CNSH VSV 12/19/2020

Công nghệ sinh học vi sinh vật

Probiotics in food

TS. Nguyễn Hoài Hương 1

CNSH VSV 12/19/2020

Các nội dung chính

a) Properties of probiotic strains and their assessment
b)Probiotic product specifications, quality assurance and
regulatory issues
c) Safety and beneficial human health effects
Background papers:
Taxonomy and physiology of lactic acid bacteria, effects and
function on nutrition (Morelli L);
Technological and commercial applications of lactic acid
bacteria; Health and Nutritional Benefits in Dairy
Products(Gilliland S);
Regulatory and clinical aspects of dairy probiotics (Reid
G).

I. Hướng dẫn đánh giá VSV probiotic

Để sử dụng trong TP, probiotic

- phải sống sót qua đường tiêu hóa,
- tăng sinh trong ruột,
- VK gram + Lactobacillus và Bifidobacterium (Holzapel
et al., 1998; Klein et al., 1998).

TS. Nguyễn Hoài Hương 2

CNSH VSV 12/19/2020

1.1 Chọn lọc chủng probiotic cho người

-VSV có khả năng sống sót tại vi trí đích và phát huy tác
dụng tại đó (ruột người).
-Điều chỉnh lại in vitro test cho thích hợp (hoạt động
của VK trong ruột).

1.2. Định danh VK probiotic

Bảo đảm tính công khai,
Chủng probiotic phải được giao cho các ngân hàng
giống quốc tế uy tín (ATCC, DSMZ…)
Định danh đến cấp chủng:
Phương pháp
- pulse field gel electrophoresis (PFGE).
- Phenotypic tests được thực hiện trước, sau đó là
phương pháp sinh học phân tử như DNA/DNA
hybridization, 16SRNA sequencing,
-Sử dụ RDP (ribosomal data base
project) so sánh và khẳng định chủng.
(www.cme.msu.edu/RDP/).

TS. Nguyễn Hoài Hương 3

CNSH VSV 12/19/2020

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3965039/

1.3. Đo hoạt tính sinh học của probiotic (ảnh

hưởng tốt lên sức khỏe)

Các thông số: Liều, chế độ sử dụng được xác định bằng
test
in vitro, thử nghiệm trên động vật và có thể trên người.
Kết quả xác định rõ ràng:
a ) Khả năng ngăn ngừa tiêu chảy gây ra do một số vi
khuẩn v à virus
Lactobacillus rhamnosus GG và Bifidobacterium lactis BB-12
tác dụng ngăn ngừa và chữa tiêu chảy cấp do rotavirus ở trẻ
em (kết hợp với bù chất điện giải).

TS. Nguyễn Hoài Hương 4

CNSH VSV 12/19/2020

b) Nhiễm Helicobacter pylori

L. Johnsonii La1
c) Cancer
L. rhamnosus GG, LC-705 và Propionibacterium sp. giảm
khả năng tiếp cận ruột của aflatoxin.

II. Phương pháp thử hoạt

tính Probiotic
In vitro
Thử nghiệm khả năng ứng dụng: khả năng chịu acid, muối
mật, sinh hợp chất kháng VSV, khả năng kết bám của VSV
trên thành ruột.
In vivo
randomized double blind, placebo controlled human trials
: pp mù đôi = cả bác sĩ và bệnh nhân đều không biết
đó là placebo
Số lượng cá thể thí nghiệm đủ lớn để xử lý thống kê có
nghĩa.

TS. Nguyễn Hoài Hương 5

CNSH VSV 12/19/2020

Xác định cơ chế hoạt động của probiotic

có ích cho sức khỏe
Người ta chưa giải thích được cơ chế của probiotic:
- Produces specific enzyme(s) or metabolite(s) that act directly on
the microorganism(s),
- The probiotic could also cause the body to produce the beneficial
action.
possible probiotic mechanisms of action, in the control of intestinal
pathogens include:
• Antimicrobial substance production
• Competitive exclusion of pathogen binding
• Competition for nutrients
• Modulation of the immune system.

Yêu cầu của FAO/WHO về phương pháp

thử nghiệm

- Clear experiments (in vitro and/or in vivo)

should be designed at the molecular level to
elucidate the mechanisms of probiotic
beneficial effects.

TS. Nguyễn Hoài Hương 6

CNSH VSV 12/19/2020

III. Yêu cầu an toàn sinh học

3.1 Khả năng kháng kháng sinh của VK probiotic
Gene kháng kháng sinh: nằm trên NST, plasmid, transposon.
VK có thể truyền gene kháng kháng sinh không được đưa
vào TP.
VK probiotic không được chứa gene kháng kháng sinh dùng
trong trị liệu và nguy cơ truyền gene kháng kháng sinh cho
VK đường ruột và VK gây bệnh khác.

3. 2. An toàn trên người

Cho đến nay lactobacilli làm probiotic chưa thể hiện nguy cơ cho
con người, đó chính là bằng chứng về an toàn
Cũng khg có yếu tố độc lực nào được phát hiện đối với lactobacilli,
bifidobacteria hoặc lactococci.
Thỉnh thoảng có hiện tượng nhiễm trùng huyết đối với lactobacilli,
nhưng hiếm.
Enterococci có thể gây bệnh, khg được sử dụng làm probiotic cho
người do: Enterococci kháng mạnh vancomycin, có nguy cơ truyền
gene kháng kháng sinh này; Một số chủng gây nhiễm trùng bệnh
viện.

TS. Nguyễn Hoài Hương 7

CNSH VSV 12/19/2020

IV. Đặc điểm sản phẩm probiotic, đảm bảo chất

lượng và các quy định pháp

1. Đặc điểm sản phẩm

Probiotic là gì = food and dietary supplements
2. Nhãn thích hợp
Trên nhãn có tên VSV đến cấp chủng.
Mật độ VK sống khi hết hạn sử dụng.
3. Quy trình SX và thu hồi tinh
sạch
- Kiểm gia giống gốc về độ thuần khiết và hoạt tính sinh
học định kỳ.
- Kiểm gia VK về độ thuần khiết và hoạt tính trong các
quá trình CN và bảo quản kế cả bảo quản TP chứa
probiotic khi hết hạn sử dụng.

QA systems

• Good manufacturing practices should be

followed in the manufacture of probiotic foods.
• Codex General Principles of Food Hygiene and
Guidelines for Application of HACCP (CAC,
1997) be followed.

TS. Nguyễn Hoài Hương 8

CNSH VSV 12/19/2020

Sữa bột chứa probiotics

SX bằng sấy phun thường khó bảo đảm mật dộ tế
bào sống
Cần nghiên cứu phương pháp vi bao thích hợp.
Các vấn đề sau cần được nghiên cứu để tăng tỉ lệ
sống sót probiotic:
• Drying method
• Type of packaging
• Size of packaging
• Storage conditions (temperature, humidity, etc.)
• Powder milk quality (Standard reference)
• Rehydration procedure
• Handling of rehydrated product.

HƯỚNG DẪN CHI TIẾT CỦA FAO

 Loại trừ các biotherapeutic agents (chế phẩm

sinh dược) và VSV có lợi khg sử dụng trong TP,
 Loại trừ GMO.

TS. Nguyễn Hoài Hương 9

CNSH VSV 12/19/2020

Guidelines for
the Evaluation of
Probiotics for
Food Use

I. Identification: genus/ species/strain

Current nomenclature can be retrieved as follows:
•Approved Lists of Bacterial Names (Int. J. Syst. Bacteriol,
1980,30:225-420) also
available in http://www.bacterio.cict.fr/
http://www.bacterio.net/
•Validation Lists, published in the International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology (or International
Journal of Systematic Bacteriology, prior to 2000)

TS. Nguyễn Hoài Hương 10

CNSH VSV 12/19/2020

http://www.bacterio.net/

1.1. Định danh đến cấp loài

DNA-DNA hybridization = lai phân tử là phương pháp
chuẩn để định danh đến cấp loài, nhưng khó thực
hiện, cần nhiều VK chuẩn.
= Sequencing genes encoding 16S rRNA is suggested
as a suitable substitute.
In this case, it is recommended that this genotypic
technique be combined with phenotypic tests for
confirmation.

TS. Nguyễn Hoài Hương 11

CNSH VSV 12/19/2020

Test kiểu hình

Test lên men đường và các sản phẩm lên men từ
glucose utilization là những kiểu hình chủ đạo để định
danh.

1.2. Định danh cấp chủng

Phương pháp SHPT
 PulsedField Gel Electrophoresis (PFGE) là chuẩn
vàng: có thể lặp lại kết quả đồng nhất.
 Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD): kết
quả kém đồng nhất.
 Nên xác định các plasmid.

TS. Nguyễn Hoài Hương 12

CNSH VSV 12/19/2020

Kỹ thuật này lần đầu tiên được Schwartz va Cantor

(1984) giới thiệu nhằm tăng khả năng di động của các
mảnh DNA lớn trong điện trường.
Xử lý mẫu bằng RE ít điểm cắt.
Mảnh DNA lớn (50kb-12Mb) không thể điện di theo
phương pháp thông thường.

TS. Nguyễn Hoài Hương 13

CNSH VSV 12/19/2020

RAPD 'Random Amplification of Polymorphic DNA

Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuyếch
đại ngẫu nhiên, kỹ thuật này được phát hiện vào
năm 1990 (Welsh và McClelland; William và ctv.).
Dùng nghiên cứu sự khác biệt di truyền của
những loài khác nhau. Mồi được sử dụng trong kỹ
thuật RAPD là những sợi oligonucleotide gồm
10- mer có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên. Các sản
phẩm RAPD được phân tích bằng cách điện di
trên gel agarose. Hệ gen của hai loài khác nhau
sẽ cho những đoạn băng trên gel khác nhau, từ
đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học.

all strains should be deposited in an internationally

recognized culture collection.

A type strain is defined in the “International Code of Nomenclature

of Bacteria” as the “nomenclatural type of the species”, and is the
"reference point" to which all other strains are compared to know
whether they belong to that species.
= chủng tham chiếu = chủng chuẩn

TS. Nguyễn Hoài Hương 14

CNSH VSV 12/19/2020

We are a recognized culture collection in the United States

and a member of the World Directory of Culture
Collections (Sixth Version, 2014).
We accept type strains and provide the documentation
required for publication.
We will perform viability testing, provide a Certificate of
Deposit, apply for any necessary import permits, and ensure
availability of the type strain for requesting organizations. A
type strain may be provided from the stock initially provided
by the depositor or as an ATCC branded strain manufactured
and authenticated by us. Full inclusion as an ATCC branded
strain will depend upon the scientific relevance of the
material.

Why do I have to submit my material

to a Collection Center?
It is a requirement of the International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM),
published by the Society for General Microbiology (SGM),
and the International Committee on Systematics of
Prokaryotes (ICSP) that authors of new names and new
combinations provide evidence that types are deposited in
two recognized collections in two different countries.
Papers will not be accepted until such documentation has
been received by the editor of these journals. Further
information on the requirements for publication can be
found in I JSEM Information for Authors.

TS. Nguyễn Hoài Hương 15

CNSH VSV 12/19/2020

II. In vitro tests to screen potential

probiotics
Tests for safety of probiotic microbes
in vitro tests:
- knowledge of strains
- mechanism of the probiotic effect.
- not sufficient for describing them
as probiotic.
- Requirements of efficacy with
human trials.

Yêu cầu có sự tương quan kq in vitro tests với in vivo

tests. For example, in vitro bile salts resistance
was shown to correlate with gastric survival in vivo.

TS. Nguyễn Hoài Hương 16

CNSH VSV 12/19/2020

Ví dụ minh họa
Lactobacillus casei Shirota
I. Nguồn gốc
Một trong số 300 chủng do Dr. Minoru Shirota phân lập
năm 1930.
1966 được đặt tên là chủng Shirota in 1966,
Công bố dưới tên L. casei YIT 9018
1980, được đặt tên chủng YIT 9029, và giữ giống tại ngân
hàng giống International Depositary Authority, Agency of
Industrial Science and Technology of Japan, với số đăng ký
FERM BP-1366.
Chủng YIT 9029, ngày nay được gọi là L. casei strain Shirota
và được sử dụng để SX fermented milk Yakult.

TS. Nguyễn Hoài Hương 17

CNSH VSV 12/19/2020

II. Công dụng

L. casei strain Shirota được sử dụng làm nguyên liệu SX

fermented milk products trong đó có sữa lên men uống
tên thương mại "Yakult."
Công dụng của chủng là VSV probiotic.

III. Mô tả và định danh đến cấp loài để chứng

minh VSV GRAS
 LAB là nhóm VSV có tính chất chung về trao đổi chất là
lên men sinh acid lactic
 LAB = VK Gram+, không sinh bào tử, catalase-âm và
không có cytochromes (Holzapfel et al. 2001).
 Kị khí chịu oxy, chịu acid, lên men nghiêm ngặt.
 Gồm các chi (genera) có tính chất sinh hóa và sinh thái
(Axelsson 1998): Aerococcus, Alloicoccus,
Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus,
Globicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera,
 Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,
Tetragenoccus, Vagococcus, và Weissella.
 Bifidobacteria = tính chất chung với LAB về sinh lý, sinh
hóa, sinh thái nhưng thuộc ngành khác.

TS. Nguyễn Hoài Hương 18

CNSH VSV 12/19/2020

Hầu hết LAB không gây bệnh trừ một số Streptococcus

Enterococcus (Donohue and Salminen 1996; Adams 1999).
LAB có lịch sử sử dụng trong TP lên men ức chế nhiều VSV
gây bệnh
Một số LAB là thành phần của VK đường ruột
Suy ra hầu hết LAB strains an toàn.

Các chứng minh của cty Yakult về chủng

an toàn qua định danh đến cấp chủng

TS. Nguyễn Hoài Hương 19

CNSH VSV 12/19/2020

Genomic Analysis
Shotgun Sequencing
Sato et al. (2004) - whole genome shotgun sequence of L.
casei strain Shirota - possible
safety concerns.
KQ:
60,000 reads =
31 megabases
(Mb).
Genome size (PFGE data) = 3.1 Mb, giving 10-fold coverage
of the genome.
=
120 contigs of 3,104,260 base pairs (bp);
the average size of the contigs was 25,868 bp.
The final size of the genome is 3,035,755 bp plus a single
plasmid (pLY101) containing 66,801 bp.

KQ nghiên cứu về Genome và Plasmid

1.Sato et al. (2004) so sánh genome L. casei Shirota với
một số chủng Lactobacillus and Lactococcus, including L.
casei ATCC 334 and L. casei BL23, cả hai quan hệ gần với L.
casei strain Shirota. : Từ bộ gene, xác định được 2,985
open reading frames (ORF) = 2,918 ORF (genome) + 67
ORF (plasmid)
2,301 protein = 2,255 protein từ genome + 46 protein từ
plasmid.
2.O'Sullivan (2012) sử dụng phần mềm GAMOLA
(Altermann and Klaenhammer 2003) và CSDL BLAST để so
sánh. KQ: 4,269 potential genes in the genome + 83
potential genes in the plasmid.

TS. Nguyễn Hoài Hương 20

CNSH VSV 12/19/2020

KQ phân tích Genome

1. Tính kháng kháng sinh
-Kháng vancomycin như tất cả các lactobacilli khác, không
có tính di truyền (khg có gene kháng).
-Chứa multidrug transporters: kháng Daunorubicin (thuốc
chữa ung thư) và họ neomycin/kanamycin. Gene này phổ
biến đối với VK Gram + và các lactobacilli, khg do gene di
động chịu trách nhiệm, khg tạo thành nguy cơ.

2. Tổng hợp Biogenic Amine

Biogenic amine VSV tạo thành do phản ứng khử nhóm
carboxyl từ amino acids = đặc tính chung của VSV không
mong muốn.
Các amino acid tạo các biogenic amine tương ứng :
histidine (histamine), tyrosine (tyramine), hydroxy-
tryptophane (serotonin), tryptophane (tryptamine), lysine
(cadaverine), ornithine (putrescine), arginine
(spermine/spermidin).
Tìm gene mã hóa các enzyme decarboxylase trên: ornithine
decarboxylase isozyme chuyển hóa ornithine into
putrescine. Enzyme này có mặt ở rất nhiều chủng
Lactobacillus.

TS. Nguyễn Hoài Hương 21

CNSH VSV 12/19/2020

3. Virulence/Infectivity
Tìm kiếm gene liên quan đến độc lực:
 production of enterotoxins,
 outer-membrane
 cytoskeleton-distending proteins,
 hemolysins,
 enterohemolysins,
 cell invasion,
 modulation proteins,
 cell-surface proteins,
 exotoxins,
 inclusion proteins.

KQ: Phát hiện một số gene mã hóa cell-invasion proteins,

như internalin khg gây bệnh.
Gene mã protein cấu trúc như collagen or fibronectin binding
protein.
Gene mã hóa protein tương tự hemolysin.
Hemolysin là yếu tố độc lực nhưng theo O'Sullivan (2012), chất
tương tự (homolog) phổ biến trong nhiều lactobacilli, chức năng
chữa rõ ràng.
KQ cho thấy các gene liên quan với độc lực trong L.
casei strain Shirota cũng tương tự như ở trong các lactobacilli khác,
khg có khả năng gây bệnh.

TS. Nguyễn Hoài Hương 22

CNSH VSV 12/19/2020

Production Process of L. casei Strain Shirota

Maintenance
of Seed
Stock and
Preparation
of Master
Stock

TS. Nguyễn Hoài Hương 23

CNSH VSV 12/19/2020

Quy trình SX Yakult

1.Food-grade skim milk powder and sugars are mixed with filtered distilled water in a
mixing tank to make a milky solution.
2. Ultra Heat Treatment Short Time (UHTST)
3.All machines are computerized and the production flows are controlled by the control
panel.
4.Live L. casei strain Shirota, cultured and tested under precise conditions in the laboratory
located at the plant, is tested to ensure a high number of colony forming units (cfu).
5.The solution is cooled to about 37°C and introduced aseptically via closed pipes and
valves into a fermentation tank. L. casei strain Shirota is added and incubated at 37°C for
about a week. To break the milk curd and to make it smooth, the fermented milk is
homogenized.
6.The cultured skim-milk solution is transferred to a storage tank to which sterile food-
grade syrup and flavors permitted in the U.S. are added and the solution thoroughly
mixed at a temperature of —10°C. Prior to bottling, the component concentration is
adjusted as needed to achieve the desired concentration of L. casei strain Shirota.
7. The finished products are stored in refrigerator under 10°C and checked for quality.
8.QC measures are in place to maintain standards for personnel and factory hygiene,
equipment cleaning, processing methods and parameters, and product handling.

QC
QC activities involve:
sampling, testing, and inspection of the product, bottles,
and packaging.
Individual bottles are randomly inspected to check for
incorrect printing, undesirable markings, and proper lid
sealing.
Packages are checked to ensure that they are sealed
correctly.
Extensive product inspection, including microbiological
quality, composition analysis, and sensory testing are
done before product is released.

TS. Nguyễn Hoài Hương 24

CNSH VSV 12/19/2020

Chemical and microbiological, sensory

tests
Chemical tests: specific gravity, Brix, and titratable acidity.
Microbiological tests: enumeration of L. casei Shirota,
standard plate count, yeasts and mold counts, coliform
counts, Escherichia coli count, Salmonella spp. counts, and
Staphylococcus aureus counts.
Sensory analyses: aroma and taste.

TS. Nguyễn Hoài Hương 25

CNSH VSV 12/19/2020

Stability test

TS. Nguyễn Hoài Hương 26

CNSH VSV 12/19/2020

Tính tổng số tb sống tối thiểu và tối

đa tiêu thụ
Mật độ probiotic = 10^8 cfu/ml.
Yakult fermented milk 65- to 200-ml / chai.
Nồng độ L. casei strain Shirota cao nhất trong SP là
4x10^10 cfu/chai.
recommended daily consumption = 1-2 chai
Lượng VK tiêu thụ là 8x10^10cfu/ngày
Thời hạn bảo quả sản phẩm 30 ngày
Mật độ ban đầu 4x10^8 cfu/ml, cho phép sau thời hạn
bảo quản mất 75% tế bào sống,
Hoa Kỳ thể tích Yakult 80 ml, vậy lượng tb sống tối đa
tiêu thụ là 6.4x10^10 cfu/ ngày.

Safety of Lactic Acid Bacteria and

Lactobacillus Species

Infectivity

TS. Nguyễn Hoài Hương 27

CNSH VSV 12/19/2020

Safety Parameters
Ability to Adhere to Intestinal Cells
Đo khả năng kết bám của VK vào Caco-2 cells và màng
nhày ruột: khả năng kết bám của L. rhamnosus GG gấp 10
lần L. casei strain Shirota, E. coli TG1 ở vị trí trung gian. Sự
loại trừ E.coli do Lactobacillus rhamnosus GG và L. casei
Shirota mang tính chất tạm thời.

Đo khả năng kết bám VK vào tế bào biểu bì ruột heo:

thích hợp hơn Caco-2 (tb trực tràng ung thư) vì tb Caco-2
được glycosyl hóa nhiều hơn tb ruột bình thường. L. casei
strain Shirota kết bám trung bình so với các lactobacilli
khác.

Ability to Degrade Mucin

TS. Nguyễn Hoài Hương 28

CNSH VSV 12/19/2020

Diagrammatic representation of mucins in the mucosal barrier to infection. (a) The normal
mucosa is covered with a continuously replenished thick mucus layer retaining host-
defensive molecules. Commensal and environmental microbes may live in the outer mucus
layer but the layer ensures that contact of microbes with epithelial cells is rare. (b) Early in
infection, many pathogens actively disrupt the mucus layer and thereby gain access to the
epithelial cell surface. In addition, this alters the environment for commensal and
environmental microbes and opportunistic pathogenesis may occur. (c) Pathogens that break
the secreted mucus barrier reach the apical membrane surface, which is decorated with a
dense network of large cell-surface mucins. Pathogens bind the cell-surface mucins via lectin
interactions and the mucin extracellular domains are shed as releasable decoy molecules.
Consequent to contact with microbes and shedding of the extracellular domain, signal
transduction by the cytoplasmic domains of the cell-surface mucins modulates cellular
response to the presence of microbes. (d) In response to infection, there are alterations in
mucins that are driven directly by epithelial cells and in response to signals from underlying
innate and adaptive immunity. These alterations include goblet cell hyperplasia and
increased mucin secretion and altered mucin glycosylation (depicted by the color change)
affecting microbial adhesion and the ability of microbes to degrade mucus. These changes in
mucins work in concert with other arms of immunity to clear the infection.

Undesirable Metabolic Activity

D-lactic acid
iogenic amines, primarily histamine or
tyramine, (TP lên men hư hỏng, khg xảy ra đối
với probiotics)
Bacteriocin bị enzyme proteinase trong ruột
phá hủy, ít tạo thành trong sữa.
Không bị ảnh hưởng của thuốc kháng viêm
không steroid.

TS. Nguyễn Hoài Hương 29

CNSH VSV 12/19/2020

Tính kháng kháng sinh

The strain proved to
be
somewhat resistant to
sulfamethoxazole with
trimethoprim,
pefloxacin, and
gentamicin and
sensitive to the other
9 antibiotics tested,

TS. Nguyễn Hoài Hương 30

CNSH VSV 12/19/2020

TS. Nguyễn Hoài Hương 31