Khoa Luan Tim Hieu Quy Trinh Phat Hien Clostridium Botulinum Trong Thi 9338

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.
S PHẠM MINH NHựT
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi cuộc sống con người ngày càng được nâng cao thỉ điều mà họ quan
tâm là vệ sinh ăn uống. Hàng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây
hậu quả nghiêm ứọng đến sức khoẻ của cộng đồng. Điều này không chỉ phổ biến ở Việt
Nam mà ngay cả các nước khác ừên thế giới cũng vậy. Một trong những nguyên nhân gây
ra tình ừạng này là sự hiện diện quá mức cho phép các vi sinh vật gây hại trong thực
phẩm. Đe có các biện pháp phòng tránh, ngăn chặn và làm giảm bớt số ca ngộ độc thực
phẩm. Mà sự hiện diện là các chuẩn gây hại như: E. Coli, Salmonella, Cỉostrỉdỉum tạo ra
độc tố khi nhiễm vi sinh vật này.
Bệnh ngộ độc botulism là một bệnh nhiễm độc do độc tố của vi khuẩn Clostridium
botulinum xâm nhập vào thực phẩm, phát ứiển và sinh ra độc tố. Người ăn phải thức ăn có
độc tố sẽ bị nhiễm độc. Gần đây, vai trò các bào tử của vi khuẩn có mặt ừong thực phẩm
có khả năng gây ngộ độc là vấn đề đang được nghiên cứu.
Là một sinh viên sắp ra trường, tầm hiểu biết mới chỉ có giới hạn trong lý thuyết,
kinh nghiệm còn non kém nên không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được
sự đóng góp ý kiến của quý Thầy, Cô để khóa luận của em được hoàn thiện.
Chương 1: MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Từ xa xưa, con người đã biết đến sử dụng vi sinh vật và ứng dụng của vi sinh vật
ứong thực phẩm. Các quá trình làm rượu, làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm...
đều ứng dụng các đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật. Khi khoa học phát ừiển,
biết rõ vai trò của vi sinh vật, thì việc ứng dụng vi sinh vật ứong sản suất ngày càng rộng
rãi có hiệu quả.
Trang 1
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT
Và cũng không vì thế mà người ứng dụng tất cả các chủng vi sinh vật tồn tại trong
tự nhiên. Ngoài những vi sinh vật có lợi cũng có những vi sinh vật có hại gây bệnh cho
cây ừồng, động vật thủy hải sản và nhất là ảnh hưởng tới con người. Hiện nay, khi xã hội
phát ứiển thì mặt hàng thực phẩm cũng khá phong phú và tiện lợi cho người tiêu dùng lựa
chọn. Thực phẩm đóng hộp có trên thị trường và được nhiều người sử dụng. Vào mùa
mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại càng quan tâm đến vấn đề dự trữ các
loại thực phẩm trong nhà để đối phó với những khó khăn có thể xảy ra. Một ứong những
thực phẩm thường được dự trữ là các loại thực phẩm đóng hộp. Nếu khi mua và sử dụng
các loại đồ hộp không cẩn thận, con người có thể bị ngộ độc do ăn phải mầm bệnh phát
triển ở ứong loại thực phẩm này. Ngộ độc thường được ghi nhận là do bị nhiễm độc tố vi
khuẩn Clostridium botulỉnum có ứong đồ hộp, còn gọi là ngộ độc botulism, có thể gây tử
vong.
Ngộ độc botulism là bệnh ngộ độc thực phẩm mang tính chất cấp tính xảy ra rất
nặng, nó có thể phá hủy hệ thần kinh trung ương và gây tử vong cao. Bệnh thường xảy ra
sau khi ăn các loại thực phẩm dự trữ được đóng hộp như thịt hộp, cá hộp, pa tê, xúc xích,
rau quả... Bệnh ngộ độc botulism thường do loại vi khuẩn Cỉostrỉdỉum botulỉnum type Ẩ
và B gây nên, vi khuẩn tiết ra độc tố botulin, một ngoại độc tố có độc tính rất cao, cao hơn
hẳn độc tố Aílatoxin và các độc tố của vi khuẩn khác. So với độc tố gây bệnh uốn ván, nó
mạnh gấp 7 lần (liều gây chết của độc tố uốn ván là 0,250 mg và của botulin là 0,035 mg).
Mặc dù vậy nhưng độc tố của nó dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, chỉ cần đun thực phẩm lên
đến 100°c trong 10-30 phút thỉ độc tố sẽ bị phá hủy hoàn toàn. Nhưng độc tố này rất bền
vững với men tiêu hóa. Bệnh ngộ độc botulism là một bệnh nhiễm độc do độc tố của vi
khuẩn c.botulinum xâm nhập vào thực phẩm, phát triển và sinh ra độc tố. Người ăn phải
thức ăn có độc tố sẽ bị nhiễm độc. Còn vi khuẩn thường không gây nên bệnh vì nó không
Trang 2
sinh sản được ứong cơ thể con người.
Chính vì vậy ta cần phải tìm hiểu toàn bộ những gì có liên quan đến vi sinh vật để
chúng ta sử dụng tối đa đặc tính có hại và đề phòng những ảnh hưởng của chúng đem lại.
Với ý nghĩa thực tế như vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện khóa luận “ Tìm hiểu quy
trình phát hiện Clostritridium botulinum trong thít” .
m
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu những vi sinh vật gây bệnh trong thịt và đi sâu tìm hiểu quy trình phát
hiện c.botulinum và độc tố botulin của vi khuẩn này. Sau đó đưa ra một số biện pháp
phòng ngừa và kiểm soát vi khuẩn trên. Và từ đó tìm ra những ứng dụng của chúng vào
trong thực tiễn để đem lại lợi ích cho con người.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản về hình thái, cấu tạo di truyền, hoạt động sinh lý,
hoá học, yếu tố độc lực, cơ chế gây độc và những ứng dụng tuyệt vời của c.botulinum.
Khả năng gây bệnh của vi sinh vật trong thực phẩm và mối liên quan của chúng
với các thực phẩm.
Nghiên cứu độc tố botulin của vi sinh vật gây bệnh ứong thực phẩm nhằm ngăn
ngừa các độc tố này.
Trang 3
Chương 2: TỐNG QUAN
2.1. Giói thiêu về thit và vê sinh an toàn thưc phẩm trên thit
2.1.1. Giá trị dinh dưỡng của thịt
Thịt là một trong những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, thịt các động vật máu
nóng như thịt lợn, thịt bò, thịt gia cầm... có chứa nhiều acid amin cần thiết, các chất béo,
chất khoáng, vitamin và một số các chất thơm hay còn gọi là chất chiết xuất. Thịt các loại
nói chung nghèo canxi, giàu photpho. Tỉ lệ Ca/P thấp.
Thịt tất cả các loài nói chung chứa nhiều nước, lượng nước lên tới 70- 75%. Protein
chiếm 15-20%, lượng lipid dao động nhiều (1-30%) tùy thuộc vào loại súc vật và độ béo
của nó. Glucid trong thịt chỉ có rất ít. Lượng ứo khoảng 1%. Giá trị sinh học protein thịt
74%, độ đồng hóa protein thịt 96-97%. Trong thịt ngoài các protein có giá trị sinh học cao,
còn có colagen và elastin là loại protein khó hấp thu, giá trị dinh dưỡng thấp vì thành phần
của nó hầu như không có tryptophan và cystein là hai acid amin có giá ừị cao. Loại này tập
trung nhiều ở phần thịt bụng, thủ, chân giò. Colagen khi đun nóng chuyển thành gelatin là
chất đồng keo. Còn elastin gần như không bị tác dụng của men phân giải protein. Vì vậy ăn
vào và thải ra nguyên dạng. Trong thịt còn chứa một lượng chất chiết xuất tan trong nước,
dễ bay hơi, có mùi vị thơm đặc biệt, số lượng khoảng 1,5- 2% trong thịt. Nó có tác dụng
kích thích tiết dịch vị rất mạnh. Các chất chiết xuất gồm có creatin, camosin (có nitơ) và
glycogen, glucose, acid lactic (không có nitơ). Khi luộc thịt phần lớn các chất chiết xuất
hòa tan vào nước làm cho nước thịt có mùi vị thơm ngon đặc hiệu.
Chất béo có ở tổ chức dưới da, bụng, quanh phủ tạng, bao gồm các axit béo no và
chưa no. Các xịt béo no chủ yếu là palmitic (25-30%) và stearie (16- 28). Các acid béo chưa
no chủ yếu là oleic (35-43%), acid béo chưa no có nhiều mạch kép khoảng 2-7%. Riêng mỡ
Trang 4
gà có 18% acid linoleic và mỡ ngựa có 16% linolenic, đó là những acid béo chưa no cần
thiết mà cơ thể không tự tổng hợp được. Mỡ lợn lớp ngoài có nhiều acid béo chưa no hơn
lớp sâu. về chất khoáng, thịt là nguồn photpho (116-117 mg%), kali (212-259 mg%) và Fe
( 1,1-2,3 mg%) tập trung nhiều ở gan. Vì yếu tố có Cu, Zn, Coban. Lượng Canxi trong thịt
rất thấp (10-15 mg%).
Vitamin: Thịt là nguồn vitamin nhóm B trong đó chủ yếu là BI tập trung ở phần thịt
nạc. Các vitamin tan trong chất béo chỉ có ở gan, thận. Ngoài ra, ở gan, thận, tim, não có
nhiều colesteron và photphatit.
Thịt gia cầm thuộc loại thịt trắng có nhiều protein, lipid, khoáng và vitamin hơn so
với thịt đỏ. [7]
Hình 2.1 Hình ảnh về thít

2.1.2. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của thịt
Thịt là nguồn dinh dưỡng giàu năng lượng, thành phần của thịt gồm có: nước,
protein, glucid, lipid, chất trích ly chứa nitơ và phi nitơ, chất khoáng, vitamin và enzyme..
.Tuy nhiên giá trị của thịt phụ thuộc chủ yếu vào protein. Protein có thành phần cân bằng
thích hợp và tất cả các acid amin cần thiết cho cơ thể. Hàm lượng lipid chứa ứong thịt cũng
Trang 5
có ảnh hưởng quyết định đến độ tăng năng lượng của thịt, làm cho thịt vừa có giá ứị năng
lượng cao vừa góp phần tăng hương vị thơm ngon của thịt. Các chất trích ly trong thịt kích
thích sự ăn ngon miệng và sự tiết dịch tiêu hoá. Thành phần hóa học của các mồ thịt, gồm
có: Mô cơ: 50 - 70%, Mô mỡ: 2 - 20%, Mô xương: 15 - 22%, Mồ liên kết: 914%. Ngoài
ra còn có mô thần kinh và mô máu.
Bảng 2.1: Tỷ lệ giữa các mô trong thịt heo ( % theo khối lượng) [5]
Thít Mồ cơ Mô mỡ Mô liên kết Mô xương
• Sụn và mô
loai
• máu thịt heo
mô 40- 5 8 % 15- 4 6 % 0,6- 0 , 8 % 0,8- 1 8 % 0,6- 0 , 8 %
Bảng2.2: Thành phần dinh dưỡng trong lOOg thịt heo

Thành phần hoá học của thịt tuỳ thuộc vào giống, tuổi giết thịt và vị trí của miếng
thịt trên cơ thể (tỉ lệ mô cơ, mô mỡ, mô liên kết).
Protein Lỉpỉd Glucỉd Nước Tro
Béo 20,3 0,48 71,9 0,52

6,8
Trung bình 17,0 25,3 0,3 56,8
0,6
Gầy 14,5 37,0 47,8 0,5
0,2
Trang 6
Bảng 2.3: Thành phần acid amin không thay thế trong thịt heo[5]
STT Acỉd Amỉn Hàm lượng % trong protein
Lysine 7,82
1
Methionine 2,53
2
3 Trytophan 1,44
4 Phoyllalanine 4,15
5 Threonine 5,16
Valine 5,17
6
7 Leucine 7,58
Isoleucine 4,99
8
9 Arginine 6,410
Histidine 3,2
10
Theo (Bảng 2.3) thì protein của thịt chứa hầu hết các acid amin không thay thế với
lượng đáng kể đáp ứng nhu cầu acid amin hằng ngày. Khi vào cơ thể protein phân giải tạo
thành khoảng 20 loại acid amin. Trong số các loại acid amin đó có chứa 8 loại acid amin
không thay thế được đối với người. Nó giúp cho cơ thể người tổng hợp và sản xuất các tế
bào một cách tốt nhất.
Do đó, thịt là một sản phẩm đặc biệt quan trọng ứong việc giúp cơ thể phát triển, rất
cần thiết đối với phụ nữ mang thai và những người ứong giai đoạn dưỡng bệnh. Ngoài ra,
protein không thay thế của thịt rất cần thiết để xây dựng các mô và phục hồi các tế bào đã
Trang 7
mất, tham gia tạo thành enzyme, acid amin, hoocmon và các thể miển dịch ...Không có
protein cơ thể không tồn tại được. Trong thịt heo chứa hầu hết các chất khoáng cần thiết
cho cơ thể duy trì những hoạt động bỉnh thường của các quá trình sống cân bằng áp suất
thẩm thấu trong tế bào và mô.. .Ngoài ra, thịt heo còn chứa nhiều loại vitamin: Bl, B2, B6,
pp..và các nguyên liệu khác. Tóm lại, hai thành phần protein và lipid của thịt chứa hàm
lượng cao quyết định giá trị dinh dưỡng của thịt. Hơn nữa, mùi vị và màu sắc của thịt có tác
dụng kích thích tiêu hoá. Do đó, trong khẩu phần thức ăn hằng ngày thịt đóng vai trò đặc
biệt quan trọng. Tuy nhiên, cần lưu ý là không nên ăn quá nhiều lượng thịt trong một bữa ăn
mà phải kèm theo các loại rau quả để giảm hàm lượng chất đạm tích tụ trong cơ thể sau khi
ăn và tạo sự cân bằng cho cơ thể.
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của thịt
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng thịt như điều kiện nuôi dưỡng, giới
tính, tuổi giết thịt, giống loài nhưng yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng thịt sau quá trình giết
mổ là quá trình vận chuyển, tồn trữ và giết mổ.
2.1.3.1. Quá trình vận chuyển
- Tránh tác động môi trường làm cho con vật hoảng sợ, căn thẳng thần kinh, gây
tiêu hao các chất dự trữ.
- Hạn chế va chạm cơ học.
- Đảm bảo cung cấp đầy đủ nước cho con vật.
2.1.3.2. Tồn trữ
-Tránh các chất cặn bã và thức ăn thừa nhiễm vào súc thịt sau khi giết mổ con vật.
- Cho uống nước đầy đủ, không làm giảm trọng lượng thịt.
- Cho thú nghỉ ngơi đúng thời gian.
2.1.3.3. Giết mổ
- Nếu thời gian lấy máu dài, tim suy yếu, máu ngưng chảy, thịt bị thâm và có mùi vị
Trang 8
xấu.
- Ngoài những yếu tố trên, phẩm chất thịt của con vật còn phụ thuộc nhiều vào mồi
trường, bệnh lý và các thuốc điều trị bệnh các hóa chất lạ có trong thức ăn.
Trang 9
2.1.4. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng nguyên liệu thịt tươi [9]
❖ Chọn thịt còn tươi mói, không bị đập nát, không có màu, mùi lạ.
Bảng 2.4: Cách lựa chọn thịt tươi
o • • •
STT CHỈ SỐ THIT TƯƠI THIT KÉM TƯƠI VÀ ÔI
• •
1 Trạng - Màng
thái ngoài khô. - Màng ngoài nhớt nhiều hay bắt đàu
bên ngoài nhớt.
- Màu sắc đỏ tươi hoặc đỏ sẫm, óng
- Màu hơi xanh nhạt hoặc hơi thẩm,
ả. thậm chí còn đen, không bóng.
- Mỡ màu tối, độ rắn giảm sút, mùi vị
- Mỡ có màu sắc, độ rắn, mùi vị bình
ôi.
thường.
- Mặt khớp có nhiều nhớt.
- Mặt khớp láng và trong.
- Dịch hoạt đục.
- Dịch hoạt trong.
2 vết cắt - Màu sắc bình thường, sáng, khô.- Màu sắc kém, hơi ướt.
3 Độ rắn -vàRắn chắc, đàn hồi cao. - Khi ấn ngón tay, để lại vết lõm, sau
đàn hồi -Lấy ngón tay ấn vào thịt, không để đó ứở về bình thường, dính tay.
lại vết lõm, khi bỏ ngón tay -raThịt ôi vết lõm không ứở về bình
không bị dính thường ngay được, dính nhiều.
4 Tủy -Bám chặt vào thành ống tủy, màu

-Tủy róc ra khỏi ống tủy, màu tối
trong đàn hồi. hoặc màu nâu, mùi hôi.
5 Nước luộc - Nước luộc trong, mùi vị thơm - Nước luộc đục, mùi vị hôi.
ngon. - Trên mặt lớp mỡ tách thành những
- Trên mặt nồi có một lớp với vết mỡ vết nhỏ.
to. - Thịt ôi nước luộc đục, mùi hôi, hầu
như không còn vết mỡ nữa.
Trang 10
❖ Chỉ tiêu hóa sinh( TCVN 7046 : 2002)

- pH=5.5-6.2
. NH3 < 35 mg / lOOg thịt Phản
ứng H2
- Độ trong của nước luộc thịt cho phép hơi đục khi
phản ứng với CuSƠ4 ❖
Chỉ tiêu vi sinh
- Tổng số vi sinh vật hiếu khí 106 Cfu/g

- E. Coli 102 Cfu/g
- Samonella 0
- B. cereus 102 Cfu/g
- Cỉostridium perỷringens 0
- Cỉostridium botulinum 0
2.1.5. Vệ sình an toàn thực phẩm trên thịt
Thịt là nguồn thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao, được xếp vào thức ăn nhóm I, đồng
thời lại là thức ăn dễ chế biến dưới nhiều dạng món ăn ngon vì vậy nó là thức ăn thường gặp
hàng ngày trong bữa ăn của nhân dân ta. Nếu chúng ta sử dụng thịt không đảm bảo tiêu
chuẩn vệ sinh thì thịt trở nên gây hại cho người sử dụng.
Thịt có thể là nguồn lây các bệnh nhiễm khuẩn như lao, than, tị thư..., các bệnh ký
sinh trùng như sán dây, sán chó... Thịt còn có thể gây ngộ độc thức ăn do vi khuẩn nhiễm
vào thịt hoặc do độc tố chứa sẵn ứong thịt và phủ tạng như cóc (bao gồm da, buồng trứng và
gan) chứa độc chất Buíòtonin, Buíòtoxin. Các loại nhuyễn thể khi chết dễ phân hủy sinh
độc tố Mytilotoxin. Các độc tố này gây liệt thần kinh trung uơng. Nếu ngộ độc nặng người
Trang 11
bệnh có thể chết do liệt hô hấp hoặc tuần hoàn.
2.1.6. Các hệ vi sinh vật gây hư hỏng và ngộ độc trên thịt
2.1.6.1. Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn thương hàn (salmonella)

Thường gặp do ăn thức ăn có nguồn gốc động vật bị nhiễm vi khuẩn thương hàn: gỏi
thịt cá, thịt gia cầm: gà, vịt, cá,.... Bệnh thường biểu hiện sau khi ăn khoảng 4 giờ đến 48
giờ thấy: sốt đau bụng, buồn nôn và nôn, đi ngoài nhiều lần trong ngày, đi ngoài phân có
máu.. .nếu không được điều trị kịp thời và đúng cách, người bệnh có thể tử vong.
Bệnh có thể chuyển sang dạng người lành mang vi khuẩn gây bệnh khi không được
điều trị đủ liều, đúng cách. Những người mang vi khuẩn ở dạng này thường xuyên thải vi
khuẩn thương hàn ra theo phân, nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời sẽ là nguồn ô
nhiễm với thực phẩm và môi trường xung quanh.
2.1.6.1. Ngộ độc thức ăn do vỉ khuẩn tụ cầu vàng (staphylococcus aureus) Thường gặp do
ăn thức ăn giàu đạm bị nhiễm vi khuẩn tụ cầu như: thịt, cá,
trứng, sữa, các loại súp ......... Vi khuẩn tụ cầu có nhiều trên da, họng khi bị viêm
nhiễm, và có trong không khí, nước...nên quá trình chế biến và bảo quản không họp vệ sinh
rất dễ nhiễm các vi khuẩn này vào thực phẩm.
Ăn thức ăn có nhiễm tụ cầu hoặc độc tố của chúng đều có thể bị ngộ độc. Bỉnh
thường, triệu chứng xuất hiện sớm ứong 30 phút đến 4 giờ sau khi ăn. Người bệnh thường
nôn thức ăn vừa ăn xong, đi ngoài nhiều lần phân toàn nước, mệt mỏi, có thể có đau đầu hôn
mê nếu nhiễm phải độc tố của tụ cầu. Bệnh không đuợc điều trị kịp thời dễ tử vong do mất
nước và điện giải. Điều trị tích cực, bệnh thường khỏi nhanh và phục hồi tốt.
2.ỉ.6.3. Ngộ độc thức ăn do vỉ khuẩn độc thịt (Clostrỉdium botuỉium)
Đây là loại vi khuẩn kỵ khí có nha bào, thường có ứong thức ăn đóng hộp, để lâu.
Biểu hiện ngộ độc thường sau khi ăn 2 giờ đến 48 giờ có các dấu hiệu: buồn nôn, nôn,
Trang 12
chóng mặt, nhức đầu, mệt mỏi, người bệnh khó thở và hôn mê. Nếu không được điều trị và
xử lý kịp thời tỷ lệ tử vong rất lớn.
2.1.6.4. Ngộ độc thức ăn do vỉ khuẩn Escherỉchia colỉ (E.Coli)
Vi khuẩn này có nhiều trong phân người và gia súc. Trong quá trình chế biến thiếu
vệ sinh, không có thói quen rửa tay trước khi ăn hay trước khi chế biến thực phẩm, bảo
quản thực phẩm không tốt để các loại côn trùng xâm nhập mang theo vi khuẩn E. Colỉ từ
phân, rác vào thức ăn. Biểu hiện ngộ độc thức ăn do nhiễm E. Colỉ thường sau 4 giờ đến 48
giờ có các dấu hiệu đau bụng đi ngoài phân có máu hay nhiều nước tùy theo từng loại vi
khuẩn E. Coli.
Bệnh có thể tử vong do nhiễm độc hay mất nước nếu nhiễm E.Coli 0.157 hay các
loại E.Colỉ khác gây bệnh giống như vi khuẩn tả. Bệnh được điều trị sớm và xử trí đúng
cách sẽ phục hồi nhanh chóng.
Trang 13
2.2. Giới thiêu về C.botulinum
2.2.1. Giói thiệu chung C.Botulỉnum

Giới (domain): Bacteria
Ngành (phylum) : Fỉrmicutes

-v i\
Lớp (class): Clostridia

z
• XJ»«Ý <.
ì* 1 i. L1 A;Ã; *.
Bộ (ordo) : Clostridiaỉes
Họ (familia) : Clostridiaceae
Chi (genus) : Clostridium

^/1 cỳy
\'%
•' ✓ e*i
Loài (species) : c. Botulinum

Hình 2.2 Clostridium botulinum
2.2.2. Lịch sử phát hiện
Clostridium botulinum lần đầu tiên được công nhận và cô lập năm 1896 bởi Emile van
Ermengem từ nơi chế biến thịt đùi lợn dính líu vào một ổ dịch botulism. Các cô lập ban đầu
được đặt tên là Botulinus bacillus. Tuy nhiên, cô lập từ các ổ dịch tiếp theo luôn luôn tìm thấy là
những bào tử dạng kỵ khí, do đó, Bengston đề xuất sinh vật được đặt vào chi Clostridium.
Từ năm 1953 tất cả các loài sản xuất độc tố thần kinh botulinum (loại AG) được xác
định là c. botulinum. Bằng chứng tồn tại số kiểu hình và kiểu gen đáng kể đã chứng minh sự đa
dạng trong loài. Điều này đã dẫn đến sự phân loại lại của c. botulỉnum loại G giống như là một
loài mới Argentinense clostridium.
Chửng c.botuỉinum không sản xuất ra chất độc botulin được gọi là sporogenes
Clostridium.
Năm 2003 bộ gen của c.botulinum được công bố với công trình của viện Sanger với
Tiến sĩ Roger Huston và Tiến sĩ M. Peck.
Trang 14
2.2.3. Kiểu hình

Các danh pháp của c.botuỉinum công nhận bốn nhóm sinh lý (I-IV). Điều này chủ yếu
dựa trên khả năng sinh vật có thể tiêu hóa protein phức tạp. Nghiên cứu DNA và cấp rRNA hỗ
trợ các phân khu của loài này thành các nhóm I-IV. Hầu hết các ổ dịch của botulism con người
là do nhóm I (thủy phân protein) hoặc II (không thủy phân protein) c. botulỉnum nhóm III chủ
yếu là các sinh vật gây bệnh ở động vật. Hiện đã có hồ sơ về c.botulỉnum nhóm rv con người
và động vật gây bệnh.
2.2.4. Đặc điểm chung của c.botulinum
Cỉostrỉdỉum là các vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di
động, có thể thủy phân đường và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. Hầu hết
nhóm Clostridium đều ưa nhiệt vừa tuy nhiên có một số loài ưa nhiệt và một số loài thuộc nhóm
ưa lạnh. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là c.botulinum và c.perýringens.
c. botulỉnum là loài sống kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng được ứong môi trường trung
tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Các dòng trong loài này có các đặc điểm
nuôi cấy khác nhau và có 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A-F. K. Kiểu kháng nguyên A,
B và F có hoạt tính thủy phân protein tạo nên một vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc ứên môi
trường Willis và Hobbs, còn các kiểu c, D, E không có khả năng này. Kiểu A thường thấy trên
các mẫu thịt trong khi kiểu E chỉ được phân lập ứên các mẫu cá.
Mật độ vi khuẩn Clostrỉdỉum được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri
ammonium citrate và disodium sulphate, ủ ở 37°c ứong 1-2 ngày. Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt
thì ủ thêm ở 50°c. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng
giữa ion sulphite (S2‘ ) và ion sắt (Fe2+ ) có trong môi trường.
Độc tố botulin được sản xuất bởi c.botuỉỉnum được cho rằng là vũ khí sinh học tiềm
năng, mất khoảng 75 ng để giết một người (LD50 của lng/kg, giả định một người trung bỉnh
nặng ~ 75kg); 500 gram của nó sẽ là đủ để giết một nửa số dân số toàn bộ con người.
Trang 15
c.botulinum là một loại vi khuẩn đất. Các bào tử có thể tồn tại ở hầu hết các mồi trường
và rất khó để giết.
Sự tăng trưởng của vi khuẩn có thể được ngăn chặn bởi acid cao, tỷ lệ của đường hòa tan cao,
nồng độ oxy cao, độ ẩm thấp hoặc lưu trữ ở nhiệt độ dưới 38° F (loại A).
Ví dụ: Mật ong, sừo bắp và chất ngọt khác có thể chứa các bào tử nhưng không có thể
phát triển trong nồng độ đường cao độ tuy nhiên khi nồng độ đường bị pha loãng trong oxy
thấp, acid thấp ứong hệ thống tiêu hóa của trẻ sơ sinh thì các bào tử có thể phát triển và sản xuất
chất độc. Ngay sau khi trẻ bắt đầu ăn thức ăn rắn, các loại nước tiêu hóa ừở nên quá chua cho vi
khuẩn phát triển.
2.2.5. Đăc điểm sình hóa
c.botulinum không thể phát triển ở pH acid thấp hơn 4.5. Nồng độ muối trên 1% có thể
ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn, c.botulỉnum không thể sử dụng lactose như một nguồn
cacbon chính, c.botulỉnum có thể được chia thành 4 nhóm và 7 độc tố vào đặc điểm sinh lý và
sinh hóa cũng như tính nhạy cảm của độc tố.
Bảng 2.5: Phân loại và đặc điểm của độc tố botulỉn [12]
Trang 16
Đăc điểm • Các loai •

Nhóm
I
Phân giải protein, sản xuất bào tử Tấc cả các loại A, các chủng phân
kháng nhiệt độ tăng trưởng tối giải protein của B và F.
thiểu 10°c.
II
Không phân giải protein, sản xuất bào Tất cả các loại E, và chủng phân giải
tử có khả năng chịu nhiệt thấp và tăng protein của B và F.
trưởng ở nhiệt độ thấp.
Không phân giải protein, ít được biết Tất cả các loại c và D chủng.
III
đến vì dòng này không liên quan bệnh

ngộ độc botulin ở người.
IV
Phân giải protein, không phân giải
saccharose, ít biết đến khả năng chịu
nhiệt của bào tử.
2.2.6. Cấu trúc

2.2.6.1. Cẩu trúc phân tử
Bộ gen của c.botulinum là 3.886.916 bp, ứong đó G + c của khoảng 28,2%. Ngoài ra
còn có một plasmid 16.344 bp.
Toxin được tổng hợp từ một chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử gần 150.000
dalton. Ở cấu trúc này, phân tử độc tố có hoạt lực tương đối thấp, nhưng khi bị một số enzym
của vi khuẩn và trypsin tách ra thành hai chuỗi nặng (100.000 dalton) và nhẹ (50.000 dalton)
nối với nhau bằng cầu nối sulíiư có gắn với một phân tử Zn. cầu nối S-S đóng vai trò quan trọng
trong việc thâm nhập và sự phân cắt của nó bằng cách phân hủy bỏ độc tính.
Trang 17
Hình 2.3 Cấu trúc phân tử
Chuỗi nặng có thể được chia theo chức năng dựa vào nhóm amin khởi đầu và kết thức
bằng nhóm cacboxyl.
Chuỗi nhẹ ( amino acid 1 - 448) hoạt động như một enzym tiêu hóa kẽm, với hoạt động
thủy phân protein tập trung tại đầu tận cùng - N ( đầu tổng họp đầu tiên của nhóm NH2 tự do).
Chuỗi nặng ( amino acid 499 - 1280) cung cấp tính đặc thù tiết axetycholin, thúc đẩy sự vận
chuyển của chuỗi nhẹ qua màng endosomal của chất truyền thần kinh.
Nếu liên kết disulphide bị gãy trước khi độc tố vào trong tế bào, chuỗi nhẹ không thể vào
màng cuối sợ trục, và gần như mất độc tính hoàn toàn.
2.2.7. Yếu tố độc lực của C.botulỉnum
m M
2.2.7.1. Đặc điểm của độc tổ
Độc tố botulin do vi khuẩn c.botulỉnum sinh ra (độc tố gây chết do làm suy hô hấp). Vi
khuẩn c.botulinum có dạng hình que, sinh nha bào có sức đề kháng cao (đun sôi ở độ cao bằng
mặt nước biển cũng không giết chết được vi khuẩn). Để tồn tại, c.botuỉỉnum cần rất ít oxy. Độc
lực của botulin rất cao (chỉ cần 1 microgam hay 1 phần triệu gam đã có thể làm chết một người,
một giọt chất độc này có thể làm chết cả trăm ngàn người). Nếu quy trình chế biến bảo quản
không tốt trong chế biến thực phẩm (nhất là đồ hộp), thực phẩm có thể bị nhiễm vi khuẩn này.
Trang 18
Phương pháp làm sôi kết hợp với điều áp có thể diệt được vi khuẩn. Nha bào của vi khuẩn
không phát ừiển trong những đồ hộp có hàm lượng đường cao như mật ong, sừô nhưng có khả
năng phát ứiển khi vào đường tiêu hóa của trẻ sơ sinh.
Ngộ độc botulin là một loại ngộ độc thực phẩm nặng do ăn các loại thực phẩm có chứa
chất độc thần kinh mạnh được hình thành trong sự phát ứiển của cơ thể. Độc tố không bền nhiệt
và có thể bị phá hủy nếu đun nóng ở 80°c trong 10 phút hoặc lâu hơn. Các tỷ lệ mắc bệnh
thấp, nhưng bệnh được quan tâm đáng kể vì tỷ lệ tử vong cao nếu không được điều ừị ngay lập
tức và đúng cách.
❖ Có ba loại chính của botulism
- Botulism thực phẩm là kết quả từ thực phẩm bị ô nhiễm, trong đó bào tử
c.botulinum được sinh ra trong điều kiện yếm khí, điều này thường xảy ra trong
thực phẩm đóng hộp.
- vết thương botulism là do độc tố sản xuất từ một vết thương bị nhiễm
c.botulinum, điều này trở nên phổ biến hơn ở người dùng
thuốc tiêm tĩnh mạch kể từ năm 1990, đặc biệt là những người sử dụng ma
túy đen (black tar heroin) và những người tiêm ma túy vào da hơn là tiêm
vào các tĩnh mạch.
- Botulism trẻ sơ sinh là do tiêu thụ các bào tử của vi khuẩn c.botulinum, mà
sau đó phát triển ứong ruột và được hấp thu vào máu, việc tiêu thụ mật ong
trong những năm đầu tiên của cuộc sống được xác định là yếu tố nguy cơ
botulism ứẻ sơ sinh .
Tất cả các hỉnh thức botulism có thể gây tử vong và được xem là trường hợp khẩn cấp y tế.
Botulism thực phẩm có thể được đặc biệt nguy hiểm vì nhiều
người có thể bị ngộ độc do ăn thực phẩm bị ô nhiễm.
Bảng 2.6: Bảng phân loại yếu tố độc lực
Trang 19
Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IY
Độc tố A, B,F B, E,F c, D G

Proteolysis + Yếu
- -
Saccharolysis +
- - -
Species Động vật

Con người, động Con người, động
vật vật
Độc tố gen Nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể Bacteriophage Plasmid
Close relative c.spororgenes C.butyricum c.subterminale
c .haemolyticum
C.putriíícum C.beijemickii C.haemolyticum
c.novyi type A
2.2.7.2. Cơ chế gây độc
Hình 2.4 Cơ chế gây độc của độc tố botulin [12]

Khi phát triển trên thực phẩm, c.botulinum tiết độc tố acethylcholine là một chất
dẫn truyền thần kinh gây đáp ứng bằng tình hạng co thắt cơ. Botulin tác động như một
độc tố thần kinh mạnh làm ức chế phóng thích acetylcholine, do đó gây kết quả như cắt
dây thần kinh bằng chất hóa học, gây liệt phản hồi. Mặc dù có đến 7 loại BTX ( A, B, Cl,
D, E, F, G) gây liệt phản hồi do ức chế phóng thích acetylcholine tại đường nối thần kinh
Trang 20
- cơ của các sợi cơ vân, chúng lại không giống nhau tại vị trí gắn kết trên tế bào niêm mạc
và vị trí tác động. Có 7 loại nhưng 3 loại A, B và E thuộc loại hay gây ngộ độc và nguy
hiểm, gây chết người do tác động lên hệ thống thần kinh. Thời kỳ ủ bệnh thường là 12-36
giờ nhưng cũng có thể từ 2 giờ đến 8 ngày với các hiệu chứng lâm sang như đau bụng,
buồn nôn, đau đầu, chóng mặt, hoa mắt có khi nhìn đôi, khó nuốt, khó thở... Ngộ độc c.
botuỉinum còn phụ thuộc vào rất nhiều điều kiện như yếu tố môi trường, đặc tính thực
phẩm, biện pháp bảo quản, tập quán sinh hoạt và ăn uống của nhân dân mà nguồn thực
phẩm gây ngộ độc cũng khác nhau.
2.2.7.3. Cơ chế gây bệnh
Khi hoạt động của dây thần kinh vận động tạo nên sự khử cực ở đầu cuối của sợi
trục (axon), acetylcholine sẽ được phóng thích từ tế bào chất vào khe synapse. Sự phóng
thích acetylcholine được thực hiện bởi một chuỗi protein vận chuyển, phức họp solule
N-ethylmalemide-senitive factor attachment protein receptor (SNARE) ( yếu tố có thể
hòa tan nhạy với N-ethylmalemide gắn lên thể nhận protein).
Khi độc tố botulin thâm nhập vào mô dịch, chuỗi nặng của độc tố thần kinh
botulin này sẽ gắn chuyên biệt lên phân tử glycoprotein được tìm thấy ở điểm cuối của
dây thần kinh tác động kiểu cholin. Sự gắn chuyên biệt này nguyên nhân cho tính chọn
lọc cao của độc tố botulin đối với synapse tác động kiểu synapse. Sau khi xâm nhập,
chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh botulin gắn chuyên biệt lên phức họp SNARE. Tùy các
loại botulinum toxin khác nhau sẽ có các protein đích khác nhau. Botulinum toxin-A
được tách thành SNAP-25, botulinum toxin-B được tách thành vách VAMP. Sự phân cắt
chuỗi nhẹ của phức họp protein trong màng tế bào là kết quả là dẫn tới sự khóa chặt các
lỗ hổng. Khi mô đích là một phần cơ, xảy ra sự liệt nhẹ do xảy ra sự cắt bó dây thần kinh
hóa học. Khi mồ đích là tuyến ngoại tiết thì sự liên kết các chất ở các tuyến ngoại tiết thì
sự tiết các chất ở các tuyến này bị khóa chặt. Sự ức chế quá trình xuất bào của
Trang 21
acetylcholine bị loại bỏ bằng cách khôi phục lại sự thay thế của phức họp protein
SNARE.
Trang 22
SNAR
(teuronuscưaí Syn3ptfc A Normal Neurotransmitter
SNARE Release
Vesicle and
E vkinctio Vosicĩo Proteins Form Terminal
Proto.n
s o Motor ÌO®Q(ị Complex Mombranes
Fu$o :
ìĩỉ. -V. ằ
Norvo 3
KHÓA LUẬN TỐT>mínu$
NGHIỆP GVHD: TH.S PHẠM MINH NHựT
Muscle Fiber Contracts
Nourotrans
mi Reieasod
Hình 2.5 Cơ chế gây bệnh của Clostrìdium botulinum
2.2.8. Hội chứng ngộ độc thịt [7]

Botulism là một căn bệnh bại liệt hiếm nhưng nghiêm trọng do botulin là độc thần kinh
và là sản phẩm của vi khuẩn c.botulinum.
2.2.8.1. Bệnh và các triệu chứng
Các triệu chứng cơ bản của botulism gồm : làm tổn thương hệ thần kinh trung ương (đặc
biệt là đến các tín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất là liệt cơ mắt (không có phản ứng
với ánh sáng, song thị), liệt cơ vòm miệng, lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là
gây liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn đến tử vong.
Trang 23
Hình 2.6 Vịt bị tê liệt do độc tố botulin
Trẻ sơ sinh với botulism sẽ xuất hiện nôn nửa, kém ăn, táo bón, khóc yếu và cơ không
phát triển. Nếu không chữa trị, những hiệu chứng này có thể phát hiển gây tê liệt cánh tay, chân,
thân và các cơ bắp hô hấp. Các triệu chứng thường bắt đầu từ 18 - 36h sau khi tiêu thụ thực
phẩm bị ô nhiễm, nhưng cũng có thể xảy ra sớm nhất là 6g hoặc trễ là 10 ngày sau khi tiêu thụ.
Botulism có nhiều loại A, B, c, D, E nhưng loại A, B, E cho độc tố mạnh nhất.
Hình 2.7 Trẻ em bị nhiễm botulỉsm

2.2.8.2. Phát hiện và điều trị
Cách trực tiếp và hiệu quả nhất để xác định chẩn đoán lâm sàng của botulism trong
phòng thí nghiệm là chứng minh sự hiện diện của chất độc trong huyết thanh hoặc phân của
Trang 24
bệnh nhân hoặc ứong thực phẩm bệnh nhân tiêu thụ. Hiện nay, phương pháp sử dụng rộng rải
nhất để phát hiện chất độc là thử nghiệm trung hòa ở chuột, trong đó bao gồm việc tiêm huyết
thanh hoặc phân người bệnh vào chuột và tỉm kiếm các dấu hiệu của botulism, thử nghiệm này
thường mất 48 giờ. Nuôi mẫu vật mất từ 5 - 7 ngày.
Những suy hồ hấp và tê liệt nghiêm trọng xảy ra với botulism có thể để bệnh nhân sử
dụng máy thở (thông gió) cho 1 tuần, cộng với chuyên sâu về y tế và chăm sóc điều dưỡng. Sau
vài tuần, tê liệt từ từ được cải thiện. Nếu chẩn đoán sớm, botulism thực phẩm và botulism vết
thương có thể được điều trị bằng một khối chất kháng độc, hoạt động của các độc tố lưu hành
ứong máu này có thể ngăn ngừa bệnh xấu đi, nhưng phục hồi vẫn phải mất nhiều tuần lễ. Bác sĩ
có thể thử loại bỏ thực phẩm bị ô nhiễm còn trong ruột bằng cách cho nôn ra hoặc rửa ruột. Đối
với vết thương cần được điều trị, thường là phẫu thuật, để loại bỏ các nguồn sản xuất vi khuẩn
chất độc hại này bằng cách cung cấp thuốc kháng sinh thích họp. Hỗ trợ chăm sóc tốt tại bệnh
viện là yếu tố chính của liệu pháp cho tất cả các hình thức bị nhiễm botulism.
2.2.8.3. Biện pháp phòng và kiểm soát bệnh
❖ Các biện pháp phòng

- Sử dụng thực phẩm tươi, sạch.
- Bảo quản thực phẩm : ưóp muối, ướp lạnh thực phẩm ngay sau khi sơ chế thực
phẩm.
- Không sử dụng thực phẩm sống : gỏi cá, mắm tôm hoặc các loại mắm ăn sống...
- Đun nấu lại thức ăn, thực phẩm đóng hộp.
- Không ăn tiết canh, lòng nấu chua chín.
- Vệ sinh nấu nuớng, thực phẩm, rửa tay sạch trước khi pha chế nấu nướng thức ăn
và trước khi ăn.
- Sử dụng sữa tiệt trùng ở nhiệt độ cao, sữa và các chế phẩm sữa theo tiêu chuẩn
Trang 25
HACCP đảm bảo vệ sinh và chất lượng an toàn thực phẩm, sữa có chứa sữa non
colostrum giàu kháng thể ngừa bệnh tật.
- Thực phẩm nghi ngờ có vi khuẩn độc thịt nên đun sôi liên tục trong 2 giờ.
- Các đồ hộp thịt, cá thấy bị phòng thì loại ngay.
♦♦♦ Các biện pháp kiểm soát
- Các biện pháp để ngăn chặn botulism bao gồm giảm mức độ ô nhiễm vi sinh vật,
quá trình acid hóa, giảm mức độ ẩm, và bất cứ khi nào có thể, tiêu hủy tất cả các
bào tử botulism ứong thực phẩm. Chế biến thực phẩm đóng hộp đúng cách sẽ
không có sự hiện diện củac. botulinum.
- Một thực phẩm có thể chứa c. botulỉnum vẫn không có khả năng gây ra botulism
nếu các sinh vật không phát ứiển, không có độc tố được sản xuất. Mặc dù, nhiều
loại thực phẩm đáp ứng các yêu cầu về dinh dưỡng cho sự phát triển của c.
botulỉnum, không phải tất cả đều cung cấp các điều kiện kỵ khí cần thiết.
2.2.9. Những ứng dụng tuyệt vời của c.botulinum
2.2.9.1. Trong y học
- Chữa chứng giật mỉ mắt

Vài chục năm trước, các thầy thuốc đã có suy nghĩ độc đáo: tiêm botulotoxin (BoNT-A)
vào cơ mắt, làm liệt có mức độ các cơ này sẽ chữa được bệnh mắt hay giật. Thử nghiệm này
thành công, trở thành liệu pháp chữa giật mi mắt hiệu quả.
- Chữa chúng co cứng cơ
Tiêm vào cơ ở chỗ tận cùng thần kinh BoTX-A ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền
acetylcholin, làm giảm sự co cứng cơ. Sau tai biến mạch máu não có 60% người bị co cứng cơ
chi ừên và chỉ 5% ứong số này có thể hồi phục. Co cứng chi trên cùng với việc mất đi các phản
ứng kết hợp khéo léo làm cho người bệnh khó khăn trong vận động, không thể chủ động ứong
cuộc sống (khó mặc quần áo, cầm thìa nĩa, khó rửa lòng bàn tay). Tiêm tại chỗ, BoTX-A chỉ cho
Trang 26
tác dụng khu trú, không tác động trên các cơ lành, cũng không gây ra các tác dụng độc chung.
Tương tự như cơ chế trên, tiêm BoTX-A vào ở chỗ nối thần kinh - cơ sẽ gây liệt cơ vân nên
chống được tắc nghẽn niệu do phì đại tiền liệt tuyến.
- Chữa chứng tiết nhiều nước bọt
Trong các bệnh thần kinh như Parkinson, bại não, thoái hoá thần kinh, đột quỵ, xơ cứng
bên (amyotrophic lateral sclerosis) thường có chứng tiết nhiều nước bọt, ảnh hưởng không tốt
đến hình ảnh, hoạt động giao tiếp của người bệnh. Lần lượt có nhiều tác giả Friedman, Potuska,
Jongerius (2001); Suskin, Tuilon, Bothvvell (2002), Ellies (2002-2003); Cheng, Mancini
(2003) đã nghiên cứu dùng BoTX-A và BoTX-B chữa chứng này. Các nghiên cứu này tuy chưa
lớn, nhưng đều nhận thấy có hiệu quả, chưa ghi nhận tai biến, trừ trường hợp trong bệnh xơ
cứng bên. Tuy nhiên, ứong bệnh xơ cứng bên, nếu tiêm vào tuyến mang tai hay các tuyến dưới
hàm cũng giảm thiểu được tai biến này.
- Điều trị bướu lành tuyến tiền liệt
Tiêm độc tố botulinum không phải là phương pháp điều ứị dứt điểm triệu chứng bí tiểu
do bướu lành tiền liệt tuyến mà chỉ là điều ứị ứiệu chứng nhằm cải thiện chất lượng cuộc sống
của bệnh nhân thông qua việc làm giảm co thắt của các cơ vùng cổ bọng đái và theo nghiên cứu
có thể một phần làm giảm kích thước bướu thông qua quá trình chết có lập trình nên chỉ định
của chúng tôi là bệnh nhân già yếu không thể thực hiện phẫu thuật được và không hy vọng có
thể điều trị dứt điểm bệnh lý bướu của bệnh nhân. Vì thế vấn đề truy tầm ung thư tiền liệt tuyến
đối với các bệnh nhân này là không đặt ra. Tuy nhiên theo nghiên cứu của một số tác giả sau khi
tiêm thuốc một thời gian thì PSA có giảm nhưng chúng tồi hoàn toàn không có kinh nghiệm về
vấn đề này. Để hiểu biết hơn lý do tại sao PSA có giảm và thời gian tác dụng lâu hơn 6 tháng
chúng tôi có tiến hành sinh thiết tiền liệt tuyến trước và sau tiêm độc tố botulinum thì nhận thấy
các tế bào tuyến dẹt đi nhiều nên có thể phỏng đoán độc tố botulinum có khả năng làm giảm các
tế bào tuyến chứ không chỉ đơn thuần tác động trên thần kinh, và do ảnh hưởng trên tế bào tuyến
Trang 27
tiền liệt nên làm giảm PSA.

Trong nhóm nghiên cứu này chúng tôi có một bệnh nhân có tổng trạng tương đối nhưng
mắc đồng thời bướu tiền liệt tuyến và bướu bàng quang nên không giải quyết bướu tiền liệt
tuyến đồng thời với bướu bàng quang vì sợ gieo rắc tế bào bướu nên bệnh nhân chấp nhận cắt
đốt bướu bàng quang trước và bơm độc tố botulinum để có thể tạm tiểu được và sẽ giải quyết
triệt để bướu tiền liệt tuyến sau. Ngoài ra chúng tôi cũng có một bệnh nhân có ca gan phối
hợp,đơn vị bạn ngại giải quyết phẫu thuật nên chuyển thực hiện tiêm độc tố botulinum. Từ đó
chúng tôi nhận thấy tiêm độc tố botulinum là phương pháp điều ứị thích hợp cho các bệnh nhân
bị ung thư giai đoạn tiến xa và đồng thời bị bí tiểu do bướu tiền liệt tuyến
+ Đường tiêm độc tổ botulinum
Có 2 đường dùng để tiêm thuốc là đường qua tầng sinh môn: có thể thực hiện mù dưới
sự hướng dẫn của ngón tay hay dưới hướng dẫn của siêu âm qua ngã trực tràng. Còn đường thứ
hai là qua niệu đạo với máy soi niệu đạo bàng quang. Đường tiêm thuốc qua tầng sinh môn
được thực hiện đầu tiên và tỏ ra có hiệu quả. Tuy nhiên theo một số tác giả đường nào cũng hiệu
quả như nhau, lựa chọn đường tiêm thuốc chủ yếu là theo kinh nghiệm của thầy thuốc cũng như
dựa vào trang thiết bị của cơ sở. vấn đề chủ yếu là tiêm được vào tiền liệt tuyến ở gần cổ bàng
quang và ở gần vùng cơ trơn niệu đạo. Thường các nhà Niệu khoa thích tiêm thuốc ngã xuyên
niệu đạo còn nếu được thực hiện bởi một bác sĩ chẩn đoán hình ảnh thì chọn ngã qua tầng sinh
môn.
+ Thời gian để có hiệu quả
Theo các nghiên cứu trước để có hiệu quả nên chờ đợi từ 5-7 ngày để có tác dụng . Ở các
bệnh nhân của chúng tôi sau thời gian 7 ngày bệnh nhân được rút thông và tự tiểu được nhưng vì
còn tiểu gấp với lượng nước tiểu ít nên chưa kịp khảo sát niệu dòng đồ, chúng tôi có hẹn bệnh
nhân quay trở lại sau một tuần để khảo sát niệu dòng đồ thấy tiểu thông Qmax < lOml/giây tuy
dòng tiểu vẫn còn yếu hơn ở người trẻ nhưng các bệnh nhân đều rất hài lòng. Có một số trường
Trang 28
họp sau đặt thông tiểu một thời gian bệnh nhân có thể tiểu được sau khi rút thông nên có thể lầm
với hiệu quả của thuốc nhưng ở các bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu bị bí tiểu từ nhiều tuần đã
được đặt thông tiểu lưu và dùng nhiều thuốc vẫn không hiệu quả, chỉ sau khi tiêm thuốc bệnh
nhân mới tự tiểu được nên chúng tôi cho là do hiệu quả của thuốc.
+ Lý do thất bại
Như đã đề cập trong phần kết quả trong loạt nghiên cứu này chúng tôi có một trường họp
thất bại do bọng đái không co bóp nên có thể phải thực hiện đo áp lực đồ bọng đái như là xét
nghiệm tiền phẫu trước khi tiêm độc tố botulinum nhưng việc này ít khả thi vỉ đa số bệnh nhân
đều quá già, nhiều bệnh phối hợp nên ít nhiều đều có ảnh hưởng lên trương lực cơ chóp bọng
đái nên nếu thấy giảm trương lực bọng đái cũng không thể cho là chống chỉ định của thủ thuật
tiêm độc tố botulinum.
• KẾT LUÂN
Cho tới thời điểm hiện nay cắt đốt nội soi tiền liệt tuyến là phương pháp điều trị chủ yếu
cho các bế tắc đường tiểu do bướu tiền liệt tuyến nhưng vẫn không thể giải quyết được tất cả
những tình huống phức tạp như ở các bệnh nhân quá già, có nhiều bệnh lý phối họp, tiêm độc tố
botulinum có thể là một trong các biện pháp hữu hiệu để giải quyết các tình huống này. Tuy
nhiên, do chưa có nhiều kinh nghiệm nên để xác định được hiệu quả của phương pháp này
chúng ta cần phải có những nghiên cứu lâu dài với số lượng bệnh nhân lớn hơn.
- Chữa chứng tiết mồ hôi khu trú nguyên phát
Nghiên cứu của Naumann (2001 và 2002) cho biết: ứong trường họp đổ mồ hôi vừa và
nặng, dùng BoTX-A tiêm dưới da cho hiệu quả tới 94% ừong khi ở nhóm chứng chỉ đạt 36%.
Trong thử nghiệm này, nhóm chứng cho tác dụng phụ nhiễm khuẩn cao hơn nhóm tiêm
BoTX-A. Các tác giả sau đó Dressler, Benecke, Baumann, Halem (2003) cũng lặp lại thử
nghiệm này với BoTX-B cho kết quả tương đương, tuy nhiên có gặp tác dụng phụ là làm khô
miệng, gây khó khăn ứong điều tiết mắt. Hiện BoTX-A được chỉ định chính thức dùng cho
Trang 29
chứng tiết mồ hôi khu trú vừa và nặng tại nhiều nước như Canada, Australia, Vương quốc Anh.
Hình2.8 Botox giúp ngăn đổ mồ hôi và chữa chứng đau cơ xương -Chữa
chứng đau cơ xương
Foster (2001) đã thử nghiệm dừng BoTX-A điều trị đau cơ xương thắt lưng mãn tính.
Các kết quả cho thấy: trên nhóm dùng BoTX-A có 73% người dừng giảm được 50% các hiệu
chứng (tính theo thang điểm nhìn) và có 67% giảm được sự tàn tật (đánh giá bằng bộ thang
điểm câu hỏi đau thắt lưng OLBPD), trong khi trên nhóm chứng các tỷ lệ tương ứng này chỉ là
25-19%. Lang (2003) cũng đề nghị dùng BoTX-A để cải thiện đau do làm giảm trương lực,
giảm hoạt động quá mức của cơ, coi như một liệu pháp giảm đau đa phương thức, có lợi hơn
cách trước đó là làm hồi phục chiều dài bình thường và sự cân bằng sinh học của cơ.
-Chữa các chứng đau nhức đầu
Có thể tiêm BoTX-A vào các cơ vùng mặt hay vào các điểm đau cho các trường hợp
nhức đầu mà nguyên nhân chưa xác định rõ. Nghiên cứu hồi cứu
(Blumenfeld-2003): trong 271 người (bao gồm 29 nhức đầu Migraine, 19 nhức đầu do căng
thẳng, 74 bị nhức đầu hỗn hợp, 154 nhức đầu mãn tính xảy ra hàng ngày) dùng BoTX-A thấy
làm giảm được số ngày nhức đầu tính theo tháng từ 19 xuống 8 ngày, giảm được cường độ đau
từ 2,4 điểm xuống 1,8 điểm. Cũng như thế với 263 người khác cũng thấy có 85% số người dùng
BoTX-A giảm được về số ngày nhức đầu trong tháng, giảm được cường độ đau. Trước đó
Silberstein (2000) và Foster (2001) thực hiện các thử nghiệm có đối chứng với giả được cho
Trang 30
biết BoTX-A thực sự có lợi ích trên chứng nhức đầu. Tsui (1986) và Brashear (1999) cũng thấy
BoTX-A, BoTX-B có làm giảm đau ứên các rối loạn trương lực cổ.
♦> Tồ chức thực phẩm và dược phẩm (Mỹ FDA) cho phép Fỉdaxomỉcỉn
điều trị nhiễm Clostridium difficile (CD) cho trẻ từ 16 tuổi trở xuống
Mỗi năm nhiễm C.difficile ảnh hưởng đến 700.000 người dân Mỹ và thường được chỉ
định các kháng sinh phổ rộng (Cephalosporin hay Flouroquinolone) tuy nhiên việc sử dụng này
ảnh hưởng đến hệ vi khuẩn đường ruột và cho phép C.dịffĩcỉle phát triển, vấn đề được đặt ra ở
bệnh viện và cả cộng đồng là khi sử dụng các kháng sinh trên thì thất bại điều trị và tỷ lệ tái phát
ngày càng tăng.
Fidaxomicin là thuốc đầu tiên trong nhóm kháng sinh Macrolide mới phổ hẹp hoạt động
bằng cách ức chế men Polymerase RNA. Qua quan sát các nghiên cứu lâm sàng, Fidaxomicin
tiêu diệt C.dỉffĩcile một cách chọn lọc, ít ảnh hưởng đến hệ vi khuẩn đường ruột. Điều này giúp
ruột ứở lại điều kiện sinh lý bình thường và từ đó giảm tỷ lệ tái phát C.dỉffĩcile .
Theo các báo cáo trước đây đăng trên Medscape Medical News, dữ liệu từ 2 thử nghiệm
lâm sàng giai đoạn 3 đã chứng minh Fidaxomicin hiệu quả điều trị không kém hơn so với
Vancomycin. Tỷ lệ tái phát thấp hơn khi điều trị C.difficile cho người lớn.
Fidaxomicin hiện đang được FDA và Hội đồng Châu Âu xem xét tiêu chuẩn trong điều trị
nhiễm C.dịffìcile ở người lớn và dự phòng tái phát.
Trang 31
Hình 2.9 Hình ảnh về thuốc diều trị nhiễm Clostridium difflcile
2.2.9.2. Trong thẩm mỹ
Sự co các cơ đã gây nên các vết nhăn gợn sóng ở trán, vết nhăn chân chim ở khoé mắt.
Trước cả khi ứng dụng vào y học, các thầy thuốc thẩm mỹ đã táo bạo tiêm vào cơ bắp trên mặt,
làm liệt có mức độ các cơ này, xoá vết nhăn. Mãi đến tháng 4/2002, FDA (Mỹ) mới chính thức
cho lưu hành, nhưng ngay từ năm 2001 đã có 1,6 triệu người Mỹ tự nguyện dùng thử, doanh số
bán ra hàng năm lúc ấy 301 ứiệu USD và đến năm 2006 thì vượt qua ngưỡng 1 tỷ USD. Đối với
việc dùng BoTX-A, nếu trong y học đi từng bước thăm dò, dè dặt thì trong thẩm mỹ lại sớm
được ưa chuộng và dùng phổ biến.
Hình 2.110 Tiêm BoTX-A điều trị vết nhăn
2.2.9.3. Hạn chế của c.botulinum
Trang 32
BoTX-A chỉ xoá được các nếp nhăn do co cơ (ví dụ co cơ khi vui, khi buồn) nhưng
không thể xoá vết nhăn do lão hoá (do giãn và trùng cơ). Vì thế, không thể làm cho người già
tươi tắn lại như nhiều người vẫn nhầm tưởng. Khi vui, khi buồn thì có sự co cơ tương thích tạo
nên nét rạng rỡ hay ủ dột. Làm liệt các cơ này thì xoá được nếp nhăn, song cũng lại mất đi sự co
cơ để biểu lộ tình cảm Nói một cách khác, xoá vết nhăn sẽ tạo nên người đẹp nhưng nhìn bên
ngoài dường như là "người đẹp vổ hồn". Mỗi lần xoá nếp nhăn chỉ kéo dài được 5-6 tháng, sau
đó sẽ nhăn trở lại, và nếu muốn tiếp tục thì lại phải đến điều trị trở lại nhưng dường như sự vô
cảm bên ngoài càng rõ hơn.
Dùng BoTX-A cần có hai thủ thuật cực kỳ quan ứọng là phải tiêm đúng cơ bị bệnh, tiêm
đúng vào đầu thần kinh cơ. Trong thẩm mỹ, nếu tiêm không đứng sẽ làm liệt cơ chỗ khác, sinh
ra nếp nhăn khác, kéo lệch hay biến dạng mặt. Trong y khoa, nếu tiêm không đúng sẽ không
chữa được bệnh tại nơi cần trong khi đó lại gây giảm trương lực cơ tại nơi khác. Dùng BoTX-A
còn có một điều quan trọng thứ hai là phải thăm dò, chọn được liều thích hợp. Cả trong thẩm mỹ
cũng như trong y học, việc dùng quá liều sẽ gây phản tác dụng, tức là gây ra tác dụng ngoài ý
muốn, làm liệt hay ức chế đau quá mức. Ke từ khi BoTX-A được dùng tới nay cũng đã có nhiều
vụ kiện do các tai biến này gây ra. Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu phần lớn là trên BoTX-A,
thấy có hiệu quả, ít độc, nhưng chưa nhiều trên BoTX-B, thấy có hiệu quả tương đương nhưng
có độc hơn.
2.2.10. Các loại thực phẩm nhiễm C.hotulìnum
Botulin là độc tố đã được chứng minh có nhiều trong các loại thực phẩm đồ hộp như ngô
đóng hộp, ớt, đậu xanh, súp, củ cải, măng tây, nấm, chín ô liu, rau bina, cá ngừ, thịt gà và gan gà
và pate gan, và các loại thịt, xúc xích, tôm hùm, thịt hun khói và cá muối...
Trang 33
Hình2.11 Đồ hộp và trái cấy nhiễm C.botulinum 2.2.11 Tình

hình nhiêm C.botulinum trên thế giới và tại Việt Nam
- Ở Hoa Kỳ nhiễm c.botulinum chủ yếu trong đồ hộp rau quả như: ớt, đậu xanh, súp, củ
cải, măng tây, nấm, chín ô liu, rau bina, cá ngừ, thịt gà. Gần đây, tại Hoa Kỳ sản phẩm
tương ớt đóng hộp thuộc nhiều nhãn hiệu đang được thu hồi sau khi có 4 người nhập
viện vì bệnh botulism phát sinh từ độc tố có trong sản phẩm của công ty Castleberry"s.
- Ở Nga, ngộ độc cá.
- Ở Đức do ăn các thức ăn làm bằng thịt chế biến sẵn, ăn nguội, dăm bông, xúc xích...
Nhật Bản - 36 người bị bệnh và 11 người đã thiệt mạng sau khi ăn chiên nhồi rễ sen. Rễ
sen được chân không đóng gói và bán unreữigerated. Các điều kiện này được cho phép
cho sự phát ứiển và sản xuất độc tố của c. botulinum.
Canada - ít nhất 37 người đã bị ảnh hưởng sau khi ăn tại một nhà hàng mà được sử dụng
một nhiệt độ lạm dụng unacidiííed tỏi ừong dầu vốn đã được bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- USA - Các trường hợp ngộ độc đã xảy ra do việc tiêu thụ khoai tây salad. Ba ổ dịch đã
xảy ra, kết quả là 50 người bị bệnh và tử vong một. Người ta cho rằng các c.botulỉnum
được hiện diện ứong khoai tây nướng được sử dụng cho salad này. Những đã được lưu
trữ ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong nhiều ngày trước khi sử dụng.
- Mỹ - Xào hành tây đã được liên quan đến một ổ dịch tại một nhà hàng ở Mỹ. 28 người đã
Trang 34
bị ảnh hưởng, với một tử vong.

- Anh - bị ồ nhiễm sữa chua hazelnut chịu ứách nhiệm về một ổ dịch dẫn đến 27 người
bệnh và tử vong một. c.botulỉnum là nghiền hazelnut được sử dụng trong da ua.
- Vào ngày 23/3, 17 bệnh nhân nặng nhất ứong vụ ngộ độc do ăn măng ứe ở tỉnh Nan
(Thái Lan) đã được đưa lên Bangkok điều trị. Năm 1991, 90 người ở Ai Cập đã phát
bệnh sau khi ăn thức ăn chứa vi khuẩn c. botulinum.Theo Christopher Braden, chuyên
gia Trung tâm Atlanta của Trung tâm Kiểm soát và Phòng bệnh của Mỹ (CDC). Chủ yếu
do cá.
- Việt Nam - Trẻ sơ sinh bị nhiễm độc tố botulin do cha mẹ ứơ lưởi bằng mật ong.
Trang 35
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

3.1. Phương pháp truyền thống để xác định c.botulinum [6]
3.1.1. Thiết bi và vât liêu

••■
- Tủ lạnh
- Giấy thấm khô
- Đèn cồn
- Dụng cụ vô trùng
- Cối và chày vô trùng
- Kẹp ghép vô trùng
- Pipet có nút và bông gòn vô khuẩu
- Dụng cụ phân phối chất lỏng
- Ổng nghiệm vồ trùng ( một số cần có nút bần)
- Bình ủ yếm khí
- Que cấy chuyền
- Tủ ấm, 35± l°c và 26 ±l°c
- Bình vô khuẩn bảo quản mẫu dự trữ
- Giá đựng ống nghiệm
- Kính hiển vi nền sáng hay đối đa
- Đĩa petri vồ trùng 15 X 100 mm
- Ống ly tâm
- Máy ly tâm lạnh tốc độ cao
- Ổng tiêm vồ trùng, 1 hoặc 3ml, với kích cỡ 25cm, lcm, 6cm để tim vào
chuột.
- Chuột (khoảng 15-20g)
Trang 36
- Chuồng nhốt chuột, thức ăn cho chuột

3.1.2 Môi trường, dụng cụ, hóa chất
- Pepton đệm bufer pepton water (BPW)
- Iron suphide Agar (ISA)
- Períringns selective Agar ( shahidi ferguson ferữingens, SFP)
- Môi trường dịch thể gan băm hay môi trường thịt chín
- Môi trường dịch thể TPGY hay với trypsin ( TPGYT)
- Môi trường thạch - lòng đỏ trứng - gan - thịt bê hay thạch - lòng đỏ trứng
yếm khí.
- Dung dịch cồn - odine (iodine 4% trong cồn 70%)
- Đệm gen - phosphate vô trùng, pH = 6.2
- Dung dịch nước muối vô trùng
- Dung dịch NaOH IN
- Dung dịch HC1 IN
- Cồn tuyệt đối
- Dung dịch trypsin (Difco, 1:250)
- Thuốc nhuộm gam, tím kết tinh, hay xanh methylene
3.1.3. Quy trình phân tích
3.1.3.1. Chuẩn bị mẫu trước khỉ phân tích Mau được giải đồng ở nhiệt độ
không quá 45°c và được phân tích ngay sau khi giải đồng. Cân lOg (hoặc 25g) mẫu trong
túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225ml) nước pepton đệm và đồng nhất mẫu bằng
máy dập mẫu. Mau được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân tùy mật độ hiện diện của
c.botulỉnum trong máu. Trước khi cấy, mẫu được xử lý nhiệt ở 70 - 80°c ứong 20 phút để
diệt bớt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật khác.
Cấy vào đĩa lml dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp vào một đĩa petri vô trùng.
Trang 37
Đỗ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 45°c vào đĩa, lắc đều. sau khi
môi trường đã đông, đỗ lên ứên thêm bề mặt khoảng lOml ISA hoặc SFP Agar. Một
phương pháp khác là cho thêm một ống nghiệm vô trùng lml dịch mẫu ở nồng độ thích
họp, thêm 12ml ISA hoặc SFP Agar đã ủ ấm ở 45°c vào ống trộn đều mẫu. sau khi môi
trường đã đông, đỗ thêm lên thêm bề mặt 2-3 ISA hoặc SFP Agar. Đĩa hoăc ống nghiệm
đã được cấy mẫu ủ ở 37°c trong 24 - 48h trong các bỉnh kỵ khí. Nếu nghi ngờ Cỉostrỉảỉum
chịu nhiệt thực hiện ủ song song ở 37°c và 50°c thông thường đọc kết quả ứên đĩa là dễ
hơn trong ống nghiệm.
ISA mồi trường không chọn lọc nên các loài sinh H2S khác không phải
c.botulinum cũng tăng trưởng được và tạo khuẩn lạc màu đen ứên môi trường này. Để
khẳng định khuẩn lạc là c.botuỉỉnum cần thực hiện những quy trình tiêu chuẩn để giúp
khẳng định kết quả. Phương pháp này chỉ phân lập Clostridium với các vi sinh vật khác,
không phân biệt được các loài Clostridium với nhau như: C.acetobutyỉicum,
c.aerotoỉerans, C.beijerinckii, c. bifermentans, c. butyricum,...
Trang 38
Cấy lml dung dịch mẫunhất

Đồng vào và
đĩapha
petri, đổ mẫu theo dãyCấy
loãng thậplml dung
phân xửdịch
lý mẫu vào ống nghiệm
10 - 15 ml môi trường ISA ở 45°c
mẫu lắc đều trong 15-20 vô
ở 80°c trùng đổ 10 - 15 ml môi trường ISA ở
phút
45°c lắc đều
Đổ lớp ISA thứ 2 khi lớp thứ nhất đã đông Đổ lớp ISA thứ 2 cao hơn l-2cm sau khi
đặc lớp thứ nhất đã đông đặc
ủ trong bình kín, ở 37°c 24 - 48h ủ trong bình kín, ở 37°c 24 - 48h
Đếm tấc cả các khuẩn lạc màu đen đường Đếm tấc cả các khuẩn lạc màu đen xuất
kính > 0,5 mm hiện trong ống nghiệm
Công thức tính:
CFƯ(ml) = (N*R) / (ni.v.fi +...+ ni.v.fi)
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được
Tính kết quả R: Tỷ lệ xác xuất V:Thể tích cấy Tính kết quả
vào mỗi đĩa ni: Số đĩa có khuẩn
lạc được chọn U Độ pha loãng
tương ứng
Hình 3.1 Quỵ trình phân tích C.botulinum
Trang 39
Cần phải thực hiên các kiểm tra hóa sinh khác mới khẳng định được. Tính
chất của các chủng:
Bảng 3.1: Tính chất của các chủng

Nhóm I II II IV
Dạng độc tố A,B,F B,E,F C,D G
+ + + +
Làm tan Gelatin
+ + +
-
Lên men
Glucose
± + ±
-
Lên men
Fructose
+ +
-
Lên men —
Mannose
± + ±
-
Lên men Maltose

+
“ - -
Lên men Sucroe

+
“ - -
Lên men
Trehalose
“ - - -
Lên men Lactose
Lipase + + + -
Lecithinase - - - -
Sinh H2S + + + +
Dựa vào đặc sinh hoá của c.botulinum mà ta kiểm ứa các phản ứng sinh hoá nhằm
khẳng định c.botulỉnum.
3.1.4. Phương pháp sử dụng môi trườngTrypticase Peptone Glucose Yeast
Extract với Trypsin (TPGYT)
Trang 40
3.1.4.1. Chuẩn bị mẫu

Mẩu được giữ lạnh cho đến khi kiểm tra, trừ các loại thực phẩm đóng hộp còn
nguyên. Đánh số thứ tự mẫu.
Đối với thực phẩm rắn và lỏng, cho vào cối vô trùng, thêm một lượng dung dịch
đệm gen - phosphate rồi nghiền bằng chày vô trùng. Hay có thể gắp từng mẫu nhỏ thực
phẩm cho vào môi trường ứăng sinh nhờ cặp ghép vô trùng. Cấy trực tiếp thực phẩm lỏng
vào mồi trường nuôi cấy bằng pipet. Chuẩn bị các mẫu dự trữ: sau khi nuôi cấy, chuyển
từng phần mẫu dự trữ vào bình dựng mẫu dự trữ và bình dựng mẫu vô trùng để sử dụng
các test khi cần thiết.
3.1.4.2. Phát hiện tế bào vỉ khuẩn
❖ Tăng sinh:
- Loại bỏ oxy hoàn toàn trong môi trường tăng sinh bằng hơi nước trong
1 0 - 1 5 phút và làm lạnh nhanh nhưng không cấy trước khi cấy vào mẫu.
- Cấy vào hai ống nghiệm chứa môi trường thịt chín l-2g thực phẩm rắn hay
l-2ml thực phẩm lỏng ( cho 15ml môi trường tăng sinh), ủ ở 35°c.
- Cấy vào hai ồng nghiệm chứa môi trường TPGY theo như ứên. ủ ở 26°c .
Chỉ sử dụng TPGYT thay thế vi khuẩn được nghi ngờ là chuẩn không phân
hủy protein chứa các kháng nguyên B, E hay F.
- Lưu ý: phải cho mẫu thực phẩm chìm vào bên dưới bề mặt môi trường một
cách nhẹ nhàng. Sau 5 ngày ủ, kiểm ứa canh trường vi khuẩn, kiểm tra độ
đục của môi trường, sự tạo khí, hay sự phân hủy cơ chất của thịt. Lưu ý mùi
tạo thành, kiểm ứa canh trường vi khuẩn dưới kinh hiển vi bằng cách chuẩn
bị và quan sát giọt ép dưới kính hiển vi đối pha có độ phân giải cao, hay
chuẩn bị vết bôi dịch chứa vi khuẩn nhuộm Gram hay nhuộm đơn với tím
kết tinh hay xanh methylene dưới kính hiển vi nền sáng. Kiểm tra hình thái
Trang 41
vi khuẩn và lưu ý tế bào diễn hỉnh của c.botuỉinum số lượng tìm thấy, mức
độ bào tử hóa và vị trí của bào tử trong tế bào. Cũng thời điểm này, kiểm tra
vi khuẩn về khả năng tạo toxin theo như cách đã mô tả. Thông thường,
toxin được tạo ra với nồng độ lớn nhất sau 7 ngày ủ, ủ thêm 10 ngày nữa để
phát hiện ra các bào tử tổn thương do chậm phát triển thành tế bào dinh
dưỡng trước khi hấp hơi nước ở áp suất cao để loại bỏ môi trường này. Để
phân lập giống thuần, bảo quan canh trường vi khuẩn tại thời điểm tạo
nhiều bào tử nhất ở điều kiện
4°c.
♦♦♦ Phân lập giông thuần
- Có thể phân lập nhanh các vi khuẩn c.botulỉnum từ hệ vi sinh vật hỗn họp
trong môi trường tăng sinh hay từ mẫu thực phẩm ban đầu nếu quá trình tạo
bào tử xảy ra tốt.
- Tiền xử ỉỷ mẫu để cấy ria: thêm vào ống nghiệm vô trùng có nút bần chứa
l-2ml canh trường vi khuẩn một thể tích tương ứng cồn tuyệt đối đã được
lọc vô trùng, lắc đều và ủ nhiệt ứong phòng trong 1 giờ. Để phân lập vi
khuẩn, lấy 1 -2ml mẫu đã dự trữ cho vào ống nghiệm có nút bần, thêm một
thể tích tương ứng cồn tuyệt đối đã lọc vồ trùng, lắc đều và ủ ở nhiệt độ
phòng trong lgiờ. Hay cách khác, có thể đun 1 hay 2ml môi trường tăng sinh
có chứa vi khuẩn ở 80°c trong 10-15 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng.
Không xử lý nhiệt với các vi khuẩn c.botulinum không phân hủy protein.
- Cấy mẫu đã xử lỷ: sử dụng que cấy vòng cấy 1 hay 2 vòng dây cấy chứa đầy
dịch mẫu đã xử lý theo một trong 2 phong cách trên lên môi trường thạch -
lòng đỏ trứng - gan thịt bê hay thạch - lòng đỏ trứng yếm khí để tách khuẩn
lạc phát ứiển riêng lẻ. Nếu cần thiết, pha loãng mẫu đến mức có thể cho các
Trang 42
khuẩn phát triển dính nhau sau khi ủ. ủ các đĩa khô trước khi đem ủ nhằm
tránh vi khuẩn phát triển dính nhau sau khi ủ. ủ các đĩa ở 35°c ứong 48
giờ trong điều kiện yếm khí.
♦> Chọn khuẩn lạc vỉ khuẩn c.botulinum điển hình
- Chọn: chọn lấy mẫu 10 khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn c.botulỉnum phát
triển độc lập. Những khuẩn lạc này có đặc điểm gồ cao hay dẹt, nhẵn hay
xù xì. Chúng thường phát triển và phân bố dàn trải và có mép không đều.
Trên môi trường lòng đỏ trứng, chúng có bề mặt óng ánh khi kiểm ứa dưới
ánh sáng chiếu lệch góc. Những vùng óng ánh này trông giống như lớp
ngọc ứai, theo trước và sau đường viền không điều của khuẩn lạc. Bên cạnh
vùng ngọc trai khuẩn lạc c.botulinum loại c, D và E thường được bao
quanh bởi một vùng kết tủa rộng (2-4mm), màu vàng. Các khuẩn lạc loại A
và B thường có vùng kết tủa nhỏ hơn. Việc phân lập các khuẩn lạc có tính
tương đối khó khăn bởi vì một số thành viên nhất định của giống
Clostridium cũng do khuẩn lạc có hình thái tương tự nhưng không sinh độc
tố.
- Cấy khuẩn lạc vào môi trường dịch thể: sử dụng que cấy vòng để cấy
khuẩn lạc c.botulinum loại E vào môi trường TPGY , các khuẩn lạc sinh ra
các toxin khác vào môi trường gan băm hay môi trường thịt chín. Sau đó
đem ủ trong 5 ngày, kiểm ứa sự tạo thành toxin.
- Phân lập giống thuần: cấy ria lại các chủng loại toxin lên môi trường thạch
lòng đỏ trứng, ủ một đĩa ở 35°c ứong điều kiện yếm khí, còn đĩa kia ủ ở
35°c trong điều kiện hiếu khí. Nếu khuẩn lạc điển hỉnh của c.botuỉinum
phát ừiển ừên đĩa thạch đã ủ yếm khí và không phát triển trên đĩa ủ hiếu khí
thì giống có thể đã thuần. Nếu không phân lập được c.botulỉnum từ ít nhất
Trang 43
một ứong các khuẩn lạc đã chọn có nghĩa là mật độ phân bố của chúng
ứong hệ vi sinh vật hỗn họp có thể thấp. Tiếp tục cấy chuyền liên tiếp vào
môi trường tăng sinh có thể làm tăng số lượng của chúng lên đủ để cho
phép phân loại được. Bảo vệ giống thuần ở trạng thái bào tử trong tủ lạnh,
trên các hạt thủy tinh, đông lạnh hay đông khô.
3.1.4.3 . Phát hiện độc tổ botulỉn
Chuẩn bị mẫu : lấy 1 phần mẫu để phát hiện tế bào vi khuẩn c.botulỉnum sống, 1
phần khác để kiểm tra độc tính. Bảo quản phần mẫu còn lại trong tủ lạnh. Ly tâm các mẫu
chứa chất rắn lơ lửng trong điều kiện lạnh và sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính.
Chiết mẫu thực phẩm rắn với 1 thể tích tương ứng của dung dịch đệm gel-phosphate, pH=
6,2. Tẩm ướt chất đệm vào mẫu thực phẩm bằng cối và chày đã làm sạch. Ly tâm mẩu đã
giã ừong điều kiện lạnh và sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính. Rửa sạch các dụng cụ
chứa mẫu nghi có dính thực phẩm với vài ml dung dịch đệm càng tốt để tránh pha loãng
toxin đến mức không thể phát hiện được.
❖ Xác định độc tính của mẫu thực phẩm hay canh trường vi khuẩn
- Xử lỷ với ừypỉn : nếu có mặt các độc tố của các vi khuẩn không phân hủy
protein trong mẫu thì cần phải kích hoạt bằng trypin để xác định. Vỉ vậy,
cần xử lý phần lỏng của mẫu rắn sau khi ly tâm, hay mẫu lỏng, hay dịch
môi trường thịt chín chúng vi khuẩn với trypin trước khi phát hiện độc tính.
Không xử lý trypin với môi trường TPGY, bởi vỉ môi trường này đã chứa
sẵn trypin và nếu xử lý tiếp với trypin có thể làm giảm hoạt tính của các
toxin đã được kích hoạt ở mức cao nhờ trypin có sẵn trong môi trường.
Điều chỉnh pH của phần mẫu lỏng về 6,2 với dung dịch NAOH IN hay HC1
IN. Thêm 0,2ml dung dịch trypin bão hòa ứong nước vào l,8ml mỗi phần
mẫu lỏng, ủ dịch hỗn họp này ở 35-37°C ứong 1 giờ, thỉnh thoảng trộn đều,
Trang 44
để kiểm tra độc tính. Để chuẩn bị dung dịch trypin, cho lgam trypin (Difco,
1:250) vào một ống nghiệm sạch và thêm lOml nước cất, lắc và hơ nóng
nhẹ để hòa tan.
- Kiểm tra độc tỉnh: tiến hành các test song song trên các mẫu đã xử lý và
không xử lý với trypin (lặp đôi). Pha loãng 1 phần của mẫu lỏng hay canh
trường vi khuẩn chưa xử lý đến 1:2 , 1:10 và 1:100 , trong dung dich đệm
gel-phosphate. Tiến hành pha loãng tương tự với từng mẫu loãng hay canh
trường vi khuẩn đã được xử lý với trypin. Tiêm vào bụng mỗi con chuột,
theo từng cặp chuột, 0,5ml mẫu lỏng chưa pha loãng vào 0,5ml mẫu kiểm
tra chưa xử lý ở mỗi độ pha loãng bằng cách sử dụng ống tiêm 1 hay 3ml
với kim cỡ 25cm, l,6cm. Lặp lại các bước này với các mẫu đã xử lý với
trypin (lặp đồi). Đun l,5ml mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn trong
lOphút ở 100°c. Làm lạnh rồi tiêm 0,5 (chưa pha loãng) vào từng con chuột
theo từng cặp. Chuột sẽ không chết, bởi vì độc tố botulin nếu có sẽ bị bất
hoạt bởi nhiệt.
- Quan sát tất cả các con chuột theo từng khoảng thời gian nhất định trong
48giờ. Ghi nhận triệu chứng và thời gian chuột chết. Triệu chứng ngộ độc ở
chuột bắt đầu thường ứong 24 giờ đầu tiên, lông xù lên, thở mạnh từng hồi,
cơ thể yếu dần, cuối cùng là liệt và hơi thở yếu hẳn rồi chết. Nếu chuột chết
mà không có các ừiệu chứng ở trên thì không có đủ bằng chứng để kết luận
rằng độc tố botulin có trong chất lỏng tiêm vào chuột. Đôi khi chuột chết là
do các họp chất độc có trong mẫu tiêm hay nhiễm trùng do vết thương.
3.2. Phương pháp hiện đại xác định c.botulỉnum

3.2.1. Phương pháp Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
3.2.1.1. Khái niệm
Trang 45
Được sử dụng để phát hiện độc tố hoạt tính sinh học và sự dò tìm độc tố không tích
cực. Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng kết họp giữa một tế bào (kháng
nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết
thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên - kháng thể hoặc bằng cách sử
dụng những kháng thể đã được đánh đấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng
xạ hay enzym).
Phương pháp này có thể sử dụng cho hầu hết tất cả kháng nguyên với độ nhạy và
độ đặc hiệu cao. Nguyên tắc của kỹ thật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên
ngoài những đĩa giếng, nếu có sự hiện điện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng
nguyên này sẽ giữ lại ứên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng
cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzym như horseradish peroxydase hay
alkaline phosphatese. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyem vào giếng, enzyme
xúc tác thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo
dõi sự đổi màu có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.
3.2.1.2. Quy trình thực hiện
❖ Nguyên vật liệu cơ bản

- Máy đọc ELISA có bước sóng 405nm
- Bản nhựa 96 giếng đáy phẳng (của hãng NƯNC, Denmark)
- Pipetman loại 20, 200, 1000 microlit và đầu typ tương ứng
- Dung dịch TYG: Môi trường dịch thể Trypticase (Tryptic) -
Pepton-Glucose-Yeast Extrace với Trypsin ( TPGYT).
- Hòa tan các thành phần rắn của môi trường cơ bản và cho vào ống nghiệm
20x150mm từng thể tích 15ml hay cho lOOml vào các lọ dung tích 170ml
có vạch chia. Hấp tiệc trùng các ống nghiệm ở 121°c trong 10 phút và các
lọ ứong 15 phút ở 121°c pH=7. Bảo quản ở 5°c. Thêm Tripsin nagy khi sử
Trang 46
dụng
- Mầu c. botulinum.
- Mau chứa huyết thanh thỏ có kháng thể TgG
- Dung dịch đệm Bicabonate 0.05 M, 0.8g Na2CƠ3 + 1.47g NaHCƠ3 trong
500ml nước cất ở pH =9.6
- 1% dung dịch đệm casein
- Đệm NaCl 0.005%, tween 20 6.04g Trisbazo; 8,76g NaCl, thêm 900ml
nước cất phân hủy Tris và NaCl, điều chỉnh pH = 25°c với HC12M và
50ml dung dịch tween 20 và định mức tới vạch 1 lít.
- Dung dịch đừng phản ứng H2SO4 0,3M pha loãng.
❖ Các bước tiến hành ELISA
> Chuẩn bị hỗn hợp dịch vi khuẩn
- Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm trên môi trường TPGY Hoặc CMM ở 37°c. Sau
24h sinh trưởng ở 37°c, 5ml môi trường được cho vào môi trường thẩm tích
bao gồm: 2.5 lít Peptone Protease 4%, 1% chiết nấm men, 1% dextrone.
- Điều chỉnh pH trung bỉnh đến 7.3 trước khi khử trùng.
- Môi trường được ủ ở nhiệt độ phòng 10 ngày.
- Môi trường nổi trên mặt được ly tâm 18000 vòng ứong 20 phút.
- Chất lỏng nổi lên trên bề mặt được tách riêng và đem đi đông lạnh với thể
tích như nhau của glycerol.
> Kỹ thuật ELISA xác định kháng thể đặc hiệu kháng Clostridium chất
dịch của mẫu
»
$ Chuẩn bị mẫu đổi chứng
- Mau âm tính: bản sao giống với tấc cả các thuốc trừ độc ( không pha loãng
vồ trùng CMM & TPGY)
Trang 47
- Mau dương tính kiểm tra độc tố chuẩn loại A, B, E, F pha loãng vô trùng
CMM & TPGY (pH=7.6 ở nồng độ 2pg/ml).

$ Chuẩn bị mẫu toxin ở dạng thô hoặc lọc sạch
- Bước l(gẳn bảng nhựa): cho mẫu chứa kháng thể IgG để kết họp với kháng
nguyên ở mẫu pha loãng 1:500 ứong dung dịch đệm carbonate, pH=9.6.
Cho lOOpl/giếng, ủ qua đêm ở 4°c. Rửa 3 lần bằng dung dịch
PBS-Tween 20 0.05%.
- Bước 2 (gắn kháng nguyên): Cho 300|il mẫu chứa kháng nguyên 9 với
nồng độ 109 tế bào/ml) hoặc ở dạng siêu nghiền đã pha loãng ở nồng độ
lOpg/lml trong dung dịch đệm PBST vào mỗi giếng của
bảng, ủ 60-90 phút ở 35°c. Sau đó rửa bảng với dung dịch rửa PBS- Tween
0.05% (3-5) lần.
- Bước 3: Phủ bảng nhựa bằng dung dịch PBS-sữa không béo 5%
PBS-Tween 20 0.05%. cho 300pl/giếng.

- Bước 4: Đem ủ mẫu chứa độc tố 2h, 35°c. Rửa mẫu trên 5 lần trong PBST.
- Bước 5: Thêm lOOpl/giếng biotin để pha loãng chứa kháng thể có
gắn nhãn peroxidase, ủ 60 phút, ứong 35°c.
- Bước 6: Rửa mẫu trên với PBST loại bỏ các phần không liên kết.
- Bước 7: Cho lOOpl cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ ứong tủ ấm 37°c trong
15-30 phút, không rửa.

- Bước 8: Phản ứng có thể dừng lại nếu cho vào H2SO4 0.3M.
$ Đọc kết quả:
- Đọc bằng mắt thường nhờ bảng so màu
- Đọc bằng máy ELISA: Đọc kết quả ở bước sóng 405nm và ghi nhận kết
quả:
Trang 48
■ Kết quả thử nghiệm xem như dương tính nếu tỷ lệ mật độ quang
(OD) của thử nghiệm và chứng âm là >2.3
■ Ngưỡng phản ứng = 2.3 X OD chứng âm
■ OD mẫu > OD ngưỡng: Dương tính
■ OD mẫu < OD ngưỡng: Âm tính
Trang 49
Chú ỷ: Giá trị OD của hai giếng trên cùng một mẫu lệch nhau gấp đôi thì cần xét
nghiệm lại mẫu đó.
SANDVMCH ELISA ASSAY METHOD

Copyrighi Elisa acsay com
1) 2)
•%
3> 4) 5
)
l±J
„Y,
Coat ptate a capture
antibody
IÝJ
Add Sampie to vveỉl.
antigen bmdỉ to capture
. Y.
Dttechng anbbody
3dded. and bmds
. Y J
EnzyĩT>e-hnked
socondary (2o)
Subs-trate added.
Substrate IS convetteđ by
eniymo to déto ctáble form
antibocty to anbgen antibody «s ađded.
<hght or colour)
b»nds to detocting
antibody
Mơnơcỉơnaỉ antitoơcty-cơatecỉ we/ỉ Anttgơn bỉrtds tơ

antibơdy
“V
* Antigen
m substrate
VV *r V"
1A/ash À antíbody
X
enzyme-linked
antibody
/
\
' ■
. ---------------- —
[A/tìStr
^ ----------------------------------------
Suí>str&t& ỉs *3Ơơoct anơ cơnvơrteơ t>y ơnz:ymơ in tơ ơơỉơr

prơduơt
Enzym&-iink.&ơ monocionsi sntibocỉy ỈDĨrtds to immotìiii^eoỉ
antỉgen
f/gure 2 Sandwich ELỈSA
Hình 3.2 Phương pháp ELISA
Trang 50
3.3 Phương pháp PCR
Tất cả các chủng c.botulinum được nuôi cấy ứong 10 ml Tryptose- Peptone-glucose-
Yeast extract (TPGY) và ủ ứong điều kiện kỵ khí ở 37°c trong 24-48h, tiếp theo nuôi qua đêm (20
giờ ở nhiệt độ tương ứng).
Bướcl. Chuẩn bị khuôn mẫu: Lấy 1 ml dung dịch chứa tế bào từ môi trường, rửa sạch với
1 ml đệm TE (0,01 M Tris-HCl, EDTA 0,001 M ,PH 8.0) trong 1 giờ ở 37°c và ngâm trong 1 ml
nước cất. Ngoài các tế bào riêng rẻ được phân lập của từng chủng vi khuẩn, ba hỗn hợp được phân
lập chứa các c.botulinum thủy phân protein loại A, B và F, các c.botulinum không thủy phân
protein loại B, E , và F hoặc tất cả bốn huyết thanh đã được chuẩn bị bằng cách trộn riêng rẻ các tế
bào được phân lập. Mọi các tế bào phân lập được đun nóng ở 99° c trong 10 phút để chia tế bào và
phát hành các DNA của vi khuẩn và đã ly tâm trong 5 phút ở 10.000 X g. Một khối lượng của lịil
của nổi trên mặt từng được sử dụng như bản mẫu trong hỗn hợp PCR. Tất cả được đun nóng ở
99°c trong 10 phút nhằm phá vỡ tế bào và tách chiết DNA của c.botulỉnum. Ly tâm trong 5 phút ở
10.000 vòng/phút. Khoảng 1 Ịil dịch nổi trên mặt được sử dụng như bản mẫu trong hỗn họp PCR.
Bước2. Mồi: Dựa trên công bố trình tự DNA của gen BoNT, bốn cặp mồi mới với nhau
được cụ thể cho cả hai loại c. botulỉnum A, B, E, hoặc F được thiết kế (Bảng 2)
Trang 51
Bảng 3.2: Mồi bắt cặp của c.boíulinum
Bảng 2: Môi cho multiplex PCR của c.otulinum loại A, B, E và F

Loại Mồi
Nhiệt Chuỗi ( 5 - 3 ’ ) Produrct Vị ừí Đ Ộ G C
ừên gen
Size (bp) (mã vùng) ( °C)
Af CBMLA1 AGC TAC GGA GGC 52 782 1788-1808

(%)
63.9
AGC TAT GTT
Ar BMLA2 2569-2548 63.4 41

CGT ATT TGG AAA GCT GAA
AAG G
Bf CBMLB1 205 434-453
64.3 CAG GAG AAG TGG 50
AGC GAA AA
Br CBMLB2 638-619 64.5 45

CTT GCG CCT TTG TTT TCT TG
Ef CBMLE1 156-175 63.7 45

CCA AGA TTT TCA 389 TCC
GCC TA
Er CBMLE2 544-525 63.6 43
GCT ATT GAT CCA AAA CGG
TGA
Ff CBMLF1 185-194 64.1 50
CGG CTT CAT TAG 543 AGA
ACG GA
Fr CBMLF2 727-708 63.3 55
TAA CTC ccc TAG ccc GGT AT
Trang 52
Bước 3. PCR: PCR được thực hiện với 50 Ịil của hỗn hợp phản ứng có chứa 1 (0.1 của mẫu,
0,3 pM của mỗi mồi, 220 nM của mỗi ứiphosphate deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, và
dTTP), 32 mM Tris-HCl (pH 8,4), 80 mM KC1, 4,8 mM MgCl, và DNA polymerase. Các sản
phẩm PCR khuyếch đại được xác định ở agarose gel 2% nhuộm màu với ethydium bromide.
Bước 4. Đọc kết quả:
Multiplex PCR của tế bào c.botulỉnum loại A, B, E, và F mang lại những sản phẩm khuếch đại dự
kiến (Bảng 3.2): loại A: 782 bp; loại B: 205 bp; loại E: 389 bp; và loại F 543 bp (Hình 3.3). Hỗn
hợp bị đình các tế bào mang các đoạn DNA tưomg
ứng. Các sản phẩm PCR được hình dung rõ ràng
trong gel agarose, từ 150bp đến 200bp khác biệt trong
kích thước của mỗi sản phẩm khuếch đại kích hoạt
một sự phân biệt giữa các mảnh vỡ dễ dàng mà không
cần sử dụng độ phân giải cao agarose.
(í
]Ợ)Ộ -♦
$1$ -•
MKI -♦
12 3 4 5 0 7 * 0
150 >
Hình 3.3 Phương pháp điện đi
Trang 53
Multiplex PCR phát hiện của c. botulỉnum. Đường 1: trọng lượng phân tử đánh dấu; 2:
c. botuỉỉnum loại A; 3: c. botulỉnum loại B; 4: c. botuỉinum loại E; 5: c. botulinum loại F; 6:
c. botuỉỉnum thủy phân protein loại A, B và F; 7: c. botuỉỉnum không thủy phân protein loại B,
E và F; 8: c. botulỉnum loại A, B, E, và F; và 9: tiêu cực kiểm soát.
Trang 54
Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ

4.1 Kết luận
Botulism là một bệnh rất nguy hiểm nhưng hiếm xảy ra. Mấy năm gần đây, cơ
quan FDA Hoa Kỳ và CFIA Canada cũng thỉnh thoảng ra cảnh báo về bệnh botulism và
cho lệnh thu hồi một vài loại sản phẩm nhiễm khuẩn bày bán trên thị trường chẳng hạn
như Hot Dog Chili Sauce Castleberry’s Ford Cpy USA, Austex Hot Dog Chili Sauce,
Kroger Hot Dog Chili Sauce, Chili French Style Green Beans Lakeside Foods, Bolthouse
Farm 100% Carrot Juice (Canada), Hot Great Value Original Chili with Beans. Tuy nhiên
độc tố botulism cũng có được vài ứng dụng ích lợi trong y khoa trị liệu. Độc tố A (BTXA)
được sử dụng để trị những xáo trộn thần kinh gây sự co thắt cơ, bệnh chứng gây ngứa
ngoài da (prurit cutané), đau cơ vùng mặt (douỉeur myo/acỉale), tiết quá nhiều mồ hôi
(hyperhỉdrose), nhức đầu (migraine)... Gần đây, do một sự tình cờ lý thú trong lúc dùng
Toxine để trị chứng mí mắt co thắt bất thường (bỉépharospasme) ở một bệnh nhân, các
bác sĩ đã khám phá thêm một tác dụng khác của độc tố là nó có thể làm tan biến và xóa bớt
nếp nhăn trên mặt một cách tạm thời. Thế là độc tố botulism nhảy vào lĩnh vực thẩm mỹ
với sự xuất hiện của thuốc Botox® Cosmetic (toxinA), Myobloc (toxinB), Dysport và
Vistabel. Tất cả đều được bào chế từ độc tố botulism. Botox có thể giúp xoá bỏ đi các nếp
nhăn trên trán, hai bên khóe mắt còn gọi là vết chân chim (patte d’oie, crows feet), khóe
miệng, giữa hai chân mày.. .Nhưng đây là lĩnh vực làm giàu cho thẩm mỹ và cũng làm
giàu cho luật sư.
4.2 Kiến nghị
Sau khi hoàn thành bài khóa luận này, tôi nhận thấy c.botuỉỉnum là một vi sinh
vật rất nguy hiểm với tấc cả khi nhiễm độc tố botulism này.
Trang 55
Vì thế, c.botulinum và độc tố botulism của nó được sử dụng làm vũ khí sinh học
với sức lan tỏa và hủy diệt mạnh nhất hành tinh.
Thực phẩm nhiễm c.botuỉỉnum rất khó nhận biết bằng cảm quan chỉ nhận biết
qua những biểu hiện lâm sàn. Chúng ta phải thực hiện tốt các biện pháp kiểm soát chúng
vì độc tố của vi khuẩn này rất mạnh khi nhiễm tỷ lệ tử vong rất cao.
Cần tuyên truyền cho người dân hiểu biết về nguy hại của các loại thực phẩm có
khả năng nhiễm khuẩn c.botulỉnum. Quản lý và thực hiện đảm bảo vệ sinh an toàn thực
phẩm ở tấc cả các khâu chế biến và bảo quản thực phẩm, cần có những biện pháp xử lý
những vi phạm vệ sinh an toàn thực phẩm thích hợp nhằm đảm bảo quyền lợi của người
tiêu dùng và sức khỏe cộng đồng.
Tìm hiểu về nguyên nhân và các biểu hiện bệnh để xử lý kịp thời tránh những
hậu quả đáng tiếc xảy ra.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
❖ PHẨN TIẾNG VIỆT

[1] . Bộ môn vi sinh - khoa Y - Đại học Y Dl2lợc TP. HCM, 1996. Vi khuẩn học.
[2] . TH.S PHẠM MINH NHựT, 2010. Bài giảng“ Phân tích đánh giả chất lượng thực
phẩm
[3] . TH.S PHẠM MINH NHựT, 2010. Bài giảng“ Thực hành phân tích đánh giá chất
lượng thực phẩm ”.
[4] . Lê Đình Hùng, 1998. Đại cương về phương pháp kiểm tra vỉ sinh vật thực phẩm.
Trung tâm Tiêu Chuẩn Đo LDHỜng Chất LDHợng khu vực III, TP. HCM.
[5] . LDHơng Đức Phẩm, 2002. Vỉ sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm.Nhà xuất
Trang 56
bản Nông Nghiệp - Hà Nội.

[6] . Trần Linh ThlMc, 2006. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm
và mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo Dục.
[7] . Nguyễn Ngọc Tuân, 2002. Vệ sinh thịt. Nhà xuất bản Nông Nghiệp - TP. HCM.
❖ PHÀN TIẾNG NƯỚC NGOÀI
[8] . Clinical Verterỉnary Microbiologin.
[9] .FAO,1992. Microbiological analysỉs ỉn the food centrol laboratory
10.P. J. Quinn và cs, 1994. Clirical Verterỉaary Microbiology
❖ PHẦN TRANG WEB
[11] . http:// vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html
[12] .Clostridium botulinum: ecology and control in foods by Andreas H. w.

Hauschild,Karen L. Dodds.
Trang 57

Khoa Luan Tim Hieu Quy Trinh Phat Hien Clostridium Botulinum Trong Thi 9338

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Khoa Luan Tim Hieu Quy Trinh Phat Hien Clostridium Botulinum Trong Thi 9338

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TH.

S PHẠM MINH NHựT

1.1. Tính cấp thiết của đề tài

sinh sản được ứong cơ thể con người.

1.2. Mục đích nghiên cứu

Chương 2: TỐNG QUAN

2.1.1. Giá trị dinh dưỡng của thịt

Hình 2.1 Hình ảnh về thít

Bảng2.2: Thành phần dinh dưỡng trong lOOg thịt heo

Béo 20,3 0,48 71,9 0,52

4 Tủy -Bám chặt vào thành ống tủy, màu

❖ Chỉ tiêu hóa sinh( TCVN 7046 : 2002)

- Tổng số vi sinh vật hiếu khí 106 Cfu/g

2.1.5. Vệ sình an toàn thực phẩm trên thịt

bệnh có thể chết do liệt hô hấp hoặc tuần hoàn.

2.1.6.1. Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn thương hàn (salmonella)

2.2. Giới thiêu về C.botulinum

2.2.1. Giói thiệu chung C.Botulỉnum

Ngành (phylum) : Fỉrmicutes

Lớp (class): Clostridia

Chi (genus) : Clostridium

Loài (species) : c. Botulinum

2.2.3. Kiểu hình

Đăc điểm • Các loai •

đến vì dòng này không liên quan bệnh

2.2.6. Cấu trúc

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử

2.2.7.1. Đặc điểm của độc tổ

Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IY

Độc tố A, B,F B, E,F c, D G

Species Động vật

Hình 2.4 Cơ chế gây độc của độc tố botulin [12]

Hình 2.5 Cơ chế gây bệnh của Clostrìdium botulinum

2.2.8. Hội chứng ngộ độc thịt [7]

2.2.8.1. Bệnh và các triệu chứng

Hình 2.6 Vịt bị tê liệt do độc tố botulin

Hình 2.7 Trẻ em bị nhiễm botulỉsm

2.2.8.3. Biện pháp phòng và kiểm soát bệnh

❖ Các biện pháp phòng

2.2.9.1. Trong y học

- Chữa chứng giật mỉ mắt

tiền liệt nên làm giảm PSA.

Hình 2.110 Tiêm BoTX-A điều trị vết nhăn

2.2.9.3. Hạn chế của c.botulinum

Hình2.11 Đồ hộp và trái cấy nhiễm C.botulinum 2.2.11 Tình

bị ảnh hưởng, với một tử vong.

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

3.1.1. Thiết bi và vât liêu

- Chuồng nhốt chuột, thức ăn cho chuột

Cấy lml dung dịch mẫunhất

Công thức tính:

CFƯ(ml) = (N*R) / (ni.v.fi +...+ ni.v.fi)

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được

vào mỗi đĩa ni: Số đĩa có khuẩn

lạc được chọn U Độ pha loãng

Hình 3.1 Quỵ trình phân tích C.botulinum

chất của các chủng:

Bảng 3.1: Tính chất của các chủng

Lên men Maltose

Lên men Sucroe

Lên men Lactose

3.1.4.1. Chuẩn bị mẫu

3.2. Phương pháp hiện đại xác định c.botulỉnum

❖ Nguyên vật liệu cơ bản