การทดลอง

เรื่อง การศึกษาสิ่งมีชีวิตในอาณาจักรมอเนอรา
Present
Let's Go!
การย้อมแกรม
แบคทีเรีย
 วัสดุ/อุปกรณ์
วัสดุ/อุปกรณ์
1.แผ่นสไลด์
2.หลอดหยด
3.ตะเกียงแอลกอฮอล์
4.บีเกอร์
5.ห่วงถ่ายเชื้อ
6.น้ำกลั่น
7.ไฟแช็ก
8.กระดาษทิชชู
สารที่ใช้ 9.กล้องจุลทรรศน์
1.Cystal violat 2.Safranin o 10.Bacter E.coli
3.Iodine 4.แอลกอฮอล์ 95% 11.Bacteria staphyloc
 วิธีการทดลอง
1. ทําความสะอาดสไลด์และเช็ดให้แห้ง
 วิธีการทดลอง
2. เตรียมรอย smear และตรึงเซลล์ด้วยความร้อน
 วิธีการทดลอง
3. หยดสี crystal violet ให้ท่วมรอย smear ทิ้งไว้นาน 1 นาที
 วิธีการทดลอง
4. เทสีที่เหลือค้างบนสไลด์ลงในอ่างน้ำแล้วชะล้างด้วยสารละลายไอโอดีน
หลังจํากนั้นหยดสารละลายไอโอดีนให้ท่วมรอย smear และทิ้งไว้นาน 1
นาที
 วิธีการทดลอง
5.เทสารละลายไอโอดีนทิ้งแล้วชะด้วยสารละลายแอลกอฮอล์95%จนกระทั้งไม่มี
สีม่วงละลายออกมา แต่อย่าเกิน 20 วินาที แล้วล้างน้ําทันที โดยให้น้ําผ่านเบาๆ
 วิธีการทดลอง
6. ซับด้วยกระดาษซับ แล้วย้อมทับด้วยการหยดสี safranin o
ให้ท่วมรอย smear ทิ้งไว้นาน 1 นาที
 วิธีการทดลอง
7. เทสีทิ้ง ล้างด้วยน้ํา แล้วซับด้วยกระดาษซับ วางทิ้งให้แห้ง
 วิธีการทดลอง
8. นําไปตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศน์แบคทีเรียทีเป็นแบคทีเรีย
แกรมบวก จะติดสีน้ําเงิน ส่วนแบคทีเรียแกรมลบจะติดสีแดง
 สรุปผล
1.การย้อมแกรมแบคทีเรียเป็นการย้อม ด้วยสี crystal violet ซึ่งมีสีม่วงน้ําเงิน
แบคทีเรียทั้งแบคทีเรียแกรมบวก และแบคทีเรียแกรมลบจะย้อมติดสีม่วงน้ําเงิน

2.การย้อมทับด้วยสารละลํายไอโอดีน (iodine treatment) ไปจะรวมกับสี crystal violet

เกิดเป็นโมเลกุลสีขนาดใหญ่ (CV-I complex) ทําให้สีติดแน่นขึ้น

3.การล้างด้วยแอลกอฮลอล์ (ethyl alcohol 95%) ผนังเซลล์ของแบคทีเรียแกรมลบ

ซึ่งมีชั้นไขมันอยู่มาก ไขมันและสีย้อมจึงละลายออกมากับแอลกอฮอล์ แต่แบคทีเรีย
แกรมบวก และ CV-I complex ยังคงติดอยู่ในเซลล์
4.การย้อมด้วย Safranin ซึ่งมีสีแดง แบคทีเรียแกรมลบจะติดสีแดง ขณะที่แบคทีเรียแก
รมบวก จะไม่ติดสีแดงและยังคงสีม่วงของ Crystal violet เหมือนเดิม
เพราะผนังเซลล์ ของแบคทีเรียแกรมบวก มีความสามารถ ในการที่จะรับสารพวก
p-rosaniline dye เช่น Crystal Violet (CV) และหลังจากการ ตรึงสี crystal violet
ด้วย Mordanting agent ได้แก่ Gram s lodine ( I ) จะเกิดเป็นสํารประกอบ complex ที่
เรียกว่า Crystal Violet lodine complex ( CVI complex ) ให้ติดกับผนังเซลล์ของ
แบคทีเรีย
หลังจากการล้างสี ( Decolorization ) ด้วย cecolorizer agent เช่น Alcohol หรือ
Acetone Teichoic acid cross-links จะช่วยให้แบคทีเรียแกรมบวก มีความสามารถที่
จะทนต่อ decolorizer อีกทั้งยังทําให้ pore size ใน peptidoglycan มีขนาดลดลงด้วย
จึงทําให้แบคทีเรีย แกรมบวก ยังคงรักษา CVI complex ไว้ จึงย้อมแกรมแล้วติดสีม่วง
 แต่ในแบคทีเรียแกรมลบ มีชั้น peptidoglycan บางกว่า และมี cross-link
ที่หนาแน่นน้อยกว่า ทําให้ pore size มีขนาดใหญ่กว่า หรือแม้แต่หลังจากการ
ล้างสีด้วย decolorizer agent ก็ ยังคงมี pore size ใหญ่กว่าในแบคทีเรียแกรมบวก
CVI complex จึงถูกขจัดออก จากผนังเซลล์ ของแบคทีเรียแกรมลบ หลังจาก
ขบวนการ Decolorization
เมื่อมีการเติม counterstain ได้แก่ Safranin ผนังเซลล์ของแบคทีเรียแกรมลบ จึง
ย้อมติดสีแดง อย่างไรก็ตามผนังเซลล์ ของแบคทีเรียแกรมบวก ยังคงสามารถรับ
เอาสี counterstain ได้บ้าง แต่ก็ยังคงติดสีม่วงอยู่
 สมาชิก
นายวรยุทธ ชื่นสกลุลทิพย์ เลขที่ 10
นายกิตติพัฒน์ พินดวง เลขที่ 15
นางสาวฟารีดา กลมกลิ้ง เลขที่ 24
นางสาวจิราพัชร พันธุ์น้อย เลขที่ 28
นางสาวณิชารีีย์ ศรเชน เลขที่ 30
ชั้นมัธยมศึกษาปีที่ 6/5
Thank you
See you next time!