第一章 透射电子显微镜的原理与操作

➢ 扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)

➢ 自第一台定型的透射式电子显微镜产生后，法国卡诺尔就提出了扫描电子显微镜的
设计思想和工作原理。
➢ 到 1942 年剑桥大学首次制成世界上第一台扫描电子显微镜。
➢ 扫描电子显微镜使用范围广，并具备分辨率高、图像立体感强、放大倍率选择范围
广、样品适应性大、制样方便等优点。
➢ 70 年代已发展成为性能完善，自动化程度高，功能齐全的一种电子光学仪器。
电子显微镜种类：
➢ 电子与物质相互作用会产生透射电子、弹性散射电子、能量损失电子、二次电子、
背反射电子、吸收电子、X 射线、俄歇电子、阴极发光和电动力等等。电镜就是利用
这些信息来对试样进行形貌观察、成分分析和结构测定的。
➢ 主要分为透射式电子显微镜(简称透射电镜，transmission electron microscope，TEM)
和扫描电子显微镜(简称扫描电镜，scanning electron microscope,SEM)两大类。
➢ 扫描透射电子显微镜(简称扫描透射电镜，STEM)则兼有两者的性能。
➢ 为了进一步表征仪器的特点，还可以分以下几大类
➢ 1.以加速电压区分的：超高压(1MV)和中等电压(200-500kV)透射电镜、低电压（1kV)
扫描电镜；
➢ 生物电镜一般为 100-120kv。
➢ 2.以电子枪类型区分:钨灯丝电镜、场发射电镜。
➢ 3.以用途区分：如高分辨电镜，分析电镜、能量选择电镜、生物电镜、环境电镜、双
束扫描电镜、冷冻电镜等。
➢ 4.以激发的信息命名的，如电子探针 X 射线微区分析仪(简称电子探针)等。

图表 1 冷冻电镜技术

二、透射电镜基本原理
➢ 就最基本的原理来说，透射电镜和光学显微镜是相同的，它们的显微放大过程基本
相似，而且电镜的光路和部件术语也同光镜基本一样。不同的是，电镜的照明源不
是可见光而是电子束；透镜也不是玻璃而是轴对称的电场或磁场，并且电子显微镜
的总体结构、成像原理、操作方式等与光学显微镜有着本质上的区别。
(一)分辨本领与放大倍数
➢ 是指能够分辨物体上两点之间的最小距离。
➢ 光学显微镜的分辨极限为 0.2μm，而电镜的分辨本领可优于 2 Å ，相差达 l 000 倍，
因为影响光镜提高分辨本领的主要因素是由于光线的衍射作用。

➢ 光学显微镜的分辨本领由阿贝公式决定

➢ 式中 d 为分辨本领，λ 为照明波波长，n 为物体与物镜之间介质的折射率，α 为物体

上的点与物镜所成夹角的一半。
普通光学显微镜用油浸镜头时 n≈1.5，α<90。即 sinα<1，用可见光作照明源时，
其平均波长约为 5 000 Å，那么，它的分辨本领约为 2 000 Å。这说明光学显微镜只能
分辨大于 2 000 Å 的结构。
➢ 要提高分辨本领， 必须采用波长短的照明源。电子显微镜的照明源波长约为 0.05 Å ，
目前最好的电镜分辨本领已达 1.4 Å ，比光学显微镜提高了 1 000 多倍。
➢ 放大倍数是指物体经过仪器放大后的像与物的大小之比。放大了的像还可多次放大，
但到一定限度后继续放大时便不能增加细节，这是分辨本领的限制所致。不能增加
图像细节的放大倍数称为空放大，而与分辨本领相应的最高放大倍数称为有效放大
倍数，为眼的分辨本领与仪器的分辨本领之比。
➢ 设电镜的分辨本领 2 Å ，其有效放大倍数为

（倍）

➢ 即 100 万倍。
➢ 这个倍数可以从电镜上直接得到，也可在摄制 20 万倍的底片后再以光学放大 5 倍来
获得。因此，标示电镜性能的主要指标是分辨本领而不是放大倍数。

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 ➢ 阴极又称为灯丝 (包括钨丝、六铍化镧等)，通常用钨丝制成，通电加热后灯丝内的
自由电子热运动增加并逸出表面，在加速电压作用下，阳极相对阴极形成正电场，
逸出阴极的电子在正电场力作用下高速飞向阳极，中心部分的电子因惯性而穿过阳
极孔成为照明电子束。
(三)电子透镜及其作用
➢ 运行中的电子束只有在通过电场或磁场时才能改变其运动轨迹。轴对称的电场或磁
场可以使电子束聚焦，故称为电子透镜。
➢ 最简单的磁透镜是用线圈通电来产生磁场的。当电流通过线圈时，产生了轴上磁场，
对电子束而言，这是折射介质。一个电子从轴上 A 点出发穿过轴上磁场时，将受到
一个横向力的作用，使之沿螺旋轨迹前进，在线圈中心磁场强度增加处，螺旋直径
加大，螺距缩短、然后回到轴上 B 点。

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电磁透镜的焦距决定于磁场强度，磁场强度决定于通过线圈的电流强度。因此，可以调节激
励电流来改变磁场强度，从而达到改变放大倍数和进行图像调焦的目的。

➢ 实用的电磁透镜是在线圈外面套上铁壳作磁路，并在铁壳中心置有极靴(pole piece)，
使线圈通电后产生的磁场高度集中而又均匀地分布在极靴中心。

➢ 电子透镜的缺陷
➢ 球差---球差是由于电子透镜的中心区域和边沿区域对电子的会聚能力不同而造成的。
结果在象平面成了一个满散圆斑。
➢ 象散---磁场不对称时，就出现象差。有的方向电子束的折射比别的方向强，这样，圆
形物点的象就变成了椭圆形的漫散圆斑。
➢ 色差---电子的能量不同，从而波长不一造成的，电子透镜的焦距随着电子能量而改
变，因此，能量不同的电子束将沿不同的轨迹运动。产生的漫散圆斑还原到物平面。

➢ (四)反差与成像
➢ 在电镜中，当电子束中的电子碰到样品中的原子核时，电子轨道将偏斜一个角度，
这种相互作用的过程称为弹性散射。弹性散射的强度与样品元素的原子序数成正比，
原子序数愈高，对入射电子的散射能力就愈大。在物镜的后焦面上装一接地的光阑，
散射角度大的电子被光阑截获而除去，仅让透射电子和散射角小的电子穿过光阑孔
参与成像，从而形成反差。这个光阑孔越小(通常为 20～30μm)。被截除的散射电子
便越多，像的反差也就越好。

三、透射电镜的使用
(一)快速检查合轴
合轴的好坏直接影响着电镜的性能，所以使用前有必要对电镜的合轴进行检查。
快速检查合轴的步骤：
1. 将光斑聚到最小，降低灯丝发射电流，调出灯 丝像，检查灯丝发射是否均匀。
2.反复微量改变第二聚光镜激励电流，观察光斑是否出现椭圆形，以判断聚光镜是否有像
散。

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灯丝电流逐步增大时光斑图像变化
3．调物镜激励电流从最大到最小 (允许使用者观察电镜时调焦用的最大 钮)，反复调整，
观察光斑中心是否偏离荧光屏中心。如有偏离说明照明系统与成像系统合轴不佳。
4．放入样品聚好焦，找一标记移置荧光屏中心，然后向欠焦的方向(减小物镜激励电流的
方向)调中聚焦钮 6～8 档，
观察标记是否偏离荧光屏中心，
如有偏离说明电流中心合轴不好。

(二) 操作钮(键)参量的选择及使用方法
操作钮(键)的参量是使用者根据样品、分析、记录等要求而定。
1．加速电压值的选择 在许多电镜中，高压分为 20kV、40kV、100kV 直到 200kV，或者更
高。所以存在选择的问题。首先分析加速电压对电镜有关参量的影响。
(1)加速电压越高，电子波长越短，分辨率增高。
(2)加速电压越高，对于给定的一个样品，穿透能力越强，图像亮度提高。但振幅反差下
降。

2．放大倍数的选择
电镜的放大倍数选择范围很宽，合理地选择倍数，才能正确的对图像进行分析和记录。
(1)倍数越高，电子束流照射的样品范围越小，样品信息损失越多。
(2)倍数越高，样品上所要求的照明强度越强。倍数增加两倍，样品上的照明强度必须增
加 4 倍。由此会增大样品上的辐射损伤。
一般在满足分辨率的条件下，倍数尽可能选低些。
➢ 在实际操作中，为了减少样品受电子的照射时间，先在低倍下粗查样品全貌，选择
最合适的观察部位后再提高倍数。

3．光阑的选择
(1)聚光镜光阑孔的选择：
➢ 聚光镜光阑位于聚光镜下方。是一个多孔的可动光阑。一般三个孔，典型孔径为 lOO
μm、200μm、600μm。根据需要选择适当的光阑孔，以改变孔径角。
➢ 较薄的样品为了提高反差(位相反差)需要较小的光阑孔，使照明孔径角极小。使用较
小的聚光镜光阑孔，可减少薄样品上的辐射损伤。为兼顾诸方面的因素，实践中多
采用 200μm 的光阑孔。
(2)物镜光阑孔的选择：
➢ 物镜可动光阑位于物镜上方，是一个四孔光阑，典型孔径为 25μm、50μm、75μ
m、100μm。
➢ 选择物镜光阑孔径时，应考虑到样品的厚度。较厚的样品，散射电子角度大，反差
较好，但亮度相对减小，所以应选用较大的孔径。
➢ 较薄的样品为了提高反差选用较小的光阑孔。但太小的光阑孔容易造成污染，从而
增加了光阑的清洗次数。

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 第二章 透射电镜生物样品制备技术

标本制作过程
1. 取材
a) 动作要快，处死动物或组织离体后 30s 内将组织浸入固定液中。
b) 组织要小，大小不允许超过 1mm3。
c) 低温操作，0--4ºC 操作以降低离体细胞内水解酶活性，尽可能减少细胞自溶。
d) 避免人工损伤
e) 部位要准确可靠。由于电镜观察视野小，具有很大的局限性。
2. 固定：常用 2.5%戊二醛，2%多聚甲醛，0.1M 磷酸盐缓冲液
3. 脱水：50%、70%、80%、90%、100%梯度酒精脱水
4. 包埋：环氧树脂(常用为 Epon812)
5. 切片：半薄切片甲苯胺蓝定位，再做超薄切片，厚度 70-100nm。
6. 染色：橘缘酸铅、醋酸铀染色
7. TEM 观察：铜网染色后上电镜观察。

一、 取材（关键环节——决定样品能否符合观察要求。）
机体内酶作用下的代谢非常迅速，生物组织离体后，细胞将会立即释放出各种水解酶引
起细胞自溶，使细胞内部微细结构发生变化。这种微细结构的改变在光镜下无法看到，但电
镜下呈现明显的人工假象。
刀片
组织块
蜡板

冰块

平皿

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二、 固定：用化学法或物理法迅速杀死细胞的过程叫做固定。设法使其尽量保持接
近细胞的生活状态，减少细胞死后变化，使细胞和细胞器的精细结构完好无损得以
保存。

(一) 固定的作用：
a) 破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；
b) 能提供一定的电子反差。
c) 在一些细胞组份之间以化学和物理反应建立交联，以提供一个骨架来稳定各种细胞器
的空间构型；
d) 稳定细胞成分；如核酸、核蛋白，糖类和脂类，使之发生交联，减少或避免抽提作用，
以保存组织成分。
(二) 固定剂：在电镜生物样品制备中，常用的固定剂有四氧化锇、醛类（甲醛、多聚甲醛、
戊二醛） 、高锰酸钾等。
a) 戊二醛(C5H8O2) 是一种毒性不大的良好的固定剂，其结构式为： O=CH--CH2--CH2-CH2-
CH=O 具有两醛基，对细胞结构有高的亲和力。
i. 优点：① 单体分子小，穿透力强，固定速度快，它可突破 1mm3 样品的界限。
② 其两个醛基，在固定时以交链作用使细胞成分得以稳定。具有稳定糖元，
保存核酸、核蛋白、微管、SER、的特点，尤其对细胞膜系统和细胞基质有较
好固定作用。 ③ 经戊二醛长时间固定的材料不会变脆，变黑。适于长期保
存样品或远离实验室野外取材。 ④ 适于进行超微细胞化学研究。
ii. 缺点： ① 它对脂质不起固定作用。单使用戊二醛固定的组织脱水后大部分脂
质被抽提而丢失。因此，它不适于单独作为电镜固定剂，最好作为锇酸固定的
前固定剂使用。 ② 无电子染色作用，反差较弱。 ③ 戊二醛固定不影响细
胞的渗透性，因此对缓冲液的渗透压要求较高。
iii. 戊二醛的配制：必要时，可加无水氯化钙，或氯化镁，使最终浓度达到 1-3mM
但要注意避免形成沉淀，还可根据需要加入苦味酸等。

b) 甲醛(CH2O) ①是醛类中最简单的醛，其分子较小，渗透较戊二醛迅速。 ②虽然

甲醛对细胞精细结构的保存不如戌二醛，但在酶活性的保存方面却优于戌二醛，故甲
醛一般用于组织化学或快速固定。 ③对结构致密的种子及脆弱的脑组织有良好的固
定作用。

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 i. 用戊二醛和多聚甲醛混合作为前固定液，配制方法为：其中，10%多聚甲醛水
溶液的配制：称取 2g 多聚甲醛加入到 20mL 蒸馏水中，加热搅拌至溶解，再
加几滴新鲜配制的 1N NaOH，使溶液变得清亮。(注意:应在通风厨中操作)

c) 四氧化锇(OsO4)：俗称锇酸，属非电解质强氧化剂。
i. 优点： ① 与氮原子有极大的亲和力，故能与各种氨基酸、肽、及蛋白质
反应，和蛋白化学结合并形成交链而使蛋白质得到稳定，故此能较完好地保存
生物微细结构。 ② 与脂肪的不饱和脂肪酸链结合，形成脂肪—锇复合物。
③ 虽然它对碳水化合物保护较差,但对作为细胞支架的磷酸脂蛋白的保护很
好，还能固定核蛋白和脂蛋白。 ④ 四氧化锇中锇原子序数较高，对样品有
较强的电子染色作用，并能产生一定的电子反差。
ii. 缺点： ① 不能保护糖原，不能固定核酸，对微管固定较差； ② 分子较大，
扩散较慢,穿透力较差； ③是酶的钝化剂，不能用于细胞化学的研究； ④
固定时间不宜太长，会使组织变脆，给切片带来困难. 故固定时间以 1-2 小时
较为适宜。 ⑤ 锇酸能与乙醇或醛类产生氧化还原反应，生成沉淀。所以经
锇酸固定组织必须用缓冲液充分漂洗干净才能转入醛类或乙醇溶液中；
⑥ 毒性大，易挥发。对眼、鼻、喉等粘膜有强烈刺激作用，因此操作时必须
在防护通风罩内进行。

iii. 双固定法： 先用戊二醛固定，叫前固定。后用四氧化锇固定，叫后固定。

d) 高锰酸钾(KMnO4) 强氧化剂，对磷脂蛋白类有特别好的固定作用，可用于保护细胞的
膜性结构，但几乎不能固定细胞的其他成分,常用浓度为 0.6%。

(三) 固定方法：
a) 浸泡固定（通用固定法）
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 i. 实质性器官：切成正方体小块 1×1×1mm³。组织块被剪刀剪切或镊子夹过的
部分弃去，然后用牙签将组织小块轻轻挑起，放入装有固定液的 EP 管中浸泡
固定。也可用镊子借液体的张力移取组织块，注意不可用力夹。EP 管 4℃冰箱
中保存。

ii. 有方向性的器官：切成长方体小块（1×1×3mm³）
。

b) 灌注固定法： 适用于一些取材比较复杂，对缺氧较敏感，或较软的组织，如脑、脊
髓、甲状旁腺等。 所谓灌注固定就是将固定液通过血液循环的途径灌注到所需固定
的组织中。
i. 全身灌注-----针头-左心室-升主动脉，快速滴注生理盐水，剪右心房，待肝脏稍
变白，换滴注电镜前固定液，动物出现抽搐反射视为成功。
ii. 局部灌注-----动物过大，如猴子，很难实现有效灌注；动物珍贵，计划取不同
组织进行几种实验。

c) 培养细胞的固定
i. 单层细胞：用细胞刮子轻刮下或者胰酶消化下细胞，3000 转/分离心 15—20 分
钟，使细胞成团在离心管尖端沉淀成块。弃上清液，再缓慢加入新鲜的前固定
液（避免将细胞团冲散）。
ii. 悬浮培养的细胞或血液等：1000 转/分离心 15—20 分钟，使细胞沉淀，弃上清
液，加入前固定液，用 3000 转/分，离心 15—20 分钟，使细胞成团。若离心
后细胞不易成团，则可以于沉淀物中加几滴牛血清蛋白，或 50 度溶化的琼脂
再离心，使细胞凝集成团。

(四) 固定的注意事项
a) 浓度： 浓度较低，固定时间必须延长，这就容易引起细胞物质的抽提及组织的肿胀；
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 浓度较高容易损坏细胞结构，尤其是四氧化锇和高锰酸钾，浓度太高能使蛋白质分子
氧化而断裂。因此，固定液的浓度一定要适宜。
b) 固定液的渗透压： 低渗固定液会引起细胞器或整个细胞膨胀，而高渗固定液则容易
使细胞收缩。固定液的渗透压是通过改变缓冲液的浓度或者通过增加钠、钙和镁等电
解质或葡萄糖和蔗糖等非电解质来调节的。
c) PH 值： 固定液 PH 值必须接近所要固定组织的 PH 值。由于大部分动物组织的平均
PH 值约 7.4，所以目前固定液的 PH 值都选用中性（7.2-7.4）
。
d) 固定的温度: 前固定(戊二醛和甲醛) 在低温（4ºC 左右）固定，后固定 (锇酸) 在室
温固定，且加以振摇。
e) 每一种固定之后，要用配制该固定液的缓冲液充分漂洗（缓冲液的温度与固定液相同） ，
以除去多余的固定液，防止戊二醛和四氧化锇与后面的脱水剂（丙酮、乙醇 ）反应，
产生沉淀，影响固定效果。

(五) 良好的固定——超微结构
a) 细胞壁和细胞膜：致密并基本上分层，没有断裂。
b) 细胞质基质：微细的颗粒沉淀，没有空白的空间。
c) 内质网（粗糙型）：扁平的腔，在两侧均匀排列着核糖核蛋白体颗粒。
d) 内质网（光滑型）：有完整膜的分叉管子，没有核糖核蛋白体颗粒附于膜上。
e) 高尔基体：完整的膜，扁平囊池成叠排列。
f) 线粒体： 既不膨胀，也不收缩，外面双层膜和内脊完整，基质致密。
g) 核膜：双层膜没有损伤并基本上互相平行，二层膜厚度不等，可能有核孔。
h) 核内容物：密度均匀，有染色质团分散在核膜附近。

三、 （缓冲液）
：因细胞本身的缓冲能力有限，为了防止组织细胞在固定时微
细结构改变或破坏，固定液用缓冲液以达到以下目的： ①维持 PH 值在生理值。
缓冲液 PH 值在 7.2-7.4 时，适合大多数的动植物组织细胞；对高含水组织可在 8.0
左右，对细菌、病毒可选在 7.0 以下。 ②提供合适的渗透压，使细胞不发生肿胀
或收缩。 ③提供适宜的离子成分，使生物样品既不发生抽提，也不出现沉淀。

(一) 缓冲液种类：
a) 磷酸盐缓冲液（PBS）
： 用于电镜技术的磷酸盐缓冲液是仿效细胞外液的成分
而配制的，因其对细胞无毒性作用，故最富有生理学功能，适合各种固定液的
配制。这种固定液特别适用于灌注固定。长期保存会出现沉淀，故应新鲜配制
为宜。

i. 根据需要，按表中所列 A 液和 B 液不同配比，可得到不同 PH 值的 0.2M

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 磷酸缓冲液。
ii. 配制 0.1M 磷酸盐缓冲液,可按上述比例再加双蒸馏水至 100 ml 。PH7.2 时
的渗透压是 226 mos mols，加入 0.18M 蔗糖，可使渗透压提高到 425 mos
mols。

b) 二甲砷酸盐缓冲液

i. 容易配制，长期保存比较稳定，不易长细菌，加入低浓度的钙质（1—3mM）
不会产生沉淀，适用于作电镜组织化学研究，特别适用于作电镜放射自显
影时的固定缓冲液。
ii. 但砷有毒性，并可与固定液起反应，有臭味，配制时应在防护罩内进行。
而且不能同磷酸缓冲液作用，会起反应。
iii.

四、 脱水： 所谓脱水，指用适当的有机溶剂取代组织细胞中的游离水。因水分
的存在会使组织结构在电镜高真空状态下急聚收缩而遭破坏，还因常用的包埋剂是
非水溶性的，细胞中的游离水影响包埋剂的浸透，因此，脱水是一个很重要的步聚。

(一) 常用脱水剂：常用于电镜生物样品制备的脱水剂有乙醇、丙酮，和过渡液环氧丙烷
等。 其中，因乙醇引起细胞中脂类物质的抽提较丙酮少，且不会使组织材料变硬、
变脆，故为最常用的脱水剂。然而，乙醇不易和用于包埋的环氧树脂相混溶，为此，
在转入包埋剂前要用“中间脱水剂”－环氧丙烷过渡，它比乙醇 易与环氧树脂混
溶，且挥发快，利于后面浸透和包埋。

(二) 脱水的原则和方法： 生物样品中的水份占据着一定的空间，急聚脱水会引起

细胞收缩，必须采用“等级系列脱水法” 。所用系列浓度一般为 30%、50%、70%、
80%、90%、95%、100%。材料在每一浓度停留 10-20 分钟，室内相对湿度要在 50%
以下。 在脱水剂浓度低于 70%时，组织处于膨胀状态，高于 70%时，组织处
于收缩状态，在 70%浓度是组织体积变化最小状态。

五、 渗透和包埋： 渗透和包埋的目的是取代活组织中的水分以及支持整
个结构，以便有特定的机械性能利于切片。

(一) 理想的包埋剂特点：
a) 粘稠度低，容易渗透，聚合均一，不产生体积收缩。
b) 能耐受电子束轰击，高温下不易升华，不变形。
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 c) 对组织成分抽提少，良好地保存微细结构。
d) 本身在电镜高倍下不显示结构。
e) 切割性能良好，切片易染色，对人无害。

(二) 常用的包埋剂：甲基丙烯酸脂，环氧树脂(常用为 Epon812), Spurr 树脂水溶性包埋

剂，低温包埋剂如：LR. white Lowicryl k4M 等。
a) 甲基丙烯酸脂: ①优点：粘稠度低，容易渗透，配制、使用、保存容易，对湿
度影响不大。 ②缺点：在聚合中易引起组织损伤，在电子束轰击易升华，收
缩率大，21％左右，造成样品损伤，在电镜包埋技术早期应用，现在已很少使
用。
b) 环氧树脂(常用为 Epon812): ①优点：因其具有三维交联结构、聚合收缩率
小，2—5%左右，聚合均匀，对组织损伤小，耐电子束的轰击，对细胞微细结
构有较好的保存性能。 ②缺点：操作不方便，切片困难，染色后反差较弱，
使用时对环境湿度要求较高。
i. 聚合原理： 环氧树脂有两种化学反应基团，其结构链的两端有环氧基（2 个 C 和
1 个 O 拉紧的三角环）
，链的中间有羟基。环氧末端基团是非常容易应变的三元环，很
容易打开并与其它含活性氢原子基团特别是胺类相结合，因此，当一个胺基附加到一
个环氧树脂上时，头尾分子将联结在一起，形成一种长链聚合物，中间的羟基也能与
其它反应物，特别是酸酐联合，形成树脂分子间的横桥。
ii. 因此，若把树脂，胺和酸酐的混合物一起加热。那么将发生三维聚合作用，

即按链的长轴及横轴交联，形成一种非常稳定，含有聚脂和聚醚的抗热溶
的惰性物质。
iii. 加速剂（胺类）： 常用的是 2、4、6-三（二甲氨基甲基）苯酚，简称 DMP-
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 iv. 固化剂（酐类）： 常用十二烷基琥珀酸酐（DDSA,偏软）和甲基内次甲基
二甲酸酐（MNA,偏硬）
。 为了改善包埋块的切割性能，使其具有适当的
韧性和弹性，可通过调节 DDSA 和 MNA 的比例来调节包埋块的软硬度。

c) 水溶性包埋剂 因这种包埋剂是水溶性的，故组织材料可在其中同时脱水和
包埋，可避免使用乙醇，丙酮等对样品的抽提，能较好保存脂肪成份，但切片
时易被水溶解，最后还得用非水溶性包埋剂来包埋，由于它能使样品的生物化
学活性丧失尽可能最低程度，因此，这类包埋剂多用于组织化学和细胞化学的
研究工作。
d) 低温包埋剂 LR. white 可在 48℃——50℃聚合; Lowicryl k4M 可在-30℃
-40℃在紫外线照射下聚合。

六、 切片：
(一) 超薄切片： 超薄切片术是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。 一般厚
度在 10-100 毫微米的切片叫做超薄切片。
a) 定位、修块： 保留进行电镜观察部分，其余部分削去，以利进行超薄切片。
i. 步骤 1：先用单面刀片将包埋块表面修去，暴露组织，再将组织周围多余
的包埋块修掉，然后将粗修后的包埋块置切片机上切出 0.5-2µm 的半薄
片，经过甲苯胺兰染色后,光镜下观察、定位.
ii. 步骤 2：根据半薄片上的定位，在包埋块端面上进行相对应的定位。后以
定位为中心，将包埋块修成便于切片的一定大小的形状（顶端面一般为
0.5*0.5mm 左右）

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b) 切片刀的制备：超薄切片刀有二种：钻石刀、玻璃刀。注意：不同类型的制刀
机有专门配备不同规格的玻璃，不能相混使用。
i. 切片刀制备：手工。
ii. 使用制刀机（现多用） （制刀机：德国 LEICA 奥地利 Relchert—Jung 公司）
iii. 下面以 LKB 制刀机为例，介绍制刀过程：
a) 玻璃条(2.5cm 宽)裁成 2.5*2.5cm 小方块
b) 在方块上稍偏离对角线处刻痕,再加压力断裂成两个三角形玻璃刀,这
样做出来的真实刀角比划痕角大 10 度左右。
c) 为使超薄切片漂浮在一个液体表面上，刀应装上一不漏的小水槽,通
常是由金属片预制或胶带制成。
iv. 刀口的选择(准备)： 将刀装在切片机的刀台上，打开聚光灯，移动灯的
位置，此时背景是暗的，而刀刃上出现一条亮线; 判断最佳刀口(高倍镜
下)： 最佳部分刀刃是一道平直的亮线；而劣质刀刃有闪烁的反光，并可
见许多的“锯齿” ，锯齿刀口不可用来切片。
v. 总结:一般好的刀口上整个刀口的 1/4-1/3 左右，为了要获得较好的切片，
最好选用应力线侧的刀口。

c) 支持膜及支持膜制作方法：
i. 载网
a) 载网一般采用很薄的铜片，此外，还有镍网、银、钼、不锈钢、尼龙
等材料制成的载网，惰性金属的载网适用于细胞化学放射自显影技术
等，非金属的载网则适用于 X 射线元素的分析。
b) 载网的直径一般为 3mm，孔形有圆形，长方形，单孔形及狭缝形等.
c) 一般选用 200 目左右，(每一英寸长度含 200 目)以保证有 70%以上的
电子束透过.
ii. 支持膜的制备：
a) 支持膜要求本身没有结构。薄而透明，易被电子穿透，有足够的机械
强度，经得住电子束的轰击，不与生物样品产生化学反应，其厚度在
15nm 左右为宜，太厚会增加电子散射，降低分辨率和反差。
b) 常用的支持膜有 Formver 膜，火棉胶膜、碳膜。前面两种为有机膜,
能满足一般分辨率的要求。对于高分辨率的研究，需要纯碳膜。有时
为了增强有机膜的强度，可再喷上一层碳作为加固膜。
i. ①Formvar 膜：化学名为聚乙烯醇缩甲醛。特点是机械强度高，
常配成 0.2-0.5%氯仿溶液。采用玻片漂浮法制膜，用干净玻片浸
入溶液后取出，表面形成一层薄膜，然后利用水的表面张力作用，
将膜剥离到水面上。无碳方华膜是纯的有机膜,上面没有镀任何
物质,故膜弹性好,背底影响小,可支持多种样品观察.适于纳米粉
末等材料。但因其导电性能不好,电子束照射下,高温或电荷积累,

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 引起局部受热碳化,产生局部黑斑,样品飘移,甚至使膜破碎,损伤
观察样品.通常在 100KV 电镜使用较多。
ii. 火棉胶膜：火棉胶膜的机械强度比 Formvar 膜弱，但制作较容易，
常配成 1-2%醋酸异戊酯( 或醋酸正戊酯)溶液。 方法： 取一直
径约 10 厘米的结晶皿，盛满蒸馏水，在上面滴一滴火棉胶液，
等火棉胶膜形成后，将干净铜网平铺在膜上，然后在铜网上复盖
一层滤纸，等滤纸湿透并与铜网贴附好之后，用镊子夹住滤纸的
边缘，一边轻轻提起，取出水面，翻转晾干备用。
d) 超薄切片： 修好包埋块，制好刀后，即可以进行超薄切片。不同厂家制造的
超薄切片操作方法各有特点，但基本结构及原理类同。切片机---按照自动进刀
的原理，超薄切片机可分为热膨胀式（左）和机械推进式（右）两类.
i. 标本块与刀刃的调整： ①首先把标本和刀分别安装好，要注

意夹紧，标本面的梯形上下底需与刀刃平行。把装有水槽的刀插入刀
夹，刀前沿紧贴刀夹前沿，刀刃应与刀台标示等高。
②根据组织块软硬程度不同，调整刀的前角(间隙角)，设定切片速度。
一般软硬适中的包埋块可选用 45º刀角，3-5º的前角，2-5mm/秒的切

速，偏硬的块可用较小角度的刀和较小前角及较慢的切速，偏软的块用
大角度的刀，较大的前角及较快切速。
ii. 对刀-- -- 对刀操作时，必须十分小心，对刀的原则是使刀刃尽量贴近标本
面，但不能摩擦到，否则，会损伤标本面和损伤刀口，因此，对刀是超薄
切片过程中极为重要，而又较难掌握的一关。

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iii. 加水： 理想的水槽液必须具有较高的表面张力，以利切片漂浮和展开，
具有极低的粘度，容许切片在其表面自由移动，一般蒸馏水是比较理想的
水槽液。加入 10 一 20%的乙醇，可降低溶液表面张力，有利于展平切片
上的皱折。
iv. 切片和捞片： 加水后，打开自动切片开关。如还未切出片，为了
节省时间，可增大切片速度，直到切出第一片，即将速度回复到适合。切
片过程随时调节切片速度和厚度，直到切出满意的切片。切片厚薄一般是
从干涉色来判断的。

v. 常见的切片缺陷的原因及消除方法：

1. 颤痕 2. 刀痕 3. 褶皱
a) 颤痕 切片中出现的与刀刃平行的刀纹．主要由于切片时环境有振动
源影响，或标本与刀夹持不牢，刀角度选择不合适，切速太快，包埋
过软等。
b) 刀痕 切片中出现的与刀刃垂直的刀纹.是由于刀口有缺口，或刀刃
上有脏物或组织材料有硬质材料所致，一般更换刀口或修去硬质材料
便可。
c) 褶皱 切片中出现有不规则的皱褶，一般由于包埋块太软，刀钝，切
面太大，水面太低，捞片时持铜网手不稳等。
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 d) 切片厚度不一：主要是刀不利、标本表面太大和包埋块各部分聚合不
均匀等原因所造成。
e) 带水：原因是水槽液面太高。
f) 切片不成带：梯形面修的上下两边不平行。
g) 切片破碎：由于组织块脱水不彻底而使包埋剂渗透不完全所造成。

七、 切片染色
(一) 电子染色剂
a) 醋酸双氧铀 ①提高核酸、蛋白质和结缔组织纤维的反差。 ②对膜结构染色
效果较差。 ③放射性和化学毒性，对光不稳定，贮存和染色最好避光。
b) 铅盐染液 ①电子密度大，对组织结构都有广泛的亲和作用。 ②提高细胞
膜及脂类物质反差。对糖元更具有染色作用。 ③铅盐毒性大，和空气中的 CO2
接触易产生白色碳酸铅沉淀污染切片，电镜显黑色致密不定型颗粒。
c) 电镜染色常规：用铀、铅盐双重染色。 具体方法如下：
i. 大约 1-2%的醋酸铀—乙醇饱和溶液染色 5—10 分钟，然后用双蒸水洗 3
遍。
ii. 铅染色约 5 分钟，双蒸水洗 3 遍，滤纸吸干后晾干，电镜观察。

(二) 负染色技术 指通过重金属盐加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬

托出样品的形态和大小的方法 。首先由 hall 在 1955 年提出。Hall 在病毒研究中用
磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒像一个亮晶的“空洞”被清晰地显示
了出来。 。
a) 正染色：在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图
像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈现光亮。
b) 负染色：染液中某些电子密度高的物质（如重金属盐等）“包埋”低电子密度
的样品，结果在图像中背景是暗的，而样品“透明”地光亮。
c) 负染色技术的意义： 对于颗粒生物材料的研究而言，负染色具有分辨率
高、简单，快速等优点。它可显示生物大分子、细菌、病毒以及分离的细胞器
等样品的形状结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒研究方面，负染色
技术成为不可取代的实验技术。

d) 负染液的制备： 目前最常用的负染色液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠。此
外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也作负染色剂用。
i. 磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾—— 用双蒸馏水成 1-3%溶液，1N NaOH 调
至 6.4-7.0。
ii. 醋酸铀—— 用双蒸馏水成 0.2-0.5%溶液，新鲜配制, 使用前 1N NaOH 调
至 PH4.5。
e) 染色方法：

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 i. 悬滴法 将标本用细管滴一滴在有支持膜的载网上，染色 1-2 分钟后即用
滤纸在悬滴的边缘处吸去余液，然后立即滴上染液，一般 1-2 分钟即可将
染液用滤纸吸干，晾干后进行电镜观察。

ii. 漂浮法：
a) 样品滴一滴在干净的载玻片上。
b) 有支持膜的载网漂浮在液滴上以沾取样品，时间 2min
c) 滤纸吸干样品余液，载网上仅有一薄层样品液膜。
d) 滴一滴复染液在玻片，未干的铜网漂浮液滴上，2min 后用滤纸吸干
多余的染液即可。

iii. 喷雾法 将染色液与病毒悬液等量混合后，在无菌柜或防护罩里用喷器将

标本喷到带膜的载网上，如果雾滴较少，往往能获得良好的效果，此法尤
其适用于高分辨率的电镜。 缺点：技术上比较繁琐，易造成病毒的扩
散，此外，病毒与染液混合时，要求溶液的缓冲条件较高，否则易产生沉
淀而影响效果。
f) 染色操作中的注意事项：
i. 标本的均匀散布问题——负染失败的最常见的原因。
a) 描述：颗粒悬滴标本的凝集现象，即生物标本与染色剂形成电子不能
穿透的团块使超微结构无法观察。因表面张力的作用，滴到载网上的
标本，颇象一颗滚动在玻璃上的水银不能展开。 可能原因：样品
浓度太高，标本的电荷，支持膜的疏水作用，样品酸碱度等不适合。
b) 解决办法： ①使用分散剂——把 0.005-0.05%牛血清蛋白溶液加到
样品悬液内。 所加量并无严格规定，例如 0.5ml 标本加入 3-4 滴即可，
试染后如果仍不见效可适当增加，也可直接用 0.01%的牛血清蛋白溶
液作为离心沉淀物的稀释。 此法适合于高度纯化的颗粒性悬液。
②亲水性处理—— 把有支持膜的载网放在离子溅射仪中，在约 10-1-
10-2 的真空中用离子轰击（蚀刻）几秒钟，支持膜即由疏水性变为亲
水性。
ii. 悬液的浓度和纯度
a) 悬液浓度要适中，太稀在电镜下寻找样品困难；太浓时，因样品的堆
集而影响观察，因此滴样时，应同时做几个不同浓度，通过电镜观察
以找出最佳稀释度，一般负染色技术通常要求每份样品至少含有
109/ml 目标颗粒，才能被观察到。
b) 待染的悬液样品虽然不要求很纯，但如果杂质太多，如大量的细胞碎
片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在将会干扰染色反应和

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 电镜的观察，尤其不要有过多的糖类，因在电子束的轰击下，糖类容
易碳化而有碍观察，因此最好进行适当的提纯。
c) 悬液里含有较大的细胞残渣，应在 2000-5000 转/分离心除去大块物
质。
iii. 悬液和染液的酸碱度（PH）问题
a) 样品悬液和染液的酸碱度会对负染色的结果产生较大的影响，一般说
来，生物样品悬液的酸碱度是中性或偏酸为宜。

(三) 免疫电子显微镜技术： 免疫电镜(immunoelectron microscopy)技术：是把免疫化

学技术与电镜技术有机的结合起来，在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定
位的一种方法学。 它主要分为两大类:一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗
原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察;另一类则是免疫电镜定位技术。
免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。

a) 常见疑问：
i. 免疫电镜的免疫学原理是不是和免疫组化相同？在操作上是不是一抗同
免疫组化相同，二抗加了胶体金标记？ 答：免疫电镜和免疫组化的
原理基本相同，但免疫电镜要求最后的免疫反应产物是高电子密度的物质，
如 DAB 显色剂或者胶体金，二者在免疫电镜中用的比较多。DAB 的反应
产物是高电子密度的细颗粒状物质，胶体金标记是高电子致密的颗粒，胶
体金可以根据制备方法的不同，其直径也有不同，因此免疫组化和免疫电
镜的具体操作过程就有明显的不同，而且不同的显色方法和不同的部位，
不同的材料，不同的抗体，方法也有所不同。

ii. 免疫电镜能不能替代免疫组化，也就是说要做免疫电镜就不用作免疫组
化了？ 答：免疫电镜肯定不可能替代免疫组化，原因很简单，免疫
电镜观察的部位极为有限，具有很大的局限性，我们经常用管中窥豹来形
容。 其优点是能够精确的反应抗原所在的亚细胞部位，但难以从整体
上反应抗原量的多少变化。而免疫组化能够从较大面积上反应抗原的量的
变化，且步骤简单，但不能确定亚细胞分布。

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 iii. 免疫电镜的一抗用单抗好，还是用多抗好？ 答：至于用单抗或者多抗，
肯定是用多抗没有单抗好，单抗非特异性少，结果更具有特异性。

iv. 免疫组化、免疫荧光、免疫电镜区别，对于我的实验，该怎么选择？

b) 免疫电镜的要解决的两个问题——免疫电镜标本的结构保存与抗原活性保存
问题，而二者常常矛盾。对于抗原的失活性问题常常比超微结构受损更重要的
问题关键还是固定剂的选择。
i. 固定剂应有以下良好特性：
a) 分子量小，易于渗透；
b) 不损害细胞内抗原的活性；
c) 固定速度快、效果好；
d) 固定后不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。
ii. 影响固定的因素有：
a) 固定剂的种类、PH 值
b) 与被固定的细胞类型有关
c) 温度，一般采用 2~4℃冷固定，能降低细胞的自溶左右和水分的抽提；
d) 固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效
果差；
e) 固定时间与温度正相关。温度高，固定快。与缓冲系的离子强度相关，
离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定快。不同固定剂或同一固定
剂的不同浓度所需的时间也不一致。
i. 常用的固定剂： 多聚甲醛-戊二醛固定液(PG)、过碘酸盐-赖氨酸-多聚
甲醛混合固定液(PLP)、苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液(PAPG)。
a) 预实验： （使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种
类浓度、温度、pH 及固定时间等。然后做出预处理的效价，作为失活参
考以再选择最适条件。）
b) 多聚甲醛-戊二醛固定液(PG)——1%多聚甲醛（PFA）+0.01%-0.05%戊二醛
固定液
i. 抗原性强的标本：可采用 4%多聚甲醛加 0.05-0.5%戊二醛进行固定；
ii. 某些抗原对戊二醛极其敏感，固定液只能用 2-4%多聚甲醛，而不能
加戊二醛。
iii. 不充分的固定会造成抗原提取或移位，同时醛类等交联固定剂会改变
蛋白质分子的结构。某些抗原性在不明显影响抗原活性前提下，选择
合适的浓度和时间，尽可能强一点为好。
iv. 多聚甲醛对组织细胞的抗原性影响不大，若加入超过 0.1%戊二醛，
抗原性就会迅速减弱；但戊二醛浓度低到 0.01-0.05 时，对抗原的影
响便不显著，而超微结构的保存也可获得很大改善。所以推荐 1%多
聚甲醛加 0.01-0.05%戊二醛作为免疫电镜标本的固定剂。时间 4.5h，
美国 EMS 公司的多聚甲醛溶液和戊二醛溶液，常用货号 157-8 和
16220。
c) 过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液(PLP)——PLP 液含 0.01 mol/L 过碘
酸钠、0.075mol/L 赖氨酸、2%多聚甲醛及 0.037mol/L 磷酸缓冲液。
i. 大多数组织抗原含蛋白质与糖类，抗原决定簇位于蛋白部分，而该固

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 定剂有选择性地固定糖类。
ii. 既稳定了抗原，又不影响抗原决定簇与抗体的结合。
iii. 加入低浓度的多聚甲醛能稳定蛋白质与脂类。因为赖氨酸价格较贵，
此固定液不如 PG 固定液经济。
d) 苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液(PAPG)——4% PFA + 15% 苦味酸 + 0.1%
戊二醛 in 0.1M PBS
i. 苦味酸穿透迅速，在不影响抗原活性前提下固定蛋白，改善膜和胞质
的保存。
ii. 特别是不能采用高浓度的戊二醛与锇酸做后固定时(如包埋后的免疫
标记)，加入苦味酸对超微结构的保存有很大帮助。
ii. 包埋：
a) 树脂包埋
i. 环氧树脂包埋法：直接脱水后包埋。
ii. 原位包埋：将小片组织或半薄切片贴在载片上，将充满环氧树脂的明
胶囊倒置于切片上聚合、硬化，进行包埋。
b) 低温包埋
i. 此方法多用低温包埋剂，如 Lowicryl 系列包埋剂、LR White 包埋剂和
LRGold 包埋剂。 这三种包埋剂均能在低温下(-35℃~-80℃)用紫外光(波
长 315~360nm)进行聚合，避免了高温对抗原性的负面影响，提高了
阳性标记率，对温度敏感的抗原应选择使用低温包埋剂。
ii. 低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的包埋后染色。能检
出应用环氧树脂包埋难以检出的多种抗原。

iii. 免疫电子显微镜基本技术方法
a) 包埋前染色： 即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取
出，修块；常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包埋。
i. 固定：组织经过适当固定 4% PFA + 15% 苦味酸 + 0.1% 戊二醛 in
0.1M PBS；
ii. 冷 冻 保 护 ： 20 ～ 30 ％ 甘 油 、 1 ～ 2 mol/L 蔗 糖 1h.
【组织采用振荡切片（切片厚度 50um 左右） 】，然后将切片贴于明胶
涂抹的玻片上（明胶涂片可防止处理过程中切片脱落），细胞可制成
混悬液用，离心法操作或制成涂片。 【液氮冻融】
iii. 漂洗：0.1M PBSpH7.4 洗 3min.
iv. 封闭：以 1：5 正常羊血清处理切片 30min，以阻断非特异性吸附。
v. 一抗：第一抗体 40C 孵育 20h 后室温 2h。
vi. 漂洗： 0.1M PBS pH7.4 洗 3min×3。
vii. 0.1M PBS pH8.2 洗 3min×3 为与胶体金结合作准备。
viii. 封闭：再次阻断非特异性吸附，同 4）
ix. 二抗：以金标记的第二抗体在室温下孵育 1h。
x. 漂洗：0.1M PBS pH8.2 洗 3min。
xi. 漂洗：0.1M PBS pH7.4 洗 3min×3 次。
xii. 后固定：1％锇酸（0.1M PBS 溶液）1h。
xiii. 漂洗：双蒸水洗 15min（中间换 3 次）
xiv. 脱水包埋：酒精或丙酮脱水，包埋，超薄切片。

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 xv. 染色：常规醋酸铀、柠檬酸铅双重染色。

b) 提高对细胞内抗原的标记率措施：
i. 切厚片 利于标记抗体的穿透。 方 法：
1. 冰冻切片： 组织块切成 8 µm 左右的厚片。放入盛有 PBS 的小
玻璃瓶内备用。也可将厚片直接贴在载玻片上进行免疫染色，操
作方便，但影响标记的阳性率。推荐将厚片漂浮在液体中进行免
疫标记。
2. 震动切片：可切 20～300 µm 的厚片。只需 20—80 µm 的切片。
优点：可以避免冰冻对组织带来的损害。不足：切出来的切片过
厚。因为免疫试剂仅能穿透切片表面 8—9 µm，而更深层的组织
就不易被标记。
ii. 增加细胞膜的通透性
1. 用 0.1％TritonX-100 等活性剂处理 5～8min，以增加细胞膜的通
透性。
2. 用冻融的方法增加细胞膜通透性。要进行防冰晶处理 (厚片在含
15％甘油、20％蔗糖的 PBS 中振摇沉底)，在液氮中速冻 0.5～
1min 后用 PBS 迅速回温。

iii. 选用相对分子质量较小的标记物
1. 辣根过氧化物酶与 IgG 的 F(ab)片段交联物，相对分子质量较小，
约 10 万，较易进入细胞内。
2. 20 世纪 90 年，建立了用 IgG F(ab)- 1 nm 金作为标记物，标记后
经银加强染色的纳米金包埋前标记法。被广泛用于膜受体的精确
定位。

c)包埋后染色： 组织标本经固定及树脂或低温包埋，制作成超薄切片后再
进行免疫化学标记的方法。
（1） 超薄切片厚 50～70nm，载于 200～300 目镍网上。
（2） 置 1％H2O2 内 10min,以增进树脂穿透性，利于抗体进入。
（3） 双蒸水洗 3 次，每次 10min。
（4） 封闭：浮于正常羊血清（1:50～1:100）滴上，室温 30～60min，要
用与第二抗体同科系动物的正常血清，封闭电荷部分）以饱和固定
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 剂中的游离醛基和占据非特异性结合部分。组织内的结缔组织等部
位富有电荷，易与第一抗体产生非特异性静电吸附，再与第二抗体
结合，从而产生非特异性染色。
（5） 漂洗：PBS （pH7.4）漂洗 3min，洗 1 次。
（6） 一抗：滤纸吸干孵育于第一抗体血清滴上，先室温预孵 1h，再置于
4 摄氏度 24～36h
（7） 漂洗：PBS 漂洗 3min 3 次。
（8） 漂洗封闭：PBS (pH8.2)漂洗 5min （内含 1％的牛血清蛋白）（除抑
制非特异性染色外，还可以封闭抗体血清中混杂的血蛋白抗体） ，此
步为胶体金结合作准备。
（9） 胶体金标记抗体液 1：30～1：100，淡红色为适宜稀释液，室温孵
育 10min～1h。10）双蒸水洗 3min 3 次
（10） （如作双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，重复上
述步骤 2～10）
（11） 染色：5％醋酸铀（双蒸水配制）染 5min，染后用双蒸水洗。
（12） 染色：柠檬酸铅染色，双蒸水洗净
（13） 电镜观察

d) 包埋后染色注意事项：
（14） 四氧化锇有保存结构的作用，但其可使抗原活性明显减低。后固定
中一般以不用四氧化锇为佳。
（15） 在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选用镍网或
金网。
（16） 在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，干燥会影响
抗体活性。
e) 包埋后染色优缺点：
（17） 优点： ①超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重
复性； ②可在同一超薄切片上进行多重免疫染色。
（18） 缺点： ①抗原活性在样品处理过程中可能减弱甚至丧失；
②环氧树脂可与组织成份发生反应而改变抗原性质； ③包埋在环
氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。

f) 冷冻超薄切片染色： 将组织置于蔗糖保护液中，以液氮速冻；在冰冻超
薄切片机上切片；然后进行免疫染色。
i. 取材：为了保证制样效果，样品块越小越好，以小于 1mm3 为宜。
ii. 固定：用 0.1M PBS(pH7.2)，将戊二醛配成 0.03％的溶液，把取材后的
样品块放入该溶液中固定 15～60 分钟。
iii. 冷冻保护处理（减少冰晶形成）： 常用的冷冻保护剂有 20～30％甘
油、1～2 mol/L 蔗糖、20％二甲基亚砜(DMSO)、5％聚乙烯醇溶液
等。处理时间从几分钟到几小时。
iv. 切片——冷冻超薄切片机：是在固有型号超薄切片机基础上附加低温
操作装置组成的。以 LEICA(UC6+FC6)为例,该装置包括：冷冻室、冷冻
刀台、冷冻样品头、存放液氮的杜瓦瓶及温度和液氮水平控制器等。
在刀台和样品头内有温度传感器及加热装置，有盛致冷剂的容器，容

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 器内还有致冷剂水平感受器。当用液氮作致冷剂时，其样品头温度可
控制在-70℃～-170℃，刀温控制在-70℃～-150℃。切片时采用干刀
法，即不用液槽法，而用滴管上的饱和蔗糖液滴，粘起玻璃刀上的切
片，然后将凝固的蔗糖液滴从冷冻室里移出，在室温下待蔗糖融化后，
利用其表面张力使切片展平，并放在附有支持膜的载网上，用双蒸馏
水洗去蔗糖后染色。
v. 免疫染色：同包埋前染色（3-13）步骤。
vi. 常规醋酸铀、柠檬酸铅双重染色。

g) 冷冻超薄切片优缺点：
i. 优点： 简便，快，抗原活性保存好。不需经固定、脱水、包埋等步
骤，所以抗原性保存较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。
ii. 缺点： 技术条件要求较高、难度较大，价格贵。

h) 免疫电镜技术存在的问题：
i. 戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响；
ii. H202 能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤。
iii. 染色中清洗工作不彻底，可产生非特异性产物和其他污染物，影响特
异性反应产物显示和观察。

(四) 免疫电子显微技术
a) 铁蛋白标记
i. 原理： 铁蛋白是一种含铁约占 23％的蛋白质，铁蛋白含有致密的铁离
子核心，含 2000～3000 个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密
区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。 抗体与铁蛋白通过双功
能试剂结合为一种双分子复合物。此复合物保留了抗体的免疫活性，通过
电镜可定位抗原。适于细胞表面抗原的定位。
ii. 优缺点：
a) 优点：铁蛋白易从马脾中获得，呈颗粒状，易分辨；
b) 缺点：分子量较大，不易穿透细胞膜和组织，对于细胞内抗原的定位
较困难。对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标
记，因此，在近年来逐渐被免疫酶和胶体金取代。

b) 过氧化物酶标记
i. 原理：将酶(主要是过氧化物酶)与抗体交联,抗原抗体反应后,加底物显示
酶的活性部位,酶反应产物经 OsO4 处理变为具有一定电子密度的锇黑，可
在电镜下观察。HRP 分子量小(40000)，穿透力强，有利于标记抗体进入细
胞内，适于细胞内的抗原定位。
ii. 优缺点：
a) 优点： HRP 标记抗体，通过 DAB 呈色反应，DAB 分解产物为不溶性
的棕色吩嗪衍生物，经 OsO4 处理变黑，具高电子密度，适于电镜观
察；HRP 分子量比铁蛋白小 20 倍，酶标抗体易透过处理后的组织细
胞膜，能用于定位细胞内抗原。

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 b) 缺点： 但酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高（如
铁蛋白，胶体金）。

c) 胶体金标记 ——胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广泛的免疫电镜标记
物。
i. 原理： 胶体金是表面带负电荷的疏水性颗粒，可与抗体相吸附，从而标
记抗体。金颗粒可分为三种，小颗粒直径 3～5nm，中颗粒 10nm，大颗粒
20nm。胶体金可标记许多大分子，最常用的是蛋白 A 一金和 Ig 一金。
ii. 优缺点：
a) 优点： ①易于制备，可根据需要制备不同大小，可进行双重或
多重标记。 ②稳定迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明
显改变。 ③电子密度高，颗粒均匀，圆球形状，界限清晰，易于辨
认。 ④定位比酶反应物精确。特异性强、灵敏度高、简便、背景清
晰，目前应用较广。

d) 凝集素标记—— 抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察。

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 i. 凝集素是一类从各种植物种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋
白。因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。常用的为植物凝
集素。
ii. 识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜表面的糖基。一种凝集素特异性专一
结合一种糖基，可作为研究细胞膜结构的探针。具有多价结合能力，能与
荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，可
用于光、电镜免疫细胞化学研究。
iii. 在探索细胞分化、增生和恶变的生物学演变过程，显示肿瘤相关抗原物质，
以及对肿瘤的诊断评价等方面均有一定的价值。

e) 理想的免疫金染色切片应：
i. 背景应清洁，无散在的金或其它无机盐颗粒，金粒集中在抗原、抗体反应
部位。
ii. 要正确判断特异性染色和非特异性染色。
a) 特异性染色 ——特异性染色的反应产物常分布于特定的区域，多数
分布于胞浆内，也有分布在细胞核表面的，因此，特异性染色表现为
在同一张切片上不同程度的阳性染色结果。
b) 非特异性染色——非特异性染色表现为无一定构型与规律，常表现为
某一部位的均匀着色，细胞及周围的结缔组织均无区别的显染色反应。
f) 要获得理想的免疫金染色切片，主要的要注意如下几点：
i. 抗体血清要高度特异性亲和力。
ii. 被检组织应有较高浓度的抗原。
iii. 冲洗液的清洁度，冲洗的彻底程度以及所用各种器皿的清洁度等。所有溶
液最好用微孔滤过器过滤，滤膜孔径 0.2～0.45um，所有器皿应清洁和专
用。
iv. 整个操作过程应在湿盒内进行，以使载网保持湿润（保护抗体的活性） 。
v.

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第三章 扫描电子显微镜
❖显微镜的发展史：
显微镜分为三个基本类型：光学、带电粒子（电子和离子）和扫描探针。光学显微镜是
人们最熟悉的，利用可见光和透镜观察物体，最小可看到一微米（百万分之一米）的物体，
例如红血球 (7 μm) 或人类头发 (100 μm)。电子和离子显微镜使用带电粒子束代替光，
并利用电磁或静电透镜聚焦粒子。这类显微镜最小能看到十分之一纳米（十亿分之一米）的
物体，例如单个原子。
使用可见光时，人们无法解决当距离小于数百纳米时目标上的光点。使用波长更短的光
（蓝光或紫外线）会稍稍好点。将标本和物镜前部放入高折射率介质（比如油）中会更好一
点，但即使将这些方法结合起来也只能将显微镜的分辨率提高到稍低于 100 nm 的水平。

扫描探针显微镜可使研究人员在极小的尺度（包括原子比例的特征）对材料结构进行成
像、表征甚至是操控。扫描探针显微镜不使用透镜，而是使用非常尖锐的探针（极小、极尖
的针）直接接触样本表面。它能记录探针与样本之间的力和相互作用并形成图像。这种仪器
还具有创建原子级别的图像所需的分辨率（十亿分之一米）。
1931 年由鲁斯卡和克诺尔发明的第一台电子显微镜使用了两个磁性透镜，三年后他们
加入了第三个透镜，使分辨率达到了 100 nm，是光学显微镜的两倍。今天，电子显微镜的
分辨率达到了 0.05 nm，是普通光学显微镜的 4000 倍，肉眼的 4,000,000 倍。

⚫ 1953 年，英国剑桥大学的麦哲马伦等人研制成功第一台实用型扫描电镜，分辨率
达到 50 nm。
⚫ 1965 年，英国剑桥科学仪器公司研制成功第一台商用扫描电镜 Mark I，其分辨率
为 10 nm，从此揭开了扫描电镜研发、制造和应用的开端。
⚫ 1975 年，美国将微型计算机引入到扫描电镜中，用于程序协调控制加速电压，放
大倍数和磁透镜焦距的关系，二次电子图像分辨率可达 6 nm。
⚫ 2005 年，美国发布全球第一台具有超高分辨率的带有低真空的场发射电镜，其分
辨率为 1.0 nm。
⚫ 2010 年，冷场扫描电镜上市将分辨率提升到 0.4 nm。
⚫ 由此脉络可以清晰地看处，随着科技的发展，扫描电镜的分辨率在逐渐降低并趋近
于电子束波长（0.01-0.001 nm），其好处不言而喻——能够通过电镜看清楚更微小
的物体，探索更微观的世界。

❖电子束与样品的作用：
当一束聚焦高能电子束沿一定方向入射到试样内部时，由于受到试样中晶格势场和原子
库仑场的作用，其入射方向会发生改变，这种现象称为散射。
入射电子的散射过程是一种随机过程，每次散射后都会使其前进方向发生改变。在非
弹性散射的过程中，每次散射后不仅使其前进方向发生改变，而且还会损失部分能量，并
伴有各种其他信息的产生，如热、俄歇电子、X 射线、可见光、二次电子、背散射电子
等。电子束和样品作用体积约数个微米(μm)深，其深度大过宽度而形状类似梨子，而且不
同信号的作用深度不同。

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 一． 反射电子或背散射电子（Back Scattered Electron)：是被固体样品中的原子核或核
外电子反弹回来的部分入射电子。来自样品表层几百纳米的深度范围。它的产额能
随样品原子序数增大而增多，可定性的做成分分析。

二． 二次电子 （Secondary Electron) :在入射电子束作用下被轰击出来并离开样品表

面的核外电子叫二次电子。二次电子能量较低，一般都不超过 8x10-19J（50ev).二次
电子一般都是在表层 5~10nm 的深度范围发射出来的，它的产额与样品的表面形貌
关系密切。

三． 特征 X 射线
当样品原子的内层电子被入射电子激发或电离时，原子就会处于能量较高的激发状态，
此时外层电子将向内层跃迁以填补内层电子的空缺，从而使具有特征能量的 X 射线释放出
来。可应用于微区分析。
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  即，若我们用 X 射线探测器测到了样品微区中存在某一特征波长，就可以判定这
个微区中存在着相应的元素。

四． 俄歇电子（Auger Electron):
在入射电子激发样品的特征 X 射线过程中，如果在原子内层电子能级跃迁过程中，
释放出来的能量并不以 X 射线的形式发射出去，而是用这部分能量把空位层内的
另一个电子发射出去，这个被电离出来的电子称为俄歇电子。其能量低，平均自由
程很小（1nm 左右） 。
五． 吸收电子（Absorbed Electron)
六． 透射电子 (Transmission Electron)
七． 阴极荧光（ Cathodoluminescence) 等

其中，二次电子所成的二次电子像反映了样品表面的形貌，它的分辨率高，是扫描电镜主要
的用途。

❖二次电子成像特点：
1.能量较低，小于 50ev。
2.穿透深度小，小于 5~50nm
3.试样表面越倾斜，其产额越高（图像越亮）（倾斜衬度）
4.试样表面越突出，尖锐处，二次电子产额大；凹陷处产额少。（漫射衬度）
5.二次电子的产额对原子序数 Z 不敏感。

SEM 的组成主要分为三部分：电子光学系统、信号收集和处理显示系统、真空系统。

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 陶 瓷 背散 射电

陶瓷二次电

牛奶盒背散射 牛奶盒能谱分

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 1、

2、信号收集和处理显示系统工作原理：
二次电子探测器收集二次电子信号进入闪烁体后即引起电离，当离子和自由电子复合
后就产生可见光。可见光信号通过光导管送入光电倍增器，光信号放大，即又转化成电流信
号输出，电流信号经视频放大器放大后就成为调制信号。

电子枪的作用是发射出电子，是整台电镜最重要的部件之一，其性能的优劣决定着电镜图像
质量的高低。

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( 续前页 )电子枪的束流密度和束斑直径很大程度上影响电镜的分辨率，目前冷场发射有着
最大的束流密度和最小的束斑直径，所以冷场发射电子枪被广泛地应用于高分辨扫描电镜。

当灯丝中通以加热电流，钨丝阴极呈白热状态时，便发射电子。在阳极加速电压的作用
下，电子穿过阳极小孔射向荧光屏出现亮点。栅极加电压用来控制电子束大小，改变荧光屏
亮度。调节偏转线圈中电流大小，可改变磁场强弱，使荧光屏得到最小的聚焦电子束半点。
电子束在横向交变电磁场作用下，可在荧光屏上来回扫描。
表格 1 电子的发射源
冷场发射
发卡型钨灯 热场发射
参数名称 六硼化镧 （111）
丝 （100）
（310）

亮度（A/cm2•sr） 105 106 108~109 5*108

阴极尖端工作温度 2650~2750 1750~1850 ~300 1750~1850

阴极电子逸出功（eV） 4.4~4.5 2.0~2.9 ~4.1 2.5~2.9

真空度（pa） ~10-3 10-4~10-5 ＜10-7 ＜10-6

使用寿命（取决于真空 ~100 小时 ~1000 小时 ≥10000 小时 ≥10000 小时

度）

灯丝烧洗（Flashing） 不需要 不需要 需要 不需要

束流稳定性（长时间） 稳定 稳定 每小时＞20% 每小时＜1%

电子束抗干扰能力 很强 较强 差 一般

对高分辨电镜的适用 不能用 可用 很好 很好

能谱的微区分析 很好用 很好用 配大面积晶体 好用

可用
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❖扫描电镜的工作原理：
扫描电镜的工作原理可以简单的归纳为“光栅扫描，逐点成像“。扫描电镜图像的放大倍数
定义为

电子束的产生是用 V 形细钨丝，即所谓的热电子阴极，被电流加热后，它将电子发射到
真空中，在阴极下方安装了带有中心钻孔的金属圆盘 （阳极） ，阳极与高压源的正极相连，
热电子阴极与负极相连。阴极和阳极间的强电场使电子向下加速，这些电子称为入射电子。
它们在周围形成发散电子束，撞击样品和载物台，但是这样发散的电子束没有实际作用。电
磁透镜最终将电子束聚焦在样品表面。在焦点上入射电子轰击样品材料，使其中的电子逃逸
出来，这些逃逸的电子称为二次电子。另外，成像还需额外的组件，即电磁偏转模块、光栅
扫描发生器、二次电子探测器（缩写为 SE 探测器）
，以及带有监视器的计算机。
扫描电子显微镜的基本原理是检测二次电子并使用他们来建立图像，为了增加被检测到
的电子，一个正偏置的光栅放在检测器的前面，光栅吸引二次电子并将其引向 SE 检测器，
这种方法来生成样品的放大图像。光栅扫描发生器将电子束引导到样品的左后部，并在那里
短暂停留，二次电子记录在 SE 检测器中，信号被放大并在监控器的左上角显示为一点。电
子束稍微向右平移，再次停止，然后重复测量，以同样的方式处理样本之后的点。成像原则
是：大量二次电子会形成亮的图像点，少量电子会形成灰的像点，而没有电子会形成黑的像
点。这样就完成了一整行，然后是第二行，最终一个矩形区域被扫描出来，图像出现在监视
器上。如果在光栅扫描中用了足够多的像素点，标本表面的图像在监视器上看起来就很自然。

❖扫描电镜的特点：
（1） 工作的放大倍数范围大。可以从几十到几十万倍。倍数转换方便。
（2） 焦深长，图像立体感强
（3） 样品制备相对简单，不用切片。样品可以较大的尺寸。
◆ 局限性：①分辨率不如透射电镜。②需要真空环境，不能活体及在大气环境观察。

❖扫描电镜的应用：
扫描电镜被广泛用于材料科学（金属材料、非金属材料、纳米材料）、生物学、医学、
半导体材料与器件、宝石鉴定、生产工艺控制、工业生产中的产品质量鉴定、考古研究、刑

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事侦察等。

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 扫描电镜的 扫描电镜对 生物样品的
部分工作特点 样品的要求 特点

样品要干燥，以免液体成份挥发，
高真空环境 含有大量水分
样品变形，挥发物污染镜筒

用极细电子束打击样 观察面清洁无污染，样品要耐受轰 柔软不稳定，由 C、H、O

品，扫描观察面 击，能导电 等元素组成，不导电

收集二次电子还原出
样品的二次电子发射率要好 二次电子发射率低
图像

❖生物组织进行电镜观察，需要解决三问题：清洁、含水、导电。
一、清洁：SEM 样品需要保持清洁、无污染物，尽量把污染程度降到最低，因此一方面
要清洁样品，一方面在拿取与制备样品时需佩戴干净无粉手套、口罩，使用的工具亦要保持
干净。
样本本身因素：取材的组织表面往往有粘液、血液、分泌物、组织碎片、油脂、药物沉
淀等覆盖，掩盖了其表面微细结构。

二、导电处理：
对于普通的生物组织：
1 在电子束打击下会产生严重的荷电效应，图像变形无法观察；
2 组织不耐受轰击，易穿孔、龟裂分解等；
3 轰击时，由于组织的元素（C、H、O）原子序数低，二次电子发射率低，信号
弱，图像反差弱。
4 解决的方法之一是在其上镀一层金属膜，给样品穿上一层“盔甲”，从而能导
电，耐轰击，二次电子发射率高，一举多得。

三、样品含水问题：含有大量水分的组织，是无法在其上镀膜的；
水分在真空中挥发，样品受表面张力作用会完全变形，同时挥发的液体成分污染镜筒，
影响图像质量；
■要求：样品既要做干燥处理，除去水分，又要不受表面张力作用保持原貌；

所以，整个样品的处理过程，是针对样品的特点及电镜特点，在尽可能保持样品原貌的
情况下，把不适合观察的、含水的、不稳定的、不导电的、二次电子发射率低的生物组织，

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处理成干燥的、导电的、稳定的、二次电子发射率高的样品的过程。

一、取材
1、样品可以是机体组织块，培养细胞，管道铸型等；
2、样品可以为 2~20mm2，最高可达 10mm。要控制在适合观察的最小体积；
3、取材要新鲜，部位准确，可对比性好；
4、塑性大、柔软的样品，若要观察其断面，就不能用刀切，那样会产生刀刃纹路，并
会挤压损伤细胞。这时可用冷冻割断法。
5、观察内纵面纤维状结构的样品，应先用刀片切一个头后，用镊子夹住顺势撕开，观
察撕裂面；
6、培养细胞、微生物等，可培养在盖玻片上或过滤膜上。
7、需要时，应对样品作出标记，确认样品的观察面、观察方向；

二、清洗
清洗的方法多种多样，以不损伤样品为原则：
○ 清洗用的清洗液可以为生理盐水、缓冲液等；
○ 对于有大量粘液的样品，如气管、肠道等，可以用低浓度的蛋白水解酶，如
胰蛋白酶、糜蛋白酶等冲洗；
○ 一般较干净的生物组织，在前固定后清洗。可在清洗液中振荡、轻摇多次更

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 换清洗液。必要时用注射器加压冲洗。
○ 游离细胞、微生物等可用离心法。将样品倒入离心管，低于 4000 转/分，3~5
分钟，弃去上清液，加入缓冲液，重复离心 3~4 次；
○ 特殊情况可使用酸、碱、醚、甘油等试剂；
○ 对于观察内部结构的组织，可以用灌注的方法来清洗和固定；
○ 对于较硬的样品，如牙齿、外壳等，可用毛笔刷、气球吹等，必要时可使用
超声波清洗法；
清洗注意事项：①严防空气干燥②注意清洗液的渗透压和亲和性③清洗液不应与固定液
起反应。
三、固定和脱水：
固定：可以戊二醛单固定或其他固定方法；
脱水：30%、50%、70%、90%、100%、100%酒精、丙酮。

四、干燥处理：样品脱水后，脱水剂排走了水分，现在我们要使样品在不受或少受表面
张力的情况下，把脱水剂赶走使样品真正干燥，又保持原貌。方法主要有空气干燥法、冷冻
干燥法、临界点干燥法。
1、空气干燥法：放样品于空气中，让水或脱水剂挥发，自然干燥；
特点：只适用于较硬样品；
2、冷冻干燥法：原理：利用某些易挥发溶剂，渗透入样品后，冷冻成固体，在真空中
升华，从而样品不受表面张力的作用而干燥。
有乙腈真空干燥法，氟利昂冷冻干燥法等。
特点：时有冰晶产生；溶剂对样品时有抽提作用；
3、临界点干燥法(Critical Point Drying)：原理：在加热密闭容器中的一定量液体时，液
体受热膨胀、蒸发，气体不断被压缩。在一特定的温度和压力下，两者密度相同，成一均一
的流体，液气界面消失，表面张力为零。这一状态称为临界点。此时的温度、压力称为临界
温度、临界压力。临界点干燥法就是利用这种现象，将样品放于某种液体中，密闭加热，使
温度、压力上升到临界点后，即无表面张力时，再放出气体，降压至常压，样品干燥取出。

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 不同的液体有特定的临界点。
我们常选用液体 CO2 做干燥处理液，在专用的临界点干燥仪中进行。
另外，常用醋酸戊酯、醋酸乙酯或醋酸异戊酯等做中间媒介液过渡搭桥，替换脱水剂，
利于 CO2 的透入。

五、装台粘胶：把样品粘在金属台上，便于拿放。
导电胶的特点及作用。
注意：
①粘台前务必确认观察面；
②接触好，不留死角，不污染样品；
③胶水干后才能镀膜
粘台时戴口罩、手套
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 • 六、金属镀膜：（作用）
1 增加电和热的传导性，防止放电；
2 防止和减轻电子束损伤，并把扫描电镜信息来源限定于样品表面；
3 增强亮度和反差；
4 对样品增加一定的机械稳定性。
对膜的要求：薄而均匀，没结构，稳定。
镀膜的方法有两种，为真空镀膜法和离子镀膜法。
真空镀膜法：原理：高真空中，把金属加热到熔点以上，使之蒸发成极细小的颗粒沉积
到样品上，形成金属膜。在真空镀膜仪中进行。所镀金属常为：金、铂、钯及其合金等。
优点：可做碳膜；可做投影；仪器可做真空干燥用；
缺点：费时；颗粒相对较粗；膜层不够均匀；膜厚度的确定。

⚫ 离子溅射镀膜法：原理：在一定真空度时，两极间
加以 1000-3000 伏的直流电压，电离残留的气体分
子成阳离子和电子。阳离子飞向阴极，轰击金属
靶，使部分金属粒子被溅射出来。这些金属粒子在
电场作用和气体分子的碰撞下，从不同方向和角
度飞向阳极，呈漫射的方式落在样品的表面，形成
一层均匀而连续的金属膜。
⚫ 优点：均匀；粒子细，信号强；操作易；
⚫ 缺点：受离子冲击的能量大，软组织易受伤；不能
做碳膜、投影、复型。
⚫ 注意事项：样品必须充分干燥，否则，膜破裂，损
伤样品；样品若稍具导电性，可减少离子冲击，减
少损伤。
金属靶常为：金、铂、钯等

生物样品其它处理方法简介
1、 冷冻隔断法：此法是为了观察组织的内部结构而设计的。有树脂割断法、有机溶媒
割断法等。 为了防止冰晶的形成，往往在组织中浸透某些物质，冷冻后，使其硬
化，又硬又脆，切断暴露观察面，解冻后，去掉渗入物。
结冰温度：0~-90 ℃ 六角形结晶冰
-80~ -140 ℃ 立方结晶的冰
低于-140 ℃ 为玻璃态无定形结构，即非结晶态
提高冷冻速率是防止冰晶生成而获得良好的结构保存的关键。
冷冻保护剂：甘油、二甲基亚砜、蔗糖、乙二醇

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 2、 组织导电技术（TCT）
原理：利用金属盐类、特别是重金属盐类化合物，可以与生物组织内的蛋白质、脂
类、淀粉等起化合作用，以达到表面离子化或产生金属化合物，从而增强导电率和
减轻充放电效应的目的。还可坚韧组织，加强固定效果。
基本程序：样品在固定、漂洗后，浸泡在组织导电液中一定时间。之后，洗净脱水，
直接上机观察。若经干燥和金属镀膜，分辨率会更高。
常用导电液：
a) 碘化钾： 碘化钾 20 克+碘 0.2 克+双蒸水约 100ml+2.5%戊二醛 10ml+葡萄糖 0.2
克；
b) 单宁酸：2~4%单宁酸+8%戊二醛；方法：2%锇酸→2~4%单宁酸+8%戊二醛→
0.5~2%锇酸
c) 硝酸银：0.1M 磷酸缓冲液将硝酸银配制成 1.5~3%溶液，密闭黑暗保存。
d) 高锰酸钾：0.1M 磷酸缓冲液，将高锰酸钾配制成 5%的溶液。处理时间需几十
小时。
组织导电法缺点：
导电液易产生沉淀、结晶，电子束轰击后分解，会腐蚀和污染镜筒；
不能完全消除荷电效应，二次电子发射率不够高；主张与镀膜法结合使用。
组织导电法优点：
简便、价廉；
可以在 SEM 中解剖观察，深入研究立体结构；
坚韧组织，脱水干燥时收缩少；
对样品无热损伤；若再经金属镀膜，其喷镀量可减少，并能抵抗镀膜时的损害。
3、 管道铸型技术
主要为观察腔性脏器（如器官内血管系统）的立体分布、构筑。
主要过程：将凝固较慢的液体物质（铸型剂） ，向管腔内注入，待其硬化成型后，将组
织腐蚀掉，保留下的即是管道铸型样品。对其镀膜后，利用 SEM 景深长的特点，进行立体
观察。
对铸型剂的要求：
1）要有适当的粘度，能充分灌满微细管道，易硬化，硬化时变化小。粘度以 20~50%甘
油溶液的粘度为宜。
2）硬化成型后，耐腐蚀、干燥、金属喷镀和电子束照射。
铸型剂有：甲基丙烯酸甲脂、乙烯基树脂、聚苯乙烯等；

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 4、游离细胞的样品制备法：
观察表面：
1.滤纸吸附法；
2.金属膜法；
3.玻片法：在玻片上涂上明胶或 0.1%多聚赖氨酸，形成薄膜，取细胞悬液滴于其上。
观察内部：
固定、清洁后，离心成团；制作鸡蛋清过滤液，倒入离心管，与细胞搅匀，再入戊二醛
固定液，使之成胶冻状为止。剥离后，再冷冻割断。

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