Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào

Nguồn protein từ sinh khối VSV

• Sinh khối những TB VSV dùng làm nguồn protein dinh

dưỡng  protein đơn bào (SCP)

• Ví dụ: sinh khối nấm men trong sản xuất bánh mỳ (men
bánh mỳ), trong sản xuất rượu (bánh men rượu), sinh khối vi
khuẩn có hoạt tính probiotic (men tiêu hóa), sinh khối
Bacillus thuringiensis có protein diệt sâu…
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Nguồn protein từ sinh khối VSV
• Ưu điểm:

- Năng suất cao, hiệu quả thu hồi lớn

-Diện tích nuôi cấy không lớn
- Tốc độ sinh sản cao gấp 100-1000 lần so với TB ĐTV
- Không phụ thuộc vào khí hậu, thời tiết…
-Có thể phân lập, lựa chọn chủng giống thích hợp cho từng quy
trình
-Sản xuất từ các nguyên liệu phi protein đa dạng, rẻ tiền  góp
phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường
- Đa số hiện nay mới sử dụng sinh khối VSV cho thức ăn động thực
vật, ít sử dụng cho con người  cần nâng cao công đoạn tinh chế,
loại bỏ tạp chất…
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
VSV sử dụng trong sản xuất SCP

• Tiêu chuẩn:

-Thời gian sinh đôi ngắn

- Có khả năng tổng hợp protein cao (40-70% so với sinh khối)
- Có thể sử dụng tối đa các chất dinh dưỡng trong môi trường
- Không gây bệnh hoặc tiết độc tố vào môi trường nuôi cấy
- Ổn định ngay cả trong điều kiện nuôi cấy không vô trùng
- Sinh khối/protein dễ dàng tách ra khỏi môi trường
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Sản xuất nấm men bánh mỳ

• Là quá trình lên men đường  rượu + CO2

• Chủng VSV: Saccharomyces cerevisiae

• Phương pháp truyền thống/ dân gian làm bánh mỳ: nhào
trộn bột, đường, sữa + bánh men giống (S. cerevisiae)  ủ
mát (25-27oC) trong vài giờ.
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Sản xuất nấm men bánh mỳ

• Nguyên liêu: rỉ đường và muối

khoáng

• Tỷ lệ giống: 1%

• Thời gian lên men: 3-4 ngày (khi

giống phát triển mạnh  đường sót
còn lại < 0,1%)

• Thu hồi: ly tâm để loại nước

Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Sản xuất sinh khổi nấm men
Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Sản xuất sinh khổi nấm men

• Cơ chất:

- Các nguồn hydrate carbon thông thường: NM phải có khả

năng sử dụng được các nguồn RH khác nhau (pentose, axit
hữu cơ…), phát triển nhanh, có sức đề kháng với CO2, có khả
năng phát triển tốt trên môi trường có nồng độ chất khử cao
- Rỉ đường: 30-40% saccharose, biotin, axit pantothnic,
inositol…  phù hợp cho sự phát triển của NM, tuy nhiên cần
hòa loãng dịch rỉ đến 4-6% đường, bổ sung khoáng, axit
amin…, pH thích hợp từ 3,5-4,5.
Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Sản xuất sinh khổi nấm men

• Cơ chất:

- Các nguồn lignocellulose

 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Sản xuất sinh khổi nấm men

• Cơ chất:

- Các nguồn dầu mỏ và khí đốt:

Nhà máy sản xuất protein sinh khối nấm
men từ paraffin, với công suất 12000
tấn/ năm (Liên Xô cũ)
Các nhà máy dùng hydrocarbon dầu mỏ
khác để sản xuất protein có công suất
120.000 – 150.000 tấn/ năm (Nhật),
100.000 tấn/năm (Italia)
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Sản xuất sinh khổi nấm men

• Cơ chất:

- Các nguồn hydrocarbon dầu mỏ:

Các chủng NM cần có: (i) Sử dụng hydrocarbon dầu mỏ là
nguồn C duy nhất cho sinh trưởng, trao đổi chất và tổng hợp
năng lượng; (ii) Bền vững với hydrocarbon ở nồng độ cao;
(iii) Có khả năng để hydrocarbon được hấp thu vào cơ thể

Các chủng NM thuộc chi Candida: C. tropicalis, C. lipolitica,

Rhodotorula sp, …
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Dịch thủy phân VSV

• Đặc điểm:

-TB VSV chứa nhiều chất có giá trị sử dụng

- Chất ngoại bào
- Chất nội bào
- Trong công nghiệp:
phá TB bằng nhiệt và nghiền
-Thủy phân bằng enzyme: -1,3-glucanase, protease,
-1,6-glucanase, mannase, chitinase… phối hợp để thủy phân
 dịch chiết nấm men/ cao nấm men
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Dịch thủy phân nấm men

• Quy trình:

-B1: Làm chết tế bào (ngâm sinh khối TB trong dung dịch muối và
dung môi hữu cơ isopropanol 0,5% trong 5-6h)  thủy phân ở 58oC
trong 48 giờ, pH 5,5 .

-B2: Giai đoạn tự thủy phân: do enzyme của Tb tự phá vỡ vách TB ở

pH 5, nhiệt độ 30-55oC trong 20 giờ. Có thể bổ sung papain, tăng nhiệt
độ 50-60oC  tăng hiệu suất thủy phân
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Dịch thủy phân nấm men
• Quy trình:

-B3: Giai đoạn Pasteur hóa, làm trong dịch chiết (ly tâm/ lọc). Sản phẩm
dịch chiết nấm men thường có hàm lượng chất khô khoảng 70-75%.

- Giải pháp thực tế 1: dùng hỗn hợp glucanase của Arthrobacter,

protease kiềm để thủy phân dịch nước muối NaCl (3%) ngâm tế bào
nấm men (20% sinh khối) ở 45-50oC, khoảng 10-13 giờ
- Giải pháp thực tế 2: Gia nhiệt hỗn hợp huyền phù chứa TB NM đến
90oC trong 10 phút rồi xử lý bằng enzyme  giảm thời gian tự thủy
phân từ 48 giờ  16 giờ, tăng hiệu suất chiết xuất từ 50%  70%
Nghiên cứu thu nhận lipid từ rơm rạ bằng con
đường lên men vi sinh vật làm nguyên liệu sản
xuất biodiesel

Đơn vị thực hiện: Phòng CNVLSH

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2014
II. NỘI DUNG KHCN CỦA ĐỀ TÀI
- Nguồn năng lượng mới: ít gây ô nhiễm, có
giá trị cao về mặt năng lượng, an toàn
trong quá trình sử dụng hơn so với dầu mỏ.
- Nhiều triển vọng trở thành nguồn năng
lượng thay thế cho dầu thô
- Sản xuất từ mỡ động vật, dầu thực vật,
tảo…

-Rơm rạ: 50-60 triệu tấn/năm

- Hiện nay chủ yếu là làm phân bón, làm
nấm, các tấm ép, lót chuồng trại…
NHÓM VI SINH VẬT TÍCH LŨY DẦU

- Các vi sinh vâ ̣t dị dưỡng có khả năng tích lũy lipid

(phần lớn là triacylglycerol – TAG) khi nguồn dinh
dưỡng trong môi trường bị cạn kiê ̣t (nguồn nitơ
hoặc nguồn photpho) nhưng nguồn carbon lại dư
thừa

- Nhóm nấm mốc gồm các loài: Mortierella alpine,

Mucor circinelloides, Tilletiopsis albescens,
Backusella ctenidia, Lectosphaerella sp., Gibberella
fujikuroi, Fusarium sp., Aspergillus fumigatus,
Aspergillus oryzae, và Penicillium decumberns.
Lipid: 12-32%

- Các chi nấm men được nghiên cứu cho thấy khả
năng tích lũy TAG cao nhất là Yarrowia, Candida,
Rhodotorula, Rhodosporodium, Cryptococcus và
Lipomyces. Lipid: 38-70%

- Các loại vi khuẩn: Arthrobacter sp, Acinetobacter

calcoaceticus, Rhodococcus opacus, Bacillus alcalophilus.
Lipid: 18-40%
 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Thu nhận được sinh khối vi sinh vật tích lũy lipid cao và tách chiết được lipid làm
nguyên liệu sản xuất biodiesel. Phần còn lại của sản phẩm thủy phân rơm
rạ được chế biến làm phân bón vi sinh

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc vừa có khả năng sinh tổng hợp
cellulase và tích lũy lipid cao trên cơ chất là sinh khối.
2. Phân loại chủng nấm mốc R4.4 và chủng nấm men NM7
3. Đánh giá khả năng đối kháng của chủng A. oryzae R4.4 và chủng L. starkeyi NM7
4. Đánh giá khả năng sinh trưởng và tích lũy lipid của chủng A. oryzae R 4.4 và
chủng L. starkeyi NM7 trên các nguồn đường khác nhau, nguồn nitơ…
5. Lựa chọn phương thức lên men rơm rạ phù hợp để tích lũy lipid cao
6. Tách chiết lipid từ sản phẩm lên men và xác định thành phần hóa học của lipid
7. Xử lý bã rơm rạ sau tách chiết lipid
1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc vừa có khả năng sinh tổng hợp cellulase
và tích lũy lipid cao trên cơ chất là sinh khối.

Nấm mốc Nấm men

Mẫu Nấm mốc Nấm men

Mật độ [CFU/ml] Số loại khuẩn lạc Mật độ [CFU/ml] Số loại khuẩn lạc
Mẫu đất 1 2,0 x 102 4 1,2 x 102 2
Mẫu đất 2 2,3 x 103 6 1,3 x 101 1
Mẫu đất 3 2,0 x 100
2 1,1 x 101
3
Mẫu đất 4 1,6 x 104
7 1,0 x 101
3
Mẫu đất 5 2,0 x 102
5 1,0 x 102
2
Mẫu đất 6 1,8 x 102
6 1,8 x 102
2
Mẫu đất 7 2,1 x 102
4 1,1 x 101
1
Mẫu đất 8 1,0 x 103
6 1,0 x 103
3
Mẫu đất 9 1,1 x 103
5 1,4 x 101
1
Mẫu rơm rạ 2,7 x 103
7 2,6 x 103
2
Hoạt tính cellulase của các chủng nấm men và nấm mốc phân lập

Chủng Đường kính vòng phân giải CMC (D-d) (mm)

NM5
Nấm mốc R4.4 21
R4.4
Nấm mốc H1.1 11
H1.1
NM7 Nấm mốc R8 17
R8 NM2 Nấm men NM2 11
Nấm men NM5 11
Nấm men NM7 13

Hoạt tính CMCase:

- Chủng R4.4: 12,5 U/mL

- Chủng R8: 7,8 U/mL

- Chủng NM7: 4,6 U/mL

Khả năng tích lũy lipid của các chủng nấm men và nấm mốc phân lập

Chủng Khả năng tích lũy

lipid

Nấm mốc R4.4 +++

R4.4 H1.1

Nấm mốc H1.1 +

Nấm mốc R8 +

Nấm men NM2 ++

Nấm men NM5 ++

Nấm men NM7 +++

2. Phân loại chủng nấm mốc R4.4 và chủng nấm men NM7

1.5 kb

Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc (bên trái) và cơ quan 18S rRNA gen
bào tử trần (bên phải) của chủng nấm mốc R4.4

Đối tượng loài so sánh Mức độ tương đồng

Chủng Aspergillus oryzae ZJZ 100%
Chủng Aspergillus sojae JPDA1 99%
Chủng Aspergillus tamarii P.tri.Iso8 91%
Chủng Aspergillus parasiticus DAOM 225948 61%
Chủng Aspergillus flavus DAOM 225949 63%
Chủng Aspergillus nominus H5 59%
 500 bp

Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc (bên trái) và tế bào của Vùng D1/D2 của
chủng nấm men NM7 gen 26S rRNA

Đối tượng loài so sánh Mức độ tương đồng

Chủng Lipomyces starkeyi 100%
Chủng Lipomyces kononenkoae 99%
Chủng Lipomyces tetrasporus 99%
Chủng Lipomyces yarrowii 99%
Chủng Lipomyces spencermartinsiae 95%
Chủng Lipomyces lipofer 93%
3. Đánh giá khả năng đối kháng của chủng A. oryzae R4.4 và chủng L. starkeyi NM7

4. Đánh giá khả năng sinh trưởng và tích lũy lipid của chủng A. oryzae R 4.4 và chủng L.
starkeyi NM7 trên các nguồn đường khác nhau
Chủng Khả năng sinh trưởng trên các nguồn đường khác nhau (g/l)
Glucose Xylose Arabinose Galactose Mannose Glucose +
Xylose

A. oryzae R 4.4 32,73 33,41 5,9 20,91 25,74 32,7

L. starkeyi NM7 25.85 3.19 3.88 11.33 23.65 21.49

Khả năng tích lũy lipid trên các nguồn đường khác nhau (% so với sinh khối khô tế bào)

A. oryzae R 4.4 26,8 27,4 10,1 18,1 22,7 30,2

L. starkeyi NM7 61,2 11,7 10,3 17,4 39.3 35,8

Đánh giá khả năng sinh trưởng và tích lũy lipid của chủng A. oryzae R 4.4 và chủng L.
starkeyi NM7 trên các nguồn nitơ khác nhau
Sinh khối khô trên các nguồn nitơ khác nhau (g/l)
Chủng
NaNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 KNO3 Cao nấm men Peptone
A. oryzae R 4.4 28,3±0.3 25,4±0,5 29,5±0,7 25,9±0.3 29,7±0,4 30,6±0,9
L. starkeyi NM7 25,1±0,8 22,8±0,4 25,8±0,3 23,7±0,6 22,3±0,5 19,2±0,7
Khả năng tích lũy lipid trên các nguồn nitơ khác nhau (% so với sinh khối khô tế bào)
A. oryzae R 4.4 29,7±0.8 25,9±0,5 26,5±0,3 20,5±0,6 17,4±0,7 19,8±0,5
L. starkeyi NM7 63,3±0,4 55,6±0,5 60,6±0,3 60,7±0,3 54,6±0,9 55,2±0,7

Ảnh hưởng của nồng độ NaNO3 đến khả năng sinh trưởng và tích lũy lipid của chủng A.
oryzae R 4.4 và chủng L. starkeyi NM7
Chủng Nồng độ NaNO3 (%)

0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8

Khả năng sinh trưởng (g/l)
A. oryzae R 4.4 4,1±0,3 9,7±0,5 12,2±0,8 20,2±0,5 30,3±0,4 31,4±0,3
L. starkeyi NM7 6,7±0,5 8,4±0,4 7,54 19,8±0,7 26,2±0,4 26,9±0,8
Khả năng tích lũy lipid (% so với sinh khối khô)
A. oryzae R 4.4
- 3,1±0,9 15,2±0,4 20,9±0,5 25,3±0,4 21,1±0,3
L. starkeyi NM7 - 15,6±0,6 26,4±0,5 40,7±1,2 63,7±0,7 42,7±0,4
Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và tích lũy lipid của chủng A. oryzae R 4.4
và chủng L. starkeyi NM7

Sinh khối khô:

8,7 ± 0.3  29,7 ± 1,1
Lipid:
KXĐ  26,4 %
pH8: SKK đạt 28,6 g/L
Lipid: 29,7%

Sinh khối khô:

5,6 ± 0.2  25,2 ± 0,9
Lipid:
7,8  62,2 %
pH7: SKK đạt 25,0 g/L
Lipid: 62,2%
5. Lựa chọn phương thức lên men rơm rạ để tích lũy lipid cho chủng A. oryzae R4.4 và
chủng L. starkeyi NM7.

Lên men chìm

Khả năng tích lũy lipid

Chủng dùng cho lên (g/100g rơm khô)
men
Lên men chìm Lên men xốp

A. oryzae R 4.4 0,8 0,6

ĐC TN L. starkeyi NM7 1,1 1,3

Lên men xốp

A. oryzae R 4.4 + L.
3,8 5,1
starkeyi NM7

ĐC TN
5. Lựa chọn phương thức lên men rơm rạ để tích lũy lipid cho chủng A. oryzae R4.4 và
chủng L. starkeyi NM7.
Khả năng thủy phân rơm rạ Ảnh hưởng dung môi hữu cơ đến
của chủng nấm mốc A. oryzae R4.4 hiệu suất tách chiết lipid
Dung môi Hàm lượng lipid

sử dụng để tách chiết [g/100 g rơm khô]

Chloroform:Methanol (2:1) 6,82
Chloroform:Methanol:Nước
6,67
(1:4:1)
n-Hexan 5,34

Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp Động thái lên men xốp rơm rạ đồng thời
giống L.starkeyi NM7 thu nhận lipid
 LÊN MEN RƠM RẠ

Rơm rạ được nghiền nhỏ Rơm rạ sau khi nghiền Rơm rạ sau tiền xử lý

Rơm rạ sau 4 tuần lên men Rơm rạ sau 2 tuần lên men
Hệ thống lên men
xốp rơm rạ
6. Tách chiết lipid từ sản phẩm lên men và xác định thành phần hóa học của lipid
TT Axit béo Tên thường Hàm lượng (%)
1 C4:0 Axit butyric
2 C6:0 Axit caproic
3 C8:0 Axit enanthic
9,1 g lipid/ 100 g rơm khô 4 C10:0 Axit capric
5 C12:0 Axit dodecanoic
6 C14:0 Axit myristic 0.58
7 C15:0 Axit pentadecylic 0.21

8 C15:1n-5 Axit pentadecenoic 0.24

9 C16:0 Axit palmitic 39.48

10 C16:1n-7 Axit heptadecenoic 2.64

11 C17:0 Axit margaric 0.54

12 C17:1n-7 - 0.83
13 C18:0 Axit stearic 8.33
14 C18:1(n-7) Axit oleic 43.54
15 C18:3(n-3) Axit linolennic 0.28
16 C20:4(n-6) Axit arachidonic 0.20
17 C22:4(n-6) Axit devoconic 0.77
18 C22:6(n-3) 0.06
19 C28:0 Axit montanic 2.29
 7. Xử lý bã thải rơm rạ sau tách chiết lipid tạo chế phẩm vi sinh

Các chủng có tác dụng phân giải lân: P.

Chủng vi sinh vật chức
năng
Nhân giống trên môi trường
dịch thể, thời gian tuỳ chủng
Môi trường xốp (bã rơm
rạ sau tách chiết lipid,
putida VL-HT14.5, Aspergillus sp. ML-HT
cám, trấu, chất dinh 4.1,
dưỡng đa, vi lượng) Cố định đạm: A. vinelandii Ab-HT14.2,
Azospirillum sp. As-HT14.1, Acetobacter
Khử trùng 1,25 at
trong 2,5 giờ diazotrophicus Ac-HT4.1

Chất lượng
TT Chỉ tiêu Phân HCVS Tiêu chuẩn TCN
Phối trộn theo tỉ lệ (1996)
1% 1 pHKCl 7,0 trung tính
2 Độ ẩm (%) 40 -
Nuôi ủ ở nhiệt độ 25 - 3 Độ xốp (%) 72 > 68
30oC 4 Hàm lượng hữu cơ 27 > 18
OM (%)
Kiểm tra chất 5 N tổng (%) 0,45 > 0,1
lượng 6 P2O5 tổng (%) 1,6 -
7 K2O tổng (%) 2,18 -
8 Axít humic (%) 0,47 -
Bảo quản, sử dụng

Mật độ VSV trong chế phẩm (CFU/g)

Chủng VSV
1 tháng 2 tháng 3 tháng
Azotobacter 1,6 x 107
8,0 x 107
3,7 x 106
Azospirillum 1,3 x 107 6,3 x 107 7,1 x 106
Acetobacter 1,4 x 107 1,4 x 107 3,2 x 106
VK PGL 4,2 x 108 3,7 x 107 2,5 x 106
Mốc PGL 4,6 x 105 1,8 x 105 2,7 x 104
7. Xử lý bã thải rơm rạ sau tách chiết lipid tạo biogas

TT Thành phần mẫu thí Thời gian lên men

nghiệm
7 ngày 13 ngày 20 ngày 28 ngày
Khả Thời Khả Thời Khả Thời Khả năng Thời gian
năng gian năng gian năng gian cháy cháy
cháy cháy cháy cháy cháy cháy (giây)
(giây) (giây) (giây)
1 100g rơm rạ sau chiết
lipid 700ml dịch Biogas
- - + 7s +++ 180 s +++ 70 s
Phùng (đã lọai cặn); pH=
7.5

2 50g rơm rạ sau chiết lipid

217 s
+ 350 ml dịch Biogas
- - + 14 s ++++ 52 s ++++ Bóp sạch
Phùng đã loại bớt nước
khí ra
(TS= 1.67%); pH= 7.5

3 25 g rơm rạ sau chiết lipid

175 ml dịch Biogas Phùng 110 s
đã loại bớt nước (TS= - - ++++ 44s ++++ 240 s +++ Bóp sạch
1.67%); pH= 7.5 khí ra
 KẾT LUẬN
1. Đã phân lập và tuyển chọn được 52 chủng nấm mốc và 20 chủng nấm men từ các mẫu đất, rơm rạ
khác nhau, trong đó chủng nấm mốc R 4.4 và chủng nấm men NM7 vừa có khả năng sinh tổng
hợp cellulase vừa có khả năng tích lũy lipid cao.

2. Đã phân loại được chủng nấm mốc R4.4 thuộc loài Aspergillus oryzae và chủng nấm men NM7
thuộc loài Lipomyces starkeyi

3. Đã đánh giá tính đồi kháng lần nhau cũng như khả năng sinh trưởng và tích lũy lipid của chủng nấm
mốc A. oryzae R4.4 và chủng nấm men L. starkeyi NM7 trên môi trường cơ sở có các nguồn
đường, nguồn nitơ và tỷ lệ nguồn nitơ khác nhau.

4. Đã chọn được một số điều kiện lên men xốp hai chủng A. oryzae R4.4 và L. starkeyi NM7 trên cơ
chất rơm rạ như tỷ lệ giống mỗi chủng 10%, thời điểm tiếp giống nấm men sau 2 ngày so với nấm
mốc và thời gian lên men 28 ngày để thu được hàm lượng lipid cao 9,1 g/100 g rơm rạ.

5. Đã phân tích được thành phần axit béo từ quá trình lên men rơm rạ, chủ yếu là axit palmitic
(39,48%) và axit oleic (43,54%), đủ đáp ứng chất lượng nguyên liệu để chuyển hoá sang biodiesel.

6. Bã rơm rạ sau tách chiết lipid có hàm lượng mùn 5,4% có thể được tận dụng làm phân bón vi sinh
đa chức năng bằng cách bổ sung một số chủng vi sinh vật có khả năng cố định nitơ, phân giải
lân... Chế phẩm đạt tiêu chuẩn theo quy định về phân bón vi sinh.

7. Bã rơm rạ sau tách chiết lipid cũng có thể sử dụng làm nguồn cơ chất lên men yếm khí sinh biogas
sử dụng bùn hoạt tính
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Sản xuất sinh khối tảo
• Giá trị dinh dưỡng của sinh khối tảo:

-Chứa 1 lượng lớn các chất có hoạt tính sinh học

- Hàm lượng protein cao: 40-60% khối lượng khô (vi tảo), 60-70% (vi khuẩn
lam)
- Hàm lượng axit amin trong cấu phần protein khá cân đối, gần với quy định
của protein tiêu chuẩn, hàm lượng các a.a không thay thế trong protein rất
cao (~ 42%)
- Chứa nhiều vitamin: A, nhóm B, K và C
- Chứa sắc tố tự nhiên  khai thác để thay thế các chất màu tổng hợp trong
CN thực phẩm, mỹ phẩm
- Một số loài có khả năng tổng hợp các chất kháng sinh  y dược
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Sản xuất sinh khối tảo
• Yêu cầu của chủng giống sản xuất:

-Tốc độ sinh trưởng nhanh, năng suất quang hợp cao, có khả năng
chống chịu được sự thay đổi của điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, độ
chiếu sáng, nồng độ muối cao, kháng bênh)

- Sinh khối có thành phần hóa học thích hợp với mục đích sản xuất,
không chứa độc tố

- Tế bào luôn ở dạng huyền phù, dễ thu hồi (lọc/ ly tâm)

 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Tảo Chrorella
- Giống Chrorella được phát hiện năm 1890, được nuôi đại trà
từ năm 1950 (USA, EU)

- Tảo đơn bào, kích thước nhỏ (1 m), tự dưỡng

- Một số loài có thể sống không cần ánh sáng và sử dụng nguồn
C hữu cơ (glucose, acetate)

- Một số loài thường sử dụng để thu nhận sinh khối: C.

elipsoidea. C. vulgaris, C. pyrenoidosa
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Tảo Scenedesmus
- Số lượng loài ít, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa không đặc trưng cho từng
loài

- Tự dưỡng nhưng cũng có khả năng phát triển không cần ánh sáng và sử
dụng nguồn C hữu cơ (đường đơn, acetate) giải phóng CO2 và H2O

- Sinh khối có hàm lượng protein cao (50-55% khối lượng khô), làm thức ăn
cho chăn nuôi

- Sinh tổng hợp các enzyme protease, amylase ngoại bào

- Loài đại diện: S. acuminatus, S. acutiformis, S. costulatus

 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Tảo Spirulina
- Là giống được sử dụng khá phổ biến để nuôi trồng thu sinh khối

- Cơ thể dạng sợi đa bào, có dạng xoắn lò xo, sống tự nhiên trong môi trường
nước giàu NaHCO3; Vòng đời ngắn, đơn giản, có thể thu hoạch quanh năm;
hiệu suất sử dụng ASMT cao, sử dụng CO2 làm nguồn C đạt 30%, năng suất
cao.

- Có xu hướng nổi lên mặt nước, tụ tập thành khối, kích thước lớn (0,25-0,5
mm)  dễ dàng thu hoạch bằng vớt, lọc

- Loài đại diện: S. platensis, S. maxima

 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Quy trình sản xuất sinh khối tảo
• Quy mô sản xuất:

- Quy mô thủ công đơn giản: trong các ao tự nhiên, các bể xây xi măng,
thùng gỗ, nhựa, không thực hiện sục CO2, không khuấy đảo.

- Quy mô bán công nghiệp: trong các bể xây hình đường ống, phía trên tiếp
xúc ASMT, cấp CO2 vào môi trường nuôi và môi trường được vận chuyển
tuần hoàn trong bể nhờ máy bơm, nhiệt độ môi trường nuôi 25-26oC

- Quy mô công nghiệp: hệ thống kín và hệ thống mở, cần khuấy trộn, sục khí
 tạo đk cho TB tiếp xúc ánh sáng, CO2, thực hiện quá trình quang hợp
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Quy trình sản xuất sinh khối tảo
• Quy mô sản xuất công nghiệp

- Hệ thống kín: trong bể lên men, chủ yếu sử dụng ánh sáng nhân tạo (đèn)
có cường độ cao và hệ thống sục khí CO2 với nồng độ điều chỉnh. Ưu điểm:
không phụ thuộc ASMT, thời tiết, khí hậu, kiểm soát tốt đk nuôi cấy  năng
suất tạo sinh khối cao. Nhược điểm: giá thành cao  ít được áp dụng rộng

- Hệ thống mở: Quá trình quang hợp sử dụng ASMT tự nhiên. Các bể nuôi có
môi trường nước cao 15-20 cm. Có hệ thống đảo trộn để tăng đk tiếp xúc
trực tiếp ASMT, làm vi tảo không bị lắng xuống đáy và môi trường dinh
dưỡng phân phối đều cho toàn bộ TB trong hệ thống.
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Quy trình sản xuất sinh khối tảo
• Môi trường nuôi trồng:

- Nước máy: bổ sung các chất

khoáng ở dạng phân bón khô

- Nước biển: bổ sung thêm muối

khoáng

- Nước thải từ các khu vực chăn

nuôi gia súc hoặc từ nhà máy xử lý
nước thải
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Quy trình sản xuất sinh khối tảo
• Cấp CO2:

- Sục khí CO2 trực tiếp từ các nhà máy sản xuất bia, rượu

- Sục không khí (có chứa CO2) kết hợp với việc sục khí CO2 ngắt quãng

- Để đảm bảo việc cung cấp khí CO2 đủ cho quá trình nuôi trồng tảo  việc
lựa chọn địa điểm là quan trọng (nên gần các nhà máy có nguồn CO 2: nhà
máy bia, rượu, nơi có nguồn nước khoáng nóng giàu HCO3 hay CO2 tự do)
 Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Quy trình sản xuất sinh khối tảo
• Thu nhận sinh khối:

-Ly tâm/ vớt/ lắng kết hóa học, lắng kết điện trường/ tự lắng kết, lọc

-Đối với Spirulina có kích thước lớn: sử dụng màng lọc nghiêng, kết hợp với
hút chân không  hiệu quả thu hồi sản phẩm cao

- Sau khi tách khỏi môi trường  sinh khối được cô đặc sơ bộ  sấy khô
bằng đông khô/ sấy chân không/ sấy quay  sản phẩm mang đi chế biến
hoặc sử dụng trực tiếp
Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Quy trình sản xuất sinh khối tảo
Chương 7: CNLM sản xuất protein đơn bào
Quy trình sản xuất sinh khối tảo
Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Khái niệm enzyme

• Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có bản chất là các
protein do các TB sống sản sinhh ra nhưng hoạt động không
phụ thuộc tế bào
 Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Phân loại enzyme
• Enzyme oxh-khử: chuyển H+ hoặc điện tử trong các phản ứng oxh-khử, thường xảy
ra trong quá trình hô hấp và lên men
• Enzyme chuyển nhóm (transferase): chuyển nhóm a.a, amin hoặc methyl cũng như
các gốc monosaccharide từ hợp chất này  hợp chất khác
• Enzyme thuỷ phân (hydrolase): phân cắt các hợp chất hữu cơ phức tạp  hợp
chất đơn giản (với sự có mặt của H2O)

• Enzyme phân huỷ (lyase): tương tự nhóm hydrolase nhưng không có mặt của H2O
• Enzyme đồng phân hoá (isomerase): biến 1 hợp chất hữu cơ thành đồng phân
• Enzyme tổng hợp (ligase): xúc tác liên kết giữa 2 phân tử với nhau, kèm theo sự
phá huỷ các mối liên kết trong chất hữu cơ phức tạp – nucleoside triphosphate  có
ý nghĩa lớn trong TĐC của TB sống.
Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Tính chất enzyme

• Tác dụng thuận nghịch

• Tính đặc hiệu
• Hoạt lực xúc tác (hoạt tính)
Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực enzyme

• Nhiệt độ
• pH
• Chất hoạt hoá và chất ức chế enzyme
Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme

• Phương pháp lên men bề mặt:

Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme
• Phương pháp lên men bề mặt:

•Môi trường dinh dưỡng chủ yếu là cám (cám mỳ, cám gạo…), thêm ít
bột hoặc các loại bã khác (bã bia, bã lõi ngô, bã khô lạc, khô đậu
tương…): Cám làm ướt, trộn đều đến khi đạt độ ẩm 55-60% hấp vô
trùng ở 0,7 atm trong 1 giờ  làm nguội đến 40-42oC  cấy bào tử mốc
giống. Tãi cám đều ra các khay (50x70 cm) với độ dày 2-4 cm.

•Đặt khay vào phòng nuôi trên giá. Nhiệt độ phòng nuôi 30-32 oC. Khi
nào mốc mọc rõ rệt, kết lớp cám thành bánh thì bẻ nhỏ, trộn đều từ
dưới lên. Độ ẩm của cám cần giữ 55-60%, về cuối cám có thể khô dần.
Thời gian nuôi: 30-48 giờ
Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme

• Phương pháp lên men bề mặt:

-GĐ1: từ khi cấy mốc giống  giờ 8-10, thường ủ đống. Nhiệt độ
tăng dần  bào tử mốc mọc mầm – cuống mầm.
* Yêu cầu: Đảm bảo sự nảy mầm nhanh, tránh tạp nhiễm cần giữ
độ ẩm môi trường 55-60%, độ ẩm không khí phòng nuôi 96-100%,
nhiệt độ 30-32oC, tránh gió bụi ở ngoài thổi vào buồng. Khi nhiệt
độ đống ủ lên cao quá  tải mỏng khối môi trường ra khay và
thổi khí (quạt hút hoặc quạt thổi qua lọc không khí hạn chế bụi
bẩn và tạp khuẩn)
Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme

• Phương pháp lên men bề mặt:

-GĐ2: kéo dài 10-18 giờ. Mốc phát triển mạnh, lan khắp bề mặt,
có xu hướng ăn sâu vào toàn bộ khối môi trường.
-* Yêu cầu: Khi mốc kết bánh và mọc không đều  lật mặt dưới
lên trên và có thể bẻ vỡ nhỏ. Quá trình hô hấp của mốc xảy ra
mạnh mẽ, chất dinh dưỡng được sử dụng phần lớn. Nhiệt độ khối
mốc và phòng nuôi tăng, hàm lượng CO2 trong phòng nuôi cấy
tăng, cần có quạt thổi (hoặc hút) không khí sạch cùng nước sạch
(đã vô trùng sơ qua)  phun mù, làm ẩm phòng
Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme

• Phương pháp lên men bề mặt:

-GĐ3: kéo dài 10-20 giờ. Enzyme tạo thành mạnh mẽ, cường độ
trao đổi chất của mốc có thể giảm đi chút ít, tốc độ bốc hơi của
môi trường cũng giảm. Khi mốc bắt đầu tạo bào tử  quá trình
nuôi cấy kết thúc
-* Yêu cầu: Thổi khí sạch vào phòng nuôi. Mốc cám phải đập nhỏ,
sấy khô ở nhiệt độ thấp  độ ẩm 10-12% thì đóng túi. Mốc cám
có thể hoà tan trong nước, lọc sạch rồi tủa enzyme bằng cồn,
bằng (NH4)2SO4 hoặc các hoá chất khác
Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme

• Phương pháp lên men bề mặt:

• Ưu điểm:
-Cho nồng độ enzyme cao hơn phương pháp nuôi chìm
-Có thể sấy khô nhanh chóng môi trường mà không làm
giảm đáng kể hoạt tính enzyme
-Tránh được nhiễm trùng toàn bộ khối môi trường
-Tốn ít điện năng
•Nhược điểm: khó được cơ giới hoá, tự động hoá  năng
suất thấp, tốn nhiều lao động thủ công, cần diện tích nuôi
lớn
Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme

• Phương pháp nuôi cấy chìm:

-VSV được cấy vào môi trường dinh dưỡng lỏng trong các nồi nhân
giống và lên men

-Trong thời gian nuôi, thổi khí nén vô trùng để cung cấp khí cho
VSV hô hấp  thiết bị phức tạp nhưng dễ cơ khí hoá, năng suất
cao, mặt bằng sản xuất nhỏ
Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme

• Phương pháp nuôi cấy chìm:

 Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme
• Phương pháp nuôi cấy chìm:

-Ưu điểm: (i) tiết kiệm diện tích sản xuất; (ii) dễ cơ giới hoá, giảm lao động thủ
công, tạo năng suất cao; (iii) Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi
trường, tránh được sự lãng phí chất dinh dưỡng nằm lại trong khối môi
trường rắn mà VSV không sử dụng được; (iv) thu được enzyme ít tạp chất
hơn; (v) đảm bảo được điều kiện vệ sinh và vô trùng  nhiễm VSV lạ ít xảy ra
hơn

-Nhược điểm: (i) Nồng độ enzyme thấp  đặc dịch môi trường trước khi tách
enzye  giá thành cao; (ii) tốn điện năng do cần sục khí liên tục; (iii) nếu
không đảm bảo nước vô trùng  dễ bị nhiễm toàn bộ môi trường
 Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp thu hồi enzyme
• Thu dịch enzyme:

• Enzyme trong TB: phải phá vỡ TB (nghiền trong máy đồng hoá, nghiền với
thuỷ tinh, cát, siêu âm, áp suất thẩm thấu cao…)  chiết xuất enzyme bằng
dung môi khác nhau (H2O, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính…)  thu
được dịch enzyme và loại bỏ bã sinh khối

• Enzyme ngoại bào: Tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi môi trường bằng
ly tâm hoặc ép lọc với việc việc sử dụng thêm các chất trợ lọc (diatomit, than
hoạt tính…) hoặc các chất tạo kết tủa (CaCl2 + (NH4)2SO4  CaSO4  chất này
dễ dàng bị lắng cặn kéo theo sinh khối  lọc dễ hơn
 Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp thu hồi enzyme
• Thu chế phẩm kỹ thuật (chế phẩm thô)

• Chế phẩm enzyme kỹ thuật là chế phẩm chưa được tinh chế, có thể chứa 1
hoặc 1 vài enzyme chủ yếu hoặc các protein không hoạt động, các chất ổn định
và các tạp chất khác

• Cô đặc dịch enzyme có nồng độ chất khô từ 4-6 g/L  15-20 g/L ở nhiệt độ
35oC (cô chân không)

• Cô đặc tiếp ở 40-45oC để đạt nồng độ chất khô 30-35 g/L, bổ sung chất bảo
quản NaCl, glucerol, sorbitol, benzoate  chế phẩm enzyme kỹ thuật dạng
lỏng (bảo quản từ 1-2 năm)
 Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp thu hồi enzyme
• Thu chế phẩm kỹ thuật (chế phẩm thô)

• Bổ sung thêm các chất ổn định để đạt nồng độ chất khô 30-40 g/L  sấy khô
với nhiệt độ ban đầu 120oC và đầu ra 60oC  chế phẩm enzyme kỹ thuật
dạng bột

• Tủa enzyme bằng các muối trung tính (NH4)2SO4 hoặc cồn  ly tâm lấy cặn,
trộn thêm các chất ổn định  sấy khô  nghiền  chế phẩm enzyme kỹ thuật
dạng bột
 Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp thu hồi enzyme
• Thu chế phẩm enzyme tinh khiết

-Tách enzyme nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ: mỗi enzyme sẽ được kết tủa
tối đa ở một nồng độ dung môi nào đó (ethanol, isopropanol, acetone…).
Nhưng dung môi có thể gây bất hoạt enzyme  quá trình kết tủa phải tiến hành
nhanh chóng ở nhiệt độ thấp

-Tách enzyme nhờ kết tủa nhanh bằng muối trung tính (NH4)2SO4 hoặc NaCl: Tác
dụng kết tủa của các ion muối tỷ lệ thuận với lực ion của chúng  mỗi loại
enzyme sẽ được tủa tối đa ở một nồng độ xác định của muối. Thường kết tủa ở
môi trường có pH gần điểm đẳng điện của enzyme. Các muối vô cơ sau khi phân
đoạn có thể được loại bằng phương pháp thẩm tích hoặc phương pháp lọc gel.
 Chương 8: Sản xuất và ứng dụng enzyme VSV
Các phương pháp thu hồi enzyme
• Thu chế phẩm enzyme tinh khiết

-Tách enzyme bằng phương pháp hấp phụ không đặc hiệu (hấp phụ chọn lọc):
dịch enzyme chảy qua cột chất hấp phụ (hydrate nhôm axit, silicagel hydroxy
apatit,…). Mức độ hấp phụ tuỳ theo khả năng tương tác của từng loại enzyme
với chất hấp phụ  dùng dung dịch đệm thích hợp để chiết rút enzyme ra khỏi
cột (phương pháp này thường được dùng để cô đặc enzyme)

-Tách enzyme bằng phương pháp trao đổi ion: dựa vào sự trao đổi ion giữa
điện tích của enzyme với điện tích của các hạt nhựa. Dung dịch rửa là dung dịch
chất điện giải có nồng độ tăng dần  cạnh tranh điện tích với enzyme nhằm
đẩy enzyme ra khỏi cột…
 BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN KHOA HỌC &CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
CHƯƠNG TRÌNH CNSH TRONG CHẾ BIẾN VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT

ENZYME α-AMYLASE BỀN NHIỆT TÁI TỔ HỢP
ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP DỆT

MÃ SỐ ĐỀ TÀI: ĐT.07.10/CNSHCB
Thuộc Chương trình: Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực
công nghiệp chế biến đến năm 2020
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ Sinh học
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Trần Đình Mấn

HÀ NỘI 03- 2013

63
 MỞ ĐẦU
Endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolaza (α-amylaza, EC 3.2.1.1) là enzym
được sử dụng rộng rãi nhất trong nhiều ngành công nghiệp: sản xuất
etanol từ tinh bột, siro fructoza-glucoza, bột giặt và các chất tẩy rửa, rũ hồ
vải, tinh bột biến tính và tái chế giấy …
Enzym α-amylaza đã được sản xuất từ lâu trên thế giới và hiện tại có tỷ
trọng chiếm khoảng 30% thị trường thế giới trong tổng số các loại enzym
công nghiệp.
Cùng với sự phát triển của Công nghệ sinh học sản xuất các enzym hiện
nay của các công ty đều sử dụng chủng tái tổ hợp có năng suất rất cao
nên giá thành enzym hạ đi nhiều so với thời gian đầu khi sản xuất sử
dụng chủng dại.
Sử dụng α-amylaza bền nhiệt trong rũ hồ vải đã được ứng dụng từ
những năm 90 của thế kỷ trước.
Hướng nghiên cứu của đề tài đáp ứng nhu cầu hiện nay của ngành dệt
may, phù hợp với chiến lược phát triển của ngành dệt may Quyết định số
42/2008/QĐ-BCT ngày 19/11/2008 của Bộ Công thương về việc phê duyệt
quy hoạch phát triển ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đến năm 2015
và định hướng đến năm 2020.
64
I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm, tính chất và nguồn thu nhận α-amylase
1.1.1. Vị trí của α-amylase và các enzyme thủy phân mối liên kết glycosidic
Bảng 1.1. Các enzyme họ 13 1.1.2. Tính chất và
Enzyme Ký hiệu theo EC Cơ chất chính phân loại α-amylase
Amylosucrase EC:2.4.1.4 Sucrose Các enzyme bền nhiệt
Sucrose phosphorylase EC:2.4.1.7 Sucrose enzyme thích nghi lạnh
Glucan branching enzyme EC:2.4.1.18 Tinh bột, glycogen (cool adaptation),
Cyclomaltodextrin EC:2.4.1.19 Tinh bột enzyme bền axit (Acid-
glycosyltranssferase
Amylomaltase EC:2.4.1.25 Tinh bột, glycogen
stable) và enzyme kiềm
Maltopentaose EC:3.2.1- Tinh bột
(Alkaline)
Alpha amylase EC:3.2.1.1 Tinh bột 1.1.3. Cấu trúc và các
Oligo-1-6 -glycosidase EC:3.2.1.10 1,6α-D oligosaccharides tâm chức năng của α-
Alpha glycosidase EC:3.2.1.20 Tinh bột amylaza
Amylopullulanase EC:3.2.1.41 Pullulan
Cyclomaltodextrinase EC:3.2.1.54 Maltodextrin
Isopullulanase EC:3.2.1.57 Pullulan
Isoamylase EC:3.2.1.57 Amylopectin
Maltotetraose-forming α-amylase EC:3.2.1.60 Tinh bột
Glucodextranase EC:3.2.1.70 Tinh bột
Trehalose-6-phosphate hydrolase EC:3.2.1.93 Trehalose
Maltohexaose-forming α-amylase EC:3.2.1.98 Tinh bột
Maltogenic amylase EC:3.2.1.133 Tinh bột (a) (b)

Hình 1.1. Cấu trúc bâc 3 của alpha-amylase từ Aspergillus

Neopullulanase EC:3.2.1.135 Pullulan niger [86] (a) và từ tuyến tụy của người (b) [38]
Malto-olygosyl trehalase hydrolase EC:3.2.1.141 Trehalose
Malto-olygosyl trehalase synthase EC: 5.4.99.15 Maltose 65
II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Vật liệu
- Các chủng vi khuẩn sinh α-amylaza trong bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ vật
liệu sinh học từ suối nước nóng, từ các mẫu bùn lấy tại Công ty giấy Bãi Bằng; phân
rác - Xí nghiệp rác thải Cầu Diễn (Hà Nội); từ nước biển, nước lẫn dầu ở mỏ Bạch Hổ.
- Các vector sử dụng: Vector pCR2.1; pHV33 và pGemT của Promega.
- Chủng vi sinh vật dùng trong tách dòng và biểu hiện gen: E. coli DH5α; E. coli TOP10;
E. coli BL21; B. subtilis 168M
-Các loại hóa chất có xuất xứ từ Sigma, Merck, Invitrogen và Việt Nam.

2. Môi trường nghiên cứu: Môi trường tinh bột – khoáng; LB; MPA …

3. Phương pháp nghiên cứu

3.1. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật
- Phân lập vi khuẩn ưa nhiệt từ suối nước nóng trên môi trường khoáng;
- Tuyển chọn các chủng sinh α-amylaza;
- Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn;
- Xác định một số đặc điểm sinh lý sinh hoá
- Phân loại theo phương pháp truyền thống theo Bergey’s.
- Phân loại theo Kit chuẩn sinh hóa API 50 CHB
- Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp α-amylaza từ chủng tuyển chọn;
- Nghiên cứu tính chất của α-amylaza từ chủng LP09 và 3BT2; 66
3.2. Phương pháp sinh học phân tử
- Tách DNA theo Ausubel và cộng sự có cải tiến
- Khuếch đại gen bằng phản ứng chuỗi
- Điện di DNA trên gel agarose
- Tinh sạch sản phẩm PCR
- Xác định trình tự DNA
- Phương pháp chuyển gen α – amylase sang vectơ con thoi pHV33
-Biến nạp plasmid pHV33 mang gen α – amylase vào B. subtilis 168M

3.3. Phương pháp hóa sinh

- Xác định hoạt tính α-amylase
Một đơn vị a-amylase là lượng ezyme cần thiết để thủy phân tinh bột thành 1 μM đường
tính theo glucose ở nhiệt độ và pH tối ưu trong 1 phút
- Xác định hàm lượng protein tổng số theo phương pháp Lowry
-Điện di protein trên gel SDS

3.4. Phương pháp nuôi cấy và thu dịch enzym

3.5. Phương pháp rũ hồ vải

67
III. KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NỘI DUNG I: NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI SINH VẬT TÁI TỔ HỢP SINH ENZYME
α-AMYLASE BỀN NHIỆT
I.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp α-amylase
bền nhiệt tại Việt Nam.
I.1.1. Phân lập các chủng vi khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp α-amylase bền nhiệt
Bảng 3.4. Nhiệt độ, pH tối ưu và hoạt tính α-amylase của các chủng tuyển chọn
STT Ký hiệu chủng Hoạt tính Đặc tính α-amylase
(UI/ml) pH opt to o
C
opt,

1 BB31 4,9 6,5 75

2 BB12T 7 6,5 65
3 BB12M 3,7 5,5 65
4 BB56 9 5,0 60
5 BB65V 13 6,5 70
6 BB65T 3 7,0 65
7 BC30 11 7,0 75
8 RX1 5,6 6,5 70
9 RX2 6,2 7,0 70
10 R7C 8 6,5 65
11 SL54 16 7,0 75
12 3BT2 16,0 6,5 80
13 ML05 12,1 7,0 75
14 ML09 14,5 7,0 55
15 LP09 14,6 6,5 80
16 LP10 13,2 7,0 70 68
I.1.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc tính enzyme chủng vi khuẩn sinh
tổng hợp α-amylase bền nhiệt cao

(A) (B)
Hình 3.1. Hình thái tế bào chủng LP09(A) Chủng LP09 x 7.500; (B) Chủng LP09 x 1.500

(A) (B)
Hình 3.2. Hình thái tế bào chủng 3BT2(A) Chủng 3BT2 x 27.500; (B) Chủng 3BT2 x 6.600

69
I.1.2.3. Phân loại 2 chủng vi khuẩn ưa nhiệt LP09 và 3BT2

Bảng 3.5. Một số đặc điểm của chủng LP09 so với chủng Geobacillus sp.

Đặc điểm Chủng LP09 Geobacillus sp.

Màu sắc khuẩn lạc Trắng sữa Trắng
Bề mặt khuẩn lạc Tròn, mép vànhăn Tròn, mép và nhăn
Hình dạng tế bào Que dài, tạo búi Que dài, tạo búi
Kích thước tế bào 0,5 ÷ 0,8 x 6,0 ÷ 8,0 μm 0,5 ÷ 8,0 μm
Nhuộm Gram (+) (+)
Khả năng di động Không Không
Tạo bào tử Không Không
Sinh trưởng tối ưu (oC): 65 65
pH Phát triển tối ưu: 7,5 7,5

70
 Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hoá của chủng 3BT2
TT Các đặc điểm của VSV B. licheniformis Chủng 3BT2
ATCC 19580
1 Khuẩn lạc: Hình dạng Sần sùi, bám chặt Tròn, sù xì, mép hơi
vào thạch có răng cưa
Màu sắc Tía đỏ Tía đỏ
2 Tế bào: Hình dạng Que ngắn, mảnh Que ngắn, mảnh
Cách sắp xếp Xếp chuỗi Đơn hoặc xếp đôi
Nhuộm Gram + +
3 Sinh bào tử Oval, không phình Oval, không phình
4 Hoạt tính catalase + +
5 Hiếu khí không bắt buộc + +
6 Sinh trưởng ở: 10 oC - -
37 oC + ++
45 oC + +++
50 oC + +++
60 oC ± +
6 % NaCl + +
10 % NaCl + +
7 Phản ứng Voges-Proskauer + +
8 Khử nitrat + +
9 Thuỷ phân tinh bột + +
10 Dịch hoá gelatin + +
11 Pepton hoá sữa + ±
12 Phản ứng ADH + + 71
I.1.3. Định tên hai chủng 3BT2 và LP09 bằng trình tự 16S rARN

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm DNA Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm
của 2 chủng tuyển chọn PCR 16S rRNA của 2 chủng tuiyển
1. Chủng LP09 chọn
2. Marker 1kb 1. Chủng LP09
3. Chủng 3BT2 2. Marker 1kb
3. Chủng 3BT2

72
Hình 3.8. Cây phân loại của chủng vi khuẩn LP09
73
 0.00 01 71
gi|254305182|gb|GQ305125.1| Bacillus subtilis strain xw-2 16S ribosomal RNA gene partial sequence
0.00 017 0

0.00 01 68
gi|195360669|gb|EU882849.1| Bacillus subtilis strain F3-7 16S ribosomal RNA gene partial sequence
0.00000 8

0.00 00 00
gi|302777014|gb|HM989844.1| Bacillus amyloliquefaciens strain AG1 16S ribosomal RNA gene partial sequence

0.00 082 6 0.00 016 9 0.00 00 00

gi|273032821|gb|GU205781.1| Bacillus vallismortis strain JY3A 16S ribosomal RNA gene partial sequence

0.00 00 00
gi|150372728|dbj|AB300822.1| Bacillus amyloliquefaciens gene for 16S rRNA partial sequence strain: Y42-3
0 .0 03280
0 .0 00 16 1 0.00 00 00
gi|241898936|gb|GQ174489.1| Bacillus velezensis strain NSB-1 16S ribosomal RNA gene partial sequence

0 .0 00 92 9
0.0 11246 gi|224611835|gb|FJ687601.1| Bacillus subtilis strain BPK-17 16S ribosomal RNA gene partial sequence

-0 .0 0 002 9
gi|256265111|gb|GQ375235.1| Bacillus licheniformis strain CICC 10181 16S ribosomal RNA gene partial sequence

-0.0000 51
0.00 363 1 gi|295311573|gb|HM006901.1| Bacillus licheniformis strain Pb-WC09001 16S ribosomal RNA gene partial sequence

0.00 002 9 0.00 14 13

3BT2

0 .0 00 675
gi|189172124|gb|EU660318.1| Bacillus cereus strain CM24 16S ribosomal RNA gene partial sequence

0.00 04 87
0.015 61 3 gi|327493120|gb|GU595366.1| Bacillus sp. WB23-14 16S ribosomal RNA gene partial sequence

0.00 017 5 0.00 05 32

gi|327335405|gb|HQ336655.1| Bacillus cereus strain C4 16S ribosomal RNA gene partial sequence

Hình 3.9. Sơ đồ cây phân loại của chủng vi khuẩn 3BT2

74
 I.1.4. Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp α-amylase bền nhiệt từ 2
chủng vi khuẩn ưa nhiệt Lp09 và 3BT2

17
15.5

15
15
13
14.5
Hoạt tính, UI/ml

11

Hoạt tính, UI/ml

LP09
LP09
9 3BT2 14
3BT2

7 13.5

5
13
3
12.5
1 6 6.5 7 7.5 8
35 45 55 65 75 pH môi trường

Nhiệt độ nuôi, oC

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH môi trường lên
đến hoạt tính α-amylase men đến hoạt tính α-amylase

75
I.2. Tạo chủng tái tổ hợp mang gen α-amylase bền nhiệt
I.2.1. Tách dòng gen mã hóa α-amylase của 2 chủng vi khuẩn tuyển chọn

Bảng 3.10. Độ tương đồng giữa trình tự gen amylase của

chủng 3BT2 so với các trình tự trên ngân hàng gen
Mã đăng ký Chủng Độ tương đồng
EF125542.1 Bacillus licheniformis strain NH1 alpha- 99%
amylase gene
GQ262779.1 Bacillus licheniformis strain MSG alpha- 99%
amylase
AF438149.1 Bacillus licheniformis from Iran alpha- 98%
amylase gene
CP000002.3 Bacillus licheniformis ATCC 14580, 93%
complete genome
AE017333.1 Bacillus licheniformis DSM 13, complete 93%
Hình 3.16. Điện di genome
đồ sản phẩm PCR
gen α-amylase của
3BT2 với cặp mồi
P2BL và P3BL
76
 Bảng 3.11. Độ tương đồng giữa gen amylase của chủng
LP09 với các chủng trong ngân hàng gen

Mã đăng ký Độ tương
Chủng
đồng
Geobacillus stearothermophilus isolate
AY705090.1 99%
TISTR 329 alpha-amylase gene
Bacillus stearothermophilus alpha-amylase
M11450.1 99%
gene
M57457.1 B. stearothermophilus alpha amylase gene, 99%
Geobacillus thermoleovorans strain NP54
JQ409473.1 99%
alpha-amylase (amy) gene,
Bacillus stearothermophilus gene encoding
Y17557.1 99%
maltohexaose-producing alpha-amylase
Hình 3.17. Điện di
đồ sản phẩm PCR
gen α – amylase
của chủng LP09

77
I.2.2. Tách promoter của gen α-amylase từ chủng chủ B. subtilis 168M

Hình 3.19. Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR đoạn gen chứa promoter
của chủng B. subtillis168M với megarprimer PK1
(1)- Thang ADN chuẩn 100 bp;
(2)- Sản phẩm PCR promoter cho gen amylase của chủng Bacillus
subtillis 168M với cặp mồi P1BS và PK1

Trình tự promoter của chủng chủ 168M với cặp mồi P1BS và PK1
TTGATTTGTATTCACTCTGCCAAGTTGTTTTGATAGAGTGATTG
TGATAATTTTAAATGTAAGCGTTAACAAAATTCTCCAGTCTTCA
CATCGGTTTGAAAGGAGGAGGCGGAAGAATGAAGTAAGAGGGAT
TTTTGACTCCGAAGTAAGTCTTCAAAAAATCAAATAAGGAGTGT
CAAGAATGAAACAACAAAAACGGCT

Hình 3.20. Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR đoạn gen chứa promoter
của chủng B. subtillis168M với megarprimer PK2
(1)- Thang ADN chuẩn 1 kb;
(2)- sản phẩm PCR promoter cho gen amylase của chủng Bacillus
subtillis 168M với cặp mồi P1BS và PK2
Trình tự promoter của chủng chủ 168M với cặp mồi P1BS và PK2

TTGATTTGTATTCACTCTGCCAAGTTGTTTTGATAGAGTGATTG
TGATAATTTTAAATGTAAGCGTTAACAAAATTCTCCAGTCTTCA
CATCGGTTTGAAAGGAGGAGGCGGAAGAATGAAGTAAGAGGGAT
TTTTGACTCCGAAGTAAGTCTTCAAAAAATCAAATAAGGAGTGT
CAAGAGTGCTAACGTTTCACCGCATC

78
I.2.3. Tạo 2 chủng tái tổ hợp mang gen sinh α-amylase của 2 chủng tuyển chọn
I.2.3.1. Tái tổ hợp gen α-amylase của từng chủng tuyển chọn với promotor của gen α-
amylase từ chủng B. subtilis 168M
P1Bs Bspr ATG P2Bl
BlAmy
ADN - Bs ADN – 3BT2
PK ATG
P3Bl

PCR1a PCR1b
P1Bs Bspr ATG
BlAmy

ATG E E
P3Bl
PCR2
T T
Bspr ATG BlAmy
A
A
pCR 2.1

T4ADN-lygaza

[pCR 2.1
Biến nạp vào
BlAmy.Bspr] E
E. coli

79
1 2 3
Hình 3.22. Sản phẩm PCR của tổ
hợp gen α-amylase của chủng 3BT2
và promotor của chủng 168M bằng
phương pháp Megaprimer
1: Marker 1kb;
2: Sản phẩm PCR;

3: marker 100bp

1 2 Hình 3.23. Điện di đồ

sản phẩm PCR tổ hợp
giữa gen α-amylase của
chủng LP09 và promotor
của chủng 168M bằng
AmyGeoBsP phương pháp
Megaprimer
1.5k
b Hình 1: sản phẩm PCR;
3.7. 2: marker 1kb
Sản
phẩm
PCR
của tổ
hợp
gen α- 80
 I.2.3.2. Tái tổ hợp gen α-amylase bền nhiệt với promoter vào vectơ biểu hiện

Bảng 3.13. Hoạt tính amylase một số dòng của chủng tái tổ hợp
gen Bs168M[pHV33BLAmyBspr]

STT Kí hiệu chủng Hoạt tính (IU/ml)

1 Bs168M[pHV33BlAmyBspr] – 1 kxđ
2 Bs168M[pHV33BlAmyBspr] – 2 78,4
3 Bs168M[pHV33BlAmyBspr] – 3 46,1
4 Bs168M[pHV33BlAmyBspr] – 4 51,3
5 Bs168M[pHV33BlAmyBspr] – 5 67,8

Hình 3.24. Hoạt tính α- 6 Bs168M[pHV33BlAmyBspr] – 6 71,3

amylase của chủng tái tổ 7 Bs168M[pHV33BlAmyBspr] – 7 kxđ
hợp gen 8 Bs168M[pHV33BlAmyBspr] – 8 74,7
Bs168M[pHV33BlAmyBspr] 9 Bs168M[pHV33BlAmyBspr] – 9 kxđ
10 Bs168M[pHV33BlAmyBspr] – 10 75,5
11 Chủng B. subtilis 168M+pHV33 7,1

81
 Hình 3.26. Hoạt tính amylase
một số dòng của chủng tái tổ
hợp gen
Bs168M[pHV33LPAmyBspr]

Bảng 3.13. Hoạt tính amylase một số dòng của

chủng tái tổ hợp gen Bs168M[pHV33LPAmyBspr]

STT Kí hiệu chủng Hoạt tính (IU/ml)

1 Bs168M[pHV33LPAmyBspr] – 1 47,4
2 Bs168M[pHV33LPAmyBspr] – 2 61,3
3 Bs168M[pHV33LPAmyBspr] – 3 45,7
4 Bs168M[pHV33LPAmyBspr] – 4 42,3
5 Bs168M[pHV33LPAmyBspr] – 5 65,7
6 Bs168M[pHV33LPAmyBspr] – 6 72,5
7 Bs168M[pHV33LPAmyBspr] – 7 26,1
8 Bs168M[pHV33LPAmyBspr] – 8 73,4
9 Bs168M[pHV33LPAmyBspr] – 9 71,2
10 Bs168M[pHV33LPAmyBspr] – 10 68,4
11 Chủng B. subtilis 168M+pHV33 7,1
 2 1

Hình 3.25. Điện di đồ Hình 3.27. Điện di đồ

plasmid từ dòng B. plasmid
subtilis tái tổ hợp cắt [pHV33LPAmyBspr]
bằng EcoRI cắt
1: Plasmid bằng EcoRI
[pHV33BlAmyBspr] 1: Marker 100bp -
2: Plasmid BioLab
[pHV33BlAmyBspr] + 2: Plasmid
EcoRI [pHV33LPAmyBspr]
3: Marker + EcoRI

Để thuận tiện cho việc xử lý kết quả nghiên cứu tiếp theo, chủng tái tổ hợp
Bs168M[pHV33LPAmyBspr] mang gen α-amylase của chủng 3BT2 và chủng tái
tổ hợp Bs168M[pHV33LPAmyBspr] mang gen α-amylase của chủng LP09 được
ký hiệu là Bs168M1 và Bs168M2

83
I.1.2.3. Biểu hiện gen α- amylase của chủng B. subtilis 168M tái tổ hợp
a/ Ảnh hưởng của tryptophan lên sinh tổng hợp α-amylase của hai chủng tái tổ hợp
Nồng độ Trp. thích hợp điều hòa biểu hiện gen α-amylase ở chủng tái tổ hợp là 0,8 g/lít.

b/ Ảnh hưởng của nguồn cơ chất biểu hiện α-amylase của hai chủng tái tổ hợp
Trên môi trường có glucose, chủng tái tổ hợp biểu hiện gen tốt nhất, hoạt tính α-amylase
chủng BS168M1 đạt 79,9 UI/ml, chủng BS168M2 đạt 76,1 UI/ml sau 48 h nuôi cấy.

c/ Ảnh hưởng nồng độ glucose lên sinh tổng hợp α-amylase của hai chủng tái tổ hợp
nồng độ glucose thích hợp để điều hòa biểu hiện gen α-amylase ở chủng tái tổ hợp là 6,5 (g/l).

d/ Ảnh hưởng nồng độ photphat lên sinh tổng hợp α-amylase của hai chủng tái tổ
hợp
nồng độ photphat thích hợp để điều hòa biểu hiện gen của chủng tái tổ hợp là (g/l): K2HPO4
0,5; KH2PO4 0,5; (NH4)3PO4 0,8.

Các kết quả trên cho thấy môi trường thích hợp để thu nhận α-amylase của chủng tái tổ hợp là
môi trường LB có bổ sung (g/l): glucose 6,5; K2HPO4 0,5; KH2PO4 0,5; (NH4)3PO4 0,8.

84
I.2.4. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện gen  - amylase của hai chủng tái tổ hợp
I.2.4.1. Tối ưu chủng 168M2 theo Box- Wilson
Phương trình hồi quy với hàm mục tiêu là hoạt tính α-amylase của chủng tái tổ hợp:
y= 89,35 + 4,95x1 + 9,83x2 + 6,23x3

TT X1 (glucose g/l)) X2 (MT LB) X3 (photphat) Y (Hoạt tính Đv/ml)

1 6.5 0.75 75,0 88,1
2 6.53 0.775 77,5 91,3
3 6,56 0.80 80,0 105,2
4 6,59 0.825 82,5 103,8
5 6,62 0.85 85,0 125,3
6 6,65 0.875 87,5 102,1
7 6,68 0.90 90,0 97,9

Môi trường tối ưu: LBx0.85 có bổ sung 6,60g Glucose, 85ml/l dung dịch photphat
gốc. Hoạt tính amylase là 125,3 UI/ml

85
I.2.4.2. Tối ưu theo phương pháp đáp ứng bề mặt

Kí Mức
Biến số Đơn vị
hiệu -α -1 0 +1 +α
LB A % 75 80 100 120 125
tryptophan B g/l 0.35 0.4 0.6 0.8 0.85
Glucose C g/l 3.36 4 6.5 9 9.64

Hình 3.28. Ảnh hưởng của các yếu tố trong Hình 3.29. Ảnh hưởng của các yếu tố
mô hình tối ưu cho sinh trưởng của chủng trong mô hình tối ưu cho sinh tổng hợp
BS 168M1 hoat tính α- amylase của chủng BS
168M1 86
 Hình 3.31. Ảnh hưởng của từng cặp
các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp
α-amylase của chủng BS 168M1

Phương trình tối ưu:

YOD(600) = -5.65016 + 5.60753*LB + 0.99613*tryp. + 1.00898* glucose - 1.86250*LB*tryp. -
0.23700*LB*glucose - 0.19600*tryp.* glucose - 0.98876*LB2 + 1.46733*tryp.2 -
0.034014*glucose2
Yhoạt tính = +425.25868 - 513.13656*LB +206.94602*tryp -12.55360* glucose -
200.81015*LB*tryp.-30.41201*LB*glucose+5.93955*tryp.*glucose +355.78299*LB2 87
+0.70427*tryp.2 +1.87428*glucose2
Cuối cùng tìm được vùng tối ưu của tất cả các yếu tố ảnh hưởng, gồm 39 phương
án (Phụ lục 5) trong đó phương án để sinh tổng hợp α-amylase cao nhất là
phương án 6, bao gồm 80% LB, tryp. 0.8g/l, glucose 4g/l. Hoạt tính đạt được theo
mô hình tối ưu là 181IU/ml, tăng gấp 4 lần so với trước khi tối ưu.

Bảng 3.24. Sự tương thích của mô hình với kết quả thực nghiệm

Số LB Tryptophan Glucose Hoạt độ lý thuyết Hoạt độ thực

TT (%) (g/l) (g/l) (IU/ml) tế (IU/ml)
1 0.80 0.80 9.00 142.6 140
2 1.20 0.80 4.00 147.9 145
3 0.80 0.40 4.00 153.0 150
4 0.80 0.80 4.00 181.4 190
5 1.20 0.40 4.00 151.6 150
6 1.00 0.71 5.26 120.5 120
7 0.90 0.75 4.53 149.8 151

88
NỘI DUNG 2.
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME α-amylase BỀN
NHIỆT
II.1. Nghiên cứu điều kiện lên men chủng tái tổ hợp sinh α-amylase bền nhiệt
ở quy mô phòng thí nghiệm
II.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tổng hợp α-amylase của chủng tái tổ hợp

180 140

160 120

140
100

Hoạt tính enzym, UI/ml

Hoạt tính enzym, UI/ml

120
80 30 C
100 30 C 37 C
37 C 60 45 C
80 45 C
40
60

40 20

20 0
20 40 60 80
0
Thời gian, h
20 40 60 80
Thời gian, h

Hình 3.32. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên Hình 3.33. Ảnh hưởng của nhiệt
sinh tổng hợp α-amylase của chủng độ lên sinh tổng hợp α-amylase
Bs168M1 của chủng Bs168M2

89
 II.1.2. Động thái lên men của hai chủng tái tổ hợp
180 2.5

160

2
140

120
Alpha-amylaza, UI/ml

1.5
100 Alpha-amylaza
Độ bền Plazmit, %
80 OD
1
60

40
0.5

20
Hình 3.34. Động thái sinh
0 0
trưởng (OD620nm) và tổng
10 20 30 40 50 60
Thời gian, h
70 80 90 100
hợp α-amylase của
chủng Bs168M1 (a) và
160 2.5
Bs168M2 (b)
140

2
120
A lpha -a m y la za , U I/m l

100
1.5
Alpha-amylaza
80 Độ bền Plazmit, %
OD
1
60

40
0.5

20

0 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Thời gian, h

90
II.2. Nghiên cứu công nghệ tách tinh chế và thu chế phẩm enzyme α-amylase
bền nhiệt tái tổ hợp trong phòng thí nghiệm

II.2.1. Tách và làm sạch α-amylase từ chủng tái tổ hợp bằng dung môi
II.2.2. Xác định thời gian xử lý nhiệt để làm sạch α-amylase
II.2.3. Kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di trên gel SDS-PAGE
II.2.4. Tinh sạch bằng (NH4)2SO4

Hình 3.35. Điện di đồ protein trên gel

SDS-PAGE các phân đoạn kết tủa
enzyme bằng dung môi hữu cơ
A. dịch enzyme thô
B. sau xử lý ở 70oC 2h
C. tủa bằng 40%
D. tủa bằng 60%
E. tủa bằng 70%

91
II.3. Nghiên cứu thu hồi enzyme trên hệ thống màng lọc protein

0,5 L

Màng siêu lọc

ultrafilter

Màng20kDa Màng 8KDa

400 ml
Hình 3.36. Quy trìnhvà dịch thải
thiết bị tinh chế alpha- 50 ml dịch thải
amylase tái tổ hợp trong
phòng thí nghiệm bằng
công nghệ màng 50 ml α-amylase tái tổ hợp
 

92
Bảng 3.27. Phân đoạn tinh chế dịch α-amylase tái tổ hợp bằng công nghệ màng lọc

Thể tích Protein tổng α-amylase tổng Hoạt tính riêng

Phân đoạn
(ml) (mg) (IU) (IU/mg)
Dịch lên men 500 443,55 92500 208,54
Dịch trước màng 20kDa 50 101,38 19224 189,62
Dịch sau màng 20kDa 450 197,41 73276 371,19
Dịch trước màng 8kDa 50 60,78 73232 1204,87
Dịch lọc qua màng 8kDa 400 83,98 44 0,52

kDa Hình 3.37. Điên di đồ SDS-

58 PAGE của các phân đoạn sử

50
dụng mang lọc: (B) gel hoạt tính
có bổ chứa 1% tinh bột tan; (A)
gel kích thước; (1) Dịch lên
men; (2) dịch còn lại sau khi lọc
bằng màng 20kDa; (3) Dịch còn
lại sau khi lọc bằng màng 8kDa
(M) marker

M A3 B1 B2 B3
93
 II.6. Nghiên cứu Quy trình công nghệ sinh tổng hợp enzyme bền nhiệt từ 2
chủng tái tổ hợp ở quy mô thử nghiệm (5-7 lít)
II.6.1. Lên men sinh tổng hợp -amylase bền nhiệt từ chủng Bs
168M[pHV33BlAmyBspr] VÀ Bs168M[pHV33LPAmyBspr]

160 2.5
180 2.5

160 140

2 2
140 120

120
Alpha-amylaza, UI/ml
Alpha-amylaza, UI/ml

100
1.5 1.5
100 Alpha-amylaza Alpha-amylaza
Độ bền Plazmit, % 80 Độ bền Plazmit, %
80 OD OD
1 1
60
60

40
40
0.5 0.5

20 20

0 0
0 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
94
Thời gian, h Thời gian, h
II.7. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm α-amylase bền nhiệt ở quy mô 70 lít/mẻ
II.7.1. Lên men sinh tổng hợp  - amylase bền nhiệt từ chủng Bs 168M1 và Bs168M2

160 2.5

140

2
120

A lpha-am y laza, U I/m l

100
1.5
Alpha-amylaza
80 Độ bền Plazmit, %
OD
1
60

40
0.5

20

0 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Thời gian, h

180 2.5

160
máy lọc tiếp tuyến Pilotscale
2
140
4
4 120
Alpha-amylaza, UI/ml

1.5
100 Alpha-amylaza
Độ bền Plazmit, %
80 OD
1
60

40
0.5

20

0 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Màng Pellicon  100 KDa -   4
5 4 Thời gian, h
Màng Pellicon 10 KDa- 5 95
II.7.2. Quy trình công nghệ thu nhận enzyme từ 2 chủng tái tổ hợp ở quy mô 70L

BS168M1 hoặc Bs168M2

Hoạt hóa chủng (LBPG, Nhân giống cấp 1

30 oC, 24 h)

Nhân giống lớn 5 lít Nhân giống cấp 2

(LBPG, 30 oC, 24 h)

Lên men sinh tổng hợp

enzym 70 lít, 30 oC, 72 giờ

Sinh khối Tách sinh khối (130 -150

UI/ml)

Dịch thải Cô đặc dịch enzym (màng Đệm rửa acetate

cô Pellicon XL)

Chế phẩm enzyme (1.000 Kiểm tra hoạt độ enzym

UI/ml) 96
II.8. Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm α-amylase bền nhiệt
Dịch enzyme thô của
chủng
BS168M1 hoặc BS168M2

Ổn định hoạt tính và độ bền CaCl2

Xử lý nhiệt (70C, 1-2 h) Hình 3.5 Quy trình

bảo quản chế phẩm
Dịch trước Cô đặc dịch enzyme (bằng lọc dòng Dịch sau
enzyme α-amylaza
màng ngang sử dụng màng lọc 20KDa và 8KDa) màng 8KDa tái tổ hợp bền nhiệt
20KDa

Thu dịch enzyme cô đặc (dịch sau

màng 20KDa và trước màng 8KDa)

Glycero Tạo dịch enzyme có Tạo dịch enzyme có

NaCl,
l chứa 10% glycerol chứa 14% NaCl, 30% sucrose,
sucrose, 10% glycerol, glycerol, Na-
1%Na-benzoate benzoate

Sản phẩm
enzyme bảo
quản ở - Sản phẩm
20C enzyme bảo
quản ở 4- 97
20C
NỘI DUNG 3: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SỬ DỤNG CHẾ PHẨM
ENZYME α-AMYLASE BỀN NHIỆT TRONG RŨ HỒ VẢI
III.1. Khảo sát các điều kiện sử dụng enzyme α-amylase bền nhiệt tái tổ hợp rũ
hồ vải quy mô phòng thí nghiệm
III.2. Sử dụng enzyme α-amylase bền nhiệt tái tổ hợp trong quá trình rũ hồ vải
ở quy mô sản xuất thử nghiệm (100 kg vải/mẻ)

Bảng 3.38. Trọng lượng vải và tỷ lệ rũ hồ của enzyme sử dụng

K/lượng sau Tỷ lệ hồ còn lại
Quy trình STT mẫu rũ hồ (g/m2) trên vải (%
TLV)
Rũ hồ theo CA Wash 125 137 0,20
phương pháp
cuộn ủ -amylase TTH 136 0,15
Rũ hồ theo CA Wash 125 136,2 0,15
phương pháp tận
trích -amylase TTH 135,5 0,10

98
III.3. Sử dụng enzyme α-amylase bền nhiệt tái tổ hợp trong quá trình rũ hồ vải ở
quy mô sản xuất (1.000-2.000 kg vải/mẻ)
QTCN Thông số kỹ thuật Đơn vị Amylase TTH CA Wash 125
Số miệng lửa số 2 2
Vận tốc m/p 70 70
Bể hóa chất
Đốt
Enzyme g/l 5 5
Ngấm
Mescour EX g/l 2 2
P ép kg/cm2 1,6 1,6
Thời gian ủ giờ 5 5
P ép kg/cm2 1 1
Vận tốc m/p 30 30
Giặt Thời gian ủ phút 15 15
LBOX o
I Nhiệt độ LBOX I C 30 30
o
Nhiệt độ bể 1;2;3 C 85;80;75 85;80;75
o
Nhiệt độ bể 4;5;6 C 85;80;75 85;80;75
P ép kg/cm2 1 1
Vận tốc m/p 30 30
Giặt Thời gian ủ phút 15 15
LBOX o
II Nhiệt độ LBOX II C 30 30
o
Nhiệt độ bể 1 C 80 80
o
Nhiệt độ bể 4;5;6 C 85;80;75 85;80;75 99
 Vải mộc

Đốt lông qua miệng lửa

Vải đi qua bể enzyme và hóa Enzyme và

chất (70-80C) hóa chất

Cuộn lô ép, ủ (70C, 6 giờ)

Giặt vải lần I

Hình 1.1 Quy
trình ứng dụng
Tẩy vải chế phẩm
enzyme α-
Giặt vải lần II và sấy
amylaza để rũ
hồ vải
Quy trình STT mẫu K/lượng sau rũ hồ Hàm lượng hồ
Vải thành phẩm (g/m2) còn lại (%)
Vải mộc → Bỏ CA Wash 125 137,2 0,15
khâu → Đốt,
Kiểm tra chất lượng vải ngấm enzyme -amylase tái
nấu tẩy, ủ → 135,5 0,10
tổ hợp
Giặt → Sấy
NỘI DUNG 4. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KINH TẾ
IV.1. Phân tích chất lượng sản phẩm vải được rũ hồ (độ trắng, bền cơ học ...)
Bảng 3.41. Các chỉ tiêu chất lượng của vải mộc 3034 sau rũ hồ

Phương pháp
Chỉ tiêu CA Wash 125 -amylase TTH
thử

Khối lượng vải sau rũ

IS O 3 8 0 1 -7 7 138 137
hồ (g/m2)

0,20 0,15

Hàm lượng hồ còn lại

(%)

Độ bền đứt băng vải D = 326,30 D = 326,30

mộc (N) N = 174,12 N = 174,12
IS O
1 3 9 3 4 (1 )-9 9 D= 287,14 D= 293,67
Độ bền đứt băng vải sau
rũ hồ (N) N = 156,48 N = 156,70 101
IV.3. Đánh giá hiệu quả kinh tế sản xuất chế phẩm α-amylase bền nhiệt tái tổ
hợp từ chủng Bacillus subtilis 168M
Bảng tổng hợp chi phí cho sản xuất 50 lít chế phẩm
Hóa chất làm môi trường (làm tròn) 407.600
Hóa chất thu hồi bảo quản chế phẩm 30.000
Vật tư tiêu hao 15.000
Điện nước năng lượng 50.000
Nhân công 150.000
Tổng chi phí sản xuất 50 lít chế phẩm 652.600

Sản phẩm thu được: 50 lit x 85% tỷ lệ hao hụt khi thu hồi = 42.5
Chi phí sản xuất 1 lít (tương đương 1kg): 652.600/42,5 = 15.355 đồng/lit hoạt tính
150UI/ml
Chi phí khác 30% (quản lý chung, kho bảo quản, bao bì, bán hàng, vận chuyển): 15.355x
30% = 4.605đồng/lit
Khấu hao nhà xưởng, thiết bị và công nghệ ước tính 25% giá thành cho 3 năm đầu: (15.355 +
4.605) x 35% = 5.390 (làm tròn) đồng/lít;
Giá thành sản phẩm trước thuế: 15.355 + 4.605+ 5.390 = 25.350 đồng/lít
Giá thành sản phẩm hiện tại công ty mua của Trung Quốc (100 UI/ml) là 30.000 đồng/ lít
Như vậy lãi trước thuế của sản phẩm là 4.650 đồng/lit
102