Scenariusz wypracowany w ramach projektu „Fizyka-Pasja

Społeczeństwo”
Autor:
Anna Modrak-Wójcik
Tytuł zajęć:
Odkrywamy funkcje białek
Numer zadania: 5

Cel: Czego uczeń się dowie? Jakie umiejętności zdobędzie lub rozwinie?

Podczas wykładu uczniowie dowiedzą się: jak zbudowane są białka i jakie funkcje pełnią
w organizmach żywych, czym jest promieniowanie elektromagnetyczne, na czym polega zjawisko
absorpcji światła i fluorescencji, jaki jest mechanizm widzenia barwnego. Poznają metody
badawcze, w szczególności spektroskopowe, stosowane w badaniach cząsteczek biologicznych.
Podczas warsztatów uczniowie poznają zasadę działania spektrofotometru i nauczą się rejestrować
widma absorpcji. Dowiedzą się jaki jest związek koloru substancji z jej widmem absorpcji.
Posługując się kołem barw będą w stanie przewidzieć, przy jakiej długości fali przypadnie
maksimum absorpcji badanego związku (nasze oko „widzi” barwę dopełniającą
do zaabsorbowanej). Zaobserwują, że fluorescencja występuje dla dłuższych fal (mniejszych
energii) w porównaniu z maksimum widma absorpcji. Będą potrafili wytłumaczyć ten efekt w
oparciu o diagram Jabłońskiego, przedstawiający układ poziomów energetycznych cząsteczek.
Przekonają się, że utworzenie kompleksu białko-ligand może zmienić właściwości spektralne
składników kompleksu, oraz że denaturacja białek prowadzi do zniszczenia unikatowej, aktywnej
biologicznie struktury tych cząsteczek. Nauczą się obsługi pipet automatycznych. Umiejętność tą
wykorzystają przygotowując samodzielnie roztwory do przeprowadzanych doświadczeń. Zdobędą
umiejętności planowania eksperymentów z zastosowaniem prób kontrolnych.
Zajęcia skierowane do uczniów grupy przedszkolnej /klasy 1-4 liceum (niepotrzebne skreślić).
Czas potrzebny na realizację scenariusza: 210-240 min.

Etapy realizacji zajęć (wraz z krótkim opisem):

A. Wykład
Wykład (45-60 min) ma na celu wprowadzenie uczniów w tematykę warsztatów.
Podczas wykładu należy omówić następujące zagadnienia:
1) budowa i funkcje białek
2) denaturacja białek
3) promieniowanie elektromagnetyczne (rodzaje, w tym światło widzialne; wielkości
opisujące fale – długość fali, częstotliwość, okres, prędkość rozchodzenia; dualizm
korpuskularno-falowy; energia fotonu – wzór Placka)
4) zjawisko absorpcji i fluorescencji promieniowania elektromagnetycznego (diagram
Jabłońskiego; widma absorpcji i fluorescencji; mechanizm widzenia barwnego)
5) zastosowania spektroskopii UV-Vis w badaniach cząsteczek biologicznych
6) właściwości witaminy B2 (ryboflawiny)
7) struktura i rola biologiczna konalbumiany oraz białka wiążącego ryboflawinę
Powyższe zagadnienia zostaną pogłębione i utrwalone podczas warsztatów.
B. Warsztaty
Część I. Zapoznanie uczniów z aparaturą doświadczalną
1. Nauka obsługi pipet automatycznych (zakresy 0,5-10 l; 10-100 l, 100-1000 l,
1-5 ml)
Tu warto przypomnieć uczniom znaczenie przedrostka mikro (1 = 10-6 ), a także
uzmysłowić ile wynosi objętość 1 ml (taką objętość ma sześcian o boku 1 cm) oraz 1 l
(taką objętość ma sześcian o boku 1 mm).
2. Omówienie budowy spektrofotometru oraz zasady pomiaru widm absorpcji
Wyjaśnienie uczniom jaka jest rola najważniejszych elementów spektrofotometru:
- lampa halogenowa (Vis) i lampa deuterowa (UV) – źródło promieniowania UV-Vis
- monochromator umożliwiający wybranie z promieniowania emitowanego przez lampy
określonej długości fali. Najważniejszym elementem monochromatora jest siatka
dyfrakcyjna (w przypadku używanego podczas warsztatów spektrofotometru) lub
pryzmat (są to tzw. elementy dyspersyjne, rozszczepiające światło na składowe)
- komora pomiarowa, w której umieszczamy kuwetę z badaną próbką oraz kuwetę
kontrolną zawierającą czysty rozpuszczalnik (w tym przypadku wodę)
- detektor mierzący ilość promieniowania przechodzącego przez kuwetę badaną
i kontrolną
- komputer sterujący pomiarem i rejestrujący dane
Omówienie pojęcia absorbancji (logarytm dziesiętny ze stosunku natężenia
promieniowania przychodzącego przez kuwetę kontrolną do natężenia promieniowania
przechodzącego przez kuwetę z próbką), będącej miarą tego jak silnie próbka absorbuje
promieniowanie o danej długości fali. Uczniowie znający już pojęcie logarytmu, sami
powinni obliczyć, jaka część promieniowania padającego jest absorbowana w przypadku
absorbancji równej 0, 1 czy 2.
Kolejnym krokiem jest wyjaśnienie uczniom, że to co mierzymy za pomocą
spektrofotometru to zależność absorbancji od długości fali promieniowania padającego
na próbkę (promieniowania wychodzącego z monochromatora). Ta zależność to widmo
absorpcji badanej próbki.
3. Ustawienie parametrów rejestracji widm absorpcji
Krótkie omówienie z uczniami programu obsługującego rejestrację widm oraz
ustawienie odpowiednich parametrów dla pomiaru widm ryboflawiny: zakres długości
fali – 200-600 nm, co 1 nm, 0,2 s/nm, mod – A (absorbancja), baseline correction.
4. Wykonanie linii bazowej (baseline correction) na kuwetach z wodą dla powyższych
parametrów
Na tym etapie należy wyjaśnić uczniom, że linia bazowa jest robiona po to, by
uwzględnić ewentualne różnice w układzie optycznym spektrofotometru na drodze
wiązki światła przechodzącej przez próbkę badaną i kontrolną oraz w absorpcji samych
kuwet. Linia bazowa jest odejmowana automatycznie od wszystkich widm
rejestrowanych w kolejnej części. Uczniowie powinni sami wywnioskować jaki powinien
być profil linii bazowej.
Uczniowie samodzielnie napełniają kuwety wodą (po 1 ml), wstawiają je do komory
pomiarowej i uruchamiają pomiar.
Część II. Obserwacja absorpcji i fluorescencji ryboflawiny
Ryboflawina, czyli witamina B2, zapewnia prawidłowe funkcjonowanie układu
nerwowego, narządu wzroku, błon śluzowych i skóry. Dzięki występującym w jej
strukturze pierścieniom aromatycznym, absorbuje i emituje światło widzialne. Jest
krystalicznym proszkiem o żółtej barwie, dobrze rozpuszcza się w wodzie.
5. Pomiar widm absorpcji rozcieńczonych roztworów ryboflawiny
Uczniowie samodzielnie przygotowują roztwór ryboflawiny (Rf) do pomiaru widma
absorbcji – 20-krotnie rozcieńczają roztwór wyjściowy ryboflawiny (bezpośrednio w
kuwecie pomiarowej) w następujący sposób:
950 l H2O + 50 l stężonego roztworu Rf (20 x rozc.)
Rejestrują widmo absorpcji przygotowanego roztworu. Przed wykonaniem widma,
posługując się kołem barw, powinni spróbować przewidzieć, przy jakiej długości fali
powinna wystąpić maksymalna absorpcja ryboflawiny (roztwór jest żółty, powinien więc
absorbować w zakresie niebieskim).
Ryboflawina w zakresie 200-600 nm ma 4 maksima absorpcyjne (Rys.1), w tym tylko
jedno w zakresie widzialnym – maksimum w 444 nm odpowiada absorpcji
promieniowania z zakresu niebieskiego. Pozostałe maksima znajdują się w obszarze UV.
Rysunek 1. Widmo absorbcji 20 razy rozcieńczonego roztworu ryboflawiny (cstęż = 226  M)
6. Obserwacja fluorescencji ryboflawiny
Uczniowie obserwują fluorescencję wodnego roztworu ryboflawiny wywołaną
oświetleniem latarką UV. Porównują barwę emitowanego światła (zielona) z „kolorem”
absorbowanym (niebieski). Emisja fluorescencji występuje więc dla dłuższych fal
(mniejszych energii) w porównaniu z maksimum widma absorpcji. Uczniowie tłumaczą
ten efekt w oparciu o diagram Jabłońskiego, przedstawiający układ poziomów
energetycznych cząsteczki.
Część III. Wykrywanie obecności białka wiążącego ryboflawinę (RfBP) w białku
jaja kurzego i określenie jego funkcji biologicznej
Należy zwrócić uwagę uczniów, że białko jaja kurzego nie jest ani białe, ani
przezroczyste – jest jasnożółte. Swój kolor zawdzięcza obecności ryboflawiny.
Ryboflawina jest niezbędna do prawidłowego rozwoju kurzego zarodka. W białku jaja
kurzego nie występuje jednak w stanie wolnym, ale w kompleksie ze specyficznym
białkiem – białkiem wiążącym ryboflawinę. Jedna cząsteczka białka RfBP wiąże jedną
cząsteczkę ryboflawiny. Ryboflawina, po związaniu się z białkiem RfBP, traci swoje
właściwości fluorescencyjne. Mówimy, że fluorescencja ryboflawiny w kompleksie jest
wygaszana.
7. Przygotowanie próbki białka jaja kurzego do pomiarów
Uczniowie sami lub z pomocą asystenta przygotowują (w falkonówce 15 ml) 10-krotnie
rozcieńczony roztwór białka jaja kurzego wg schematu:
1 ml białka + 9 ml H2O
Białko jest bardzo lepkie, więc przed pobraniem trzeba obciąć końcówkę tipsa (nie za
wysoko, aby w tipsie zmieścił się 1 ml białka, np. na wysokości 5 mm). Po wymieszaniu
z wodą mogą pojawić się agregaty białkowe (widoczne gołym okiem włókna). Tak
przygotowany roztwór uczniowie przelewają do probówek 2 ml (5 szt.) i wirują przez 3
minuty przy największych obrotach. Po odwirowaniu delikatnie przenoszą supernatant
(roztwór znad osadu) do czystej falkonówki.
8. Porównanie fluorescencji ryboflawiny w roztworze wodnym oraz w roztworze
zawierającym rozcieńczone białko jaja kurzego
Ten etap demonstruje zastosowanie spektroskopii UV-Vis do wykrywania obecności
i określenia funkcji biologicznej białka wiążącego ryboflawinę.
Uczniowie przygotowują 2 próbki w kuwetach fluorescencyjnych:
1)2)2 ml H20
2 ml 10 razy rozcieńczonego białka jaja kurzego (po wirowaniu)
Przed rozpoczęciem eksperymentu, sprawdzają czy próbki wykazują fluorescencję
wywołaną oświetleniem latarką UV. Najlepiej oświetlać kuwetę w zaciemnionym
miejscu, od boku lub z góry. Żadna z próbek nie powinna fluoryzować. Następne, do
każdej z próbek dodają porcje stężonej ryboflawiny o objętości 5 l. Po każdym dodaniu
dokładnie mieszają zawartość kuwety pipetą automatyczną nastawioną na 1 ml,
a następnie porównują fluorescencję obu roztworów. Dodanie każdej porcji oraz swoje
obserwacje odnotowują w Tabeli 1 (w tym zaznaczają maksymalne stężenie Rf, przy
którym jeszcze nie widać jej świecenia w roztworze białka). Bardzo słabe świecenie
roztworu Rf w obecności białka (widoczne w ciemności) powinno pojawić się
po dodaniu 2-3 porcji, próbka 1 zaczyna fluoryzować po dodaniu pierwszej porcji.
Uczniowie powinni dodać oko 6-ciu porcji – w roztworze wodnym (próbka 1) powinni
zaobserwować zdecydowanie intensywniejszą fluorescencję niż w próbce 2. Obecne w
białku jaja kurzego specyficzne białko – białko wiążące ryboflawinę, RfBP, wiąże
dodawaną ryboflawinę. Wiązanie ryboflawiny z RfBP powoduje wygaszanie jej
fluorescencji. Dopiero dodanie nadmiaru ryboflawiny, który nie może być już związany
przez białko, powoduje, że roztwór zaczyna fluoryzować. Białko RfBP jest
odpowiedzialne za gromadzenie ryboflawiny, zapewniającej prawidłowy rozwój zarodka
kurzego.
9. Obserwacja wzrostu fluorescencji ryboflawiny na skutek denaturacji białka RfBP
Ten etap pokazuje, że prawidłowa struktura przestrzenna białek jest niezbędna
do pełnienia dedykowanej im roli biologicznej.
Uczniowie przygotowują 2 próbki w kuwetach fluorescencyjnych, z których jedna pełni
rolę kontroli (K):
1)2)2 ml 10 razy rozcieńczonego białka jaja kurzego
2 ml H20 + 10 l* stężonego roztworu Rf (K)
Obserwują fluorescencję każdej z próbek (latarka UV) – próbka 2 świeci, próbka 1 nie.
Następnie do próbki 1 i 2 dodają 200 l 0,1 M kwasu solnego (HCl, w dwóch porcjach
po 100 l, by zminimalizować agregację dla próbki 1 z białkiem):
Próbka 1 + 2 x 100 l 0,1 M HCl
Próbka 2 + 2 x 100 l 0,1 M HCl
Po dodaniu do próbek kwasu ponownie przeprowadzają obserwację fluorescencji
(można obserwować proces dodawania kwasu w ciemności świecąc latarką UV, Rys. 2).
Próbka zawierająca białko (1) zaczyna świecić. Dodanie HCl wywołało denaturację białka
RfBP, uwolnienie ryboflawiny i wzrost jej fluorescencji. Pokazujemy też, że dodanie
kwasu do wodnego roztworu Rf (próbka 2) nie wywołuje zmiany świecenia. W tym
miejscu należy omówić znaczenie prób kontrolnych
w badaniach naukowych. Można też zmierzyć pH
roztworów papierkami lakmusowymi, by przekonać
uczniów, że dodanie kwasu rzeczywiście obniżyło ich
pH.
Rysunek 2. Fluorescencja ryboflawiny pojawiająca się po
dodaniu kwasu do roztworu białka
Część IV. Wykrywanie obecności konalbuminy w białku jaja kurzego
i określenie jej funkcji biologicznej
Konalbumina, obecna w białku jaja, posiada właściwości antybakteryjne, dzięki
zdolności wiązania jonów żelaza oraz innych metali, takich jak Co, Cu, Zn, Al, co czyni
jony tych metali niedostępnymi dla wzrostu bakterii. Jedna cząsteczka konalbuminy
może związać dwa jony Fe 3+. Wiązanie jest realizowane przez 4 reszty aminokwasowe
miejsca wiążącego oraz jon węglanowy CO32–, który jest niezbędny do powstania
kompleksu. Dowodem na powstanie kompleksu jest zmiana barwy chlorku żelaza
z żółtej na łososiową.
10. Przygotowanie próbki białka do pomiarów
Uczniowie sami lub z pomocą asystenta przygotowują (w falkonówce 15 ml) 2-krotnie
rozcieńczony roztwór białka jaja kurzego wg. schematu:
2 ml białka + 2 ml H2O
Po wymieszaniu z wodą mogą pojawić się agregaty. Można je odwirować (patrz pkt. 7).
11. Obserwacja tworzenia kompleksu konalbuminy z jonem Fe3+
Uczniowie przygotowują 3 próbki eppendorfówkach 2 ml, z których 2 pełnią rolę
kontroli (2 i 3):
1) 760 l białka (2 x rozcieńczonego) + 40 l NaHCO3 + 40 l FeCl3
2) 760 l białka (2 x rozcieńczonego) + 40 l NaHCO3
3) 760 l H2O + 40 l NaHCO3 + 40 l FeCl3
Porównują kolory próbek i wyciągają wnioski. Próbka 1 jest łososiowa (Rys. 3), co jest
dowodem na obecność konalbuminy, która utworzyła kompleks z jonem żelaza Fe3+
w obecności jonu węglanowego CO32–. Próbka 2 nie zmieniła koloru – to nie węglan
sodu wywołuje zmianę barwy białka. Próbka 3 jest żółta – jest to efekt dodania chlorku
żelaza FeCl3, który ma zabarwienie żółte. W nieobecności konalbuminy nie pojawia się
łososiowe zabarwienie.
Rysunek 3. Zmiana barwy białka jaja kurzego
po dodaniu FeCl3 w obecności jonów CO32– (próbka
1); próbki 2 i 3 to próbki kontrolne (2 – białko
bez FeCl3, 3 – woda z NaHCO3 i FeCl3)
12. Obserwacja denaturacji konalbuminy w obecności chlorowodorku guanidyny
Ten etap pokazuje, że prawidłowa struktura przestrzenna białek jest niezbędna
do pełnienia przez nie ich roli biologicznej.
Chlorowodorek guanidyny to związek, który zaburza strukturę wody oddziaływującej
z białkiem. Białko przestaje być stabilizowane przez otaczające je cząsteczki wody,
co prowadzi do destabilizacji struktury białka i do całkowitej denaturacji.
Próbkę 1 z pkt. 11 uczniowie dzielą na 2 porcje po 400 l. Do pierwszej dodają 800 l
6 M chlorowodorku guanidyny (6 M GdnHCl), do drugiej (kontrola) 800 l H2O:
1A)
400 l próbki 1 + 800 l 6 M GdnHCl
1B)
400 l próbki 1 + 800 l H2O
Obserwują zmianę koloru próbek i wyciągają wnioski. Próbka 1A utraciła łososiowy
kolor – w wyniku denaturacji konalbumina straciła funkcjonalną strukturę przestrzenną,
a co za tym idzie zdolność wiązania jonów żelaza. Próbka 1B pozostała łososiowa –
dodanie wody nie powoduje zmiany struktury białka.
Spis materiałów potrzebnych do realizacji scenariusza (z uwzględnieniem etapów realizacji):
Odczynniki:
- stężony wodny roztwór ryboflawiny (Rf, witamina B2), c  200 M (etapy 5-6, 8-9)
- białko jaja kurzego (docelowo 10- oraz 2-krotnie rozcieńczone wodą) – 4 ml/grupę (etapy 7-12)
- woda dejonizowana (etapy 4-5, 7-12)
- 0,1 M HCl (etap 9)
- 25 mM FeCl3 (etap 11)
- 1M NaHCO3 (etap 11)
- 6 M GdnHCl pH 8 (zawierający 50 mM fosforan i 300 mM NaCl) (etap 12)
Aparatura i drobny sprzęt:
- spektrofotometr (etapy 2-5)
- wirówka laboratoryjna (etap 7)
- latarka UV (etapy 6, 8-9)
- pipety automatyczne i tipsy (etapy 1, 4-5, 7-12)
- kuwety absorpcyjne plastikowe 1 cm (zakres spektralny od ~230 nm), objętość pomiarowa 1 ml;
2 szt./grupę (etapy 4-6)
- kuwety fluorescencyjne plastikowe 1x1 cm (zakres spektralny od ~230 nm), objętość pomiarowa
2,5 ml; 4 szt./grupę (etapy 8-9)
- papierki lakmusowe (etap 9)
- statywy, eppendorfówki, falkonówki (etapy 7-12)
- kolorowe wydruki ze slajdami z wykładu (koło barw i spektrum światła widzialnego, diagram
Jabłońskiego, struktura ryboflawiny i białka wiążącego ryboflawinę, struktura konalbuminy);
1 zestaw/grupę (etapy 5-6, 8-9, 11-12)
Wykorzystane źródła podczas prowadzenia zajęć (np. strony internetowe), karty pracy (proszę
załączyć):
Karty pracy – Tabela 1
Tabela 1. Karta pracy (etap 8)
objętość dodana
nr dodania
(l)
próbka 1(Rf)
obserwacja
próbka 2 (Rf+białko)
Słowa klucze (dzięki nim nauczyciel będzie mógł znaleźć w bibliotece ten opis):
absorpcja, fluorescencja, wygaszanie fluorescencji, spektrofotometr, widmo
absorpcji,
ryboflawina, białko wiążące ryboflawinę , konalbumina, jony metali, funkcje białek
Ciekawostki powiązane z zajęciami:
W białku jaja kurzego zidentyfikowano kilkaset białek. Wiele z nich pełni rolę ochronną wobec
drobnoustrojów. Niektóre, jak lizozym, powodują uszkodzenie otoczki bakteryjnej. Inne działają
poprzez hamowanie proteaz bakteryjnych (np. owostatyna) lub poprzez ograniczenie dostępności
kluczowych składników odżywczych (np. awidyna tworząca kompleks z biotyną oraz badana
podczas zajęć konalbumina).

16405 znaki
1800 – 35 bt, 20ł
cena 320bt, 182ł