(Biophavn) SX KHANG SINH

SẢN XUẤT KHÁNG SINH
Mục tiêu
1. Nắm được qui trình chung sản xuất kháng sinh
2. Xây dựng qui trình sản xuất benzylpenicillin
3. Mở rộng triển khai qui trình sản xuất một số kháng

sinh khác
Kháng sinh – Lịch sử phát triển
1928: phát hiện nấm mốc xanh

Penicillium có khả năng ức chế
sự phát triển của vi khuẩn
Alexander Fleming
~ 1940: phát hiện chủng Penicillium

mới có khả năng sản xuất penicillin
với số lượng lớn
Howard Walter Florey

Kháng sinh – Lịch sử phát triển
1944: phát hiện streptomycin từ xạ

khuẩn Streptomyces
Salman Waksman
Một số kháng sinh khác:
 Actinomycin, neomycin, streptothricin từ Streptomyces
 Polymyxin, chloramphenicol, tetracyclin,..
 Từ 1970, kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp

Sản xuất kháng sinh – Các giai đoạn
Sản xuất
Chiết tách
Tinh chế
Đóng gói
Sản xuất kháng sinh – Giai đoạn lên men
Nguyên liệu thô Vi sinh vật Kháng sinh
Quá trình lên men

Nguyên liệu thô Chất chống bọt

Dầu thực vật, silicon
Nguồn carbon Nguồn nitơ Khoáng chất, vitamin
Lactose, glucose Muối amoni S, P, Cu, Zn, Mg
Rỉ đường, đậu Sulfat,

nành hydrophosphat
Nuôi cấy vi sinh vật trong

bình lắc với mội trường tăng
trưởng
Vi sinh vật sản xuất

kháng sinh
Bình lên men
Trong quá trình lên men, VSV tiếp

tục tăng trưởng và sản xuất 1
Bình chứa môi trường được trang Giai đoạn lên lượng lớn kháng sinh
bị đĩa khuấy để trộn môi trường và men
bơm không khí vô trùng
http://www.madehow.com/Volume-4/Antibiotic.html
Lên men kháng sinh – Các giai đoạn
Lên men kháng sinh gồm các giai đoạn:
 Giai đoạn chuẩn bị:
1. Hoạt hóa vi sinh vật
2. Chuẩn bị bình chứa môi trường:

• Môi trường: nước nóng, chất dinh dưỡng (C, N,…),
yếu tố tăng trưởng (vitamin, acid amin…)
• Đĩa khuấy để trộn đều môi trường
• Bơm không khí lọc vô trùng
• Sau 24-48 h, chuyển môi trường sang bình lên men

3. Giai đoạn lên men:
• VSV tăng trưởng và nhân đôi
• Sản xuất 1 lượng lớn kháng sinh
Yêu cầu kỹ thuật

 Giữ nhiệt độ bình lên men khoảng 25 oC
 Khuấy môi trường liên tục
 Bơm không khí lọc vô trùng

by Genentech, Graphics Department
Bình lên men

Sản xuất kháng sinh – Giai đoạn chiết tách và tinh chế
Giai đoạn chiết tách, tinh chế và hoàn chỉnh
Sau khi chiết tách từ dịch lên men và tinh chế bằng phương pháp trao
đổi ion hay dung môi, thu được kháng sinh dạng bột
Đóng gói và vận chuyển
http://www.madehow.com/Volume-4/Antibiotic.html
4. Giai đoạn chiết tách và tinh chế:
Sau 3-5 ngày lên men, lượng kháng sinh thu được đạt
tối đa  bắt đầu giai đoạn chiết tách
 Kháng sinh tan trong nước: chiết tách bằng phương

pháp trao đổi ion
• Tách kháng sinh ra khỏi tạp chất hữu cơ
• Tách kháng sinh với các hợp chất tan trong nước
khác
Nguyên tắc chiết tách kháng sinh bằng pp trao đổi ion
http://www.waters.com/waters
 Kháng sinh tan trong dầu: chiết tách bằng dung môi
• Dịch lên men được xử lý bằng dung môi hữu cơ:
butyl acetat, methyl isobutyl keton  hòa tan kháng
sinh
• Phục hồi kháng sinh bằng các chất hữu cơ
 Kháng sinh thu được ở dạng bột tinh khiết
Sản xuất kháng sinh – Giai đoạn hoàn chỉnh
5. Sản xuất kháng sinh với các dạng bào chế khác
nhau:
• Dạng tiêm truyền tĩnh mạch: kháng sinh được hòa trong
dung môi, đóng gói và hàn kín
• Dạng viên nang
• Dạng thuốc bôi ngoài da
6. Vận chuyển đến nơi đóng gói
7. Phân phối đến nơi sử dụng

Sản xuất kháng sinh
Toàn bộ quá trình sản xuất kháng sinh: lên men,

phục hồi và xử lý có thể hoàn thành trong 5 – 8 ngày
Sản xuất kháng sinh – Kiểm soát chất lượng
Sản xuất kháng sinh
Môi trường Trang thiết bị
Vô trùng
Sản xuất kháng sinh – Kiểm soát chất lượng
 Kiểm tra dịch nuôi cấy vi sinh vật trong suốt quá trình
lên men
 Kiểm tra thường xuyên các thông số: pH, độ ẩm,

điểm chảy,…
Sản xuất benzylpenicillin
Kháng sinh bezylpenicillin
Vòng
Vòng β-lactam thiazolidin
Nhánh acyl Acid 6-aminopenicillanic
Cấu trúc của penicillin G – penicillin tự nhiên

Kháng sinh bezylpenicillin
 Là kháng sinh đầu tiên được sản xuất với khối lượng
lớn
 Là nguyên liệu dùng để bán tổng hợp các kháng sinh

khác
 Quá trình lên men penicillin là mô hình sản xuất

kháng sinh điển hình
 Vẫn được sử dụng trong lâm sàng

Sản xuất benzylpenicillin – Khó khăn
Mặc dù:
 Sử dụng các thiết bị hiện đại, phức tạp

Mặc dù:
 Áp dụng kỹ thuật kiểm soát chất lượng (feed back

control)
Mặc dù:
 Áp dụng kỹ thuật xử lý trên máy tính

Tuy nhiên: qui trình lên men kháng sinh chưa hoàn
thiện, do:
 Khó khăn khi tối ưu hóa
 Không thể thu được hai lô sản phẩm hoàn toàn giống
nhau
Nguyên nhân:
 Chất lượng và số lượng dân số vi sinh vật thay đổi

trong suốt chu trình sản xuất
 Do những thay đổi nhỏ trong các thông số kiểm soát:

áp suất không khí, độ chìm sâu
 Môi trường dinh dưỡng phức tạp

Sản xuất benzylpenicillin – Giống
 1928: Fleming phân lập P. notatum sản xuất penicillin
 1940: Florey và Chain sản xuất penicillin tinh khiết với

số lượng lớn
Tuy nhiên, khó khăn của kỹ thuật nuôi cấy bề mặt môi
trường lỏng vi sinh vật hiếu khí:
• Quá trình nuôi cấy kéo dài
• Cần nhiều sức lao động
• Dễ bị nhiễm
Penicillium chrysogenum
P. chrysogenum được phân lập từ dưa bị nhiễm mốc

xanh, có khả năng sản xuất penicillin với hiệu suất cao
P. chrysogenum có thể tăng trưởng trong điều kiện lên

men chìm trong bình kín có khuấy và thông khí liên tục
Khả năng sản xuất kháng sinh trên qui mô

công nghiệp
Chủng P. chrysogenum
Sản xuất PN ~ 2 mg/l
hoang dại
Đột biến Tác nhân vật lý, hóa học
đột biến
Chọn lọc
Sản xuất PN ~ 20 g/l
đột biến chọn lọc
15 kb
ACV synthase Isopenicillin N Acyltransferase

synthase
Nhóm gen chịu trách nhiệm sinh tổng hợp penicillin ở P. chrysogenum
http://jb.asm.org/cgi/content/full/182/9/2355/F1
Nhóm gen penicillin
Nhóm gen penicillin tái

tổ hợp
Tạo chủng vi sinh vật sản xuất

penicillin với hiệu suất cao
Sản xuất benzylpenicillin – Nhân giống
Chủng vi sinh vật gốc
Nuôi cấy trên môi trường rắn
Hoạt hóa trong môi trường lỏng
Nuôi cấy với môi trường lỏng

trong bình lắc
Nuôi cấy với môi trường lỏng

trong hệ thống thiết bị
Sản xuất benzylpenicillin – Lên men
Nồi lên men

1. Cung cấp oxy

- Dưới dạng không khí lọc vô trùng
- Tốc độ 0,5 – 1,2 vvm
 Trang bị hệ thống cánh khuấy và gờ cản:

• Thúc đẩy quá trình thông khí
• Thúc đẩy sự trộn lẫn tế bào và môi trường

2. Kiểm soát nhiệt độ

- Quá trình sản xuất penicillin nhạy cảm với nhiệt độ
- Duy trì nhiệt độ 26±1 oC
 Trang bị hệ thống làm lạnh:
• Kiểm soát nhiệt chuyển hóa
• Giảm nhiệt độ của quá trình lên men
• Làm nguội môi trường sau khi tiệt trùng

Hệ thống
làm lạnh
Nồi lên men

3. Thiết bị và tác nhân khử bọt

- Quá trình nuôi cấy vi sinh vật tạo bọt do sự thông khí và
khuấy trộn mạnh
 Dịch nuôi cấy VSV bị hao hụt theo đường khí thải
 Cần trang bị hệ thống phát hiện bọt tự động
 Xử lý:
• Tạm thời: tạo áp suất ngược dòng  giữ dịch

nuôi cấy trong nồi lên men
• Dùng chất khử bọt vô trùng

4. Các trang bị khác

- Các thiết bị khác được trang bị nhằm kiểm tra các thông
số như: nhiệt độ, pH, năng lượng tiêu hao của mô tơ điện,
dòng khí, oxy hòa tan và phân tích khí thải
- Bộ cảm biến cung cấp dữ liệu cho quá trình kiểm soát
chất lượng thủ công hay bằng hệ thống máy tính
Một số thiết bị hỗ trợ quá trình lên men
http://216.47.139.198/pensim/bground.html
5. Bổ sung môi trường

- Môi trường lên men không chứa tất cả các chất dinh
dưỡng cần thiết ngay từ đầu
- Các chất bổ sung:
• Được tiệt trùng từng lô hay tiệt trùng bằng hệ thống

liên tục
• Bổ sung trong suốt quá trình lên men bằng hệ

thống tự động  có thể kiểm soát tốc độ hoặc
ngừng cung cấp
6. Hệ thống vận chuyển và lấy mẫu

- Hệ thống vận chuyển vô trùng dùng để:
• Chuyển giống vi sinh vật vào nồi lên men
• Lấy mẫu thường qui trong quá trình lên men
• Thu hoạch sản phẩm từng phần khi nồi lên men
đầy do bổ sung môi trường
• Chuyển sản phẩm của quá trình lên men sang giai
đoạn chiết tách
6. Hệ thống vận chuyển và lấy mãu

- Hệ thống vận chuyển vô trùng do:
• Thiết kế kỹ thuật
• Hơi nước phải tiếp xúc được với toàn bộ bộ phận

của nồi lên men và hệ thống ống dẫn
Bất cứ khối không khí hay bề mặt thiết bị không tiếp

xúc với hơi nước đều có thể là nguyên nhân gây
ngoại nhiễm
6. Hệ thống vận chuyển và lấy mãu

- Quá trình lấy mẫu cần thiết nhằm theo dõi:
• Tốc độ tăng trưởng
• Động học của các chất dinh dưỡng
• Nồng độ penicillin
• Sự ngoại nhiễm
Lên men benzylpenicillin – Kiểm soát
- Độ thông khí: tốc độ tăng trưởng VSV trong giai đoạn lên
men = giai đoạn nhân giống  mật độ VSV trong môi
trường cao  không đủ thông khí để duy trì sản xuất
penicillin
- Nồng độ oxy: nồng độ oxy dưới ngưỡng tới hạn 

quá trình sinh tổng hợp benzylpenicillin giảm mạnh
mặc dù VSV vẫn tăng trưởng
Sản xuất benzylpenicillin – Kiểm soát quá trình lên men
Kiểm soát tốc độ tăng trưởng của VSV:
 Duy trì tốc độ tăng trưởng nhanh chỉ đến khi mật độ
VSV đạt tối đa so với công suất của nồi lên men
 Tốc độ giai đoạn tăng trưởng tiếp theo được kiểm

soát bằng cách kiểm tra nghiêm ngặt lượng chất dinh
dưỡng cung cấp
Benzylpenicillin được sản xuất với hiệu suất cao

Lên men benzylpenicillin – Môi trường
Môi trường lên men ban đầu chỉ cung cấp một lượng
chất dinh dưỡng nhất định cho quá trình tăng trưởng
VSV trong giai đoạn đầu
1. Nguồn nitơ: cao ngô (Corn Steep Liquor – CSL)
• Là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất tinh bột
ngô
• Được dùng để nuôi cấy nấm sản xuất penicillin và

nhiều loại nấm sản xuất kháng sinh khác
• Cung cấp mốt số hợp chất carbon có ích như:

acid, đường
• Cung cấp một số ion vô cơ và yếu tố tăng trưởng
• Rẻ tiền
1. Nguồn nitơ: cao ngô (Corn Steep Liquor – CSL)
• Là chất dinh dưỡng phức tạp, thành phần hóa học

chưa được xác định rõ
• Là hợp chất tự nhiên
• Thành phần khác nhau giữa các lô mẻ sản xuất
Không có hai lô mẻ lên men hoàn toàn giống nhau
Chuyển sang sử dụng nguồn nitơ có thành phần xác

định
2. Nguồn nitơ phụ trợ và một số chất dinh dưỡng cần

thiết khác:
• Canxi: dưới dạng CaCO3 để trung hòa pH acid tự

nhiên của cao ngô
• Magie, sulfat, phosphat, kali và các kim loại vi

lượng
Lên men benzylpenicillin – Môi trường lên men
3. Tiệt trùng môi trường:
- Ở 120 oC
- Trong nồi lên men hoặc trong thiết bị đi kèm
- Có thể tiệt trùng liên tục

Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng
- Môi trường tiệt trùng được khuấy trộn, thông khí, điều
chỉnh pH, nhiệt độ
- Cấy giống và bắt đầu pha tăng trưởng
- Nguồn carbon ban đầu:
• Chỉ đủ cung cấp cho giai đoạn tăng trưởng ban đầu
• Không đủ :
 Cung cấp năng lượng cho quá trình sản xuất
penicillin
 Đảm bảo duy trì sinh khối cần thiết trong các
giai đoạn còn lại của quá trình lên men
- Nguồn carbon được bổ sung liên tục để có thể kiểm

soát tốc độ tăng trưởng của VSV
- Nguồn carbon thường được sử dụng: sucrose hoặc

glucose. Để giảm chi phí có thể sử dụng dạng không
tinh khiết: mật đường hoặc dịch tinh bột thủy phân
- Nguồn carbon khác: nhiều nhà sản xuất sử dụng

lactose
- Khi nồng độ đường còn dư trong môi trường quá thấp

 không đo được  tốc độ bổ sung nguồn carbon
quyết định dựa trên kinh nghiệm và quan sát hệ thống
- Kiểm soát tỉ lệ cung cấp nguồn carbon  sử dụng

lactose  tốc độ thủy phân lactose thành hexose hạn
chế  lượng carbon cung cấp chậm và ổn định
- Canxi, magie, phosphat và các kim loại vi lượng được

cung cấp từ đầu  đủ dùng cho cả quá trình lên men
- Nitơ và lưu huỳnh cần bổ sung để cân bằng với nguồn

carbon
• Bổ sung nitơ dưới dạng khí amoniac
• Bổ sung sulfat dưới dạng kết hợp với đường

- Tỉ lệ cân bằng giữa nitơ và carbon giúp:
• Đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của VSV
• Duy trì lượng dự trữ ion amoni
• Cân bằng pH môi trường: quá trình chuyển hóa

carbon tạo pH acid sẽ được cân bằng pH kiềm của
amoniac
- Pha tăng trưởng nhanh chóng chuyển sang pha sản

xuất penicillin
 pH và nhiệt độ tối ưu của pha tăng trưởng không phải

là tối ưu của pha sản xuất penicillin
 thay đổi pH và nhiệt độ
- Acid phenylacetic (PAA) là chất bổ sung cuối cùng sẽ

được cung cấp liên tục
- Các chất dinh dưỡng được tiệt trùng trước khi đưa vào
nồi lên men
- Hiếm khi xảy ra nhiễm vi khuẩn đề kháng kháng sinh
- Ngoại nhiễm gây ảnh hưởng đến chất lượng quá trình
lên men. VD: vi khuẩn sản xuất β-lactamase gây:
• Phá hủy penicillin
• Sử dụng chất dinh dưỡng của môi trường
• Mất kiểm soát pH môi trường
• Ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

Yêu cầu quan trọng của quá trình lên men là điều
kiện vô trùng  duy trì sự tăng trưởng của VSV sản
xuất kháng sinh, không có sự phát triển của VSV
ngoại nhiễm
Lên men benzylpenicillin – Kích thích bằng PAA
- PAA cung cấp nhánh bên cho penicillin
- Không có PAA, hiệu suất sản xuất penicillin giảm mạnh
- PAA ức chế sự tổng hợp các penicillin không mong

muốn khác
- Nồng độ PAA cao gây độc
- PAA có giá thành cao
Kiểm soát lượng PAA không đạt tới giới hạn gây độc 
giảm lượng PAA ngay trước khi quá trình lên men kết
thúc
- PAA hiện diện trong cao ngô: do hệ vi khuẩn tự nhiên

biến đổi từ phenylalanin có trong hạt ngô
PAA Nhánh acyl Acid 6-

aminopenicillanic
+ PAA
Sinh tổng hợp và bán tổng hợp các penicillin
Sản xuất benzylpenicillin – Nguyên liệu
Môi trường nuôi cấy sản xuất penicillin:

Thành phần Tỉ lệ [% (w/v)]
Nước
Cao ngô 2,0
Lactose 4,0
NaNO3 0,3
K2HPO4 0,05
MgSO4 0,025
CaCO3 0,4
Β- phenylethylamin 0,25
Chất chống tạo bọt 3 giọt/100 ml
Lên men benzylpenicillin – Kết thúc
- Kết thúc quá trình lên men phụ thuộc nhiều yếu tố và là
một quyết định phức tạp
- Ngừng quá trình lên men khi bắt đầu giảm hiệu suất
biến đổi các nguyên liệu thô đắt tiền thành penicillin
Lên men benzylpenicillin – Kết thúc
Động học quá trình lên men penicillin

Sản xuất benzylpenicillin – Chiết xuất
1. Loại bỏ tế bào
Bezylpenicillin và các chất chuyển hóa khác hòa tan

ngoại bào cùng với các thành phần môi trường dinh
dưỡng
 Bước đầu tiên sau lên men là loại bỏ tế bào VSV khỏi
môi trường lỏng: dùng phương pháp lọc hoặc ly tâm
Tuyệt đối tránh ngoại nhiễm VSV có khả năng sản

xuất β-lactamase – là nguyên nhân gây thất thoát
sản phẩm
Chiết xuất benzylpenicillin – Chiết tách
2. Tách bezylpenicillin
- Thường tách bằng dung môi. Ngoài ra có thể dùng
phương pháp sắc ký trao đổi ion, kết tủa
- Ở pH 2-2,5, penicillin có hệ số tách cao trong các
dung môi hữu cơ như amyl acetat, butyl acetat, metyl
isobutyl keton
Thực hiện chiết tách nhanh vì benzylpenicillin không
bền ở pH thấp
- Tách penicillin trở lại pha nước bằng hệ đệm pH 7,5
- Kết tinh và sấy khô bezylpenicillin
Chiết xuất benzylpenicillin – Xử lý sản phẩm thô
3. Xử lý bezylpenicillin
- Bezylpenicillin được sản xuất dưới các dạng muối
khác nhau, tùy mục đích sử dụng:
• Là nguyên liệu bán tổng hợp các kháng sinh nhóm
β-lactam
• Dùng trong lâm sàng
- Gồm ba bước cơ bản:
1. Tạo muối thích hợp
2. Loại bỏ chí nhiệt tố
3. Tiệt trùng: lọc hay nhiệt khô
Chiết xuất benzylpenicillin – Xử lý sản phẩm thô
3. Xử lý bezylpenicillin
- Bào chế:
 Dùng đường tiêm: kháng sinh được đóng gói trong
lọ vô trùng dưới dạng bột đông khô hay huyền dịch
 Dùng đường uống: được bào chế dưới dạng viên
bao phim hay các dạng khác
- Kiểm nghiệm:
Lấy ngẫu nhiên số lượng thích hợp mẫu thành phẩm

kiểm tra hoạt tính, độ tinh khiết, chí nhiệt tố và độ vô
trùng
Sản xuất penicillin V
Cung cấp các chất cho

acyl khác nhau
Tổng hợp các

penicillin khác nhau
Chất cho acyl Penicillin

PAA Benzylpenicillin
Phenoxyacetyl Penicillin V
Sản xuất penicillin V
Chủng VSV: P. chrysogenum
 Dùng một chủng đột biến để sản xuất hai kháng

sinh
 Dùng các chủng đột biến khác nhau để sản xuất

hai loại penicillin
Penicillin V
Penicillin V:
- Sử dụng trong lâm sàng
- Là nguyên liệu bán tổng hợp các penicillin khác không

sản xuất trực tiếp được bằng phương pháp lên men
Sản xuất penicillin
Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn sản xuất penicillin

http://www.unisanet.unisa.edu.au/Information/10947info/08%20Lecture%2026%20antimicrobials%205.pdf
Sơ đồ tóm tắt dây chuyền sản xuất penicillin

http://www.sciencecentric.com/news/08061223-pfizers-work-on-penicillin-becomes-national-historic-chemical-landmark.html
Dây chuyền sản xuất penicillin của nhà máy Pfizer

Sản xuất cephalosporin C
Benzylpenicillin, penicillin V
Mở vòng
Cephalosporin
VD: sản xuất cephalosporin thế hệ 1: cephalexin
Đa số cephalosporin được bán tổng hợp từ sản

phẩm lên men cephalosprin C
Lên men cephalosporin C – Giống
- Chủng gốc Acremonium chrysogenum (trước đây có

tên Cephalosporium acremonium): được phân lập ở bờ
biển Sardinian (Địa Trung Hải), năm 1945
- Cephalosporin C được phân lập năm 1952
- Sau một thập kỷ, các cephalosporin bán tổng hợp mới
được sử dụng trong lâm sàng
Lên men cephalosporin C


Sinh tổng hợp penicillin = Sinh tổng hợp

cephalosporin C
Isopenicillin N
Penicillin N
Desacetoxycephalosprin C
Desacetylcephalosprin C Cephamycin C
Cephalosprin C
Kháng sinh nhóm cephem
Cephalosporin C
Cephamycin C
- Quá trình lên men cephalosporin C tương tự như

benzylpenicillin
- Không cần tiền chất dinh dưỡng chuyên biệt cho quá
trình lên men
- Các chất chuyển hóa của sinh vật cung cấp đủ cơ chất
mang nhóm acetyl cho phản ứng vận chuyển acetyl
(acetyltransferase)
Chiết tách cephalosporin C
Chiết tách cephalosporin chủ yếu bằng phương pháp

hấp phụ trên carbon hay resin, không sử dụng dung môi
Qui trình sản xuất kháng sinh khác nhau ở giai đoạn
phục hồi, không khác nhau ở giai đoạn lên men
Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh
Sản xuất
Chiết tách
Đảm bảo
GMP
chất lượng
Tinh chế
Đóng gói
Kiểm tra chất lượng
Dạng chưa thành Dạng thành phẩm

phẩm
Một số yêu cầu cơ bản của GMP:
1. Tất cả giai đoạn sản xuất phải được xác định rõ và

nguyên vật liệu phải ổn định để đảm bảo chất lượng
cũng như các tiêu chuẩn chuyên biệt
2. Các bước quyết định và những thay đổi lớn đến quá
trình phải được xem xét
3. Tất cả các yếu tố thuận lợi cần thiết cho GMP phải
được chuẩn bị:
• Đào tạo nhân lực
• Nhà xưởng
• Trang thiết bị
• Nguyên vật liệu, bao bì, nhãn
• Qui trình, tài liệu chuẩn
•
4. Tài liệu và qui trình được viết rõ ràng, ngôn ngữ dễ

hiểu
5. Người vận hành được đào tạo để thực hiện đúng qui
trình
6. Ghi lại báo cáo từng giai đoạn sản xuất, những thay
đổi và điều tra nguyên nhân
7. Báo cáo quá trình sản xuất và phân phối của từng lô
mẻ
8. Giảm thiểu nguy cơ ảnh hưởng đến chất lượng trong

quá trình phân phối
9. Có hệ thống sẵn sàng thu hồi bất cứ lô mẻ sản xuất

nào từ nhà kinh doanh hay phân phối
10. Xem xét tất cả các ý kiến phản hồi

Sản xuất erythromycin
Sản xuất erythromycin từ Saccharopolyspora erythraea
Xạ khuẩn Actinomyces:
- Phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước
- Cung cấp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp
- 9.000 hợp chất, chiếm 70-80% chất chuyển hóa thứ

cấp có hoạt tính sinh học do Actinomyces sản xuất:
• Chiếm 2/3 tổng số kháng sinh do VSV sản xuất
• 60% chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học không

phải là kháng sinh
• 80% do vi khuẩn thuộc chi Streptomyces sản xuất

Sản xuất erythromycin từ S. erythraea
Xạ khuẩn Actinomyces:
- Có thể sử dụng Actinomyces với qui mô công nghiệp

để sản xuất hợp chất polyketide có nhiều hoạt tính
sinh học khác nhau như chống ung thư, kháng sinh,
ức chế miễn dịch,…
- S. erythraea có khả năng sản xuất kháng sinh nhóm

macrolid erythromycin – là một polyketide nhóm I
- Erythromycin được phân lập từ S. erythraea (trước
đây có tên là Streptomyces erythraea)
- Waksman phân lập S. erythraea năm 1919
- 1952, hoạt tính kháng sinh của chủng S. erythraea

NRRL2338 có nguồn gốc từ chủng phân lập đầu tiên
được công bố
- Chủng NRRL2338 sản xuất 0,25-1 g erythromycin

trong 1 l môi trường, tùy điều kiện lên men
- Sau 50 năm, hiệu suất tăng gấp 10 lần, 10-13 g/l môi
- Quá trình sinh tổng hợp erythromycin do nhóm gen

ery có kích thước khoảng 60 kb mã hóa
Modul ER
Domäne
KR KR DH KR KR KR
AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP TE
S S S S S S S
O O O O O O O
OH OH O OH OH
OH OH O OH
OH OH O
O
OH OH O
HO OH
OH OH
OH NMe2
HO
O OH
O O
O O OMe
O OH
Erythromycin
- Quá trình lên men tạo hỗn hợp erythromycin A, B, C

và D:
• Chỉ có erythromycin A là chất mong muốn
• Các chất khác là sản phẩm trung gian bị hydroxy

hay methyl hóa
- Chủng VSV tốt có khả năng sản xuất 8-10 g/l

erythromycin, chiếm >90% hàm lượng
- 1952, Lilly là công ty đầu tiên sản xuất erythromycin

cung cấp cho thị trường
- Những năm 1970, Abbot là nhà cung cấp lớn nhất về

số lượng cũng như giá trị
- Mỗi năm sản xuất ~ 4.000 tấn erythromycin:
• 1.000 tấn dùng ở dạng erythromycin
• 1.500 tấn chuyển thành azithromycin
• 1.500 tấn chuyển thành clarithromycin
• 400 tấn chuyển thàng roxithromycin

Chọn giống, giữ giống và lên men
Khuẩn lạc S. erythraea
Các chủng năng suất cao dễ bị biến đổi di truyền  liên

tục phân lập lại để giữ chủng cho năng suất cao đồng
thời có ít sản phẩm phụ erythromycin B, C
1. Chọn chủng S. erythaea năng suất cao:
- Chọn chủng từ ống thạch nghiêng, đông khô hay

huyền phù bào tử
- Nuôi cấy trong 30 ml môi trường lỏng V1
- Sau 48 h, pha loãng và trải trên môi trường M1 hay

CMAE-1 để thu các khuẩn lạc riêng rẽ
1. Chọn chủng S. erythaea năng suất cao:
- Sau 10-14 ngày ủ ở 34 oC, khuẩn lạc mọc:
• Giống ngôi sao
• Đường kính ~ 3 mm
• Màu xám hồng, mặt dưới màu nâu đậm
• Chọn các khuẩn lạc có hình thái khóm khác nhau

và cấy trên ống thạch nghiêng
2. Giữ giống S. erythaea:

- Ống thạch nghiêng:
• Ủ 10-14 ngày ở 34 oC
• Bảo quản ở 4 oC trong 1 tháng
- Huyền phù bào tử:
• Thêm 5 ml nước vô trùng vào ống thạch nghiêng
• Thêm 20% glycerol
• Phân nhỏ thành ống 1,5 ml
• Bảo quản ở -80 oC trong 1 năm
Kiểm tra khả năng sản xuất erythromycin:

- 1 ml huyền phù bào tử mới pha hoặc 1,5 ml huyền
phù bào tử đông khô + 30 ml môi trường V1. Ủ 40
giờ ở 34 oC trên máy lắc
- Lấy 3 ml dịch nuôi cấy + 27 ml môi trường F1, nuôi
trong 9 ngày và bổ sung:
• Ngày 0-6: dầu đậu nành, 0,2 ml/ngày
• Ngày 0-5: n-propanol, 0,1 ml/ngày
• Ngày 6-9: n-propanol, 0,15 ml/ngày
Kiểm tra khả năng sản xuất erythromycin:

- Cân bình và bổ sung lượng nước bay hơi hàng ngày
- Lấy mẫu, lọc và định lượng erythromycin
- Chọn chủng tốt nhất để đông khô
3. Lên men:
- Giai đoạn 1: nuôi cấy giống trong 35 ml MT V1
- Giai đoạn 2: sau 48 giờ:
• Cấy vào 3,5 l môi trường V2
• Tốc độ thông khí 0,6 vvm
• Nhiệt độ 34 oC
 Theo dõi lượng oxy hòa tan, pH, quá trình oxy hóa
khử, nồng độ khí thải CO2
 Theo dõi sự tăng trưởng: ly tâm đo thể tích hệ sợi

hoặc cân sinh khối
3. Lên men:
- Giai đoạn 3: sau ~ 40 giờ, chuyển 1,5 l dịch nuôi cấy
vào bình lên men 20 l chứa 10 l môi trường F1
• Nhiệt độ 34 oC
• Chỉnh pH ≤ 7,2 bằng H2SO4
• Tốc độ khuấy 700 vòng/phút

• Tốc độ thông khí 0,37 vvm trong 12 giờ đầu, sau
đó tăng lên 0,83 vvm
• Duy trì dinh dưỡng: dầu đậu nành, n-propanol,
3. Lên men:
- Giai đoạn 3:
 Theo dõi quá trình oxy hóa khử, nồng độ khí thải
CO2, glucose tự do
 Hàng ngày lấy 50-100 ml dịch nuôi cấy để định lượng

erythromycin
 Soi kính hiển vi để kiểm tra ngoại nhiễm và hình thái

VSV
Chiết tách erythromycin
Tách erythromycin gồm các bước chính:
1. Tách erythromycin-isothiocyanat
2. Tạo erythromycin base
3. Kiểm tra độ tinh khiết và hoạt tính erythromycin

- Chỉnh pH 8,5 bằng NaOH 20%
- Ly tâm với vận tốc 3.000 g ở 4 oC để loại bỏ sinh khối.
Dịch nổi tiếp tục lọc bằng sợi thủy tinh
- Chỉnh pH 9,5 ± 0,1
- Thêm 1,5% methylisobutylketon và khuấy đều trong
10 phút ở 4 oC
- Ly tâm với vận tốc 2.000 g trong 5 phút
- Thu pha hữu cơ và định lượng erythromycin bằng
HPLC
- Đun pha hữu cơ đến 30 oC, thêm 0,63 l dung dịch Na

isothiocyanat 33% cho mỗi gam erythromycin
- Chỉnh pH 5,8 bằng acid acetic 10%
- Làm nguội hỗn hợp đến 10 oC, ủ trong 3 giờ và khuấy

nhẹ để kết tinh erythromycin, duy trì pH 5,8
- Lọc và rửa tủa bằng nước cất
- Sấy chân không ở 50 oC
- Hiệu suất của giai đoạn này khoảng 83%

- Hòa tan bằng cách khuấy nhẹ erythromycin –

isothiocyanat trong dichloromethan ở 33 oC, chỉnh pH
9,5-10 bằng NaOH 15%
- Lọc huyền dịch với chất trợ lọc, than hoạt. Rửa lại
bằng 1 lượng nhỏ dichloromethan
- Tách pha hữu cơ (dịch lọc) với nước khử ion ở 33 oC,
khuấy nhẹ
- Cô quay dịch chiết để tăng nồng độ erythromycin 

dễ dàng kết tinh
- Kết tinh erythromycin ở 5 oC trong 3-5 giờ
- Phục hồi erythromycin bằng ly tâm hay lọc, rửa lại

bằng dichloromethan, sấy khô ở 50 oC
- Hòa tan erythromycin base thô trong nước khử ion và

đun ở 50-60 oC
- Thêm lauryl sulfat. Ly tâm hay lọc, rửa với nước khử
ion (60 oC) để thu erythromycin base tinh khiết
- Erythromycin base có thể chuyển thành dạng ester,

muối hay dẫn chất bán tổng hợp
3. Thử hoạt tính sinh học và độ tinh khiết
Thử hoạt tính sinh học của eruthromycin bằng phương

pháp sinh học và thực hiện song song với
erythromycin chuẩn, gồm các bước:
- Đổ 35 ml môi trường TSB vào hộp petri (12x12 cm)
- Khi môi trường đông đặc, thêm lớp thứ hai gồm 35
ml TSB và 35 μl dịch nuôi cấy của Micrococcus luteus
( nuôi 18 giờ, ở 30 oC trong môi trường LB)
3. Thử hoạt tính sinh học và độ tinh khiết
- Nhỏ 10 μl phần nổi của dịch nuôi cấy (hoặc dạng hòa
tan trong methanol) lên đĩa thử kháng sinh đặt trên bề
mặt hộp thạch. Ủ ở 30 oC trong 48 giờ, đo vùng ức
chế tăng trưởng của M. luteus và tính lượng
erythromycin dựa vào đường cong chuẩn
- Thử độ tinh khiết bằng HPLC: định lượng

erythromycin A, B, C

(Biophavn) SX KHANG SINH

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

(Biophavn) SX KHANG SINH

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

SẢN XUẤT KHÁNG SINH

1. Nắm được qui trình chung sản xuất kháng sinh

2. Xây dựng qui trình sản xuất benzylpenicillin

3. Mở rộng triển khai qui trình sản xuất một số kháng

1928: phát hiện nấm mốc xanh

~ 1940: phát hiện chủng Penicillium

Howard Walter Florey

1944: phát hiện streptomycin từ xạ

Một số kháng sinh khác:

 Actinomycin, neomycin, streptothricin từ Streptomyces

 Polymyxin, chloramphenicol, tetracyclin,..

 Từ 1970, kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp

Nguyên liệu thô Vi sinh vật Kháng sinh

Quá trình lên men

Nguyên liệu thô Chất chống bọt

Nguồn carbon Nguồn nitơ Khoáng chất, vitamin

Lactose, glucose Muối amoni S, P, Cu, Zn, Mg

Rỉ đường, đậu Sulfat,

Nuôi cấy vi sinh vật trong

Vi sinh vật sản xuất

Bình lên men

Trong quá trình lên men, VSV tiếp

Lên men kháng sinh gồm các giai đoạn:

 Giai đoạn chuẩn bị:

1. Hoạt hóa vi sinh vật

2. Chuẩn bị bình chứa môi trường:

• Đĩa khuấy để trộn đều môi trường

• Bơm không khí lọc vô trùng

• Sau 24-48 h, chuyển môi trường sang bình lên men

3. Giai đoạn lên men:

• VSV tăng trưởng và nhân đôi

• Sản xuất 1 lượng lớn kháng sinh

Yêu cầu kỹ thuật

 Khuấy môi trường liên tục

 Bơm không khí lọc vô trùng

by Genentech, Graphics Department

Bình lên men

Giai đoạn chiết tách, tinh chế và hoàn chỉnh

Đóng gói và vận chuyển

4. Giai đoạn chiết tách và tinh chế:

 Kháng sinh tan trong nước: chiết tách bằng phương

• Tách kháng sinh ra khỏi tạp chất hữu cơ

• Dạng viên nang

• Dạng thuốc bôi ngoài da

6. Vận chuyển đến nơi đóng gói

7. Phân phối đến nơi sử dụng

Toàn bộ quá trình sản xuất kháng sinh: lên men,

Sản xuất kháng sinh

Môi trường Trang thiết bị

 Kiểm tra thường xuyên các thông số: pH, độ ẩm,

Nhánh acyl Acid 6-aminopenicillanic

Cấu trúc của penicillin G – penicillin tự nhiên

 Là nguyên liệu dùng để bán tổng hợp các kháng sinh

 Quá trình lên men penicillin là mô hình sản xuất

 Vẫn được sử dụng trong lâm sàng

 Sử dụng các thiết bị hiện đại, phức tạp

 Áp dụng kỹ thuật kiểm soát chất lượng (feed back

 Áp dụng kỹ thuật xử lý trên máy tính

 Khó khăn khi tối ưu hóa

 Chất lượng và số lượng dân số vi sinh vật thay đổi

 Do những thay đổi nhỏ trong các thông số kiểm soát:

 Môi trường dinh dưỡng phức tạp

 1928: Fleming phân lập P. notatum sản xuất penicillin