PROIZVODNJA AMINOKISELINA

Primena i proizvodnja
Aminokiselina L-glutamat L-lizin D,L-metionin L-treonin God. proiz. (t) 1 700 000 850 000 350 000 70 000 Cena (US$/kg) 1 2 2 5 Primena
poboljanje ukusa dodatak hrani dodatak hrani dodatak hrani

L-asparaginska
L-fenilalanin glicin L-arginin L-triptofan ostale

10 000
10 000 25 000 1000 1000 3000

10
10 10 20 20

Aspartam
Aspartam, medicina zaslaiva medicina, kozmetika dodatak hrani medicina i dr.

Naini proizvodnje ekstrakcija iz hidrolizata proteina

hemijska sinteza biotransformacija hemijskih prekursora mikrobna proizvodnja

 Ekstrakcija iz hidrolizata proteina

Prvi postupak za proizvodnju aminokiselina. Primenjuje se za proizvodnju L-cisteina, L-cistina, L-leucina, L-

asparagina, L-arginina i L-tirozina. Sirovine: penini gluten, proteini soje ili kukuruza, ivotinjska dlaka ili nokti ili nus-proizvodi mesne industrije. protein
kiselinska hidroliza

hidrolizat proteina
frakciono taloenje

rastvorne aminokiseline
hromatografsko razdvajanje

hidrofobne aminokiseline

kristalizacija

 Hemijska sinteza
Nedostatak: dobija se racemska smea.
Metionin I dalje se dobija hemijskom sintezom.
Akrolein hidantoin
ClCH2COOH + Metil-merkaptan NH3

NaOH

metionin

H2NCH2COOH + HCl

Glicin

Iz hlorsiretne kiseline i amonijaka

ClCH2COOH + NH3 H2NCH2COOH + HCl

trekerova sinteza aminokiselina

 Biotransformacije
Prednost: lako preiavanje proizvoda
Mana: skupe sirovine

Mikrobni postupci
Prednost: jeftine sirovine
Mana: kompleksna fermentaciona smea, skuplje

preiavanje. Zahtevi

Stimulisanje sinteze enzima neophodnih za produkciju i njihova aktivacija Represija ili inhibicija enzima koji katalizuju reakcije degradacije odgovarajuih aminokiselina Stimulisanje resorpcije supstrata Stimulisanje ekskrecije aminokiselina
Reenja Klasine mutacije i metode rekombinantne DNK

L-glutaminska kiselina
Primena
Primenjuje se uglavnom kao prehrambeni aditiv Umami ukus

U manjoj meri u farmaceutskoj industriji i kozmetici Neurotransmiter

Proizvodnja
Prvobitno hidrolizom proteina Konbu algi, a zatim hidrolizom

peninog glutena. Hemijski postupci bazirani na trekerovoj sintezi

Dupont proces

acetilen - akrilna kiselina - metil--formilpropionat - D,L-glutaminska kis.

Ajinomoto proces
akrilonitril - -cijanopropionaldehid - D,L-glutaminska kis.

Mikrobioloki postupak razvijen u Japanu 1957. godine i danas se

gotovo iskljuivo koristi.

 Proizvodni mikroorganizam Corynebacterium glutamicum (raniji naziv Micrococcus glutamicus)

Nesporogena, Gram-pozitivna bakterija, podlee pleomorfizmu, neophodan biotin za rast. Pored melase i hidrolizata skroba mogu da koriste i metanol i aceton, ali ne i parafine
Koriste se i: Brevibacterium flavum Corynebacterium efficiens Corynebacterium alkanolyticum (za rast na parafinima)

Biosinteza
Kljuni enzimi:
-ketoglutarat-dehidrogenaza

L-glutamat-dehidrogenaza

Kod proizvodnih sojeva: Vm GDH vea 150 puta

Vana je i reakcija karboksilovanja fosfoenolpiruvata Biotin je neophodan za funkcionisanje PEPkarboksilaze Izocitrat-dehidrogenaza ima isti koenzim (NADP) kao GDH.

 Uslov:
Divlji sojevi C. glutamicum ne proizvode glutaminsku

kiselinu pri visokoj koncentraciji biotina u podlozi.

Kada je visoka koncentracija biotina nakuplja se

mlena kiselina, umesto glutaminske.

Biotin ne smeta kada su prisutne povrinski

aktivne supstance ili -laktamski antibiotici.

Razlog: uticaj ovih supstanci na propustljivost

membrana.

Za propustljivost mebrana kljuan je sadraj lipida: u novije vreme utvreno da su kljune mikolne kiseline mikolne kiseline imaju preko 30 C-atoma ustanovljeno je da se sadraj ovih kiselina smanjuje kada je limitiran biotin, ili kada sa dodaju antibiotik ili povrinski aktivna supstanca Tween 40.

 Auksotrofni mutanti
U ovoj proizvodnji auksotrofni mutanti reavaju

problem propustljivosti membrana.

Auksotrofi zavisni od oleata Auksotrofi zavisni od glicerola

Danas se primenjuju genetski modifikovani sojevi

koji imaju viestruke kopije gena za sintezu glutamat-dehidrogenaze

Proizvodnja
Izvor C: melasa ili hidrolizati skroba. Izvor N: amonijane soli ili urea. Limitirana koncentracija biotina ili dodavanje Tween-a. pH: 7-8 Sinteza glutaminske kiseline se ubrzava pri kraju eksponencijalne faze rasta. Dolivni postupak zbog katabolike represije Nakon 14 h poinje dolivanje odrava se sadraj glukoze oko 0,5 % Prinos glutaminske kiseline je 50-60 % ili 150-200 g/l nakon 60 h.

Izdvajanje proizvoda

fermentaciona orba

vakuum filtracija

ultrafiltracija

Jonoizmenjivka hromatografija

Enzimska transformacija D,L-glutaminske kiseline

OH C CH2 CH2 CH COOH NH2 O OH C O

racemaza iz L. fermentii

CH2 CH2 H2N CH COOH

L-glutamat dehidraza iz P. crucivicae

O N H COOH

L-pirolidon karboksilna kiselina

L-lizin
Koristi se kao dodatak stonoj hrani jer je esencijalna

aminokiselina. Dodaje se kao ista supstanca da se izbegne prevelika koncentracija azota.

Proizvodni mikroorganizmi:
iste bakterijske vrste kao kod proizvodnje glutaminske kiseline-

C. glutamicum

drugaiji tip auksotrofnih mutacija.

Biosinteza

aspartat

aspartil-fosfat

aspartilsemialdehid
dihidropikolinska kiselina diaminopimelinska kiselina

L-homoserin

L-treonin

L-metionin L-lizin

L-izoleucin

U prvobitnom procesu se primenjuju auksotrofni mutanti kojima je neophodan homoserin za rast. Izbegava se feedback inhibicija aminokiselinama koje nastaju iz homoserina.

Nove strategije:

Izoluju se mutirani sojevi koji su dobri producenti lizina u prisustvu analoga lizina, to upuuje na izostanak feedback regulacije lizinom.
Mutanti koji nemaju piruvatkarboksilazu i niu koncentraciju citrat-sintaze. Primena tehnika rekombinantne DNK fuzija protoplasta.

Proizvodnja
C. glutamicum Dolivni postupak, 60 h

Prinos: 120 g/l

Separacija:
Filtracija Ultrafiltracija Jonoizmenjivaka hromatografija ili vakuum-suenje

Mikrobna transformacija D,L--aminokaprolaktama

O H N H2N CH CH2 NH2 CH2 CH2 CH2 C OH O

Criptococcus laurentii

D,L--amino-kaprolaktam Achromobacter obae

NH2 H N O

H NH2

D--amino-kaprolaktam

D,L--aminokaprolaktam je jeftin intermedijer u proizvodnji sintetskih polimera.

Indirektni ili dvojni postupak proizvodnje lizina 1. stupanj:

Koristi se auksotrof E. coli koji je izgubio sposobnost

sinteze dekarboksilaze diaminopimelinske kiseline. Neophodan lizin za rast. Mora se paljivo kontrolisati. Ako je preniska konc. Razvijaju se prototrofi. Nakuplja se DAP.

2. stupanj:
Koristi se prototrof E. coli ili Aerobacter aerogenes.
Ovi mikroorganizmi ne smeju imati aktivnu lizin-

dekarboksilazu

L treonin

Proizvodi se na industrijskom

nivou pomou mutanata E. coli.

Selektirani su sojevi koji imaju deregulisan metabolizam sa aspartat-kinazom i homoserindehidrogenazom neosetljivom na feedback-inhibiciju. Prinosi: 80 g/l za 30 h. Separacija proizvoda odvajanje elija centrifugiranjem ili ultrafiltracijom vakuum-uparavanje kristalizacija

Proizvodnja aspartama
Vetaki zaslaiva, god. proizvodnja oko 10000 t. Za sintezu su neophodni L-fenilalanin i asparaginska kiselina

Asparaginska kiselina
Kontinualni postupak
Reaktor sa elijama E. coli imobilisanim u -karagenanske ili

poliakrilamidne mikrokapsule. elije imaju 30 puta veu aktivnost aspartaze jer sadre plazmid sa genom za sintezu ovog enzima. Aspartat nastaje adicijom amonijaka na fumarat
O H2N COOH CH CH2 H C OH O C OH

C
HOOC

Visoka produktivnost imobilisanih elija 140 g/(l h)

Visoka operativna stabilnost poluivot 2 godine. Primenjuju se i postupci sa E. coli imobilisana u poliuretanske

estice ili Pseudomonas putida imobilisana u -karagenanske mikrokapsule.

Fenilalanin
Enzimski postupak
Adicija amonijaka na trans-cimetnu kiselinu. Reakciju katalizuje fenilalanin-amonijum liaza iz Rhodotorula glutinis ili Rhodotorula rubra. Razvijen i kontinualni postupak O O sa imobilisanim elijama CH C OH
H2N CH C OH CH

NH3

CH2

Dostignuta finalna koncentracija proizvoda oko 50 g/l, prinos oko 83%.

t-cinaminska kiselina

Hidroliza N-acetilfenilalanina
Primenjuju se aminoacilaze.

Dobija se fenilalanin istoe adekvatne za primenu u farm. industriji, ali je neophodna racemizacija D-enantiomera i recikliranje.

Fermentacija

Dva kljuna enzima u regulaciji biosinteze: DAHP sintaza (2) i prefenat dehidrataza (PDH, 9). Reenja: Auksotrofni mutanti C. glutamicum.

U novije vreme prinosi poveani primenom rekombinantnih sojeva Brevibacterium flavum ili E.coli koji sadre amplifikovane gene za sintezu PDH ili gene za sintezu PDH ili DAHPS koji ne podleu feedback regulaciji jer postoji vie izoenzima.

L-tirozin auksotrofni mutanti E. coli

Proizvodnja aspartama
Enzimski postupak

racemizacija Imob. termolizin iz 60 oC B. stearothermophilus 2 h D-fenilalanin-OMe

L-Z--aspartil-Lfenilalanin-OMe
hemijsko hidrogenovanje

ZH

Z: benziloksikarbonil grupa

Triptofan
Tri tipa proizvodnje
Enzimska transformacija prekursora Kondenzacija indola i serina. Postupak je neekonomian jer su polazni reaktivi skupi. Stereoselektivna hidroliza N-acetil-D,L-triptofana aminoacilazama. Mikrobna transformacija prekursora Konverzija metabolikih prekursora triptofana- indola ili antranilne kiseline. Postupak sa antranilnom kiselinom kao prekursorom i genetski modifikovanim sojem Bacillus amyloliquefaciens komercijalizovan. Postupak je zabranjen jer finalni proizvod sadri neistou koja izaziva eozinofilija-mialgija sindrom.

Fermentacija na ugljenohidratnim sirovinama Razvijeni su postupci sa auksotrofnim mutantima E. coli i C. glutamicum. Primenjuju se i proizvodni mikroorganizmi dobijeni primenom tehnike rekombinantne DNK sa viestrukim kopijama operon koji sadri enzime neophodne za biosintezu triptofana.

Aminokiseline dobijene enzimskim transformacijama

Prednost: mogu se dobiti neproteinogene a.k. i a.k.

koje ne postoje u prirodi.

O

hidantoinaza

N CH

NH2 COOH

karbamoilaza
O H2N CH R C OH

esteraza, amino-acilaza, amidaze

L-aminokiselina

R - CH -C
NHR2 R1

H + CN - oksinitrilaza R - C - CN HO

R-C
H

Aminoacilaza
primenjuje se ve 30 godina razdvajanje racemske smee acetilaminokiselina ovako se proizvode: L-metionin, L-triptofan, L-valin, L-tirozin i L-prolin (za infuzione rastvore)

N-acetil-D,L-aminokiselina
racemizacija

Imob. aminoacilaza

Kontinualni upariva

kristalizator
N-acetil-D-

separator

aminokiselina
(ne kristalizuje)

L-aminokiselina
(kristalizuje)

Hidantoinaza/karbamoilaza sistem

Primenjuje se na industrijskom nivou za proizvodnju D-fenilglicina i p-

hidroksi-D-fenilglicina. boni lanci polusintetskih antibiotika ampicilina i amoksicilina.

Oksido-redukcione reakcije
Najvie se primenjuje leucin-dehidrogenaza za proizvodnju L-terc-leucina

(prekursor u sintezi lekova). Dobija se iz trimetilpiruvata.

Problem: regeneracija NADH Reenje: upotreba format-dehidrogenaze kao enzima za regeneraciju koenzima. oslobaa se gasoviti CO2 i pomera poloaj ravnotee ka L-Tle. koristi se i PEG-NADH da bi se koenzim zadrao u membranskom reaktoru