UNIVERZITET U TUZLI

FARMACEUTSKI FAKULTET

Ena Muhamedović

DIPLOMSKI RAD

BAKTERIOCINI – ALTERNATIVA ZA NOVU GENERACIJU ANTIBIOTIKA

Tuzla, juli 2022. Godine

Mentor rada: Dr.sc. Fatima Numanović, red.prof.

Rad ima: 37 strana

Redni broj diplomskog rada: ______________

Sažetak

Široka pojava bakterija otpornih na antibiotike i usporavanje otkrivanja novih klasa antibiotika
smatra se ozbiljnim javnozdravstvenim problemima. Prekomjerna upotreba antibiotika tokom
dugog razdoblja omogućila je zaraznim organizmima da se prilagode antibioticima i zauzvrat,
smanji njihovu efikasnost.

Naknadno širenje otpornih sojeva bakterija od osobe do osobe ili sa animalnih izvora u okolišu,
kao što su stoka ili hrana za životinje tretirana antibioticima sličnim onima korištenih za liječenje
ljudskih infekcija, bio je glavni faktor u proširenju rezistencije na antibiotike (Ansari 2015; CDC
2018).

Zbog gubitka efikasnosti mnogih antibiotika, istraživači su pod pritiskom da identificiraju nove
vrste terapijskih molekula i strategije. Iz perspektive kvalitete i sigurnosti hrane, pojava novih
patogena, diverzifikacija izvora opskrbe i novije prehrambene navike potrošača koji se sve više
odlučuju za svježije i 'prirodnije' prehrambene proizvode, bez konzervansa i soli, jesu globalni
izazovi (Farber 2016).

Stoga, kako bi se osigurala kvaliteta i sigurnost prehrambenih proizvoda, održavala

konkurentnost izmedju farmi, te ograničila upotreba antibiotika i širenje rezistencije gena,
potrebno je pronaći zamjene za hemijske aditive, sol i antibiotike. Napredak u identifikaciji
bakteriocina i njihovoj karakterizaciji potaknula je interes za korištenje ovih molekula kao novih
aditiva za hranu ili kao terapeutska sredstva.
Summary

The widespread emergence of antibiotic-resistant bacteria and the slowdown in the discovery of
new classes of antibiotics are considered serious public health problems. Excessive use of
antibiotics over a long period of time has allowed infectious organisms to adapt to antibiotics
and, in turn, reduce their effectiveness.

Subsequent spread of resistant strains of bacteria from person to person or from animal sources
in the environment, such as livestock or animal feed treated with antibiotics similar to those used
to treat human infections, has been a major factor in expanding antibiotic resistance (Ansari
2015; CDC 2018) .

Due to the loss of efficacy of many antibiotics, researchers are under pressure to identify new
types of therapeutic molecules and strategies. From the perspective of food quality and safety,
the emergence of new pathogens, diversification of supply sources and new eating habits of
consumers who are increasingly opting for fresher and more ‘natural’ food products, without
preservatives and salt, are global challenges (Farber 2016).

Therefore, in order to ensure the quality and safety of food products, maintain competition
between farms, and limit the use of antibiotics and the spread of gene resistance, it is necessary
to find substitutes for chemical additives, salt and antibiotics. Advances in bacteriocin
identification and characterization have sparked interest in the use of these molecules as novel
food additives or as therapeutic agents.
Sadržaj

1.UVOD .....................................................................................................................................6

2. OPŠTE KARAKTERISTIKE BAKTERIOCINA ....................................................................8

2.1 Bakteriocini .......................................................................................................................8

2.2 Mehanizam djelovanja bakteriocina ...................................................................................9

2.3 Bakterijska rezistentnost na bakteriocine .......................................................................... 12

2.4 Primjena bakteriocina ...................................................................................................... 13

3. KLASIFIKACIJA BAKTERIOCINA ................................................................................... 15

3.1 Bakteriocini Klase I ......................................................................................................... 16

3.1.1 Mehanizam djelovanja bakteriocina klase I................................................................ 18

3.2 Bakteriocini Klase II ........................................................................................................ 19

3.3 Bakteriolizini ................................................................................................................... 21

4. BAKTERIOCINI – NOVA GENERACIJA ANTIBIOTIKA ................................................. 22

4.1 Izolacija i prečišćavanje bakteriocina ............................................................................... 22

4.2 Bakteriocini i antibiotici................................................................................................... 23

4.3 Djelovanje bakteriocina na humani organizam ................................................................. 25

4.3.1 Bakteriocini bakterija mliječne kiseline u liječenju humanih urinarnih infekcija ....... 27

4.3.2 Bakteriocini u prevenciji i liječenju mastitisa ............................................................ 30

4.3.3 Antikancerogeno djelovanje bakteriocina .................................................................. 31

4.3.4 Potencijalna kontraceptivna svojstva bakteriocina ..................................................... 32

4.3.5 Antilisterijski efekat bakteriocina .............................................................................. 33

ZAKLJUČAK ........................................................................................................................... 35

Literatura .................................................................................................................................. 36
1.UVOD

Bakteriocini su prvi put otkriveni prije gotovo 100 godina i otkriveno je da ih proizvode mnoge
vrste bakterija i archaea (Baquero F. Moreno F. 1984.). Sastoje se od heterogene obitelji malih
ribosoma, sintetizirane proteinske molekule s jakim antimikrobnim djelovanjem. Ove molekule
se uglavnom sintetiziraju kao nebiološki aktivni prekursori peptida koji sadrže N-terminalnu
vodeću sekvencu.

Ovi antimikrobni peptidi imaju bakteriostatski ili baktericidni spektar djelovanja koji je
uglavnom usmjeren protiv bakterija vezanih uz proizvodni soj i u rjeđim slučajevima protiv šireg
spektra nepovezanih skupina bakterije. Ćelije koje proizvode bakteriocin obično postavljaju
mehanizme odbrane kako bi spriječili da budu ubijeni vlastitim bakteriocinima, bilo
sintetiziranjem samoimuniteta proteina ili korištenjem efluks pumpi, ili korištenjem oba sistema.
(Baquero F. Moreno F. 1984.)

Termin bakteriocini prvi put je predložen od strane Tagg i sar. (1976), i definisani su kao
proteinska jedinjenja sposobna da inhibiraju rast bliskih bakterija, ili bakterija iste ekološke niše.
Prvi podaci o bakteriocinima zabilježeni su u radu sa Gram-negativnim bakterijama, tačnije sa
Eshcerichia coli i nazvani su kolicini. (Cotter, P. D., Ross, R. P., & Hill, C. 2013.)

Od tog perioda, bakteriocini su definisani na osnovu osobina kolicina koji su plazmidno

kodirani, veliki proteini koji imaju bakteriocidni efekat kroz interakciju sa specifičnim
receptorima i letalni su izazivajući SOS-inducibilnu biosintezu (sl.1). Pored bakteriocina koji se
uklapaju u ovu definiciju, veliki broj bakteriocina Gram-pozitivnih bakterija odstupa od ove
definicije.

Slika 1: Struktura membranski vezanog kolicina u otvorenom (gore) I zatvorenom (dole) peptidnom
lancu. Crvene tačke označavaju histidin

6
Osnovna razlika bakteriocina Gram-pozitivnih bakterija i Gram-negativnih bakterija je u
mehanizmu transporta bakteriocina iz bakterijske ćelije. Takođe, u Gram-pozitivnim bakterijama
sinteza i ekspresija bakteriocina je pod regulacijom specifičnih gena, dok su bakteriocini Gram-
negativnih bakterija pod uticajem ćelije domaćina. (Cotter, P. D., Ross, R. P., & Hill, C. 2013.)

Do danas, bakteriocini su pronađeni skoro u svakoj bakterijskoj vrsti.„Gotovo 99% svih bakterija
mogu sintetisati makar jedan bakteriocin, jedini razlog zašto ga nismo našli je zato što ga nismo
ni tražili“ (Klaenhammer, 1988). Diverzitet i broj bakteriocina ukazuju na njihovu ozbiljnu ulogu
kao antimikrobnih jedinjenja.

Bakteriocini se sve češće pominju kao zamjena za antibiotike ili dopuna antibiotskoj terapiji.
Antibiotici i bakteriocini se razlikuju u tri ključne karakteristike:

 bakteriocini su ribozomalno sintetisani, dok antibiotici nisu,

 bakteriocini imaju relativno uzak spektar delovanja, dok većina antibiotika poseduje
širok spektar delovanja,
 bakteriocini ispoljavaju dejstvo u mnogo manjim koncetracijama od antibiotika.
Bakteriocini podrazumevaju veliki broj proteina koji se razlikuju u veličini,

7
2. OPŠTE KARAKTERISTIKE BAKTERIOCINA

2.1 Bakteriocini

Iako bakteriocini imaju antibiotska svojstva, oni se ne klasificiraju kao antibiotici, od kojih su
različiti po brojnim karakteristikama. Bakteriocini su mali peptidi koji se sintetiziraju na
ribosomima tijekom lag faze rasta, dok su antibiotici sekundarni metaboliti. Budući da je
biosinteza bakteriocina relativno jednostavna, putem bioinženjeringa lako se može pojačati
njihova aktivnost ili djelovanje na određenu bakteriju.

Aktivnost bakteriocina jeste uži spektra, odnosno bakteriocini određene vrste bakterija aktivni su
protiv sojeva iste vrste ili srodnih vrsta, dok antibiotici imaju široki spektar djelovanja.
Bakteriocini djeluju na način da formiraju pore ili inhibiraju biosintezu ćelijske membrane, dok
antibiotici djeluju na ćelijskoj membrani ili unutarćelijskim ciljevima. (Klaenhammer, 1988)

Bakteriocini su termostabilni i aktivni u širokom rasponu pH vrijednosti nasuprot antibioticima

koji su termolabilni i aktivni u uskom rasponu pH vrijednosti. Bakteriocini nemaju boju, okus i
miris, a antibiotici imaju.

Dok su bakteriocini sigurni za konzumaciju zahvaljujući tome što ih proteolitički enzimi lako
razgrađuju, antibiotici imaju nisku razgradivost. Osim toga, bakteriocini uglavnom nisu toksični
za eukariotske ćelije, dok antibiotici jesu. Ciljne ćelije mogu razviti rezistentnost na bakteriocine
ili antibiotike. Rezistentnost na bakteriocine ostvaruje se prilagodbom putem promjena u sastavu
ćelijske membrane, dok se rezistentnost na antibiotike ostvaruje genetskim promjenama kojima
se inaktivira aktivna komponenta. (Klaenhammer, 1988)

Na kraju, bakteriocini se primjenjuju u prehrambenoj industriji te imaju i kliničku primjenu, dok

se antibiotici mogu primjenjivati samo klinički.

8
Podaci u nastavku rezimiraju razliku između bakteriocina i antibiotika. (tab. 1 )

Tabela 1: Razlike između bakteriocina i antibiotika

Bakteriocin je proteinski toksin Antibiotik je antimikrobna

DEFINICIJA koji proizvode bakterije protiv supstanca koja ubija ili inhibira
blisko povezanih bakterijskih rast drugih bakterija.
spojeva.
ANTIBAKTERIJSKA AKTIVNOST Uski spektar Široki spektar

Sinteza bakteriocina se odvija u Antibiotici su sekundarni

PROIZVODNJA ribosomima procesom metaboliti produkta vlastitiog
translacije kakvu jesu polimeri metabolitickog puta.
amino kiselina.
MOLEKULARNA TEŽINA Velika molekularna masa Mala molekularna masa

RIBOZOMALNO PORIJEKLO Ribozomalnog porijekla Neribozomalnog porijekla

OSJETLJIVOST NA BAKTERICIDNE Nisu osjetljivi na baktericidne Osjetljivi su na baktericidne

AGENSE agense
Vezanje za ćelijske zidove
MEHANIZAM DJELOVANJA
osjetljivih mikroba dovodi do
ionske neravnoteže I stvra spore.
agense
Uništava ćelijski zid I
membranu,inhibira proteinsku
sintezu kao I sintezu DNK i RNK

2.2 Mehanizam djelovanja bakteriocina

Bakteriocini koje sintetiziraju gram-pozitivne bakterije djeluju prvenstveno na širi i/ili uži
spektar drugih gram-pozitivnih bakterija, a djelovanje im može biti baktericidno sa ili bez lize
stanice, ili bakteriostatsko (Silva i sur., 2018).

Za mnoge bakteriocine (lantibiotici tipa A i bakteriocini razreda II) glavno mjesto djelovanja je
citoplazmatska membrana bakterija, odnosno primarni receptori su anionski lipidi citoplazmatske
membrane (McAuliffe i sur., 2001; Zacharof i Lovitt, 2012). Bakteriocini na njoj formiraju pore,
čime izazivaju raspršivanje, to jest gubitak protonske motorne sile, koju čine pH gradijent i
membranski potencijal, a koja služi za sintezu ATP-a i akumulaciju metabolita putem
transportnih sistema u membrani. Na taj način ćelij gubi osnovni izvor energije, što dovodi do
njene smrti. (sl.2)

9
 Slika 2: Prikaz inhibicije sinteze ćelijskog zida (a) i formacije pore (b).Oba mehanizma započinju
vezivanjem molekule nizina za lipid II koji je ujedno i glavni transporter peptidoglikanskih jedinica-
gradivnih komponenata membrane

Lantibioticima tipa A za djelovanje nije potreban proteinski receptor, no aktivnost nizina ovisi o
koncentraciji lipida II, koji je prekursor u sintezi peptidoglikana, odnosno neophodan je za
sintezu ćelijske membrane. Interakcijom s lipidom II povećava se sposobnost nizina da se veže
za membranu, ošteti lipidni dvosloj i formira pore, što znači da osjetljivost pojedinih vrsta
bakterija na nizin ovisi o sastavu njihove citoplazmatske membrane. Nizin formira stabilne pore
koje imaju promjer od približno 1 nm. Za formiranje i otvaranje pora od strane nizina, važno je
energetsko stanje bakterijske ćelije, to jest električni transmembranski potencijal. Nizin, kao i
neki drugi lantibiotici i bakteriocini razreda II, također može djelovati na način da cilja lipid II i
inhibira sintezu ćelijske membrane, ali u usporedbi sa formiranjem pora to je sporiji proces
(McAuliffe i sur., 2001).

Lantibiotici tipa B mogu djelovati na način da remete osnovne enzimske aktivnosti te mogu
inhibirati sintezu peptidoglikana, povećati permeabilnost membrane, formirati komplekse sa
lipidom II ili inhibirati bakterijsku fosfolipazu A2.

Bakteriocini razreda IIa djeluju na način da uzrokuju gubitak protonske motorne sile ili formiraju
sitne pore. Budući da se bakteriocini razreda IIb sastoje od dva peptida, oba su potrebna za
formiranje hidrofilnih pora i povećanje permeabilnosti membrane. U razredu IIc nalaze se
strukturno različiti bakteriocini sa različitim djelovanjem, poput permeabilizacije membrane,
inhibicije stvaranja septuma i aktivnosti feromona. Lakticin Q ubraja se u razred IId i on se,
primjerice, veže s vanjske strane lipidnog dvosloja te formira velike pore prosječnog promjera
većeg od 4,6 nm, a za njegovo djelovanje nije potreban lipid II (sl.3). Bakteriocini razreda III

10
kataliziraju hidrolizu ćelijske membrane, odnosno autolizu bakterijske ćelije (Paiva i Breukink,
2013).

Slika 3: Prikaz aktivnosti Lakticin Q bakteriocina

Kako bi se bakterijske ćelije zaštitile od djelovanja vlastitih bakteriocina, sintetiziraju specifične

imunosne proteine, a geni odgovorni za njihovu proizvodnju genetski su bliski genima za sintezu
samih bakteriocina te se obično nalaze na istom operonu. U zaštiti lantibiotika zajednički
sudjeluju dva imuna sistema, odnosno imunosni proteini LanI i LanFEG. LanI se nalazi s vanjske
strane citoplazmatske membrane te sprječava bakteriocin da formira pore, dok LanFEG
kontrolira koncentraciju bakteriocina u membrani na način da molekule bakteriocina koje su se
smjestile u membrani transportira izvan membrane.

Kod bakteriocina razreda II imunosni protein se uglavnom većim dijelom nalazi u citoplazmi, a
samo mali dio je povezan sa membranom. Ta interakcija imunosnog proteina sa
citoplazmatskom membranom štiti bakterijsku ćeliju od djelovanja bakteriocina. Imunosni
protein može varirati u veličini te se može sastojati od 51 do 254 aminokiseline (Paiva i
Breukink, 2013).

11
2.3 Bakterijska rezistentnost na bakteriocine

Kao i u slučaju konvencionalnih antibiotika, dugotrajna primjena bakteriocina, to jest izloženost

patogenih bakterija ili uzročnika kvarenja bakteriocinima, može dovesti do razvoja otpornosti na
iste. Iako brzo djelovanje bakteriocina u velikoj mjeri smanjuje mogućnost razvoja otpornosti
kod osjetljivih bakterija, i dalje je moguća pojava mutiranih bakterijskih ćelija. Učestalost pojave
otpornosti, kao i mehanizmi putem kojih se ona javlja, mogu se razlikovati i između sojeva istih
vrsta bakterija.

Otpornost na neki bakteriocin može biti stečena i pojaviti se kod bakterija koje su prethodno na
njega bile osjetljive ili može biti urođena. Nekoliko genskih lokusa povezuje se sa otpornošću na
bakteriocine. Ako mutacije na određenom genu uzrokuju osjetljivost na bakteriocin, tada je taj
gen odgovoran za urođenu otpornost.

S druge strane, ako mutacije na genu dovedu do razvoja otpornosti, tada ga se povezuje sa
stečenom otpornošću. Mehanizmi putem kojih se ostvaruje otpornost obično su povezani sa
promjenama u ćelijskom omotaču bakterija. Te promjene mogu uzrokovati smanjeno vezivanje
ili umetanje bakteriocina, odstranjivanje bakteriocina, izbacivanje bakteriocina putem efluks
pumpi i razgradnju bakteriocina (Bastos i sur., 2015).

Najviše istraživanja provedeno je u vezi sa otpornošću bakterija na nizin, pediocin i lakticin 3147
(Bastos i sur., 2015). Gravesen i sur. (2002) proveli su istraživanje o razvoju otpornosti kod
bakterije Listeria monocytogenes na pediocin PA-1 i nizin A. Naglasak je bio na 6 razlika
između različitih sojeva i utjecaju okolišnih uvjeta (pH, NaCl, temperatura).

Utvrđene su značajne razlike u frekvencijama razvoja otpornosti s obzirom na korišteni

bakteriocin, sojeve bakterije i okolišne uvjete. Razvoj otpornosti na pediocin PA-1 testiran je na
20 sojeva Listeria monocytogenes, od kojih je pet bilo potpuno otporno, devet je imalo srednje
pojačanu otpornost, a šest sojeva je bilo osjetljivo na pediocin.

Razvoj otpornosti na nizin A utvrđen je za 14 sojeva. Četiri soja imala su srednje pojačanu
otpornost na nizin, dok je ostalih deset sojeva bilo osjetljivo na nizin. Okolišni uvjeti, odnosno
snižena temperatura (10°C u odnosu na 30°C), pH vrijednost (5,5 u odnosu na 6,5) i dodatak
NaCl (6,5%), nisu imali utjecaj na frekvenciju otpornosti na pediocin PA-1, ali je otpornost na
nizin A u takvim uvjetima značajno smanjena. Jydegaard i sur. (2000) istraživali su mehanizam
inaktivacije bakterije Listeria monocytogenes 412 nizinom i pediocinom te su utvrdili kako ona
ovisi o bakterijskoj fazi rasta.

Ćelije su u stacionarnoj fazi rasta bile otpornije na oba bakteriocina nego u eksponencijalnoj fazi
rasta. Također je utvrđeno da dodatak natrijevog klorida (6,5%) ili snižena temperatura (5°C)
pojačavaju toleranciju bakterije na pediocin. Bastos i sur. (2015) navode istraživanje koje su
proveli autori Rasch i Knøchel, a u kojem je proučavana otpornost Listeria monocytogenes na
nizin i pediocin.

12
Korišten je 381 soj, od kojih niti jedan nije bio prirodno otporan na nizin, a samo dva soja imala
su pojačanu toleranciju na nizin. Nadalje, 20 sojeva je bilo otporno na pediocin, dok su 34 soja
imala pojačanu toleranciju na pediocin.

2.4 Primjena bakteriocina

Antibakterijska svojstva bakteriocina čine ih pogodnima za primjenu u različitim područjima, a

posebno u prehrambenoj industriji. Mogu se koristiti kao sredstvo poboljšanja sigurnosti i
kvalitete te poboljšanja senzornih svojstava različitih namirnica kao što su mliječni ili mesni
proizvodi, jaja i povrće. Osim u samim namirnicama, bakteriocini se mogu koristiti kao sredstvo
protiv stvaranja biofilmova koji se formiraju na opremi u pogonima. Također se koriste i u
farmaceutskoj industriji i medicini, a svoju primjenu našli su i u proizvodima poput sapuna ili
zubne paste (Zacharof i Lovitt, 2012; Perez i sur., 2014).

Bakteriocini mogu biti sastojak antimikrobnih filmova i premaza koji služe kao barijera između
određene namirnice i okoliša, a koji su sastavljeni od tankih slojeva biopolimera u koje se
bakteriocini mogu inkorporirati. Takvi filmovi i premazi koriste se za poboljšanje sigurnosti i
kvalitete namirnica pri tom ne mijenjajući njihova senzorska i nutritivna svojstva.

Tako se u proizvodnji sireva najčešće koriste biopolimeri poput proteina i polisaharida, koji su
pogodni za inkorporaciju bakteriocina ili bakterija koje ih sintetiziraju. Njihovom upotrebom
može se inhibirati rast patogenih bakterija i bakterija uzročnika kvarenja, spriječiti naknadna
kontaminacija, poboljšati stabilnost i sigurnost te produžiti rok trajnosti mliječnih proizvoda
(Valdés i sur., 2017; Silva i sur., 2018).

Antimikrobni filmovi mogu se koristiti i kao dio ambalaže sireva kako bi se spriječio rast
patogenih bakterija na njihovoj površini. Film mora biti u direktnom doticaju sa površinom sira
kako bi se bakteriocini po njoj mogli raširiti i učinkovito djelovati (Nandane i sur., 2007).
Bakteriocini se mogu koristiti u kombinaciji sa hemijskim aditivima, ili sa drugim postupcima
koji mogu uključivati primjenu visokih temperatura, visokog pritiska ili pulsirajućeg električnog
polja.

Hemijski aditivi koji se obično koriste su EDTA (etilendiamintetraoctena kiselina), natrijev

laktat i kalijev diacetat. Etilendiamintetraoctena kiselina se koristi kako bi se oštetila vanjska
membrana gram-negativnih bakterija te kako bi one postale osjetljive na djelovanje bakteriocina.
Primjena visokih temperatura učinkovito djeluje na bakterije koje su otporne na pojedine
bakteriocine. Postupci primjene visokog pritiska i pulsirajućeg električnog polja, također
uzrokuju osjetljivost gram-negativnih bakterija na bakteriocine. Efikasnost djelovanja
bakteriocina može se povećati i primjenom više različitih bakteriocina zajedno (Nandane i sur.,
2007).

13
Osim u proizvodnji mliječnih proizvoda, bakteriocini, a posebno lantibiotici, imaju veliki
potencijal za primjenu kao sredstvo u borbi protiv formiranja biofilmova. Biofilmovi su
zajednice jedne ili više vrsta mikroorganizama koje mogu nastaniti različite biotičke i abiotičke
površine te predstavljaju velik izazov u prehrambenoj industriji, kao i u bolničkom okruženju.
Bakterije koje se nalaze u biofilmu često su otporne na antibiotike i fizikalni i hemijski stres te
mogu preživjeti u iznimno nepovoljnim uvjetima.

U mljekarskim pogonima rizik predstavljaju biofilmovi nastanjeni primjerice bakterijama

Listeria monocytogenes, Bacillus cereus i Staphylococcus aureus, kao i pojedinim gram-
negativnim bakterijama, koje uzrokuju bolesti koje se prenose hranom (sl.4). Mogu se formirati
na vlažnim površinama, podu, odvodima, zidovima, raznoj opremi, dijelovima pasterizatora,
tankovima za mlijeko, drvenim površinama poput polica u zrionama i ostalom (Marino i sur.)

Slika 4: Biofilmovi tretirani nizinskim peptidima (nizin A i Nizin I4V)

14
3. KLASIFIKACIJA BAKTERIOCINA

Klasifikacija bakteriocina je dugi vremenski period predmet neslaganja i rasprave. Prva

klasifikacija bakteriocina predložena je 1993 (Klaenhammer, 1993):

 Klasa I – bakteriocini koji poseduju lantionin – Lantibiotici;

 Klasa II – mali, termostabilni, koji ne poseduju lantionin
 Klasa III- veliki, termostabilni protein;
 Klasa IV – kompleksni bakteriocini, sastoje se od proteina plus još jedne ili više
hemijskih komponenti (masti, ugljeni-hidrati) neophodnih za aktivnost.

Kasnije, predložena je dosta drugačija i jednostavnija shema klasifikovanja bakteriocina BMK.

U novijoj klasifikaciji, bakteriocini su podijeljeni u dvije klase, Klasa I – lantibiotici i klasa II –
bakteriocini koji ne poseduju lantionin. Prethodna Klasa III je preimenovana u bakteriolizine, i
izdvaja se kao posebna grupa bakteriocina, a Klasa IV je izbačena (Klaenhammer, 1993):
Međutim, Heng i Tagg (2006) smatraju da se takvom klasifikacijom kolicini, kao prototip
bakteriocina ne mogu svrstati ni u jednu od predloženih klasa. Zbog toga ovi naučnici predlažu
novu, univerzalnu klasifikaciju koja bi obuhvatala sva do sada okarakterisana antimikrobna
jedinjenja koja spadaju u bakteriocine. Ipak mnogo više korištena i citirana klasifikacija, kojom
se rukovodilo i u ovom radu (shema 1) (Rea et al., 2011)

Danas je opšte prihvaćena definicija bakteriocina BMK koja glasi: “Bakteriocini su mali,
ribozomalno sintetisani peptidi ili proteini koji imaju relativno uzak spektar antimikrobne
aktivnosti koja je ograničena na blisko srodne vrste i prema kojoj soj proizvođač ima mehanizam
specifične samozaštite“.

15
 Shema 1: Prikaz predložene univerzalne klasifikacije koja bi obuhvatila sve do sada
okarakterisane bakteriocine

3.1 Bakteriocini Klase I

Generalno, Klasi I bakteriocina pripadaju svi bakteriocini koji prolaze kroz posttranslacione
modifikacije. Prvom klasifikacijom, svi bakteriocini ove klase su podijeljeni na Tip A i Tip B.
Međutim, kako ova klasifikacija nije bila održiva, ona je modifikovana i predloženo je da se Tip
A lantibiotika podijeli na dvije podgrupe (AI i AII). Takođe, ovom klasifikacijom, uvedena je još
jedna posebna grupa lantibiotika, a to su dvo-peptidni lantibiotici.

Kako se broj lantibiotika tokom vremena povećavao, predložene su nove klasifikacije, međutim,
ni jednom od predloženih klasifikacijama nisu mogli da se obuhvate svi bakteriocini ove grupe
sve do prijedloga koji su dali su (Rea et al. (2011), gdje predlažu da se ova klasa bakteriocina
podeli na podklase Ia (lantibiotici), Ib (labirintopeptini) i Ic (saktibiotici).

Klasa Ia – lantibiotici - to su mali peptidi (19-28 aminokiselina). Lantibiotici trpe

posttranslacione modifikacije i dobili su ime jer sadrže lantionin/metilantionin residue u svojim
polipeptidnim lancima. Ove modifikacije se dogadjaju usljed dehidratacije serina ili treonina do
dehidroalanina odnosno dehidrobutirina.

16
Neke od modifikacija se dogadjaju usljed kondezacije serina i treonina sa cisteinom, pri čemu se
formiraju lantionin i metil-lantionin. Lantibiotici su prvi put podeljeni u dve subklase: tip A i tip
B (Breukink et al., 1999).

Tip A lantibiotika, u koji spada i nizin, su dugački, pozitivno naelektrisani peptidi (do 34
aminokiselina), koji djeluju na ciljnu ćeliju tako što vrše depolarizaciju membrane izazivajući
curenje malih molekula, što dovodi do eventualne smrti ćelije. Struktura metillantionin mostova
je slična među svim lantibioticima ove grupe. Tip B lantibiotici su kraći (do 19 aminokiselina),
imaju globularnu strukturu i neki djeluju na ciljnu ćeliju tako što inhibiraju enzim koji ima ulogu
u sintezi ćelijskog zida. Međutim, na primjeru djelovanja nizina, koji pored toga što formira pore
na ćelijskoj membrani senzitivne ćelije, što ga svrstava u tip A, on inhibira i sintezu
peptidoglukana vezujući se za prekursor peptidoglukana lipid II što ga klasifikuje kao tip B
(Breukink et al., 1999).

Postojala je težnja da se ova klasa podijeli na četiri podklase, na osnovu načina dobijanja zrelog
peptida, kao i na osnovu odsustva/prisustva antimikrobne aktivnosti.

Podklasa I – linearni peptidi kod kojih je pre-peptid modifikovan djelovanjem dva enzima LanB
i LanC. Najbolje okarakterisan bakteriocin ove grupe je nizin.

Podklasa II – bakteriocini sa više globularnom strukturom nego predhodna grupa. Pre-peptidi

bakteriocina ove podklase su modifikovani pod uticajem jednog proteina, LanM. Najbolje
okarakterisani bakteriocini ove podklase su lakticin.

Podklasa III – peptidi koji su slični lantibioticima na osnovu srodnosti modifikacionih enzima,
ali za koje nije pokazano da imaju antimikrobno djelovanje. Tri okarakterisana predstavnika ove
podklase su SapB, AmfS i SapT, a uključeni su u formiranje vazdušnog micelijuma kod
Streptomyces sp. (Klaenhammer, 1993).

Podklasa IV – bakteriocini ove podklase su grupisani na osnovu još jedne nove klase lantionin
sintetaze, LanL. Bakteriocini ove i podklase III mogu se svrstati u “lantipeptide”, koji opisuju
jedinjenja koja po strukturi pokazuju povezanost sa lantibioticima, a koji ne ispoljavaju
antimikrobno djelovanje.

Klasa Ib – Labirintopeptini su relativno novooktriveni posttranslaciono modifikovani peptidi.

Po strukturi se razlikuju od lantibiotika jer kod njih se nakon posttranslacione modifikacije
formira labionin, karbaciklična aminokiselina (Klaenhammer, 1993). Bakteriocini ove klase su
se pokazali izuzetno potentni u borbi protiv virusa Herpes simpleks.

17
Klasa Ic – Saktibiotici su ciklični bakteriocini koji trpe neobične posttranslacione modifikacije
sa formiranim vezama između sumpora iz tri cisteinska ostatka i α-ugljenika iz dva fenilalanina i
jednog trenonina . Predstavnik ove grupe je Subtilozin A.(sl.5)

Slika 5 : a) Klasa I- nizin,lipid II kompleks b) Klasa II-sakacin c) Klasa III-kolicin B

3.1.1 Mehanizam djelovanja bakteriocina klase I

Djelovanje lantibiotika najviše je usmjereno na Gram-pozitivne bakterije, među njima su i

patogene bakterije koje nose rezistencije na antibiotike, patogene bakterije prisutne u hrani kao i
bakterije koje izazivaju kvarenje namirnica (Wiedemann et al., 2001). Djelovanje na senzitivnu
ćeliju lantibiotici vrše vezivanjem za lipid II (prekursor peptidoglukana) čime dovode do
inhibiranja sinteze ćelijskog zida i formiranjem pora na ćelijskoj membrani.

Formiranjem pora na ćelijskoj membrani ometa se potencijal membrane, stopira se formiranje

ATP-a i na kraju dolazi do smrti ćelije. Kombinovanje dva različita mehanizma djelovanja
bakteriocina u kojima je ciljni molekul isti, predstavlja ove molekule moćnim antimikrobnim
sredstvom, što rezultira djelovanjem u nanomolarnim koncentracijama.

Lantibiotik, nizin A, djeluje na senzitivnu ćeliju korištenjem oba mehanizma i time predstavlja
jedan od najpotentnijih bakteriocina. Neki lantibiotici, kao što su nukacin ISK-1 i lakticin 481,
koriste lipid kao ciljni molekul za vezivanje za ćeliju, ali mehanizam delovanja na senzitivnu
ćeliju im se zasniva samo u inhbiranju sinteze ćelijskog zida.

Ipak, bakteriocini ove podgrupe se međusobno razlikuju u tome što se neki vezuju za
cviterjonske lipide, a neki za anjonske lipide, po čemu su dosta slični nizinu. Neki bakteriocini,
kao što je mutacin II, energetski potpuno osiromašuju ćelije. Sam mehanizam delovanja ovog
bakteriocina nije u potpunosti shvaćen, ali pretpostavlja se da na neki način inhibira metaboličke
procese proizvodnje energije u ćeliji (Baquero F. Moreno F. 1984).

18
Primjećeno je da ovaj bakteriocin ne formira stabilne pore na ćelijskoj membrani, ali je nejasno
kako i da li formira privremene pore. U slučaju dvopeptidnih lantibiotika (lakticin 3147), prvi
peptid, LtnA1 komponenta, vezuje se za lipid II, a drugi peptid, LtnA2 komponentu, vezuje se za
kompleks LtnA1/lipid II, gde nastanak trokomponentnog kompleksa dovodi do formiranja pora u
membrani ćelije.

3.2 Bakteriocini Klase II

Bakteriocini ove grupe su uglavnom mali, termostabilni, katjonski i hidrofobni peptidi. Klasa II
bakteriocina predstavlja veliku i raznovrsnu grupu antimikrobnih peptida koji su podijeljeni u
nekoliko podgrupa, a dalje na podklase: IIa – „pediocinlike“ bakteriocini; IIb – dvopeptidni
bakteriocini; IIc – cirkularni bateriocini; IId – bakteriocini bez lider peptida. Zajednička osobina
bakteriocina klase II je mehanizam njihovog djelovanja na senzitivne ćelije. Na osnovu većeg
broja studija, pokazano je da bakteriocini ove klase djeluju tako što permeabilizuju ćelijske
membrane, nakon čega dolazi do curenja malih molekula iz ćelije, što izaziva smrt ćelije.

Međutim, pored toga što je mehanizam njihovog djelovanja isti, receptori na senzitivnim
ćelijama za koje se vezuju bakteriocini se mogu razlikovati.

Podklasu IIa čine bakteriocini koji su slični pediocinu, „pediocin-like“. Oni vrlo često imaju
uzak spektar delovanja, ali su jako značajni jer inhibiraju rast Listeria monocytogenes. Oni se
vezuju za senzitivnu ćeliju koristeći komponente manozafosfotransferaznog sistema (man-PTS),
svoju antimikrobnu aktivnost ostvaruju, kao što je već pomenuto, narušavanjem membranskog
potencijala senzitivne ćelije (Diep et al., 2007; Kjos et al., 2010). Ono što je karakteristično za
bakteriocine ove podklase je da imaju konzerviranu N-terminalnu sekvencu
YGNGVXCXXXXVXV (gde je X bilo koja aminokiselina) i formiraju jedan ili dva disulfidna
mosta u N-terminalnom delu peptida. U ćeliji se sintetišu sa lider peptidom koji se, prije
izbacivanja bakteriocina iz ćelije, isijeca proteolitičkim enzimima.
Obično se isijecanje odvija posle dva glicina (GG).

Prvi i najbolje okarakterisan bakteriocin ove podklase je Pediocin PA-1/AcH koji

sintetiše Pediococcus acidalactici (Motlagh et al., 1992), ali se može naći i u laktokokama,
streptokokama kao i laktobacilima.

19
Podklasu IIb čine bakteriocini koji su sastavljeni od dva nemodifikovana peptida. Jedinstvenost
ovih bakteriocina predstavlja to što je optimalna antimikrobna aktivnosti uslovljena delovanjem
oba peptida, koji se nalaze u međusobnom odnosu 1:1. U nekim slučajevima, pojedinačni peptidi
mogu ispoljavati antimikrobnu aktivnost, ali je ta aktivnost dosta slabija od one kad oba peptida
deluju. Međutim, u slučaju bakteriocina laktokokcin G (Baquero F. Moreno F. 1984) i lakticin
705 potvrđeno je da pojedinačni peptidi nemaju antimikrobnu aktivnost.

Svi dvopeptidni bakteriocini poseduju lider peptid koji se iseca posle dva glicina (GG-) i
eksportuju se van ćelije koristeći ABC-transporte. Do sada je okarakterisano 15 bakteriocina koji
pripadaju ovoj podklasi. Laktokocin G je prvi i najbolje okarakterisan bakteriocin ove grupe i
njegova aktivnost zavisi od oba peptida, odnosno komponenata α i β, koji su prisutni u odnosu
1:1. Receptor za vezivanje laktokcina G za senzitivnu ćeliju je undekaprenil pirofosfatna
fosfataza (Upp protein), koja je uključena u sintezu peptidoglukana . Sam mehanizam djelovanja
ova dva peptida na senzitivnu ćeliju nije do kraja objašnjen, ali vjerovatno dolazi do vezivanja
oba peptida za površinu ćelijske membrane, čime menja njen potencijal, što dovodi do curenja
jona i smanjenja koncentracije ATP-a u ćeliji, a rezultat je smrt ćelije (Garneau et al., 2002).

Podklasu IIc čine bakteriocini kod kojih su terminalni C i N krajevi kovalentno povezani, što
rezultira cirkularnoj formi ovih bakteriocina (Maqueda et al., 2004). Dugi niz godina, enterocin
AS-48 je bio jedini poznati cirkularni bakteriocin, ali danas je poznato još nekoliko bakteriocina
ove podklase: gasericin A i cirkularin, karnociklin A, subtilozin, uberolizin, leukocilizin i
laktociklicin Q. Strukturu ovih cirkularnih peptida čini 58-70 aminokiselina, koje su katjonske i
sadrže veliki broj hidrofobnih aminokiselina (Maqueda et al., 2008). Oni pokazuju izuzetnu
stabilnost na različitim temperaturama i širokom pH opsegu. Takođe, bakteriocini ove podklase
su otporni na delovanje pronaze ali su osetljivi na delovanje endoproteaza.

Neki od cirkularnih bakteriocina ispoljavaju širok spektar antimikrobnog djelovanja, takođe

mogu delovati na patogene kao što su, stafilokoke, enterokoke, listerije i klostridije.

Ono što je karakteristično za bakteriocine ove grupe kao što su enterocin AS-48, gasericin A,
subtilozin A i karnocilin A jeste da mogu ispoljiti svoju aktivnost bez prisustva bilo kakvog
receptora. Enterocin AS-48 formira ne-selektivne pore, što uzrokuje curenje malih molekula, dok
karnocilin A formira anjon-selektivne pore što izaziva depolarizaciju membrane

20
IId podklasu bakteriocina čine neklasifikovani, jednopeptidni bakteriocini koji se razlikuju od
pediocina. Među bakteriocinima podklase IId mogu se razlikovati: 1. sec- zavisni bakteriocini; 2.
bakteriocini bez lider peptida ("leaderless bacteriocins") i 3. ostali bakteriocini klase IId.
Bakteriocine bez lider peptida uglavnom sintetišu bakterije koje nisu BMK, stafilokoke i
bakterije propionske kiseline (Maqueda et al., 2008).

Prvi bakteriocini ovog tipa su bakteriocini L50 i enterocin Q izolovani iz BMK, Enterococcus
faecalis i Enterococcus faecium. Bakteriocini ove podklase svoju antimikrobnu aktivnost
ostvaruju permeabilizacijom membrane, a potom curenjem ćelijskog sadržaja dolazi do smrti
ćelije. Pojedini bakteriocini ove podklase (laktokokcin A i B), kao i bakteriocini podklase IIa,
koriste man-PTS komponente kao receptore za vezivanje za senzitivnu ćeliju. Pored ovih
sličnosti, bakteriocini ove podklase ne pokazuju nikakvu homologiju sa bakteriocinima podklase
IIa.

3.3 Bakteriolizini

Ovoj grupi pripadaju veliki bakteriocini (>30kDa) i termolabilni bakteriocini.

Ranije su bili svrstani u klasu III bakteriocina. Na osnovu mehanizma djelovanja,
razlikuju se u odnosu na ostale bakteriocine, jer oni djeluju na senzitivnu ćeliju
izazivajući njeno liziranje.

Ono što je jedna od najinteresantnijih razlika u odnosu na ostale bakteriocine je to što

bakteriolizini ne sintetišu uvijek imuni protein, nego se njihova imunost zasniva na modifikaciji
ćelijskog zida bakterijske ćelije, producenta bakteriocina. Predstavnici ove grupe bakteriocina su
helveticin J (Joerger i Klaenhammer, 1986), helveticin V-1829 i acidoflucin A.

21
4. BAKTERIOCINI – NOVA GENERACIJA ANTIBIOTIKA

4.1 Izolacija i prečišćavanje bakteriocina

S obzirom da bakteriocini čine jako heterogenu grupu jedinjenja, međusobno se razlikuju, a te

razlike se ogledaju u različitoj rastvorljivosti u organskim rastvaračima, veličini, izoelekričnoj
tački, afinitetu prema ligandima itd.

Bakteriocini su proteini ili mali peptidi, a ono što im je zajedničko to je da su najčešće pozitivno
naelektrisani. Zbog svih ovih karakteristika bakteriocina, genetička karaktetrizacija bakteriocina
je nadmašila biohemijski pristup proučavanja njihovih karakteristika. Poslednjih nekoliko
godina, kako dolazi do razvijanja biohemijskih metoda i upoznavanja karakteristika bakteriocina,
biohemijski pristup karakterizacije bakteriocina je u porastu. Metode za izolaciju bakteriocina se
mogu podijeliti u tri grupe (Maqueda et al., 2008).

Prva grupa podrazumijeva metodu taloženja proteina korišćenjem amonijum-sulfata, a nastavlja

se nekim tipom hromatografije (jonoizmenjivačka, gel filtracija) i na kraju se završava
reverzno-faznom tečnom hromatografijom visokih performansi (RP-HPLC).

Druga grupa predstavlja modifikaciju prve, metoda se zasniva na taloženju proteina amonijum-
sulfatom, a zatim slijedi ekstrakcija proteina hloformom ili metanolom i na kraju, kao dodatno
prečišćavanje, koristi se HPLC.

Posljednji način na koji se mogu izolovati bakteriocini, koji se u današnje vrijeme najrjeđe
koristi, zasniva se na podešavanju pH vrednosti medijuma u kojem je rasla bakterijska kultura, a
koncetracija bakteriocina se dovodi do maksimuma, a nakon toga se koristi hidrofobna
hromatogrfija. (Maqueda et al., 2008).

Koja od navedenih metoda će biti korišćena, u mnogome zavisi od vrste bakteriocina, i

uglavnom se odabir metoda određuje empirijski. Jedan od problema koji se javljaju prilikom
izolacije bakteriocina je koncetracija bakteriocina u medijumu koja je jako niska, a vrlo retko
postoji način da se indukuje povećana proizvodnja. Ovaj problem se često rešava time što se
priprema velika količina polaznog materijala. Veći problem prilikom izolacije bakteriocina
predstavlja to što se BMK gaje u složenim medijumima kao što su MRS i GM17, koji u sebi već
sadrže značajnu količinu peptida kao i šećera, aminokiselina, koji mogu da ometaju izolaciju
željenog bakteriocina.

Zbog prethodno navedenih problema koji se mogu javiti, prije procesa izolacije i prečišćavanja
bakteriocina, potrebno je ustanoviti optimalne uslove za produkciju maksimalne koncetracije
bakteriocina (vremenski period rasta bakterijske kulture, medijum).

22
Biohemijski put dobijanja čistih bakteriocina sve češće se koristi u utvrđivanju njihove
potencijalne primene u konzervisanju hrane. Upotreba nizina i pediocina, kao konzervanasa
hrane, dovela je do potrebe da se razviju brze metode za izolaciju dovoljne količine čistih
bakteriocina.

Najčešći vid izolacije bakteriocina je njegovo taloženje amonijum-sulfatom. Ovaj metod ne

zahtijeva složenu aparaturu i prilično je jeftina metoda, međutim problem je što je potrebna
izuzetno velika količina početnog materijala i veoma je dug i zahtevan proces. Iz tog razloga,
posljednjih godina je se ova metoda zamjenjuje hromatografijom.

4.2 Bakteriocini i antibiotici

Iako istraživanja na antimikrobnim jedinjenjima datiraju još od 1877 godine, kada su Paster i
Joubert primijetili da neke bakterije mogu sprečavati rast Bacillus anthracis, interesovanje za
ovu oblast je i dalje veliko. Od tada se ulažu konstantni napori da se pronađu nepatogene
bakterije koje će sprečavati rast drugih bakterija. Takođe, poslednjih decenija, usled intezivne
upotrebe antibiotika, došlo je do porasta broja rezistentnih bakterija na antibiotike. Među
bakterijama koje nose rezistencije na antibiotike, najrasprostranjenije i najveće probleme
izazivaju sojevi rezistentni na metacilin vrste Staphylococcus aureus (MRSA) i vankomicin
rezistentne enterokoke (VRE) koje izazivaju sistemske infekcije u bolnicama (Cotter et al.,
2005).

Prvi veliki pomak u istraživanju, kao odgovor problemu bakterijskih rezistencija, bilo je
otkrivanje nizina. Nizin svoju antimikrobnu aktivnost ostvaruje vezivanjem za molekul lipida II,
koji je inače i ciljni molekul za djelovanje antibiotika vankomicina. Na osnovu ovog mehanizma
djelovanja nizina, mogu se napraviti novi antibiotici koji će se vezivati za ciljni molekul i
ispoljavati svoju antimikrobnu aktivnost (Sit i Vederas, 2008).

Pored toga što su mehanizmi djelovanja bakteriocina iskorišteni za pravljenje novih antibiotika,
bakteriocini se mogu koristiti i kao alternativa za antibiotike. Iako bakteriocini posjeduju
antibiotske karakteristike, oni se ne nazivaju antibioticima.

Razlozi su, sa jedne strane da bi se izbjegla konfuzija, a sa druge zato što imaju uzak
spektar djelovanja, za razliku od antibiotika (Maqueda et al., 2008). I pored toga,
činjenica da mogu djelovati na specifične patogene vrste, kao i da se mogu naći svuda u prirodi,
čini ih dobrim kandidatima za alternativu ili dopunu antibioticima.

23
Do sada je ispitivano djelovanje nizina i lakticina 3147 na patogene bakerije koje nose
rezistencije na antibiotike. Nizin je pokazao izuzetne rezultate na vankomicin i oksacilin
rezistentne Helicobacter pylori i Neisseria sp., dok je lakticin 3147 u in vitro uslovima pokazao
aktivnost protiv Staphylococcus aureus (uključujući MRSA), enterokoka (uključujući i VRE) i
streptokoka.

Kombinovanjem rezultata dobijenih proučavanjem odnosa između strukture i funkcije

bakteriocina i njihove ekspresije u homologim ili heterologim domaćinima teži se dobijanju
novih pristupa u izučavanju bakteriocina koji će omogućiti dobijanje derivata sa većim
antimikrobnim potencijalom i širim spektrom djelovanja.

24
4.3 Djelovanje bakteriocina na humani organizam

Upotreba konvencionalnih antibiotika može izazvati promjene u mikroflori probavnog sistema,

što može rezultirati raznim probavnim poremećajima i bolestima te narušenim imunitetom.
Pojedini bakteriocini mogu poslužiti kao alternativa antibioticima u kontroli infekcija izazvanih
raznim patogenim bakterijama, bez štetnog učinka na organizam.

Bakteriocini bi u probavnom sistemu mogli djelovati na više načina. Jedan je da djeluju kao
kolonizirajući peptidi. U probavnom sistemu ćelije su gusto naseljene, odnosno ćelije istih ili
različitih bakterijskih vrsta dolaze u bliski kontakt. Bakterije koje sintetiziraju bakteriocine stoga
mogu biti u prednosti budući da oni mogu djelovati na susjedne osjetljive bakterije.

Bakteriocini u većim koncentracijama imaju inhibitorno djelovanje, dok se u manjim

koncentracijama mogu ponašati kao signalni peptidi te potaknuti aktivaciju imunog sistema.

Pročišćeni bakteriocini imaju potencijal primjene protiv patogenih bakterija rezistentnih na

antibiotike bez negativnih posljedica na organizam (Dobson i sur., 2012; Arques i sur., 2015;
López-Cuellar i sur., 2016). Arques i sur. (2015) navode nekoliko istraživanja provedenih na
temu učinka bakteriocina na probavni sistem.

Potkožna aplikacija lakticina 3147 na miševima pokazala se efikasnom protiv bakterije

Staphylococcus aureus. Pregledom jetre, bubrega i slezene šest sati nakon primjene utvrđena je
uspješna kontrola širenja bakterije. Lakticin 3147 također bi mogao biti djelotvoran u tretiranju
dijareje izazvane bakterijom Clostridium difficile, iako podaci pokazuju da se pri oralnom
uzimanju brzo razgrađuje u probavnom sustavu.

Primjena bakterija koje sintetiziraju bakteriocine i mogu preživjeti u probavnom sistemu stoga
može biti bolja opcija od izravne primjene bakteriocina, s obzirom da se na taj način izbjegava
proteoliza tijekom prolaska kroz želudac. U jednom istraživanju provedenom na štakorima
proučavan je učinak primjene pročišćenog nizina i soja Lactococcus lactis CHCC 5826 koji
sintetizira nizin, na sastav crijevne mikroflore.

Primjena bakterije povećala je razinu bifidobakterija, a smanjila razinu enterokoka i streptokoka

u fecesu. Takav učinak nije uočen kod primjene pročišćenog nizina. Dobson i sur. (2011) s druge
strane u istraživanju navode da iako prolazak bakterije Lactococcus lactis DPC6520 kroz
gastrointestinalni sustav nije utjecao na njezinu sintezu lakticina 3147, u uzorcima fecesa nije
utvrđena aktivnost te bakterija nije imala utjecaja na Clostridium difficile.

Iako se bakteriocini mogu sintetizirati i zadržati aktivnost u probavnom sistemu, utvrđivanje

prisutnosti i djelovanja bakteriocina u tako kompleksnom okruženju i dalje može predstavljati
izazov (Arques i sur., 2015).

25
Nizin i lakticin 3147 učinkoviti su protiv sojeva bakterije Clostridium difficile, no rezultati
pojedinih istraživanja pokazuju da ti bakteriocini ipak nisu najbolji izbor u liječenju crijevnih
infekcija. (sl.6)

Slika 6 : Struktura Nizina I Lakticina 3147

Bakteriocin koji bi se koristio u tu svrhu trebao bi imati uzak spektar aktivnosti, odnosno ciljno
inhibitorno djelovanje na određeni patogen, a poznato je da nizin i lakticin 3147 imaju široki
spektar djelovanja usmjeren u najvećoj mjeri prema gram-pozitivnim bakterijama.

Stoga osim na patogenu bakteriju također imaju štetno djelovanje i na normalnu crijevnu
mikrofloru (Rea i sur., 2013). Rea i sur. (2011) istražili su djelovanje antibiotika vankomicina i
metronidazola te bakteriocina lakticina 3147 na bakteriju Clostridium difficile, kao i njihov
utjecaj na mikrofloru debelog crijeva. Primjenom svake od triju antimikrobnih supstanci
značajno se smanjio broj stanica Clostridium difficile, no također je došlo i do većih promjena u
sastavu crijevne mikroflore, odnosno manje raznovrsnosti zbog velikog povećanja broja
enterobakterija te smanjenja broja bakteroida.

Ne zna se da li je lakticin 3147 imao izravan utjecaj na bakteroide ili su nastale promjene
povezane sa njegovim djelovanjem na druge bakterije. Lakticin 3147 također negativno utječe na

26
laktobacile i bifidobakterije. Autori navode bakteriocin turicin CD kao bolji izbor u liječenju
infekcija izazvanih Clostridium difficile.

To je bakteriocin kojeg sintetizira bakterija Bacillus thuringiensis, a ima uzak spektar aktivnosti i
ciljno djelovanje protiv Clostridium difficile, koje je jednako učinkovito kao i ono lakticina 3147.
Nadalje, turicin CD ne uzrokuje značajne promjene u sastavu crijevne mikroflore te nakon
nekoliko sati nestaje iz crijeva čime se smanjuje mogućnost da patogen na njega razvije
otpornost.

Osim u liječenju gastrointestinalnih infekcija, bakteriocini, a posebno lantibiotici, uspješno se

primjenjuju u liječenju kožnih, dišnih i urogenitalnih infekcija, a nizin se također pokazao
djelotvornim u liječenju mastitisa kod ljudi. López-Cuellar i sur. (2016) navode i potencijal
primjene nizina i bakteriocina koje sintetizira Enterococcus mundtii u liječenju određenih vrsta
raka kao što su rak dojke, debelog crijeva ili pluća.

4.3.1 Bakteriocini bakterija mliječne kiseline u liječenju humanih urinarnih infekcija

Rezistentnost na antibiotike predstavlja prilagodbu bakterije i njen rast u prisustvu antibiotika.

Sticanje rezistentnosti povezano je s učestalnošću korištenja antibiotika među kojima mnogi
spadaju u istu skupinu, stoga rezistentnost na jedan antibiotik može dovesti do rezistentnosti na
cijelu skupnu (Arques i sur., 2015.) Nepravilnim i prekomjernim unosom antibiotika u
organizam dolazi do povećanja stope rezistentnosti na njih same.

Otprilike 20- 50% svih prepisanih antibiotika u američkim bolnicama povezanih s akutnim
oboljenjima prepisani su nepotrebno ili neadekvatno (CDC, 2013.). Isto tako loša kvaliteta
lijekova u kojima se često nalaze preniske koncentracije aktivne tvari pospješuju sticanje
rezistentnosti (Smelov i sur., 2016.). Iz 28 097 uzoraka urina izvanbolničkih pacijenata izolovano
je uropatogene E. coli u koncentraciji od 46,5%.

Kod tih 46,5% uzoraka u kojima je bila prisutna E. coli određivali su rezistentnost na antibiotike.
E. coli pokazala se visokorezistentnom prema amoksicilinu (57,8%), sulfometoksazol-
trimetoprimu (33,8%) i cefaleksinu (10,8%). Kinoloni antibiotici koji inače pokazuju dobru
eradikciju prema uropatogenima nisu se pokazali učinkoviti te je E. coli bila rezistentna u 16%
uzoraka(tab. 2) ( Pastuović i sur,2007).

27
 Tabela 2 : Prikazuje rezistentnost E. coli na sve korištene antibiotike u istraživanju.

Antibiotik Rezistentnost E.coli (%)

Amoksicilin 57,8
Sulfometoksazol+trimetoprim 33,8
Norfloksacin 16,1
Ciprofloksacin 15,5
Cefaleksin 10,8
Gentamicin 5,7
Amoksicilin+klavulanska kiselina 2,6
Nitrofurantoin 2,6
Netilmicin 1,1
Cefuroksim 0,8
Ceftibuten 0,5

Sve veća rezistentnost uropatogena na antibiotsko liječenje dovelo je do potrebe za istraživanjem

antimikrobnih tvari kako bi se pronašla adekvatna zamjena za antibiotike koji pokazuju sve
manju uspješnost u liječenju urinarnih infekcija.Istraživana je aktivnost bakteriocina protiv
biofilma i antibakterijsku aktivnost bakteriocina koje proizvodi Lactobacillus plantarum SJ33 na
kateterima. Bakterijske ćelije Staphylococcus aureus tretirali su bakteriocinima Lactobacillus
plantarum SJ33 te su usporedili s netretiranim stanicama (Amirta i sur 2019). Promatrajući kroz
elektronski mikroskop (Sl. 7) uočili su kako su netretirane stanice očuvane, pravilnog oblika i
odvojene jedna od druge.

Ćelije tretirane s bakteriocinima bile su deformirane sa značajnim porama na staničnoj membrani

iz kojih izlazi unutarstanični sadržaj što potvrđuje baktericidni mehanizam djelovanja
bakteriocina. (Hammami R. i sur. 2013.)

28
 Slika 7: Netretirane (A) I tretirane (B) ćelije Staphylococcus aureus bakteriocinom kojeg
sintetizira Lactobacillus plantarum SJ33 promatrane pod elektronskim mikroskopom.

Naučnici su izolirali bakteriocin DT24 kojeg proizvodi Lactobacillus brevis DT24 i ispitali
njegovu učinkovitost protiv uropatogene E. coli i ostalih uropatogena. Na temelju dobivenih
rezultata zaključili su da bakteriocin DT24 ima širok spektar djelovanja. Bakteriocin DT24
pokazao je visoka antimikrobna svojstva prema uropatogenima E. coli, S. aureus, E. faecalis i E.
faecium ali loša antimikrobna svojstva prema P. aeruginosa.

Izolirana je bakterija iz K. pneumonia iz 47 uzoraka od kojih je 16 uzoraka uzeto s katetera i 31

uzoraka iz urina. Izolati su tretirani antibioticima koji se uobičajeno koriste u liječenju urinarnih
infekcija te su svi pokazali visoku rezistentnost na antibiotike osim na antibiotik amikacin.
Djelovanje amikacina kao jedinog uspješnog antibiotika protiv K. pneumonia daljnje je
uspoređeno s djelovanjem bakteriocina enterocina kojeg sintetizira E. faecalis na K. pneumonia.

Provedeno je istraživanje u cilju izolacije Lactobacillus fermentum iz humanog mlijeka.

Utvrđena je antimikrobna aktivnost bakteriocina prema uropatogenim bakterijama:
Staphylococcus aureus, Proteus spp., Enterococcus spp., Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella spp. Uropatogene bakterije tretirane su bakteriocinom probiotičke
bakterije Lactobacillus fermentum na hranjivoj podlozi kroz 24 sata inkubacije na 37 °C nakon
čega je izmjeren inhibicijski prsten. Svi uropatogeni pokazali su osjetljivost na bakteriocin
bakterije Lactobacillus fermentum. Najveću osjetljivost prema bakteriocinu pokazali su
uropatogeni Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli i Klebsiella
spp. dok je najmanja osjetljivost prisutna kod uropatogena Enterococcus spp. i Proteus spp.
Provedeno istraživanje ukazuje da Lactobacillus fermentum izoliran iz humanog mlijeka ima
sposobnost inhibiranja uropatogena izvanstaničnim bakteriocinima koje sintetizira. Glavni cilj
probiotičkog djelovanja pri liječenju urinarnih infekcija je spriječiti nagli porast uropatogena u
urinarnom traktu dok se prirodna mikrobiota ponovno ne uspostavi. (Hammami R. i sur. 2013.)

29
4.3.2 Bakteriocini u prevenciji i liječenju mastitisa

Globalni problem današnje intenzivne proizvodnje mlijeka je mastitis, najčešća i najskuplja

bolest mliječnih životinja. Korištenje antibiotika u cilju liječenja mastitisa može dovesti do
zaostanka antibiotskih rezidua u organizmu tretiranih krava ili prolaska antibiotika u sirovo
mlijeko kroz mliječnu žlijezdu i krv.

Rezidualni antibiotici osim što su opasni za ljudsko zdravlje, mogu uzrokovati probleme u
preradi mlijeka u fermentiranju mliječnih proizvoda poput jogurta, sira i sladoleda. Upravo se iz
tog razloga kao i zbog pojave otpornosti bakterija na antibiotike javila potreba za otkrivanjem
alternativnih metoda u prevenciji i liječenju mastitisa. Tako Nascimento i sur. (2004.) kao jednu
od potencijalnih alternativnih antimikrobnih tvari navode korištenje bakteriocina.(sl.8)

Sve više se počelo koristiti germicidne formulacije za sprječavanje mastitisa kod mliječne stoke.
Sredstva za sanitaciju sisa se rutinski koriste prije i poslije mužnje krava kako bi se spriječio
prodor patogena u sisni kanal, uzročnika intramamarnih infekcija( Sears i sur,1992). U studiji su
uspoređivali formulaciju na bazi nizina (Ambicin N®) s konvencionalnim hemijskim tretmanima
kao što su jodofor i kloroheksidin.

Inicijalni podatci pokazali su znatno smanjenje patogena na površini tretiranog dijela sisa nakon
jedne minute izlaganja germicidnoj formulaciji (tab. 3). Pored toga, germicidna je formulacija
pokazala mali potencijal za iritaciju kože sisa nakon ponavljanog izlaganja u usporedbi s 1%-
tnim jodoforom i 5%-tnim kloroheksidin diglukonatom. (Hammami R. i sur. 2013.)

Slika 8 : Primjena antibiotika u veterini

30
 Tabela 3: Podaci performansa za germicidno sredstvo za sanitaciju sisa na bazi nizina

Bakterije uzročnici mastitisa Redukcija korištenjem Ambicin N

S.aureus 61,8 %

S.agalactiae 98,6 %

E.coli 85,5 %

S.uberis 67,1 %

K.pneumonia 76,5 %

4.3.3 Antikancerogeno djelovanje bakteriocina

Nekoliko bakteriocina pokazalo je djelovanje protiv raka i to selektivnim djelovanjem na ćelije

raka. Bakteriocini koje proizvode gram-negativne bakterije, npr kao mikrocin E492 (Lagos i sur.
2009.) i kolicini (A, D, E1, E2, E3) ili gram pozitivne bakterije, uključujući nizin pokazali su
citotoksične učinke protiv malignih ljudskih ćelijskih linija. Citotoksičnost bakteriocina protiv
ćelija raka uzrokovana je indukcijom apoptoze i/ili depolarizacijom ćelijske membrane koja
dovodi do promjena permeabilnosti (Kaur i Kaur 2015).

Na primjer, istraživanja su pokazala da u ćelijama karcinoma skvamoznih stanica glave i vrata,

nizin inducira povećanu fragmentaciju DNA ili apoptozu i smanjena proliferacija ćelija
indukcijom zaustavljanja ćelijskog ciklusa u kancerogenim ćelijama (sl.9). Osim toga, primjena
nizina smanjila je veličinu tumora kod miševa s oralnim karcinomom.

U drugom slučaju, azurin, bakteriocin koji se proizvodi sojem P. aeruginosa, proučavan je kao
potencijalni lijek protiv raka zbog njegovog selektivnog vezanja na ljudske ćelije raka, i
rezultirajući citotoksični i apoptotički učinak, bez uticaja na normalne ćelije(Yamada i sur.
2004).

Važno je napomenuti da se većina studija koje se odnose na antikancerogena svojstva

bakteriocina bile su provedena u in vitro uslovima i stoga postoji potreba za in vivo validaciju.

31
 Slika 9 : Apoptoza

4.3.4 Potencijalna kontraceptivna svojstva bakteriocina

Nisin, subtilosin, fermenticin (Kaur i sur. 2013.) i lakticin 3147 pokazalo se da pokazuju
spermicidno svojstvo uzrokujući smanjenje ili promjenu pokretljivosti ljudskih spermatozoida,
dakle ističući njihov potencijal kao kontracepcijskih sredstava za kontrolu rađanja (Dicks et al.
2018).

U provedenoj studiji, intravaginalna primjena nizina u kunića tokom dvije sedmice spriječila je
začeće bez izazivanja upale ili oštećenja vaginalnog epitela. Međutim, ako su koncentracije
nizina korištene u testovima kontrole rađanja pomoću životinjskih modela ekstrapolirano za
ljudsku upotrebu, vjerojatno bi uključeni nivoi ozbiljno uticali na zdravu ljudsku vaginalnu
mikrobiotu (Dicks et al. 2018) i stoga se ovaj faktor mora uzeti u obzir pri daljnjem razvoju
bakteriocina, posebno bakteriocina širokog spektra, kao potencijalnog sredstva za kontrolu
rađanja.

32
4.3.5 Antilisterijski efekat bakteriocina

Listeria monocytogenes je Gram-pozitivna bakterija, štapićastog oblika, raste u aerobnim ili

fakultativno anaerobnim uslovima. Ima sposobnost da raste na niskim temperaturama (4°C),
toleriše niske pH vrijednost (<5.0) i visoke koncetracije NaCl (do 10%), ona se može naći u
različitim sredinama i njena kontrola je jako teška (Farber i Peterkin, 1991).

Pripada grupi patogenih bakterija koja napada imunokompromitovane osobe, djecu, stare i
trudnice. Izaziva akutnu bolest, listeriozu, jednu od najtežih bolesti zastupljenih u industrijski
razvijenim zemljama (Schlech, 2000) sa smrtnim ishodom u preko 20-25% slučajeva. S obzirom
na sveprisutnost L. monocytogenes, u mnogim zemljama Evropske Unije (EU), u posljednjih 15
godina je zabilježen veliki broj slučajeva listerioze (Tab. 4)

Tabela 4: Godišnji izvještaji zabilježenih slučajeva listerioze u zemljama EU

Zemlja 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Belgija 4,7 5,6 4,3 7,3 8,6 5,9 6,4
Danska 7,5 7,1 5,2 5,4 7,6 8,5 10,3
Vels 1,9 2,8 2,6 4,5 4,0 3,5 3,5
Finska 3,5 5,4 3,8 7,9 6,7 6,8 8,5
Njemačka 2,6 2,9 3,1 3,6 6,2 6,2
Holandija 2 3 3 5,6 3,9
Švedska 5,9 7,5 4,4 5,3 4,7 4,4 4,6
Švicarska 5,1 3,8 6,1 7,8 9,8 9,1

Najveći rizik predstavlja u gotovim mliječnim prozivodima, proizvedeni od nepasterizovanog ili

pasterizovanog mlijeka, zatim u gotovim ribljim proizvodima i sirovom voću i povrću (EFSA,
2013; Ferreira et al., 2014). Najčešći način kontaminacije gotovih proizvoda dešava se
kolonizacijom perzistentnih sojeva L. monocytogenes, koji imaju sposobnost preživljavanja
čišćenja i dezinfekcije pogona u kojima se izvodi proizvodnja (Lomonaco et al., 2009).

Generalno, perzistencija je definisana kao sposobnost ćelija da opstanu u nepovoljnim uslovima

sredine usljed promjene u metabolizmu, do koje dolazi usljed stohastičkih promena u profilu
genske ekspresije.

Perzistentni sojevi L. monocytogenes, detektovani su, kako u malim, tako i velikim pogonima za
proizvodnju mlečnih proizvoda, zatim u pogonima za proizvodnju lososa i u pogonima za
proizvodnju mesa takođe i u pogonima za proizvodnju živinskog mesa (Farber i Peterkin, 1991).

33
Generalno, mliječni proizvodi predstavljaju veoma pogodnu sredinu za rast i razmnožavanje L.
monocytogenes. Najčešće se može naći na površini sireva sa dugim zrenjem, kod kojih se na
površini pH vrednost povećava tokom zrenja, što pruža mnogo povoljnije uslove za rast L.
moncytogenes. Pored ovih sireva, L. Monocytogenes je detektovana u sirevima tipa „cottage“,
mekim sirevima, zatim kamemberu (Back et al., 1993).

Zbog ovih karakteristika L. monocytogenes, usljed obima proizvodnje, industrija mlijeka, kao i
ostatak prehrambene industrije, se susreće sa stalnim problemima. Iz tog razloga, porasla je
potreba za ispitivanjem novih načina za kontrolu L. Monocytogenes u gotovom proizvodu. Jedan
od načina, koji se u poslednjih deset godina izuzetno ispituje, je korišćenje bakteriocin
proizvođača BMK kao starter kultura ili korišćenje samog izolovanog i prešišćenog bakteriocina
u kontroli L. monocytogenes.

Prilikom kontole L. monocytogenes, korišćenjem BMK, nizin proizvođača, u proizvodnji

„cottage sira“, dobijen je bakteriostatički efekat (Dal Bello et al., 2012), dok je u proizvodnji
kamembera dobijen bakteriocidni efekat u prvih nedelju dana zrenja, a nakon toga nije više
uticao na rast L. monocytogenes (Farber i Peterkin, 1991).

Mnogo bolji rezultati kontrole L. monocytogenes u siru, dobijeni su prilikom kombinacije nizina
sa još jednim bakteriocinom zatim kombinacijom nizina i organske kiselina, ili kombinacijom
visokog pritiska i nizina (Arques et al., 2005). Pored nizina, kao biokonzervansi hrane u kontroli
L. monocytogenes, ispitivani su i mnogi drugi bakteriocini, ali se izdvajaju pediocin AcH/PA-1 i
lakticin 3147, koji su pokazali najbolje rezultate.

I pored intezivnog izučavanja bakteriocina kao biokonzervansa hrane, samo se nizin i pediocin
AcH/PA1 koriste komercijalno kao prirodni konzervansi hrane u preko 50 zemalja širom svijeta.
Razlozi za to su različiti, a neki od njih su relativno uski spektri djelovanja mnogih bakteriocina
ili stalne promjene zakonskih regulativa za korišćenje dodataka u prehrambenoj industriji. Pored
toga, potencijalni problem predstavlja brza adaptacija patogenih bakterija na bakteriocine koji se
dodaju.

34
ZAKLJUČAK

Bakteriocini imaju svojstva zbog kojih se mogu koristiti u širokom rasponu prehrambenih i
medicinskih primjena. Dakle, sigurnost bakteriocina zahtijeva mnogo pažnje. Antimikrobno
djelovanje bakteriocina je naširoko proučavan fenomen; međutim, postoji nedostatak dostupnih
in vitro i in vivo podataka o sigurnosti i toksičnosti bakteriocina.

Zapravo, u tu svrhu potrebno je provesti različita ispitivanja kako bi se procijenila njihova

citotoksičnost u eukariotskim stanicama, sposobnost induciranja apoptoze. inhibitorni učinak,
hemolitička aktivnost, akutna i subkronična toksičnost itd.

Odobrenje zdravstvenih agencija za primjenu bakteriocina u prehrambenoj industriji, stočarstvu

te farmaciji je dugotrajan proces koji uključuje dodatna klinička ispitivanja .

Propisi koje je predložila FDA treba strogo slijediti kako bi se postiglo zakonsko odobrenje
bakteriocina kao sigurnih i pouzdanih konzervanasa za hranu ili terapeutskih agenasa.

35
Literatura

1. Baquero F, Moreno F. The microcins. FEMS Microbiology Letter 1984;23:117–24

2. Cotter, P. D., Ross, R. P., & Hill, C. Bacteriocins — a viable alternative to

antibiotics? Nature Reviews Microbiology, 11(2), (2013).95-105.

3. Klaenhammer TR. Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie 1988;70:337–49

4. Silva C. C. G., Silva S. P. M., Ribeiro S. C. (2018). Application of Bacteriocins and

Protective Cultures in Dairy Food Preservation. Frontiers in Microbiology. (2018). 9(594): 1-
15.

5. McAuliffe O., Ross R. P., Hill C. (2001). Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of
action. FEMS Microbiology Reviews. 25: 285-308.

6. Paiva A. D., Breukink E. (2013). Antimicrobial Peptides Produced by Microorganisms. U:

Antimicrobial Peptides and Innate Immunity (Hiemstra S., Zaat S. A. J., Ur.). Springer,
Switzerland. 53-95.

7. Bastos M. C. F., Coelho M. L. V., Santos O. C. S. (2015). Resistance to bacteriocins

produced by Gram-positive bacteria. Microbiology. 161: 683-700.

8. Rea M. C., Dobson A., O’Sullivan O., Crispie F., Fouhy F., Cotter P. D., Shanahan F.,
Kiely B., Hill C., Ross R. P. (2011). Effect of broad- and narrow-spectrum antimicrobials on
Clostridium difficile and microbial diversity in a model of the distal colon. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America. 108(1): 4639-4644.

9. Maqueda, M., Sanchez-Hidalgo, M., Fernandez, M., Montalban-Lopez, M., Valdivia, E.,
Martinez-Bueno, M. (2008): Genetic features of circular bacteriocins produced by Gram-
positive bacteria FEMS Microbiology Reviews 32:2–22.

10. Arqués J. L., Rodríguez E., Langa S., Landete J. M., Margarita Medina M. (2015).
Antimicrobial Activity of Lactic Acid Bacteria in Dairy Products and Gut: Effect on pathogens.
BioMed Research International

11. Hammami R, Fernandez B, Lacroix C et al. (2013). Anti-infective properties of

bacteriocins: an update. Cell Mol Life Sci ;70: 2947–67.

12. Kaur S, Kaur S. 2015. Bacteriocins as potential anticancer agents. Front Pharmacol 6:272

36
13. Yamada T, Hiraoka Y, Ikehata M et al. 2004. Apoptosis or growth arrest: modulation of
tumor suppressor p53’s specificity by bacterial redox protein azurin. Proc Natl Acad Sci
USA;101:4770–5.

14. Farber, J.M., Peterkin, P.I. (1991): Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen.
Microbiological Reviews 55: 476-511.

37