INSULIN ASPART

I. Phương pháp điều chế:

- Được điều chế bằng công nghệ tái tổ hợp DNA trong các tế bào nSaccharomyces
cerevisiae.
- Trong đó, Insulin Aspart có sự khác biệt cấu trúc so với Insulin của người khi thay Proline
ở vị trí số 28 thành Acid Aspartic.
- Chi tiết:
+ Chuẩn bị đoạn oligonucleotide mã hóa cho insulin: dựa vào trình tự cấu trúc của các
amino acid của insulin gồm 51 amino acid với 2 chuỗi polypeptid A và B nối với nhau bằng
2 cầu disulfur. Người ta tạo dòng gên riêng biệt mã hóa cho 2 chuỗi A và B.
+ Chuẩn bị vector: có thể dùng plasmid của vi khuẩn hay nấm men.
+ Dùng enzym hạn chế cắt plasmid và nối đoạn gên mã hóa cho insulin để tạo vector tái tổ
hợp.
+ Chuyển vector tái tổ hợp vào vi khuẩn.
+ Nuôi cấy (lên men) vi khuẩn trong môi trường thích hợp.
+ Tách chiết và thu sản phẩm là 2 loại polypeptid A và B riêng biệt. Trộn 2 loại peptid lại
với nhau và xử lý bằng phương pháp hóa học hay enzym để tạo cầu nối disulfur.

II. Tính chất lý – hóa:

- Bột trắng mịn.
- Thực tế không hòa tan được trong ethanol 96%, methanol hay dung dịch được tạo thành
với pH ≈ 5.1.
- Trong dung dịch với pH < 3.5 hoặc > 6.5, khả năng hòa tan hiệu quả ≥ 25 mg/mL.

III. Kiểm nghiệm:

1. Định tính:
A. Kiểm tra sắc ký đồ thu được trong định lượng:
- Peak chính trong sắc ký đồ thu được của dung dịch thử phải giống với thời gian lưu của
peak chính trong sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn.

B. Giải trình tự peptide:

- Chuẩn bị mẫu thử: Chuẩn bị 2.0 mg/mL mẫu thử cần được kiểm tra trong 0.01 M
hydrochloric acid và chuyển 25 uL của dung dịch này sang một ống sạch. Thêm 100 uL
dung dịch đệm HEPES pH 7.5 và 20 uL dung dịch 1 mg/ml của Staphylococcus aureus
strain V8 protease, type XVII-B R. Đóng nắp và ủ trong 25 °C trong vòng 6 giờ. Ngừng phản
ứng diễn ra bằng cách thêm 145 uL của dung dịch đệm sulfate pH 2.0 R.

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Chuẩn bị cùng lúc và theo cách tương tự với dung dịch mẫu thử
nhưng sử dụng insulin aspart CRS thay vì mẫu cần kiểm tra.

- Bảng kết quả thu được của sắc ký đồ dung dịch thử phải tương đồng với sắc ký đồ của
dung dịch chuẩn.
2. Kiểm tinh khiết:
A. Kiểm tạp chất có khối lượng phân tử lớn hơn insulin aspart:
- Tổng diện tích của các đỉnh có thời gian lưu thấp hơn đỉnh chính không quá 0.5% của tổng
diện tích peak. Bỏ qua bất kì đỉnh nào có thời gian lưu lớn hơn do sự xuất hiện của insulin
aspart monomer.
B. Kiểm tra các protein liên quan: sử dụng Sắc ký lỏng như được giới thiệu ở phần định
lượng:
- Giới hạn:
+ B28isoAsp insuline aspart: tối đa 1%.
+ Tổng diện tích đỉnh của A21Asp insulin aspart, B3Asp insulin aspart và B3isoAsp insulin
aspart: tối đa 2%.
+ Tổng những tạp khác: tối đa 1.5 %.

3. Định lượng:
- Sắc ký lỏng.

- Mẫu thử: Hòa tan mẫu thử cần kiểm tra trong 0.01 M hydrochloric acid để thu được dung
dịch có nồng độ 4.0 mg/mL. Duy trì dung dịch ở 2 – 8 °C và sử dụng trong 24 giờ.

- Mẫu thử lại: Sử dụng dung dịch thích hợp có chứa hàm lượng B3Asp insulin aspart và
A21Asp insulin aspart không nhỏ hơn 1%. Điều này có thể đạt được bằng cách bảo quản
dung dịch tham chiếu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 – 3 ngày. Duy trì nhiệt độ dung
dịch ở 2 – 8 °C và sử dụng trong 72 giờ.

- Tốc độ dòng chảy: 1 mL/min.

- Đầu dò: Spectrophotometer ở 214 nm.
- Tính toán: Tính tổng hàm lượng của C256H381N65O79S6, B28isoAsp insulin aspart, A21Asp
insulin aspart, B3Asp insulin aspart và B3isoAsp insulin aspart:
* Sử dụng các khu vực của đỉnh tương ứng với sắc ký đồ thu được ở mẫu thử, mẫu tham
chiếu và hàm lượng đã được công bố của insulin aspart cộng với B28isoAsp insulin aspart,
A21Asp insulin aspart, B3Asp insulin aspart và B3isoAsp insulin aspart trong insulin aspart
CRS.

IV. Công dụng – cách dùng:

1. Công dụng: Được dùng trong các trường hợp sau
- Trị đái tháo đường type 1 và 2 để kiểm soát đường huyết.
- Nhiễm toan ceton do đái tháo đường, tình trạng tăng glucose huyết tăng áp lực thẩm thấu.
- Phụ nữ đái tháo đường mang thai hoặc phụ nữ mang thai mới phát hiện đái tháo đường. -
Đái tháo đường ở lần điều trị khởi đầu nếu mức HbA1C > 9.0% và glucose máu lúc đói >
15.0 mmol/L.
2. Cách dùng:
- Insulin thường tiêm dưới da (dưới da vào vùng đùi, cánh tay trên, mông hoặc bụng).
- Phải tiêm insuslin ở nhiệt độ phòng.

A. Người lớn:
- Liều 0.4 – 0.5 IU/kg/ngày.
- Liều insulin aspart ban đầu thận trọng từ 0.2 – 0.4 IU/kg/ngày có thể được xem xét để tránh
khả năng hạ đường huyết.
- Liều ban đầu cao hơn có thể được yêu cầu ở những bệnh nhân béo phì, ít vận động hoặc có
biểu hiện nhiễm toan ceton.

B. Trẻ em:
- Ban đầu: 0.4 – 0.5 IU/kg/ngày chia làm nhiều lần.
- Khoảng thông thường: 0.4 – 1 IU/kg/ngày chia làm nhiều lần. Có thể dùng liều thấp hơn
(0,25 IU/kg/ngày), đặc biệt ở trẻ nhỏ, để tránh khả năng hạ đường huyết.
- Trẻ sơ sinh ≥ 6 tháng và trẻ em < tuổi: 0.4 – 0.8 IU/kg/ ngày.
- Trẻ em ≥ 7 tuổi: 0.7 – 1 IU/kg/ ngày.
- Trẻ em dậy thì và thanh thiếu niên: Trong tuổi dậy thì, nhu cầu về cơ bản có thể tăng lên > 1
IU/kg/ngày.