KROMATOGRAFİ

1
 Kromatografi kantitatif ayırma teknikleri
içinde en populer yöntemlerden biridir.

 Kromatografi öncelikle bir ayırma

yöntemidir. Ancak sistem çıkışına uygun bir
dedektör eklenerek kalitatif ve kantitatif
tayin yapmakta mümkündür.

2
 Kromatografik Yöntemlerin Tarihçesi
 İlk kromatografik çalışmalar; Rus botanikçi
Tswett (1901)
 Kromatografik çalışmaların hız kazanması; Kuhn
ve Lederer (1931)
 Sıvı-Sıvı kromatografisinin temeli; Martin ve
Synge (1941)
 İlk gaz kromatografisi; James ve Martin (1950)
 Gaz-sıvı kromatografisinin gelişimi (1954 ile
1962)
 Gaz kromatografisi bir analitik teknik olarak
kullanılması (1962)
3
 Kromatografik Ayırmalara Giriş

• Kromatografi- Kromatografi; yüzey alanı büyük

sabit bir faz ve bu sabit faz üzerinde hareket eden
hareketli faz arasında bir karışımdaki bileşenlerin
ayrılmasını esas alan bir yöntemdir.

• Hareketli Faz - Sabit faz üzerinden analitlerin hareketini

sağlayan bir sıvı
yada gazdır.

• Sabit Faz- Analitlerin hareketli fazın akışı süresince

ayrılmasını sağlayan bir katı dolgu maddesidir.

4
 Hareketli fazın ilerlemesiyle, çözünen
maddelerin durgun faz üzerinden yıkanarak
taşınmalarına elusyon adı verilir.
 Faz üzerinde tutunan bir karışımdaki
bileşenleri faz üzerinden taşımakta
kullanılan çözücüye eluent denir.
 Elusyon zamanı veya elusyon hacmine karşı
çözünen madde konsantrasyonuna bağlı
sinyalin oluşturduğu grafiğe kromatogram
denir.

5
 Bir karışımdaki bileşenlerin seçici olarak
ayrılması için bileşenlerin katı faz üzerinde
ayrıcalıklı olarak tutunması gereklidir.
 Hareketli faz olarak gaz kullanıldığında (GC’de),
ayrılan bileşenlerle gaz molekülleri arasında
herhangi bir etkileşim olmaz. Bu nedenle gaz
kromatografisinde seçiciliği sabit faz sağlar.
 Sıvı kromatografisinde ise bileşenlerle her iki faz
arasında bir etkileşim söz konusudur. Bu yüzden
sıvı kromatografisinde sabit faz ve hareketli fazı
kontrol ederek seçiciliği artırmak mümkündür.

6
 Ayrılacak bileşenlerle sabit ve hareketli faz
molekülleri arasında etkileşim gösteren farklı
güçler vardır. Bunları temel olarak iki türde
inceleyebiliriz.
 Bunlar;

- İyonik kuvvetler
- Polar kuvvetler

7
 İyonik Kuvvetler
 İyonik güçler elektriksel yükün bir
sonucudur. İyonik bir türü ayırmak için
sabit fazda anyonik yada katyonik gruplar
içeren sabit faz kullanılabilir

8
 Polar Kuvvetler
 Moleküllerdeki dipolün yada anlık meydana gelen
dipolun bir sonucu olarak doğan moleküller arası
güçlerdir. Örneğin alkoller, ketonlar ve aldehitler
kalıcı dipolleri olan polar maddelerdir. Benzen ve
toluen ise polarlanabilen maddelere örnek olarak
verilebilir. Bir kromatografik sistemde polar
maddeler seçici olarak tutunabilir. Sabit faz en
azından polarize olabilen aromatik çekirdek yada
hidroksil bileşikleri gibi polar moleküller içeririler

9
Kromatografik Yöntemlerin Sınıflandırılması:
1. Kolon Kromatografisi - Sabit fazın dar bir
kolona doldurulur ve hareketli faz basınç ile (yer
çekimi, vakum yada basınç) sabit faz üzerinden
geçirilir.
2. Düzlem Kromatografisi- Bu yöntemde;
sabit faz bir düz tabak yada bir kağıttır. Hareketli
faz sabit faz üzerinden kapiler hareket ile sabit faz
üzerinden hareket eder.

Kolon Kromatografisi
• Temel olarak üç türü vardır:
1. Sıvı Kromatografisi
2. Gaz Kromatografisi
3. Süperkritik Akışkanlı Sıvı Kromatografisi

10
• Bir karışımdaki bileşenlerin
bazıları sabit faz üzerinde güçlü
bazıları ise zayıf tutunurlar. Sabit
fazda zayıf tutunan türlerin
hareketli fazdaki hızları güçlü
tutunanlardan daha hızlıdır.

• Bileşenler bir bant verecek

şekilde ayrılırlar.

• Bu bantlar, hareketli fazda

türlerin göç hızlarına bağlıdır.

11
KROMATOGRAFİK KOLON

12
ADSORBAN PARÇACIĞI

13
 Kolonda Analitlerin Göçü
• Bir kromatografi kolonunun iki çözüneni ayrılmadaki verimliliği, iki türün
eluasyon sırasındaki bağıl hızlarına bağlıdır. Analitin kolondan göç hızı
analitin sabit faz ile hareketli faz arasındaki dengesine bağlıdır.

Partisyon Oranı (K)

• Analit, sabit fazda bağlanma ve ayrışarak kolonda hareket eder.

A stationary A mobile
• Partisyon sabiti (K) çözünenlerin hareketli ve sabit fazdaki
konsantrasyonlarının oranını esas alan denge sabiti ifadesi olarak
tanımlanır.

cs cs = Analitin sabit fazdaki konsantrasyonu

K=
cm cm = Analitin hareketli fazdaki konsantrasyonu

14
Alıkonma Zamanı (tR) - Örneğin enjeksiyonundan analitin dedektöre
ulaşıncaya kadar geçen zamana alıkonma zamanı (tR)
denir.
(tR)B

(tR)A
Detector Signal

Unretained
tM Species
A B

Time

• Ölü Zaman (tM) - Hiç tutunmayan bir türün kolondan

geçmesi için gerekli olan zamana ölü zaman denir.
• Ayarlanmış tutunma zamanı - Analitin
kolonda gerçek tutunma
zamanını verir.
tR - tM
15
Analitin Göç Hızı: Kapasite Faktörü

(tR)B

(tR)A
Detector Signal

Unretained
tM Species
A B

Time

• Kapasite Faktörü (k') - Bir kolonda analitin

göç hızlarını tanımlanmasında en yaygın kullanılan
önemli bir deneysel parametredir.
(t R ) A − t M
A Analiti için : k 'A =
tM

(t R ) B − t M
B Analiti için: k 'B = 16
tM
Relatif Göç Hızları: Seçicilik Faktörü

(tR)B

Detector Signal (tR)A

Unretained
tM Species
A B

Time

• Seçicilik Faktörü (a) – Bir karışımdaki analitler

arasındaki seçiciliği (yani ayrılmayı) seçicilik
faktörü (a) gösterir.
k 'B (t R ) B − t M k’A = A analitinin kapasite faktörü
α= =
k ' A (t R ) A − t M k’B = B analitinin kapasite faktörü

• Kapasite ve seçicilik faktörü kolonun ayırma gücünün hesaplamasında

kullanılır.
17
Kolon Verimi
• Kolon verimi; bir karışımdaki bileşenleri kolonun ayırma gücü olarak
tanımlanabilir.

Tabaka Teorisi - Tabaka teorisinde; kolon verimliliğinin kantitatif

ölçümünde birbiriyle bağıntılı iki terim kullanılır. Bunlar;

1- Tabaka yüksekliği
2- Teorik tabaka sayısı

18
 Tabaka yüksekliği (H) genellikle 0,1 cm ile
0,001 cm arasında değişirken, teorik tabak
sayısı N 100 ile 100.000 arasında
değişebilir.

 Kolon verimi, tabaka yüksekliğinin H

azalması ve tabaka sayısının N artmasıyla
artar.

19
Plaka yüksekliğinin belirlenmesi (H)
 Bir gaus eğrisinin genişliği standart sapma
σ yada varyans σ2 değerleriyle tanımlanır.
 Kromatografik bantlarda gaus eğrisine
benzediğinden ve kolon verimliliği
kromatografik piklerin genişlikleri ile
doğrudan ilgili olduğundan birim kolon
uzunluğu başına varyans değeri kolon
verimliliğinin bir ölçüsü olarak
kullanılabilir.

20
 σ2
H=
L

σ 2 = varyans

21
H ve N’ nin deneysel tayini

 Teorik tabaka sayısı N ve tabaka yüksekliği

H kolon performansının ölçütü olarak
yaygın olarak kullanılmaktadır.
 H ve N’nin deneysel tayininde, pikin
tutulma süresi tR ve pikin tabanının kalınlığı
W (zaman olarak) ölçülür. Bu verilerden
faydalanılarak H ve N hesaplanabilir.

22
 • Zamanın bir fonksiyonu olarak standart sapma (σ )

σ
τ=
L tR
τ = zamanın standart sapması
tR = alıkonma zamanı

• Gaus eğrisinde, ortalamanın ±s olduğunda oluşan üçgenin alanı gaus eğrisinin

% 68 ini verir. Benzer şekilde ortalamanın ±2s aralığındaki alanın altında
kalan pik alanı gaus eğrinin yaklaşık % 96’sını kapsar. Bu nedenle pikin
taban genişliği 4 standart sapmaya eşittir.
W = 4τ or τ = W/4
yada 2
LW 2
 tR 
H = N = 16 
16t R2 W  23
 VAN DEEMTER EŞİTLİĞİ
H = B/u + Cs u + Cm u
 H = Tabaka yüksekliği
 u = saniye başına cm olarak hareketli
fazın doğrusal hızı
 B = Uzunlamasına difüsyon katsayısı

 Cs ve Cm = sırasıyla durgun ve hareketli

fazın kütle aktarım katsayısıdır.
24
 Uzunlamasına difüzyon
katsayısı B/u
 Türlerin çok yoğun ortamdan az yoğun
ortama geçmesine difüzyon denir.
Bileşenlerin göç hızı, türlerin difüzyon
katsayısına DM ve bölgeler arasındaki
konsantrasyon farkına bağlıdır.
 Kromatografide uzunlamasına difüzyon,
çözünen türlerin bantın merkezinden her
iki yöne göçünden oluşur.
25
 Durgun faz kütle aktarım katsayısı Cs u
 Durgun faz tutuklanmış bir sıvı ise kütle
aktarım katsayısı Cs, destek parçacıklarının
üzerindeki film kalınlığının karesi ile
doğrudan, çözünenin bu film içindeki
difüzyon katsayısı Ds ile ters orantılıdır.
 Durgun faz bir katı yüzey ise kütle aktarım
katsayısı Cs, türlerin absorpsiyonu ve
desorpsiyonu için gerekli süre ile doğrudan
orantılıdır. Bu süre ise hareketin birinci
derece hız sabitiyle ters orantılıdır.
26
Hareketli faz kütle aktarım katsayısı Cm
 Hareketli faz kütle aktarımı olayları çok
karmaşıktır. Hareketli faz kütle aktarım katsayısı
Cm analitin hareketli fazdaki difüzyon katsayısı DM
ile ters orantılıdır. Dolgudaki parçacıkların çapının
karesi ile, kolon çapının karesi ve akış hızı ile
ilgilidir.

27
 Eddy Difüzyonu

 Hareketli fazda bölge genişlemesi hareket

eden analitin aldığı yola bağlıdır.

28
 Kolunun Rezolüsyon (Ayırma Gücü) (RS) –Kolonun ayırma gücünün kantitatif
ölçütüdür.

2[ (t R ) B − (t R ) A ]
RS =
W A + WB
29
Bant genişlemesi ve Kolon Verimi
Pik Şekli
• Hareketli fazda analitlerin kalma zamanı farklı olduğundan pikler bir Gaus
dağılımı verir.

• Bazı analit molekülleri hareketli fazda diğerlerinden daha az hızlarda

hareket edebilir. Eğrinin tepe noktası analitlerin kolonda geçirdikleri
ortalama zamanı verir.
• Pikin genişliği kolonun uzunluğu ile direkt olarak ilişkilidir. Daha uzun
olan kolonlarda pik genişliği artar.

• Pik genişliği hareketli fazın akış hızına da (hacmine) bağlıdır. Daha

yüksek akış hızlarında daha dar pikler görülür.
30
 Sonuç olarak; kolon uzunluğunun
artmasıyla ve hareketli fazın akış hızının
azalmasıyla pikin genişliği artar. Bunun
tam tersi olan durumlarda pik genişliği
azalır yani pik darlaşır ve sivrilir. İdeal bir
bant dar ve sivri olmalıdır.

 Sıvı kromatografisinde; hareketli fazın akış

hızı gaz kromatografisine göre çok
düşüktür.
31
 Sıvı kromatografisinde tabaka yüksekliği
gaz kromatografisinden yaklaşık 10 kat
daha büyüktür. Bu yüzden sıvı
kromatografisinde kullanılan kolonların
boylarını 50 cm’den büyük yapmak pratik
değildir.

 Gaz kromatografisinde ise kolon boyları 50

m ve daha büyük olabilir. Sonuç olarak gaz
kromatografisinde kullanılan kolonların
tabaka sayısı çok daha fazla olduğu için
ayırma gücüde daha iyidir.

32