Trần Khải Văn Bctt Vikysinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA PHẠM NGỌC THẠCH
Khoa Điều dưỡng – Kỹ thuật Y học

Bộ môn Xét nghiệm
BÁO CÁO THỰC TẬP

VI – KÝ SINH
Bệnh viện Nhi Đồng 2
Môn học: KTXN1: Vi sinh – Ký sinh

Tên sinh viên: Trần Khải Văn
Lớp: Cử nhân Xét nghiệm 2019
MSSV: 1956010022
TP. HỒ CHÍ MINH – 2022

Báo cáo thực tập Vi – Ký sinh
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ đầy đủ
TIẾNG VIỆT
BV Bệnh viện
DNT Dịch não tủy
KHV Kính hiển vi
KN Kháng nguyên
KSĐ Kháng sinh đồ
KST Ký sinh trùng
KT Kháng thể
KTV Kỹ thuật viên
MD Miễn dịch
QT Quang trường
TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh
XN Xét nghiệm
Từ viết tắt Từ đầy đủ Nghĩa tiếng Việt

TIẾNG ANH
Ab Antibodies Kháng thể
AFB Acid-Fast bacilli Trực khuẩn kháng acid-cồn
BA Blood Agar Thạch máu
BCP Bromocresol Purple Thạch BCP
CA Chocolate Agar Thạch sô-cô-la
CFU Colony Form Unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc
ELISA Enzyme-Linked Kỹ thuật miễn dịch gắn men
ImmunoSorbent Assay
HEK Hekteon Agar Thạch Hektoen
HIV Human Virus suy giảm miễn dịch ở
Immunodeficiency Virus người
HP Helicobacter pylori -
SAD Saubouraud Agar Thạch Sabouraud
SS Salmonella-Shigella Thạch SS
Agar
ZN Ziehl-Neelsen Nhuộm Ziehl-Neelsen
1
MỤC LỤC
MỤC LỤC ....................................................................................................................... 1
DANH MỤC HÌNH......................................................................................................... 2
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... 4
MỤC ĐÍCH CỦA BÁO CÁO THỰC TẬP ..................................................................... 5
NỘI DUNG ..................................................................................................................... 6
A. GIỚI THIỆU ĐƠN VỊ THỰC TẬP ............................................................................ 6
1. Giới thiệu bệnh viện ................................................................................................. 6
1.1. Lịch sử hình thành .............................................................................................. 6
1.2. Chức năng và nhiệm vụ ...................................................................................... 7
2. Giới thiệu Khoa Vi sinh:........................................................................................... 7
3. Cảm nhận về đơn vị thực tập .................................................................................... 9
B. VI SINH.................................................................................................................... 10
I. Kỹ thuật vi sinh cơ bản ........................................................................................... 10
1. Kỹ thuật cấy vi khuẩn.......................................................................................... 10
2. Kỹ thuật nhuộm Gram ......................................................................................... 16
3. Kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen (nhuộm kháng acid)............................................ 21
II. Test nhanh ............................................................................................................. 25
1. Test nhanh phát hiện kháng nguyên virus SARS-CoV-2 ..................................... 25
2. Test nhanh Helicobacter pylori............................................................................ 28
3. Test nhanh HIV ................................................................................................... 31
III. Trang thiết bị ........................................................................................................ 35
1. Máy định danh và kháng sinh đồ tự động Phoenix .............................................. 35
2. Máy cấy máu BactecTM FX ................................................................................. 39
C. KÝ SINH .................................................................................................................. 43
1. Soi tươi phân ....................................................................................................... 43
2. Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA) ................................................................. 47
TỔNG KẾT ................................................................................................................... 52
ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN .................................................................................. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 54
1
DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Bệnh viện Quân sự vào đầu thế kỷ 20 ................................................................. 6
Hình 2: Bệnh viện Nhi Đồng 2 hiện nay .......................................................................... 6
Hình 3: Sơ đồ tổ chức khoa Vi sinh ................................................................................. 7
Hình 4: Sơ đồ phòng Vi sinh tầng trệt .............................................................................. 8
Hình 5: Sơ đồ phòng Vi sinh tầng 1 ................................................................................. 8
Hình 6: Kỉ niệm với các anh chị trong khoa Vi sinh......................................................... 9
Hình 7: Que cấy 10µL (vàng) và que cấy 1µL (xanh) .................................................... 11
Hình 8: Môi trường MC (1), BA (2), BCP (3) và SAD (4) ............................................. 11
Hình 9: Môi trường SS (trái) và HEK (phải) .................................................................. 12
Hình 10: Phương pháp cấy 4 chiều ................................................................................ 14
Hình 11: Phương pháp cấy định lượng ........................................................................... 15
Hình 12: Tủ ấm thường (trái) và tủ ấm CO2 (phải) ........................................................ 15
Hình 13: Cấu tạo vi khuẩn Gram dương và Gram âm .................................................... 16
Hình 14: Lame đã được cố định ..................................................................................... 17
Hình 15: Nhuộm và rửa Crystal Violet .......................................................................... 17
Hình 16: Nhuộm và rửa Lugol ....................................................................................... 18
Hình 17: Tẩy màu phết nhuộm bằng cồn ....................................................................... 18
Hình 18: Nhuộm và rửa Safranin ................................................................................... 19
Hình 19: Kết quả nhuộm Gram, cầu khuẩn Gram dương (trái) và trực khuẩn Gram âm
(phải) ............................................................................................................................. 19
Hình 20: Máy nhuộm Gram tự động PREVI Color Gram .............................................. 20
Hình 21: Hóa chất dùng trong nhuộm Ziehl-Neelsen ..................................................... 21
Hình 22: Sơ đồ tóm tắt quy trình nhuộm Ziehl-Neelsen ................................................. 23
Hình 23: Máy nhuộm ZN tự động (trái) và kết quả nhuộm ZN (phải) cho thấy có trực
khuẩn kháng acid-cồn bắt màu hồng (khoanh đỏ) trên nền xanh .................................... 24
Hình 24: Bộ kit test nhanh COVID-19 ........................................................................... 25
Hình 25: Cấu trúc của khay thử theo nguyên lý dòng chảy ............................................ 25
Hình 26: Tóm tắt quy trình test nhanh COVID-19 ......................................................... 27
Hình 27: Cách đọc kết quả test nhanh ............................................................................ 27
Hình 28: Bộ kit test nhanh H. pylori .............................................................................. 28
Hình 29: Tóm tắt quy trình test nhanh H. pylori............................................................. 30
Hình 30: Bộ kit test nhanh HIV gồm SD Bioline HIV 1/2 3.0 (trái) và Determine HIV 1/2
(phải) ............................................................................................................................. 32
Hình 31: Tóm tắt quy trình test nhanh HIV .................................................................... 34
Hình 32: Kết quả test nhanh HIV ................................................................................... 34
Hình 33: Máy định danh và KSĐ tự động BD Phoenix M50 .......................................... 35
Hình 34: Ống canh trường định danh (ID Broth) ........................................................... 37
Hình 35: Máy đo độ đục PhoenixSpec ........................................................................... 38
2
Hình 36: Ống canh trường AST, AST-S và chất chỉ thị tương ứng................................. 38
Hình 37: Chuyển huyền dịch ID Broth và ống AST/AST-S Broth sau khi được nhỏ chất
chỉ thị ............................................................................................................................ 39
Hình 38: Đổ các huyền dịch vào phần giếng tương ứng và đóng nắp ............................. 39
Hình 39: Máy cấy máu tự động BactecTM FX .............................................................. 40
Hình 40: Nguyên lý phát hiện vi khuẩn của máy cấy máu .............................................. 41
Hình 41: Thực hiện cấy phân lập và định danh trên chai cấy máu dương tính ................ 42
Hình 42: Chuẩn bị các dụng cụ làm lame soi phân ......................................................... 43
Hình 43: Nhỏ nước muối NaCl 0,9% và đánh tan đều mẫu phân trong giọt nước muối .. 44
Hình 44: Đậy lamelle ..................................................................................................... 45
Hình 45: Giun lươn, ấu trùng giai đoạn 1 ....................................................................... 46
Hình 46: Nấm men ........................................................................................................ 46
Hình 48: Giardia lamblia, thể bào nang.......................................................................... 46
Hình 47: Trichomonas hominis ...................................................................................... 46
Hình 50: Sợi cơ ............................................................................................................. 47
Hình 49: Hạt mỡ ............................................................................................................ 47
Hình 51: Máy xét nghiệm Immunomat – Virion/Serion ................................................. 47
Hình 52: Các khay vi giếng được đựng trong túi kín ...................................................... 48
Hình 53: Các hóa chất cần thiết cho xét nghiệm............................................................. 49
Hình 54: Xếp các giếng vào khung theo đúng thứ tự hiển thị trên màn hình hệ thống .... 50
3
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Các loại môi trường được sử dụng và công dụng của chúng ............................. 12
Bảng 2: Bộ môi trường cần chuẩn bị đối với từng bệnh phẩm ........................................ 13
Bảng 3: Các môi trường và tủ ấm tương ứng ................................................................. 15
Bảng 4: Cách trả lời kết quả khi đọc tiêu bản nhuộm Ziehl-Neelsen .............................. 24
Bảng 5: Điểm khác nhau giữa kit test SD Bioline HIV 1/2 3.0 và Determine HIV 1/2 ... 32
Bảng 6: Chủng chuẩn được sử dụng để QC tương ứng với từng nhóm vi khuẩn ............ 37
Bảng 7: Quy định ghi kết quả khi đọc lame phân ........................................................... 45
4
MỤC ĐÍCH CỦA BÁO CÁO THỰC TẬP

Xét nghiệm vi – ký sinh đóng vai trò rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh nhiễm trùng
để tìm ra căn nguyên gây bệnh gồm vi khuẩn, virus và ký sinh trùng, từ đó giúp cho bác sĩ
đưa ra phương hướng điều trị hiệu quả. Tuy nhiên, các xét nghiệm này đòi hỏi nhiều ở kỹ
năng và tay nghề của người KTV. Chính vì lý do đó, mục đích của chuyến thực tập tại
Bệnh viện Nhi Đồng 2 này là để:
- Tìm hiểu và làm quen với môi trường làm việc của một phòng xét nghiệm Vi sinh thực
tế tại bệnh viện.
- Quan sát cách tổ chức quản lý phòng xét nghiệm vi – ký sinh.
- Ôn tập lại kiến thức và vận dụng chúng vào thực tiễn trong phòng xét nghiệm tại bệnh
viện. Ghi nhận những điểm khác nhau giữa làm việc thực tế tại bệnh viện với những kiến
thức từ sách vở được học tại trường.
- Quan sát, học hỏi các quy trình làm việc từ lúc nhận mẫu cho đến lúc trả kết quả xét
nghiệm.
- Quan sát, học hỏi các quy trình và cách vận hành những máy móc xét nghiệm hiện đại
đang được sử dụng tại phòng xét nghiệm.
- Tích cực tham gia vào các công việc của khoa để thành thạo các kỹ thuật xét nghiệm vi –
ký sinh.
- Học hỏi thêm được những kiến thức mới và những kinh nghiệm thực tế từ các anh chị
trong khoa.
5
NỘI DUNG
A. GIỚI THIỆU ĐƠN VỊ THỰC TẬP
1. Giới thiệu bệnh viện
1.1. Lịch sử hình thành
Bệnh viện (BV) Nhi đồng 2 tọa lạc trên một khu đất cao với diện tích 8,6 hecta, giáp bốn
mặt tiền đường: Lý Tự Trọng, Chu Mạnh Trinh, Nguyễn Du và Hai Bà Trưng (Quận 1).
Bệnh viện có vị trí đẹp và gắn liền với quá trình phát triển của thành phố. Lịch sử hình
thành bệnh viện gồm các mốc thời gian như sau:
- Tiền thân của BV Nhi Đồng 2 hiện giờ là
Bệnh viện Quân sự (Tiếng Pháp là Hôpital
militaire) khi họ mới xâm chiếm Nam Kỳ vào
năm 1962. Cơ sở này vào cuối thập niên 1870
chuyển về số 14 rue Lagrandière, hiện nay là
14 Lý Tự Trọng, P. Bến Nghé, Q.1, TP.HCM.
- Từ năm 1905 trở đi, dưới sự điều hành của
bác sĩ Charles Grall, bệnh viện đã mở cửa chữ
trị cho mọi thành phần, quân sự cũng như dân
sự, kể cả dân bản xứ và bệnh viện chính thức
đổi tên thành “Bệnh viện Grall” vào năm 1925
để vinh danh ông. Hình 1: Bệnh viện Quân sự vào đầu thế kỷ 20
- Vào năm 1976, sau khi đất nước ta được giải phóng và người Pháp rút đi thì Bệnh viện
Grall được chuyển giao cho nhà chức trách Cộng hòa Xã hội Chủ nghĩa Việt Nam và được
đổi tên thành Bệnh viện Nhi Đồng 2 vào ngày 1/6/1978.
Hình 2: Bệnh viện Nhi Đồng 2 hiện nay
6
1.2. Chức năng và nhiệm vụ

Bệnh viện Nhi đồng 2 hiện là bệnh viện chuyên khoa Nhi – hạng 1, trực thuộc Sở Y tế
TP.HCM. Đồng thời, cũng là một trong 4 bệnh viện Nhi hàng đầu tại Việt Nam phụ trách
công tác khám, chữa bệnh cho các bé từ 0 đến dưới 16 tuổi.
Bệnh viện còn là trung tâm đào tạo thực hành cho các trường: Đại học Y Dược TP.HCM,
Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, Đại học Nguyễn Tất Thành; là cơ sở đào tạo y khoa
liên tục do Bộ Y tế cấp mã đào tạo. Ngoài ra, bệnh viện cũng là nơi tiếp nhận sinh viên
quốc tế đến tham quan và học tập về chuyên ngành nhi khoa.
Bệnh viện cũng là một trung tâm hợp tác nghiên cứu lâm sàng với các viện, bệnh viện đầu
ngành trong cả nước, Tổ chức Y tế thế giới, các trường đại học và viện nghiên cứu của các
nước phát triển, …
2. Giới thiệu Khoa Vi sinh:
Khoa Vi sinh được thành lập từ năm 1978, hay còn có tên gọi khác là tổ Vi trùng (trước
năm 1977 trực thuộc khoa Xét nghiệm) được chia làm 3 bộ phận chính:
- Bộ phận nuôi cấy vi khuẩn: thực hiện các xét nghiệm nuôi cấy, định danh và làm kháng
sinh đồ vi khuẩn và ký sinh trùng.
- Bộ phận huyết thanh – miễn dịch: thực hiện các xét nghiệm miễn dịch, ELISA để chẩn
đoán vi – ký sinh.
- Bộ phận sinh học phân tử: thực hiện các xét nghiệm như PCR để chẩn đoán vi khuẩn gây
bệnh như lao, ho gà và các loại virus như HSV, HAV, HBV, …
Hình 3: Sơ đồ tổ chức khoa Vi sinh
7
Phòng Ký sinh trùng Phòng vật tư Phòng môi Phòng môi Phòng rửa
trường trường dụng cụ
Cửa
chính
Phòng nuôi cấy vi khuẩn

Phòng vệ sinh Phòng trực Phòng sinh
hoạt Khu vực
nhận mẫu
Hình 4: Sơ đồ phòng Vi sinh tầng trệt
Phòng trực Phòng PCR Phòng pha chế hóa chất Phòng tách chiết
Phòng sinh học phân tử
Phòng hành chính

Hành
lang
Phòng họp Phòng miễn dịch
Phòng
trưởng
khoa
Hình 5: Sơ đồ phòng Vi sinh tầng 1
8
3. Cảm nhận về đơn vị thực tập

Ấn tượng đầu tiên của em khi mới bước chân vào bệnh viện đó là quy mô rộng lớn cũng
như vẻ đẹp cổ kính của nó. Nét kiến trúc của bệnh viện vẫn giữ nguyên từ thời Pháp thuộc
và dù trải qua nhiều lần sửa chữa để hiện đại hơn nhưng những giá trị về nghệ thuật của nó
vẫn giữ nguyên như vậy. Để phục vụ cho đối tượng bệnh nhân của mình là trẻ em thì trong
khuôn viên bệnh viện còn có các khu vui chơi cùng với những hàng cây xanh mát khiến
cho việc đi lại trong bệnh viện mang cảm giác thoải mái, thân thiện với trẻ nhỏ và tạo được
trải nghiệm tốt nhất cho trẻ khi đến với bệnh viện.
Về khoa Vi sinh, em được biết là khoa được công nhận đạt chuẩn ISO 15189 và khi được
tiếp xúc thực tế thì em mới tận mắt thấy được mọi thứ được vận hành ra sao. Các khu vực
được tại đây được phân chia rõ ràng, thiết kế đi lại hợp lý và thuận tiện, cơ sở vật chất và
trang thiết bị thì hiện đại, tiện nghi giúp cho việc làm xét nghiệm nhanh chóng và thuận
lợi. Về mặt con người, các anh chị KTV trong khoa đều là những người có kinh nghiệm
làm việc lâu năm và ai cũng có tác phong chuyên nghiệp. Anh chị luôn hướng dẫn chúng
em nhiệt tình và luôn tạo điều kiện để tụi em được thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm để tụi
em học được nhiều nhất có thể. Các anh chị còn chủ động chia sẻ những quy trình hướng
dẫn thực hành, hướng dẫn sử dụng trang thiết bị để tụi em có điều kiện học tập tốt nhất. Từ
cách các anh chị giao tiếp với nhau thì có thể thấy được khoa Vi sinh là một tập thể đoàn
kết. Điều đó không chỉ thể hiện ở trong công việc mà còn qua những hoạt động của bệnh
viện mà các anh chị tham gia. Nhóm em cũng được các anh chị mời gọi để tham gia cùng
với vai trò là cổ động viên và qua hoạt động đó em nhận được mình hòa nhập hơn với mọi
người và cũng tạo nên một kỉ niệm khó quên trong đợt thực tập này của em.
Hình 6: Kỉ niệm với các anh chị trong khoa Vi sinh
9
B. VI SINH
Quy trình thời gian định danh trong xét nghiệm vi sinh:
Ngày 1: Lấy và nhận mẫu
Khảo sát đại thể.
Khảo sát vi thể:
 Đánh giá chất lượng mẫu đàm (thang Barlett).
 Soi tươi.
 Soi nhuộm.
Cấy 4 chiều và ủ trong tủ ấm với nhiệt độ ủ 35-37oC hoặc tủ ấm có thêm 5% CO2.
Ngày 2: Đọc kết quả nuôi cấy
Khảo sát tính chất khuẩn lạc, chọn khúm nghi ngờ gây bệnh để:
 Các thử nghiệm sinh hóa.
 Định danh.
 Làm KSĐ.
Đối với các mẫu không mọc hoặc non thì ủ tiếp.
Ngày 3: Định danh loài
Đọc kết quả ủ tiếp từ ngày trước.
Đọc kết quả định danh và KSĐ.
Trả kết quả.
I. Kỹ thuật vi sinh cơ bản
1. Kỹ thuật cấy vi khuẩn
Kỹ thuật cấy vi khuẩn là kỹ thuật chuyển vi khuẩn vào môi trường có các chất dinh dưỡng
và các chất bổ trợ khác nhằm mục đích phân tách, tăng sinh và giúp ta khảo sát từng loại
vi khuẩn.
Đây là kỹ thuật cơ bản và được thực hiện thường xuyên trong các phòng xét nghiệm vi
sinh. Bên cạnh đó, tùy vào mục đích sẽ có các phương pháp cấy khác nhau.
1.1. Chuẩn bị dụng cụ:
- Bút lông, bút chì.
- Bơm kim tiêm (dùng trong cấy máu).
10
- Que cấy.
Hình 7: Que cấy 10µL (vàng) và que cấy 1µL (xanh)
- Môi trường nuôi cấy.
1 2
3 4
Hình 8: Môi trường MC (1), BA (2), BCP (3) và SAD (4)
11
Hình 9: Môi trường SS (trái) và HEK (phải)
- Tủ ATSH cấp 2.
- Tủ ấm
1.2. Quy trình:
Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết đặt trong tủ ATSH và lưu ý phải có thêm đèn cồn nếu thực
hiện kỹ thuật trên bàn nuôi cấy ngoài tủ.
 Bước 1: Nhận mẫu bệnh phẩm (đàm, mủ, máu, nước tiểu, dịch não tủy,…) và quan sát
đại thể (màu sắc, nhầy, máu,…) để ghi nhận lại trên phiếu chỉ định và hệ thống của bệnh
viện.
 Bước 2: Chọn môi trường phù hợp với từng loại bệnh phẩm và dán code lên hộp thạch.
Mỗi bệnh phẩm đều phải chuẩn bị thêm 1 lame có dán code hoặc ghi thông tin lên để
nhuộm Gram đánh giá vi thể.
Bảng 1: Các loại môi trường được sử dụng và công dụng của chúng
Môi trường Công dụng

Chocolate Agar (CA) Cung cấp nhiều chất dinh dưỡng và yếu tố V, X giúp
phân lập các loài vi khuẩn khó cấy như Haemophilus
influenzae, Neisseria meningitidis,…
Blood Agar (BA) Môi trường giàu chất dinh dưỡng và máu cừu được
sử dụng để nuôi cấy các vi khuẩn khó tính. Nó cũng
được dùng để phát hiện được sự tiêu huyết do độc
tính ly giải tế bào tiết ra bởi một số vi khuẩn.
12
Bromocresol Purple (BCP) BCP khả năng biến đổi màu dựa vào sự thay đổi pH.
Ban đầu, pH ở mức 7 nên môi trường có màu tím
nhưng nếu có mặt vi khuẩn lên men lactose và sản
sinh acid lactic làm giảm pH đi thì vùng có vi khuẩn
sẽ có màu vàng.
Môi trường tuy không chọn lọc nhưng có thể giúp dễ
ta phát hiện họ vi khuẩn đường ruột
(Enterobacteriaceae).
MacConkey Agar (MC) Thạch MC dùng để nuôi cấy chọn lọc các trực khuẩn
Gram âm, đặc biệt là họ vi khuẩn đường ruột và chi
Pseudomonas.
Môi trường còn có khả năng phân biệt được giữa vi
khuẩn có lên men lactose và không lên men lactose.
Những vi khuẩn có lên men lactose sẽ sinh ra acid
nên pH môi trường sẽ giảm, do đó làm đổi màu của
đỏ.
Canh thang Giúp tăng sinh vi khuẩn, dùng để lưu lại các vi khuẩn
từ dịch não tủy, mủ và dịch vô trùng.
Sabouraud Dextrose Agar Môi trường chứa nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho
(SDA) sinh vật phát triển, có thêm Chloramphenicol
và/hoặc Tetracycline - là các kháng sinh phổ rộng -
để ức chế sự sinh trưởng của nhiều vi khuẩn Gram
dương và Gram âm. Vì vậy, SDA chủ yếu dùng để
nuôi cấy chọn lọc nấm.
Salmonella Shigella Agar (SS) Môi trường chọn lọc dùng để nuôi cấy, phân lập
Hekteon Agar (HEK) Salmonella và Shigella.
Bảng 2: Bộ môi trường cần chuẩn bị đối với từng bệnh phẩm
Bệnh phẩm Môi trường lựa chọn Lưu ý

Nước tiểu BA/ BCP Chuẩn bị thêm SDA
Đàm CA, BA, MC/ BCP nếu có thêm chỉ định
Máu CA, BA, MC/ BCP cấy nấm.
Mủ BA, MC/ BCP, canh thang
Dịch não tủy CA, BA, canh thang
Dịch vô trùng CA, BA, MC/ BCP, canh
thang
Sinh dục CA, BA
Phân SS, HEK
 Bước 3: Chọn dụng cụ và phương pháp cấy phù hợp:
+ Cấy phân lập (cấy 4 chiều) thì dùng que cấy 10 µL (que cấy vàng).
13
+ Cấy định lượng thì dùng que cấy 1 µL (que cấy xanh dương).
+ Bơm kim tiêm dùng chọc hút mẫu trong cấy máu, chuẩn bị thêm gòn cồn để sát trùng
miệng chai cấy máu trước khi chọc hút mẫu để tránh ngoại nhiễm.
 Bước 4: Tiến hành cấy
Dùng que cấy lấy bệnh phẩm đủ 1 vòng que cấy hoặc dùng bơm kim tiêm để hút mẫu bơm
vào mỗi hộp thạch đối với cấy máu.
Nếu bệnh phẩm được lấy bằng que gòn (mủ, sinh dục) thì dùng que lăn trên một phần nhỏ
ở rìa mỗi hộp thạch trên vùng cấy thứ nhất.
* Cấy 4 chiều:
Cấy đường thứ 1: dùng một tay mở nắp hộp petri, một tay ria đầu khuyên cấy trên 1/4 - 1/3
mặt thạch, ria lại vài lần, tránh chạm vào rìa của đĩa petri gây tạp nhiễm.
Cấy đường thứ 2: quay 1/4 đĩa, đặt khuyên cấy từ đường cấy thứ 1, ria chạm vào đường
cấy thứ 1 khoảng 4 lần. Sau đó, tiếp tục ria đường cấy thứ 2, không chạm vào đường cấy
thứ 1.
Cấy đường thứ 3: xoay 1/4 đĩa thạch tiếp theo, đặt khuyên cấy từ đường cấy thứ 2, ria chạm
đường cấy thứ 2 khoảng 4 lần. Sau đó, tiếp tục ria đường cấy thứ 3, không chạm vào đường
cấy thứ 2.
Cấy đường thứ 4: xoay phần tư đĩa còn lại, đặt khuyên cấy từ đường cấy thứ 3, ria chạm
đường cấy thứ 3 khoảng 4 lần. Sau đó, tiếp tục ria đường cấy thứ 4, không chạm vào đường
cấy thứ 3.
Hình 10: Phương pháp cấy 4 chiều
* Cấy định lượng: đối với mẫu bệnh phẩm là nước tiểu:
- Dùng khuyên cấy 1 µL lấy mẫu bệnh phẩm đầy khuyên cấy và kéo 1 đường thẳng từ trên
xuống đến hết đường kính hộp thạch.
- Cấy theo đường zig zag từ trên xuống dưới đến hết hộp thạch. Lưu ý là khoảng cách giữa
các đường cấy.
14
Hình 11: Phương pháp cấy định lượng
Bước 5: Sau khi cấy xong, đặt ngược hộp thạch (nắp nằm ở dưới) để dễ cầm nắm và đem
ủ ấm trong các tủ theo quy định.
Bảng 3: Các môi trường và tủ ấm tương ứng
Loại tủ ấm Loại môi trường

Tủ ấm thường, nhiệt độ 35-37oC MC, BCP, SAD, HEK, canh thang
Tủ ấm CO2, nhiệt độ 35-37oC, 5% CO2 CA, BA
Hình 12: Tủ ấm thường (trái) và tủ ấm CO2 (phải)

15
2. Kỹ thuật nhuộm Gram

2.1. Mục đích:
Nhuộm Gram là một kỹ thuật cơ bản và quan trọng nhất trong phân tích vi khuẩn ở giai
đoạn dầu. Cụ thể, kỹ thuật này giúp ta có thể xác định sơ bộ đặc tính của vi khuẩn về hình
dạng, tính chất bắt màu và cách sắp xếp.
2.2. Nguyên lý:
Do sự khác biệt về cấu trúc thành tế bào vi khuẩn nên vi khuẩn Gram dương giữ được màu
tím của phức hợp Crystal Violet sau khi cố định bằng Iodine mà không bị tẩy bởi cồn. Vi
khuẩn Gram âm không giữ được màu của phức hợp này sau khi tẩy bằng cồn.
Hình 13: Cấu tạo vi khuẩn Gram dương và Gram âm

Như được thể hiện từ hình minh họa trên, vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dày
và không có lớp màng ngoài nên khi tẩy cồn sẽ làm cho các lỗ peptidoglycan co lại. Vì vậy
mà phức hợp màu Crystal Violet – Iodine bị giữ lại trong tế bào.
Trong khi đó, vi khuẩn Gram âm khi tẩy cồn sẽ bị làm tan lớp màng ngoài và phức hợp
Crystal Violet – Iodine sẽ bị rửa trôi khiến cho vi khuẩn Gram âm bị mất màu và bắt được
màu hồng của Safranin ở bước tiếp theo.
2.3. Trang thiết bị và vật tư:
- Kính hiển vi.
- Máy sấy lame.
16
- Bút sáp, lame kính và que cấy.

- Bộ thuốc nhuộm Gram: Crystal Violet, Iodine, Cồn 95%, Safranin.
2.4. Quy trình:
Bước 1: Lame sau khi đã được dàn mẫu bệnh phẩm và làm khô bằng máy sấy lame thì sẽ
phải cố định bằng cồn tuyệt đối hoặc hơ nhẹ qua ngọn lửa đèn cồn 2-3 giây.
Hình 14: Lame đã được cố định
Bước 2: Phủ Crystal Violet lên phết nhuộm và để yên trong 1 phút.
Bước 3: Đổ bỏ thuốc nhuộm và rửa sạch lame bằng nước.
Hình 15: Nhuộm và rửa Crystal Violet

17
Bước 4: Phủ Lugol lên phết nhuộm và để yên trong 1 phút.

Bước 5: Đổ bỏ Lugol và rửa sạch lame bằng nước.
Hình 16: Nhuộm và rửa Lugol

Bước 6: Tẩy màu bằng cồn 95% bằng cách nhỏ từ từ dung dịch lên phết nhuộm cho đến
khi không còn xuất hiện màu tím và rửa lại bằng nước.
Hình 17: Tẩy màu phết nhuộm bằng cồn

18
Bước 7: Phủ Safranin lên phết nhuộm và để yên trong 1 phút.

Bước 8: Đổ bỏ thuốc nhuộm và rửa sạch lame bằng nước.
Hình 18: Nhuộm và rửa Safranin

Bước 9: Để khô tự nhiên phết nhuộm.
2.5. Kết quả:
Hình 19: Kết quả nhuộm Gram, cầu khuẩn Gram dương (trái) và trực khuẩn Gram âm (phải)
Sau khi tiêu bản đã khô, ta tiến hành đọc kết quả trên kính hiển vi bằng vật kính dầu (x100).
Kết quả đọc lame sẽ được mô tả thông qua 3 đặc tính:
- Hình thể: cầu khuẩn, trực khuẩn, …
19
- Tính chất bắt màu Gram:

 Vi khuẩn Gram dương: bắt màu tím.
 Vi khuẩn Gram âm: bắt màu hồng.
- Cách sắp xếp: đứng đơn lẻ, xếp đôi, xếp thành chuỗi, xếp thành từng đám,…
2.6. Lưu ý:
Nhuộm Gram tuy là một kỹ thuật đơn giản nhưng cũng có vô số các yếu tố dẫn đến sai lệch
kết quả mà KTV nên lưu ý và đề ra hướng khắc phục nhanh chóng:
- Gram dương trở thành Gram âm do những nguyên nhân:
 Lứa cấy quá già: do vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất sẽ sinh ra các chất làm
tăng tính acid của môi trường nuôi cấy gây sai lệch kết quả. Tốt nhất là nên nhuộm
với lứa cấy 18-24 giờ.
 Dung dịch Lugol bị hư: sẽ không có khả năng cố định màu Gram dương khiến cho
nó bị tẩy trôi bởi cồn. Để tránh lỗi này thì trước khi tiến hành nhuộm nên kiểm tra
chất lượng của Lugol xem có bị cặn hoặc đổi màu từ nâu sang vàng không.
 Tẩy màu quá lâu: làm cho vi khuẩn Gram dương không giữ được màu nhuộm ban
đầu. Vì vậy, phải luôn canh chuẩn thời gian khi tẩy màu.
- Gram âm trở thành Gram dương do những nguyên nhân:
 Cố định tiêu bản khi còn ướt, các hợp chất protein có trong môi trường hoặc trong
mẫu thử làm tiêu bản khó tẩy màu.
 Lame phết quá dày khiến cho vi khuẩn tập trung tại một chỗ, khó bị tẩy màu nên
chúng sẽ giữ màu tím sau giai đoạn tẩy cồn.
 Thuốc nhuộm bị cặn.
 Tẩy màu quá nhanh.
Để hạn chế các sai sót do tay nghề và đẩy nhanh tiến độ công việc thì khoa Vi sinh sử dụng
máy nhuộm Gram tự động PREVI Color Gram của hãng bioMérieux – Pháp.
Hình 20: Máy nhuộm Gram tự động PREVI Color
20
3. Kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen (nhuộm kháng acid)

3.1. Nguyên lý:
Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen (ZN) là phương pháp sử dụng 2 hoá chất nhuộm màu
là đỏ Fuchsin và xanh Methylene kết hợp với chất tẩy màu (hỗn hợp acid HCL và cồn 96o).
Các loại vi khuẩn thuộc dòng Mycobacterium có vách tế bào chứa khá nhiều mỡ acid béo
và sáp (mycolic acid). Những chất này không thấm nước, làm cho tế bào vi khuẩn khó bắt
màu trong các phương pháp nhuộm thông thường. Nhưng nếu dùng thuốc nhuộm Fuchsin
kiềm cùng với sự hơ nóng vi khuẩn sẽ bắt màu dễ dàng hơn phần lớn màu nhuộm sẽ ngấm
vào bên trong thân tế bào vi khuẩn phần khác sẽ được kết hợp với mycolic acid tạo một
phức hợp kỵ nước giữ cho phần Fuchsin đã vào không ngấm ngược trở ra. Nền phiến phết
được nhuộm thêm phần xanh Methylene tạo sự tương phản để dễ khảo sát.
Khi đã được nhuộm, vi khuẩn thuộc dòng Mycobacterium khó bị tẩy màu bằng dung dịch
acid-cồn trong khi các loại vi khuẩn khác cùng nhuộm theo phương pháp này sẽ bị tẩy màu
một cách dễ dàng.
3.2. Dụng cụ:
- Lame kính.
- Bút sáp.
- Giá nhuộm tiêu bản.
3.3. Hóa chất:
- Dung dịch Fuchsin 0,3% .
- Dung dịch hỗn hợp acid-cồn 3% ( gồm HCl đậm đặc 30 mL và cồn Ethylic 95° 970 mL).
- Dung dịch xanh Methylene 0,3%.
Hình 21: Hóa chất dùng trong nhuộm Ziehl-Neelsen
21
- Dung dịch sát khuẩn phenol 5% hoặc Javen 0,5%.

- Dầu soi kính.
3.4. Các bước thực hiện:
Bước 1: Chuẩn bị tiêu bản trong tủ an toàn sinh học:
- Mở nắp cốc đờm nhẹ nhàng, đặt nắp ngửa trên khay inox.
- Dùng đầu vát của que phết bằng chọn lấy chỗ đờm nhầy mủ nhẹ nhàng cắt mẫu đờm bằng
cách di cạnh vát que gỗ vào thành cốc đờm, mỗi bệnh phẩm dùng que cấy riêng.
- Đậy nắp cốc đờm.
- Đặt que cấy có mẫu bệnh phẩm vào giữa lame kính và dàn trải theo vòng xoắn ốc từ trong
ra ngoài, dàn đều đặn liên tục tạo độ mịn dày vừa phải hình ô van kích thước dài 2 cm rộng
1cm.
- Ngâm que cấy sau khi dàn vào dung dịch sát khuẩn Phenol 5% hoặc Javen 0,5%.
Bước 2: Làm khô tiêu bản trên mấy sấy lame và cố định bằng cách hơi qua ngọn lửa đèn
cồn 3-4 lần, mỗi lần 3 giây.
Bước 3: Tiến hành nhuộm:
- Đặt tiêu bản trên giá nhuộm.
- Phủ đầy dung dịch Fuchsin 0,3% lên tiêu bản.
- Hơi nóng cho đến khi thấy làn khói mỏng bốc lên thì ngưng, thực hiện 3 lần (khoảng 5
phút nếu có đồng hồ canh giờ). Đợi lame nguội.
- Rửa sạch nhẹ nhàng bằng nước.
- Tẩy màu bằng dung dịch acid-cồn trong 1-5 phút cho đến khi vết nhuộm sạch.
- Phủ đầy dung dịch Methylene 0,3% để 1 phút.
Bước 4: Để khô tiêu bản
- Chờ tiêu bản khô một cách tự nhiên, không được dùng giẻ, giấy thấm khô hoặc hơ lửa.
- Để tránh lây nhiễm từ tiêu bản này sang tiêu bản khác, nên đặt các tiêu bản nằm xa nhau
trong quá trình nhuộm, rửa, tẩy.
22
Bước 5: Đọc tiêu bản

Soi tiêu bản bằng việc sử dụng kính hiển vi quang học vật kính dầu 100X. Cần phải đọc ít
nhất 100 quang trường và đếm tất cả số vi khuẩn lao có trong 100 quang trường rồi ghi
nhận kết quả theo quy định.
Hình 22: Sơ đồ tóm tắt quy trình nhuộm Ziehl-Neelsen
23
3.5. Diễn giải và báo cáo kết quả:

Bảng 4: Cách trả lời kết quả khi đọc tiêu bản nhuộm Ziehl-Neelsen
Số lượng AFB Trả lời kết quả

Không AFB/ 100 quang trường Âm tính (không phát hiện
trực khuẩn kháng acid-cồn)
1-9 AFB/ 100 quang trường Số cụ thể
10-99 AFB/ 100 quang trường 1+
1-10 AFB trong 1 quang trường/ 2+
50 quang trường
>10 AFB trong 1 quang trường/ 3+
20 quang trường
Để tăng hiệu quả công việc và giảm thiểu sai sót do trong quá trình thao tác thì hiện nay
việc nhuộm ZN tại khoa Vi sinh chủ yếu được thực hiện trên máy nhuộm tự động Ral
Stainer xuất xứ từ hãng Ral Diagnostic của Pháp.
Hình 23: Máy nhuộm ZN tự động (trái) và kết quả nhuộm ZN (phải) cho thấy có trực
khuẩn kháng acid-cồn bắt màu hồng (khoanh đỏ) trên nền xanh
3.7. Lưu ý (cảnh báo):

- AFB nhạt màu có thể do tẩy quá lâu hoặc nhuộm chưa đủ (thời gian, sức nóng).
- Nếu AFB tối màu có thể do nhuộm nền quá lâu.
- Mỗi mẻ nhuộm không nên quá 12 tiêu bản, các tiêu bản để cách nhau ít nhất 1 cm.
24
II. Test nhanh

1. Test nhanh phát hiện kháng nguyên virus SARS-CoV-2
1.1. Mục đích:
Phát hiện sự hiện diện kháng nguyên của SARS-CoV-2 trong mẫu bệnh phẩm bằng bộ kit
ProDetectTM COVID-19 Antigen Rapid Test.
Hình 24: Bộ kit test nhanh COVID-19
1.2. Nguyên lý:

- ProDetectTM COVID-19 Antigen Rapid Test
sử dụng các cặp kháng thể đơn dòng có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao đối với kháng nguyên
SARS-CoV-2.
- Dụng cụ gồm một que thử đặt cố định trong
khay nhựa. Que thử gồm 3 phần chính: lớp
nhận mẫu, lớp cộng hợp và lớp màng phản
ứng:
+ Lớp cộng hợp được phủ sẵn cộng hợp vàng.
+ Kháng thể đơn dòng của các KN SARS-
CoV-2 được cố định sẵn tại vùng kết quả (T). Hình 25: Cấu trúc của khay thử theo nguyên lý
+ Kháng thể đa dòng đề kháng IgG chuột được dòng chảy

cố định sẵn tại vùng chứng (C).
25
- Trong quá trình xét nghiệm, mẫu bệnh phẩm phản ứng với thuốc thử tại lớp cộng hợp tạo
thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Phức hợp tiếp tục di chuyển trên màng nhờ
mao dẫn, gặp và phản ứng với các kháng thể tại vùng kết quả và tạo ra vạch màu (T). Vạch
màu này xuất hiện cho kết quả dương tính, còn nếu không thì kết quả là âm tính.
- Nhằm mục đích kiểm tra quy trình xét nghiệm, một vạch màu sẽ luôn xuất hiện tại vùng
vạch chứng (C) để khẳng định lượng mẫu bệnh phẩm là đủ và lớp màng đã thấm tốt.
1.3. Bảo quản hóa chất/ sinh phẩm:
- Bộ kit sẽ ổn định cho đến ngày hết hạn in trên túi nếu được bảo quản ở nhiệt độ 2-30oC,
tránh tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, tránh nơi ẩm ướt và tránh tiếp xúc với nhiệt độ cao.
- Khay thử phải được bảo quản trong túi kín ban đầu cho đến khi sử dụng. Nếu túi đã bị
rách, hỏng hoặc đã hết hạn sử dụng thì không được sử dụng bộ kit test đó.
1.4. Thu thập, vận chuyển và bảo quản mẫu:
- Mẫu bệnh phẩm được thu thập bằng tăm bông đã được cung cấp trong bộ kit. Lấy mẫu
dịch tỵ hầu bằng cách đưa tăm bông vào hốc mũi nơi có nhiều dịch tiết nhất, xoay nhẹ
nhàng để thấm ướt tăm bông nhằm lấy đủ lượng dịch tiết.
- Mẫu nên được sử dụng ngay sau khi lấy. Nếu không thể thực hiện liền mà cần vận chuyển
đi nơi khác thì phải cho tăm bông vào ống bảo quản có nắp đậy. Mẫu bệnh phẩm khi gửi
tới PXN phải đầy đủ thông tin bệnh nhân, đủ thể tích, đạt chất lượng, được bảo quản đúng
cách và thông tin phải trùng khớp với phiếu chỉ định.
1.5. Thực hiện xét nghiệm:
- Lấy khay thử và ống chiết ra khỏi túi, đặt trên mặt phẳng nằm ngang. Sử dụng ngay trong
vòng 1 giờ.
- Ghi mã bệnh nhân.
- Nhúng đầu que chứa mẫu vào ống chiết. Xoay đầu que trong khoảng 10 giây, miết đầu
que vào thành và đáy ống 8-10 lần để giải phóng kháng nguyên.
- Bóp cho hai thành ống ép vào đầu que, từ từ xoay que và ép đầu que khi rút que ra khỏi
ống để thu được càng nhiều dung dịch chứa mẫu càng tốt. Hủy que mẫu đã sử dụng theo
quy định khi xử lý chất thải lây nhiễm sinh học.
- Đậy chặt ống bằng nắp nhỏ giọt.
- Lắc mạnh ống theo chiều ngang 10 lần để trộn đều mẫu. Tránh để dụng dịch chạm tới đầu
lọc trong nắp nhỏ giọt.
26
- Bỏ nắp trên ống nhỏ giọt và nhỏ 3 giọt (100µL) nẫu chiết từ ống vào giếng mẫu (S) của
khay thử và bắt đầu tính thời gian.
- Đọc kết quả sau 15 phút.
Hình 26: Tóm tắt quy trình test nhanh COVID-19

1.6. Diễn giải kết quả và báo cáo:
- Dương tính: nếu xuất hiện hai vạch màu: một là vạch chứng (C) và một là vạch kết quả
(T). Trong trường hợp này, trả kết quả test nhanh là dương tính và đề nghị thực hiện xét
nghiệm RT PCR để khẳng định.
- Âm tính: chỉ xuất hiện vạch chứng (C) và không có vạch nào trong vùng kết quả (T).
Trong trường hợp này, trả kết quả test nhanh là âm tính tuy nhiên không loại trừ nhiễm
SARS-CoV-2. Tiếp tục theo dõi, giám sát theo quy định của Bộ y tế.
Hình 27: Cách đọc kết quả test nhanh
* Lưu ý:
 Độ đậm của vạch kết quả (T) có thể khác nhau phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên
SARS-CoV-2 trong mẫu bệnh phẩm. Vì vậy, bất cứ độ mờ nào xuất hiện tại vạch
kết quả (T) cũng đều được coi là dương tính.
27
 Kết quả không hợp lệ: không xuất hiện vạch chứng (C). Nguyên nhân do lượng mẫu
bệnh phẩm không đủ hoặc thực hiện sai quy trình. Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng và
xét nghiệm lại bằng khay thử mới khác. Nếu kết quả vẫn như cũ, cần liên hệ ngay
với nhà phân phối để được tư vấn, hướng dẫn.
1.7. Lưu và xử lý mẫu:
Tiến hành hủy bỏ toàn bộ mẫu và bộ kit test đã sử dụng theo quy định trong quy trình xử
lý chất thải SARS-CoV-2.
1.8. Hạn chế:
- Kết quả xét nghiệm là định tính, nó không phải là tiêu chí duy nhất để xác định bệnh nhân
nhiễm COVID-19 không mà còn phải kết hợp với các triệu chứng lâm sàng và các xét
nghiệm khác.
- Kết quả xét nghiệm âm tính không loại trừ khả năng bị nhiễm SARS-CoV-2 mà cần phải
theo dõi thêm. Nếu khẳng định chẩn đoán COVID-19 thì phải xét nghiệm RT-PCR.
- Có thể xảy ra âm tính giả khi có quá nhiều máu hoặc nhầy trong mẫu, mẫu được lấy hoặc
bảo quản không đúng cách.
- Kết quả dương tính có thể không phải do COVID-19 mà do nhiễm một chủng coronavirus
không phải SARS-CoV-2 hoặc có các yếu tố gây nhiễu khác.
2. Test nhanh Helicobacter pylori
2.1. Mục đích:
Helicobacter pylori một loại xoắn
khuẩn nhỏ sống trên bề mặt dạ dày và
tá tràng, liên quan đến loạt bệnh
đường tiêu hóa, thường gặp nhất là
viêm dạ dày thể hoạt động và mãn
tính, loét do rối loạn tiêu hóa.
Khoa Vi sinh tại bệnh viện sử dụng
bộ test nhanh kháng nguyên H. pylori
(One Step H. pylori Test Device)
(Phân) của ABON thuộc tập đoàn
Abbott.
Bộ kit bao gồm: khay thử, ống chiết
mẫu (dung dịch đệm NaCl 0.015M), Hình 28: Bộ kit test nhanh H.pylori
ống nhỏ giọt.
28
2.2. Nguyên lý:

- One Step H. pylori Antigen Test Device (Phân) là xét nghiệm sắc ký miễn dịch định tính,
hoạt động theo nguyên lý dòng chảy một chiều phát hiện kháng nguyên H. pylori trong
mẫu phân người.
- Sau khi nhỏ vào vùng nhận mẫu, mẫu bệnh phẩm sẽ phản ứng với các phần tử phủ sẵn
kháng thể kháng H. pylori. Hỗn hợp tạo thành tiếp tục di chuyển lên màng sắc ký nhờ mao
dẫn để phản ứng với kháng thể kháng H. pylori đã cố định sẵn tại vạch kết quả (T) và tạo
thành một vạch màu.
- Vạch T phủ sẵn kháng thể kháng H. pylori và vạch chứng C phủ sẵn kháng thể kiểm soát
- Sự xuất hiện vạch màu ở vạch kết quả T thể hiện kết quả dương tính. Ngược lại, nếu vạch
nói trên không xuất hiện sẽ cho kết quả âm tính.
- Để kiểm soát quy trình, có một vạch màu luôn xuất hiện tại vùng chứng (vạch chứng C).
Nếu vạch chứng này không hiện diện, kết quả xét nghiệm không có giá trị.
2.3. Bảo quản hóa chất/ sinh phẩm:
- Bảo quản bộ kit trong túi kín ở nhiệt độ phòng hoặc trong ngăn mát tủ lạnh (trong khoảng
từ 2-30oC). Bộ kit sẽ ổn định cho đến khi hết hạn in trên túi nếu được bảo quản theo đúng
yêu cầu.
- Không sử dụng bộ kit khi hết hạn sử dụng hoặc khi túi bị rách, hỏng.
2.4. Thu thập, vận chuyển và bảo quản mẫu:
- Mẫu bệnh phẩm là phân được cho vào lọ chứa mẫu sạch, khô, không thấm nước, không
chứa chất tẩy rửa, chất bảo quản hoặc môi trường vận chuyển vì những yếu tố đó sẽ ảnh
hưởng đến xét nghiệm. Lấy phần phân nhầy máu vì sẽ có khả năng chứa nhiều vi khuẩn
gây bệnh.
- Bệnh phẩm phải được vận chuyển ngay đến PXN không quá 2 giờ. Nếu chưa thực hiện
xét nghiệm ngay, mẫu phân có thể được lưu ở 2-8oC trong vòng 72 giờ, hoặc -20oC nếu
muốn lưu được lâu hơn.
- Mẫu bệnh phẩm khi gửi tới phòng xét nghiệm phải đầy đủ thông tin bệnh nhân, đủ thể
tích, đạt chất lượng, được bảo quản đúng cách và thông tin bệnh nhân phải trùng khớp với
phiếu chỉ định.
2.5. Thực hiện xét nghiệm:
- Xử lý mẫu:
29
 Đối với mẫu phân lỏng: Giữ ống nhỏ giọt thẳng đứng, hút mẫu phân sau đó chuyển
2 giọt (khoảng 80 μL) vào ống chiết mẫu.
 Đối với mẫu phân rắn: mở nắp của ống chiết mẫu, sau đó cầm nắp ống và chọc que
lấy mẫu (gắn liền với nắp) vào mẫu bệnh phẩm tại ít nhất 3 vị trí khác nhau để lấy
khoảng 50 mg mẫu (tương đương 1⁄4 hạt đậu). Không xúc mẫu phân.
- Vặn chặt nắp, lắc mạnh ống để trộn đều mẫu và dung dịch chiết mẫu. Để yên ống chiết
mẫu trong 2 phút.
- Lấy khay thử ra khỏi túi. Ghi mã bệnh nhân và giờ thực hiện lên khay thử.
- Giữ ống lấy mẫu đã xử lý thẳng đứng và bẻ đi phần chóp gắn liền với nắp. Đảo ngược
ống dung dịch chiết mẫu và truyền 2 giọt dung dịch mẫu (khoảng 80 μL) vào vùng nhận
mẫu của test thử.
- Chờ và đọc kết quả trong vòng 10 phút. Không sử dụng kết quả sau 20 phút.
Đậy nắp và lắc

mạnh ống chiết Bỏ phần
Thu thập mẫu mẫu chóp gắn liền
phân với nắp
Nhỏ 2 giọt dung

dịch mẫu vào
vùng nhận mẫu
Hình 29: Tóm tắt quy trình test nhanh H. pylori

- Vạch chứng (C) xuất hiện ở cửa sổ đọc kết quả cho thấy test hoạt động hiệu quả.
- Vạch kết quả (T) thể hiện kết quả của mẫu bệnh phẩm.
- Kết quả cuối cùng:
30
+ Dương tính: khi xuất hiện cả 2 vạch màu kết quả (T) và vạch chứng (C).
Lưu ý: độ đậm màu sắc của vạch kết quả (T) sẽ khác nhau phụ thuộc vào nồng độ kháng
nguyên H. pylori có trong mẫu bệnh phẩm. Do đó, bất kỳ độ đậm nhạt nào của vạch kết
quả (T) đều được coi là dương tính.
+ Âm tính: chỉ xuất hiện vạch chứng (C). Không xuất hiện vạch kết quả (T).
+ Không xác định: nếu vạch chứng (C) không xuất hiện trong cửa sổ đọc kết quả sau khi
thực hiện thử nghiệm, kết quả coi như không có giá trị. Nguyên nhân có thể do không thực
hiện đúng theo quy định hướng dẫn hoặc có thể test hết hạn sử dụng. Kỹ thuật viên nên
đọc lại quy trình và làm lại xét nghiệm bằng test thử mới khác. Nếu tình trạng vẫn như cũ,
báo với KTV trưởng và báo Trưởng khoa, liên lạc với đại lý phân phối để được giải đáp.
2.7. Lưu và xử lý mẫu:
- Không lưu mẫu, hủy mẫu ngay sau khi thực hiện xét nghiệm. Mẫu phân sau xét nghiệm
được xử lý theo quy trình xử lý chất thải y tế.
2.8. Lưu ý:
- Mỗi test chỉ sử dụng 1 lần, không tái sử dụng test thử.
- Không trộn hoặc trao đổi những mẫu khác lại với nhau.
- Không trực tiếp chạm ngón tay vào vùng nhận mẫu hoặc cửa sổ đọc kết quả vì có thể làm
ảnh hưởng đến kết quả test nhanh.
- Đọc kết quả trong khoảng thời gian quy định.
- Kết quả xét nghiệm âm tính không loại trừ khả năng bị nhiễm H. pylori. Nếu kết quả xét
nghiệm âm tính mà các triệu chứng lâm sàng vẫn xuất hiện, cần làm thêm xét nghiệm bằng
các phương pháp khác.
- Sau khi điều trị bằng kháng sinh, nồng độ kháng nguyên H. pylori có thể giảm xuống
dưới ngưỡng phát hiện của xét nghiệm. Do đó, cần thận trọng khi chẩn đoán trong quá trình
điều trị bằng kháng sinh.
3. Test nhanh HIV
3.1. Mục đích
Xét nghiệm này dùng phát hiện nhanh, định tính sự hiện diện của KT đối với HIV-1 và
HIV-2 trong huyết thanh hoặc huyết tương người giúp chẩn đoán những trường hợp nhiễm
virus HIV. Tại khoa Vi sinh, để chuẩn đoán HIV thì trước tiên phải thực hiện xét nghiệm
trên máy miễn dịch ARCHITECT i2000SR của Abbott (Mỹ) để sàng lọc. Nếu kết quả
31
dương tính thì mới tiến hành thực hiện 2 xét nghiệm test nhanh bổ sung để khẳng định,
gồm:
+ Determine HIV 1/2 của Alere (Mỹ).
+ SD Bioline HIV 1/2 3.0 của Standart Diagnostics (Hàn Quốc).
Hình 30: Bộ kit test nhanh HIV gồm SD Bioline HIV 1/2 3.0 (trái) và
Determine HIV 1/2 (phải)
3.2. Nguyên lý:

Cả 2 loại sinh phẩm nêu trên đểu sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch với cấu trúc que thử
tương tự nhau:
+ Một nơi nhỏ mẫu thử, mẫu sẽ di chuyển dọc theo test thử nhờ mao dẫn.
+ Một vùng cộng hợp được phủ sẵn cộng hợp kháng nguyên HIV tái tổ hợp (gp41, p24 và
g36) và keo Selenium (Determine HIV 1/2) hay keo vàng (SD Bioline HIV 1/2). Nếu trong
mẫu có chứa KT kháng HIV thì sẽ kết hợp với cộng hợp này tạo thành phức hợp KN-KT.
Sự khác nhau giữa 2 bộ kit xét nghiệm này nằm ở khả năng phân biệt được type HIV, cụ
thể được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 5: Điểm khác nhau giữa kit test SD Bioline HIV 1/2 3.0 và Determine HIV 1/2
SD Bioline HIV 1/2 3.0 Determine HIV ½

Phân biệt được HIV-1 và HIV-2 do cấu trúc Không có khả năng phân biệt HIV-1 và
trên test thử gồm: HIV-2 do cấu trúc trên test thử gồm:
32
- Vạch thử 1 (T1) được phủ KN bắt giữ tái - Vạch thử (T) được phủ kháng nguyên
tổ hợp của HIV-1 (gp4, p24) HIV tái tổ hợp (gp41, gp36). Chúng sẽ bắt
- Vạch thử 2 (T2) được phủ KN bắt giữ tái lấy phức hợp KN-KT được tạo ra ở vùng
tổ hợp của HIV-2 (gp36). cộng hợp và tạo thành vạch đỏ nhìn thấy
 Các KN này sẽ bắt giữ phức hợp KN- được. Ngược lại, các công hợp sẽ tiếp tục
KT tạo thành ở vùng cộng hợp sẽ tạo chảy tới vạch chứng (C) theo lực mao dẫn
thành vạch đỏ nhìn thấy được. Nếu và không hiện vạch T.
không có phức hợp KN-KT thì dòng - Vạch chứng (C) được phủ sẵn các kháng
chảy vẫn đi đến vạch chứng (C) và thể kiểm soát để bắt lấy các cộng hợp làm
không xuất hiện các vạch thử. xuất hiện vạch màu đỏ. Vạch chứng giúp
- Vạch chứng (C) được phủ sẵn các kháng đảm bảo tiến trình được thực hiện đúng và
thể kiểm soát để bắt lấy các cộng hợp làm thuốc thử trên vạch chứng vẫn còn hoạt
xuất hiện vạch màu đỏ. Vạch chứng giúp động tốt.
kiểm tra quy trình xét nghiệm được thực
hiện đúng và thuốc thử trên vạch chứng có
phản ứng tốt không.
3.3. Quy trình thực hiện:
3.3.1. Chuẩn bị
- Chuẩn bị sẵn pipette, đầu col, giấy thấm, lọ xử lý chất thải.
- Ly tâm mẫu 2500 vòng/ 10 phút để tách huyết thanh / huyết tương.
- Chuẩn bị kit xét nghiệm tương ứng với số lượng mẫu bệnh phẩm và để chúng ổn định ở
nhiệt độ phòng trong 15-30 phút.
- Ghi thông tin bệnh nhân lên phiếu tiến trình xét nghiệm nhanh.
- Lấy khay thử trong túi kín ra và đặt trên mặt phẳng sạch nằm ngang.
- Ghi tên bệnh nhân, giờ bắt đầu nhỏ mẫu lên khay thử.
3.3.2. Thực hiện xét nghiệm:
SD Bioline HIV 1/2 3.0 Determine HIV 1/2
- Dùng micropipette hút chính xác 10 µL - Gỡ bỏ lớp bảo vệ bên ngoài.
huyết thanh mẫu nhỏ vào vùng nhận mẫu.
- Ngay khi nhỏ mẫu sẽ thấy màu tía di - Dùng micropipette hút chính xác 50 µL
chuyển đến cửa sổ đọc kết quả nằm ở chính huyết thanh mẫu nhỏ vào vùng nhận mẫu
giữa khuôn xét nghiệm. (được đánh dấu bằng kí hiệu mũi tên).
- Nhỏ thêm 4 giọt buffer vào vùng nhận
mẫu.
3.3.3. Đọc kết quả:
33
- Đọc kết quả tại thời điểm 15 phút sau khi nhỏ mẫu.
Hình 31: Tóm tắt quy trình test nhanh HIV
3.4. Diễn giải và biện luận kết quả:

- Dương tính: vạch đỏ xuất hiện ở cả vùng chứng (C)
và vùng thử (T) của kit. Bất cứ độ đậm nào của vạch
đỏ xuất hiện tại vùng T đều được diễn giải là “Dương
tính”.
- Âm tính: chỉ xuất hiện vạch đỏ ở vùng chứng (C)
và không có vạch đỏ nào xuất hiện ở vùng thử (T)
được diễn giải là “Âm tính”.
- Kết quả không có giá trị: nếu vạch đỏ không xuất
hiện ở vùng chứng (C) thì xét nghiệm không có giá
trị và cần phải làm lại xét nghiệm khác.
Hình 32: Kết quả test nhanh HIV
34
III. Trang thiết bị

1. Máy định danh và kháng sinh đồ tự động Phoenix
1.1. Giới thiệu:
BD Phoenix M50 là hệ thống máy với chức năng thực hiện định danh vi khuẩn và nấm
men được phân lập từ các bệnh phẩm của bệnh nhân. Nó còn có khả năng làm kháng sinh
đồ cũng như kiểm tra chỉ thị kháng thuốc tự động.
Máy có thể thực hiện tối đa 50 test trong 1 lần chạy với khả năng định danh chính xác và
nhanh chóng, cụ thể như sau:
- Khả năng định danh vi khuẩn Gram dương: > 140 loài, thời gian XN trung bình là 3 giờ.
- Khả năng định danh vi khuẩn Gram âm: > 160 loài, thời gian XN trung bình là 3 giờ.
- Khả năng định danh nấm: 64 loài, thời gian XN trung bình từ 4-8 giờ.
Về khả năng thực hiện KSĐ thì máy cũng có thể làm KSĐ đối với nhiều nhóm vi khuẩn
Gram dương và Gram âm với thời gian trung bình từ 6-16 giờ với sự hỗ trợ của phần mềm
BD Xpert. Phần mềm hỗ trợ sẽ giúp giải thích kết quả định danh và kháng sinh đồ dựa theo
các tiêu chuẩn và phần mềm sẽ được cập nhật thường xuyên.
Hình 33: Máy định danh và KSĐ tự động BD Phoenix M50

1.2. Nguyên lý:
1.2.1. Nguyên lý định danh:
Trên thanh hoá chất Phoenix chứa hàng loạt các hoá chất sử dụng để kiểm tra các đặc điểm
hoá sinh cổ điển, màu hoặc huỳnh quang nhằm định danh vi sinh vật. Canh trường nền giúp
vi sinh vật phát triển và cơ chất enzyme có nhiệm vụ kiểm tra đặc điểm sinh hoá. Việc
35
kiểm tra áp dụng kỹ thuật đa thông số MPD (Multiple parameter determination) và so sánh
đặc điểm sinh hoá dựa vào các chất đặc trưng và các chỉ thị nhận biết.
- Acid tạo thành khi vi sinh vật sử dụng một cơ chất cụ thể nào đó, được nhận biết bằng
chỉ thị phenol đỏ.
- Cơ chất màu chuyển màu vàng khi có phản ứng enzyme thuỷ phân hoặc có hợp chất P-
nitrophenyl/ P-nitroanilide xuất hiện. Việc thuỷ phân cơ chất huỳnh quang sẽ dẫn đến sự
phát quang.
- Vi sinh vật tiêu thụ một loại carbon nhất định sẽ khiến chỉ thị resazurin-based giảm.
Ngoài ra còn có các test để kiểm tra sự thủy phân, phân hủy hay sử dụng một cơ chất nào
1.2.2. Nguyên lý kháng sinh đồ:
Máy Phoenix áp dụng nguyên tắc thu nhỏ để thực hiện KSĐ. Hệ thống này nhận chỉ thị
oxy hoá khử để phát hiện sự sinh trưởng của VSV trong môi trường chứa kháng sinh. 15
thông số đo của chỉ thị oxy hoá khử kết hợp với đo độ đục được sử dụng trong việc xem
sự phát triển của VSV.
Mỗi thanh panel chứa nhiều thuốc kháng sinh khác nhau và được pha loãng nồng độ theo
cấp số nhân. Kết quả KSĐ được đánh giá thông qua giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
của mỗi vi sinh vật.
1.2.3. Nguyên lý phát hiện chỉ thị kháng thuốc:
Hệ thống có giúp phát hiện các chỉ thị kháng thuốc ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương:
- Khả năng sinh Carbapenemase ở Enterobacteriaceae, Acinetobacter spp. và P.
aeruginosa.
- Khả năng sinh ESBL ở Enterobacteriaceae.
- Kháng Vancomycin ở Enterococcus.
- Kháng Aminoglycoside nồng độ cao ở Enterococcus.
- Kháng Methicillin ở Staphylococci.
- Sinh β - lactamase ở Staphylococcus.
- Kháng Macrolide ở Streptococcus.
1.3. Kiểm tra chất lượng:
1.3.1. Mẫu bệnh phẩm:
- Mẫu được lấy ở thời điểm trước khi sử dụng kháng sinh.
36
- Bệnh phẩm: các loại bệnh phẩm đã qua nuôi cấy có mọc khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn
gây bệnh trên hộp thạch được chỉ định sử dụng máy tự động Phoenix để thực hiện định
danh và KSĐ.
- Kiểm tra độ thuần của khuẩn lạc: nên cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên một hộp thạch
BA/BCP/MC để kiểm tra.
1.3.2. Thiết bị:
Đảm bảo thiết bị được bảo trì, hiệu chuẩn.
1.3.3. Hóa chất/ sinh phẩm, môi trường:
- Thực hiện kiểm tra chất lượng mỗi tuần bằng chủng chuẩn.
Bảng 6: Chủng chuẩn được sử dụng để QC tương ứng với từng nhóm vi khuẩn
VK Gram âm VK Gram dương Streptococcus Nấm men

NMIC/ID PMIC/ID SMIC/ID Yeast ID
E. coli S. aureus S. pneumoniae Candida parapsilosis
ATCCTM 25592 ATCCTM 29213 ATCCTM 49619 ATCCTM 22019
P.aeruginosa E. faecalis
ATCCTM 27853 ATCCTM 29212
1.4. Các bước thực hiện:

Nội dung Công việc chi tiết
các bước
Chọn khuẩn Sau khi đọc hộp thạch và phát hiện khuẩn lạc nghi ngờ sau nuôi cất, KTV
lạc nghi ngờ tiến hành chọn các khuẩn lạc thuần:
cần định • Khuẩn lạc phát triển 18 - 24h.
danh • Khuẩn lạc khó phát triển 48h.
Chuẩn bị - Dán nhãn/ ghi tên/ mã bệnh nhân trên ống
huyền dịch canh trường định danh ID Broth.
ID - Huyền phù hoá khuẩn lạc đã chọn ở bước 1
trong ống canh trường định danh Phoenix.
- Đóng nắp và vortex ống huyền dịch trong 5
giây.
- Để yên 10 giây nhằm tránh bọt khí.
Sử dụng máy đo độ đục PhoenixSpec đến khi
đạt yêu cầu :
- Độ đục tiêu chuẩn dành cho vi khuẩn:
 0.2 - 0.3 McFarland: Gram âm, Gram Hình 34: Ống canh trường
dương. định danh (ID Broth)
37
 0.5 - 0.6 McFarland: Gram âm, Gram dương và Streptococcus.

- Độ đục tiêu chuẩn dành cho nấm: 2.0 - 2.4 McFarland.
Sử dụng huyền dịch ngay hoặc không quá 15 phút.
Hình 35: Máy đo độ đục PhoenixSpec
Chuẩn bị - Tương tự như ID Broth, chúng ta cần chuẩn bị canh trường KSĐ AST
huyền dịch hoặc AST-S khi thực hiện thêm KSĐ.
AST hoặc - Nhỏ 1 giọt chỉ thị AST hoặc AST-S (AST/AST-S Indicator) vào ống
AST-S canh trường AST hoặc AST-S.
- Trộn đều bằng cách đảo ngược vài
lần (không vortex).
- Cấy chuyền huyền dịch từ ID Broth
đã pha ở bước 2 vào ống:
 Nếu huyền dịch đạt độ đục là
0,5 – 0,6 McFarland: thêm
25μL huyền dịch định danh
vào ống canh trường AST.
 Nếu huyền dịch đạt độ đục là
0,2 – 0,3 McFarland: thêm
50μL huyền dịch định danh
vào ống canh trường AST.
- Đóng nắp, trộn đều vài lần (không Hình 36: Ống canh trường AST, AST-
vortex)
- Đối với nấm, không cần pha ống S và chất chỉ thị tương ứng
canh trường AST mà sẽ làm kháng nấm đồ thay thế bằng phương pháp
thủ công.
38
Hình 37: Chuyển huyền dịch ID Broth và

ống AST/AST-S Broth sau khi được nhỏ
chất chỉ thị
Chuẩn bị - Lấy panel ra khỏi bao (panel phải sử dụng trong vòng 2 giờ sau khi lấy
panel rồi đổ ra khỏi bao).
huyền dịch - Đặt panel lên khay cấy mẫu sao cho phần giếng nạp mẫu nằm phía trên
vào panel và hướng lên trên.
tương ứng - Dán nhãn thông tin bệnh nhân vào panel.
- Đổ huyền dịch đã pha vào phần giếng của panel.
 ID Broth đổ vào giếng bên trái (51 giếng).
 AST/ AST-S Broth đổ vào giếng bên phải (85 giếng
Đậy nắp giếng.
Đưa ngay panel chuẩn bị vào hệ thống máy hoặc không quá 30 phút.
Hình 38: Đổ các huyền dịch vào phần giếng tương ứng và đóng nắp
2. Máy cấy máu BactecTM FX

2.1. Giới thiệu:
39
Cấy máu là xét nghiệm vi sinh được chỉ định cho các trường hợp nghi ngờ nhiễm khuẩn
huyết để xác nhận chẩn đoán cũng như xác định tác nhân gây bệnh và có kháng sinh đồ
định hướng cho điều trị.
Ngày nay, cấy máu bằng hệ thống máy tự động được sử dụng phổ biến thay thế cho các
phương pháp cấy trên môi trường lỏng hay chai cấy máu 2 pha.
Tại khoa Vi sinh của bệnh viện đang sử dụng cấy máu BactecTM FX được thiết kế để phát
hiện nhanh vi khuẩn và nấm trong các mẫu bệnh phẩm. Mẫu được lấy từ bệnh nhân và tiêm
trực tiếp vào chai cấy máu BACTEC, sau đó được ủ trong máy. Một số các tính năng và
ưu điểm của máy là:
- Hệ thống trực quan giúp giảm thiểu thời gian thao tác khi trong máy tích hợp cả màn hình
cảm ứng LCD, bộ phận đèn chỉ báo trạng thái và máy quét code ở các vị trí thuận tiện.
- Thiết kế đơn giản giúp cho thao tác dễ dàng, không ảnh hưởng đến người thực hiện.
- Hệ thống luôn theo dõi tình trạng của chai cấy máu mỗi 10 phút trong suốt 24 giờ mỗi
ngày.
- Các kết quả dương được phát hiện nhanh và được thông báo theo 3 cách khác nhau: phát
ra âm thanh báo hiệu, hiển thị trên màn hình của máy số chai cấy máu dương và hiển thị
màu đỏ trên hệ thống đèn chỉ báo trạng thái.
Hình 39: Máy cấy máu tự động BactecTM FX
40
2.2. Nguyên lý:

Nếu có sự hiện diện của vi khuẩn trong chai cấy máu thì chúng sẽ chuyển hóa chất dinh
dưỡng trong môi trường nuôi cấy, giải phóng CO2 vào môi trường. Thuốc nhuộm trong
cảm biến (sensor) dưới đáy chai phản ứng với làm điều chỉnh lượng ánh sáng được hấp thu
bởi vật liệu huỳnh quang trong cảm biến. Một máy dò ảnh (photo detector) ở mỗi trạm sẽ
đo mức phát huỳnh quang tương ứng với lượng CO2 mà vi sinh vật thải ra. Hệ thống đo và
phân tích kết quả theo các thông số được lập trình trước.
Hình 40: Nguyên lý phát hiện vi khuẩn của máy cấy máu
2.3. Quy trình thực hiện:

Bước 1: Lấy và nhận mẫu
Lấy máu tĩnh mạch bằng phương pháp vô trùng (tránh ngoại nhiễm cho mẫu).
Thể tích lấy máu chiếm 1/10 hay tối đa 1/5 thể tích môi trường cấy máu. Thông thường lấy
10 mL máu cho môi trường cấy máu có thể tích 50 mL. Đối với trẻ em, lấy khoảng 1 – 3
mL máu (1% thể tích máu cơ thể).
Cấy ngay vào chai môi trường cấy máu BACTEC PEDS Plus/F.
41
Bước 2: Nạp chai cấy máu vào máy

- Kéo ngăn nạp mẫu còn trống.
- Quét mã vạch (barcode) của chai cấy máu để nhận dạng. Lưu ý là chai cấy máu sẽ gồm 2
barcode: code chỉ định cấy máu và code của riêng chai cấy máu được sử dụng cho BN đó
nên phải quét đúng thì máy mới ghi nhận vào hệ thống.
- Đẩy chai cấy máu vào các ô còn trống (có đèn tín hiệu xanh lá).
- Đóng ngăn nạp mẫu lại.
Bước 3: Đọc kết quả
Các chai cấy máu sẽ được máy đo kết quả mỗi 10 phút, khi có kết quả dương tính thì thiết
bị sẽ cảnh báo bằng tín hiệu đèn và âm thanh để KTV tiến hành xử lý.
Trên hệ thống máy BACTEC, ngăn nạp mẫu chứa chai dương tính sẽ có tín hiệu đèn đỏ
còn âm tính sẽ có tín hiệu đèn xanh lá và ô chứa chai cấy máu cũng có tín hiệu đèn nhấp
nháy tương tự. Quét mã vạch khi lấy chai cấy máu ra để hệ thống nhận dạng chai đã được
lấy ra và thiết lập lại tín hiệu đèn của ô đó.
Bước 4: Trả kết quả
Mẫu dương tính sẽ được cấy phân lập để định danh tác nhân gây bệnh.
Mẫu âm tính sẽ được dò lại thông tin với phiếu
chỉ định và nhập trả kết quả đến bệnh nhân.
Bước 5: Cấy phân lập và định danh các chai cấy
máu dương tính.
- Sát khuẩn nút chai cấy máu dương tính sau khi
lấy ra khỏi máy cấy máu.
- Chọn môi trường gồm CA, BA và MC.
- Ghi thông tin lên đĩa môi trường và lame để
nhuộm soi.
- Rút máu từ chai cấy dương tính.
- Nhỏ một giọt lên từng đĩa môi trường Hình 41: Thực hiện cấy phân lập và định
- Nhỏ một giọt lên lam kính, soi tươi. danh trên chai cấy máu dương tính
- Tiến hành cấy.
42
C. KÝ SINH
1. Soi tươi phân
1.1 Nguyên lý
Quan sát đại thể và dùng kính hiển vi quang học khảo sát trực tiếp mẫu phân. Soi tươi
không cần nền: là phương pháp soi tươi qua kính hiển vi đóng bớt tụ quang, với bệnh phẩm
được đặt trong một giọt nước muối sinh lý trên một lam kính, ép dưới một lamelle.
1.2 Mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm: phân. Phân nghi ngờ tả, lỏng đục như nước vo gạo, tanh. Đây là mẫu nghiệm
trọng cần thực hiện ngay.
Thời gian lấy mẫu: nên lấy vào giai đoạn sớm của bệnh trước khi dùng kháng sinh.
1.3 Các bước thực hiện
Bước 1: Lấy và nhận mẫu
Điều kiện tiên quyết cho việc hoàn thành kỹ thuật xét nghiệm là thu thập bệnh phẩm đúng
quy cách. Việc thu thập như thế nào còn tùy thuộc vào các kỹ thuật mà KTV thực hiện. Do
đó việc thu thập bệnh phẩm cần tuân thủ một số tiêu chí sau :
- Dụng cụ lấy mẫu :
+ Lọ vô trùng, không thấm nước, có nắp đậy
chặt.
+ Đầy đủ thông tin BN (tên BN, mã số, tuổi,
giới tính) và phù hợp với phiếu chỉ định xét
nghiệm.
- Mẫu bệnh phẩm :
+ Không lẫn đất, cát hoặc nước tiểu.
Hình 42: Chuẩn bị các dụng cụ làm lame soi phân
+ Phải đủ để xét nghiệm (từ 5 – 150 gram).
+ Vận chuyển đến PXN càng sớm càng tốt (không quá 2 giờ).
Bước 2: Khảo sát đại thể:
Quan sát mẫu phân và ghi nhận tính chất của mẫu vào phiếu xét nghiệm:
– Trạng thái: lỏng đục hay đặc/ có nhầy và máu.
– Màu sắc: vàng, nâu đen, trắng, đục như nước vo gạo.
43
– Có ký sinh trùng, giun hay đốt sán ...

– Mùi: tanh, hôi ...
Đánh giá tính chất của phân định hướng cho xét nghiệm:
– Phân nghi ngờ tả: phân lỏng, trắng đục như nước vo gạo, có mùi rất tanh.
– Phân nghi ngờ Cryptosporidium: phân nhão mịn vàng, phân của người có tình trạng suy
giảm miễn dịch, phân của bệnh nhân AIDS.
– Phân có chứa bọt nghi ngờ có thể hoạt động của Giardia.
– Phân có chứa máu nghi ngờ có thể hoạt động của Amip.
– Phân đàm máu: nghi ngờ nhiễm trùng vi khuẩn Shigella, Salmonella.
– Khi nghi ngờ có đơn bào nên lấy ở phần có máu, mũi nhầy.
– Muốn phát hiện giun sán nên lấy ở rìa cục phân.
– Trùng roi, trùng lông nên lấy ở vùng phân có bọt.
Bước 3: Chuẩn bị tiêu bản
Dùng bút chì sáp hoặc bút lông ghi thông tin BN (tên, mã số BN,...) lên đầu lame kính để
phân biết, tránh nhầm lẫn giữa các mẫu bệnh nhân với nhau.
Nhỏ một giọt nước muối NaCl 0,9% lên giữa lame kính.
Dùng que tre, gỗ lấy mẫu phân (to bằng đầu que diêm) đánh tan đều trong giọt nước muối
đến khi có màu đục là được, tuy nhiên cần lưu ý :
- Khi nghi ngờ có đơn bào nên lấy ở phần có máu, mủ nhầy.
- Muốn phát hiện giun sán nên lấy ở rìa mẫu phân.
- Trùng roi, trùng lông nên lấy ở vùng phân có bọt.
Hình 43: Nhỏ nước muối NaCl 0,9% và đánh tan đều mẫu phân trong giọt nước muối
44
Đậy lamelle lên phết vừa làm. Cầm miếng lamelle ở 2 cạnh, cho cạnh tiếp xúc với phết
phân vừa thực hiện và hạ nhẹ xuống miếng lame kính, như vậy sẽ tránh có bọt khí trong
phết phân.
Không làm phết quá dày sẽ làm che lấp các mục tiêu cần quan sát hoặc quá mỏng sẽ khó
tìm các mục tiêu.
Hình 44: Đậy lamelle
Bước 4: Khảo sát vi thể:

Soi phân: soi tươi tất cả các mẫu có chỉ định soi phân và các mẫu có chỉ định cấy phân
nhưng nghi ngờ phân có tả hoặc có Cryptosporidium.
Nhỏ một giọt nước muối sinh lý 0.85% lên một lam sạch đã đánh số thứ tự, dùng que sạch
lấy một lượng phân tương đương với đầu que diêm (chú ý phần nhầy máu) rồi trộn hoà đều
vào giọt nước muối trên lam kính, đến khi có màu đục là được.
Đậy lamelle lên bằng cách đặt nghiêng một cạnh lamelle xuống trước, từ từ hạ lamelle
xuống sao cho dung dịch không tràn, không bọt.
Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, sau đó chuyển sang vật kính 40X, soi theo hình
chữ chi từ phải sang trái, từ trên xuống dưới tìm hình ảnh di động của tả, hồng cầu, bạch
cầu, tất cả trứng giun sán, giun và đơn bào đường ruột, nấm men, hạt mỡ, sợi cơ có trong
mẫu phân
1.4 Diễn giải kết quả và báo cáo:
Quy định ghi kết quả soi trứng ký sinh, hồng cầu, bạch cầu... ở vật kính 40X như sau:
Bảng 7: Quy định ghi kết quả khi đọc lame phân
Kết quả đọc Ghi kết quả

Có 1 đến 2 trứng hay hồng cầu, bạch cầu,... trong 1 vi trường +
Có 3 đến 5 trứng hay hồng cầu, bạch cầu,... trong 1 vi trường ++
45
Có 6 đến 20 trứng hay hồng cầu, bạch cầu,... trong 1 vi trường +++
Có > 20 trứng hay hồng cầu, bạch cầu,... trong 1 vi trường ++++
Không có trứng hay hồng cầu, bạch cầu,... Âm tính
Dưới đây là một số hình ảnh trong quá trình soi phân:
Hình 45: Giun lươn, ấu trùng giai đoạn 1 Hình 46: Nấm men
Hình 48: Trichomonas hominis Hình 47: Giardia lamblia, thể bào nang
46
Ngoài các ký sinh trùng thì trong soi tươi phân còn phải ghi nhận sự hiện diện của sợi cơ
và hạt mỡ để biết được tình trạng tiêu hóa của bệnh nhân, đặc biệt là trẻ nhỏ, có tốt không.
Hình 50: Hạt mỡ Hình 49: Sợi cơ
2. Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA)

2.1. Mục đích:
Hiện nay, nhờ sự hỗ trợ của các thiết bị y tế hiện đại mà việc xét nghiệm chẩn đoán nhiễm
các KST như giun, sán hay đơn bào được thực hiện bằng kỹ thuật ELISA tự động trên máy
Immunomat – Virion/Serion (Đức).
Xét nghiệm này giúp phát hiện định tính kháng thể IgG kháng các loại giun, sán hoặc đơn
bào trong mẫu huyết thanh hoặc huyết tương người và chỉ được sử dụng bởi KTV đã được
huấn luyện.
Hình 51: Máy xét nghiệm Immunomat – Virion/Serion
47
2.2. Nguyên lý:

- Các loại giếng được thiết kế phủ sẵn kháng nguyên của những KST cần quan tâm. Trong
bước ủ đầu tiên với huyết thanh của bệnh nhân, nếu có bất kỳ kháng thể nào thì chúng sẽ
liên kết với kháng nguyên được phủ sẵn ở vi giếng.
- Tiếp theo, các giếng phải được rửa bỏ những phần không kiên kết trong mẫu và thêm
enzyme liên hợp vào. Nếu có bất kỳ kháng thể nào hiện diện ở vi giếng thì enzyme liên
hợp sẽ giữ lại.
- Sau khi rửa lần 2, chất tạo màu (tetramethylbenzidine hoặc TMB) được thêm vào. Với sự
hiện diện của enzyme liên hợp, peroxidase xúc tác sử dụng peroxide để chuyển hóa chất
tạo màu từ không màu thành màu xanh.
- Thêm chất dừng phản ứng vào sẽ làm màu xanh chuyển sang màu vàng.
- Đọc kết quả ở bước sóng 450/ 650-620 nm.
2.3. Hóa chất/ sinh phẩm:
Các hóa chất được cung cấp cùng với bộ xét nghiệm:
- Khay vi giếng: chứa kháng nguyên của KST cần xét nghiệm gồm 96 giếng trong một
khung giữ thanh vi giếng.
Hình 52: Các khay vi giếng được đựng trong túi kín
- Enzyme liên hợp: 1 lọ chứa 11 mL protein A liên hợp với peroxidase.

- Chứng dương: một lọ chứa 1 mL huyết thanh thỏ dương tính pha loãng.
48
- Chứng âm: một lọ chứa 1 mL huyết thanh người âm tính pha loãng.
- Chất tạo màu: 1 lọ chứa 11 mL chất tạo màu tetramethylbenzidine (TMB).
- Dịch rửa đậm đặc 20X: 1 chai chứa 25 mL đệm đậm đặc và chất hoạt động bề mặt.
- Đệm pha loãng: 2 lọ chứa 30 mL dung dịch protein đệm.
- Dung dịch dừng phản ứng: 1 lọ chứa 11 mL dung dịch 1M acid phosphoric.
1 2
3 4
Hình 53: Các hóa chất cần thiết cho xét nghiệm
(1): Chứng âm (trái) và chứng dương (phải)
(2) Enzyme liên hợp (phải) và chất tạo màu (trái)
(3) Dung dịch đệm pha loãng (trái) và dung dịch dừng phản ứng (phải)
(4) Các hóa chất được đặt vào các khay
49
2.4. Mẫu bệnh phẩm:

- Bệnh phẩm: 3 mL máu chứa trong ống nắp đỏ, có hạt, không chứa chất chống đông.
- Nếu mẫu máu không xét nghiệm ngay phải ly tâm tách lấy huyết thanh/ huyết tương để
trong tủ lạnh 2 oC-8oC. Nếu thời gian lưu trữ quá 2 tuần thì mẫu thử phải được lưu ở -20
o
C. Các mẫu này phải được làm tan đông ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
2.5. Nội dung thực hiện:
- Trước khi thực hiện xét nghiệm thì phải kiểm tra xem các hóa chất và chứng có đủ cho
lần thực hiện xét nghiệm đó không. Khi đã chuẩn bị xong thì tiến hành nạp hóa chất vào
máy sau đó tới mẫu.
- Bẻ số lượng giếng cần thiết (2 giếng chứng + số lượng mẫu) cho mỗi loại KST và đặt
trong khung giữ thanh vi giếng theo đúng thứ tự và số lượng.
Hình 54: Xếp các giếng vào khung theo đúng thứ tự hiển thị trên màn hình hệ thống
- Cho khay đã chứa giếng vào máy. Từ đây trở đi thì các thao tác đều được thực hiện tự
động bên trong máy Immunomat.
- Pha loãng tự động mẫu xét nghiệm theo tỷ lệ 1:64.
 Bước 1: pha loãng 1:21, hút 620 µL dung dịch pha loãng + 30 µL mẫu bệnh phẩm.
 Bước 2: pha loãng 1:64, hut 175 µL dung dịch pha loãng + 80 µL dung dịch đã
pha loãng 1:21.
- Thêm 100 µL chứng âm vào giếng số 1, 100 µL chứng dương vào giếng số 2 và 100 µL
mẫu bệnh phẩm đã pha loãng vào các giếng còn lại. Do chứng âm và chứng dương được
cung cấp đã được pha loãng trước đó nên không cần pha loãng thêm nữa.
50
- Đưa khay vào buồng ủ lần 1, nhiệt độ ủ là 15-25oC trong 10 phút.

- Rửa 5 lần với 350 µL đệm rửa đã pha loãng.
- Thêm 100 µL liên hợp vào mỗi giếng, lắc 10 giây.
- Đưa khay vào buồng ủ lần 2, nhiệt độ là 15-25oC trong 10 phút.
- Rửa 5 lần với 350 µL đệm rửa đã pha loãng.
- Thêm 100 µL chất tạo màu (TMB) vào mỗi giếng, lắc 10 giây.
- Đưa khay vào buồng ủ lần 3, nhiệt độ là 15-25oC trong 10 phút.
- Thêm 100 µL dung dịch ngừng phản ứng và lắc 10 giây.
- Đưa khay vào buồng đọc kết quả.
- Đọc tất cả các giếng tại 450/ 620-650 nm.
- Kết quả control đạt:
 Chứng âm: ≤ 0.3
 Chứng dương: ≥ 0.5
- Kết quả mẫu:
 Dương tính: kết quả đọc độ hấp thụ cao hơn hoặc bằng 0.3 đơn vị OD.
 Âm tính: kết quả đọc độ hấp thụ thấp hơn 0.3 đơn vị OD.
51
TỔNG KẾT
Trải qua khoảng thời gian 4 tuần thực tập học phần vi-ký sinh tại bệnh viện Nhi Đồng 2 đã
tạo điều kiện cho em tìm hiểu thêm về các chuyên ngành vi – ký sinh cũng như vận dụng
những kiến thức mà mình đã học được vào thực tiễn.
Nhờ có đợt thực tập này mà em có cơ hội được tham gia vào các công việc trong một phòng
xét nghiệm vi – ký sinh. Trong quá trình làm việc đó, em cũng học hỏi được cách vận hành
phòng xét nghiệm, cách thức làm việc và tác phong của một người KTV khi làm việc tại
phòng xét nghiệm là như thế nào. Dưới sự hướng dẫn tận tình của những anh chị KTV thì
em đã học được nhiều kiến thức mới và có được những kinh nghiệm quý báu để em định
hướng nghề nghiệp cho bản thân sau này.
Bên cạnh đó, không thể không cảm ơn các thầy cô thuộc bộ môn Xét nghiệm vì đã tạo điều
kiện cho chúng em được thực tập tại các bệnh viện chất lượng và bệnh viện Nhi Đồng 2
thật sự đã cho em có được một trải nghiệm thực tập vô cùng bổ ích.
Những gì em tích lũy được trong kỳ thực tập này được thể hiện qua bài báo cáo này của
em. Trong xuyên suốt bài báo cáo, có thể sẽ không tránh khỏi những thiếu sót nên em rất
mong nhận được ý kiến đóng góp từ các thầy cô để bài viết của em được hoàn thiện hơn.
52
ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN

..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
53
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ môn Ký sinh trùng Y học Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch (2017). Ký sinh trùng
Y học giáo trình thực tập, Nhà xuất bản Y học.
2. Bộ môn Ký sinh trùng Y học Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch (2017). Ký sinh trùng
Y học giáo trình đại học, Nhà xuất bản Y học.
3. Bộ môn Vi sinh Y học Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch (2015), Bài giảng Vi sinh Y
học, Lưu hành nội bộ.
4. Bộ môn Xét nghiệm Đại học Y dược TP.HCM (2017). Kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh Y
học, Nhà xuất bản Y học.
5. Tài liệu hướng dẫn sử dụng kit ProDectectTM test nhanh COVID-19 của nhà sản xuất.
6. Tài liệu hướng dẫn sử dụng kit Determine HIV 1/2 của nhà sản xuất.
7. Tài liệu hướng dẫn sử dụng kit H. pylori Ab của nhà sản xuất.
8. Tài liệu hướng dẫn sử dụng kit SD Bioline HIV 1/2 3.0 của nhà sản xuất.
9. Tài liệu hướng dẫn sử dụng máy BD Phoenix M50 của nhà sản xuất.
10. Tài liệu hướng dẫn sử dụng máy cấy máu tự động BD BactecTM FX của nhà sản xuất.
11. Tài liệu hướng dẫn sử dụng máy Immunomat của nhà sản xuất.
54

Trần Khải Văn Bctt Vikysinh

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Trần Khải Văn Bctt Vikysinh

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA PHẠM NGỌC THẠCH

Khoa Điều dưỡng – Kỹ thuật Y học

BÁO CÁO THỰC TẬP

Môn học: KTXN1: Vi sinh – Ký sinh

TP. HỒ CHÍ MINH – 2022

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ đầy đủ Nghĩa tiếng Việt

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

MỤC ĐÍCH CỦA BÁO CÁO THỰC TẬP

Hình 2: Bệnh viện Nhi Đồng 2 hiện nay

1.2. Chức năng và nhiệm vụ

Hình 3: Sơ đồ tổ chức khoa Vi sinh

Phòng nuôi cấy vi khuẩn

Hình 4: Sơ đồ phòng Vi sinh tầng trệt

Phòng sinh học phân tử

Phòng hành chính

Hình 5: Sơ đồ phòng Vi sinh tầng 1

3. Cảm nhận về đơn vị thực tập

Hình 6: Kỉ niệm với các anh chị trong khoa Vi sinh

Hình 7: Que cấy 10µL (vàng) và que cấy 1µL (xanh)

- Môi trường nuôi cấy.

Hình 8: Môi trường MC (1), BA (2), BCP (3) và SAD (4)

Hình 9: Môi trường SS (trái) và HEK (phải)

Môi trường Công dụng

Bệnh phẩm Môi trường lựa chọn Lưu ý

Hình 10: Phương pháp cấy 4 chiều

Hình 11: Phương pháp cấy định lượng

Loại tủ ấm Loại môi trường

Hình 12: Tủ ấm thường (trái) và tủ ấm CO2 (phải)

2. Kỹ thuật nhuộm Gram

Hình 13: Cấu tạo vi khuẩn Gram dương và Gram âm

- Bút sáp, lame kính và que cấy.

Hình 14: Lame đã được cố định

Hình 15: Nhuộm và rửa Crystal Violet

Bước 4: Phủ Lugol lên phết nhuộm và để yên trong 1 phút.

Hình 16: Nhuộm và rửa Lugol

Hình 17: Tẩy màu phết nhuộm bằng cồn

Bước 7: Phủ Safranin lên phết nhuộm và để yên trong 1 phút.

Hình 18: Nhuộm và rửa Safranin

- Tính chất bắt màu Gram:

Hình 20: Máy nhuộm Gram tự động PREVI Color

3. Kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen (nhuộm kháng acid)

Hình 21: Hóa chất dùng trong nhuộm Ziehl-Neelsen

- Dung dịch sát khuẩn phenol 5% hoặc Javen 0,5%.

Bước 5: Đọc tiêu bản

Hình 22: Sơ đồ tóm tắt quy trình nhuộm Ziehl-Neelsen

3.5. Diễn giải và báo cáo kết quả:

Số lượng AFB Trả lời kết quả

3.7. Lưu ý (cảnh báo):

II. Test nhanh

Hình 24: Bộ kit test nhanh COVID-19

1.2. Nguyên lý:

+ Kháng thể đa dòng đề kháng IgG chuột được dòng chảy

Hình 26: Tóm tắt quy trình test nhanh COVID-19

Hình 27: Cách đọc kết quả test nhanh

2.2. Nguyên lý:

Đậy nắp và lắc

Nhỏ 2 giọt dung

Hình 29: Tóm tắt quy trình test nhanh H. pylori

3.2. Nguyên lý:

SD Bioline HIV 1/2 3.0 Determine HIV ½

3.3.3. Đọc kết quả: