Potvrdni testovi- ZA NAUCITI

Identifikacija vrste S. aureus temelji se uglavnom na dokazu katalaze, koagulaze i DNA-aze, a postoje i
komercijalni lateks-aglutinacijski testovi koji se temelje na dokazivanju specifičnih antigena bakterije
S. aureus (npr. protein A). Meticilinska rezistencija vrste S. aureus može se dokazati testiranjem
osjetljivosti na cefoksitin ili dokazom prisutnosti gena mecA odgovornog za meticilinsku rezistenciju.
Postoje i automatizirani sustavi koji se rabe i za identifikaciju bakterija i za određivanje osjetljivosti.
Dokazivanje MRSA-e u nadzornim uzorcima otežano je zbog prisutnosti normalne bakterijske flore te
se, radi sprječavanja rasta ostalih bakterija, rabe različiti selektivni bujoni za prekonoćnu inkubaciju
i/ili različite selektivne podloge (npr. kromogeni agar). Probir MRSA-e može se izvoditi i uz pomoć
molekularnih testova, među kojima su najspecifičniji i najosjetljiviji oni iz treće generacije, koji kao cilj
detekcije imaju cijelu regiju između SCCmec fragmenta i orfX (ne samo mecA gen). Tipizacija je važna
kod MRSA-e jer omogućuje uvid u povezanost izolata, pomaže utvrditi prijenos patogena i otkriti
izvor iz kojeg se širi. Fenotipskim metodama tipizacije uspoređujemo fenotipska svojstva bakterija i
umnogome su zamijenjene metodama genotipizacije. Najvažnije su i najčešće korištene i citirane
genotipizacijske metode: elektroforeza u pulsirajućem polju (Pulse-field Gel Electrophoresis-PFGE),
zatim višelokusno sekvencijsko tipiziranje (Multi-locus Sequence Type-MLST) i sekvencioniranje regije
koja kodira za protein A (sequencing of protein A region of Staphylococcus aureus - spa typing).
Potrebno je istaknuti važnost točne i relativno brze dijagnostike MRSA-e u kliničkim i probirnim
uzorcima.

Uz ispitivanje mikrodilucije bujona, Institut za kliničke i laboratorijske standarde (CLSI) preporučuje

test difuzije cefoksitina diskom ili ploču koja sadrži 6 μg/ml oksacilina u Mueller-Hinton agaru sa
dodatkom 4% NaCl kao alternativne metode testiranja na MRSA. Osim toga, postoje testovi koje je
odobrila FDA za molekularnu detekciju mecA gena i komercijalno dostupni kromogeni agari koji se
mogu koristiti za detekciju MRSA. Konačno, lateks aglutinacija ili imunohromatografski membranski
testovi za PBP2a mogu se koristiti za otkrivanje MRSA.

PREZENTACIJA: „ovo možeš čitavo ubaciti na jedan slajd, ili jednu po jednu ovo metodu uz
objasnjenje, navela sam ti brojevima“

 Identifikacija S.aureus se temelji uglavnom na dokazu katalaze, koagulaze i DNA-aze, a

postoje i komercijalni lateks-aglutinacijski testovi temeljeni na dokazivanju specifičnih
antigena bakterije 1
 Meticilenska rezistencija S.aureus može se dokazati testIranjem osjetljivosti na cefoksitin ili
dokazom prisutnosti gena mecA odgovorno za rezistenciju 2
 Postoje i autmatizirani testovi za identifikaciju bakterija kao i osjetljivosti
 Radi sprječavanja rasta ostalih bakterija, koriste se i različiti selektivni bujoni za prekonoćnu
inkubaciju kao i različite selektivne pofloge (npr. Hromogeni agar)
 Potvrdni test MRSA-e se može izvoditi uz pomoć molekularnih testova 3
 Uz ispitivanje mikrodilucije bujona, Institut za kliničke i laboratorijske standarde (CLSI)
preporučuje test difuzije cefoksitina diskom ili ploču koja sadrži 6 μg/ml oksacilina u Mueller-
Hinton agaru sa dodatkom 4% NaCl kao alternativne metode testiranja na MRSA
 Kao potvrdni test koristi se i mikrocilucija bujona ali i imunohromatografski membranski
testovi 4

1 Latex test ima prednost direktne detekcije PBP2′ proteina koja se izvodi u brzom vremenskom
okviru uz minimalan trud. Ima potencijal da bude čak i precizniji od detekcije mec A gena, jer se lažno
pozitivni rezultati neće pojaviti kod sojeva koji posjeduju mec A, ali nisu u stanju proizvesti proteinski
proizvod gena. Osim toga, test ne otkriva sojeve koji su hiperproducenti ni beta-laktamaze ni PBP-a.
Komponente kompleta: Testni lateks senzibiliziran monoklonskim antitijelom protiv PBP2, kontrolni
lateks senzibilizovan monoklonskim antitijelom iste IgG podklase koje ne pokazuje reaktivnost sa
proteinima S. Aureus, Reagens za ekstrakciju 1 i 2, test kartice, štapići za miješanje te letak sa
uputama.

Postupak analize

• Lagano protresite lateksni reagens. Dok držite bočicu s kapaljkom uspravno, stavite jednu kap
lateksnog reagensa na krug na aglutinacijsku karticu.

• Upotrebom miješalice u obliku petlje ili štapića za miješanje koji se isporučuje s kompletom,
izaberite 1 do 3 sumnjive kolonije stafilokoka (gram-pozitivno, katalaza pozitivno) na ploči agara.

• uz pomoć miješalice u obliku petlje ili štapića za miješanje pažljivo emulgirajte kolonije u kapi
lateksa 10 sekundi tako da se dobije homogena suspenzija. Zatim rasporedite suspenziju po cijeloj
površini kruga.

• Polako vodoravno okrećite karticu od 30 sekundi do najviše 1 minute.

• Pogledajte vidi li se golim okom ikakva aglutinacija u roku od najviše 1 minute.

2. Cefoksitin inducira rezistenciju na meticilin. A) Pozitivna hemokultura je subkulturirana na krvni

agar (bez cefoksitinskog diska). B) Ista pozitivna hemokultura je subkulturirana sa cefoksitin diskom
(30 mg). Podsjetimo da je cefoksitin surogat za oksacilin, stoga otpornost na bilo (oksacilin ili
cefoksitin) označava otpornost na meticilin.
3.

4. Mikrodilucija bujona je metoda koja se koristi za ispitivanje osjetljivosti mikroorganizama na

antibiotike