SPEKTROFOTOMETRYCZNA METODA OZNACZANIA

CHLOROFILU W ROŚLINACH

Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest izolacja chlorofilu z wybranych kultur roślinnych, porównanie całkowitej
zawartości chlorofilu oraz zawartości chlorofilu a i b w badanych próbkach.

Materiały i sprzęt
Świeże lub zamrożone liście szpinaku (materiał roślinny może ulec zmianie), aceton, woda
destylowana, bibuła filtracyjna, lejek, folia aluminiowa, moździerz, cylinder miarowy 50 ml,
pipeta automatyczna, spektrofotometr.

Wprowadzenie

Chlorofile występują w chloroplastach roślin pełniąc (wraz z karotenami) rolę

syntezatorów wytwarzających materię organiczną na drodze fotosyntezy. Chlorofil jest
zielonym barwnikiem występującym w organizmach zdolnych do przeprowadzenia procesu
fotosyntezy, m.in. w roślinach wyższych, glonach, cyjanobakteriach. Funkcją chlorofili
w organizmach przeprowadzających fotosyntezę jest wychwytywanie kwantów światła
i przekazywanie energii wzbudzenia do centrum reakcji fotoukładu skąd wybijane są elektrony,
spożytkowane następnie w dalszych etapach fotosyntezy.
Znaczna zawartość chlorofili w organizmach fotosyntetyzujących jest odpowiedzialna
za ich zieloną barwę. Zielony kolor chlorofilu spowodowany jest wysoką absorpcją
w czerwonej i niebieskiej części spektrum światła, a niską absorpcją w zielonej części spektrum
światła (długość fali 500-600 nm).
Cząsteczka chlorofilu zbudowana jest z pochodnej porfiryny – feoporofiryny
(pięciopierścieniowej porfiryny z różnymi podstawnikami). Zawiera on cztery połączone ze
sobą pierścienie pirolowe, które łączy centralnie ułożony atom Mg. W układzie porfirynowym
występują naprzemienne wiązania pojedyncze i podwójne, które tworzą układ rezonansowy.
Dzięki zdolności feoporofiryny do łączenia się poprzez wiązanie estrowe z alkoholem o 20
atomach węgla – fitolem (C20H39OH), chlorofile dobrze rozpuszczają się w lipidach,
rozpuszczalnikach lipidowych, acetonie, alkoholach i są prawie nierozpuszczalne w wodzie.
Istnieje kilka rodzajów chlorofilu, przy czym najbardziej rozpowszechnione
w przyrodzie to chlorofil a (barwa niebieskozielona) i chlorofil b (barwa zielonożółta),
występujące u wszystkich organizmów fotosyntezujących. Inne, jak chlorofile c i d występują
jedynie u części glonów. Chlorofil a różni się od chloralu b obecnością grupy metylowej
– CH3 zamiast grupy aldehydowej przy II pierścieniu pirogowym. O aktywności
fotochemicznej chlorofili decydują labilne elektrony zawarte w układzie wiązań sprzężonych –
C = C – C =C – i przy atomach azotu (patrz: Rys. 1).
Chlorofil a absorbuje światło czerwone o długości fali około 680 nm i światło fioletowe
o długości fali 440 nm (P-680), natomiast chlorofil b najintensywniej absorbuje światło
pomarańczowoczerwone i światło niebieskie (P-700) (Rys. 2). Tak więc dwa rodzaje chlorofilu
uzupełniają się wzajemnie w pochłanianiu promieniowania słonecznego.

1
Rys. 1. Struktura chemiczna chlorofilu a i b.

Rys. 2. Widma absorpcji elektronowej chlorofilu a i b.

Przebieg ćwiczenia:

I. Metoda ekstrakcji chlorofilu z liści roślin zielonych

Chlorofile można wyekstrahować z liści alkoholem, acetonem oraz mieszaniną acetonu

i wody. Chlorofil a wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali 663 nm natomiast
chlorofil b – przy 645 nm. Przygotowujemy 80 % roztwór wodnego acetonu – stosunek 8:2
(v:v). 1 g materiału roślinnego pociąć nożyczkami na małe kawałeczki i rozetrzeć
w moździerzu porcelanowym z niewielką ilością (ok. 4 ml) 80 % roztworu acetonu aż do
uzyskania zielonej pasty. Dodać kolejne 4 ml roztworu acetonu i rozetrzeć na jednorodną pulpę.
Przelać zawiesinę poprzez sączek z bibuły filtracyjnej umieszczony w małym szklanym lejku

2
do 50 cm3 cylindra miarowego (z korkiem). Kolejnymi porcjami roztworu acetonu (2x4 ml)
myć moździerz i tłuczek, przenosząc popłuczyny do cylindra i uzupełnić w/w roztworem do
kreski. Zamknąć cylinder korkiem i wytrząsnąć zawartość przez 10 sek., a następnie odstawić
w ciemne miejsce lub owinąć folią aluminiową.

II. Sporządzenie widma absorpcji elektronowej ekstraktu.

1. Spektrofotometr VIS 7220 G (Rys. 3) włączyć na ok. 15 min. przed rozpoczęciem pomiarów,
co zapewni odpowiednie rozgrzanie lampy i detektora. Włącznik znajduje się po prawej stronie
obudowy.
2
1
3

Rys. 3. Spektrofotometr VIS 7220 G. (1) Pokrywa przedziału próbek, (2) wyświetlacz LCD,
(3) klawiatura do obsługi urządzenia, (4) okno odczytu długości fali, (5) pokrętło do zmiany
długości fali, (6) dźwignia ręcznej zmiany położenia próbek.

2. Przed rozpoczęciem pomiarów należy wykalibrować spektrofotometr. Obracając pokrętło

zmiany długości fali ustawić pożądaną wartość (odczytana w oknie wskaźnika). Umieścić ślepą
próbę (próbę zerową) w podajniku, zamknij pokrywę przedziału próbek. Ustaw za pomocą
dźwigni ręcznej zmiany pozycji podajnika kuwetę z próbą zerową w drodze optycznej
urządzenia. Naciśnij klawisz [100 %] w celu ustalenia 100 % wartości transmitancji (T).
Przemieść podajnik, tak aby blokował wiązkę światła, sprawdzając czy wartość transmitancji
wskazywana przez aparat wynosi 0%. Jeżeli nie naciśnij klawisz [0%], a następnie z powrotem
ustaw próbę zerową na drodze wiązki światła. Na wyświetlaczu powinna zostać wskazana
wartość 100% dla T. W przypadku gdy wartość transmitancji jest inna należy ponownie
nacisnąć klawisz [100%] i powtórzyć procedurę do momentu wyświetlania właściwych
wartości. Po ustaleniu wartości 0 i 100% T można przystąpić do pomiaru próbek.
3. Umieścić kuwety z badaną próbkę i próbką referencyjną na drodze optycznej, wartości
absorbancji (A) zostaną wyświetlone na ekranie urządzenia.
4. Za pomocą pokrętła nastawy długości fali (5) wybrać długość fali światła (wskazana przez
prowadzącego ćwiczenia), dla której zostanie wykonany pomiar absorbancji. Wprowadzić w
bieg promieni świetlnych kuwetę z próbką referencyjną (próbka odniesienia) i odczytać na
wyświetlaczu przyrządu wartość absorbancji (A).

3
5. Dla każdej nowo wybranej długości fali światła należy powtórzyć czynności opisane w
punktach 3-4. Następnie całą procedurę powtórzyć dla badanej próbki.
6. Po zakończeniu pomiarów proszę wyłączyć aparat, wylać zawartość kuwet a następnie je
umyć i opłukać wodą destylowaną.
7. Obliczyć zawartość chlorofilu a i b oraz całkowitą zawartosć chlorofilu korzystajac z
ponizszych zależności:
Zawartość chlorofilu a: Cchl(a) = 12,7 × A(663) - 2,7 × A(645) (1)
Zawartość chlorofilu b: Cchl(b) = 22.9 × A(645) – 4,7 × A(663) (2)
Całkowita zawartości chlorofilu: Cchl(a)+chl(b) = 8,02 × A(663) + 20,2 × A(645) (3)

Otrzymane wyniki wyrażają zawartość chlorofilów w [mg/dm3] roztworów.

8. Porównać wyniki oznaczenia całkowitej zawartości chlorofilu a i chlorofilu b i określić
stosunek zawartości chlorofilu a do chlorofilu b. Odnieść uzyskane wyniki do wartości
literaturowych
𝑪𝒄𝒉𝒍𝒂
=
𝑪𝒄𝒉𝒍𝒃

9. Na papierze milimetrowym (w arkuszu kalkulacyjnym) sporządzić wykres zależności

absorbancji od długości fali A = f().