CELLULÁRIS SZÍV-

ELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI
TECHNIKÁK
Dr. Virág László
Intracelluláris mikroelektród technika
Voltage clamp technika
Patch clamp technika
Intracelluláris mikroelektród technika
 Ag/AgCl
3 M KCl

Re ~ 10 - 40 MOhm

0.1 - 0.2 µm
 erısítı számítógép

ingerlı
d A/D
e
r Detektált jel
P

0mV
szervfürdı

d: ingerlı elektróda

50 mV
e: mikroelektróda
r: referens elektróda
100 ms
P: preparátum
 0 mV

50%
20 mV
APA
100 ms
Vmax

90%
RP
APD50

APD90
elıinkubáció anyag kimosás

60 perc 20-60 perc 60 perc

Két mikroelektródás voltage clamp
teszt potenciál

parancsjel
(voltage command)

holding potenciál

“makroszkópikus” nátrium-áram
A voltage clamp áramkör felépítése
Patch clamp: a voltage clamp egy
speciális esete
 Patch clamp: a voltage clamp egy
speciális esete

(1) Szívjunk be egy

kis membrán
darabot a
mikropipetta
hegyének belsejébe
(átmérı ~ 1 µm)

Sejt
 Patch clamp: a voltage clamp egy
speciális esete

(2) “Gigaohm-seal”

R > 1 GOhm

Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy
speciális esete
(3) Kapcsoljuk a
kívánt potenciálra
az elektróda
belsejét és
tartsuk konstans
értéken a voltage
clamp módszert
használva.

Sejt
 Patch clamp: a voltage clamp egy
speciális esete
(3) Kapcsoljuk a
kívánt potenciálra
zárt az elektróda
belsejét és
nyitott tartsuk konstans
értéken a voltage
clamp módszert
használva.

+ +
Sejt
 Patch clamp: a voltage clamp egy
speciális esete
(3) Kapcsoljuk a
kívánt potenciálra
az elektróda
zárt zárt belsejét és
tartsuk konstans
értéken a voltage
nyitott clamp módszert
használva.

Sejt
Nátrium csatornák tulajdonságai

parancsjel
(voltage command)

10 msec
 Nátrium csatornák tulajdonságai

1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt

állapotban vannak
 Nátrium csatornák tulajdonságai

1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt

állapotban vannak
2. A csatornanyitások csak rövid rövid
események a makroszkopikus
nátrium áramhoz viszonyítva.

“makroszkópikus”
nátrium áram
 Nátrium csatornák tulajdonságai

1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt

állapotban vannak
2. A csatornanyitások csak rövid rövid
események a makroszkopikus
nátrium áramhoz viszonyítva.
3. A csatornanyitások idıtartama és
latenciája nagyon változó és
elıfordul, hogy a csatorna ki se nyílik

“makroszkópikus”
nátrium áram
 Nátrium csatornák tulajdonságai

1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt

állapotban vannak
2. A csatornanyitások csak rövid rövid
események a makroszkopikus
nátrium áramhoz viszonyítva.
3. A csatornanyitások idıtartama és
latenciája nagyon változó és
elıfordul, hogy a csatorna ki se nyílik
4. A csatornák nyitási valószínősége
hasonló a makroszkópikus áramhoz
300 felvétel szummája

“makroszkópikus”
nátrium áram
 Nátrium csatornák tulajdonságai

1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt

állapotban vannak
2. A csatornanyitások csak rövid rövid
események a makroszkopikus
nátrium áramhoz viszonyítva.
3. A csatornanyitások idıtartama és
latenciája nagyon változó és
elıfordul, hogy a csatorna ki se nyílik
4. A csatornák nyitási valószínősége
hasonló a makroszkópikus áramhoz
5. A csatornák inaktivációja miatt a 300 felvétel szummája
másodszori nyitás nagyon ritka

“makroszkópikus”
nátrium áram
1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt
állapotban vannak.
2. A csatornanyitások csak rövid rövid
események a makroszkopikus
áramhoz viszonyítva.
3. A csatornanyitások idıtartama és
latenciája nagyon változó és
elıfordul, hogy a csatorna ki se nyílik
4. A csatornák nyitási valószínősége Slowly inactivating
hasonló a makroszkópikus áramhoz K current channel
5. A csatornák többször is (Ram & Dagan,
kinyílhatnak, ha nincs inaktiváció
1987)
 Patch clamp technika konfigurációi

On- Cell-Attached
Cell
 Patch clamp technika konfigurációi

Inside-
On- out patch
Cell
 Patch clamp technika konfigurációi

On- Whole
Cell Cell
Patch clamp technika konfigurációi

Whole
Cell
 Patch clamp technika konfigurációi

outside-
Whole out patch
Cell
 Whole cell konfiguráció

Rs

Rc Cm
Run-down jelenség

ATP-függı kálium áram

Run-down jelenség

L típusú kalcium áram

 Patch clamp technika konfigurációi

Whole Cell, perforated

Whole patch
Cell - amphotericin-B
- nystatin
Run-down jelenség
L típusú kalcium áram
Sejtizoláció

- Ca2+ - mentes perfúzió

- emésztés (kollagenáz...)
- mechanikai agitáció
 L típusú kalcium áram

400 ms
0 mV

-40 mV

200 pA
100 ms
 L típusú kalcium áram

ICa amplítúdó (pA)

0

-40 mV -35 mV

-400

-800

-1200
-40 -20 0 20 40 60
Potenciál (mV)
 L típusú kalcium áram

ICa amplítúdó (pA)

0
-30 mV
-40 mV

-400

-800

-1200
-40 -20 0 20 40 60
Potenciál (mV)
 L típusú kalcium áram

ICa amplítúdó (pA)

0
-25 mV
-40 mV

-400

-800

-1200
-40 -20 0 20 40 60
Potenciál (mV)
 L típusú kalcium áram

ICa amplítúdó (pA)

0
-20 mV
-40 mV

-400

-800

-1200
-40 -20 0 20 40 60
Potenciál (mV)
 L típusú kalcium áram

ICa amplítúdó (pA)

0
-15 mV
-40 mV

-400

-800

-1200
-40 -20 0 20 40 60
Potenciál (mV)
 L típusú kalcium áram

ICa amplítúdó (pA)

0
-10 mV
-40 mV

-400

-800

-1200
-40 -20 0 20 40 60
Potenciál (mV)
 L típusú kalcium áram

ICa amplítúdó (pA)

55 mV Áram-feszültség (I-V) karakterisztika

-40 mV

-400

-800

-1200
-40 -20 0 20 40 60
Potenciál (mV)

elıinkubáció anyag kimosás

5-10 perc 3-5 perc 10-15 perc