xuất hoàn toàn không được có trong sản phẩm cuối cùng. Trong
trường hợp của K. lactis, người ta quyết định tiêu diệt nấm men trước khi thu hồi sản
phẩm. Bằng cách đưa vào bước tiêu diệt này, quá trình sản xuất này về cơ bản có thể
giống với bất kỳ loại enzyme nào được tạo ra bằng quá trình lên men.

Lý do chính liên quan đến các yêu cầu pháp lý.

Các quy định giới hạn mức độ thải các sinh vật biến đổi gen vào môi trường. Sẽ
không mong muốn làm ô nhiễm thiết bị, người vận hành và môi trường nhà máy với
những sinh vật sống được như vậy. Bất hoạt các sinh vật trong khi chúng được chứa
trong máy lên men sẽ khắc phục được vấn đề này.

Trong thiết kế quy trình ban đầu, các sinh vật đã bị bất hoạt bằng cách bổ sung n-
octanol, thúc đẩy sự phân giải của nấm men. Bằng cách này, tất cả chymosin trong và
ngoài tế bào đã được tạo sẵn trong pha lỏng của canh trường. N-octanol phải được loại
bỏ trong quá trình tiếp theo (thêm một bước bổ sung). Hơn nữa, quá trình ly giải của
nấm men cũng đưa các thành phần tế bào vào môi trường.

Đối với các chủng tiết gần như tất cả chymosin vào môi trường trong quá trình lên
men, quá trình tự phân hoàn toàn của tế bào là không cần thiết. Người ta thấy rằng
trong trường hợp này, các tế bào nấm men có thể dễ dàng bị giết chết bằng cách bổ
sung axit benzoic ở một giá trị pH thấp.

Axit benzoic trong mọi trường hợp là một chất bảo quản thường được sử dụng cho các
sản phẩm rennet. Do đó, tiết kiệm được trong bước công thức cuối cùng. Độ pH thấp
của hỗn hợp được sử dụng trong quá trình tiêu diệt nấm men cũng tạo điều kiện cho
quá trình tự xúc tác chuyển đổi pro-chymosin thành chymosin, tương tự như quá trình
xử lý tự nhiên xảy ra ở bê.

Các tế bào nấm men bị tiêu diệt nhưng không bị ly giải. Các tế bào nguyên vẹn về hình
thái có thể được loại bỏ dễ dàng bằng phương pháp lọc thích hợp, chẳng hạn như lọc
chân không quay. Chất hỗ trợ lọc có thể tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình này. Dịch
lọc và nước rửa được kết hợp và chứa hầu hết chymosin. Chất lỏng này được cô đặc
bằng phương pháp siêu lọc dẫn đến dung dịch gốc là nguyên liệu cơ bản để tạo ra sản
phẩm cuối cùng. Sau công thức cuối cùng, bước lọc vô trùng được thực hiện để loại bỏ
bất kỳ vi sinh vật nào có thể được đưa vào trong quá trình thu hồi hoặc xây dựng công
thức.