ΜΙΧΑΗΛ ΠΙΣΤΟΛΑΣ 20211487

Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Φαρμακευτικής

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ BIO 215

ΤΙΤΛΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ: Ηλεκτροφορητικός
Διαχωρισμός Πρωτεϊνών SDS-PAGE

Εαρινό Εξάμηνο 2023

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Σκοπός της συγκεκριμένης εργαστηριακής άσκησης ήταν η κατανόηση της αρχής της
ηλεκρτοφόρησης με επακόλουθη εκμάθηση και εφαρμογή της τεχνικής SDS-PAGE για τον
διαχωρισμό πρωτεϊνών.Η ηλεκτροφόρηση είναι μια πολύ διαδεδομένη τεχνική
διαχωρισμού και ανάλυσης των πρωτεϊνών αλλά και των μακρομορίων DNA και RNA , η
οποία στηρίζεται στην κίνηση φορτισμένων μορίων εντός ενός ομοιογενούς ηλεκτρικού
πεδίου. Πιο συγκεκριμένα, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, φορτισμένα μόρια μέσα
σε υδατικά διαλύματα, κινούνται προς την κατεύθυνση του ηλεκτροδίου με το αντίθετο
φορτίο.Έχοντας ως αποτέλεσμα τα μόρια με αρνητικό φορτίο να κινηθούν προς την άνοδο
και αυτά με θετικό φορτίο προς την κάθοδο . Όσον αφορά την μέθοδο SDS-PAGE είναι η
πιο κοινή μέθοδος για ηλεκτροφορητικό ποιοτικό και ποσοτικό διαχωρισμό πρωτεϊνών και
γίνεται με τη χρήση πηκτωμάτων πολυακρυλαμίδης και κάτω από αποδιατακτικές
συνθήκες για τις πρωτεΐνες.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

Για την εκτέλεση της πειραματικής άκησης αρχικά έγινε προετοιμασία του δείγματος
χρησιμοποιόντας το πρωτεινικό διάλυμα που απομονώθηκε στην προηγούμενη
εργαστηριακή άσκηση και προστέθηκαν σε δυο διαφορετικά σωληνάκια Ependor
διαφορετικές ποσότητες πρωτείνης συγκέντρωσης 1-1,5mg/mL. Στην συνέχεια βάση της
συγκέντρωση της ολικής πρωτεΐνης που προσδιορίστηκε στο προηγούμενο πείραμα,
υπολογίστηκε η ποσότητα των πρωτεϊνών σε μg που περιέχεται στα 10 μL και 15 μL
πρωτεϊνολυμάτων. Σε κάθε σωλήνα Eppendorf προστέθηκαν 6 μL διαλύματος 4Χ Sample
buffer,και τα δείγματα τοποθετήθηκαν για θέρμανση σε θερμαινόμενο block στους 95 °C
για 3-5 λεπτά.Έπειτα για την ηλεκτροφόριση τοποθετήθηκε το πήκτωμα στις κατάλληλες
θέσεις της συσκευής της ηλεκτροφόρησης η οποία καλύφθηκε με 1Χ Running buffer, και
αφαιρέθηκε η χτένα από την πηκτή καλύπτοντας ακολούθως τα πηγαδάκια με αρκετή
ποσότητα του διαλύματος 1Χ Running buffer.Στην συνέχεια φορτώθηκαν 10 μL του
πρωτεϊνικού δείκτη στο πρώτο πηγαδάκι του πηκτώματος και ακολούθως τα βαμμένα
δείγματα σε ξεχωριστά πηγαδάκια χωρίς να τραυματιστούν.Έπειτα έγινε σύνδεση της
συσκευής ηλεκτροφόρησης με το τροφοδοτικό και ρυθμίστηκε η τάση του ρεύματος στα
200V.Τα δείγματα αφέθηκαν να τρέξουν για περίπου 40-45 λεπτά και η ηλεκτροφόρηση
τερματίστηκε όταν το μέτωπο των δειγμάτων έφτασε περίπου στο 1 cm από το άκρο του
πηκτώματος.Έπειτα αφαιρέθηκε με προσοχή το πήκτωμα απο τη συσκευή και
τοποθετήθηκε σε διάλυμα Coomassie Blue όπου αφέθηκε για 30 λεπτά. Με σκοπό την
αφαίρεση της μη-ειδικής χρώσης , από τις περιοχές του πηκτώματος που δεν περιέχουν
πρωτεΐνες, αφέθηκε στην πηκτή για 12-24 ώρες σε διάλυμα αποχρωματισμού και τέλος το
πήκτωμα φωτογραφήθηκε.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

ΠΙΝΑΚΑΣ 1

Δείγμα 1 Δείγμα 2
Πρωτεΐνη (μL) 10 15
Πρωτεΐνη (μg) 10,07 15,105

Συγκέντρωση από το προηγούμενο πρωτεϊνικό δείγμα => C=1,007M

ΑΣΚΗΣΗ 1

Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μια πολύ διαδεδομένη τεχνική η οποία αποσκοπεί στον

διαχωρισμό και την ανάλυση των πρωτεϊνών αλλά και των μακρομορίων DNA και RNA.
Η συγκεκριμένη μέθοδος στηρίζεται στην κίνηση φορτισμένων μορίων εντός ενός
ομοιογενούς ηλεκτρικού πεδίου δηλαδή, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου φορτισμένα
μόρια μέσα σε υδατικά διαλύματα, κινούνται προς την κατεύθυνση του ηλεκτροδίου με το
αντίθετο φορτίο έχοντας ως αποτέλεσμα, τα μόρια με αρνητικό φορτίο να κινούνται
ανοδικά και αυτά με θετικό φορτίο καθοδικά . Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των
διαφόρων μορίων καθορίζεται από το καθαρό τους φορτίο, το μέγεθος,το σχήμα τους αλλά
και από την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου το οποίο εφαρμόζεται. Αυτό οδηγεί στο
αποτέλεσμα διαφορετικά μόρια να κινούνται με διαφορετική ταχύτητα επιτρέποντάς τον
διαχωρισμό τους.Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε πηκτώματα πολυμερών με πιο
ευρέως χρησιμοποιούμενα τα πηκτώματα πολυακρυλαμίδης για διαχωρισμό πρωτεϊνών
και μικρών μορίων DNA και RNA και αγαρόζης για τον διαχωρισμό μεγαλύτερων μορίων
νουκλεϊκών οξέων.Τέλος αξίζει να αναφερθεί πως όσο μεγαλύτερη είναι η μάζα του μορίου
τόσο μικρότερη θα είναι η ταχύτητα με την οποία θα μετακινηθεί το μόριο στο πήκτωμα.
Συμπερασματικά η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μια ιδιαίτερα χρήσιμη τεχνική για το
διαχωρισμό ενός δείγματος στα επιμέρους συστατικά του επιτρέποντας την ανάλυση
πολύπλοκων δειγμάτων, τον έλεγχο της καθαρότητας ενός δείγματος καθώς επίσης και την
ανίχνευση προσμίξεων στο δείγμα.

ΑΣΚΗΣΗ 3

Η διαφορά μεταξύ του διαχωριστικού gel και του gel πακεταρίσματος είναι πως το
δαχωριστικό gel αποτελεί το σημείο στο οποίο γίνεται η φόρτωση των πρωτεϊνικών
δειγμάτων και βρίσκεται στο πάνω μέρος,έχοντας επίσης χαμηλότερη συγκέντρωση
πολυακρυλαμίδης 4-5%.Με την βοήθεια μιας ειδικής χτένας συμπυκνώνεται σε μια μικρή
ζώνη έχοντας ως αποτέλεσμα οι πρωτείνες που περιέχονται σε κάθε δείγμα να φτάνουν
ταυτόχρονα στο πήκτωμα διαχωρισμού. Από την άλλη το gel πακεταρίσματος βρίσκεται
κατω από το πήκτωμα πακεταρίσματος και είναι το κατεξοχήν πήκτωμα διαχωρισμού των
πρωτεϊνών, το οποίο αποτελείται από υψηλότερη συγκέντρωση πολυακρυλαμίδης (6% και
πάνω) σε σχέση με το διαχωριστικό gel.
ΑΣΚΗΣΗ 2

Η μέθοδος SDS- PAGE αποτελεί την πιο κοινή μέθοδο για ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό
πρωτεϊνών και επιτυγχάνεται με τη χρήση πηκτωμάτων πολυακρυλαμίδης και κάτω από
αποδιατακτικές συνθήκες για τις πρωτεΐνες.Αρχικά το SDS είναι ένα ανιονικό
απορρυπαντικό το οποίο προστίθεται στο αποδιατακτικό διάλυμα των πρωτεϊνών,
αποσκοπόντας στην αποδιάταξη των πρωτεϊνών μέσω της διάσπασης όλων σχεδόν των μη
ομοιοπολικών δεσμών αλλά και στο να τους προσδώσει αρνητικό φορτίο.Ένα μόριο SDS
προσδένεται ανά 2 αμινοξέα της πρωτεΐνης με αποτέλεσμα το σύμπλοκο που
δημιουργείται να αποκτά ένα ισχυρό αρνητικό φορτίο. Το αποδιατακτικό διάλυμα περιέχει
επίσης αναγωγικά αντιδραστήρια με πιο σύνηθες τη β-μερκαπτοαιθανόλη τα οποία έχουν
ως σκοπό την αναγωγή και το σπάσιμο των δισουλφιδικών δεσμών που αναπτύσσονται
ανάμεσα σε ομάδες -SH κυστεϊνών, γεγονός το οποίο διασφαλίζει την πλήρη αποδιάταξη
της πρωτείνης και την μετάβαση της στην πρωτοταγή δομή.Το αποδιατακτικό διάλυμα
προστίθεται στο πρωτεϊνικό δείγμα, και θερμαίνεται σε υψηλή θερμοκρασία με σκοπό την
επίτευξη πλήρους αποδιάταξης.Όταν το πρωτεινικό δείγμα είναι πλέον πλήρως
διατεταγμένο προτού υποβληθεί σε ηλεκτροφόρηση, ο καθοριστικός παράγοντας για το
διαχωρισμό που ακολουθεί είναι η μοριακή μάζα των πρωτεϊνών. Το πρωτεϊνικό δείγμα
κινείται στο πήκτωμα προς την θετικά φορτισμένη άνοδο με ταχύτητα αντιστρόφως
ανάλογη της πρωτεϊνικής μάζας.
Στις περισσότερες περιπτώσεις η ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE είναι ασυνεχής, το οποίο
σημαίνει ότι γίνεται σε 2 πηκτώματα, το πήκτωμα πακεταρίσματος και το πήκτωμα
διαχωρισμού τα οποία για την ηλεκτροφόρηση καλουπώνονται σχηματίζοντας ένα
sandwitch με επίπεδα τζάμια και γίνεται πολυμερισμός. Εφόσον ολοκληρωθεί ο
πολυμερισμός ακολουθεί, προσθήκη διαλύματος ηλεκτροφόρησης του οποίου ρόλος είναι
η εξασφάλιση της αγωγιμότητας του συστήματος και η ηλεκτροφόρηση ξεκινά με την
ενεργοποίηση και την ρύθμιση του τροφοδοτικού το οποίο είναι συνδεδεμένο με την
συσκευή. Αξίζει να σημειωθεί πως για την ευκολότερη παρακολούθηση της πορείας της
ηλεκτροφόρησης αλλά και της φόρτωσης των δειγμάτων στην συσκευή γίνεται προσθήκη
κυανούν της βρωμοφαινόλης το οποίο χρωματίζει μπλε τα δείγματα καθώς επίσης γίνεται
και προσθήκη γλυκερόλης η οποία αποσκοπεί στην αύξηση της πυκνότητας των
δειγμάτων. Όταν έχει ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση, το πήκτωμα αφαιρείται και
προστίθεται σε διάλυμα χρωστικής Coomassie Blue. Εφόσον γίνει η χρώση περίσσεια της
χρωστικής απομακρύνεται με την χρήση αποχρωματικού διαλύματος στο οποίο και
αφήνεται το πήκτωμα για 12-24 ώρες.Τέλος χαρακτηριστικές μπλε ζώνες εμφανίζονται στο
δείγμα, εκ τον οποίων κάθε ζώνη αντιστοιχεί σε μια πρωτείνη συγκεκριμένου μοριακού
βάρους και μέσω της χρήσης ενός πρωτεινικού δείκτη που περιέχει πρωτείνες γνωστού
μοριακού βάρους γίνεται ο υπολογισμός του μοριακού βάρους στο οποίο αντιστοιχεί κάθε
πρωτείνη των δειγμάτων.

ΑΣΚΗΣΗ 4

Τα καλύτερα αποτελέσματα ως προς την ολική πρωτεϊνική σύσταση των

κυτταροκαλλιεργειών έδωσε το δεύτερο πηγαδάκι της φωτογραφίας των αποτελεσμάτων
γεγονός το οποίο μπορούμε να αντιληφθούμε από την μετατώπιση καθώς επίσης οι
χαρακτηριστικές του ζώνες είναι περισσότερο μπλε και καθαρές από τα υπόλοιπα