‫الر ِح ِيم‬ ‫بِ ْس ِم هللاِ َّ‬

‫الر ْح َم ِن َّ‬
 Univerzitet u Tuzli
Medicinski fakultet

Imunohematologija i protočna citometrija

Doc. dr. med sci Fejzo Džafić

 IMUNOHEMATOLOGIJA

• Određivanje krvnih grupa

• Anti human globulin test (AHGT) - Coombsov test
• Titar hladnih aglutinina
• CRROSS – MATCH test
 ODREĐIVANJE KRVNIH GRUPA
• Pojam krvnih grupa potekao iz radova krajem XIX
vijeka
• Imunizacija životinja na bakterije dovodi do stvaranja
antitijela
• Krajem 1895 pokušaj imuniziranja životinjskih
eritrocita (J. Bordet)
• Crvena krvna zrnca od jedne životinjske vrste
posjeduju zajedničke supstance nazvane antigenima
• LANDSTEINER (1900 humani serum ne aglutinira
eritrocite životinja, nego druge uzorke humane krvi
 ODREĐIVANJE KRVNIH GRUPA

• Da li je ovaj fenomen normalan ili patološki?

• 1901 odgovor normalan
• Miješao uzorake seruma osoba svoje laboratorije sa
svakim uzorkom eritrocita
• Razlikovao tri krvne grupe: O, A i B
• 1902 Decastello i Sturli opisali su prvi uzorak koji je
uvršten u četvrtu grupu AB
 ODREĐIVANJE KRVNIH GRUPA

• Eritrociti Serum Grupe Učestalost

ni A ni B anti A O 36,18%
anti B
A anti B A 42,20%
B anti A B 14,34%
A iB bez ijednog AB 7,28%
 ODREĐIVANJE KRVNIH GRUPA

• Bosna i Hercegovina 1981:

a. O krvna grupa 36,18
b. A 42,20
c. B 14,34
d. AB 7,28
• Tuzla 1981
a. O krvna grupa 35,78
b. A 39,97
c. B 16,60
d. AB 7,65
 ODREĐIVANJE KTVNIH GRUPA

• Krvne grupe ABO sistema

• Krvne grupe LEWIS (Anti Le)
• Krvne grupe sistema MNSs
• Krvne gurpe sistema P
• Krvne grupe sistema Rh
• Krvne grupe sistema Lutheran, Kell, Duffy, Kidd i
Auberger
Mišljenje
Japanaca
 Kako se određuju krvne grupe

1. Određivanje krvne grupe ABO sistema na pločici

2. Određivanje krvne grupe ABO sistema metodom u
epruvetama
ODREĐIVANJE KRVNIH GRUPA ABO SISTEMA NA
PLOČICI
• Materijal za rad:

 Uzorak krvi
 Test reagensi (anti – A, anti – B)
 Pločice,
 Šapići,
 Fiziološki rastvor (FR)
• Rezultat određivanja krvne grupe na pločici je
orjentacioni i ne smije se izdati kao zvanični
podatak
ODREĐIVANJE KRVNE GRUPE ABO
SISTEMA NA PLOČICI
 Određivanje krvnih grupa ABO sistema u
epruvetama
• Uzorak krvi propisno označen brojem jedinice krvi ili
imenom i prezimenom lica kome se ispituje krvna
grupa
• Test reagensi (anti –A, anti –Bi anti – AB)
• Svježi test eritrociti A1, i B, u vidu 2-5% suspenzije
• 6 epruveta
• Pipeta
• FR
 Tumačenje rezultata

• Pozitivnim nalazom se smatra prisustvo aglutinina u

bilo kojoj epruveti ili prisustvo hemolize u 4 i 5
epruveti
• Rezultati iz metode određivanja ABO krvnih grupa na
pločici i u epruveti se moraju podudarati
 Anti human globulin test (AHGT) - Coombsov
test

• Dokazuje se prisustvo ili odsustvo antitijela ili

komponenata komplementa vezanih na površini
eritrocita
• Direktnim Coombsov-im testom (DAT) provjerava se
in vivo prisustvo vezanih antitijela ili komponenata
komplementa na površini eritrocita
• Indirektnim Coombsov-im testom se provjerava
prisustvo aglutinišućih ili neaglutinišućih količina
eritrocitnih antitijela u ispitivanom serumu
vezanih antitijela ili komponente
komplementa na površini eritrocita

Aglutinišućia ili
neaglutinišućia k
oličina eritrocitnih
antitijela
 Materijal za rad

• Uzorak krvi
• Antihuman globulin reagens (AHG) polispecifični
• FR
• Epruvete
• pipeta
 Tumačenje rezultata

• Pozitivan DAT potvrđuje da su eritrociti

obloženi tj da se na njihovoj površini nalaze in
vivo vezana antitijela ili komponente
komplementa
 Test se radi:

• U sklopu predtransfuzijskih ispitivanja davalaca i

primalaca krvi
• Prilikom određivanja krvne grupe novorođenčeta
• Na zahtjev ljekara kod sumnje na:
a. Posttransfuzijske reakcije (PTR-e)
b. Sumnje na imune i autoimune bolesti
c. U stanjima kada postoji sumnja na obloženost
membarne eritrocita nekim antitijelima i/ili
lijekovima
 Titar hladnih aglutinina

• Hladni aglutinini su kompletna ‚nespecifična‘

antitijela, najčešće IgM klase
• Vrlo rijetko mogu biti IgG klase
 Materijal za rad:

• Serum koji se ispituje

• 3 puta oprani O Rh D negativni (test) eritrociti
• FR
• Epruvete
• Pipete
 Tumačenje rezultata

• Titar hladnih antitijela se određuje na osnovu

aglutinacija koje su se javile poslije 16 h inkubacije
 Kad se izvodi ovaj test

• Na zahtjev ordinirajućeg ljekara, kod sumnje na

postojanje nekog virusnog oboljenja npr:
 Infektivne mononukleoze
 Infekcija mikoplazmom pneumonije

• Test može imati dijagnostički i prognostički značaj

 CRROSS – MATCH test

• CRROSS – MATCH test se radi u svrhu ispitivanja

seruma pacijenta na moguće prisustvo imunih
antitijela na tkivne antigene organa (bubrega) koji se
transplantira
 Upotreba testa

• Neposredno prije svake transplantacije bubrega

 PROTOČNA CITOMETRIJA

PROTOČNA CITOMETRIJA je tehnologija koja simultano

mjeri a potom i analizira mnogobrojne karakteristike
pojedinačnih čestica, uglavnom stanica, prilikom
njihovog protoka kroz aparat (“flow” citometar).
Čestice se mjere i analiziraju u odnosu na:
• • relativnu veličinu
• • relativnu gustinu i složenost
• • relativni intenzitet fluorescence
• Protočni citoflurometar FACS (fluorescence activited cell
sorter) je kompjuterizovani aparat za automatizovanu
analizu i selektivnu separaciju stanica na osnovu njihovih
svojstava da fluoresciraju i da rasipaju svjetlost
 Osnovi protočne citometrije

• Pripadnost određenoj staničnoj liniji, stepen

diferencijacije, faza staničnog ciklusa kao i aktivacioni
status stanice uglavnom se mogu odrediti analizom
eksprimiranih molekula
• Ekspresija molekula može se detektovati pomoću
fluorescentnih obilježivača specifičnih za dati molekul
i mjerenjem količine emitovane fluorescencije sa
stanice
 Princip rada “flow” citometra:

• Stanice se inkubiraju sa monoklonskim antitijelima

specifičnim za ispitivani molekul i pritom pravi
suspenzija.
• Antitijela su obilježena fluorohromom-
fluorescentnom bojom.
• Stanice u obliku supenzije protiču u vidu jednog sloja
(“jedna po jedna”) kroz osvetljenu cjevčicu u aparatu
• Emitovana florescencija se detektuje (sakuplja,
propušta kroz filtere i konvertuje u digitalne signale
koji se pamte i analiziraju u računaru)
►Mjerenje se izvodi dok laserska svjetlost
stanice prolaze
pojedinačno laminarnim
protokom u struji
izotonične tekućine. Hidrodinamično
fokusiranje
Tekućina za
oblaganje
►Stanice bivaju obasjane
Centralni tok uzorka
laserskom svjetlosti, a
stepen raspršenja
svjetlosti je pokazatelj Igla za ubacivanje
fizičkih osobina stanica. uzorka
 Stepen raspršenja svjetlosti pod pravim uglom
od smjera laserske zrake razmjeran je zrnatosti
tj. unutrašnjoj strukturi stanicee.

Detektor za
unutrašnju
strukturu stanice

Detektor za veličinu
Upadna laserska
stanice
svjetlost
Stepen raspršenja svjetlosti u
smjeru laserske zrake razmjeran
je veličini stanice
Protočni citometar
Protočni citometar Beckman Coulter FC500
 Osnove protočne citometrije

• Detekcijom fluorescence na pojedinačnim stanicama

u suspenziji mogu se izbrojati stanice koje
eksprimiraju molekule za koje su se vezala
obilježena antitijela
• Količina vezanih antitijela za svaku pojedinačnu
stanicu (što odgovara nivou ekspresije) se mjeri
prilikom njihovog prolaska kroz fluorimetar
• Relativna zastupljenost specifičnih molekula na
različitim staničnim populacijama može se uporediti
ukoliko koristimo isto sredstvo za obilježavanje i
odredimo ukupnu emitovanu fluorescencu za svaku
populaciju
 Osnove protočne citometrije

• U pripremi za protočnu citometriju stanične

suspenzije se mogu inkubirati sa jednom ili više vrsta
obilježenih antitijela. Najčešće se koriste fluorohrom-
obilježena antitijela za specifične molekule na
površini stanice
• Citoplazmatski molekuli se takođe mogu
detektovati tako što se stanice podvrgnu tretmanu
koji ih dovodi u privremeno stanje povećane
permeabilnosti sto će omogućiti obilježenim
antitijelima da prođu membranu
 Šta se može određivati protočnom
citometrijom?

• Odvajanje čestica u suspenziji

• Razlikovanje “biološkog” od “ne-biološkog”
• Odvajanje “živih” čestica od “mrtvih”
• Procesuiranje 105-106 čestica za manje od 1 min
• Sortira pojedinačne česice za subsekventnu analizu
 Primjena protočne citometrije

• 1. DNK/RNK analiza- odnosno analiza staničnog

ciklusa
• 2. Analiza stanične funkcije
• 3. Mikrobiologija
• 4. Imunofenotipizacija
Primjena protočne citometrije
 1. Analiza staničnog ciklusa

• Jedna od najranijih primJena protočne citometrije je

utvrđivanje faze staničnog ciklusa na osnovu
određivanja količine stanične DNK

• Protočna citometrija je i dalje metoda izbora za brzo i

precizno određivanje staničnih frakcija koje su u
različitim fazama staničnog ciklusa.
 1. Analiza staničnog ciklusa
• Najjednostavniji metod zasniva se na afinitetu
fluorescentne boje za vezivanje za DNK, čime se
detektuje njena količina u stanici.
• Propidium jodid (PI) je najčešće u upotrebi. Nakon
vezivanja sa DNK pojačavaju mu se flourescentna
svojstva. Neophodno je staničnu membranu učiniti
propustljivom za ovaj molekul.
• Hoechst 33342 se upotrebljava kada je potrebno
obilježavanje nepropustnih (živih) stanica.
 Druge boje sa afinitetom za DNK/RNK

• Propidium Jodid
• Hoechst
• Cijaninske boje
• TOTO-1 , YOYO-1, TOTO-3
• Thiazol Orange, Thiazol Blue, Thioflavin
• PRO boje
• SYTO/SYTOX boje (Sytox green)
• Acridin Orange
• Pyronin Y
• Styryl boje
• Mithramycin + EtBr
 Hromozomska analiza

• Pojedinačni hromozomi se mogu analizirati “flow”

citometrom nakon odgovarajuće izolacije i pripreme.

• Najčešći metod je zasnovan na upotrebi dvije različite

DNK boje, gde jedna (Hoechst 33258) prvenstveno
obilježava AT-bogate regije DNK dok druga
(chromomycin A3) predominantno obilježava regije
sa GC.
 2. Mjerenje apoptoze

• Apoptoza je programirana stanična smrt pri kojoj

stanica prolazi kroz strogo regulisan proces
“umiranja”

• Odlikuje se:
• kondenzovanjem hromatinskog materijala
• vakuolizovanjem nuklearnog materijala
• često praćena internukleozomalnom degradacijom
DNK stvarajući tipičan “ljestvičast” izgled na DNK
elektroforezi na gelu
 Metodi za detekciju apoptoze

• Boje: Hoechst 33342 (UV), PI, YOPRO-1

• DNK Fragmenti: Nakon fiksiranja ili permeabilizovanja

stanica, fragmenti DNK male molekulske težine se
ekstrahuju i jedan dodatni pik ('sub-G1') porijeklom
od apoptoznih stanica može biti viđen na
histogramu DNK.

• Internukleozomalna degradacija DNK može biti

vizuelizovana enzimskim obilježavanjem okrajaka
pokidane DNK
 3. Mikrobiologija

• Detekcija nepoznatih organizama

• Testiranje osetljivosti na antibiotike
• Detekcija spora
 Detekcija bakterija na osnovu
sadržaja nukleinskih kiselina

Fluorescentne boje
• moraju biti relativno specifične za nukleinske kiseline
• moraju fluorescirati samo kada su vezane za
• nukleinske kiseline

Primeri
• DAPI
• Hoechst 33342
• cyanine dyes YoYo-1, YoPro-1, ToTo-1
 Identifikacija mikroorganizama
pomoću antitijela

• Brojanje i identifikacija ciljnih organizama u miješanoj

populaciji
Primeri uključuju:
• • Legionella spp. u rashladnim uređajima
• • Cryptosporidium & Giardia u vodenim rezervoarima
• • Listeria monocytogenes u mlijeku
• • E.coli O157:H7 u kontaminiranom mesu
• • Bacillus anthracis & Yersinia pestis biološko oružje
 Identifikacija mikroorganizama
pomoću antitijela

Miješane suspenzije bakterija – analiza spora

Identifikacija moguća već samo na osnovu rasipanja

Signali svjetlosnog rasipanja iz mješavine živih spora B.anthracis, živih spora B.

subtilis i sporama B. anthracis ozračenim gama zracima
 4. Imunofenotipizacija

• Najvažnija primjena protočne citometrije je analiza i

razvrstavanje subsetova stanica krvi sa upotrebom
površinskih markera
• Pored toga, najvažnije podgrupe krvnih stanica imaju
različito prednje i bočno rasipanje, koje je prema
zakonima optike uslovljeno veličinom, oblikom kao i
kompleksnošću unutrašnjih struktura
• U poređenju sa limfocitima neutrofili imaju
značajno veće bočno rasipanje zbog
intracitoplazmatskih granula,monociti imaju
značajno veće prednje rasipanje zbog svoje veličine
 Analiza: izdvojene stanice od interesa

Lizirana cijela krv Side Scatter

Neutrofili

Monociti

Limfociti

Forward Scatter
• Stanice se analiziraju na osnovu relativnog
intenziteta fluorescencije koja potiče od
staničnih struktura za koje je vezano antitijelo
konjugovano sa fluorohromom

• U protočnoj citometriji se koriste specifični

fluorohromi sa karakterističnim ekscitacijskim i
emisijskim spektrom.
 Elektronika

Fluidi Detektori svjetla

FL3 P Cy5

FL2 PE

FL1 FITC

Lasersko SSC

Svjetlo
488nm
FSC
Računar
 Identifikacija stanica

►Upotrebom monoklonalnih antitijela koja reaguju sa

specifičnim antigenima eksprimiranim na B & T
limfocitima, monocitima i granulocitima možemo
detektovati:
►vrste pojedinih stanica,
►njihove subpopulacije,
►stanje aktivacije i
►vijabilnost.
 Primjena protočne citometrije u kliničkoj laboratoriji

► Procjena imunološkog statusa pacijenta: identifikacija

limfocitnih subpopulacija, određivanje njihovog udjela,
apsolutnog broja i stanja aktivacije:

► CD3+ ukupni T limfociti

► CD3+/CD4+ T pomoćnički limfociti
► CD3+/CD8+ T citotoksični limfociti
► CD19+ B limfociti
► CD3-/CD56+ NK stanice
► CD3+/HLA-DR+ aktivirani T limfociti
 Ovo je veoma korisno za dijagnostiku i praćenje:

►Kongenitalnih imunodeficijencija

►Stečenih imunodeficijencija
 Agamaglobulinemija
(izostanak populacije B limfocita)
 Monitoring HIV infekcije

►Imunofenotipizacija subpopulacija limfocita se koristi

za procjenu imunog statusa oboljelog kao i za
praćenje eventualne progresije bolesti
*Odgovara CDC vodičima za HIV monitoring.

Omjer CD4/CD8 i apsolutni broj CD4 T limfocita

►za praćenje toka bolesti
►za utvrđivanje potrebe za antiretroviralnom
terapijom,
►kao i za praćenje njenih efekata
 Mjerenje vrijednosti limfocita CD4

• Limfociti CD4 su sastavni dio imunološkog

sistema.
• Broj prisutnih limfocita CD4 je direktan indikator
sposobnosti imunološkog sistema da se odbrani
od oportunističkih infekcija.
• Značajne oportunističke infekcije nastaju kada je broj
limfocita CD4 ispod 200/mm³.
 Mjerenje vrijednosti limfocita CD4

• Broj limfocita CD4 kod HIV-neinficiranih osoba je

između 500 i 1.200 u jednom kubnom milimetru
krvi.
• Pad vrijednosti limfocita CD4 kod HIV-inficirane
osobe se obično javi nakon niza godina, kako
infekcija napreduje.
 Mjerenje vrijednosti limfocita CD4

• Broj limfocita CD4 između 500 i 200 ukazuje da je

imunološki sistem donekle oštećen,
• Vrijednosti ispod 350 ili njihov rapidni pad je
indikacija za razmatranje uključivanja anti -HIV
tretmana.
• Uz upotrebu ARV terapije, broj limfocita CD4 će
se vremenom povećavati ka normalnim
vrijednostima i održavati se na određenom nivou.
 Mjerenje vrijednosti limfocita CD4

• Važno je pratiti broj limfocita CD4.

• Koliko često će se mjeriti vrijednosti limfocita
CD4 zavisi od brojnih faktora:
• prethodne vrijednosti limfocita CD4; prisustvo ili
odsustvo simptoma bolesti;
• da li je osoba na HIV tretmanu ili da li je upravo
započela neki novi tretmanski režim.
Smanjenje udjela CD3+CD4+ T limfocita i omjera
CD4/CD8 stanica
 Monitoring imunosupresivne terapije i
rekonstitucije imunog sistema
• Analiza udjela B i T limfocitne subpopulacije kod
pacijenata na imunosupresivnoj terapiji u cilju
praćenja njene efikasnosti kao što je:
- Mabthera (anti-CD20),
- OKT 3 (anti-CD3)...
• Praćenje rekonstitucije imunog sistema nakon: -
transplantacije koštane srži ili
-nakon završene imunosupresivne terapije
Hvala na pažnji!!!!!