DÀN Ý TRÌNH BÀY BÁO CÁO CNSX DP – NHÓM 5

SẢN XUẤT KHÁNG SINH NHÓM  - LACTAM

I/ Đại cương
1. Định nghĩa kháng sinh
- Năm 1942, Selman Waksman “Kháng sinh (antibiotics) là các chất được sản
xuất bởi vi sinh vật có khả năng ức chế các vi sinh vật khác ở nồng độ thấp”
- Định nghĩa; “Kháng sinh là các chất có nguồn gốc vi sinh vật hay bán tổng
hợp hay tổng hợp hoàn toàn có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng
của vi sinh vật ở nồng độ thấp một cách đặc hiệu”
2. Kháng sinh nhóm  - lactam (penicillin)
- Là một họ kháng sinh rất lớn, bao gồm các kháng sinh có cấu trúc hóa học
chứa vòng beta – lactam. Khi vòng này liên kết với một cấu trúc khác sẽ hình
thành các phân nhóm lớn tiếp theo: Nhóm penicilin, nhóm cephalosporin và các
beta – lactam khác. [Trong phạm vi bài học, nhóm chúng em sẽ tìm hiểu về quá
trình sản xuất các kháng sinh phân nhóm penicillin và cephalosporin]

- Các penicillin có cấu trúc hóa học chung gồm vòng  - lactam nối với vòng
thiazolindin (nhân 6 – APA). Penicillin G là chất kháng sinh đầu tiên được sản
xuất với khối lượng lớn và được dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các
kháng sinh khác.
- Các cephalosporin có cấu trúc nhân cơ bản là acid 7 – amino –
cephalosporanic (7 – ACA). Đa số các cephalosprin được bán tổng hợp từ sản
phẩm lên men cephalosporin C.
- Quá trình lên men Penicillin là mô hình sản xuất kháng sinh điển và là nguyên
liệu để sản xuất ra các kháng sinh nhóm beta – lactam
2. Quy trình chung sản xuất kháng sinh nhóm  - lactam
 Sản xuất

Chiết tách

Tinh chế

Đóng gói

 Các kháng sinh nhóm beta – lactam được sản xuất theo phương pháp lên
men chìm ở quy mô công nghiệp. Từ sản phẩm của quá trình lên men này
có thể trực tiếp chiết tách và tinh chế thành kháng sinh hoặc sử dụng sản
phẩm này làm nguyên liệu để tiếp tục thực hiện quá trình bán tổng hợp ra
các loại kháng sinh khác

II/ Sinh tổng hợp các Penicillin tự nhiên (Penicillin G, Penicillin V)

1. Trước khi lên men
* Chủng giống
- Chủng nấm mốc Penicillium chrysogenum, thuộc họ nấm cúc
(Aspergillaceae), chi mốc xanh (Penicillium)
- Bảo quản ở dạng đông khô, bảo quản siêu lạnh ở nhiệt độ -70ºC hoặc bảo quản
trong Nito lỏng
* Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng
Penicillin là một tripeptid vòng gồm 3 acid amin là acid aminoadipic,
cystein và valin
 Là tiền chất để tổng hợp ra nhân cơ bản của penicillin (6 – APA)
 Cần nguồn đạm giàu acid amin (thường dùng cao ngô) để tế bào nấm xây
dựng nên phân tử penicillin
Thành phần môi trường dinh dưỡng bao gồm những nguồn chính sau
- Nguồn Carbon: Glucose hay lactose là nguồn năng lượng chính để nấm phát
triển, thích hợp nhất là glucose. Để giảm chi phí có thể dùng loại không tinh
khiết như rỉ đường hoặc dịch thủy phân tinh bột
- Nguồn Nitơ: Chủ yếu là cao ngô, có thể thay thế bằng bột đậu tương, bột lạc
hoặc bột hạt bông
- Nguồn lưu huỳnh: Các muối sulfat của kali, natri và amoni. Thường sử dụng
nhất là Nathiosulfat (Na2S2O3)
- Nguồn kim loại vi lượng: Một số kim loại như Mg, Mn, Fe, Zn, Na, Cu,…
thường được bổ sung dưới dạng muối sulfat hoặc có sẵn trong nước máy hoặc
nguồn nguyên liệu tạo môi trường.
- Các chất tiền thể:
 + Nếu bổ sung acid phenylacetic sẽ tạo ra penicillin G
+ Nếu bổ sung acid phenoxyacetic sẽ tạo ra penicillin V
+ Nếu không bổ sung tiền chất, nấm sẽ tạo ra hàng loạt các penicillin có
mạch ngang khác nhau (VD: Penicillin K, Penicillin F, Penicillin N,…)
Các chất tiền thể này đều gây độc cho nấm nên áp dụng biện pháp bổ sung liên
tục và khống chế chặt chẽ nồng độ theo yêu cầu
Môi trường nhân giống

Cao Ngô 20g

Glucose 40g
KH2PO4 0.5g
NaNO3 3.0g
MgSO4.7 H2O 0.125g
CaCO3 5.0
Nước máy vừa đủ 1 lít
pH sau khi khử trùng 6.0-6.1

Môi trường lên men tạo penicillin

Cao Ngô 0.5

Glucose 0.5
Lactose 0.3
NH4NO3 0.125
MnSO4. 7H2O 0.1
Na2SO3 . 10H2O 0.05
MgSO4.7H2O 0.002
ZnSO4 0.002
KH2PO4 0.2
CaCO3 0.3
Acid phenylacetic 0.1
Dầu phá bọt Theo nhu cầu
2. Trong lên men

* Điều kiện lên men

- Nhiệt độ: Duy trì ở 30ºC trong quá trình nhân giống; 23 – 25ºC trong quá trình
lên men
- pH: Trong khoảng 6,0 – 6,5. Cho CaCO 3 vào môi trường lên men để ổn định
pH
- Thông khí: Cần thổi khí (lên men bề mặt); lắc hoặc khuấy trộn kèm theo sục
khí (lên men chìm). Nhu cầu cấp khí khi có khuấy trộn liên tục là 1,2 – 1,5
VVM, khí cần vô trùng
- Thời gian: Trong 6 – 7 ngày
- Thiết bị lên men: làm bằng thép không gỉ, hình trụ, đứng, kín, dung tích 25 –
300 m3

* Nhân giống: Giống cấy cho giai đoạn sản xuất thường là 1 – 10% tổng thể tích
lên men
* Lên men: Phương pháp lên men có bổ sung
- Nuôi cấy giống trong bình lên men, giữ nhiệt độ bình lên men khoảng 25ºc,
khuấy môi trường liên tục và bơm không khí lọc vô trùng với lưu lượng 1,2 –
1,5 VVM
- Kiểm soát quá trình lên men: pha sinh trưởng và pha sinh kháng sinh
+ Pha sinh trưởng: Nấm phát triển hệ sợi mạnh, sinh khối tăng nhanh,
penicillin được tạo ra ít.
+ Pha sinh kháng sinh: Hệ sợi phát triển chậm, sự sản xuất penicillin tăng
dần, penicillin được tạo thành chủ yếu trong pha này
- Thu hoạch: Thu hoạch từng phần và bổ sung môi trường mới
3. Sau lên men: Chiết xuất và tinh chế penicillin

III/ Sản xuất 6 – APA và các kháng sinh penicillin bán tổng hợp
- 6 – APA là khung cơ bản của các penicillin bán tổng hợp, được phát hiện
trong môi trường lên men P.chrysogenum
 Dùng chính Penicillin G/V để chế tạo ra 6 – APA, là nguyên liệu chủ yếu
để bán tổng hợp ra các penicillin mới
- Các penicillin bán tổng hợp được sản xuất bằng cách gắn kết các mạch nhánh
khác nhau vào phân tử 6 – APA bằng con đường hóa học hay sinh học (phương
pháp enzyme từ vi khuẩn)
- Có hai hướng chính là acyl hóa nhóm –NH 2 ở vị trí số 6 và ester hóa nhóm –
COOH ở vị trí số 3
* Sản xuất 6 – APA bằng phương pháp hóa học

Sơ đồ phản ứng tổng hợp hóa học 6 – APA từ Penicillin G

*Sản xuất 6 – APA bằng phương pháp sinh học (phương pháp thủy phân bằng
vi sinh vật/enzyme)
- Người ta sản xuất 6 – APA bằng cách sử dụng Penicillinacylase để cắt mạch
nhánh của Penicillin G/V
- Có thể dung phương pháp chuyển hóa nhờ enzyme (cố định tế bào sinh
enzyme) hoặc cố định trực tiếp enzyme Penicillinacylase/Penicillinamidase
- Cơ chế chung của phương pháp này

- Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Penicillinamindase ngoại bào:
xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, có khả năng thủy phân các Penicillin K, F, V
nhanh nhưng với Penicillin G thì hiệu suất thủy phân thấp. Các enzyme ngoại
bào này hoạt động mạnh ở pH = 9,0
- Một số vi khuẩn có chứa enzyme Penicillinamindase nội bào như E. Coli và B.
megatherium có tác dụng thủy phân nhanh phân tử Penicillin G, hoạt động
mạnh ở pH = 7,3 – 8,5

Nuôi cấy
E.Coli hay

Ly tâm thu
sinh khối,
Phá vỡ tế
bào bằng
 Tinh chế
enzyme, thu

Cố định
enzyme trên
polyacryami

Tách chiết 6
– APA và
tinh chế

IV/ Sinh tổng hợp các cephalosporin và sản xuất các kháng sinh bán tổng hợp
nhóm cephalosporin và 7 – ACA, 7 – ADCA
- Cephalosporin C là kháng sinh chiết xuất từ môi trường lên men
Cephalosporium acremonium có hoạt phổ tương tự penicillin, cũng bị
penicilinase phá vỡ vòng  - lactam
- Penicillin V hoặc Penicillin G có thể được chuyển thành cephalosporin bằng
cách mở rộng vòng hóa học. Tuy nhiên hầu hết các cephalosporin được dùng
trong lâm sàng là sản phẩm bán tổng hợp từ lên men Cephalosporin C
- Các cephalosporin có cấu trúc nhân cơ bản là acid 7 – amino –
cephalosporanic (7 – ACA). Có thể sản xuất 7 – ACA theo phương pháp hóa
học bằng cách cắt mạch nhánh của Cephalosporin C hoặc sử dụng enzyme
penicilinamindase

Sơ đồ phản ứng điều chế 7 – ACA từ Cephalosporin C bằng phương pháp

enzyme
- Trong môi trường lên men C.acremonium tồn tại đồng thời một hỗn hợp
kháng sinh Penicillin N và Cephalosporin C
 Bán tổng hợp các kháng sinh mới nhóm Cephalosporin từ Penicillin
- Từ Penicillin G/V, bằng phương pháp hóa học có thể tạo được nhân 7 –
ADCA. Sau đó enzyme peniciliamindase lại thủy phân cắt đứt mạch bên để tạo
ra nhân cơ bản 7 – ADCA theo sơ đồ phản ứng sau

Sơ đồ phản ứng hóa học điều chế 7 – ADCA từ Penicillin G

- Từ 7 – ACA và 7 – ADCA bằng các phản ứng hóa học đã tạo ra hàng ngàn
cephalosporin mới có hoạt phổ kháng khuẩn khác nhau được dùng trong y học