Datum: ___________________ VJEŽBA 2.

Obrada uzoraka iz gornjeg dijela dišnog sustava. Uzimanje i obrada

obrisaka ždrijela i nosa. Gram pozitivni koki roda Strephtococcus

Cilj vježbe:
 Nabrojati kliničke uzorke iz gornjeg dijela dišnog sustava; ponoviti uzorkovanje brisa
ždrijela i vestibuluma nosa
 Streptococcus: osnovni klinički uzorci za BHS-A i BHS-B, mikromorfologija i
makromorfologija, bacitracinski test, CAMP, optohinski test
 Enterococcus: osnovni klinički uzorci, mikromorfologija i makromorfologija

GRAM POZITIVNI KOKI: STREPTOKOKI

Streptokoki su gram pozitivni, oksidaza-negativni i katalaza negativni okrugli ili ovalni
koki koji se često nalaze u paru ili u kraćim ili duljim lancima. Nepokretni su i nemaju spore.
Fakultativni su anaerobi s fermentativnim metabolizmom - razgrađuju glukozu do mliječne
kiseline – naziva ih se još bakterijama mliječne kiseline. Neki streptokoki zahtijevaju
atmosferu obogaćenu s CO2. Za rast na umjetnim odlogama trebaju izrazito bogate podloge
(obogaćene krvlju ili serumom). Široko su rasprostranjeni u prirodi kao normalna flora sluzica
čovjeka i životinja, a neki od njih mogu uzrokovati bolesti. Sva navedena svojstva zajednička
su većini streptokoka. Klasična se klasifikacija temelji na hemolizi na krvnom agaru (α, ß, γ-
hemoliza), antigenoj strukturi ugljikohidrata C u staničnoj stijenci beta hemolitikči koki se
serotipizacijom dalje razvrstavaju u grupe A do U. Za humanu patologiju najvažniji su S.
pyogenes, S. pneumoniae i S. agalactiae.

Streptococcus pyogenes je ß-hemolitički streptokok antigenske skupine A (BHS-A). Na

krvnom agaru nakon 24 sata inkubcije izraste u obliku sitne sjajne i prozirne kolonije sa
širokom zonom potpune hemolyze. Čini normalnu ždrijelnu floru u 15-20% zdrave djece, no
jedan je od najčešćih uzročnika bolesti u čovjeka: glavni je uzročnik akutne bakterijske upale
ždrijela, erizipela, celulitisa, pioderme, bakterijemije, šarlaha i sindroma toksičnog šoka.
Glavni su čimbenici virulencije različiti enzimi i toksini te protein M. Uzrokuje i
poststreptokokne bolesti - akutnu reumatsku vrućicu i akutni glomerulonefritis.
Laboratorijska dijagnostika: zlatni standard u dijagnostici streptokokne angine je kultivacija
obriska ždijela na hranilištima obogaćenim krvlju. Uzorci se kultiviraju u mikroaerofilnim
ilianaerobnim uvjetima 24-48 sati. Identifikacija sumnjivih kolonija vrši se diskom bacitracina,
a konačna identifikacija aglutinacijskim testom. Brze metode dijagnostike - dokazivanje
streptokoknog antigena u obrisku ždrijela (npr. Rapid Strep Test) zauzimaju sve značajnije
mjesto.

S. agalactiae je ß-hemolitički streptokok antigenske skupine B (BHS-B). Čini normalnu

floru vagine i donjeg dijela cerviksa u 5-40% zdravih žena. Uzrokuje novorođenačku spesu,
meningitis i pneunomiju. U odraslih osoba S. agalactiae je oportunistički patogen.
 S. pneumoniae (pneumokok) je alfa hemolitički streptokok. Čini normalnu floru
nazofarinksa u oko 20-40% zdrave djece te u 5-10% zdravih osoba. Uzrokuje bakterijsku
upalu srednjeg uha, pneumoniju, sepsu i meningitis.

Viridans streptokoki koloniziraju sluznice gornjeg dišnog sustava čovjeka i rijetko

uzrokuju bolesti. S. mutans uzrokuje karijes, a S. viridans endokarditis i dentalni apsces.

U zaseban rod Enterococcus svrstava se desetak vrsta bakterija, od kojih su kao

uzročnici infekcija značajni E. faecalis i E. faecium. Iako imaju morfološke osobine
streptokoka razlikuju se po otpornosti na nepovoljne utjecaje okoline (rast uz prisutstvo
žučnih soli, rast u 6,5% NaCl, povišena temperature) što se koristi u njihovoj identifikaciji.
Uzrokuju endokarditis, urinarne infekcije. Enterokoki su intrizično rezistentni prema nekim
antibioticima – za izolate iz krvi i likvora potrebno je napraviti cefinaza (nitrocefinski) test.

BACITRCINSKI TEST
Koristi se za identifikaciju grupe A (S. pyogenes) od ostalih beta hemolitičkih streptokoka.
Niska koncentracija bacitracina selektivno imhibira rast BHS-a. Test treba provoditi na čistoj
kulturi ispitivanog streptokoka na čiju se površinu postavi test bacitracina. Nkon inkubacije
na 35-37 °C očitava se zona inhibicije rasta. Pozitivan test – prisustvo bilo koje zone inhibicije
rasta.

OPTOHINSKI TEST
Koristi se za identifikaciju S. pneumoniae od ostalih streptokoka. Test se zasniva na
diferencijalnoj osjetljivosti S. pneumoniae prema optohinu. Hranilište se inokulira
suspektnim sojem na koji se postavlja disk optohina. Nakon inkubacije 35-37°C očitava se
zona inhibicije rasta. Pozitivan test – zona inhibicije >15mm

CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen) test

Koristi se za identifikaciju grupe BHS-B (S. agalactiae) od ostalih beta hemolitičkih
streptokoka. Grupa B streptokoka producira vanstanički “CAMP” faktor koji pojačava lizu
ovčjih ili goveđih eritrocita uz prisustvo stafilokoknog hemolizina. Ovaj fenomen se može
promatrati ako oba mikroorganizma nasadimo okomito jedan na drugi na KA s ovčjom krvi.
Pozitivna reakcija (polumjesečasta zona pojačane hemolize) javlja se uutar 5-6 h
inkubacije/35-37 °C/CO2 atmosfera ili nakon 18-24 h/ pri 35-37°C / zrak.

Test tolerancije na povećanu koncentraciju soli (6,5% NaCl)

Koristi se za diferenciranje enterokoka (otporni) od ostalih streptokoka grupe D (osjetljivi).
Žuč – eskulin agar
Tablica 3. Identifikacija streptokoka i enterokoka

Praktični rad:

ZADATAK 1.

3.1 Opisati porasle kolonije na krvnom agaru u čistoj kulturi; odrediti vrstu hemolize
Morfologija Kultura A Kultura B Kultura C

Veličina

Oblik

Rub

Uzdignutost

Hemoliza

Pigment

Suspektnost na?

3.2 Pripremiti mikroskopske preparate iz suspektnih kultura i obojiti ih polikromatski po

Gram-u.
Mikroskopiranje pripremljenih preparata

a) b) c)

Povećanje: ______ Povećanje: ______ Povećanje: _____

Bojenje: ________ Bojenje: ________ Bojenje: _______
1. Izraditi KATALAZA test iz kulture A i B
Na temelju rezultata zadatka odredi kojem rodu pripadaju bakterije iz kulture A i B.
a) _____________________________________________________________________
b) _____________________________________________________________________
c) _____________________________________________________________________

2. Prema izgledu kolonija i vrsti hemolize odredi daljni postupak za identifikaciju izolirane
bakterije, prema priliženoj tablici 3. :
a) _____________________________________________________________________
b) _____________________________________________________________________
c) _____________________________________________________________________

1. Očitavanje optohinskog testa:

Zona inhibicije: ____________ Optohin (S, R): _________________

2. Očitavanje disk difuzijskog antibiograma kultura A

Antibiotik Zona inhibicije Osjetljivost (S,I,R)

Penicillin

Klaritromicin

Klindamicin

3. Očitavanje disk difuzijskog antibiograma kultura B

Antibiotik Zona inhibicije Osjetljivost (S,I,R)

Klaritromicin

Klindamicin

tetraciklin

Sulfometoksazol/trimetoprim

Oksacilin(penicillin)

4. Očitavanje E-testa za Streptococcus pneumoniae:

MIK penicilina G: _________________µg/ml

E – test
Pitanja:
Svi beta hemolitički streptokoki pripadaju Lancefieldovoj grupi A. DA NE
Streptococcus pneumoniae je gram pozitivni, inkapsulirani, beta hemolitički kok.
DA NE
Streptococcus pyogenes je uvijek osjetljiv na penicillin. DA NE
Za razliku od streptokoka, enterokoki su vrlo otporni prema uvjetima okoline i antibioticima.
DA NE
Svi streptokoki su katalaza negativni. DA NE
Koja bolest nastaje zbog toksigenog djelovanja BHS-A?
___________________________________________________________________________
Navedi dvije neinfektivne komplikacije koje mogu nastati nakon preboljelih neliječenih
streptokoknih infekcija.
___________________________________________________________________________