Xác định độ thấm dầu ô liu bằng máy đo phổ NMR để bàn 60 MHz

Trong khi lợi ích sức khỏe của dầu ô liu nguyên chất (EVOO) đã được ghi nhận rõ ràng, độ
tinh khiết của bất kỳ lô cụ thể nào vẫn còn nhiều tranh cãi. Nhu cầu lớn đối với EVOO, cùng
với chi phí sản xuất tương đối cao, đã khuyến khích sự pha trộn bất hợp pháp, khiến EVOO
trở thành một trong những loại thực phẩm gian lận nhất. Mặc dù EVOO thường được pha
loãng với các loại dầu rẻ hơn, bao gồm đậu nành và ngô, việc bổ sung các chất pha loãng có
hại hơn (ví dụ, anilin màu vàng) cũng đã được báo cáo. Các cơ quan quản lý tập trung và các
phương pháp phân tích đã tìm kiếm các giao thức đáng tin cậy để xác định và thậm chí định
lượng các trường hợp tạp nhiễm kinh tế. Điều này đã bao gồm việc sử dụng các kỹ thuật khối
phổ GC và / hoặc gạch nối (ví dụ, LC-MS).

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H NMR) cung cấp một giải pháp thay thế hấp dẫn cho
các phương pháp phân tích cồng kềnh hơn này. Các lợi ích bao gồm chuẩn bị mẫu dễ dàng và
lặp lại, phân tích dữ liệu đơn giản và sàng lọc đa thành phần linh hoạt. 1H NMR không giới
hạn ở nhiệt độ, dung môi hoặc giao thức dòng cụ thể. Thay vào đó, mỗi quang phổ chứa cộng
hưởng của mọi thành phần chứa hydro trong một mẫu và mọi thành phần đều có hệ số phản
hồi bằng nhau. Điều này có nghĩa là nồng độ tương đối của từng thành phần có thể được đánh
giá trực tiếp mà không cần đến các phương pháp hiệu chuẩn phức tạp.

Bất chấp những lợi ích tiềm năng của việc đưa 1H NMR vào môi trường quy định, kích thước
vật lý lớn của các máy đo phổ NMR truyền thống kết hợp với số vốn cần thiết để mua và bảo
trì các thiết bị này đã khiến việc kết hợp kỹ thuật này vào khoa học thực phẩm phần lớn là
không thực tế. Những tiến bộ gần đây trong công nghệ nam châm đất hiếm vĩnh cửu và sự
phát triển của một loại máy quang phổ NMR để bàn mới đã bắt đầu làm giảm bớt những rào
cản này. Máy quang phổ NMR để bàn thường dễ sử dụng hơn và giá cả phải chăng hơn so
với các máy đo trường cao. Chúng đủ nhỏ gọn để đưa vào bất kỳ môi trường phòng thí
nghiệm tiêu chuẩn nào. Mặc dù độ phân giải mà chúng cung cấp thấp hơn, nhưng máy quang
phổ để bàn có từ trường đủ đồng nhất để xác định và định lượng chính xác. Bài báo này nêu
bật tính hiệu quả của công nghệ NMR để bàn để định lượng hàm lượng dầu đậu nành trong
EVOO.

Dầu ăn là chất béo trung tính của axit béo bão hòa (ví dụ, palmitic và stearic) và không bão
hòa (ví dụ, axit oleic, linoleic và axit α-linolenic). Do bản chất tổng hợp của chúng, việc giải
thích phổ 1H NMR của dầu trước tiên đòi hỏi sự hiểu biết về axit béo tự do rời rạc. Các axit
béo tự do có thể có tối đa sáu ký hiệu hóa học1: axit cacboxylic, olefin, bis-allylic, allylic / α-
CH2 và ankin, như thể hiện trong Hình 1. Các allylic / α-CH2 được định nghĩa là các phần tử
metylen tiếp giáp với a cacbonyl hoặc một vinyl, trong khi cộng hưởng bis-allylic là liên kết
metylen nối hai nhóm vinyl. Mặc dù các thành phần riêng lẻ của các axit béo này không được
phân giải hoàn toàn ở tần số 60 MHz, nhưng tích phân được lấy từ các vùng xác định có thể
phân biệt chính xác các dạng axit béo khác nhau. Các thành phần alkyl và α-cacbon được
quan sát thấy trong phổ của các axit béo bão hòa (Hình 1a), trong khi các axit béo không bão
hòa (Hình 1b) cho các phổ phức tạp hơn và nhiều thông tin hơn, tích hợp theo mức độ bão
hòa và số lượng proton cho mỗi chức năng tập đoàn.

Hình 1 - Phổ NMR 60 MHz 1H xếp chồng lên nhau cho: a) axit béo bão hòa và b) axit béo không bão hòa. Các
nhóm chức năng tương ứng được dán nhãn phía trên sự cộng hưởng thích hợp. Các vùng tích phân đỉnh được
xác định là: axit cacboxylic (COOH) (δ 10,50–12,00), olefin (CH = CH) (δ 4,92–5,67), bis-allylic (= CH-CH2-
CH =) (δ 2,50–3,05 ), allylic / alpha-C (= CH-CH2-alkyl hoặc O = C-CH2) (δ 1,75–2,50) và alkyl (-CH2 / -
CH3) (δ 0,46–1,75 ppm). (Sao chép lại với sự cho phép của Tin tức Hóa chất & Kỹ thuật;
http://www.heterobetainas.uah.es/intranet/REVISTA%20CHEM&ENG%20NEWS/cen2014 602- EUR-dl.pdf)

Dầu ăn sẽ có phổ NMR 1H tương tự, hãy tiết kiệm : 1) gốc axit cacboxylic được thay thế
bằng các liên kết glyxerit (–CH2 - / - CH-δ 3,82–4,5 ppm) (Hình 2) và 2) tích phân của các
dãy cộng hưởng phổ khác biệt về mặt hóa học phản ánh thành phần phần trăm của các axit
béo đối với một loại dầu ăn cụ thể (Bảng 1). Do đó, quang phổ 1H NMR có thể được sử dụng
trực tiếp để phân biệt các loại dầu ăn có cấu hình axit béo đặc trưng khác nhau.
Hình 2 - Phổ NMR 60 MHz 1H xếp chồng lên nhau cho dầu ô liu và đậu nành. (Sao lại với sự cho phép của Tin
tức Hóa chất & Kỹ thuật; http://www.heterobetainas.uah.es/intranet/REVISTA%20 CHEM & ENG% 20NEWS /
cen20140602-EUR-dl.pdf)
Bảng 1 - Thành phần phần trăm của dầu ô liu nguyên chất và dầu đậu nành

Cách dễ hiểu nhất để phân biệt EVOO và dầu đậu nành là vùng bis-allylic. EVOO được cấu
tạo chủ yếu từ các axit béo không bão hòa đơn và các axit béo không bão hòa đa, chứa bis-
allylic chỉ đại diện cho một thành phần nhỏ của EVOO. Ngược lại, dầu đậu nành bao gồm
50-60% axit béo không bão hòa đa, với axit linoleic (ω-6) đại diện cho thành phần chính. Do
đó, vùng bis-allylic trong dầu đậu nành nguyên chất, hoặc EVOO bị pha trộn từ đậu nành,
đậm hơn nhiều so với các mẫu EVOO thực sự nguyên chất. Việc xác định sự tích hợp tuyệt
đối của tất cả các thành phần liên quan đến lượng proton bis-allylic cung cấp một dấu hiệu
trực tiếp về sự tạp nhiễm; thành phần lớn hơn mong đợi biểu thị sự hiện diện của các axit béo
không bão hòa đa.

Ngoài ra, chúng ta có thể quan sát và định lượng lượng tạp chất. Dung dịch gốc của EVOO
và dầu đậu nành đã được chuẩn bị (~ 0,5 M trong CDCl3) và được sử dụng để tạo ra các mẫu
EVOO được pha tạp ở 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 và 60 (thể tích)% đậu nành dầu. Ba bộ
giải pháp gốc đã được chuẩn bị để phân tích (những giải pháp này sẽ được gọi là "thử
nghiệm" trong toàn bộ văn bản). Một máy quang phổ để bàn NMReady (Nanalysis Corp.,
Calgary, Alb.) Đã được sử dụng để thu được phổ NMR 60-MHz 1H trong ba lần cho tất cả
các mẫu để đảm bảo độ lặp lại của phép đo. Quang phổ được đo bằng tám lần quét ở cửa sổ
quang phổ 12 ppm, 2k điểm, apodization 0,1 Hz và độ trễ thư giãn 5 giây.

Sử dụng chương trình xử lý phổ MNova (Mestrelab Research, Escondido, Calif.), Các hiệu
chỉnh pha và đường cơ sở giống nhau đã được áp dụng cho mỗi phổ. Quang phổ sau đó được
quy chiếu δ đến CHCl3 dư (δ = 7,24 ppm). Một ví dụ về biểu đồ xếp chồng được thể hiện
trong Hình 3a. Sau khi được tham chiếu, phổ được tích hợp với các vùng được xác định
trước.
Hình 3 - a) Phổ NMR 60-MHz 1H xếp chồng lên nhau của các mẫu dầu ô liu được pha trộn thủ công với dầu
đậu nành. b) Lượng dầu đậu nành bị tạp nhiễm được xác định bằng phần trăm các proton bis-allylic trong mỗi
mẫu EVOO.

Phần trăm của các proton bis-allylic được tính toán cho mỗi phổ bằng cách sử dụng tích phân
tuyệt đối của vùng bis-allylic so với tổng tích phân tuyệt đối của mẫu. Đối với mỗi thử
nghiệm, các giá trị đo được trong ba lần được tính trung bình. Ba giá trị trung bình này, cùng
với giá trị trung bình tổng thể của tất cả dữ liệu thu được, được vẽ biểu đồ so với lượng dầu
đậu nành tạp nhiễm đã biết để thiết lập độ chính xác và tuyến tính của phương pháp (Hình
3b).

Độ lặp lại của phép đo được mô tả trong Hình 4a bằng cách chồng các phổ thu được. Việc
phóng to vùng bis-allylic cho thấy sự thống nhất tốt giữa ba thử nghiệm. Giá trị trung bình và
giá trị trung bình tích hợp tuyệt đối bis-allylic được báo cáo cùng với độ lệch chuẩn cho ba
thử nghiệm (Hình 4b). Sau khi được chuẩn bị, đường chuẩn tuyến tính này có thể được sử
dụng trong các mẫu chưa biết của EVOO để xác định lượng dầu đậu nành được thêm vào
mẫu trong vòng một vài phần trăm, nếu có.
Hình 4 - a) Phổ 1H NMR phủ trên ba thử nghiệm EVOO pha tạp chất ở 35% dầu đậu nành. b) Trung bình,
trung vị và độ lệch chuẩn (STD) cho giá trị trung bình của các mẫu thử.

Tóm tắt

Quang phổ NMR để bàn đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả để xác định và định
lượng sự tạp nhiễm đậu tương trong các mẫu EVOO. Mặc dù NMR để bàn có độ phân giải
thấp hơn so với các máy đo phổ NMR truyền thống, nhưng vẫn có đủ độ phân giải để xác
định chính xác và lặp lại sự khác biệt trong thành phần axit béo. Ngoài ra, những quang phổ
này có thể được sử dụng để dễ dàng đánh giá sự hiện diện của các chất gây ô nhiễm khác. Ví
dụ, các pic thơm của anilin màu vàng sẽ rất rõ ràng trong khoảng 6,0-8,0 ppm. Chúng tôi hiện
đang tìm cách: 1) mở rộng phương pháp này cho các chất tạp nhiễm EVOO khác, 2) kiểm tra
phạm vi rộng hơn của các mẫu EVOO, 3) hiểu rõ hơn về độ chính xác và tiện ích của NMR
để hiểu rõ nguồn gốc và độ tinh khiết của mẫu và 4) mở rộng NMR để bàn các kỹ thuật hỗ trợ
đảm bảo chất lượng trong các lĩnh vực khác của khoa học thực phẩm.

Tham khảo

1. Knothe, G. và Kenar, JA Xác định cấu hình axit béo bằng quang phổ 1H NMR. Eur.
J. Môi. Khoa học. và Công nghệ. 2004, 106 (2), 88–96.
Susanne D. Riegel là quản lý hóa học ứng dụng, Nanalysis Corp., Bay 4 4500 5 St. NE,
Calgary, Alb., Canada, T2E 7C3; điện thoại: 1.855.667.3239; e-mail:
susie.riegel@nanalysis.com; www.nanalysis.com