Seminarski rad

Mikrobologija s parazitologijom

MIKROBNI ANTAGONIZAM I ODREĐIVANJE

OSJETLJIVOSTI MIKROBA NA ANTIMIKROBNE
SPOJEVE

Ana Schneider,
Valerija Vuga,
Marija Boc, studentice 1.godine izvanrednog preddiplomskog studija
sestrinstvo

1.Uvod
Posljednjih godina raste interes za istraživanje i razvoj novih
antimikrobnih sredstava iz različitih izvora za borbu protiv otpornosti
mikroba. Stoga je sve veća pažnja posvećena metodama probira i
evaluacije antimikrobne aktivnosti. Nekoliko bioloških testova kao što su
difuzija diskom, difuzija u jažici i razrjeđivanje bujonom ili agarom
dobro su poznati i često se koriste, ali drugi kao što su protočne
citofluorometrijske i bioluminiscentne metode nisu naširoko korišteni jer
zahtijevaju posebnu opremu i daljnju procjenu ponovljivosti i
standardizacije, čak i ako mogu pružiti brze rezultate učinaka
antimikrobnih sredstava i bolje razumijevanje njihovog utjecaja na
vitalnost i oštećenja stanica nanesena testiranom mikroorganizmu. U
ovom seminaru obraduje se metoda testiranja antimikrobne osjetljivosti i
detaljne informacije o njihovim prednostima i ograničenjima.

Ključne riječi: Tankoslojna kromatografija (TLC)–bioautografija, Time-

kill test, Metoda antimikrobnog gradijenta, Metoda difuzije u agaru

1.2. Razradba
Nakon revolucije u “zlatnoj eri”, kada su otkrivene gotovo sve grupe
važnih antibiotika (tetraciklini, cefalosporini, aminoglikozidi i makrolidi)
i kada su glavni problemi kemoterapije riješeni šezdesetih godina
prošlog stoljeća, povijest se danas ponavlja i ovi uzbudljivi spojevi su u
opasnosti od gubitka učinkovitosti zbog porasta rezistencije mikroba.
Trenutačno je njegov utjecaj značajan zbog neuspjeha liječenja povezanih
s bakterijama rezistentnim na više lijekova. Iz tog razloga, otkriće novih
antibiotika je isključivo važan cilj. Prirodni proizvodi i danas su jedan od
glavnih izvora novih vrsta lijekova. Potječu iz prokariotskih bakterija,
eukariotskih mikroorganizama, biljaka i raznih životinjskih organizama.
Mikrobni i biljni proizvodi zauzimaju najveći dio do sada otkrivenih
antimikrobnih spojeva. Biljke i drugi prirodni izvori mogu osigurati
širok raspon složenih i strukturno raznolikih spojeva. Nedavno su se
mnogi istraživači usredotočili na istraživanje biljnih i mikrobnih
ekstrakata, eteričnih ulja, čistih sekundarnih metabolita i novih
sintetiziranih molekula kao potencijalnih antimikrobnih sredstava.
Međutim, kada smo pregledali objavljene članke o antimikrobnom
učinku ovih prirodnih proizvoda, usporedba između rezultata često je
teška.
2. Procjena antimikrobne aktivnosti
Za procjenu ili provjeru in vitro antimikrobne aktivnosti ekstrakta ili
čistog spoja mogu se koristiti različite laboratorijske metode.
Najpoznatije i osnovne metode su difuzija diskom i metode razrjeđivanja
bujonom ili agarom. Druge metode se koriste posebno za antifungalna
ispitivanja. Za daljnje dubinsko proučavanje antimikrobnog učinka
agensa, preporučuju se time-kill test i metode protočne citofluorometrije,
koje daju informacije o prirodi inhibitornog učinka (baktericidnog ili
bakteriostatskog) (ovisnog o vremenu ili koncentraciji) i stanici oštećenje
naneseno ispitivanom mikroorganizmu. Zbog nove privlačnosti
svojstava novih antimikrobnih proizvoda kao što je suzbijanje bakterija
otpornih na više lijekova, važno je razviti bolje razumijevanje trenutačno
dostupnih metoda za probir i/ili kvantificiranje antimikrobnog učinka
ekstrakta ili čistog spoja za njegovu primjene u ljudskom zdravlju,
poljoprivredi i okolišu. Stoga su u ovom pregledu detaljno razmotrene
tehnike za procjenu in vitro antimikrobne aktivnosti.

3. Agar
Ispitivanje difuzijom diska u agaru razvijeno 1940. godine i službena je
metoda koja se koristi u mnogim kliničkim mikrobiološkim
laboratorijima za rutinsko testiranje osjetljivosti na antimikrobne tvari.
Danas Institut za kliničke i laboratorijske standarde objavljuje mnoge
prihvaćene i odobrene standarde za ispitivanje bakterija i kvasaca. Iako
se sve izbirljive bakterije ne mogu točno testirati ovom metodom,
standardizacija je napravljena za testiranje određenih izbirljivih
bakterijskih patogena kao što su streptokoki, Haemophilus influenzae,
Haemophilus parainfluenzae, Neisseria gonorrhoeae i Neisseria
meningitidis. U ovom postupku, agar ploče se inokuliraju
standardiziranim inokulumom ispitivanog mikroorganizma. Zatim se
diskovi filter papira (promjera oko 6 mm) stave na površinu agara.
Petrijeve zdjelice se inkubiraju pod odgovarajućim uvjetima. Općenito,
antimikrobno sredstvo difundira u agar i inhibira klijanje i rast
ispitivanog mikroorganizma, a zatim se mjere promjeri zona inhibicije
rasta. Rezistencije testiranog mikrobnog soja, njegovi rezultati također
vode kliničare u odgovarajućem odabiru početnih empirijskih tretmana i
antibiotika koji se koriste za pojedinačne pacijente u određenim
situacijama. Štoviše, metoda difuzije na agar disku nije prikladna za
određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC), budući da je
nemoguće kvantificirati količinu antimikrobnog sredstva difundiranog u
agar medij. Ipak, može se izračunati približni MIC za neke
mikroorganizme i antibiotike usporedbom zona inhibicije s pohranjenim
algoritmima.

4. Disk-difuzijski test
Unatoč tome, disk-difuzijski test nudi mnoge prednosti u odnosu na
druge metode: jednostavnost, nisku cijenu, mogućnost testiranja
ogromnog broja mikroorganizama i antimikrobnih sredstava. Štoviše,
nekoliko studija pokazalo je veliki interes kod pacijenata koji boluju od
bakterijske infekcije za antibioterapiju temeljenu na antibiogramu
uzročnika. Ta je činjenica posljedica dobre korelacije između in vitro
podataka i in vivo evolucije. Prije standardizacije, metoda disk-difuzije
već je korištena za testiranje posakonazola na filamentozne gljive i
mikafungina. Trenutno se koristi standardizirani antifungalni disk-
difuzijski pristup za testiranje nedermatofitnih filamentoznih gljiva.
Gore navedene prednosti ove metode, uglavnom jednostavnost i niska
cijena, pridonijele su njezinoj uobičajenoj upotrebi za antimikrobni
pregled biljnih ekstrakata, eteričnih ulja i drugih lijekova. Nekoliko
prethodnih studija pokazalo je dobru korelaciju između vrijednosti MIC-
a određenih Etestom i onih dobivenih metodom razrjeđivanja bujonom
ili metodom razrjeđivanja agara. Ova se tehnika također može provesti
za istraživanje antimikrobne interakcije između dvaju lijekova. Za
proučavanje kombiniranog učinka dvaju antibiotika, Etest traka,
impregnirana prvim antibiotikom, stavlja se na prethodno inokuliranu
površinu agar ploče. Nakon jednog sata, traka se uklanja i zamjenjuje
drugom natopljenom drugim antibiotikom. Sinergija se otkriva
smanjenjem MIK kombinacije za najmanje dva razrjeđenja u usporedbi s
onom najaktivnijeg antibiotika testiranog pojedinačno. Također za istu
svrhu, trake Etest mogu se položiti na agar medij u obliku križa pod
kutom od 90° na sjecištu između ljuskica na odgovarajućim MIC-ovima
za testirani mikroorganizam. Zatim, nakon inkubacije, indeks frakcijske
inhibitorne koncentracije (FICI) može se izračunati pomoću sljedeće
formule:
∑ FICI = FIC(A) + FIC(B)

Daljnje difuzijske metode koriste se u mikrobiološkim istraživačkim

laboratorijima za ispitivanje ekstrakata, frakcija ili čistih tvari na njihovu
antimikrobnu moć ili za istraživanje antagonizma između
mikroorganizama.

5.Difuzija u jažici
Metoda difuzije u jažici u agaru široko se koristi za procjenu
antimikrobne aktivnosti biljaka ili mikrobnih ekstrakata. Slično postupku
koji se koristi u metodi disk-difuzije, površina ploče agara inokulira se
širenjem količine mikrobnog inokuluma po cijeloj površini agara. Zatim
se aseptično sterilnom bušilicom ili vrhom probuši rupa promjera 6 do 8
mm i u jažicu se unese volumen antimikrobnog sredstva ili otopine
ekstrakta željene koncentracije. Zatim se ploče s agarom inkubiraju pod
odgovarajućim uvjetima ovisno o ispitivanom mikroorganizmu.
Antimikrobno sredstvo difundira u agar mediju i inhibira rast testiranog
mikrobnog soja.

6. Metoda difuzije u agar čepu

Metoda difuzije u agar čepu često se koristi za isticanje antagonizma
između mikroorganizama, a postupak je sličan onome koji se koristi u
metodi difuzije diskom. Uključuje stvaranje agar kulture soja na
odgovarajućem mediju za kulturu uskim crtama na površini ploče.
Mikrobne stanice tijekom svog rasta izlučuju molekule koje difundiraju u
agar mediju. Nakon inkubacije, agar-ploča ili cilindar aseptično se izreže
sterilnom bušilicom za pluto i odloži na površinu agara druge ploče
prethodno inokulirane ispitivanim mikroorganizmom. Tvari difundiraju
iz čepa u agar medij. Zatim se otkriva antimikrobna aktivnost mikrobno
izlučenih molekula pojavom zone inhibicije oko agar čepa.
7. Cross streak metoda
Cross streak metoda Cross streak metoda se koristi za brzi pregled
mikroorganizama na antagonizam. Mikrobni soj od interesa zasijan je
jednom crtom u središtu agar ploče. Nakon razdoblja inkubacije ovisno o
mikrobnom soju, na pločicu se nasaju testirani mikroorganizmi jednom
crtom okomito na središnju crtu. Nakon daljnje inkubacije, antimikrobne
interakcije se analiziraju promatranjem veličine zone inhibicije.

8.Metoda otrovane hrane

Metoda otrovane hrane uglavnom se koristi za procjenu protugljivičnog
učinka protiv plijesni. Antifungalno sredstvo ili ekstrakt se ugradi u
rastaljeni agar u željenoj konačnoj koncentraciji i dobro promiješa. Zatim
se medij izlije u Petrijeve zdjelice. Nakon prethodne inkubacije preko
noći, inokulacija se može obaviti diskom micelija veličine od 2 do 5 mm,
koji se postavlja u središte ploče. Nakon daljnje inkubacije pod
odgovarajućim uvjetima za testirani soj gljivica, mjere se promjeri rasta
gljivica u kontrolnim pločama i pločama s uzorcima, a protugljivični
učinak procjenjuje se sljedećom formulom:
Antifungal activity (%) = ((Dc−Ds)/Dc) × 100

9. Agar difuzija
Također poznata kao metoda kontakta s agarom, to je tehnika koja se
najmanje koristi. Uključuje prijenos difuzijom antimikrobnog agensa s
kromatograma na agar ploču prethodno inokuliranu testiranim
mikroorganizmom. Nakon nekoliko minuta ili sati kako bi se omogućila
difuzija, kromatogram se uklanja i agar ploča se inkubira. Zone inhibicije
rasta pojavljuju se na mjestima gdje antimikrobni spojevi dolaze u
kontakt sa slojem agara. Izravna bioautografija je najprimjenjivanija
metoda među ove tri metode. Razvijena TLC ploča se uranja u mikrobnu
suspenziju ili se raspršuje njome. Zatim se bioautogram inkubira na 25
°C tijekom 48 sati u vlažnim uvjetima. Za vizualizaciju rasta mikroba
često se koriste tetrazolijeve soli. Ove soli podvrgavaju se pretvorbi u
odgovarajući intenzivno obojeni formazan pomoću dehidrogenaza živih
stanica. P-Iodonitrotetrazolium violet je najprikladniji reagens za
detekciju. Te se soli raspršuju na bioautogram koji se ponovno inkubira
na 25 °C tijekom 24 sata ili na 37 °C tijekom 3-4 sata. Mueller Hinton
bujon s dodatkom agara preporučuje se da podlozi dobije dovoljno
tekućine da omogući najbolje prianjanje na TLC ploču i održava
odgovarajuću vlažnost za rast bakterija.

10. Bioautoografija
Izravna bioautoografija može se koristiti s gljivicama ili bakterijama. To
je najlakša tehnika za detekciju antifungalnih tvari, a također daje
dosljedne rezultate za gljivice koje proizvode spore kao što su
Aspergillus, Penicillium i Cladosporium. Za bakterije, sojevi Bacillus
subtilis, Staphylococcus aureus i Escherichia coli često se koriste za
identifikaciju antibakterijskih spojeva. Također poznata kao imerzijska
bioautoografija, hibrid je obje prethodne metode. TLC ploča je
prekrivena rastaljenim zasijanim agar medijem. Kako bi se omogućila
dobra difuzija testiranih spojeva u agar medij, ploče se mogu staviti na
nisku temperaturu nekoliko sati prije inkubacije. Nakon inkubacije pod
odgovarajućim uvjetima, ovisno o ispitivanom mikroorganizmu, može
se izvršiti bojanje tetrazolijevom bojom. Kao i izravna bioautoografija,
ova se metoda može primijeniti na sve mikroorganizme. Sve u svemu,
TLC-bioautografija je jednostavna, učinkovita i jeftina tehnika za
razdvajanje složene smjese, au isto vrijeme lokalizira aktivne sastojke na
TLC ploči. Stoga se može izvoditi iu sofisticiranim laboratorijima iu
malim laboratorijima koji imaju pristup samo minimalnoj opremi. Iako
ima sofisticiranu on-line tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti
povezanu bioanalizu, koja postaje sve popularnija kao metoda izbora za
konačno čišćenje ekstrakcijskih frakcija za dobivanje čistih spojeva, TLC-
bioautoografija nudi brzu tehniku za probir velik broj uzoraka za
bioaktivnost i u frakcioniranju prema bioaktivnosti. Može se koristiti za
detekciju antimikrobnih sredstava u uzorcima okoliša i hrane, kao i za
traženje novih antimikrobnih lijekova. Metode razrjeđivanja
najprikladnije su za određivanje MIK vrijednosti jer daju mogućnost
procjene koncentracije ispitivanog antimikrobnog sredstva u agaru ili
bujon mediju. Za kvantitativno mjerenje in vitro antimikrobne aktivnosti
protiv bakterija i gljivica može se koristiti metoda razrjeđivanja bujona ili
agara. Zabilježena vrijednost MIC definirana je kao najniža koncentracija
ispitivanog antimikrobnog sredstva koja inhibira vidljivi rast testiranog
mikroorganizma. Postoje mnoge odobrene smjernice za ispitivanje
osjetljivosti na antimikrobna sredstva razrjeđivanja izbirljivih i
neizbirljivih bakterija, kvasaca i filamentoznih gljivica. Najpriznatije
standarde daju CLSI i Europsko povjerenstvo za ispitivanje osjetljivosti
na antimikrobne lijekove (EUCAST). Kao što je savjetovano, ove
smjernice pružaju jedinstveni postupak za testiranje koji je praktičan za
izvođenje u većini kliničkih mikrobioloških laboratorija. Razvoj takvih
metodoloških standarda ne jamči kliničku važnost takvog testiranja.
Unatoč tome, omogućuje provođenje biološke analize u
standardiziranom pristupu kako bi se procijenila klinička važnost
rezultata.

11. Metoda razrjeđivanja bujona

Mikro- ili makro-razrjeđivanje bujona jedna je od najosnovnijih metoda
testiranja osjetljivosti na antimikrobne lijekove. Postupak uključuje
pripremu dvostrukih razrjeđenja antimikrobnog agensa u tekućem
mediju za rast koji se raspoređuje u epruvete koje sadrže minimalni
volumen od 2 ml ili s manjim volumena pomoću mikrotitracijske ploče s
96 jažica (mikrodilucija). Zatim se svaka epruveta ili jažica inokulira
mikrobnim inokulumom pripremljenim u istom mediju nakon
razrjeđivanja standardizirane mikrobne suspenzije podešene na 0,5
McFarlandove skale. Nakon dobrog miješanja, inokulirane epruvete ili
mikrotitracijska ploča s 96 jažica se inkubiraju.

12. Kondidija i gljivice

Što se tiče konidija i gljivica koje stvaraju spore, mikrodilucija
standardizirana pomoću CLSI uključuje inokulum spora podešen
spektrofotometrijski na. Međutim, u EUCAST testu, inokulum se može
podesiti brojanjem hemocitometrom. Brojne studije pokazale su važnost
pripreme inokuluma brojanjem hemocitometra za ponovljivu i prikladnu
pripremu neovisno o boji i veličini konidija. Određivanje minimalne
baktericidne koncentracije (MBC) ili minimalne fungicidne koncentracije
(MFC), također poznate kao minimalna letalna koncentracija (MLC),
najčešća je procjena baktericidne ili fungicidne aktivnosti. MBC se
definira kao najniža koncentracija antimikrobnog agensa potrebna za
ubijanje 99,9% konačnog inokuluma nakon inkubacije od 24 sata pod
standardiziranim skupom uvjeta, u kojem se MBC može odrediti nakon
bujona makrodilucija ili mikrodilucija potkulturom uzorka iz jažica ili
epruveta, dajući negativan rast mikroba nakon inkubacije na površini
neselektivnih ploča s agarom kako bi se odredio broj preživjelih stanica
nakon 24 sata inkubacije. Baktericidna krajnja točka (MBC) je subjektivno
definirana kao najniža koncentracija, pri kojoj je ubijeno 99,9% konačnog
inokuluma. MFC se također definira kao najniža koncentracija lijeka koja
daje 98%-99,9% učinka ubijanja u usporedbi s početnim inokulumom.
Provedeno je nekoliko studija za procjenu različitih parametara
ispitivanja za određivanje MFC-a različitih lijekova protiv izolata
Candide, Aspergillus i drugih plijesnić.

13. Metoda razrjeđivanja agara

Metoda razrjeđivanja agara uključuje ugradnju različitih željenih
koncentracija antimikrobnog agensa u agar medij, uobičajeno
korištenjem serijskih dvostrukih razrjeđenja, nakon čega slijedi
inokulacija definiranog mikrobnog inokuluma na površinu ploče agara.
MIC krajnja točka bilježi se kao najniža koncentracija antimikrobnog
sredstva koja potpuno inhibira rast u odgovarajućim uvjetima
inkubacije. Ova je tehnika prikladna i za testiranje osjetljivosti na
antibakterijska i antifungalna sredstva. Ako se višestruki izolati testiraju
u odnosu na jedan spoj ili ako testirani spoj svojim bojanjem maskira
otkrivanje rasta mikroba u tekućem mediju, metoda razrjeđivanja
agarom često se preferira nego razrjeđivanje bujona za određivanje MIK-
a. Danas su dostupni komercijalno proizvedeni replikatori inokuluma
koji mogu prenijeti između 32 i 60 različitih bakterijskih inokula na
svaku agar ploču. Razrjeđivanje agara često se preporučuje kao
standardizirana metoda za izbirljive organizme. Ova metoda predstavlja
dobru korelaciju s Etestom uglavnom za antibakterijsko testiranje protiv
gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija. Štoviše, usporedbe
kategorija metoda razrjeđivanja agara, difuzije diskom i
mikrorazrjeđivanja bujona daju izvrsne rezultate.
Time-kill test je najprikladnija metoda za određivanje baktericidnog ili
fungicidnog učinka. To je snažan alat za dobivanje informacija o
dinamičkoj interakciji između antimikrobnog sredstva i mikrobnog soja.
Time-kill test otkriva vremenski ovisan ili koncentracijski ovisan
antimikrobni učinak.

14. Atp test

ATP bioluminiscencijski test temelji se na sposobnosti mjerenja adenozin
trifosfata (ATP) kojeg proizvode bakterije ili gljivice. Kako je ATP
kemijski oblik energije svih živih stanica, prisutan je u stanici u više-
manje konstantnoj količini. Stoga se njegova kvantifikacija koristi za
procjenu mikrobne populacije u uzorku. D-luciferin u prisutnosti ATP-a
prolazi kroz konverziju pomoću luciferaze u oksiluciferin koji stvara
svjetlost. Količina emitirane svjetlosti mjeri se luminometrom i izražava
kao relativna svjetlosna jedinica (RLU).

15. Protočna citofluorometrijska metoda

Prije nekoliko godina predložena je korisnost protočne citometrije za
ispitivanje osjetljivosti mikroorganizama. Stoga su mnogi autori
istraživali antibakterijsko i antifungalno djelovanje mnogih lijekova
koristeći ovu metodologiju. Brzo otkrivanje oštećenih stanica ovim
pristupom ovisi o upotrebi odgovarajućeg bojenja bojama. Stoga se
propidijev jodid (PI), fluorescentno i interkalirajuće sredstvo, naširoko
koristi kao DNK boja. Zabilježeno je nekoliko studija o učinkovitosti
protočnog citometra kao alata za antibakterijsko testiranje eteričnih ulja
protiv Listeria monocytogenes, koristeći kombinirano bojenje s PI za
procjenu oštećenja membrane i karboksifluorescein diacetatom (cFDA)
za otkrivanje aktivnosti esteraza. Posljedično, uz lizirane stanice, tri
subpopulacije (mrtve, održive i ozlijeđene stanice) mogu se jasno
razlikovati ovom metodom. Oštećene stanice opisuju se kao stanice koje
pokazuju oštećenja staničnih komponenti i naknadno oštećenje
reproduktivnog rasta. Kvantifikacija ozlijeđenih stanica ima zanimljiv
ishod u mikrobiologiji hrane, budući da bi ova subpopulacija mogla biti
kritična ako oporavak stanica postane moguć, kao što su uvjeti
zlouporabe temperature tijekom skladištenja hrane. Doista, protočna
citofluorometrijska metoda omogućuje otkrivanje antimikrobne
rezistencije i procjenjuje utjecaj testirane molekule na vitalnost i oštećenje
stanica testiranog mikroorganizma. Štoviše, brzo daje ponovljive
rezultate (2-6 sati u usporedbi s 24-72 sata za metodu mikrodilucije).
Međutim, široka uporaba ove metodologije za testiranje osjetljivosti na
antimikrobne lijekove trenutno se čini malo vjerojatnom zbog
nedostupnosti potrebne opreme za protočnu citometriju u različitim
laboratorijima. Trenutno su mikrobne infekcije postale važna klinička
prijetnja, sa značajnim povezanim morbiditetom i mortalitetom koji je
uglavnom posljedica razvoja mikrobne rezistencije na postojeće
antimikrobne agense. Stoga se metode za testiranje senzibilnosti na
antimikrobne lijekove i otkrivanje novih antimikrobnih sredstava
intenzivno koriste i nastavljaju se razvijati. Neke su tehnike podvrgnute
standardizaciji CLSI i EUCAST-a, što je označilo velike značajne korake
na ovom polju. Međutim, kod testiranja prirodnih proizvoda često se
traže neke izmjene standardiziranih protokola. Stoga je imperativ paziti
da se ne mijenjaju osnove mikrobiologije razrjeđivanjem medija kulture i
korištenjem visoko koncentriranog inokuluma. Štoviše, ako uzmemo u
obzir korištenje otapala koja mogu utjecati na rast testiranog
mikroorganizma, možemo reći da manje metodološke prilagodbe
standardiziranih protokola mogu biti rješenje.

16. Literatura

1. Mayers D.L., Lerner S.A., Ouelette M. vol. 2. Springer Dordrecht

Heidelberg; London: 2009. (Antimicrobial Drug Resistance C: Clinical
and Epidemiological Aspects). pp. 681–1347. [Google Scholar]
2. Guschin A., Ryzhikh P., Rumyantseva T. Treatment efficacy, treatment
failures and selection of macrolide resistance in patients with high load
of Mycoplasma genitalium during treatment of male urethritis with
Josamycin. BMC Infect. Dis. 2015;15:1–7. [PMC free
article] [PubMed] [Google Scholar]
3. Martin I., Sawatzky P., Liu G. Antimicrobial resistance to Neisseria
gonorrhoeae in Canada: 2009–2013. Can. Commun. Dis. Rep. 2015.
4. Berdy J. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot. 2005;58:1–
26. [PubMed] [Google Scholar].