輔仁大學化學系

分析化學(一)實驗

下學期
實驗課程表
Complex-Formation Titrations with EDTA：
Exp 1 Preparation of Standard 0.01M EDTA Solution（37E-2）
The Determination of Magnesium by Direct Titration（37E-3）
The Determination of Calcium by Displacement Titration（37E-4）
Exp 2 牛奶成分分析
Titrations with Sodium Thiosulfate：
Preparation of 0.1M Sodium Thiosulfate（37H-1）
Exp 3
Standardization of Sodium Thiosulfate Against Potassium Iodate
（37H-2）
Titrations with Potassium Bromate：
Preparation of Solutions（37I-1）
Exp 4
Standardization of Sodium Thiosulfate Against Potassium Bromate
（37I-2）
The Determination of Ascorbic Acid in Vitamin C Tablets by
Exp 5 Titration with Potassium Bromate（37I-3）
The Potentiometric Determination of Solute species in a Phosphate
Exp 6
Mixture
Exp 7 Folin-酚蛋白質濃度測定

Exp 8 Introduction to Qualitative Organic Analysis

Exp 9 Analysis of Aspirin

Reference
1. Douglas A. Skoog, Donald M. West, F. James Holler, Stanley R. Crouch, Fundamentals
of Analytical Chemistry, 8th Edition.
2. Liu Ya-Li, Experiments in Medical Chemistry.
3. Theodore E. Brown, H. Eugene LeMay, Bruce E. Bursten, Catherine Murphy, Patrick
Woodward, Matthew E. Stoltzfus, Laboratory Experiments for Chemistry：The Central

Science, 11th &13th Edition.

 Exp 1
Complex-Formation Titrations with EDTA
EDTA 錯合生成滴定
 目的
使用EDTA 並藉由直接滴定法和取代滴定法來求得溶液中金屬離子的濃度。
 原理
EDTA 溶液作為滴定劑特別有價值，因為 EDTA 與金屬離子以 1:1 的比例結合，而不管陽離
子的電荷如何。例如，銀和鋁的錯合物是通過下方反應形成的

EDTA 是一種卓越的試劑，不僅因為它與所有陽離子形成螯合物，而且因為大多數這些螯
合物對於滴定來說足夠穩定。這種的穩定性是由分子內的幾個錯合位點產生了籠狀結構，
其中陽離子被有效地包圍並與溶劑分子隔離開來。金屬/EDTA 複合物的一種常見結構如圖
17-6 所示。EDTA 與金屬形成錯合物的能力使其在食品和生物樣品中廣泛用作防腐劑。

 溶液製備
實驗步驟
1. pH 10 緩衝溶液 (足夠用於 80-100 次滴定): 將 57mL 濃 NH4OH 及 7 g NH4Cl 混和後以蒸
餾水稀釋至 100 mL。
2. Eriochrome Black T 指示劑 (足夠用於 100 次滴定): 100 mg 固體溶解於含有 15 mL 乙醇
胺及 5 mL 的純乙醇的溶液。此溶液應每兩週配製一次；儲存於冰箱可降低其變質。
 製備 0.01 M EDTA 標準溶液:
實驗步驟
1. 在 80°C 下乾燥約 4g 的純 Na2H2Y‧2H2O (Note 1) 以移除過多水分，在乾燥器中冷卻
至室溫。
2. 秤取 3.8 g 至 1 L 定量瓶中 (Note 2)，加入 600~800mL 的水 (Note 3) 並定時攪拌 (可能
花費 15 分鐘或更久的時間使其溶解)。
3. 當全部固體溶解時，以 H2O 稀釋至標線處並混合均勻(Note 4)，於 80°C 乾燥後，該鹽
的水分為原本的 0.3%，故在計算溶液的莫耳濃度時，需修正扣除之
Notes
1. W.J. Bladel 與 H.T.Knight 在 Anal. Chem, 1954,26(4),741 中說明了二鈉鹽的純化方法。
2. 必要時此溶液可以從無水二鈉鹽來製備，此重量應取約 3.6 g。
3. 製備 EDTA 標準溶液中所使用的水內必須完全無多價陽離子的存在，如果對其品質存有疑
慮，則使用前將水經陽離子交換樹脂進行處理。
4. 另一替代方案為約 0.01M 的 EDTA 溶液可以藉由與已知濃度 Mg2+溶液直接滴定來製備與標
定。
 以直接滴定法測定鎂離子的含量
反應式如下：

實驗步驟
1. 以一乾淨 500mL 燒杯裝入0.615 g七水合硫酸鎂，並以加水至 250 mL且攪拌均勻。
2. 取 25 mL 的七水合硫酸鎂溶液至 250mL 錐形瓶；加入 1~2mL pH 10 的緩衝溶液及 3~4
滴 Eriochrome Black T 指示劑。
3. 以 0.01M EDTA 滴定直到顏色從紅色變為藍色(Note1 and 2)。
Notes
1. 在滴定終點附近的顏色變換較慢，必須注意避免滴定過量。
2. 若存在其他鹼土族，會與 Mg2+一起被滴定；可藉由(NH4)2CO3 來移除 Ca2+和 Ba2+。大部分
多價陽離子一樣也會被滴定。以氫氧化物形式沉澱或掩蔽劑的使用可視需要來消除此干擾
源。
 以置換法測定鈣離子的含量
討論
鎂/EDTA 的錯合溶液對於陽離子滴定是有用的，因其會形成比鎂錯合物還要穩定的錯合物，但
沒有可用的指示劑，錯合物中的鎂離子被化學當量的陽離子分析物置換，並以鉻黑 T (Eriochrome
Black T) 作為指示劑滴定剩餘未錯合的分析物與被釋放的鎂離子。

實驗步驟
1. 製備 0.1 M Mg2+ / EDTA 錯合物 (足夠 90-100 次滴定)
將 3.72 g 的 Na2H2Y‧2H2O 置於 50 mL 蒸餾水中，加入 2.46 g 七水合硫酸鎂，並添加 2-3 滴酚酞，
接著加入足夠的 0.1 M NaOH 使溶液變成淡粉色。
Notes
1. 加入 1-2 滴鉻黑 T 至部份此緩衝至 pH 10 的溶液 ，溶液應轉變成暗紫色；加入 1 滴 0.01 M
Na2H2Y 溶液至暗紫色溶液，溶液應轉變成藍色；而加入等當量 0.01 M Mg2+ 溶液應使溶液轉
變成紅色。原始溶液的組成應用額外Mg2+或是H2Y2- 溶液調整至符合以上條件。

 滴定
1. 秤取未知物至 500 mL 燒杯中 (Note1)，以錶玻璃覆蓋。
2. 小心地加入 5-10 mL 6 M HCl，當樣品溶解後，加入 50 mL 去離子水並煮沸以移除CO2(g)
3. 燒杯冷卻後，加入 1-2 滴甲基紅，並以 6 M NaOH(aq)中和直到紅色消失。(紅→黃)
4. 將此溶液定量轉移至 500 mL 定量瓶中，稀釋至標線處，取 50 mL 進行滴定，方法如下:
(1) 加入 2mL pH 10 緩衝溶液、1 mL Mg / EDTA 溶液及 3-4 滴鉻黑 T (或是鈣鎂指示劑)。
(2) 與標準 0.01 M Na2H2Y(aq) 進行滴定，直到溶液從紅色變為藍色。
(3) 計算未知物中 Ca 含量的毫克數。
Notes
1. 樣品中需含有 150-160 mg Ca2+。
2. 此滴定本質上和 Mg2+ (aq) 的直接滴定法所遇到的干擾相同，也可用相同的方式消除。
 Exp 2
Analysis of milk
牛奶成分分析

 目的
認識牛奶成份並學習如何鑑定。
 原理
1. 牛奶的成份
全脂牛奶含有豐富的營養成份，經過處理後可得到蛋白質、脂肪、乳糖、維生素及多種礦物質等，如圖
（一）所示。

圖（一）牛奶的營養成份

(1) 蛋白質：
牛奶中含有酪蛋白（Casein）及乳漿蛋白（包括乳白蛋白及乳漿蛋白）。
(2) 脂肪：
牛奶中的脂肪酸有不少短鏈脂肪酸，很容易被消化、吸收。不飽和的脂肪酸總量為 38%，其餘
皆為飽和脂肪酸。所以在限制飽和脂肪酸的飲食中，常用脫脂牛奶代替全脂牛奶。
(3) 醣類：
牛奶中的醣類為乳糖（Lactose），乳糖的甜味不大，其不僅在小腸內可幫助乳酸菌合成維生素B群，
抑制腐敗細菌的生成，亦具有調節小腸內外滲透壓的作用。乳糖在人體中需藉小腸絨毛頂端所分泌
的乳糖酶（Lactase）將其分解，形成葡萄糖及半乳糖；而乳糖酶的分泌會隨年齡的增長而逐漸降低，
尤其是黃種人和黑種人在 3~ 5 歲時，乳糖分解能力急速下降，到了成年之後降得更低。而西方人由
於傳統性地嗜食乳品，乳糖酶的活性比東方人活絡得多。如果乳糖酶的能力已經退化消失，就無法
再分解牛奶中的乳糖，而未被吸收的乳糖到了大腸會被細菌分解為有機酸及氣體。有機酸會刺激腸
壁，加速大腸蠕動而引起腹痛，並且使糞便有酸味。而大腸中產生的氣體，則會使腹部膨脹、腹鳴，
這就是乳糖不耐症（Lactose intolerance）。而市面上所謂低乳糖鮮奶，就是在鮮乳製造過程中多加
了乳糖酶，使部分乳糖先行分解，讓乳糖不耐症者易於吸收。
(4) 維生素：
牛奶是維生素 B2 的最主要來源，而維生素 B2（分子式 C17H20N4O6）是人體必需的 13 種維生素之
一，微溶於水。除此之外牛奶也含有維生素 A、B1、B6 及 B12。
(5) 礦物質：
牛奶中含大量的鈣，若常飲用牛奶，較易達到人體對鈣的需要量。牛奶中磷的量恰與鈣成一比例，
最適合骨骼生長。除此之外，牛奶中尚含鈉、鉀及鎂。但牛奶缺少鐵，其含量比母奶少，所以用牛
奶餵哺嬰兒，應該在奶粉配方中添加鐵質，防止貧血。

2. 牛奶成份的分離與鑑定
(1) 雙脲試驗（Biuret test）→ 鑑定乳白蛋白、乳球蛋白、酪蛋白。
三胜肽以上的胜肽和蛋白質中皆含雙脲結構。當待測液中含有蛋白質或胜肽時，以鹼性硫酸銅稀溶
液處理，會形成粉紫紅至深紫紅色的錯合物。

其反應如下：

(2) 鈣離子的鑑定 → 以取代滴定法測定牛奶中鈣的含量。

 藥品與實驗器材
1. 50 mL低脂牛奶 10. 125 mL錐形瓶
2. 50 %醋酸 11. 加熱板
3. pH-10 buffer 12. 溫度計
4. Eriochrome Black T（EBT） 13. 滴定管及管架
5. 0.01 M EDTA 14. 水流抽氣機
6. 95% EtOH 15. 抽濾漏斗
7. 0.1 M NaOH 16. 抽濾瓶
8. 0.2 M 硫酸銅 17. 濾紙
9. 10 mL、100 mL量筒 18. 錶玻璃
 步驟
1. 量取 50 mL 的牛奶並秤量其重量，倒入 125 mL 的錐形瓶。
2. 將含有牛奶的錐形瓶置於水浴中加熱至40°C，一邊攪拌一邊逐滴加入50%醋酸至絮狀乳白色
沉澱不再增加為止（約 1 mL）
3. 冷卻至室溫後過濾，保留濾液及濾餅。
濾液
4. 量取 10 mL 濾液，加入 2 mL pH-10 buffer、1 mL Mg/EDTA、0.5 mL 6M NaOH及3～4滴 EBT
指示劑，以0.01 M EDTA 滴定至溶液顏色由紅變藍，記錄體積。

濾餅
5. 將濾餅倒入裝有 25 mL 95% EtOH 的容器中，均勻攪拌後以抽氣方式過濾。
6. 將過濾後的酪蛋白沉澱物展開在錶玻璃上乾燥並秤重，計算出酪蛋白在牛奶中的重量百分
比。
7. 取10～20 mg 的酪蛋白，接著加入 2～3 mL 的 0.1 M NaOH 及 10 滴 0.2 M 硫酸銅溶液
→紫色錯合物。
 Exp3
Titrations with Sodium Thiosulfate
以硫代硫酸鈉進行滴定

 目的
以硫代硫酸鈉滴定碘分子，並利用澱粉為指示劑進行標定。
 原理
許多方法都是基於碘離子的還原特性:
－ －
2I → I2 + 2e

化學反應中的產物--碘離子通常會以硫代硫酸鈉標準溶液搭配澱粉指示劑進行滴定:

I2+ 2S2O32 → 2I + S4O62

－ － －

硫代硫酸鈉對碘酸鉀的標準化
硫代硫酸鈉溶液可以方便地通過滴定在已知體積的酸化標準碘酸鉀溶液中加入未測量過量的碘
化鉀時產生的碘進行標準化。其化學反應式為:
－ － ＋
IO3 + 5I + 6H → 3I2 + 3H2O

請注意: 每 1mole 碘酸鹽會產生 3 mole 的碘，以下程序便是基於上述原理。

 步驟
準備 0.1M硫代硫酸鈉溶液
1. 將約 600 mL的蒸餾水煮沸 10 至 15 分鐘。
2. 將水冷卻至室溫。
3. 取 500 mL煮沸後的蒸餾水，加入約 12.5 g Na2S2O3‧5H2O 和 0.05g Na2CO3。
4. 攪拌直至固體完全溶解。
5. 將溶液移至乾淨玻璃瓶或塑膠瓶中，並存放於暗處。

準備 0.01M 碘酸鉀溶液:
1. 取1.1 g KIO3（精確到 0.1 mg）。
2. 加入200 mL蒸餾水充分溶解固體後，將溶液稀釋至500 mL。
配置澱粉指示劑:
1. 取0.5 g starch(澱粉)，溶於5 mL蒸餾水中，攪拌均勻。
2. 加入100 mL沸水中，煮沸2 min。
滴定:
1. 吸取 50 mL 標準碘酸鹽溶液到250 mL錐形瓶中。
2. 從此步開始單獨處理每個樣品，以盡量減少碘離子在空氣中氧化造成的誤差。
3. 加入2g KI 至錐形瓶中，並搖晃錐形瓶以加速溶解。
4. 加入 2 mL 的 6 M HCl，立即用0.1M硫代硫酸鈉滴定，直至溶液變為淡黃色。
5. 加入 5 mL 澱粉指示劑，接者持續以0.1M硫代硫酸鈉滴定至藍色消失。
6. 計算碘溶液的莫耳濃度。
 Exp 4
Titrations with Potassium Bromate
與溴酸鉀進行滴定
 目的
利用溴酸鉀與碘化鉀在酸性下產生碘分子的反應，來標定硫代硫酸鈉。

 溶液製備
1. 0.015 M 溴酸鉀 (Potassium bromate): 將 0.25 g 溴酸鉀加入燒杯中，以100 mL 蒸餾水使其溶解。
*溴酸鉀固體若接觸到潮濕有機物質(如垃圾桶中的紙巾)可能會引起火災，故須向助教請教多餘溴酸鉀
的處理方式。
2. 0.1M 硫代硫酸鈉：取 300 mL煮沸後的蒸餾水，加入 7.45 g Na2S2O3‧5H2O 和0.03 g Na2CO3。
3. 3 M H2SO4：取 4.2 mL 18 M H2SO4 ，加入蒸餾水稀釋至 25 mL
4. 澱粉指示劑: 取0.5g starch(澱粉)，溶於5mL蒸餾水中，攪拌均勻，再加入100 mL沸水中，煮
沸2 min。

 硫代硫酸鈉對溴酸鉀的標定
討論
藉由已知體積的標準溴酸鉀與未測量的過量碘化鉀反應而產生碘：
BrO3 + 6I + 6H+ → Br + 3I2 + 3H2O
－ － －

用硫代硫酸鈉溶液滴定產生的碘。

實驗步驟
1. 取 25 mL KBrO3 溶液至 250 mL 錐形瓶並用蒸餾水潤洗錐形瓶內壁。
2. 加入 2 g KI 及 5 mL 3M H2SO4 (aq)後，立即與 0.1 M Na2S2O3 溶液滴定直到溶液成淡黃色。
3. 加入 5 mL 澱粉指示劑，並滴定直到藍色消失。
4. 計算硫代硫酸鈉溶液的濃度。
 Exp 5
The Determination of Ascorbic Acid in Vitamin C Tablets by Titration with
Potassium Bromate
藉由與溴酸鉀的滴定法測定維他命 C 藥片中的抗壞血酸
目的
利用碘間接滴定法定量維他命 C。

討論
抗壞血酸 C6H8O6 可藉由溴 (Br2) 完全氧化成脫氫抗壞血酸。

一未測量的過量 KBr 加入酸化的樣品溶液中，將溶液與溴化鉀標準溶液滴定至過量溴的第一次

永久性外觀，與標準硫代硫酸鈉進行碘滴定法測量此過量，整個滴定過程不可延遲，否則抗壞
血酸易受空氣氧化。

溶液配置
1. 0.015 M 溴酸鉀 (Potassium bromate): 將 0.25 g 溴酸鉀加入燒杯中，以100 mL 蒸餾水使其溶解。
*溴酸鉀固體若接觸到潮濕有機物質(如垃圾桶中的紙巾)可能會引起火災，故須向助教請教多餘溴酸
鉀的處理方式。
2. 1.5 M H2SO4：取 25 mL 18M H2SO4 ，加入蒸餾水稀釋至 300 mL
3. 0.1M 硫代硫酸鈉：取500 mL煮沸後的蒸餾水，加入12.5 g Na2S2O3‧5H2O 和 0.05g Na2CO3。
4. 澱粉指示劑: 取0.5g starch(澱粉)，溶於5mL蒸餾水中，攪拌均勻，再加入100 mL沸水中，煮
沸2 min。

實驗步驟
1. 秤取(近至毫克) 3 至 5 個維他命 C 藥片 (Note 1)，在研缽中均勻磨碎。
2. 秤取 0.30 g (四捨五入至 0.1 mg) 至乾燥的 250 mL 錐形瓶。
3. 將樣品溶於 50 mL 1.5 M H2SO4 (Note 2)，加入 5 g KBr，立即與標準0.015 M KBrO3 滴定直
到溶液變為淡黃色，紀錄 KBrO3 所加入的體積，加入 3 g KI 及 5 mL 澱粉指示劑，與 0.1 M
Na2S2O3 進行反滴定 (Note 3)，滴定至無色。
4. 紀錄維他命 C 藥片中抗壞血酸 (176.12 g/mol) 的質量 (毫克)。

Notes
1. 此方法不適用於維他命 C 咀嚼片。
2. 在分析過程中，藥片中的黏合劑可能會殘留在懸浮溶液當中，若黏合劑為澱粉，則加入KI後會
出現碘錯合物的顏色。
3. 硫代硫酸鹽所需的反滴定體積很少超過幾毫升。
 Exp 6
The Potentiometric Determination of Solute Species in a Phosphate Mixture
磷酸鹽混合物中溶質種類的電位測定

 目的
使用玻璃電極系統定位中和滴定的終點並估計解離常數。
 實驗器材
1. 250 mL 燒杯 2 個
2. 滴定管 2 支
3. 25 mL 吸量管
4. pH meter
 實驗藥品
1. 0.1M HCl
2. 0.1M NaOH
3. 0.01M H3PO4
4. 0.01M Na3PO4
 討論
未知物是由以下系列的一個或兩個相鄰成員製備的水溶液：HCl、H3PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、
Na3PO4 和 NaOH。 目的是確定這些組成成分中的哪些物質用於製備未知物以及每種溶質的重量
百分比。
大多數未知需要使用標準酸或標準鹼進行滴定。 少數可能需要單獨滴定，一種用酸，另一種用
鹼。 未知物的初始 pH 值提供了有關適當滴定的指導。滴定圖如下：

 實驗步驟
1. 首先將 pH meter 針對已知 pH 值的緩衝液進行校正。
2. 吸取100.00 mL 0.01 M Na3PO4 溶液到 250 mL 燒杯中，用蒸餾水沖洗內壁。用 0.1 M HCl，
以每0.5 mL HCl 體積記錄 pH 值，滴定至pH值不再變化。
3. 吸取100.00 mL 0.01 M H3PO4 溶液到 250 mL 燒杯中，用蒸餾水沖洗內壁。用 0.1M NaOH 滴
定，以每 0.5 mL NaOH 體積記錄 pH 值，滴定至pH值不再變化。
 Exp 7
Folin-酚蛋白質濃度測定
 目的
Folin-酚蛋白質濃度測定
將經過一系列稀釋後的蛋白質標準品（Protein standard）以 UV-Vis 檢測，對所取得之檢量
線進行蛋白質的定量分析（Quantitative analysis）。

 討論
本實驗是利用Folin-酚試劑法（or Lowry法）檢驗蛋白質，而此實驗方法為雙縮脲反應之延
伸。實驗中所用之Folin-酚試劑是由甲乙兩試劑所組成：甲試劑包含碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅
及 酒 石 酸 鉀 鈉 ， 而 乙 試 劑 （ Folin & Ciocalteu’s Phenol Reagent ） 則 是 包 含 磷 鉬 酸
（Phosphomolybdic acid, PMA）、磷鎢酸（Phosphotungstic acid, PTA）、硫酸與溴。

在鹼性條件下，甲試劑中的酒石酸鉀鈉銅鹽溶液可與蛋白質中的胜鍵（Peptide bond），產
生紫紅色錯合物（Complex）。以乙試劑處理後，蛋白質中酪胺酸的酚基將還原乙試劑，使其呈
現藍色，而其顏色深淺是與蛋白質中酪胺酸的含量呈正比。但是，乙試劑在酸性條件較穩定，
故加入乙試劑後應儘速使其反應以免磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞，因此加入乙試劑後要迅速搖勻
之，使其在極短時間內反應。

 實驗器材
(1) UV-Vis Spectrophotometer
(2) Cuvette

 溶液製備
(1) 2% Na2CO3 solution（A 試劑）
取1g Na2CO3 置於定量瓶中，以 0.1M NaOH 溶液稀釋至 50 mL，搖晃均勻後保存於塑膠瓶中
(2) 1% CuSO4·5H2O solution（B 試劑）
取 0.5g CuSO4·5H2O 置於定量瓶中，以去離子水稀釋至 50 mL，搖晃均勻後備用
(3) 2.7% KNaC4H4O6·4H2O solution（C 試劑）
取1.35g KNaC4H4O6·4H2O 置於定量瓶中，以去離子水稀釋至 50 mL，搖晃均勻後保存於塑膠
瓶中
(4) 1000 ppm 牛血清蛋白儲備液
量取 0.1g 牛血清蛋白置於定量瓶中，以去離子水稀釋至 100 mL，混勻即為 1000 ppm之儲備液
(5) 300 ppm 牛血清蛋白儲備液
以 pipette 吸取 3 mL 的 1000 ppm 牛血清蛋白儲備液加入7 mL 去離子水進行稀釋，並搖晃均勻後
備用
(6) Folin 甲試劑
取 49 mL A 試劑、0.5 mL B 試劑及 0.5 mL C 試劑置於 125 mL 錐形瓶中，搖晃均勻備用
(7) Folin 乙試劑
取3 mL 2N Folin & Ciocalteu’s Phenol Reagent 置於 20 mL 樣品瓶中，再加入 3 mL 去離子水稀
釋成 1N 後備用
 實驗步驟
(1) 準備 7 個已清洗過的 20 mL 樣品瓶，將之分別編號 1~7。
(2) 使 用 Pipette 於 7 個樣品瓶中加入如下表配製的溶液。
編號 1 2 3 4 5 6 7
牛血清蛋白（mL） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
去離子水（mL） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0

(3) 在編號 1 的樣品瓶中加入 5 mL Folin 甲試劑後，搖晃樣品瓶 1 分鐘，並靜置 10 分鐘。過程

中，在加入 Folin 甲試劑到 1 號瓶 7 分鐘後，立刻在 2 號瓶加入 5 mL Folin 甲試劑，依此類
推，每瓶 Folin 甲試劑的添加時間間隔 7 分鐘，依序完成七種濃度的樣品。
(4) 在各瓶靜置 10 分鐘後，加入 0.5 mL 的 Folin 乙試劑，迅速搖晃 1 分鐘，再靜置 30 分鐘（此
時溶液逐漸變成深藍色）。
(5) 在各瓶靜置 30 分鐘後，使用 UV-Vis Spectrophotometer，以波長 660 nm 偵測各樣品之吸收
值 3 次。
(6) 將 1~7 號瓶之樣品吸收值對濃度作圖，可獲得一條檢量線。
(7) 計算各濃度之平均吸收值和相對標準誤差（Relative Standard Deviation, RSD）。

Folin-酚蛋白質濃度測定各樣品之時間分配
編號 1 2 3 4 5 6 7

加 5 mL 甲試劑 0 7 14 21 28 35 42

搖晃 1 分鐘 1 8 15 22 29 36 43

加 0.5 mL 乙試劑 11 18 25 32 39 46 53

搖晃 1 分鐘 12 19 26 33 40 47 54

靜置 30 分鐘 42 49 56 63 70 77 84
單位：分鐘（Min）
 Exp 8
Introduction to Qualitative Organic Analysis
有機定性分析
 A. DNP Test for Carbonyl Compounds

醛或酮與 2,4-dinitrophenylhydrazine 反應產生 2,4-dinitrophenylhydrazone 沉澱或 DNP。醇類和酚類不

會與該試劑發生反應。
在 分 類 測 試 中 ， 先 將 固 體 或 液 體 未 知 物 溶 於 95% 乙 醇 中 ； 然 後 加 入 稀 釋 的 酸 性 2,4-
dinitrophenylhydrazine 溶液。如生成黃色、橙色或紅色沉澱物的表示陽性結果。如果有醛類或是無立體
障礙的酮類，通常會立即產生沉澱。如果在室溫下靜置 15 分鐘，接著再加熱 15 分鐘後，依然都沒有沉
澱生成，則該測試為陰性。
沉澱物的顏色通常可以用於辨別未知物的結構。如 hydrazones 的共軛羰基化合物（aryl or alkenyl）
為橙色，而非共轭羰基的化合物為黃色。
Limitations 高分子量脂肪族酮，如 2-octanone、2-decanone、6-nonanone 和 6-undecanone， 在測試條
件下可能無法反應，或者它們可能產生油或低熔點固體。
使用醇類可能會得到偽陽性測試，因為許多醇是通過還原醛或酮來製備的。如果醇類不純，殘餘的
醛或酮可能會得到偽陽性的結果。此外，一些 allylic 和 benzylic alcohols 可以被 hydrazines 氧化成醛或酮，
然後可以給出陽性測試。3-Phenyl-2-propen-1-ol（cinnamyl）、4-phenyl-3-buten-2-ol 和diphenylmethanol
（benzhydrol）屬於這一組。因為氧化通常在反應物被加熱時發生，所以單純在加熱測試溶液後得到的
陽性結果都是不確定的。

Experimental
*Equipment：
disposable plastic gloves droppers
hot water bath 150mm test tube
*Chemicals：
2,4-dinitrophenylhydrazine test solution，3 mL（ Notes 1）
unknown，1 drop liquid
*Compounds for Positive and Negative Tests：
Liquids： 1-butanol, benzaldehyde, acetophenone, benzyl alcohol

>>>>Safety Note
市售 2,4-dinitrophenylhydrazine 含有 10-20%的水。不要使其乾燥，因為去除水分可能導致hydrazine
爆炸。2,4-dinitrophenylhydrazin 是一種潛在的致癌物質，可被皮膚吸收，請務必戴上一次性塑膠手套。
且使用該試劑後需要徹底清洗用過的玻璃器具。
Procedure
在一個小試管中，取 1-2 滴未知液體。加入 3 mL 2,4-dinitrophenylhydrazin 測試試劑，生成沉澱物則
為陽性結果，記錄沉澱的顏色。如果沒有形成沉澱，讓測試溶液在室溫下靜置 15 分鐘（Notes 2）。如果
在時間結束後依然沒有沉澱生成，則將測試溶液在水浴(60-70℃)中加熱約 15 分鐘（Notes 3）。不要將試
劑煮沸， 因為乙醇的損失可能導致試劑沉澱。如果在加熱結束後沒有沉澱生成，則認為該測試為陰性。

Experimental Notes
1. Preparation of the DNP test reagent。將 3.0 g 2,4-dinitrophenylhydrazin 放入 125-mL 錐形瓶中，並加入
15 mL 濃 H2SO4。用玻璃棒攪拌，打碎任何試劑塊，直到大部分試劑溶解。接著，小心加入 20 mL 的
水，然後加入 70 mL 的 95%乙醇。最後過濾棕橙色溶液中未溶解的試劑
2. 加入幾滴水可能有助於沉澱的形成，但是不要加入太多的水，以免 hydrazin 試劑沉澱
3. 如果加熱測試溶液，則任何陽性結果都視為暫定

 B. Ceric Nitrate Test for Alcohols and Phenols

醇類或酚類在用硝酸鈰銨處理時會產生有色錯離子，且其它含氧官能團（醛、酮、羧酸基等）不會
干擾錯合物的形成，除非在 Limitations 中註明。一旦確定了有醇或酚的存在，對有色錯合物的額外測試
將使我們能夠區分醇和酚。鈰離子即使與醇錯合，也很容易還原成無色的 Ce3+，如果在有色的鈰-醇錯合
離子中加入溫和的還原劑如 dimedone，則顏色會褪色。而在酚測試中，最初的顏色是由於苯酚氧化的產
物所導致（來自 Ce4+對苯酚的作用），dimedone 對這些氧化產物的顏色沒有影響。因此，酚測試液的顏
色在加入 dimedone 後不會消失。

Limitations 單純的硝酸鈰對所有醇類和酚類的測試並不可靠，因為如果羥基化合物超過 10-12 個碳，

將無法檢測出陽性結果，或給出的顏色變化非常微弱以至於無法觀測到。由於顏色變化可能很小，因此
同時做一個空白測試，便可以清楚地和未知物比較顏色。
容易氧化的醇，例如苯甲醇，最初的橘黃色可能會變暗，然後隨著鈰離子的還原而褪色。一些容易
被氧化的化合物（furfuryl alcohol、dimedone、some unsaturated ketones…等）可能會導致測試試劑的初始
顏色褪色而沒有變暗。
容易烯醇化的化合物，例如 β-diketones 或β-keto esters，通常最初會產生深藍色隨後褪色。
 氨基醇無法檢測出陽性結果，因為鹼性的氨基會使 pH 值偏高，導致 Ce(OH)4 沉澱。
總之，醇類的陽性結果是橘色-紅色間，可能褪色也可能不會（但如果添加 dimedone 顏色應該要會
褪色）。酚類的陽性結果是一種有色的沉澱物，或加入 dimedone 後也不褪色的溶液。如果觀察到橘色-
紅色以外的褪色顏色，或 Ce4+的原始黃色單純褪色，則該測試結果為不確定的。

Experimental
*Equipment：
dropper stirring rod
100-mm test tubes
*Chemicals：
ceric nitrate test solution (Notes 1) dimedone, 10 mg
1,4-dioxane, 0.5 mL
unknown, 1-2 drops liquid
*Compounds for Positive and Negative Tests：
Liquids： 1-butanol, benzaldehyde, acetophenone, 2-chlorophenol
>>>>Safety Note
Dioxane 具有致癌性。只能在抽風櫥中使用，並在使用後徹底清洗。在某些情況下，可以用丙酮或
水代替（ Notes 2）。

Procedure
在兩根試管中分別加入 0.5 mL（約 25 滴）1,4-dioxane（Notes 2）、3 滴水和 2 滴硝酸鈰測試溶液。
接著，在兩根試管中擇一加入 1-2 滴未知物液體，而另一根試管作為空白測試。
透光將試管置於白紙上並由管口向下看溶液，可以非常仔細地比較出兩根試管的顏色。在 10 分鐘內
出現的微弱顏色變化將視為陽性結果。
在每個試管中加入幾毫克 dimedone 後，空白測試中的顏色應在混合時立即消失。而如果未知物是酚，
未知物試管中的顏色將保持不變，但如果它不是酚，則會立即褪色。

Experimental Notes
1. Preparation of the ceric nitrate test reagent。將 100 g 硝酸鈰銨加入到 250 mL 的 2N HNO3 中，並加熱至
約 50℃溶解，然後過濾任何未溶解的鹽類。（此試劑量足以進行 1000 多次測試，根據班級需要調整
用量）
2. 1,4-Dioxane（p-dioxane）通常含有雜質且會給出陽性測試，因此在得出任何結論前，先單獨使用
dioxane 進行測試。如果無法得出 dioxane 的陰性測試結果，則使用丙酮取代。（如果未知物溶於水，
可以用水代替 dioxane。）

 C. Schiff Test for Aldehydes

Schiff 測試（也稱為 fuchsin-aldehyde 測試）是由於醛與無色的 rosaniline 染料反應所產生的紫羅蘭色
或紫色產物，而酮不會進行這種反應。
無色染料的製備是由粉紅色的 p-rosaniline hydrochloride（fuchsin）染料，通過用亞硫酸處理所產生
的一種或多種 leucosulfonic acid（leuco-指無色或白色）。 其中一種可能的 leucosulfonic acid 反應方程式
如下：
 醛與無色的 Schiff 試劑發生加成反應，並生成有色產物，雖然我們只列出了一種典型的產物，但還
是可能會生成含有不同量 SO2 和 RCHO 的混合產物。

Limitations 儘管在 Schiff 測試中酮類不會產生紫色加成產物，但一些酮類確實會產生粉紅色， 這是

由於去除了來自 leucosulfonic acid 的 SO2 和再次生成原始 p-rosaniline 的關係（這種粉紅色沒有醛加成產
物的藍色調）。因為部分醛類只顯示出了微弱的紫色，因此空白測試和已知物測試應該與未知物測試同
時進行，以便更精確的比較顏色。
醛類如 o-和 p-hydroxybenzaldehydes 不會產生紫色加成產物。因此，如果未知物含有酚基，則Schiff
測試可能會給出偽陰性的結果。
溫和的鹼、胺、加熱或是長時間暴露在空氣中，都會破壞 Schiff 試劑並再次生成 p-rosaniline 的粉紅
色。

Experimental
*Equipment：
dropper
three 150-mmtest tubes
*Chemicals：
2 mL Schiff reagent, 2 mL (Note 1)
unknown, 1-2 drops of liquid
*Compounds for Positive and Negative Tests：
Liquids：1-butanol, benzaldehyde, acetophenone

>>>>Safety Note
許多 aniline 染料都可能致癌，且會被皮膚吸收，因此須採用適當的預防措施。

Procedure
將 2 mL Schiff 試劑放入試管中，加入 1-2 滴液體未知物。搖試管分散未知物，然後讓混合物靜置 10
分鐘，如果未知物不溶於試劑，請在 10 分鐘期間偶爾搖晃混合物，但不可以加熱試管。
深粉色或紫色的生成代表存在醛基，而如果沒有顏色變化（或變為亮粉色）則被認為是陰性測試結果。

Experimental Notes
1. Preparation of Schiff reagent。將 0.1g p-rosaniline hydrochloride 溶解在 100mL 的蒸餾水中，接著再加
入 4 mL 飽和 sodium bisulfite（約 4 g sulfite）。在加入亞硫酸鹽溶液後染料的顏色會褪色，此時讓溶
液靜置一小時，然後加入 1 mL 濃鹽酸，再用約 2g 活性炭將所得的亮粉色溶液去除（如有必要，用
活性炭重複處理，直至試劑無色。）。
將 Schiff 試劑存放在密閉的棕色玻璃瓶中，如果試劑在使用前變成粉紅色，則可以通過加入更
多飽和 Na2SO3 溶液和濃 HCl 溶液來褪色，然後用活性炭除色。
 E. Ferric Chloride Test for Phenols
當酚與氯化鐵相遇時，會迅速形成有色錯合離子，而醇類不會發生這種反應，因此，該測試可以用
於從醇類中區分酚類。錯合離子的顏色可以為綠色、藍色、紫色或紅色，顏色取決於許多因素，包括酚
的結構、溶劑與濃度。少量酚類形成的顏色會迅速褪色，因此，混合後應立即檢查測試溶液，且由於顏
色變化可能微弱，故應將測試溶液與空白測試進行比較。
Limitations 除酚類以外的其他化合物也可能給出陽性氯化鐵測試結果，當羰基化合物如 β-dione 或
β-keto ester，在溶液中以 5%以上的 enol 形式存在時，都有可能給出陽性氯化鐵測試結果。（硝酸鈰測試、
DNP 測試或紅外光譜皆可用於區分羰基化合物中的酚）
在OH 基團周圍具有高度立體障礙性的苯酚，例如2,6-di-t-butylphenol 或 2,4,6-tribromopheno，l可能
沒有顏色變化或顏色變化很微弱以至於無法檢測到，而其他一些酚類物質， 例如 p- hydroxybenzoic 也不
能給出陽性氯化鐵測試結果。因此，氯化鐵測試呈陰性並不一定意味著化合物不含酚基。

Experimental
*Equipment：
droppers
 100-mm test tubes
*Chemicals：
ferric chloride test reagent，1-3 drops（Notes）
methanol，about 1 mL unknown，1-2 drops of liquid
*Compounds for Positive and Negative Tests：
Liquids：2-butanol, ethyl acetoacetate, 2-chlorophenol
Procedure
首先，將 1-2 滴未知液體溶於在裝有 0.3 mL 甲醇的試管中，接著加入 2 滴水
並充分均勻混合，再加入 1 滴氯化鐵試劑，最後使用相同的步驟準備一個空白測試。如果是陽性測試結
果其顏色將從淺橘色變為綠色、紅色或紫色，但顏色變化可能很微小。
Experimental Notes
1. Preparation of ferric chloride test reagent。將 10g 六水合氯化鐵溶解在 100mL 的無水甲醇中即可製備完
成。(三氯化鐵易溶解不需要加熱)
 F. Alcohol Classification Test（The Lucas Test）
Lucas 測試的原理是透過一級醇、二級醇、三級醇與濃 HCl 和 ZnCl2 混合物（Lucas 試劑）反應速率
不同來區分彼此，通過觀察可溶於 Lucas 試劑的醇何時產生不溶於試劑的產物（the alkyl chloride），即
可確定反應的相對速率。

Lucas test。在 Lucas 測試中，將未知醇類與 Lucas 試劑混合並記錄反應的時間。一級醇在 5-10 分鐘

內不會表現出明顯的反應；二級醇在 1-5 分鐘內會開始發生反應，並且在大約 10 分鐘後會顯示出分層；
而三級醇通常在混合後會立即開始反應。由於測試中可能產生誤差，例如 Lucas 試劑的活性
（Notes 2），因此，在做未知醇測試時應該與二級醇（2-butanol）同時進行，並比較兩者的反應時間。
Limitations 醇在分類測試的主要限制是未知醇必須可溶於測試試劑，第二個限制是必須可以形成共
振穩定的 benzylic 和 allylic alcohols（1°、2°或 3°）碳陽離子中間體，讓測試試劑快速發生反應， 就像三
級醇一樣。

Experimental
*Equipment：
five droppers hot water bath
six 100-mm test tube spatula
thermometer
*Chemicals：
2-butanol，5 drops
t-butyl alcohol，5 drops
conc, hydrochloric acid，3 mL Lucas reagent（Notes 1），3 mL
unknown，5 drops of liquid for each test
*Compounds for Positive and Negative Tests：
Liquids：1-butanol，2 butanol，t-butyl alcohol, benzyl alcohol
Procedure
將 1 mL 的 Lucas 試劑分別放入兩個試管中，並將溫度調節至 26-27℃，必要時可使用溫水浴。接著，向
一個試管中加入 5 滴 2-butanol，再向第二個試管中加入 5 滴液體未知物，並用刮刀均勻混合，最後，記
錄混合初始時間，及每個試管內混合物變混濁的時間。對於2-butanol 來說反應時間應為 1-2 分鐘，其他
二級醇也應該在 1-5 分鐘內發生反應，而三級醇的反應時間會更快，一級醇則是在 10 分鐘內都不會發生
反應。
Experimental Notes
1. Preparation of the Lucas reagent。在通風櫥中將 77g 的無水 ZnCl2 溶解在 50 mL 的冰浴濃 HCl 中（注
意：溶解會放熱，並釋放出大量的氣態 HCl。）
2. 氯化鋅和 Lucas 試劑都具有極強的吸濕性，因此，Lucas 試劑最終會因吸收空氣中的水分而失去活性
 Exp 9
Analysis of Aspirin
阿斯匹林的分析
 目的
藉由酸-鹼滴定來測定阿斯匹靈的純度；熟悉反滴定分析的概念。

 實驗器材
(1) 50 mL 滴定管 2 支 (6) 250 mL 錐形瓶3 個
(2) 600 mL 燒杯 (7) 滴定管夾
(3) 鐵試管夾 (8) 加熱板
(4) 支架和環 (9) 沸石
(5) 鐵絲網

 實驗藥品
(1) 阿斯匹林（學生製備）
(2) 0.1M HCl
(3) 0.1M NaOH
(4) 0.1M KHP
(5) 95% 乙醇
(6) 酚酞指示劑

 原理
經由實驗製備的阿斯匹靈也許不是純的，其中最可能的雜質是醋酸或是水楊酸。即便是商
業市售阿斯匹靈片也不會是 100%乙醯柳酸。因為大部分阿斯匹靈片都會添加少量黏著劑，幫助其
凝聚，防止碎裂。雖然黏著劑是化學惰性且是故意添加，但仍使市售阿斯匹靈片並非百分之百
的乙醯柳酸。除此之外，環境中的濕氣會水解阿斯匹靈，長時間將阿斯匹靈暴露於濕氣中會發
覺其有醋味，正是因為乙醯柳酸的水解產物是乙酸：

在本實驗中，將藉由酸鹼滴定分析材料中乙醯柳酸的百分比。滴定是一種通過逐漸添加已
知體積的標準溶液直到判斷分析物和滴定劑之間反應完成，來確定溶液中分析物濃度的過程。
有時為了方便或必須添加過量滴定劑，再用另一試劑滴定，此種方法稱為反滴定。再該技術中，將
滴定劑添加到樣品中，並使其稍微過量，再與分析物的反應完成後，過量（未反應）試劑的量
通過用另一種標準溶液滴定來確定。因此，通過了解添加過量試劑的毫莫耳數（mmol），減去
反滴定的毫莫耳數，即可計算出樣品中分析物的毫莫耳數。

反應試劑的莫耳數＝總莫耳數－反滴定莫耳數

在低溫時，乙醯柳酸可以用鹼來中和:
如果沒有存在酸雜質，可以藉由標定完的鹼溶液來滴定測量阿斯匹靈的純度；若存在酸雜質，
阿斯匹靈滴定不只中和乙醯柳酸，還會中和其他酸雜質，因此從阿斯匹靈滴定即可求出樣品中
酸的總毫莫耳數。

酸的總毫莫耳數＝NaOH 毫升 × NaOH 濃度為

了測量樣品中乙醯柳酸的含量，利用其在高溫下與鹼的迅速反應：

此反應被稱為鹼促進水解或皂化反應。中和樣品中所有酸性物質後，加入過量鹼並提高溫度使
反應發生，而水解反應中未消耗的過量鹼，將被 HCl 反滴定測量，由此便可計算出樣品中乙醯
柳酸的莫耳數，進而求得其重量百分比。
 實驗步驟
A. 溶液製備
1. 0.1M NaOH：取1.2 g NaOH至燒杯中，溶於水稀釋至300 mL
2. 0.1M KHP：取2.04 g KHP溶於100 mL蒸餾水中
3. 0.1M HCl：取2.5 mL 12M HCl加水稀釋至300 mL
B. 標定0.1M NaOH及0.1M HCl
1. 取25mL KHP至乾淨錐形瓶中，加入2滴酚酞，以0.1M NaOH進行標定，滴定至溶液為粉紅
色，記錄滴定體積並計算NaOH標定後濃度
2. 取25mL HCl至乾淨錐形瓶中，加入2滴酚酞，以標定後的 NaOH進行標定，滴定至溶液為
粉紅色，記錄滴定體積並計算HCl標定後濃度
C. 阿斯匹林分析
1. 取 0.5g 阿斯匹靈至乾淨的 250mL 錐形瓶並加入 25mL 95%乙醇，將阿斯匹靈溶解後加
入2 滴酚酞指示劑。
2. 用標定後 NaOH 滴定樣品至淡粉色（中和樣品所有酸物質），並記錄使用體積。
3. 再額外加入 20 毫升標定後NaOH，使溶液過鹼。
4. 用加熱板將裝有樣品之錐形瓶放在 600mL 燒杯中熱水浴 15 分鐘，以促進乙醯柳酸水
解，裝置如下圖所示：

5. 將錐形瓶冷卻至室溫，可用水浴或冰浴。
6. 若此時溶液不為淡粉色，加入2滴酚酞指示劑及5mL標定後NaOH，再次加熱15分鐘。
7. 利用標定後HCl 溶液進行反滴定過量鹼直到淡粉色消失。
8. 紀錄 HCl 使用體積，並計算樣品中乙醯柳酸的重量百分比。
 安全注意事項
乙醇易燃。