ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.

HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

CÁC PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH
CẤU PHẦN CỦA PROTEIN

GVHD:TS. Phan Ngọc Hòa

Người trình bày: Đoàn Thị Phương Dung
GIỚI THIỆU VỀ
PROTEIN
 PROTEIN TRONG THỰC PHẨM

• Là thành phần có nhiều trong tất cả các tế bào

• Chức năng: dự trữ, nhiều chức năng sinh học quan trọng, tạo cấu trúc tế bào

• Cấu tạo: đại phân tử cấu tạo từ các a.a liên kết nhau tạo chuỗi polypeptide, gồm 4 bậc

• Các nguyên tố có trong Pr gồm: C,H,O,N,P,S…N thay đổi hàm lượng nhiều nhất (13,4-

19,1%)
• KLPT lớn: 5.000 đến > 1tr Dalton  dễ tạo thành dịch keo khi hòa tan

• Các phân tử keo không qua màng bán thấm  tinh sạch protein  sản xuất SP giàu Pr

như đậu hủ, phô mai…

• Tinh sạch Pr  P dạng keo  dạng kết tủa Pr hay Pr biến tính

• Phân tích Pr là quy trình phức tạp

VAI TRÒ CỦA VIỆC PHÂN TÍCH PROTEIN

• Khai báo giá trị dinh dưỡng trên nhãn hàng

• Khảo sát các tính chất chức năng đặc biệt của Pr trong thực phẩm
• Xác định hoạt tính sinh học (trong NCKH thực phẩm và dinh dưỡng học)
• Giúp nhà sản xuất đánh giá sự đồng đều của lô hàng
 CÁC PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH CẤU PHẦN PROTEIN
NGUYÊN TẮC CHUNG

1. Xác định : 2. Yếu tố lưa chọn PP phân tích:

- Hàm lượng nguyên tố N - Độ nhạy
- Liên kết peptid - Độ đúng
- Axit amin thơm - Độ chính xác
- Khả năng nhuộm màu - Thời gian và chi phí phân tích
- Độ hấp thụ tử ngoại
- Các đặc điểm của vật liệu phân tích
- Tính chất khuếch tán ánh sáng
 1. Phương pháp Kjeldahl

NGUYÊN TẮC CƠ BẢN

 Dùng để định lượng Nitơ tổng
QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN
 Vô cơ hóa mẫu thực phẩm bằng H2SO4 (hoặc H2O2) Bước 1: Phân hủy mẫu 
đậm đặc, t0 cao với chất xúc tác để tạo muối - RCH(NH2)COOH + H2SO4 đđ → CO2 + SO2 + NH3 + H2O
- NH3 + H2SO4đđ → (NH4)2SO4
(NH4)2SO4
 Chất xúc tác phản ứng là K2SO4 và CuSO4
 Dùng kiềm mạnh NaOH/KOH để đẩy NH 3 ra khỏi
Bước 2: Chưng cất đạm 
muối (NH4)2SO4.
- NaOH + (NH4)2SO4→ Na2SO4 + NH3 + H2O
 NH3 bay ra cùng nước vào bình hứng, có chứa sẵn
- 2NH3 + H2SO4 dư → (NH4)2SO4
một lượng dư H 2SO4.
Bước 3: Chuẩn độ
 Định phân lượng H 2SO4 dư bằng dd NaOH - Bằng dd NaOH 0.1N
 Chuẩn độ: xác định được lượng H 2SO4 đã phản ứng
1. Phương pháp Kjeldahl

DỤNG CỤ
- Bình chứa mẫu đốt
- Bình rửa
- bình phản ứng
- ống sinh hàn
- Phễu thủy tinh
- bình hứng NH3
- đèn đốt
- Gía đỡ
- Máy nghiền cơ học hoặc cối
- Rây
 1. Phương pháp Kjeldahl

Thực phẩm Hệ số chuyển đổi

CÁCH TÍNH KẾT QUẢ
Trứng, thịt 6.25
HL Pr thô = 0,0014 x (VH2SO4 – V’H2SO4) x 100 x 6,25
Sản phẩm chế biến từ sữa 6.38
NGUYÊN TẮC CƠ BẢN
Trong đó:
Lúa mì 5.70
• 0,0014: lượng nitơ (g) tương đương với 1ml HCl 0.1N
• V : dung dịch H2SO4 dùng cho mẫu trắng (ml) Các loại ngũ cốc khác, hạt có dầu 6.25
• V’ : dung dịch H2SO4 dùng cho mẫu thử (ml)
• m: khối lượng của mẫu thử (g) Hạnh nhân 5.18

• 6.25 là hệ số chuyển đổi

Đậu phụng, đậu Braxin 5.46

Các loại đậu khác, dừa 5.30

 2. Phương pháp Dumas

NGUYÊN TẮC CƠ BẢN

• Mẫu được đốt cháy hoàn toàn bằng khí O2 tinh khiết ở nhiệt độ khoảng

950oC

• Hỗn hợp khí sau quá trình đốt cháy chủ yếu là CO2, H2O, O2, NOx và N2…

• Hỗn hợp khí được cho qua Cu và CuO nóng đỏ.

• Các oxit của nitơ bị Cu phân huỷ thành N và O 2, đồng thời O2 này cùng với

O2 nằm trong các khí đốt tạo với Cu thành CuO

• Hợp chất CO khi gặp CuO sẽ bị oxy hoá thành CO2 trước khi hấp phụ vào

dd kiềm chỉ còn lại khí N thoát ra.

• Đo lượng khí N thoát ra bằng nitơ kế sẽ tính toán được hàm lượng Pr có
2. Phương pháp Dumas
THIẾT BỊ - DỤNG CỤ
• Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,0001 g.
• Máy nghiền phòng thử nghiệm, thích hợp để nghiền mẫu.
• Sàng thử nghiệm, có cỡ lỗ 0,800 mm hoặc 1 mm làm bằng
vật liệu không chứa sắt.
• Chén nung (ví dụ, bằng thép không gỉ, thạch anh, gốm
hoặc platin) hoặc ống thiếc, thích hợp để sử dụng cho
thiết bị Dumas.
• Thiết bị Dumas, kèm một lò nung có thể duy trì được
nhiệt độ bằng hoặc lớn hơn 850 0C, có detector dẫn nhiệt
và có thiết bị thích hợp để tích phân tín hiệu.
• Có thể sử dụng các loại thiết bị Dumas có bán sẵn trên thị
trường
2. Phương pháp Dumas

NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG

03 bước của phương pháp Dumas:
• Đốt: Mẫu được cân chính xác và thanh lọc để loại bỏ khí N. Được đốt tại
nhiệt độ cao với sự tham gia của O2 nguyên chất tại 10000C, tạo ra các khí
như: Carbon dioxide, nước, nito oxit.
Mẫu + O2  CO2 + H2O + O2 + NxOy + Oxit khác
• Loại bỏ và khử Oxy: Sản phẩm cháy đượ đi qua buồng chứa đồng CU
nóng 650 độ C chuyển đổi các Oxit Nito thành Phân tử N2. Các khí còn lại
được hấp thụ hết qua các bộ hấp thụ.
CO2  +  H20 + NxOy + O2 + Cu →  CO2  +  H20 + N2 → N2
• Đo lường: tín hiệu đo lường từ bộ cảm biến TCD theo nguyên lý dẫn điện.
 3. Phương pháp Biuret

NGUYÊN TẮC CƠ BẢN

•Trong môi trường kiềm, Cu2+có khả năng tạo
phức với các liên kết peptid sẽ tạo phức có màu
tím hồng.
•Độ hấp thu đo ở bước sóng 540 nm.
•Xác định hàm lượng protein có trong mẫu bằng
phương pháp đường chuẩn.
•Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng để
xác định hàm lượng protein vì phản ứng này là
Phản ứng xảy ra trong phương pháp Biuret.
phản ứng đặc trưng của liên kết peptit.
3. Phương pháp Biuret

DỤNG CỤ:
- Ống nghiệm 10ml
- Dung dịch CuSO4, NaOH, Tartrat Kali
Natri
Phản ứng xảy ra trong phương pháp Biuret.
- Thuốc thử Biuret
- pipet 1ml
- bình định mức
- máy so màu

KẾT QUẢ PHẢN ỨNG BIURET

Theo định luật Beer–Lambert, độ đậm của màu
tím cũng như khả năng hấp thụ ánh sáng tại
bước sóng 540 nm tỉ lệ thuận với nồng độ
protein.
 4. Phương pháp Lowry

NGUYÊN TẮC CƠ BẢN DỤNG CỤ

•Dựa trên phản ứng Biuret với các bước bổ sung và thuốc thử để tăng độ
• Thuốc thử Folin
nhạy
• dd CuSO4
•Lowry thêm dd Folin-Ciocalteau (phosphomolybdic/ phosphotungstic acid)
• bình định mức
với các gốc tyrosine và tryptophan của phân tử Pr để tạo ra màu xanh lam có
• pipet 1ml
thể được phát hiện ở bước sóng 650 - 750 nm.
• ống nghiệm 10ml
•Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ Pr trong một
phạm vi nhất định (5 – 100 µg) • Máy so màu

•Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của Pr chuẩn  xác định hàm lượng Pr
•Mẫu Pr sau khi phản ứng với thuốc nhuôm thì không thể bổ sung cho các thử
nghiệm khác
•PP này áp dụng cho mẫu Pr có chứa tyrosine và trytophan
4. Phương pháp Lowry

Phản ứng xảy ra trong phương pháp Lowry

 5. Phương pháp BCA (Axit Bicinchoninic)

NGUYÊN TẮC CƠ BẢN

•Dựa trên phản ứng Biuret trong điều kiện kiềm
•Protein khử ion đồng (II) thành ion đồng (I) trong môi
trường kiềm. Phức tạo ra giữa ion đồng (I) và dung dịch cơ
chất BCA màu xanh táo sẽ có màu hồng nhạt.
•Bước sóng phát hiện là 562nm
•Thuốc thử BCA sẽ liên kết với cysteine, tryptophan,
tyrosine, peptid
•Cường độ màu tạo ra sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ protein.
•Sử dụng cho Pr đã được tinh sạch
•Phạm vi phát hiện Pr là 0.2 – 50 µg
5. Phương pháp BCA
 6. Phương pháp Bradford

NGUYÊN TẮC CƠ BẢN

•Sử dụng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein.
•Màu thuốc đổi từ đỏ nhạt đến xanh nhạt.
•Bước sóng hấp thụ cực đại từ 465 - 595nm
•Sự thay đổi mật độ quang ở bước sóng 595nm tỷ lệ thuận với nồng độ
protein có trong mẫu
•Hiệu quả nhuộm màu tăng lên do tương tác kỵ nước giữa phân tử phẩm
nhuộm với bộ khung polypeptit kề bên các gốc tích điện dương của protein.
•Phẩm nhuộm sau khi bám vào protein sẽ thay đổi phổ hấp thụ so với lúc
chưa liên kết.
•Phạm vi phát hiện Pr là 0.2 – 20µg
6. Phương pháp Bradford
 7. Phương pháp quang phổ UV

NGUYÊN TẮC CƠ BẢN

•Pr hấp thụ bức xạ UV mạnh ở bước sóng 280 nm, do các gốc
a.a có vòng thơm tryptophan và tyrosine của phân tử Pr hấp thụ
ánh sáng.
Cơ chế hoạt động
•Phương pháp tuân theo định luật Beer Lambert.
•Vì mỗi Pr có thành phần axit amin có chứa số vòng thơm khác
nhau nên cần xác định độ hấp thụ phân tử cho từng loại protein.
•Không làm mất đi thành phần Pr
•Phạm vi phát hiện Pr là 20 – 300µg/ml
•Chỉ dùng xác Pr có trong sữa và các sản phẩm thịt

Máy đo quang phổ UV -VIS

 8. Phương pháp chuẩn độ Formol (PP Sorensen)

DỤNG CỤ
NGUYÊN TẮC CƠ BẢN
Máy lắc 3 erlen 100mL
•Thêm một lượng dư formol trung tính vào dung dịch axit Máy khuấy từ, cá từ 1 burette 25mL
Máy đo pH 2 becher 100mL
amin, lúc này formol sẽ đẩy H+ ra khỏi – NH3+ và phản ứng với
Bình định mức 100mL Ống nhỏ giọt
nhóm – NH2 tạo thành dẫn xuất methyl hóa. 1 pipet 1mL  
1 pipet 20mL
•Axit amin mất đi tính bazo và chỉ còn tính axit do chỉ còn lại
nhóm – COOH tự do.
•Định lượng các nhóm cacboxyl của chúng bằng dung dịch
kiềm tiêu chuẩn NaOH 0.1N
•Số nhóm –COOH tự do = nhóm a.a liên kết formoldehit
•Tính được lượng axit amin có trong dung dịch
 8. Phương pháp chuẩn độ Formol (PP Sorensen)

QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN TÍNH KẾT QUẢ

•Cho vào bình nón 20ml mẫu + 0.5ml dd phenolphtalein 1% • Đối với sản phẩm đặc (khô hay ướt): (%)
•Cho tiếp từng giọt NaOH 0.1N  dd có màu vàng nhạt X = (V.0,0028.100.Vo)/(G.V’)
•Thêm 20ml dd formaldehit 30% vào bình nón, lắc đều  dd • Đối với sản phẩm lỏng: (g/l)
sẽ mất màu trong 5 phút X= (V.0,0028.100.Vo)/(Vm.V’)

•Chuẩn độ bằng NaOH 0.1N cho đến khi có màu vàng nhạt Trong đó:      V: Số ml NaOH 0,2N tiêu tốn để
chuẩn độ
(pH=9) 0,0028: Lượng nito tương ứng với 1ml
NaOH 0,2N (g)
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Văn Mùi, 2007, Thực hành hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội.
2. Giáo trình phân tích thực phẩm – công nghệ thực phẩm, Trường Đại học công nghiệp TP.HCM
3. Lê Thị Mùi, 2009, Kiểm nghiệm và phân tích thực phẩm, trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng
4. TCVN 8133-1 : 2009 – Xác định nitơ tổng số bằng phương pháp Dumas
5. TCVN 10034:2013 – Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, hướng dẫn xác định hàm lượng nitơ bằng phương pháp
Kjeldahl