Organizacija PCR laboratorije

S obzirom da je primjena PCR-a vrlo široka, poželjno bi bilo uspostaviti odvojene

sekcije za genetska, maligna i zarazna oboljenja, a forenzički DNK laboratorij u svakom
slučaju treba zasebno uspostaviti. PCR je relativno nova tehnika koja se koristi u većini
dijagnostičkih patoloških laboratorija, pa je vrlo često potrebno stvoriti prostor za njega u
već uspostavljenom laboratoriju.
Sve aktivnosti koje se provode u laboratoriji se mogu podijeliti u dvije grupe:
1. pre-PCR (priprema uzorka i priprema za PCR)
2. post-PCR (provođenje i analiza PCR.
Bez obzira na veličinu laboratorija i oboljenja koja se u njemu dijagnosticiraju, idealno je
da se prostor podijeli na tri dijela ili da se ograniči tok rada na tri odvojena područja koja
uključuju: područje za pripremu uzoraka, postavljanje PCR-a i obradu nakon PCR-a.

Slika 1: prijedlog organizacije PCR laboratorije

Područje za pripremu uzoraka je namijenjeno za prihvaćanje i obradu svih uzoraka, a

potrebne su posebne mjere opreza ukoliko se primaju neki od zaraznih uzoraka.
Područje postavljanja PCR-a se treba održavati bez kontaminacije iz područja pripreme
uzoraka i post PCR obrade. U ovom području svaki zaposlenik mora imati svoje mjesto
kao i set pipeta i ostale opreme. Osim postavljanja PCR-a, koristi se i za pripremu i
skladištenje reagensa. Područje nakon PCR-a se koristi za PCR amplifikaciju i obradu
amplificiranih produkata. U ovaj prostor se mogu postaviti i termocikleri. Ovo je
potencijalno najopasnije područje koje može prenijeti kontaminaciju na ostatak radnih
površina.
Drugi način organizacije su dvije odvojene prostorije sa dva područja, a svaki dio treba
biti specifično dizajniran i opremljen za posebne zadatke. Prva prostorija se treba
koristiti isključivo za aktivnosti prije PCR-a i treba biti podijeljena na područje za
pripremu mješavine, kao i područje za pripremu uzorka. Pritisak zraka bi trebao biti
blago pozitivan kako bi se spriječilo utjecanje aerosola. Druga prostorija treba imati
poseban prostor za amplifikaciju nukleinskih kiselina i odvojen prostor za analizu
proizvoda. Ovdje pritisak zraka treba biti blago negativan kako bi se osiguralo da
aerosoli amplifikona ne napuštaju prostoriju.
Slika 2: organizacija PCR laboratorije sa dvije prostorije
Način rada za najsigurnije korištenje PCR-a je podijeliti svaki korak u 6 različitih
prostorija. Prostorija 1, označena na slici 3. kao „Master-mix Laboratory Area“ služi za
pripremu amplifikacijskih reagensa zajedno sa kontrolama. U ovoj prostoriji se
pripremljen master miks i kontrola dodaju u PCR reakcione epruvete, stoga je potrebno
ukloniti svaki rizik od kontaminacije. U prostoriji 2, „Extraction Laboratory Area“, se
odvija priprema uzoraka, tkivnih ili serumskih, koji se obrađuju za ekstrakciju RNK ili
DNK. Prostorija 3, „RT-PCR Laboratory Area“, se koristi ukoliko je genetski materijal
uzorka RNK. Prostorija 4, „PCR/Ampli Laboratory Area“, služi za amplifikaciju, te
prostorija 5, „Analysis Laboratory Area“, za analizu dobijenih rezultata amplifikacije.
Dodatna prostorija 6 služi za nested-PCR tehniku.

Slika 3: Idealan raspored PCR laboratorije

U slučaju da se radi o malom laboratoriju ili je iz nekih drugih razloga nemoguće imati
dvije ili tri odvojene prostorije, moguće je čitav postupak provesti u jednoj, međutim
područja rada moraju biti razgraničena, odvojena jedno od drugog, te udaljena što je
više moguće. Ukoliko se sve aktivnosti obavljaju unutar jedne prostorije, onda se
priprema uzoraka mora odvijati unutar nape sa laminarnim protokom koja je opremljena
UV svjetlom, a stijenke nape je potrebno brisati 10% otopinom izbjeljivača prije obrade
uzoraka ili pripreme PCR uzoraka. Vrlo je važno imati pre-PCR aktivnosti koje su
prostorno odvojene od područja amplifikaicje i analize – bilo da se nalaze u različitim ili
istim prostorijama. Razlog tome je što se obično ima mala količina uzorka nukleinske
kiseline tokom pripreme i vrlo visoka koncentracija nakon amplifikacije. Ovo znači da
ukoliko se analizira PCR u istom prostoru dok se pripremaju uzorci, moguće je dobiti
lažno pozitivne rezultate zbog kontaminacije amplifikonom.
Bez obzira na koliko prostorija bila razdvojen proces PCR-a, važno je kretati se
isključivo u jednom smjeru od oblasti 1 kad posljednjoj oblasti/prostoriji, kako bi se i na
taj način spriječila kontaminacija.
Najčešći izvor kontaminacije PCR produkata je stvaranje aerosola PCR amplikona koji
je povezan sa post-PCR analizom. Metode za eliminisanje ovih aerosola uključuju
dizajn laboratorije, korištenje specifičnih pipeta, te hemijski i enzimski pristup problemu.
Izbor metode ovisi o učestalosti amplifikacije ciljnog amplifikona i relativnim količinama i
koncentracijama amplifikona stvorenih PCR-om. Postoje PCR sistemi koji omogućavaju
izravno mjerenje nakupljana amplikona tokom reakcije. Real-time PCR sistemi nude
alternativni pristup tradicionalnim post-PCR metodama analize. Prikupljanje podataka
tokom amplifikacije koristeći sisteme za detekciju koji se temelje na fluorescenciji,
eliminiše potrebu za rukovanje uzorkom. Kada su detekcija i analiza gotove, reakcijske
epruvete ostaju zatvorene i ne izlaze amplifikoni. Upotreba PCR-a u istraživačke i
dijagnostičke svrhe zahtijeva poštovanje nekih dodatnih procedura kako bi reakcije dale
valjane rezultate i kako PCR laboratorija ne bi bila kontaminirana. Kontaminacija može
proisteći iz nekoliko različitih izvora poput pojačavanja i pročišćavanja klonova
plazmida, te ponovljena izolacija šablonskih nukleinskih kiselina i amplifikona. U
istraživačkim laboratorijama kontaminacija amplikonom može biti manje izazovna, dok u
dijagnostičkim laboratorijama postoji veća mogućnost za kontaminaciju zbog ponovljene
analize odabranih šablona kao i zbog činjenice da se PCR testovi mogu izvesti na
granici ili blizu granice detekcije PCR-a. S obzirom da su amplikoni glavni izvor
kontaminacije, odvajanjem izvora aktivnosti amplikona (npr. post-PCR) od aktivnosti
prije PCR-a, značajno se smanjuje mogućnost kontaminacije.
PCR laboratoriji zahtijevaju različitu opremu poput naprimjer centrifuga, vrtložnih
miješalica, pipeta, frižidera i zamrzivača, termociklera, te instrumenata za analizu (npr.
sistemi za elektroforezu). Svaka od prostorija u PCR laboratoriji ili svaki odvojeni dio
treba biti premljen namjenskim resursima, a izvor deionizirane vode, namjenske
centrifuge, te hladnjače moraju biti prisutne u obje prostorije. Da bi se osiguralo da su
aktivnosti prije i nakon PCR-a odvojene, svaka soba mora imati svoj zasebni set
opreme uključujući pipete, reagense i police. Sve treba biti označeno mjestom kojem
pripada i mora se koristiti isključivo u tom prostoru. Budući da je pipetiranje sastavni dio
PCR analiza, svako područje mora imati svoje pipete koje se ne smiju izmjenjivati
između radnih mjesta. Jedna od preporuka je korištenje filterskih vrhova za PCR
postavke jer se tako izbjegava ulazak aerosola u pipetu, te se smanjuje mogućnost da
već prisutni aerosoli u pipeti kontaminiraju glavnu mješavinu ili uzorke. Također, mora
se slijediti jednosmjeran tok rada. Materijali i reagensi koji se koriste u područjima
amplifikacije i analize se nikada ne smiju unositi u prostor pre-PCR-a bez temeljite
dekontaminacije. Zbog toga je potrebna različita oprema za svako područje. Ovakav
jednosmjeran tok rada se odnosi i na osoblje, odosno ono koje je radilo u područjima
analize i amplifikacije ukoliko se treba vratiti u područje pre-PCR-a, mora promijeniti
zaštitnu opremu jer bi ona mogla biti kontaminirana aerosolima amplifikona. Još jedna u
nizu mjera predostrožnosti jeste i vremensko odvajanje što znači da se PCR reakcije se
mogu postaviti ujutro, dok se analiza i amplifikacija mogu obaviti poslijepodne.

Literatura
 https://www.integra-biosciences.com/china/en/blog/article/setting-pcr-lab-scratch
 https://www.researchgate.net/publication/
50226255_Setting_up_a_PCR_laboratory
 http://grcpk.com/wp-content/uploads/2014/10/12.-Setting-up-PCR-Lab.pdf
 https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-90-481-3132-7_6?noAccess=true