6.

ปฏิบตั กิ ารที่ 6
การทําให้ ปลอดเชือ้ และการทําลายการติดเชือ้
(Sterilization and Disinfection)
วัตถุประสงค์ เพื่อให้ นกั ศึกษาสามารถ
1. เลือกวิธีการควบคุมทําลายจุลนิ ทรี ย์ได้ อย่างเหมาะสม และทําได้ อย่างมี ประสิทธิภาพ
2. อธิบายผลของความร้ อนที่มีตอ่ แบคทีเรี ย ที่มี spore และไม่มี spore
3. เปรี ยบเทียบความสามารถในการทําลายจุลนิ ทรี ย์ของ disinfectant และ antiseptic ชนิดต่างๆ
4. ใช้ อปุ กรณ์ที่ใช้ ทําลายจุลนิ ทรี ย์ในห้ องปฏิบตั กิ ารได้

บทนํา
การควบคุมทําลายจุลนิ ทรี ย์ตา่ งๆ เป็ นสิง่ จําเป็ นอย่างยิ่งในการป้องกันการปนเปื อ้ นในขณะทําการ
ทดลอง ป้องกันการติดโรคจากผู้ป่วยและอุปกรณ์ตา่ งๆ รวมทังการแพร่ ้ กระจายของจุลนิ ทรี ย์ที่ก่อโรคใน
สิง่ แวดล้ อม การทําลายจุลนิ ทรี ย์ทกุ ชนิดรวมทัง้ spore เรี ยกว่า sterilization และการทําลายเฉพาะจุลนิ ทรี ย์
ที่ก่อโรค หรื ออาจก่อโรคที่ปนเปื อ้ นในสิง่ ต่างๆ เรี ยก disinfection
ความร้ อน รังสี และสารเคมีตา่ งๆ สามารถทําลายจุลนิ ทรี ย์ได้ ด้วยกลไกต่างๆ กันเช่นความร้ อนทําให้
โปรตีนเสียสมบัตไิ ป สารเคมีบางอย่างขัดขวางการทํางานของเอนไซม์ เป็ นต้ น

การทดลองที่ 1 ผลของความร้ อนต่อแบคทีเรี ย

วัสดุและอุปกรณ์
1. เชื ้อ Bacillus subtilis อายุ 72 ชัว่ โมง หลอดละ 3 ml1 หลอด
E. coli อายุ 24 ชัว่ โมง หลอดละ 3 ml 1 หลอด
2. Sterile test tube 5 หลอด
3. Sterile pipette ขนาด 1 ml 1 อัน
4. Nutrient agar (NA) 1 plate
6.2

วิธีทดลอง นักศึกษาทํากลุม่ ละ 1 เชื ้อ แล้ วแลกผลกัน

1. แบ่ง plate NA ออกเป็ น 6 ส่วน เขียนชื่อเชื ้อแบคทีเรี ยที่ทดสอบ และเวลากํากับดังนี ้ 0, 2, 5, 10, 15,
และ 20 นาที ดังรูป

20 0

15 2
E coli
10 5

2. ใช้ loop เผาไฟปล่อยให้ เย็น แล้ วแตะเชื ้อแบคทีเรี ย 1 loop streak บน NA เป็ นรูปฟั นปลา ส่วนที่เขียน
เวลา 0 กํากับ
3. ใช้ pipette ดูดเชื ้อแบคทีเรี ย ใส่ใน sterile test tube 5 หลอด หลอดละ 0.5 ml เขียนเวลากํากับที่หลอด
2, 5, 10, 15, และ 20 นาที
4. นําหลอดใส่เชื ้อทังหมดไปใส่
้ ใน water bath (100oC) จับเวลาตามที่เขียนกํากับไว้
5. เมื่อครบเวลา 2 นาที นําหลอดที่เขียน กํากับ 2 นาที ออกจาก water bath ใช้ loop แตะเชื ้อ 1 loop
"
streak บน NA ในช่วง 2 นาที ระวังอย่าให้ ชนกับช่องอื่นๆ • ! เ#น เ%ยว (น จน ครบ
-ก หลอด
6. เมื่อครบเวลา 5 นาที นําหลอดที่เขียน 5 นาที ไปทําเช่นเดียวกัน ทําเช่นนี ้จนครบทุกหลอด
7. ควํ่า plate NA แล้ วนําไป incubate ที่ 35oC ดูผลวันรุ่งขึ ้น บันทึกผลลงในตารางที่ 6.1

การอ่ านผล
ถ้ าแบคทีเรี ยที่ใช้ ทดสอบถูกทําลายด้ วยความร้ อน จะไม่มีแบคทีเรี ยขึ ้นบน NA ให้ เปรี ยบเทียบเวลาที่ใช้
ทําลายแบคทีเรี ย ทังสองชนิ
้ ด
3+ มีแบคทีเรี ย ขึ ้นมาก
2+ มีแบคทีเรี ย ขึ ้นปานกลาง
1+ มีแบคทีเรี ย ขึ ้นน้ อย
- ไม่มีแบคทีเรี ยขึ ้นเลย
 6.3

ตารางทึ่ 6.1 ผลของความร้ อนต่อแบคทีเรี ย

ระยะเวลาที่แบคทีเรี ยถูกความร้ อน (นาที)
แบคทีเรี ย 0 2 5 10 15 20
B. subtilis +
3 T 1 -
-
-
_

E. coli +3 -
- -
- -

การทดลองที่ 2 ผลของแสง ultraviolet (UV) ต่อ แบคทีเรี ย

วัสดุและอุปกรณ์
1. เชื ้อ E. coli 1 หลอด
2. Nutrient agar (NA) 1 plates
3. Sterile cotton swab 1 อัน
4. ตู้ UV วางอยูก่ ลางห้ องปฏิบตั กิ าร

วิธีทดลอง ให้ นกั ศึกษา 1 กลุม่ ทําเพียง 1 เวลาเท่านัน้

1. แบ่งครึ่ง NA plate และเขียนกํากับที่ก้น plate ดังรูป

ปิ ด UV ปิ ด UV
2 นาที 10 นาที

E. coli E. coli

2. ใช้ sterile cotton swab จุ่มเชื ้อ E. coli บิดกับข้ างหลอดพอหมาดแล้ วนําไป spread ให้ ทวั่ ผิว NA
3. นํา NA ในข้ อ 2 วางไว้ ใต้ แสง UV โดยเปิ ดฝา plate ครึ่งหนึง่ ให้ แบคทีเรี ยถูกแสง UV นาน 2 และ 10
นาที ตามที่เขียนกํากับไว้
o
4. เมื่อครบเวลา ปิ ดฝา plate ควํ่า plate แล้ วนําไปเข้ า incubator 35 C ดูผลวันรุ่งขึ ้น

หมายเหตุ แสง UV เป็ นอันตรายต่อผิวหนังและตา ให้ ปิด UV ทุกครัง้ ก่อนที่จะนํา plate เข้ าไปวางใต้ แสง UV
หรื อนํา plate ออกมาเข้ า incubator
6.4

การอ่ านผล
ดูจํานวนเชื ้อแบคทีเรี ยที่ขึ ้นทังสองข้
้ างเปรี ยบเทียบกัน แล้ วบันทึกผลลงในตารางที่ 6.2
3+ มีแบคทีเรี ย ขึ ้นมาก
2+ มีแบคทีเรี ย ขึ ้นปานกลาง
1+ มีแบคทีเรี ย ขึ ้นน้ อย
- ไม่มีแบคทีเรี ยขึ ้นเลย

ตารางที่ 6.2 ผลของแสง UV ต่อแบคทีเรี ย

เปิ ดนาน 2 นาที เปิ ดนาน 10 นาที
แบคทีเรี ย ไม่ถกู UV (ปิ ด) ถูก UV ไม่ถกู UV (ปิ ด) ถูก UV
E. coli +
3 + า + 3 -

การทดลองที่ 3 ผลของสารเคมีตอ่ แบคทีเรี ย

วัสดุและอุปกรณ์
1. เชื ้อ B. subtilis อายุ 24 ชม. 1 หลอด
S. aureus 1 หลอด
E. coli 1 หลอด
Pseudomonas aeruginosa 1 หลอด
2. Nutrient agar (NA) 1 plate
3. Sterile paper strip 2 แผ่น
4. Antiseptics และ disinfectants :
ยาแดง (mercurochrome)
ยาเหลือง (acriflavin)
5% Lysol
4% Savlon
5. Forceps
6. Beaker ใส่ 95% แอลกอฮอล์
7. ตะเกียงแอลกอฮอล์
 6.5

วิธีทดลอง นักศึกษาแต่ละกลุม่ ใช้ นํ ้ายาฆ่าเชื ้อ 1 ชนิด

1. เขียนชื่อเชื ้อแบคทีเรี ย และ ชื่อนํ ้ายาฆ่าเชื ้อกํากับที่ก้น plate ดังรูป

B. subtilis
S. aureus Paper strip
ชุบนํ ้ายาฆ่าเชื ้อ
E. coli
P. aeruginosa

2. ใช้ loop ที่เผาไฟแล้ ว จุ่มเชื ้อแบคทีเรี ย ลากบนผิววุ้น ตามเส้ นที่ขีดไว้

3. ใช้ forceps จุ่ม 95% แอลกอฮอล์ ลนไฟปล่อยให้ เย็นแล้ วคีบ paper strip จุ่มนํ ้ายาฆ่าเชื ้อให้ เปี ยกทัง้
แผ่น ค่อยๆ ลากให้ แผ่นกระดาษแตะขอบ plate ที่ใส่นํ ้ายาฆ่าเชื ้อ เพื่อไม่ให้ เปี ยกมากเกินไป
4. นําpaper strip มาวางตังฉากกั้ บรอย streak ดังรูป แล้ วใช้ forceps แตะ paper strip ให้ ตดิ กับวุ้น
5. ควํ่า plate แล้ วนําเข้ า incubator 35oC ดูผลวันรุ่งขึ ้น

การอ่ านผล
นํ ้ายาฆ่าเชื ้อจะแพร่ซมึ ออกไปรอบแผ่น paper strip ถ้ าสามารถยับยังการเติ
้ บโตของแบคทีเรี ยได้ จะ
เกิด clear zone บริ เวณรอยต่อระหว่าง paper strip และรอย streak วัดความกว้ างของ clear zone บันทึกผล
ลงในตารางที่ 6.3

ตารางที่ 6.3 ผลของสารเคมีตอ่ แบคทีเรี ย

Antiseptic/ ความกว้ างของ clear zone (mm)
disinfectant B. subtilis S. aureus E. coli Ps. aeruginosa
ยาแดง 6 5 4 9

ยาเหลือง 3 1 0 0

5% Lysol 6 5 2 1

4% Savlon 5 6 3 0
6.6

การสาธิต
1. เครื่ องมือฆ่าเชื ้อในห้ องปฏิบตั กิ าร (sterilizer)
1.1 Autoclave
1.2 Hot air oven
1.3 เครื่ องกรองแบคทีเรี ย เช่น Millipore filter
ดูรายละเอียดได้ จากหัวข้ ออุปกรณ์ทางจุลชีววิทยา หน้ า 1-3